DE1523071C - Verfahren und Vorrichtung zur chro matographischen Analyse von Peptiden - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur unterschiedlicher Konzentration enthalten. Die Pufferchromatographischen Analyse von Peptiden, bei dem flüssigkeit fließt von der einen Kammer zur nächsten die mit dem Eluatstrom aus der chromatographischen Kammer und durch einen Auslaß 36 am Boden des Trennvorrichtung abströmenden und mit einem alka- Gerätes heraus, von wo aus sie zum oberen Ende der lischen Reagenz vermischten Fraktionen durch ein 5 Säule 10 hin über Röhren 38 und 40 gepumpt wird. Heizbad und anschließend durch eine Analysier- Während die Pufferflüssigkeit in der Kammer 10 einrichtung geleitet werden. abwärts fließt, werden die zuvor im Harz der Säule

Ferner bezieht sich die Erfindung auf eine zur adsorbierten Peptide nacheinander durch einen AusDurchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung laß 42 am unteren Ende der Säule abgegeben und mit einer chromatographischen Trennvorrichtung, ίο fließen vor Beginn des Trennvorgangs zu einer Pumeinem Heizbad zur Erwärmung des aus der Trenn- penröhre 44 einer Pumpe 46. Zur Zuführung von Vorrichtung austretenden, mit dem alkalischen Natriumhydroxid oder eines anderen Alkalis zwecks Reagenz vermischten Eluatstroms und einer dem Hydrolyse der Peptide enthält die Pumpe 46 außer-Heizbad nachgeschalteten Analysiereinrichtung. dem eine Pumpenröhre 48.

Derartige Verfahren und Vorrichtungen sind 15 Die Pumpe enthält außerdem eine Pumpenröhre grundsätzlich bekannt. Dabei ist es üblich, für die 50, über die Stickstoff an einer Röhrenverzweigung im Heizbad befindliche Rohrschlange Glas zu ver- 52, an der das, Natriumhydroxid in die die Peptide wenden. Glas hat jedoch den Nachteil, daß es einer- enthaltende Strömung eingeführt wird, in die Flüssigseits teuer ist. und andererseits einen verhältnismäßig keitsströmung eingebracht wird. Vom Stickstoff wird großen Raumbedarf aufweist. Aridere Materialien, 20 die Flüssigkeit in Schübe unterteilt, so daß die in die diese Nachteile nicht zeigen und außerdem auch eine Röhre 54 eintretende Strömung aus Flüssigkeitsbei erhöhten Temperaturen alkalibeständig sind, sind schuhen besteht, die voneinander durch Stickstoffdagegen leicht hydrophob, wodurch im Transport- einschlüsse getrennt sind. Zur Unterteilung der Ströröhrensystem Druckschwankungen auftreten, die zu mung wird deshalb Stickstoff an Stelle alkalifreier Schwingungen der Flüssigkeitsschübe im Transport- 35 Luft angewendet, weil er, wie man herausgefunden röhrensystem führen können. hat, die Anwendung eines stärkeren Alkalis bei einem

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, diese bei geringen oder vernachlässigbaren schädigenden Einden bekannten Verfahren und Vorrichtungen auf- fluß auf die für das Alkali empfindlichen Aminotretenden Schwierigkeiten zu vermeiden. säuren zuläßt, wodurch der Anteil der Hydrolyse be-

Zu diesem Zweck ist das eingangs beschriebene 30 trächtlich gesteigert wird. Beispielsweise kann man

Verfahren nach der Erfindung dadurch gekennzeich- 16 bis 20 Volumprozent Natriumhydroxid in einer

net, daß zur Vermeidung von Druckschwankungen Wasserlösung anwenden. Von der Röhre 54 wird die

im Transportröhrensystem an einer auf der Hoch- Strömung durch eine Mischspule 56 in eine Röhre 58

druckseite des Heizbades liegenden Stelle entlüftet eines Heizbades 60 geleitet, in dem die Peptide der

wird. 35 Wirkung des Alkalis und der Wärme unterworfen

Die eingangs beschriebene Vorrichtung zur Durch- werden und eine Temperatur von 95° C aufrecht-

führung des Verfahrens ist nach der Erfindung ge- erhalten wird.

kennzeichnet durch eine Entlüftungsvorrichtung, die Die Röhre im Heizbad hat eine beträchtliche

zwischen der Trennvorrichtung und dem Heizbad in Länge von z. B. etwa 120 Fuß (36,5 m), wenn sie

das Transportröhrensystem eingeschaltet ist. 4° geradlinig gemessen ist. obgleich sie aus Raum-

Durch die Anordnung einer Entlüftungsvorrich- ersparnisgründen wie eine Spule in einem Gefäß mit

tung im Transportröhrensystem vor dem Heizbad der Heizflüssigkeit aufgewickelt ist. Die Röhre 58 hat

werden die lästigen Schwankungen vermieden. Hier- einen Innendurchmesser von vorzugsweise 2,16 mm

durch ergibt sich der weitere Vorteil, daß billigere und besteht aus einem fluorierten Kohlenwasserstoff,

und apparativ wesentlich kleinere Schläuche aus 45 Diese Röhre ist selbst bei erhöhten Temperaturen

einem fluorierten Kohlenwasserstoff an Stelle von gegen Alkalien widerstandsfähig, aber wegen der

Glasröhren im Heizbad verwendet werden können. Wasserabstoßung des fluorierten Kohlenwasserstoffs

Die Entlüftungsvorrichtung besteht vorzugsweise treten in der Röhre unerwünschte Druckschwankun-

aus einer Röhre, die mittels eines Verzweigungsglie- gen und Stöße auf. Um diese unerwünschten Druck-

des in die,zum Heizbad führende, das alkalische 50 Schwankungen und Flüssigkeitsstöße in der Röhre

Reagenz enthaltende Transportröhre eingeschaltet des Heizbades 60, in dem eine wirksame alkalische

ist. Zweckmäßigerweise ist die Entlüftungsröhfe eine Hydrolyse der Peptide während des Durchflusses er-

Kapillarröhre mit einem Durchmesser von etwa folgt, zu verhindern, wird der Druck des Mediums

0,12 mm. in der Röhre 58 gesteuert; die Stöße werden dadurch

Die Erfindung wird an Hand einer Figur beschrie- 55 verhindert, daß auf der Hochdruckseite der Heizbadben, die das Verfahren und teilweise schematisch die röhre 58 eine Entlüftungsröhre 62 vorgesehen ist. Vorrichtung veranschaulicht. . Die Entlüftungsröhre 62 besteht aus einer Kapillar-Gemäß der Figur enthält das Gerät eine chromato- röhre, die aus Polyvinylchlorid hergestellt ist. Wähgraphische Säule 10, an deren oberem Ende eine aus- rend die Länge und der Innendurchmesser der Entwaschende Flüssigkeit von einem einen veränder- 60 lüftungsröhre 62 etwas schwanken können, betragen baren Flüssigkeitsgradienten herstellenden Gerät 12 die bevorzugte Länge 15,2 cm und ihr Innendurch-¹ mit Hilfe einer Förderpumpe 14 mit Zylinder und messer 0,127 mm. Damit keine Peptide vergeudet Kolben zugeführt wird. Das Gerät 12, das einen werden, ist die Entlüftungsröhre 62 vor der Verzweiveränderbaren Flüssigkeitsgradienten herstellt, ist be- gungsstelle 52 an die Pumpenröhre 48 der Alkalireits anderweitig vorgeschlagen worden. Es enthält 65 zuführleitung angeschlossen, in der das Alkali für die mehrere Kammern 34, die an ihren unteren Enden Peptide mit dem Stickstoff, der die Strömung in miteinander in Verbindung stehen und die aus- Schübe zerteilt, zur Röhre 54 strömt,
waschende Flüssigkeit oder eine Pufferflüssigkeit Der Auslaß der Röhre 58 ist über eine Röhre 64

an eine Pumpenröhre 66 angeschlossen; wie bemerkt sei, wird das Medium in die Röhre 58 hinein- und aus ihr herausgepumpt. Die unterteilte Strömung, die die Peptide und das Alkali enthält, wird in das Heizbad 60 gepumpt, in dem die Hydrolyse der Peptide bei einer Temperatur von 95° C stattfindet; diehydrolysierten Peptide werden aus dem Heizbad 60 gepumpt, während gleichzeitig nachfolgend Peptiden vom Auslaß 42 der chromatographischen Säule in die Pumpenröhre 44 gelangen.

Nach der Hydrolyse werden die Peptide der Reihe nach in ein selbsttätiges Analysiergerät gepumpt, das z.B. in der USA.-Patentschrift 3 074784 beschrieben ist. Das Gerät enthält eine Pumpe 46', die ein Teil der Pumpe 46 oder auch eine gesonderte Pumpe mit zusammendrückbaren Röhren sein kann. Die Pumpe 46 oder 46' ist eine Dosierpumpe und z. B. in der USA.-Patentschrift 2935028 vom 3. Mai 1960 erläutert.

Die hydrolysierten Peptide werden der Reihe nach über die Pumpenröhre 66 und Röhren 68 und 70 zu einer Pumpenröhre 72 befördert. In den Röhren 68 und 70 ist eine Entlüftungsröhre 74 eingeschaltet, damit die Stickstoffeinschlüsse aus der Strömung austreten können, bevor diese in die Pumpenröhre 72 gelangt. Die Entlüftungsröhre 74 liegt oberhalb eines Punktes 76, an dem die Röhren 68 und 70 verbunden sind, so daß der Stickstoff in der Entlüftungsröhre 74 hochsteigt und in die Atmosphäre gelangt, während die Flüssigkeitsschübe am Punkt 76 vorbei in die Röhre 70 eintreten und zu einer zusammenhängenden Flüssigkeitsströmung verdichtet werden, die in die Pumpenröhre 72 eintritt.

In dem Analysiergerät werden die hydrolysierten Peptide kolorimetrisch analysiert, wie anschließend kurz erläutert sei. Die Peptide werden für die kolorimetrische Analyse dadurch vorbehandelt, daß sie mit einer Flüssigkeit vermischt werden, die ein Verdünnungsmittel, z. B. Methylglykoläther und ein Farbreagenzmittel enthält, für das Ninhydrin in Gegenwart von Hydrindatin als Reduktionsmittel gewählt ist. Diese Flüssigkeit wird vorzugsweise im voraus gemischt und von einem undurchsichtigen Behälter aus (nicht gezeigt) einer Pumpenröhre 75 zugeführt, die mit dem Einlaß einer Mischspule 76 verbunden ist. Eine neutralisierende Säure, z. B. Essigsäure, wird über eine Pumpenröhre 78 zugeführt, die das restliche Alkali neutralisiert, das während der Hydrolyse im Heizbad 60 nicht vollkommen .verbraucht ist. Über eine Pumpenröhre 80 wird Stick-Stoff zur Unterbrechung der Flüssigkeitsströmung herangeführt. In die hydrolysierten Peptide wird die Essigsäure vor einer Verzweigungsstelle 84 an einer Verzweigungsstelle 82 eingeführt, damit die Neutralisierung erfolgt, bevor das Farbreagenzmittel den Peptiden am Einlaß der Mischspule 76 zugeführt wird. Die zerteilte Flüssigkeitsströmung wird von der Mischspule 76 aus einer Röhre 86 eines Heizbades 88 zugeführt, dessen Temperatur 95° C beträgt. Der Auslaß der Heizbadröhre 86 ist an einer Kühlschlange 90 angeschlossen, deren Auslaß über eine Röhre 92 an einem Einlaß 96 einer Kolorimeterdurchflußzelle 94 liegt. Von dieser wird die Flüssigkeit an einem Auslaß 98 abgegeben. An die Röhre 92 ist vor dem Einlaß 96 der Durchflußzelle eine Röhre angeschlossen, die mit einer Pumpenröhre 101 verbunden ist, so daß die Stickstoffeinschlüsse oder -blasen, die in die Strömung über die Pumpenröhre eingeführt sind, aus der Strömung entfernt werden, bevor diese in die Durchflußzelle 94 eintritt. Die Stickstoffblasen und eine kleine Flüssigkeitsmenge werden aus der Röhre 92 angesaugt, so daß nur Flüssigkeiten in die Durchflußzelle 94 gelangen. Einer Lichtquelle 102 sind mehrere Linsen zugeordnet, die das Licht in Längsrichtung der Durchflußzelle 94 durch die strömende Flüssigkeit lenken. Ein Detektor 104, der das nach dem Durchgang durch die Flüssigkeit die Durchflußzelle 94 verlassende Licht empfängt, steuert ein Registriergerät 106. Der durch die Pumpenröhre 50 bzw. 80 zur Unterbrechung der Flüssigkeitsströmung eingeführte Stickstoff übt eine Reinigungswirkung aus, weil die Stickstoffeinschlüsse oder -blasen die Teilchen entfernen, die an den Innenwänden der Röhren haften und sich dort zusammenballen.

Der Durchmeser der Pumpenröhren 44, 48, 50 vor dem Heizbad 60 und der Durchmesser der Röhre 66 sind derart gewählt, daß das im Heizbad 60 befind- *** liehe Medium unter einem zwangläufigen Druck steht und eine kleine Menge der Flüssigkeit ununterbrochen aus der Entlüftungsröhre 62 hinausströmt.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur chromatographischen Analyse von Peptiden, bei dem die mit dem Eluatstrom aus der chromatographischen Trennvorrichtung abströmenden und mit einem alkalischen Reagenz vermischten Fraktionen durch ein Heizbad und anschließend durch eine Analysiereinrichtung geleitet werden, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vermeidung von Druckschwankungen im Transportröhrensystem an einer auf der Hochdruckseite des Heizbades liegenden Stelle entlüftet wird.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend eine chromatographische Trennvorrichtung, ein Heizbad zur Erwärmung des aus der Trennvorrichtung austretenden, mit dem alkalischen Reagenz vermischten Eluatstroms, und eine dem Heizbad nachgeschaltete Analysiereinrichtung, gekennzeichnet durch eine Entlüftungsvorrichtung (62), die zwischen der Trennvorrichtung (10) und dem Heizbad (60) in das Transportröhrensystem eingeschaltet ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die durch das Heizbad (60) geführte lange Transportröhre (58) aus einem fluorierten Kohlenwasserstoff besteht.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Entlüftungsvorrichtung (62) aus einer Röhre besteht, die mittels eines Verzweigungsgliedes in die zum Heizbad (60) führende und das alkalische Reagenz enthaltende Transportröhre (48) eingeschaltet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Entlüftungsröhre eine Kapillarrohre mit einem Durchmesser von etwa 0,12 mm ist.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen