DE1445977C - Verfahren zur mikrowellen Herstellung von 5 Purinnucleosid monophosphaten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von S'-Purinnucleosid-monophosphaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Purine durch Bebrüten mit den Stämmen ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium Ammoniagerres in einem Nährmedium, dem einerseits Pantothensäure, Pantothensäuresalze, Pantethein, ß-Alanin oder Coenzym A, andererseits Vitamin B₁ oder dessen Salze bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe zugesetzt worden sind, in die entsprechenden 5'-Purin- nucleosid-monophosphate überfuhrt und diese in üblicher Weise aus der Fermentierflüssigkeit isoliert. Beispiele für 5'-Purinnucleotide sind z. B. 5'-Inosinsäure, abgekürzt 5'-IMP, 5'-Guanylsäure, abgekürzt 5'-GMP, 5'-Adeny!säure, abgekürzt 5'-AMP und 5'-Xanthylsäure, abgekürzt 5'-XMP.

Aus der belgischen Patentschrift 621 122 ist ein Verfahren zur Totalsynthese von 5'-Guanylsäure bekannt, bei dem mit Brevibacteriumstämmen sehr geringe Konzentrationen dieses Nucleotids hergestellt werden können. Erfindungsgemäß werden mindestens lOfach höhere Konzentrationen erhalten. Ferner ist aus der französischen Patentschrift 1 301 052 ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure durch Fermentierung von Inosin in Gegenwart von organisehen Phosphaten bekannt. Inosin ist bekanntlich eine ziemlich schwer zugängliche Substanz, während die erfindungsgemäß als Ausgangsprodukte eingesetzten Purine leicht erhältlich sind. Andererseits werden erfindungsgemäß anorganische Phosphate als Phosphorquellen verwertet, während gemäß der französischen Patentschrift 1 301 052 organische Phosphate, wie Nitrophenylphosphat, notwendig sind.

Bei der erfindungsgemäßen Fermentierung unter Verwendung der Stämme Brevibacterium Ammoniagenes ATCC 687J und 6872 werden die Purinbasen als Präkursoren der Nucleotide in einer Menge von mehr als 0,5 mg/ml zugegeben. Die Stämme ATCC 6871 und 6872 benötigen als Wachstumsfaktor Biotin. Bei Zusatz von Hypoxanthin wird 5'-IMP gewonnen, 5'-GMP sammelt sich bei Zusatz von Guanin an und 5'-AMP wird durch Zugabe von Adenin gewonnen. Natürliche Stoffe, welche deren Präkursoren enthalten, können ebenfalls verwendet werden. Zum Beispiel kann man eine Fermentationsflüssigkeit zugeben, die mikrobiell gebildetes Hypoxanthin enthält.

Zu dem Kulturmedium wird eine geeignete Menge Pantothensäure, Pantothensäuresalze, wie z. B. CaI-ciumpantothenat, //-Alanin, Pantethein, CoenzymA oder diese Substanzen enthaltende natürliche Stoffe zugefügt. Im allgemeinen liegt die zugefügte Menge zwischen etwa 0,5 bis etwa 50 ng/ml, bezogen auf die Pantothensäure oder ähnliche Verbindung. Die Menge des in dem Medium vorliegenden Vitamins B, oder dessen Salzen bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe beträgt im allgemeinen etwa 0,1 bis etwa 10lxg/ml. .· ■■-;

Auch natürliche Kulturmedien, die Pantothensäure und Vitamin B₁ enthalten, sind im Rahmen der fo Erfindung geeignet. Als Naturstoffe, welche Pantothensäure enthalten und die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, können Fleischextrakt, Leberextrakt, Reiskleie, Melasse oder lösliche Fischsubstun/ genannt werden.

Zu den natürlichen Stoffen, welche Vitamin B, enthalten, gehören z.B. Reishülsen und Kleie, Hefeextrakt, Leberextrakt.

Diese Stoffe werden zu dem Grundmedium zugefügt, welches eine Kohlenstoffquelle, eine anorganische Stickstoffquelle, anorganische Salze, eine Aminosäurequelle und andere Verbindungen enthält, die für das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus notwendig sind. Unter den Kulturbestandteilen sind Phosphate und ■ Magnesiumsalze wichtig, und um günstige Ausbeuten zu erhalten, ist es notwendig, beide Bestandteile zuzusetzen, um weitaus höhere Konzentrationen zu bewirken.

Die günstigste Zugabe liegt bei 0,6 bis 1,5% K₂HPO₄, 0,6 bis 1,5% KH₂PO₄ und 0,6 bis 1,5% MgSO₄ ■ 7 H₂O. Der Zusatz soll so erfolgen, daß etwa gleiche Konzentrationen an diesen drei Salzen erhalten werden.

Die Fermentierung erfolgt nach an sich üblichen Bedingungen. Die Temperatur beträgt 25 bis 38° C, wobei das Optimum bei etwa 30⁰C liegt. Normalerweise ist für Flaschen- und Kolbenkulturen Schütteln erwünscht, und für Tank- und Schalengärbehälter sind Submerskulturen geeignet. Die Züchtungszeit beträgt 24 bis 168 Stunden, und die Menge an 5'-Purinnucleosid-monophosphat erreicht ihr Maximum bei 72- bis 120stündiger Kultivierungszeit. Die Isolierung erfolgt in an sich üblicher Weise.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung:

Beispiel 1

Brevibacterium Ammoniagenes ATCC 6872 wurde nach Autoklavieren (bei 120⁰C für 15 Minuten) des Impfkulturmediums, welches 2% Glucose, 1,0% Casaminosäuren (frei von Vitamin), 0,1% K₂HPO₄, 0,03% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,3% NaCl, 0,01% FeSO₄ · 7H₂O und 30μg/l Biotin (pH 7,3) enthielt und Beimpfung des Fermentationsmediums mit einer Menge von 10 Volumprozent 24 Stunden kultiviert. Je 30 ml des Mediums wurden in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben gegossen und nach Autoklavieren (bei 120⁰C für 15 Minuten) verwendet. Das Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung wurde verwendet, und die Kultivierung bei 30"C unter Rühren durchgeführt. Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums war folgende: 10% Glucose, 1 % K₂HPO₄,1 % KH₂PO₄,1 % MgSO₄ - 7 H₂O, 0,01% CaCl₂ ■ 2 H₂O, 30 ₍ig/l Biotin, 3 mg/ml Hypoxanthin, Calciumpantothenat in verschiedenen Konzentrationen. Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren (15 Minuten bei 120⁰C) mit Sn-NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach Sterilisierung wurden 0,6% sterilisierter Harnstoff und Vitamin-B]-Hydrochlorid in verschiedenen Konzentrationen zu dem Medium zugefügt. Die Menge an 5'-lnosinsäure (Natriumsalz), welche sich nach 96 Stunden in der Kulturflüssigkeit angereichert hat, ist in der folgenden Tabelle I auf-

^8cfÜhrt: ' Tabelle I

Zugegebenes Caleiiinipaiilolhenat	Zugegebenes Vitamin HI IKI	Gebildete .V-Iiuisinsiiurc
<!'g/ml)	C.g/nuV	(ing/nil)
0	0	Spur
5	0	Spur
0	1	Spur
1	I	XJ
5	0,1	(),X
5	I	II.I

Beispiel 2 .

Die Kultivierung wird unter Verwendung des gleichen Stammes und unter ähnlichen Kultivierungsbedingungen, wie im Beispiel 1 angegeben, unter Zusatz von β - Alanin in verschiedenen Konzentrationen anstatt von Calciumpantothenat durchgeführt. Die Menge der sich, nach 120 Stunden angereicherten 5' - Inosinsäure (Natriumsalz) ist in Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle II

Zugegebenes /S-Alanin	Zugegebenes Vitamin Bl -HCl	Angesammelte , 5'-Inosinsäure (Na-SaIz)
		(mg/ml)
O	1,0	Spur
1	1,0	7,0
2	1,0	9,1
5	1,0	11,5
10	1,0	11,3
5	0	Spur
5	0,1	6,1
5	0,5	9,7

Beispiel.3

Der gleiche Stamm und das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 wurden verwendet mit der Ausnahme, daß als Zusatz 1,5% Pepton an Stelle von 1,0% Casaminosäuren verwendet wurden. Zu dem verwendeten Fermentationsmedium wurden geeigneten Mengen /?-Alanin, Pantethein und Coenzym A und Hefeextrakt, Fleischextrakt, Leberextrakt, lösliche Fischsubstanz oder natürliche Stoffe, welche diese Verbindung enthielten, an Stelle von Calciumpantothenat zugesetzt, und weiterhin wurde 1 μg/ml Vitamin B1 zugegeben. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiels 1. Die Menge an 5'-Inosinsäure (Natriumsalz), welche sich im Fermentationsmedium nach 120stündiger Kultivierung ansammelte, ist in Tabelle III wiedergegeben.

Tabelle III

Pantothensäure verwandte	Vitamin B1	Angesammelte
Verbindungen oder natürliche	(μ&ΊηΙ)	5'-Inosinsäure
Stoffe, die diese enthalten	1	(Na-SaIz) (mg/ml)
Kein Zusatz	1	Spur
/S-Alanin, 5 μ&/ηι1	1	11,1
Pantethein, 1 μ£/πι1	1	6,9
Pantethein, 10 μg/ml	1	10,9
Coenzym A, 10 μ£/ηι1	1	7,8
Coenzym, 40 μ§/ηι1	—	11,0
Hefeextrakt, 0,5%	1	11,2
Fleischextrakt, 1,0%	—	10,8
Leberextrakt, 0,7%	1	11,3
Lösliche Fischsubstanz,		10,2
1,2%

B e i s ρ ie I 4

Es wurde Brevibacterium Ammoniagenes ATCC 6871 und das gleiche Impf- und Fermentationsmedium wie im Beispiel 3 verwendet. Der Stamm wurde unter Zugabe von Pantothensäure (oder /3-Alanin) und Vitamin B1 in verschiedenen Konzentrationen kultiviert. Die anderen Fermentationsmaßnahmen waren ähnlich denen des Beispiels 1. Die sich nach einer Kultivierungszeit von 96 Stunden ansammelnde Menge an 5'-Inosinsäure (Natriumsalz) ist in Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle IV

Zugesetzte Verbindung der Pantothenreihe	Zugesetztes Vitamin Bl (με/mi)	Angesammelte 5'-Inosinsäure (Na-SaIz) (mg/ml)
2o Kein Zusatz Calciumpantothenat, 10 μξ/τηΐ Kein Zusatz Calciumpantothenat, 10 μ^ΤΤίΙ /S-Alanin, 10 μξ/ηύ	kein Zusatz kein Zusatz 2 2 2	Spur Spur Spur 8,9 9,2

30

Beispiel 5

Der gleiche Stamm und das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 wurden verwendet sowie das Medium, das durch Zugabe von 0,3% Pepton zu dem Fermentationsmedium des Beispiels 1 ohne Hypoxanthin erhalten wurde. Pantothensäure oder ihre verwandten Verbindungen und Vitamin B1 wurden in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Der Zusatz von Guanin während des Wachstums erfolgte so, daß während einer Kultivierung von 72 Stunden 2 mg/ml Guanin eingesetzt wurden. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiels 1. Die Menge der nach einer Kultivierungszeit von 96 Stunden sich in der Kulturflüssigkeit ansammelnden 5'-Guanylsäure (Natriumsalz) ist in Tabelle V wiedergegeben.

Tabelle V

Zugesetzte Pantothensäure,	Zugesetztes	Angesammelte
verwandte Verbindungen	Vitamin Bl HCI	5'-Guanylsäure (Na-SaIz)
(ng/ml)	feg/ml)	(mg/ml)
Calciumpantothenat, 10	0	Spur
Kein Zusatz	2	Spur
Calciumpantothenat, 10	2	3,9
/S-Alanin, 10	2	4,1
Pantethein, 5	2	4,9
Coenzym A, 30	2	4,8

55

60 B ei s ρ i e 1 6

Es wurde der gleiche Stamm und das gleiche Impfmedium wie im Beispiel 1 sowie ein ähnliches Fermentationsmedium wie im Beispiel 5 verwendet, zu dem 5 μ^ηιΐ Pantothensäure und 1 μg/ml Vitamin B1 Hydrochlorid zugefügt wurden. Die Zugabe erfolgte so, daß während einer Kultivierungszeit von 48 Stun-

den 2,5 mg/ml Adenin eingesetzt wurde. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiels 1. Nach einer Kultivierungszeit von 96 Stunden sammelte sich in der Kulturflüssigkeit 6,5 mg/ml 5'-Adenylsäure. Werden Pantothensäure oder Vitamin B1 weggelassen, so reichert sich 5'-Adenylsäure nur geringfügig an.

Beispiel7

Brevibacterium Ammoniagenes ATCC 6871 wurde verwendet. Das Impfmedium und Fermentationsmedium des Beispiels 5 wurden verwendet und die Komponenten in der Weise zugesetzt, daß während einer Kultivierung von 48 Stunden 2,0 mg/ml Guanin oder Adenin eingesetzt wurden. Andere Kultivierungsbedingungen waren ähnlich denen des Beispiels 1. Somit wurden in der Kulturflüssigkeit nach einer Kultivierung von 96 Stunden 4,8 mg/ml 5'-Guanylsäure (Natriumsalz) gewonnen, wenn Guanin zugefügt wurde, und im Falle der Zugabe von Adenin sammelten sich 5,1 mg/ml 5'-Adenylsäure an. Wenn man Pantothensäure oder Vitamin B1 wegläßt, so sammeln sich nur geringe Mengen 5'-Guanylsäure oder 5'-Adenylsäure an.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von 5'-Purinnucleosid-monophosphaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Purine durch Bebrüten mit den Stämmen ATCC 6871 oder 6872 von Brevibacterium Ammoniagenes in einem Nährmedium, dem einerseits Pantothensäure, Pantothensäuresalze, Pantethein, ^-Alanin oder Coenzym A, andererseits Vitamin Bl oder dessen Salze bzw. diese Substanzen enthaltende Naturstoffe zugesetzt worden sind, in die entsprechenden 5'-Purinnucleosid-monophosphate überführt und. diese in üblicher Weise aus der Fermentierflüssigkeit isoliert.