DE1792019B - Verfahren zur Herstellung von Rifamycin-SV - Google Patents

Description

	Vegetatives	ATCC 13 685	Lösliches	Vegetatives	ATCC 21 271	Lösliches
Nährboden	Myzelium	Luft	Pigment	Myzelium	Luft-	Pigment
	glasklar	myzelium	', grüngelb	glasklar bis	myzeliurn	helles
Stärke Agar	bis hellbraun	rosa	; bis hell	orangebraun	fehlt	grüngelb
		weiß	braun	bis dunkel		bis braun
				braun		grüngelb
	glasklar		hellgelb	glasklar bis		helles grün
Ca-Malat-	bis hellbraun	rosa		orangegelb	fehlt	gelb bis
Glukose-Agar		weiß				braun
						grüngelb
	glasklar		wenig	glasklar bis		sehr helles
Ca-Malat-	bis hellorange	weiß	schwach-	orangegelb bis		braun
Glycerin-Agar		hell	; orange	orangebraun		grüngelb
	glasklar bis	orange	'■ sehr helles	glasklar bis	fehlt	braungelb
Bennet-Agar	orangegelb	rosa	gelbbraun	orangegelb		bis braun
		weiß		bis dunkles		rot
				rotbraun	: fehlt

Die in der vorstehenden Tabelle genannten Nährböden hatten folgende Zusammensetzung:

Stärke Agar: 10 g lösliche Stärke, Ig K₂HPO₄, Ig MgSO₄-7 H₄O, Ig NaCL. 2 g (NH₄)₂SO₄, 2 g CaCO₃, je 0,001 g FeSO₄ · 7H_äO, MnCI₄ · 4H₄O, ZnSO₄-7H₂O, 20 g Agar Difco, mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach 20minutiger Sterilisation bei 12O⁰C lag der pH-Wert bei 6,7 bis 7,8.

Ca-Malat-Glukose-Agar: 20 g Glukose, 10 g Ca-

Malat, 0,5 g NH₄Cl, 0,5 g K₂HPO₄, 15 g Agar Difco,

mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach ISminutiger Sterilisation bei 115^CC lag der pH-Wert bei 6,5.

Cü-Malat-Glycerin-Agar: 10 g Glycerin, 10 g Ca-Maliite, 0,5 g NH₄Cl, 0,5 g K₂HPO₄, 15 g Agar Difco, mit destilliertem Wasser auf Ϊ000 ml aufgefüllt. Nach 15minutiger Sterilisation bei 115^CC lag der pH-Wert bei 6,5 bis 6,6.

Bennet-Agar: 10g Glukose, Ig Hefeextrakt, Ig Fleischextrakt, 2 g N-Z-Amin A, 15 g Agar, mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach Sterilisation lag der pH-Wert bei 6,7 bis 6,8.

Das Fermentations- und Extraktionsverfahren kommt im wesentlichen dem zur Herstellung von Rifamycin B beschriebenen Verfahren gleich und be-Iteht in der Züchtigung von Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 in einem eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und wichtige Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, bis dieses Nährmedium eine beträchtliche antibiotische Wirksamkeit besitzt, und in der Extraktion von Rifamycin SV aus dem Nährmedium. Dieser Stamm wird unter Rühren und unter belüfteten submersen Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 25 und 37°C und vorzugsweise bei 28^CC gezüchtet. Als Kohlenstoffquelle können die folgenden Koh.enhydrate und Kohlenstoffderivate verwendet werden: Glukose, Galactose, Lactose, Saccharose, Maltose, Glycerin, Mannit. Brauchbare Stickstoffquellen sind z. B. Am:nosr iren und deren Gemische, Peptide, Proteine und deren Spaltprodukte wie Pepton, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Maiswasser, lösliche Fischrückstände, Fleischextrakte, wäßrige Teile der Getreidesamen. Die Fermentation kann über 96 bis 180 Stunden hinweg durchgeführt werden. Der Anfangs-pH-Wert, der im allgemeinen bei etwa pH 6,2 bis pH 6,4 lag, sank während der Fermentation auf pH 5,5 bis 6,0. Im allgemeinen wurden die be3ten Ergebnisse bei 180stündiger Fermentation beobachtet. Nach dieser Zeit erhielt man eine ausgezeichnete Ausbeute des Antibiotikums.

Nach Ablauf der Fermentation konnte das Rifamycin SV durch folgendes Verfahren isoliert werden: Das Fermentationsmedium wird bei dem End-pH-Wert von pH 6,4 bis pH 6,6 filtriert. Um die beste Stabilität der antibiotischen Substanz zu garantieren, wird das Filtrat auf einen pH-Wert, der vorzugsweise unter pH 5 liegt, angesäuert. Die wirksame Substanz wird mit Wasser nichtmischbaren Lösungsmitteln, wie Chloroform, Butanol, Äthyl-, Propyl-, Butyl- oder Amylacetat, extrahiert. Das Volumenverhältnis zwischen dem Medium und dem Lösungsmittel ändert sich je nach dem gewählten Lösungsmittel; im allgemeinen wird ein Verhältnis von 2:1 bis zu 10: 1 verwendet.

Das Myzelium behält weiterhin eine mikrobiologische Wirksamkeit, die bemerkenswert höher ist als die bei der Fermentation von Rifamycin B beobachtete. Mit einem mit Wasser nichtmischbaren Lösungsmittel wird die wirksame Substanz aus dem Myzelium extrahiert und dann mit der organischen Phase vereinigt, die bereits das meiste Rifamycin enthält. Die wirksame Substanz kann aus dem Myzelium auch mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Aceton extrahiert werden. In diesem Falle wird die Flüssigkeit filtriert, das Aceton im Vakuum abgedampft, das Rifamycin mit einem mit Wasser nichtmischbaren Lösungsmittel extrahiert und das Verfahren, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt.

Wenn die Hauptmenge der anlibiotisch wirksamen Substanz in das Lösungsmittel überführt worden ist, wird vorzugsweise bei einer Temperatur von unter 30° C im Vakuum bis zur Trockene destilliert.
Die Reinigung des Rifamycin SV wird chromatographisch an einer mit einem geeigneten Adsorptionsmaterial, wie Silikagel, präparierten Säule durchgeführt. Die Rifamycine werden in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Aceton gelöst, auf die

ίο Säule gebracht und mit einem geeigneten Lösungsmittelgemisch wie Aceton und Benzol eluiert. Im allgemeinen ist die Abtrennung von Rifamycin SV aus anderen Rifamycinen ziemlich scharf, da es eine wesentlich höhere Beweglichkeit besitzt und auf Grund des charakteristischen orangegelben Farbringes innerhalb der Säule leicht verfolgt werden kann. Das das Rifamycin SV enthaltende Eluat wird dann im Vakuum zur Trockne konzentriert und ein kristalliner, orangegelber Rückstand erhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Suspension des Myzelium der Streptomyces mediterranei ATCC 13 685 wurde mit N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt und auf Bennet-Agar okuliert. Die Kolonien, die die mutagene Behandlung überlebten, wurden isoliert und auf ihre Fähigkeit, das Wachstum von Pseudomonas reptilivora NRRL-B6, die auf Penassay-Samenagar bei einem pH-Wert von pH 7,2 gezüchtet wurden, zu hemmen, geprüft. Rifamycin B ist unter diesen Bedingungen mikrobiologisch inaktiv, und Rifamycin SV bildendes Streptomyces med-i'.erranei ATCC 21 271 wurde ausgewählt.

Dieser Stamm wurde 6 bis 8 Tage lang auf dem Bennet-Agar vermehrt und bei 28⁰C inkubiert. Mit der Kultur, die aus der schräg im Reagenzglas angelegten Agarkultur erhalten wurde, wurden zwei 500-ml-Erlenmeyerkolben unter sterilen. Bedingungen okuliert. Die Kolben enthielten 100 ml des vegetativen Mediums der folgenden Zusammensetzung:

Fleischextrakt 5 g

Hefeextrakt 5 g

Pepton 5 g

Caseinhydrolysat 3 g

Glukose 20 g

NaCl 1,5 g

mit H₂O auf 1 Liter aufgefüllt.

Der pH-Wert wurde mit NaOH auf pH 7,3 eingestellt.
Die auf diese Weise okulierten Kolben wurden

SS 72 Stunden bei 28⁰C auf irgendeinen Schüttelapparat untergebracht. Der Inhalt der beiden EHenmeyei* kolben wurde als Impfstoff benutzt, indem man ihn in einen 10 Liter fassenden Vorfermenter, der 4 Liter des vorstehend erwähnten vegetativen Mediums enthielt, eingoß.

Die Inkubation wurde bei 28°C unter Rühren mit 750 U/min und unter Belüftung mit 1 V/V/min durchgeführt. Nach 30stündigem Wachstum wurde ein 7- bis 10"/₀iges Volumen gepackter Zellen erhalten.

G5 Im nächsten Stadium wurde ein 10 Liter fassender, aus Olas bestehender Fermenter verwendet, der 4 Liter des nachstehend erwähnten Fermentationsmediums enthielt:

Erdniißmehl 25 g

Sojubohnenmehl 5 g

(NH₄WaO₄ 9,5 g

VIgSO₁ -7H₅O 0,85 g

Glukose 95 g

Glycerin 40 g

KH₂PO₁ Ig

Propylenglykol 5 g

CaCO, 8,5 g

Na-Diäthylbarbitiirat .... 1,7 g

CuSO₁-5 H,0 2,8 mg

FeSOj-7H.rO 8,5 mg

ZnSO₄-7 H.,0 42,5 mg

VInSO₄ -4HoO 3,4 mg

CaCl.,-6H.,Ö 1,7 mg

(NH₄HMo₇O₂₄ · 4 H₂O ... 0,85 mg

mit H₂O auf 1 Liter aufgefüllt

Der pH-Wert wurde mit NaOH auf pH 7,8 eingestellt. Die Sterilisation wurde 60 Minuten bei 120°C durchgeführt. Nach der Sterilisation lag der pH-Wert bei 6,4. (Ein Teil des Inhalts des Vorfermenters gleich 5°/₀ des Inhaltes des Fermenters wurde als Impfstoff verwendet).

Die Fermentation wurde bei 28⁰C unter Rühren mit 750 U, min und unter Belüftung mit 1 V/V/min durchgeführt. Silikon A wurde als Antischaummittel verwendet. Während der Fermentation erhielt die Kulturbrühe eine charakteristische rotbraune Farbe. Nach 120stündigem Wachstum wurde ein 20- bis 25° „iges Volumen gepackter Zellen erhalten. Der pH-Wert der Brühe war pH 6,0. Nach 180 Stunden wurde die höchste antibiotische Wirksamkeit (200Oy/ ml Rifamycin SV) erzielt. Die Brühe wurde zu diesem Zeitpunkt isoliert.

Beispiel 2

Eine gemäß Beispiel 1 erhaltene Kultur von Streptomyces meditcrranei ATCC 21 271 wurde unter Rühren gemäß Beispiel 1 in einem Kolben präpariert. Zur Vorzüchtunp wurde sie in einen 10 Liter fassenden, aus Glas bestehenden Fermenter gegossen, der 4 Liter des folgenden Mediums enthielt:

Glukose 5 g

Erdnußmehl 7.5 g

CaCO₃ 1,65 g

MgSO₁-7 H.,0 0,33 g

KH₂PO₄ 0,33 g

FeSO₄ ■ 7 H₂O 3.3 mg

ZnSO₁ -7H,0 16.5 mg

MnSO₄-4H₂O 1.3 mg

mit H₂O auf 1 Liter aufgefüllt

Der pH-Wert wurde auf pH 7,5 eingestellt. Die Sterilisation wurde 50 Minuten bei I2O^QC durchgeführt. Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,4. Nach 38stündigem Wachstum betrug das Volumen der gepackten Zellen 6 bis 8°/₀ des Gesamtvolumens. Ein Impfstoff gleich 10% wurde für einen 20 Liter fassenden, aus Glas bestehenden Fermenter, der 10 Liter des folgenden Fermentationsmediums enthielt, verwendet:

Maiswasser 20 g

Sojabohnenmehl 15 g

(NH₄)S₁SO₄ 6 g

MgSO₄-7 H₂O 0,85 g

Glukose 100 g

KHoPO₄ Ig

CaCO₃ 6 g

FeSO₄-7HoO 8,5 mg

ZnSO₄ -7H„O 42,5 mg

MnSO₄-4HoO 3,4 mg

CuSO₁-5 HoO 2,8 mg

COCl₂-OH₂O 1,7 mg

mit H₂O auf 1 Liter aufgefüllt

Der pH-Wert wurde mit Natrium auf pH 7,8 eingestellt. Die Sterilisation wurde 50 Minuten bei 120³C durchgeführt. Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,4. Die Fermentation wurde 150 Stunden bei 28°C durchgeführt. Bei der Isolierung betrug der pH-Wert der Fermentationsbrühe pH 6,0. Die antibiotische Endaktivität betrug 1600 y/ml Rifamycin SV.

Das Produkt wurde extrahiert, auf chromatographischem Wege gereinigt und dann kristallisiert, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Chromatographie wurde mit Silikagel (Merck 0,05 bis 0,20 mm) durchgeführt. Das rohe Rifamycin wurde in Aceton gelöst und dann mit einem Benzol-Aceton-Gemisch im Verhältnis 1 : 1 eluiert. Das auf diese Weise gereinigte Produkt zeigte die chemisch-physikalischen Eigenschaften von Rifamycin SV.

Schmelzpunkt: Zersetzungsbeginn bei 140²C. [\]o° = -3,9⁰C (c = 1 °/₀ in Methanol).

Das IR-Spektrum zeigte folgende Absorptionsbanden: 3440, 2920 (Nujol), 2850 (Nujol), 1700, 1658. 1605, 1545, 1464 (Nujol), 1415. 1375 (Nujol), 1325. 1290, 1260, 1218, 1197, 1164, 1125, 1115, 1102, 1083. 1050, 1020, 976. 962. 950, 930, 915, 898, 871, 845.

830, 801. 785, 772, 760, 750, 717, 703 cm"¹.

Das sichtbare und das UV-Spcktrum wurden mit Phosphatpuffer pH — 7.3 durchgeführt und zeigten Absorptionsmaxima bei 223,314 und 445 m/x.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces mediterrane: ATCC 21 271 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, unter aeroben submersen Bedingungen züchtet und die Fermentationslösung in üblicher Weise aufarbeitet.

   15

   In einer früheren Veröffentlichung (Antibiotics Annual, 1959/1960, S. 262) beschreibt Se η si et al. die Herstellung des Antibiotikums Rifamycin, das ftus einem Gemisch vieler Substanzen mit ähnlicher Struktur besteht, durch Fermentation eines Streptotnyces-mediterranei-Stammes. Als Interessanteste unter diesen Substanzen envies sich Rifamycin B: deswegen versuchte man, die Ausbeute zu verbessern. In »Appl. Microbiol«, S. 325 (1961), wird von Margalith tt al. eines der Forschungsergebnisse beschrieben; dort heißt es, daß sich die Ausbeute und die Reinheit von Rifamycin B durch Zusatz von Natriumdiäthylbarbiiurat zu der Fermentationsbrühe verbessern läßt. Eine weitere Veröffentlichung (S e η s i et al., 11 Farmaco, Ed. Sei., 16, S. 165) betrifft die Herstellung von Rifamycin SV, das eine der Komponenten der Rifamycin-Gattung darstellt, eine höhere antibakteriell Wirksamkeit besitzt und ein wichtiges Zwischenglied zur Synthese anderer Rifamycin-Derivate darstellt. Allgemein ausgedrückt, besteht das Verfahren darin, daß man Rifamycin B einer Reihe chemischer Prozesse unterwirft, während der es zuerst zu Rifamycin O oxydiert, dann zu Rifamycin S hydrolysiert und schließlich mit einem milden Reduktionsmittel in Rifamycin SV verwandelt wird. Diese Synthese ist offensichtlich sehr mühsam und bringt in den verschiedenen Stufen ziemlich schwer zu lösende praktische Probleme mit sich, verbunden mit wahrscheinlich häufig vorkommenden Verlusten desselben Antibiotikums. Aus wirtschaftlichen Überlegungen heraus suchte man nach einem einfacheren Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV.

   Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV ist dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces mideterranei ATCC 21271 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, unter aeroben submersen Bedingungen züchtet und die Fermentationslösung in üblicher Weise aufarbeitet.

   Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 wird eihalten, wenn man Streptomyces mediterranei der Wirkung physikalischer (z. B. UV-Strahlen), chemischer (Senfgas, N-methyl-N'-nitrosoguanidin) oder biologischer (z. B. Actinophage) Mutationsmittel aussetzt.

   Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 behält die ursprüngliche Taxonomie des Streptomyces mediterranei bei, und die seine Kultur betreffenden Eigenschaften sind praktisch die gleichen. Nur bei der Bildung des Luftmyzeliums und in der Farbe der löslichen Pigmente wurden einige Unterschiede beobachtet, nachdem Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 auf entsprechenden Nährboden gewachsen war. In der folgenden Tabelle werden die Eigenschaften des Streptomyces mediterranei ATCC 13 685 mit denen des Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 verglichen.

   Vergleich der Eigenschaften der Kulturen von Streptomyces mediterranei ATCC 13 685 und von Streptomyces mediterranei ATCC 21 271 auf mehreren Nährböden