DE19728954C1

DE19728954C1 - Saccharid-Konjugate, diese enthaltende pharmazeutische Mittel, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE19728954C1
Application number: DE19728954A
Authority: DE
Inventors: Peter Dr Mareski; Johannes Dr Platzek; Bernd Dr Raduechel; Dietmar Dr Berndorff; Hans-Joachim Dr Weinmann
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1997-06-30
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 1999-04-22
Anticipated expiration: 2017-07-01
Also published as: WO1999001160A1; AU8210998A

Description

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegen stand, das heißt Konjugate bestehend aus einem aminogruppen-enthaltenden Polymeren, Metallion(en) enthaltenden signalgebenden Gruppe(n) und Mono- oder Oligosacchariden sowie gegebenenfalls Kationen anorganischer und/oder organischer Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamide, diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Mittel, ihre Verwendung in der Diagnostik sowie Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und Mittel.

Lymphknotenmetastasen werden in ca. 50-70% der Patienten mit malignen Tumoren gefunden (Elke, M. Lymphknotenerkrankungen. In: W. Frommhold, H.- S. Stender and P. Thurn (eds.), Radiologische Diagnostik in Klinik und Praxis, 7th edition, Vol. IV, pp. 475-512, Stuttgart-New York: Georg Thieme Verlag, 1984). Die Beteiligung von Lymphknoten an einer malignen Erkrankung hat be deutenden Einfluß auf die einzuleitenden Therapiemaßnahmen. Die möglichst frühe und möglichst genaue Diagnose eines Lymphknotenbefalls ist daher für den Patienten von größter Bedeutung.

Die kontrastmittelunterstützte Lymphographie hat in der medizinischen Praxis jedoch bisher nur unbefriedigende Ergebnisse geliefert. Röntgenuntersuchun gen mit iodierten Ölen, z. B. mit iodierten Fettsäureestern des Mohnöls, zeigen einerseits zwar gute Speicherfähigkeiten in den Lymphknoten und eine brauch bare Kontrastwirkung, sind aber andererseits aufgrund ihrer bekannten Neben wirkungen (Keinert, K., Köhler, K., and Platzbecker, H., Komplikationen und Kontraindikationen. In: M. Lüning, M. Wiljasalo, and H. Weissleder (eds.), Lym phographie bei malignen Tumoren, pp. 40-50. Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1976) weder allgemein noch problemlos anwendbar. Sie können, insbesondere bei zu schneller Applikation, im Hinblick auf die leichte Verletzlichkeit der Lymphgefäße Läsionen begünstigen. Eine Reihe von Nachteilen sind im Öl charakter dieser Kontrastmittel begründet. Da die Suspendierung des Öls erst im Blut erfolgt, ist die Größe der Öltröpfchen nicht im voraus bestimmbar. Fallen die Öltröpfchen zu groß aus, sind häufig Mikroembolien, z. B. in der Lunge, un vermeidbar. Da die Aufnahme der großen Öltröpfchen aus dem interstitiellen Raum in die Lymphkapillaren kaum möglich ist, gelingt eine Darstellung der Lymphgefäße und Lymphknoten, beispielsweise nach subkutaner oder intra parenchymatöser Injektion, nur in Ausnahmefällen.

Der letztgenannte Nachteil ist nur durch endolymphatische Applikation zu überwinden, wobei jedoch eine ebenfalls nicht komplikationslose vorherige Farbstoffmarkierung und operative Freilegung der Lymphgefäße unter Lokal anästhesie in Kauf genommen werden muß. Ein weiterer Nachteil ist darin zu sehen, daß die Kontrastmittel auf Basis iodierter Öle nach erfolgter Applikation nur sehr langsam wieder ausgeschieden werden. In Abhängigkeit von der Zube reitungsform beträgt die Ausscheidungszeit Wochen bis Monate.

Durch Emulgieren der iodierten Öle hat man versucht, die aufgezeigten Nach teile zu überwinden. Dadurch wurde erreicht, die Viskosität und Tröpfchengröße zu verringern. Auf diese Weise konnte die Kapillarpassage verbessert und bei Stabilität der Emulsion das Embolisationsrisiko gesenkt werden. Diese Teil erfolge konnten jedoch nur durch andere Nachteile erkauft werden. Beispiels weise genannt seien in diesem Zusammenhang die effektive Reduktion des Iodgehalts pro ml Kontrastmittel und damit verbunden unausbleiblicher Kon trastverlust, größere Lokaltoxizität am Lymphknoten, hepatotoxische Effekte und histologisch nachweisbare Fremdkörperreaktion, die durch beigefügte Emulgatoren verstärkt werden.

Alle Kontrastmittel auf Basis iodierter Öle sind wenig stabil und aufgrund der dargestellten Nebenwirkungen nur begrenzt anwendbar. Auch die in der EP 0 022 056 als Lymphographika vorgeschlagenen Derivate der triiodierten 5- Aminoisophthalsäure haben in der medizinischen Praxis die in sie gesetzten Erwartungen nicht erfüllt, weil sie nach Applikation wieder aus dem Lymphge fäßsystem hinausdiffundieren. Aufgrund ihrer mangelhaften Speicherfähigkeit in den Lymphknoten sind diese wässrigen Zubereitungsformen bestenfalls be grenzt für die periphere Lymphographie geeignet.

Wasserlösliche iodierte Röntgenkontrastmittel wie Iotrolan (Isovist®) haben für die Darstellung des lymphatischen Systems nur einen eingeschränkten Anwen dungsbereich. Mittels Infusion in den interstitiellen Raum (intrakutan, subkutan bzw. intramuskulär) werden ebenfalls nur die im Einzugsbereich der Infusions stelle befindlichen Lymphgefäße bzw. -knoten kontrastreich dargestellt. Die hochwasserlöslichen, niedermolekularen Substanzen diffundieren anschließend aus den Lymphgefäßen in das Interstitium. Dieser Nachteil kann auch nicht durch die empfindliche Methode der Computertomographie kompensiert wer den.

In der Nuklearmedizin werden radioaktive ^99mTc-Tracer für die indirekte Lymph knoten-Darstellung eingesetzt. Neben der limitierten räumlichen Auflösung gel ten auch hier die Nachteile, daß nur die die Injektionsstelle versorgenden Lymphbahnen dargestellt werden.

Als Lymphographika für die Kernresonanztomographie sind auch superpara magnetische Eisenoxidpartikel, z. B. AMI-227, vorgeschlagen worden (Guimaraes, R., Clement, O., Bittoun, J., Carnot, f., and Frija, G. MR lympho graphy with superparamagnetic iron nanoparticles in rats: pathologic basis for contrast enhancement. Am. J. Roentgenol., 162, 201-207, 1994). Die bisher am Tier gewonnenen Untersuchungsergebnisse weisen jedoch auf eine unbefriedi gende Bildgebung trotz hoher Dosierung der Partikel hin.

Verschiedene als Lymphographika vorgeschlagene Verbindungen (Hanka, L. et al., Radiology 1996, 198, 365-370) zeigen eine derartige Tierspezifität (Ratte vs. Meerschweinchen und Kaninchen), daß ihre Weiterentwicklung eingestellt wer den mußte.

Es bestand daher weiterhin die Aufgabe, Verbindungen zur Verfügung zu stel len, die sich nach parenteraler Applikation im Lymphgewebe anreichern und die oben genannten Nachteile nicht besitzen, z. B. gegenüber den bekannten Strukturen einen günstigeren Sicherheitsabstand zwischen diagnostischer und letaler Dosis ("margin of safety") aufweisen. Diese Aufgabe wird durch die vor liegende Erfindung gelöst.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Konjugate bestehend aus ei nem aminogruppen-enthaltenden Polymeren, Metallion(en) enthaltenden si gnalgebenden Gruppe(n) und Mono- oder Oligosaccharide sowie gegebenen falls Kationen anorganischer und/oder organischer Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamide sich überraschenderweise hervorragend zur Herstellung von NMR-Diagnostika, insbesondere für die Lymphographie eignen.

So weisen sie überraschenderweise folgende Vorteile auf:

- eine für eine gute Bildgebung ausreichende Anreicherung im Lymph system,
- eine hohe Verträglichkeit (LD₅₀),
- eine geringe Ausscheidungszeit (sie werden in der Regel innerhalb von 14 Tagen zu mehr als 98% aus dem Körper ausgeschieden),
- ihre hohe Relaxivität erlaubt es, sie in geringer Dosierung zu applizieren,
- sie ermöglichen oft sogar eine morphologische Differenzierung des Lymphknotengewebes,
- sie zeigen keine abweichenden Tierspezifitäten.

Die erfindungsgemäßen Konjugate lassen sich durch die allgemeine Formel I beschreiben:

P (K)_m (L-Z)_n(I),

worin

P für ein k Aminogruppen - von denen (n + m) jeweils um ein Wasserstoff atom vermindert sind - enthaltendes Polymer, wobei (n + m) ≦ k sein soll,
n und m jeweils für die ganzen Zahlen 1-149,
k für die Zahlen 12 bis 150,
K für eine Metallion(en) enthaltende signalgebende Gruppe,
L für einen Linker und
Z für ein um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid stehen.

Das für P stehende, k Aminogruppen enthaltende, von denen (n + m) jeweils um ein Wasserstoffatom vermindert sind, Polymer ist ein Dendrimer (z. B. WO 96/01655, EP 0271180), Polylysin (z. B. EP 0331616), Polypeptid, Poly alkylamin, Poly[N-(2-aminoethyl)]methacrylamid (z. B. US-5,364,613) oder Poly saccharid (z. B. EP 0535668). Bevorzugt ist die Summe (n + m) der signalge benden Gruppen (K) und der über L gebundenen jeweils um eine Hydroxyl gruppe verminderten Mono- oder Polysaccharide (Z) gleich der Anzahl k der im Polymeren enthaltenen Aminogruppen, d. h. es liegt eine vollständige Besetzung der in P enthaltenen Aminogruppen vor. Die Polymere enthalten bevorzugt 12, 24, 32, 36, 40, 48, 64 oder 80 Aminogruppen, von denen z. B. 3, 4, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 16, 18, 19, 21, 47 an signalgebende Gruppen K und z. B. 9, 8, 18, 17, 16, 13, 11, 10, 20, 6, 29, 27, 33 an über L gebundene jeweils um eine Hy droxylgruppe verminderte Mono- oder Polysaccharide Z gebunden sind.

Bei einer Unterbesetzung der Aminogruppen ist die Summe (n + m) bevorzugt ≧ k - 4.

Die signalgebende Gruppe K ist ein Chelatkomplex bestehend aus einem Rest der allgemeinen Formel II, III, IV, V oder VI.

worin
R¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Metallionen äquivalent der Elemente der Odnungszahlen 20-32, 37-39, 42-44, 49 oder 57-83,
R² ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten C₁-C₇- Alkylrest, einen Phenyl- oder Benzylrest,

mit
o in der Bedeutung der Zahlen 0-10,
p und I jeweils in der Bedeutung der Ziffern 0 oder 1, mit der Maßgabe, daß p nur dann für die Ziffer 1 steht, wenn I die Ziffer 1 bedeutet,
T¹ eine -NHCS- oder -CO-gruppe,
U eine -CHR³-CONR³-M¹- oder -CH₂-CH(OH)-M²-gruppe mit R³ unabhängig voneinander in der Bedeutung von R2 oder der Gruppe -CH₂-(CH₂)_o- COOH und M¹ und M² jeweils in der Bedeutung eines Phenylenrestes oder einer geradkettigen, verzweigten, gesättigten oder ungesättigten C₁-C₂₀- Alkylenkette, die gegebenenfalls substituiert ist durch 1-5 (CH₂)_o-COOH, 1-5 OR²-reste oder 1-8 Sauerstoffatome, 1-2-NH-, 1-2-C(=NH)-, 1-5- CONR³-, 1-5-NR³CO-, 1-2 Phenylen- oder 1-2 Phenylenoxygruppen ent hält, bedeuten, mit der Maßgabe, daß mindestens zwei der Rest R¹ für Metallionenäquivalente der Elemente der oben genannten Ordnungszahlen stehen.

Ist die erfindungsgemäße Verbindung zur Anwendung in der NMR-Diagnostik bestimmt, so muß das Metallion der signalgebenden Gruppe paramagnetisch sein. Dies sind insbesondere die zwei- und dreiwertigen Ionen der Elemente der Ordnungszahlen 21-29, 42, 44 und 58-70. Geeignete Ionen sind beispiels weise das Chrom(III)-, Eisen(II)-, Kobalt(II)-, Nickel(II)-, Kupfer(II)-, Praseo dym(III)-, Neodym(III)-, Samarium(III)- und Ytterbium(III)-ion. Wegen ihres star ken magnetischen Moments sind besonders bevorzugt Gadolini um(III)-, Terbium(III)-, Dysprosium(III)-, Holmium(III)-, Erbium(III)-, Eisen(III)- und Mangan(II)-ionen.

Für die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in der Nuklear medizin muß das Metallion radioaktiv sein. Geeignet sind zum Beispiel Radio isotope der Elemente Kupfer, Kobalt, Gallium, Germanium, Yttrium, Strontium, Technetium, Indium, Ytterbium, Gadolinium, Samarium, Iridium, Rhenium und Bismut; bevorzugt sind Technetium, Gallium, Indium und Rhenium.

Ist die erfindungsgemäße Verbindung zur Anwendung in der Röntgen-Diagno stik bestimmt, so leitet sich das Metallion vorzugsweise von einem Element hö herer Ordnungszahl ab, um eine ausreichende Absorption der Röntgenstrahlen zu erzielen. Es wurde gefunden, daß zu diesem Zweck diagnostische Mittel, die ein physiologisch verträgliches Komplexsalz mit Metallionen von Elementen der Ordnungszahlen 25 und 26 sowie 57-83 enthalten, geeignet sind.

Bevorzugt sind Mangan(II)-, Eisen (II)-, Eisen(III)-, Praseodym(III)-, Neo dym(III)-, Samarium(III)-, Gadolinium(III)-, Ytterbium(III)- oder Bismut(III)-ionen, insbesondere Dysprosium(III)-ionen.

In R¹ gegebenenfalls vorhandene acide Wasserstoffatome, das heißt diejeni gen, die nicht durch das Zentralion substituiert worden sind, können gegebe nenfalls ganz oder teilweise durch Kationen anorganischer und/oder organi scher Basen oder Aminosäuren oder Aminosäureamide ersetzt sein.

Geeignete anorganische Kationen sind beispielsweise das Lithiumion, das Kaliumion, das Calciumion und insbesondere das Natriumion. Geeignete Kat ionen organischer Basen sind unter anderem solche von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie zum Beispiel Ethanolamin, Diethanolamin, Morpho lin, Glucamin, N,N-Dimethylglucamin und insbesondere N-Methylglucamin. Ge eignete Kationen von Aminosäuren sind beispielsweise die des Lysins, des Ar ginins und des Ornithins sowie die Amide ansonsten saurer oder neutraler Aminosäuren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die ein Molekulargewicht von 5.000- 200.000 D, vorzugsweise 15.000-60.000 D, besitzen, weisen die eingangs ge schilderten gewünschten Eigenschaften auf. Sie enthalten die für ihre Verwen dung benötigte große Anzahl von Metallionen im Komplex stabil gebunden.

Sie reichern sich im Lymphsystem an, erlauben Aussagen über die Perfusion von Geweben, geben die Möglichkeit, das Blutvolumen in Geweben zu bestim men und die Relaxationszeiten bzw. Densitäten des Blutes selektiv zu verkür zen. Solche physiologischen Informationen sind nicht durch den Einsatz von extrazellulären Kontrastmitteln, wie z. B. Gd-DTPA [Magnevist®], zu erhalten. Aus diesen Gesichtspunkten ergeben sich auch die Einsatzgebiete bei den mo dernen bildgebenden Verfahren Kernspintomographie und Computertomogra phie: spezifischere Diagnose von metastasierenden, insbesondere malignen Tumoren und frühe Therapiekontrolle bei zytostatischer, antiphlogistischer oder vasodilatativer Therapie.

Die erfindungsgemäßen Saccharid-Polymer-Komplexe eignen sich hervorra gend für die interstitielle und besonders für die i. v. Lymphographie.

Als weitere Vorteile gegenüber extrazellulären Kontrastmitteln, wie z. B. Gd- DTPA [Magnevist®], muß die höhere Effektivität als Kontrastmittel für die Kern spintomographie (höhere Relaxivität) hervorgehoben werden, was zu einer deutlichen Reduktion der diagnostisch notwendigen Dosis führt. Gleichzeitig können die erfindungsgemäßen Kontrastmittel als Lösungen isoosmolar zum Blut formuliert werden und verringern dadurch die osmotische Belastung des Körpers, was sich in einer verringerten Toxizität der Substanz (höhere toxische Schwelle) niederschlägt. Geringere Dosen und höhere toxische Schwelle führen zu einer signifikanten Erhöhung der Sicherheit von Kontrastmittelanwendungen bei modernen bildgebenden Verfahren.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß nunmehr Kom plexe mit hydrophilen oder lipophilen, makrocyclischen oder offenkettigen, nie dermolekularen oder hochmolekularen Liganden zugänglich geworden sind. Dadurch ist die Möglichkeit gegeben, Verträglichkeit und Pharmakokinetik die ser Polymer-Komplexe durch chemische Substitution zu steuern.

Bevorzugte Substituenten für R² sind das Wasserstoffatom, die Methyl-, Iso propyl-, Phenyl- und Benzylgruppe. Als für V stehende bevorzugte Gruppen seien beispielhaft genannt die CH₂C₆H₄-, CH₂-O-C₆H₄-, (CH₂)₄-, (CH₂)₆- und (CH₂)₁₀-Gruppe, wobei die C₆H₄-gruppe an T¹ gebunden ist.

Bevorzugte Substituenten für R³ sind das Wasserstoffatom, die Methyl-, CH₂COOH- und (CH₂)₂COOH-Gruppe.

Als Gruppen M¹ seien beispielhaft genannt

wobei α die Verknüpfungsstelle an den Rest -CONR³ und β die Verknüpfungs stelle an T¹ angibt.

Bevorzugt sind die Gruppen:

Als Gruppen M² seien beispielhaft genannt:

wobei α die Verknüpfungsstelle an den Rest -CH(OH)- und β die Verknüpfungs stelle an T¹ angibt.

Bevorzugt sind die Gruppen:

Besonders bevorzugt ist die Gruppe:

Als Gruppen Z seien für die Monosaccharide die jeweils um eine Hydroxylgrup pe verminderten Hexosen, Pentosen und N-Acetyl-neuraminsäure, die jeweils in der Pyranose- oder Furanose-Form vorliegen, sowie deren Derivate genannt. Bevorzugt sind Hexosen, die in der Pyranose-Form vorliegen, wie z. B. D-Ga lactose, D-Mannose, D-Glucose, L-Fucose, Galactose-6-sulfat, Mannose-6-sul fat, D-Glucosamin-6-sulfat, D-Glucosamin-3,4,6-trisulfat und N-Acetyl glucosamin. Als bevorzugte Monosaccharide seien beispielhaft die N-Acetyl-2- amino-2-deoxy-D-glucose, -D-Galactose und D-Mannose, die 6-Deoxy-L-Ga lactose sowie N-Acetyl-neuraminsäure aufgeführt. Steht Z für Oligosaccharide, so können diese linear oder verzweigt aus den oben genannten Monosacchari den aufgebaut sein, wobei die Verknüpfung terminal oder innerhalb der Kette erfolgt sein kann. Als Oligosaccharide seien beispielhaft genannt: Sialyl-Lewis^x (s. z. B. H. Ohmoto et al, J. Med. Chem. 1996, 39, 1339); Desoxy-Sialyl-Lewis^x (s. z. B. W. Stahl et al, Angew. Chemie 1994, 106, 2186); Sialyl-Le^x (s. z. B. W. Stahl, J. prak. Chemie 1995, 337, 441); Gentiobiose (Fluka Chemie AG, Schweiz); Lactose; Maltose; Lactulose (Fluka Chemie AG, Schweiz); LactNAc; N,N',N"-Triacetylchitotriose; Gal(1 4)Gal, N,N'-Diacetylchitobiose; N,N',N",N'''-Tetraacetylchitotetraose; Maltotriose; Digalacturonsäure; Trigalactu ronsäure (Carbohydrates International AB, Schweden).

Bevorzugt erfolgt die Bindung des Polymeren (über den Linker L) an die Mono- oder Polysaccharide über die C-2-Position, besonders bevorzugt über die C-1- Position der Zucker.

Der Linker L, über den die jeweils um eine Hydroxylgruppe verminderten Mono- oder Oligosacchaide an P gebunden sind, wird durch die Gruppe T²-M³-X be schrieben, wobei M³ für eine direkte Bindung steht oder die für M¹ angegebene Bedeutung hat, T² für eine -NHCS-, -C(=NH)-, -CH₂- oder CO-gruppe steht und an P bindet, X für NH, CO, O und S steht und an Z bindet. Als M³ seien bei spielsweise die Gruppen

genannt, wobei γ die Verknüpfungsstelle an X und δ die Verknüpfungsstelle an T² angibt.

Bevorzugt steht M³ für eine direkte Bindung und für die Gruppen

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate der allgemeinen Formel I erfolgt in an sich bekannter Weise, daß

a) ein Polymer-Komplex(bildner)-Konjugat der allgemeinen Formel VII
P(K')_m(VII),
worin
K' für einen Rest der allgemeinen Formel II', III', IV', V' oder VI'
worin
R^1' unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine Säureschutzgruppe oder ein Metallionenäquivalent der Elemente der Ordnungszahlen 20-29, 39, 42, 44 oder 57-83 steht und
R², V, o, p, T¹ und U die oben genannte Bedeutung haben, mit n' Mono- oder Oligosacchariden der allgemeinen Formel VIII
L*-Z' (VIII),
worin
n' = 1-3 n,
Z' die für Z genannte Bedeutung hat, wobei jedoch die in Z gegebenenfalls enthaltenen Carboxy-, Amino- und Hydroxygruppen gegebenenfalls ge schützt sind,
L* für eine Gruppe T^2'-M^3'-X mit
T^2' in der Bedeutung von -NCS, -C(=NH)OCH₃, -CHO, einer -CO-Fg-gruppe
wobei
Fg für -Cl, -F, -OH,
-N_3'-O-CO-R⁴ mit R⁴ in der Bedeutung einer geradkettigen oder verzweigten C₁-C₇-Alkylkette,
M^3' die für M³ angegebene Bedeutung hat, wobei jedoch die in M³ gegebenen falls enthaltenen Carboxygruppen gegebenenfalls geschützt sind, und
X für NH, CO, O und S steht,
oder
b) ein Polymersaccharid-Konjugat der allgemeinen Formel IX
P(L'-Z')_n(IX),
worin
L' die für L genannte Bedeutung hat, wobei jedoch die in L gegebenenfalls enthaltenen Carboxygruppen gegebenenfalls geschützt sind und
P, Z' und n die oben genannte Bedeutung haben, mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K*, wobei m' = 1-3 m ist und K* für Verbindungen der allgemeinen Formeln
worin
R^1', R², V, U und Fg die oben genannte Bedeutung haben, und
T^1' für -NCS, -CO-Fg, -C(=NH)OCH₃ oder -CHO steht oder
c) ein Polymer der allgemeinen Formel X
P-(H)_k(X),
worin
P und k die oben angegebenen Bedeutungen haben, in einer Eintopfreaktion mit n' Mono- oder Oligosacchariden der allgemeinen Formel VIII
L*-Z' (VIII),
worin
n', L* und Z' die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K*, wobei K* für Verbindungen der allgemeinen For meln

worin m', R^1'

, R²

, V, T^1'

, und Fg die oben genannte Bedeutung haben, umge setzt wird, wobei die gegebenenfalls notwendige Metallioneneinführung vor oder nach der gegebenenfalls notwendigen Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt, mit der Maßgabe, daß, falls R^1'

für Schutzgruppen steht, diese vor der Metall ioneneinführung abzuspalten sind.

Falls R^1' für eine Säureschutzgruppe steht bzw. falls die in L', M^3' und Z' enthal tenen Caboxygruppen geschützt sind, kommen niedere Alkyl-, Aryl- und Aralkylgruppen, beispielsweise die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Phenyl-, Ben zyl-, Diphenylmethyl-, Triphenylmethyl-, bis-(p-Nitrophenyl)-methylgruppe, sowie Trialkylsilylgruppen in Frage.

Die gegebenenfalls gewünschte Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Verfahren (s. z. B. E. Wünsch, Methoden der Org. Chemie, Houben-Weyl, Bd XV/1, 4. Auflage 1974, S. 315), beispielsweise durch Hydrolyse, Hydrogenolyse, alkalische Verseifung der Ester mit Alkali in wäßrig-alkoholischer Lösung bei Temperaturen von 0°C bis 50°C, saure Ver seifung mit Mineralsäuren oder im Fall von tert.-Butylestern mit Hilfe von Tri fluoressigsäure.

Als Hydroxyschutzgruppen kommen z. B. die Benzyl-, 4-Methoxybenzyl-, 4-Ni trobenzyl-, Trityl-, Diphenylmethyl-, Trimethylsilyl-, Dimethyl-t-butyl-silyl-, Di phenyl-t-butysilylgruppe in Frage. Als Schutzgruppe für die 1-OH-Gruppe der Mono- und/oder Oligosaccharide ist auch die Methylgruppe geeignet.

Die Hydroxygruppen können auch z. B. als THP-Ether, Alkylether, α-Al koxyethylether, MEM- und MOM-Ether oder als Ester mit aromatischen oder ali phatischen Carbonsäuren, wie z. B. Essigsäure und Chloressigsäure, Benzoe säure, Levulinsäure oder 2-Chloracetoxymethyl (bzw. ethyl)benzoesäure (GIT Fachz. Lab. 1996, 46) vorliegen. Im Falle von Polyolen können die Hydroxy gruppen auch in Form von Ketalen mit z. B. Aceton, Acetaldehyd, Cyclohexanon oder Benzaldehyd geschützt sein.

Bei gleichzeitigem Vorliegen von Carboxylgruppen können Hydroxygruppen auch durch intramolekulare Veresterung zu den entsprechenden Lactonen ge schützt vorliegen.

Die Hydroxyschutzgruppen können nach den dem Fachmann bekannten Litera turmethoden, z. B. durch Hydrogenolyse, reduktive Spaltung mit Lithi um/Ammoniak, Säurebehandlung der Ether und Ketale oder Alkalibehandlung der Ester freigesetzt werden (siehe z. B. "Protective Groups in Organic Synthe sis", T. W. Greene, John Wiley and Sons 1981).

Als Aminschutzgruppen seien die dem Fachmann geläufigen Benzyloxycar bonyl-, tertiär-Butoxycarbonyl-, Trifluoracetyl-, Fluorenylmethoxycarbonyl-, Ben zyl-, Formyl-, 4-Methoxybenzyl-, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl-, Phthaloyl-, 1,2- Oxazolin-, Tosyl-, Dithiasuccinoyl-, Allyloxycabonyl-, Sulfat-, Pent-4-encarbonyl-, 2-Chloracetoxymethyl (bzw. -ethyl) benzoyl-, Tetrachlorphthaloyl-, Alkyloxycar bonyl-gruppen [Th. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Syntheses, 2nd ed, John Wiley and Sons (1991), S. 309-385, E. Meinjohanns et al, J. Chem. Soc. Pekin Trans 1, 1995, 405; U. Ellensik et al, Carbohydrate Research 280, 1996, 251; R. Madsen et al, J. Org. Chem. 60, 1995, 7920, R. R. Schmidt, Tetrahedron Letters 1995, 5343].

Die unter a) angegebene Umsetzung erfolgt nach den dem Fachmann geläufi gen Methoden wie sie z. B. in P. Erbacher et al, Bioconjugate Chem. 1995, 6, 401; G. Molema et al, J. Med. Chem. 1991, 34, 1137; J. L. Montero et al, Bull. Soc. Chim. France, 1994, 131, 854; P. Midoux et al, Nucleic Acids Research 1993, 21, 871; M. Andersson et al, Bioconjugate Chem. 1993, 4, 246; R. Roy et al, Tetrahedron Letters 1995, 36 4377; U. K. Saha et al, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1995, 2571; C. R. McBroom et al, Methods Enzymol. 1972, 28, 212 be schrieben werden. Sie wird in Lösungsmitteln wie z. B. Wasser, Methylenchlorid, Acetonitril, Chloroform, DMSO, Pyridin, Ethanol/Wasser, Ethanol/Acetonitril, Di oxan, DMF, THF, niedere Alkohole, Tetramethylharnstoff, N-Methylpyrrolidon, Polyethylenglykole, 12-Dimethoxyethan, Dimethylacetamid, 1,2-Dichlorethan oder - falls möglich - deren Mischungen mit Wasser bei Temperaturen von -10° C bis 100°C, bevorzugt 0 bis 50°C, besonders bevorzugt bei Raumtemperatur innerhalb von 5 Minuten bis 72 Stunden, bevorzugt 1 bis 24 Stunden, beson ders bevorzugt 1 bis 14 Stunden, gegebenenfalls unter Zusatz einer organi schen oder anorganischen Base, wie z. B. aromatischen oder aliphatischen Aminen, Alkali- oder Erdalkali-hydroxiden, -carbonaten oder -hydrogencarbona ten und quartären Ammoniumhydroxiden durchgeführt. Beispielhaft genannt seien Triethylamin, Di-isopropyl-N-ethylamin (Hünig-Base), N-Methylmorpholin, Tributylamin, Tetramethylethylendiamin, Pyridin, Lutedin, 2,4,6-Trimethylpyridin, 4-Dimethylaminopyridin, N-Methylimidazol, Tetramethylguanidin, DBU, Lithium-, Natrium-, Kalium, Calcium, Magnesium-, Barium-hydroxid, -carbonat, -hydro gencarbonat. Die Umsetzung kann auch in den dem Fachmann bekannten Pufferlösungen, vorzugsweise bei pH 8 bis 11, besonders bevorzugt bei pH 8,5 bis 9 erfolgen. Die pH-Wert-Einhaltung erfolgt bevorzugt unter Verwendung ei nes pH-Staten. Steht T^2' für eine CHO-Gruppe so wird eine Kupplung durch reduktive Aminierung unter Zuhilfenahme eines Reduktionsmittels nach dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt (J.-P. Sabri et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 1181; M. D. Bomann et al, J. Org. Chem. 1995, 60, 5995; S. Bhattacharyya et al, J. Chem. Soz. Pekin Trans. I 1994, 1; O. S. Artyushin et al., Ser. Khim 1991, 9, 2154; R. F. Borch et al, JACS 1971, 93 2897). Als Reduk tionsmittel dienen z. B. Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Lithiumbor hydrid, Calciumborhydrid, Pyridin-BH₃, Lithiumaluminiumhydrid und Zinkbor hydrid. Auch eine katalytische Hydrierung an z. B. Palladium oder Nickelkataly sator ist geeignet.

Steht Fg für eine OH-Gruppe, so kann auch eine in-situ Aktivierung mit den dem Fachmann bekannten Kupplungs-Reagenzien wie z. B. DCCI, EEDQ, Staab- Reagenz, BOP, PyBOP, TBTU, TDBTU, HBTU (s. z. B. Fournic-Zaluski et al, J. Med. Chem. 1996, 39, 2596; Houben-Weyl, Band XV/2, Teil II, 1974; Y. M. An gell et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 5981; L. A. Carpino et at, J. Chem. Soc. Commun. 1994, 201; H-O. Kim et al, Tetrahedron Letters 1995, 36, 6013; D. Papaioannou et al, Tetrahedron Letters, 1995, 36, 5187, G. Stemple et al, Bioorg. Med. Letters 1996, 6, 55; durchgeführt werden.

Die unter b) angegebene Reaktion des Polymersaccharid-Konjugats der allge meinen Formel IX mit den Komplexen oder Komplexbildnern K* der allgemeinen Formel II" bis VII" und II'a erfolgt ebenfalls in an sich bekannter Weise wie z. B. beschrieben in US-5,135,737, H. Takalo et al, Bioconjugate Chem. 1994, 5 278; EP 0430863; EP 0331616; WO 96/01655; EP 0271 180; US-5,364,613; WO 95/17451 und WO 96/02669. Sie wird in Lösungsmitteln wie z. B. Wasser, Methylenchlorid, Acetonitril, Chloroform, DMSO, Pyridin, Ethanol/Wasser, Ethanol/Acetonitril, Dioxan, DMF, THF, niedere Alkohole, Tetramethylharnstoff, N-Methylpyrrolidon, Polyethylenglykole, 12-Dimethoxyethan, Dimethylacetamid, 1,2-Dichlorethan oder - falls möglich - deren Mischungen mit Wasser bei Tem peraturen von -10°C bis 100°C, bevorzugt 0 bis 50°C, besonders bevorzugt bei Raumtemperaturen innerhalb von 5 Minuten bis 72 Stunden, bevorzugt 1 bis 24 Stunden, besonders bevorzugt 1 bis 14 Stunden, gegebenenfalls unter Zu satz einer organischen oder anorganischen Base, wie z. B. aromatischen oder aliphatischen Aminen, Alkali- oder Erdalkali-hydroxiden, -carbonaten oder -hydrogencarbonaten und quartären Ammoniumhydroxiden durchgeführt. Bei spielhaft genannt seien Triethylamin, Di-isopropyl-N-ethylamin (Hünig-Base), N- Methylmorpholin, Tributylamin, Tetramethylethylendiamin, Pyridin, Lutedin, 2,4,6-Trimethylpyridin, 4-Dimethylaminopyridin, N-Methylimidazol, Tetramethyl guanidin, DBU, Lithium-, Natrium-, Kalium, Calcium-, Magnesium-, Barium-hy droxid, -carbonat, -hydrogencarbonat. Die Umsetzung kann auch in den dem Fachmann bekannten Pufferlösungen, vorzugsweise bei pH 8 bis 11, besonders bevorzugt bei pH 8,5 bis 9 erfolgen. Die pH-Wert-Einhaltung erfolgt bevorzugt unter Verwendung eines pH-Staten. Steht T^2' für eine CHO-Gruppe so wird eine Kupplung durch reduktive Aminierung unter Zuhilfenahme eines Reduk tionsmittels nach dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt (J.-P. Sabri et al, Tetrahedron Letters 1994, 35, 1181; M. D. Bomann et al, 7. Org. Chem. 1995, 60, 5995; S. Bhattacharyya et al, J. Chem. Soz. Pekin Trans. I 1994, 1; O. S. Artyushin et al., Ser. Khim 1991, 9, 2154; R. F. Borch et al, JACS 1971, 93 2897). Als Reduktionsmittel dienen z. B. Natriumborhydrid, Natriumcyanobor hydrid, Lithiumborhydrid, Calciumborhydrid, Pyridin-BH₃, Lithiumaluminium hydrid und Zinkborhydrid. Auch eine katalytische Hydrierung ist geeignet.

Die unter a) und b) angegebenen Reaktionen erfolgen vorzugsweise mit einem Überschuß des aktivierten Saccharids der Formel VIII bzw. des aktivierten Komplexes bzw. Komplexbildners K*, vorzugsweise mit einem 1,5- bis 3fachen Überschuß.

Die unter c) angegebene Eintropfreaktion erfolgt unter den unter a) und b) an geführten Reaktionsbedingungen, indem man ein Polymer der allgemeinen Formel X mit einem Gemisch aus m' = 1-3 m K* und n' = 1-3 n L*-Z' umsetzt. Das Besetzungsverhältnis der im Polymer enthaltenen Aminogruppen wird durch das Verhältnis n' : m' gesteuert.

Die nach den oben angegebenen Umsetzungen a)-c) notwendige bzw. bereits in K' oder K* erfolgte Metallioneneinführung geschieht in der Weise, wie sie z. B. in der Deutschen Offenlegungsschrift 34 01 052 offenbart worden ist, indem man das Metalloxid oder ein Metallsalz (beispielsweise das Nitrat, Acetat, Car bonat, Chlorid oder Sulfat) des Elements der Ordnungszahlen 20-32, 37-39, 42-44, 49, 57-83 in Wasser und/oder einem niederen Alkohol (wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol) löst oder suspendiert und mit der Lösung oder Sus pension der äquivalenten Menge des komplexbildenden Liganden umsetzt und anschließend, falls gewünscht, vorhandene acide Wasserstoffatome der Säure gruppen durch Kationen von anorganischen und/oder organischen Basen, Aminosäuren oder Aminosäureamiden substituiert.

Die Neutralisation erfolgt dabei mit Hilfe anorganischer Basen (z. B. Hydroxiden, Carbonaten oder Bicarbonaten) von z. B. Natrium, Kalium, Lithium, Magnesium oder Calcium und/oder organischer Basen wie unter anderem primärer, sekun därer und tertiärer Amine, wie z. B. Ethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Me thyl- und N,N-Dimethylglucamin, sowie basischer Aminosäuren, wie z. B. Lysin, Arginin und Ornithin oder von Amiden ursprünglich neutraler oder saurer Aminosäuren, wie z. B. Hippursäure, Glycinacetamid.

Zur Herstellung der Komplexverbindungen kann man beispielsweise den sauren Komplexsalzen in wäßriger Lösung oder Suspension so viel der gewünschten Basen zusetzen, daß der Neutralpunkt erreicht wird. Die erhaltene Lösung kann anschließend im Vakuum zur Trockne eingeengt werden. Häufig ist es von Vorteil, die gebildeten Neutralsalze durch Zugabe von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie z. B. niederen Alkoholen (Methanol, Ethanol, Isopropanol und andere), niederen Ketonen (Aceton und andere), polaren Ethern (Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyethan und andere) auszufällen und so leicht zu isolierende und gut zu reinigende Kristallisate zu erhalten. Als beson ders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die gewünschte Base bereits während der Komplexbildung der Reaktionsmischung zuzusetzen und dadurch einen Verfah rensschritt einzusparen.

Enthalten die sauren Komplexverbindungen mehrere freie acide Gruppen, so ist es oft zweckmäßig, neutrale Mischsalze herzustellen, die sowohl anorganische als auch organische Kationen als Gegenionen enthalten.

Dies kann beispielsweise geschehen, indem man den komplexbildenden Ligan den in wäßriger Suspension oder Lösung mit dem Oxid oder Salz des das Zentralion liefernden Elements und der Hälfte der zur Neutralisation benötigten Menge einer organischen Base umsetzt, das gebildete Komplexsalz isoliert, es gewünschtenfalls reinigt und dann zur vollständigen Neutralisation mit der be nötigten Menge anorganischer Base versetzt. Die Reihenfolge der Basen zugabe kann auch umgekehrt werden.

Die Reinigung der so erhaltenen Polysaccharid-Konjugate erfolgt, gegebenen falls nach Einstellung des pH-Wertes durch Zusatz einer Säure oder Base auf pH 6 bis 8, bevorzugt ca. 7, vorzugsweise durch Ultrafiltration mit Membranen geeigneter Porengröße (z. B. Amicon-®XM30, Amicon®-YM10, Amicon®-YM3) oder Gelfiltration an z. B. geeigneten Sephadex®-Gelen.

Im Falle von neutralen Verbindungen ist es häufig von Vorteil, die polymeren Komplexe über einen Anionenaustauscher, beispielsweise IRA 67 (OH^--Form) und gegebenenfalls zusätzlich über einen Kationenaustauscher, beispielsweise IRC 50 (H⁺-Form) zur Abtrennung ionischer Komponenten zu geben.

Die Herstellung der als Ausgangssubstanzen benötigten Polymer-kom plex(bildner)-Konjugate der allgemeinen Formel VII

P(K')_m(VII)

und der Polymersaccharid-Konjugate der allgemeinen Formel IX

P(L'-Z')_n(IX)

erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man ein Polymer der allgemeinen Formel X

P-(H)_k(X)

mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K* der allgemeinen Formeln II"-VI" und II'a bzw. mit N' aktivierten Mono- oder Oligosacchaiden der allgemeinen Formel VIII

L*-Z' (VIII)

unter den oben unter a) und b) angegebenen Reaktionsbedingungen umsetzt.

Die Polymere der allgemeinen Formel X können in Form der freien Amine oder in Form ihrer Salze, z. B. als Hydrochloride, Hydrobromide oder Hydrosulfate eingesetzt werden. Sie sind literaturbekannt (z. B. Polylysin: EP 0331 616; Den drimere: WO 96/01655, EP 0271 180, EP 0430863, Polypeptid, Polyallylamin, Poly[N-(2-aminoethyl)] methacrylamid: US-5,364,613; Polysaccharid: V. D. Nadkarni et al, Carbohydrate Research 1996, 290, 87, E. A. Yates et al, Carbo hydrate Research 1996, 294, 15, D. J. Tyrrell et al, TiPS 1995, 16, 198, JP- Patentschrift 06080705-A).

Die verwendeten Komplexe bzw. Komplexbildner K* sind literaturbekannt oder analog literaturbekannten Methoden erhältlich:

II" und II'a: s. z. B. EP 263 059,
III": s. z. B. DE 195 07 822, DE 195 80 858, DE 195 07 819
IV": s. z. B. WO 91/14459
V": s. z. B. US-5,053,503, WO 96/02669, WO 96/01655, EP 0430863, EP 255471, US-5,277,895, EP 0232751, US-4,885,363
VI": s. z. B. US-4,923,985

Die als Edukte benötigten Mono- und Oligosaccharide der allgemeinen Formel VIII sind ebenfalls literaturbekannt oder analog literaturbekannten Methoden er hältlich (s. auch experimentellen Teil): s. z. B. EP 0 128097; A. J. Jonas et al. Biochem. J. 1990, 268, 41; JP-Patentschrift 04211099; D. H. Buss et al, J. Chem. Soc. C. 1968, 1457; C. M. Hilditch et al, J. Appl. Phycol. 1991, 3, 345; M. Monsigny et al, Biol. Cell 1984, 51, 187; E. P. Dubois et al, Bioorganic and Me dicinal Chemistry Letters 1996, 6, 1387; C. R. McBroom et al, Methods Enzymol. 1972, 28, 212, M. Ponpipom et al, J. Med. Chem. 1981, 24, 1388; J. Haensler et al, Bioconjugate Chem. 1993, 4, 85; Y. Miura et al, Carbohydrate Research 1996, 289, 193; R. Roy et al. Tetrahedron Letters 1995, 36, 4377; W. Stahl et al, Angew. Chemie 1994, 106, 2186; U. Sprengard et al, Angew. Chemie 1996, 108, 359; A. Toepfer et al, Tetrahedron Letters 1995, 36, 9161; U. Sprengard et al, Angew. Chemie 1995, 107, 1104; D. Zanini et al, Tetrahedron Letters 1995, 36, 7383; R. Roy et al, J. Chem. Commun. 1996, 201; W. Spevak et al, J. Med. Chem. 1996, 39, 1018; E. A. L. Biessen et al, J. Med. Chem. 1995, 38, 1846; K. Yamada et al, Tetrahedron Letters 1995, 36, 9496; Lemieux et al, JACS 1975, 97, 4076; S. Koto et al, Bull. Chem. Soc. Jap. 1976, 49, 2639; P. W. Austin et al, J. Chem. Soz. C 1965, 1419; H. Paulsen, Angew. Chem. 1990, 102, 851; R. R. Schmidt et al, Angew. Chem. 1986, 98, 213; H. Kunz, Angew. Chem. 1987, 99, 297; J. Banoub, Chem. Review 1992, 92, 1167; H. Paulsen, Angew. Chem. 1982, 94, 184, R. R. Schmidt et al, Liebigs Ann. Chem. 1983, 1249; H. A. van Doren et al, Carbohydrate Research 1989, 194, 71, F. D. Tropper et al, J. Car bohydr. Chem. 1992, 11, 751; T. Sugawara et al, Carbohydrate Research 1992, 230, 117, Y. C. Lee et al, Biochemistry 1976, 15, 3956; Blomberg et al, J. Car bohydr. Chem. 1992, 11, 751.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt eben falls in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen Komplex verbindungen - gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusät ze - in wäßrigem Medium suspendiert oder löst und anschließend die Suspen sion oder Lösung gegebenenfalls sterilisiert. Geeignete Zusätze sind beispiels weise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie z. B. Tromethamin), Zusätze von Komplexbildnern oder schwachen Komplexen (wie zum Beispiel Diethylentria minpentaessigsäure oder die korrespondierenden Ca-Polysaccharid-Polymer- Komplexe) oder - falls erforderlich - Elektrolyte wie zum Beispiel Natriumchlorid oder - falls erforderlich - Antioxidantien wie zum Beispiel Ascorbinsäure.

Sind für die enterale Verabreichung oder andere Zwecke Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Mittel in Wasser oder physiologischer Salz lösung erwünscht, werden sie mit einem oder mehreren in der Galenik üblichen Hilfsstoff(en) [z. B. Methylcellulose, Lactose, Mannit] und/der Tensid(en) [z. B. Lecithine, Tween®, Myrj®] und/oder Aromastoff(en) zur Geschmackskorrektur [z. B. ätherischen Ölen] gemischt.

Prinzipiell ist es auch möglich, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel auch ohne Isolierung der Komplexsalze herzustellen. In jedem Fall muß beson dere Sorgfalt darauf verwendet werden, die Chelatbildung so vorzunehmen, daß die erfindungsgemäßen Salze und Salzlösungen praktisch frei sind von nicht komplexierten toxisch wirkenden Metallionen.

Dies kann beispielsweise mit Hilfe von Farbindikatoren wie Xylenolorange durch Kontrolltitrationen während des Herstellungsprozesses gewährleistet werden. Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung der Komplexverbin dungen und ihrer Salze. Als letzte Sicherheit bleibt eine Reinigung des isolierten Komplexsalzes.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel enthalten vorzugsweise 1 µMol -1,3 Mol/l des Komplexsalzes und werden in der Regel in Mengen von 0,0001- 5 mMol/kg dosiert. Sie sind zur enteralen und parenteralen Applikation be stimmt. Die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen kommen zur Anwen dung.

1. für die NMR- und Röntgen-Diagnostik in Form ihrer Komplexe mit den Ionen der Elemente mit den Ordnungszahlen 21-29, 39 42, 44 und 57-83;
2. für die Radiodiagnostik und Radiotherapie in Form ihrer Komplexe mit den Radioisotopen der Elemente mit den Ordnungszahlen 27, 29, 31, 32, 37-39, 43, 49, 62, 64, 70, 75 und 77.

Die erfindungsgemäßen Mittel erfüllen die vielfältigen Voraussetzungen für die Eignung als Kontrastmittel für die Kernspintomographie. So sind sie hervorra gend dazu geeignet, nach oraler oder parenteraler Applikation durch Erhöhung der Signalintensität das mit Hilfe des Kernspintomographen erhaltene Bild in seiner Aussagekraft zu verbessern. Ferner zeigen sie die hohe Wirksamkeit, die notwendig ist, um den Körper mit möglichst geringen Mengen an Fremdstoffen zu belasten, und die gute Verträglichkeit, die notwendig ist, um den nichtinvasi ven Charakter der Untersuchungen aufrechtzuerhalten.

Die gute Wasserlöslichkeit und geringe Osmolalität der erfindungsgemäßen Mittel erlaubt es, hochkonzentrierte Lösungen herzustellen, damit die Volumen belastung des Kreislaufs in vertretbaren Grenzen zu halten und die Verdünnung durch die Körperflüssigkeit auszugleichen, das heißt NMR-Diagnostika müssen 100- bis 1000fach besser wasserlöslich sein als für die NMR-Spektroskopie. Weiterhin weisen die erfindungsgemäßen Mittel nicht nur eine hohe Stabilität in- vitro auf, sondern auch eine überraschend hohe Stabilität in-vivo, so daß eine Freigabe oder ein Austausch der in den Komplexen nicht kovalent gebundenen -an sich giftigen - Ionen innerhalb der Zeit, in der die neuen Kontrastmittel voll ständig wieder ausgeschieden werden, nur äußerst langsam erfolgt.

Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Mittel für die Anwendung als NMR-Diagnostika in Mengen von 0,0001-5 mMol/kg, vorzugsweise 0,005-0,5 mMol/kg, dosiert. Details der Anwendung werden zum Beispiel in H.-J. Wein mann et al., Am J. of Roentgenology 142, 619 (1984) diskutiert.

Besonders niedrige Dosierungen (unter 1 mg/kg Körpergewicht) von organ spezifischen NMR-Diagnostika sind zum Beispiel zum Nachweis von Tumoren und von Herzinfarkt einsetzbar.

Die erfindungsgemäßen Mittel sind aufgrund ihrer günstigen radioaktiven Ei genschaften und der guten Stabilität der in ihnen enthaltenen Komplexverbin dungen auch als Radiodiagnostika geeignet. Details ihrer Anwendung und Do sierung werden z. B. in "Radiotracers for Medical Applications", CRC-Press, Boca Raton, Florida, beschrieben.

Eine weitere bildgebende Methode mit Radioisotopen ist die Positronen-Emissi ons-Tomographie, die positronenemittierende Isotope wie z. B. ⁴³Sc, ⁴⁴Sc, ⁵²Fe, ⁵⁵Co und ⁶⁸Ga verwendet (Heiss, W. D.; Phelps, M. E.; Positron Emission Tomography of Brain, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York 1983).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind überraschenderweise auch zur Differenzierung von malignen und benignen Tumoren in Bereichen ohne Blut- Hirn-Schranke geeignet. Sie zeichnen sich auch dadurch aus, daß sie vollstän dig aus dem Körper eliminiert werden und somit gut verträglich sind.

Da sich die erfindungsgemäßen Substanzen in malignen Tumoren anreichern (keine Diffusion in gesunde Gewebe, aber hohe Durchlässigkeit von Tumor gefäßen), können sie auch die Strahlentherapie von malignen Tumoren unter stützen. Diese unterscheidet sich von der entsprechenden Diagnostik nur durch die Menge und Art des verwendeten Isotops. Ziel ist dabei die Zerstörung von Tumorzellen durch energiereiche kurzwellige Strahlung mit einer möglichst ge ringen Reichweite. Hierzu werden Wechselwirkungen der in den Komplexen enthaltenen Metalle (wie z. B. Eisen oder Gadolinium) mit ionisierenden Strah lungen (z. B. Röntgenstrahlen) oder mit Neutronenstahlen ausgenutzt. Durch diesen Effekt wird die lokale Strahlendosis am Ort, wo sich der Metallkomplex befindet (z. B. in Tumoren) signifikant erhöht. Um die gleiche Strahlendosis im malignen Gewebe zu erzeugen, kann bei Anwendung solcher Metallkomplexe die Strahlenbelastung für gesunde Gewebe erheblich reduziert und damit bela stende Nebenwirkungen für die Patienten vermieden werden. Die erfindungs gemäßen Metallkomplex-Konjugate eignen sich deshalb auch als radiosensibi lisierende Substanz bei Strahlentherapie von malignen Tumoren (weiterhin las sen sich Mössbauer-Effekte oder die Neutroneneinfangtherapie ausnutzen). Geeignete β-emittierende Ionen sind zum Beispiel ⁴⁶Sc, ⁴⁷Sc, ⁴⁸Sc, ⁷²Ga, ⁷³Ga und ⁹⁰Y. Geeignete geringe Halbwertzeiten aufweisende α-emittierende Ionen sind zum Beispiel ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ²¹³Bi und ²¹⁴Bi, wobei ²¹²Bi bevorzugt ist. Ein geeignetes Photonen- und Elektronen-emittierendes Ion ist ¹⁵⁸Gd, das aus ¹⁵⁷Gd durch Neutroneneinfang erhalten werden kann.

Bei der in-vivo-Applikation der erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel kön nen diese zusammen mit einem geeigneten Träger wie zum Beispiel Serum oder physiologischer Kochsalzlösung und zusammen mit einem anderen Pro tein wie zum Beispiel Human Serum Albumin verabreicht werden. Die Dosie rung ist dabei abhängig von der Art der zellulären Störung, dem benutzten Metallion und der Art der bildgebenden Methode.

Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel werden parenteral, vorzugs weise i. v., appliziert.

Details der Anwendung von Radiotherapeutika werden z. B. in R. W. Kozak et al. TIBTEC, Oktober 1986, 262, diskutiert.

Die erfindungsgemäßen Mittel sind hervorragend als Röntgenkontrastmittel ge eignet, insbesondere für die Computertomographie (CT), wobei besonders her vorzuheben ist, daß sich mit ihnen keine Anzeichen der von den jodhaltigen Kontrastmitteln bekannten anaphylaxieartigen Reaktionen in biochemisch pharmakologischen Untersuchungen erkennen lassen. Besonders wertvoll sind sie wegen der günstigen Absorptionseigenschaften in Bereichen höherer Röh renspannungen für digitale Substraktionstechniken.

Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Mittel für die Anwendung als Röntgenkontrastmittel in Analogie zu Meglumin-Diatrizoat in Mengen von 0,1- 5 mMol/kg, vorzugsweise 0,25-1 mMol/kg dosiert.

Details der Anwendung von Röntgenkontrastmitteln werden zum Beispiel in Barke, Röntgenkontrastmittel, G. Thieme, Leipzig (1970) und P. Thurn, E. Bü cheler "Einführung in die Röntgendiagnostik", G. Thieme, Stuttgart, New York (1977) diskutiert.

Insgesamt ist es gelungen, neue Polymer-Metallkomplexe zu synthetisieren, die neue Möglichkeiten in der diagnostischen und therapeutischen Medizin er schließen.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung des Erfindungs gegenstandes:

Die in den nachfolgenden Beispielen verwendeten, dem Fachmann bekannten und geläufigen Abkürzungen, bestimmter, häufig wiederkehrender Verbin dungsnamen, sind im Folgenden namentlich und/oder durch Strukturformeln einmalig erläutert;
wobei
⇐ jeweils die Position, in den nachfolgend beschriebenen, Molekülen an gibt, über welche die Bindung an das Polymer P erfolgt.

1) DTPA: [Bis-(2-aminoethyl)-amin-N,N,N',N",N"-pentaessigsäure]

2) Gd-DTPA: Gadoliniumkomplex von [Bis-(2-aminoethyl)-amin-N,N,N',N" ,N"-pentaessigsäure] mono-Natriumsalz

3) DTPA-Monoanhydrid-monoethylester:

4) DTPA-tetra-tert.-butylester (zentrale Carboxymethylfunktion):

3,9-Bis-(tert.-butoxycarbonylmethyl)-6-Carboxymethyl-3,6,9- triazaundecansäure-di-tert.-butylester

5) DTPA-tetra-tert.-butylester (terminale Carboxymethylfunktion):

6,9-Bis-(tert.-butoxycarbonylmethyl)-3-carboxymethyl-3,6,9-tria zaundecansäure-di-tert.-butylester

6) Gly-Me-DOTA-tri-tert.-butylester:

10-[1-(Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecan- 1,4,7-triessigsäure-tri-tert-butylester, Natriumbromid

7) Gd-Gly-Me-DOTA:

Gadoliniumkomplex von 10-[1-(Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure

8) Sialyl-Lewis^x = [sLe^x]: (α-Neu5Ac-(2-3)-β-D-Gal-(1-4)-[a-L-Fuc-(1-3)]-β-GIcNAc)

Die in den jeweiligen Synthesen eingesetzten Polyamine sind im Folgenden einmalig benannt und die entsprechenden Literaturstellen zu deren Synthese einmalig angeführt:

a) 12er-Kaskadenpolyamin (12mer-Polyamin):

12er-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)- ethyl]-trimesinsäureamids-Cores mit N,N'-Dibenzyloxycarbonyl-L-lysin

Synthesebeschreibung auf analoge Weise wie in DE 195 25 924 A1 in Beispiel 1d) beschrieben für die Darstellung des 24er-Kaskadenpolyamins, nur unter Verwendung von N,N'-Dibenzyloxycarbonyl-L-lysin anstelle eines vollständig Benzyloxycarbonyl geschützten "Tri-Lysins".

b) 24er-Kaskadenpolyamin (24mer-Polyamin):

24er-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)- ethyl]-trimesinsäureamids

Synthesebeschreibung in: DE 195 25 924 A1; EP 0430 863 A1; WO 97/ 02051; DE 195 18 222 A1

c) 36er-Kaskadenpolyamin (36mer-Polyamin):

36er-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)- ethyl]-trimesinsäureamids-cores mit sechs 1-(Carboxymethoxyacetyl)-4,7,10- tris(N,N'-dibenzyloxycarbonyl-lysyl)-1,4,10-tetraazacyclododecan

Synthesebeschreibung in: EP 0430 863 A1; WO 97/02051

d) 48er-Kaskadenpolyamin (48mer-Polyamin):

48er-Polyamin auf der Basis des mit 1-(Carboxymethoxyacetyl)-4,7,10- tris(N,N'-dibenzyloxycarbonyl-lysyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan- Hexamincores mit 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-tetrakis-(N,N'- dibenzyloxycarbonyl-lysyl)

Synthesebeschreibung in: EP 0271180

f) 24er-Starburst-Dendrimer:

Tomalia D. A. et al.; Polym. J. (Tokyo) 1985, 17, 117; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1986, 19, 2466; Tomalia D. A., et al.; Macromolecules 1987, 20, 1164; Tomalia D. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 1601; Tomalia D. A. et al.; J. Org. Chem. 1987, 52, 5305.

e) 48er-starburst-Dendrimer:

Tomalia D. A. et al.; Polym. J. (Tokyo) 1985, 17, 117; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1986, 19, 2466; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1987, 20, 1164.

Beispiel 1 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₃₃-Konjugat a) Polyamid aus 13 kD-poly-L-Lysin und DTPA

Eine Lösung von 5,0 g (0,38 mmol; entsprechend 30,4 mmol an freien Amino funktionen) poly-L-Lysinhydrobromid (13 kD, Kaufware Sigma) wird in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 14,7 g (36,5 mmol) DTPA-Mono anhydrid-mono-ethylester (Darstellung wie in EP 0263051 A1, EP 0450742 A1 und EP 0413405 A1 beschrieben) hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktions lösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachge rührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32 %iger Natronlauge auf 11,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran [cut off 3000 D; AMICON®] gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entioni siertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Pro duktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 10,26 g (84,6%; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 7,44%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,61; H 5,68; N 13,14; Na 13,48;
gef.: C 42,55; H 5,72; N 13,20; Na 13,61;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration bei einer Komplexie rungstemperatur von 22°C mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungs grad des Polymers von 58,7% (entsprechend 47 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion [vgl. hierzu: Chem. Rev., 60, 39 (1960); Tetrahydron, 34, 1285 (1978), 47, 8791 (1991)] als auch der quantitativen Aminogruppenbestimmung mit der TNBS-Methode (vgl. hierzu: Fields, R., J. Biochem. 1971, 124, 581-590 und weiterführende Lit.: Chem. Rev., 60, 39 (1960); Tetrahedron, 34, 1285 (1978); 47, 8791 (1991)] liegen im Mittel pro Po lymermolekül 33 freie Aminofunktionen vor.

b) 13-kD-poly-L-Lysin-(DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₃₃-Konjugat

1,5 g (0,047 mmol; entsprechend 1,54 mmol an freien Aminofunktionen) der Ti telverbindung aus Beispiel 1a) werden in 80 ml entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 molarer Salzsäure auf 9,5 eingestellt. Anschließend wird portionsweise mit insgesamt 2,07 g (6,63 mmol) p-Iso thiocyanatophenyl-β-D-galactopyranose (Darstellung gemäß: M. Ponpipom et al., J. Med. Chem. 24, 1388; 1981. Zur allgemeinen Bildung von Isothiocyana ten aus den entsprechenden Anilinvorstufen von diversen Hexapyranosen vgl. z. B.: D. H. Buss, I. J. Goldstein; J. Chem. Soc., 1968, 1457-1461, McBroom C. R., Samanen C. H. and Goldstein I. J., Methods Enzymol. 1972, 28, 212-219) versetzt, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung mittels 0,1 molarer Natron lauge bei 9,5 konstant gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei 22°C wird filtriert und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml aufgefüllt. Dreimalige Ultrafiltration der Reaktionslösung über eine YM3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gefolgt von Gefriertrocknung des verblei benden Rückstands liefert 1,84 g (92,6% d. Theorie) eines amorphen und farblosen Feststoffs.
Wassergehalt: 6,78%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,34; H 5,54; N 11,02; S 2,49; Na 10,18;
gef.: C 44,27; H 5,70; N 19,97; S 2,53; Na 10,24;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode, welche zur quantitativen und qualitativen Bestimmung von freien Aminofunktionen allgemein eingesetzt werden können, verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Amino funktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 40% β-D-Ga lactose (entsprechend 33 Galactoseresten pro Molekül). Die colorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung (Dubois et al., Anal. Chem. 1956, 28, 3, 350) zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Polyamins liefert als Ergebnis einen mittleren statistischen Beladungsgrad von 32,68% an D-Galactoseresten pro Molekül und ist somit als identisch anzusehen mit dem Beladungsgrad, welcher allein durch die prozentualen Elementverhältnis se ermittelt wurde (hier gefunden: 33 D-Galactosereste pro Molekül).

c) 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₃₃-Konjugat

1,27 g (0,0411 mmol; entsprechend 1,56 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 1b) werden in 40 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 0,42 g (1,59 mmol) Gadoliniumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet.
Ausbeute: 1,44 g (97,2% d. Th.) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 3,89%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,00; H 5,45; N 10,11; S 2,31; Gd 16,53; Na 2,42;
gef.: C 39,87; H 5,74; N 9,98; S 2,28; Gd 16,58; Na 2,42;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 58.9% Gd-DPTA und 41,1 % D-Galactose (entsprechend 47 Gd-DTPA-Einheiten und 33 β-D-Galactose resten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 2 13 kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₃₃-Konjugat a) 13-kD-poly-L-Lysin-(DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-α-D- mannopyranosyl]₃₃-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,75 g (0,023 mmol; entsprechend 0,77 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 1a) mit 1,2 g (3,8 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-α- D-mannopyranose [Darstellung gemäß: Monsigny, M. et al., Biol. Cell. 51, (1984), 187] nach Aufarbeitung 1,29 g (92,4% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 4,86%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,34; H 5,54; N 11,02; S 2,49; Na 10,18;
gef.: C 44,40; H 5,57; N 10,96; S 2,58; Na 10,20;

Die Durchführung der Ninhydrinreaktion an der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem pro zentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 40% D-Mannose (entsprechend 33 Man noseresten pro Molekül).

b) 13 kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₃₃-Konjugat

0,85 g (0,020 mmol; entsprechend 0,94 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 2a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben, mit 10 ml einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung, die einen Gesamtgehalt von 0,25 g (0,96 mmol) an Gadoliniumchlorid aufweist, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 918 mg (98,5% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 6,14%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 40,39; H 5,05; N 10,04; S 2,27; Gd 15,86; Na 2,32;
gef.: C 40,42; H 5,11; N 10,01; S 2,36; Gd 15,92; Na 2,28;

Aus den molaren Elementarverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 60.3% Gd-DPTA und 39.7% D-Mannose (entsprechend 47 Gd-DTPA-Einheiten und 33-D-Mannose reste pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der quantitativen Ninhy drinreaktionen keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Die T₁ und T₂-Relaxivitäten der Titelverbindung wurden sowohl in Wasser, als auch im Plasma bestimmt:

Die Messungen erfolgten bei 40°C, einer Magnetfeldstärke von 0.47 Tesla, der T1-Sequenz: 180°-TI-90° [Inversion Recovery]
sowie der T2-Sequenz: 90°-TE-180° [CPMG].

Alle Relaxivitätsbestimmungen erfolgten auf einem Minispec PC 20 und als Referenzprobe diente in allen Fällen eine Lösung von Gd-DTPA der Konzen tration 1 mmol/L.

R₁ (Wasser) = 14.4 ± 0.0 (L/mmol . s)
R₁ (Plasma) = 17.4 ± 0.2 (L/mmol . s)
R₂ (Wasser) = 16.4 ± 0.2 (L/mmol . s)
R₂ (Plasma) = 21.4 ± 1.9 (L/mmol . s)

Beispiel 3 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D-glucopy ranosyl]₃₃-Konjugat a) 13-kD-poly-L-Lysin-(DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₃₃-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,9 g (0,028 mmol; entsprechend 0,92 mmol an freien Aminfunktionen) der Ti telverbindung aus Beispiel 1a) mit 1,44 g (4,56 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β- D-glucopyranose [Darstellung in Analogie zu: M. Ponpipom et al., J. Med. Chem. 24, 1388; 1981 und Monsigny et al., Bio. Cell, 51, 187, 1984] nach Auf arbeitung 1,08 g (90,6% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 3,75%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,34; H 5,54; N 11,02; S 2,49; Na 10,18;
gef.: C 44,40; H 5,51; N 11,03; S 2,55; Na 10,20;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen mehr. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Bela dungsgrad des Polymers mit 40% D-Glucose (entsprechend 33 Glucoseresten pro Molekül).

b) 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₃₃-Konjugat

1,0 g (0,023 mmol; entsprechend 1,10 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 3a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben, mit 10 ml ei ner wässrigen Gadoliniumchloridlösung, die einen Gesamtgehalt von 0,298 g (1,12 mmol) Gadoliniumchloridlösung aufweist, komplexiert. Nach Aufarbei tung und Gefriertrocknung erhält man 1,06 g (99,2% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 5,47%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 40,39; H 5,05; N 10,04; S 2,27; Gd 15,86; Na 2,32;
gef.: C 40,44; H 5,12; N 10,09; S 2,31; Gd 15,90; Na 2,31;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 59.7% Gd-DPTA und 40.3 % D-Glucose (entsprechend 47 Gd-DTPA-Einheiten und 33-D-Glucosereste pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 4 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₁-Konjugat

Bei Raumtemperatur werden 5,0 g (1,06 mmol; entsprechend 25,44 mmol an freien Aminfunktionen) 24er-Kaskadenamin [als HBr-Salz] in 300 ml destillier tem Wasser gelöst. Der pH-Wert der resultierenden Lösung beträgt 1,6. Durch tropfenweises Versetzen dieser Lösung mit 1 molarer Natronlauge wird ein pH- Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 12,3 g (30,53 mmol) DTPA-Monoanhydrid-monoethylester (Darstellung wie in Europäische Patent anmeldung Nr. 0263051 A1, Europäische Patentanmeldung Nr. 0450742 A1 und Europäische Patentanmeldung Nr. 0413405 A1 beschrieben) portions weise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 mola rer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten bei Raumtemperatur wird der pH-Wert der Reaktionslösung, durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf 11,5 eingestellt. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von destillier tem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rück stand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5,50 g (86,4 bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pul ver
Wassergehalt: 9,33%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,20; H 5,66; N 13,88; Na 12,86;
gef.: C 43,01; H 5,70; N 14,03; Na 12,84;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, er gibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 45,8% (entsprechend 11 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion liegen im Mittel pro Polymermolekül 13 freie Aminofunktionen vor.

b) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₁₃-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,12 mmol; entsprechend 1,65 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 4a) mit 2,3 g (7,26 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β-D- galactopyranose nach Aufarbeitung 1,33 g (93,2% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 7,41%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,46; H 5,38; N 10,67; S 3,49; Na 8,47;
gef.: C 45,32; H 5,28; N 10,71; S 3,44; Na 8,51;

Die Ninhydrinreaktion Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Pro dukt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 54,2% D-Galactose (entsprechend 13 Galactoseresten pro Mole kül).

c) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₁₃-Konjugat

1,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 4b) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 10 ml einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung, die einen Gesamtgehalt von 0,232 g (0,88 mmol) Gadoliniumchlorid enthält, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefrier trocknung erhält man 978,4 mg (98,4% d. Th.) der Titelverbindung als amor phes Pulver.
Wassergehalt: 4,36%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,04; H 4,97; N 9,87; S 3,23; Gd 13,40; Na 1,96;
gef.: C 42,12; H 5,03; N 9,81; S 3,26; Gd 13,54; Na 1,93;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 46.4% Gd-DPTA und 53.6 % D-Galactose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-D-Galactose resten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 5 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₁₃-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,12 mmol; entsprechend 1,65 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 4a) mit 2,3 g (7,26 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-α-D- mannopyranose nach Aufarbeitung 1,31 g (91,8% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 4,89%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,46; H 5,38; N 10,67; S 3,49; Na 8,47;
gef.: C 45,27; H 5,40; N 10,58; S 3,40; Na 8,60;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 53,8% D-Mannose (entsprechend 20 α-D-Mannoseeinheiten pro Molekül).

b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₃₃-Konjugat

1,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 5a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 10 ml ei ner wässrigen Gadoliniumchloridlösung, die einen Gesamtgehalt von 0,232 g (0,88 mmol) Gadoliniumchlorid enthält, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 952,2 mg (96,4% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 7,89%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,04; H 4,97; N 9,87; S 3,23; Gd 13,40; Na 1,96;
gef.: C 41,98; H 5,02; N 10,01; S 3,27; Gd 13,42; Na 1,91;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45% Gd-DPTA und 55% D- Mannose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Die Messungen erfolgten bei 40°C, einer Magnetfeldstärke von 0.47 Tesla und der T₁-Sequenz: 180°-TI-90° [Inversion Recovery]
sowie der T₂-Sequenz: 90°-TE-180° [CPMG].

Alle Relaxivitätsbestimmungen erfolgten auf einem Minispec PC 20. Als Referenzprobe diente in allen Fällen eine Lösung von Gd-DTPA der Konzentration 1 mmol/L.

R₁ (Wasser) = 15.4 ± 0.0 (L/mmol . s)
R₁ (Plasma) = 17.7 ± 1.1 (L/mmol . s)
R₂ (Wasser) = 17.6 ± 0.2 (L/mmol . s)
R₂ (Plasma) = 19.3 ± 1.2 (L/mmol . s)

Beispiel 6 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-β- D-glucosaminopyranosyl]₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl β-D-glucosaminopyranosyl]₁₃-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,3 g (0,156 mmol; entsprechend 2,03 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 4a) mit 3,15 g (8,92 mmol) 2-[Acetylamino-2- deoxy]-1-[4-(isothiocyanatophenyl)]-β-D-glucosaminopyranose [Darstellung in Analogie zu: M. Ponpipom et al., J. Med. Chem 24, 1388; 1981 und Monsigny et al., Biol. Cell, 51, 187, 1984] nach Aufarbeitung 1,74 g (89,6% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 3,94%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,97; H 5,56; N 11,66; S 3,34; Na 8,10;
gef.: C 46,03; H 5,60; N 11,62; S 3,30; Na 8,07;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers von 54,1% N-Acetyl-glucoseeinheiten (entsprechend 13 N- Acetylglucosaminresten pro Molekül).

b) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-β- D-glucosaminopyranosyl]₁₃-Konjugat

1,5 g (0,120 mmol; entsprechend 1,32 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 6a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 10 ml einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung komplexiert, die einen Gesamtgehalt von 0,356 g (1,35 mmol) Gadoliniumchlorid enthält. Nach Aufarbeitung und Gefrier trocknung erhält man 1,57 g (97,3% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 4,91%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,65; H 5,16; N 10,82; S 3,10; Gd 12,85; Na 1,88;
gef.: C 42,71; H 5,20; N 10,86; S 3,14; Gd 12,91; Na 1,85;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 46% Gd-DTPA und 54% N- Acetyl-D-Glucosamin, d. h. es liegen im Mittel 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13- N-Acetyl-D-Glucosamineinheiten pro Molekül vor. In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 7 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₁₃-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,2 g (0,144 mmol; entsprechend 1,872 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 4a) mit 2,61 g (8,24 mmol) p-Isothiocyanatophenyl β-D-glucopyranose nach Aufarbeitung 1,49 g (87,1% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 8,37%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,46; H 5,38; N 10,67; S 3,49; Na 8,47;
gef.: C 45,52; H 5,44; N 10,73; S 3,55; Na 8,60;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 54,9% D-Glucose (entsprechend 13 Glucoseresten pro Mole kül).

b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₁₃-Konjugat

1,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 7a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 232 mg (0,88 mmol) einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung (10 ml) komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 952,2 mg (96,4% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 7,89%

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45% Gd-DPTA und 55% D- Glucose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 8 36er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₆-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₂₀-Konjugat a) 36er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₆-Konjugat

Bei Raumtemperatur werden 4,0 g (0,54 mmol; entsprechend 19,41 mmol an freien Aminfunktionen) 36er-Kaskadenamin [eingesetzt als Hydrobromid; Dar stellung gemäß: Schmitt-Willich et al., Schering AG, Europäische Patentanmel dung Nr. 0430 863 A1; WO 97/02051; Deutsche Patentanmeldung Nr. 195 18 222 A1] in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der resultierenden Lösung beträgt 1,8. Durch tropfenweises Versetzen dieser Lösung mit 1 molarer Natronlauge wird ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insge samt 9,38 g (23,3 mmol) DTPA-Monoanhydrid-monoethylester portionsweise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten bei Raumtemperatur wird der pH-Wert der Reaktionslösung, durch Ver setzen mit 1 molarer Natronlauge auf 11,5 eingestellt. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässri ge Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rück stand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5,50 g (86,4% d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 9,33%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,23; H 5,63; N 13,88; Na 12,46;
gef.: C 43,40; H 5,68; N 13,92; Na 12,30;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, er gibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 45,1% (entsprechend 16 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach Ninhydrinreaktion der Titelverbindung lie gen im Mittel im Polymer 20 freie Aminofunktionen pro Molekül vor.

b) 36er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₆-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₂₀-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,5 g (0,12 mmol; entsprechend 2,54 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 8a) mit 3,55 g (11,2 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-α-D- mannopyranose nach Aufarbeitung 1,87 g (86,3% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 4,93%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,52; H 5,35; N 10,62; S 3,55; Na 8,14;
gef.: C 45,60; H 5,41; N 10,58; S 3,49; Na 8,22;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59% N-Acetyl-D-Glucosamin (entsprechend 20 Glucose resten pro Molekül).

c) 36er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₆-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₂₀-Konjugat

1,5 g (0,10 mmol; entsprechend 1,32 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 8b) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit einer Lö sung von 358,5 mg (1,36 mmol) Gadoliniumchlorid in 10 ml Wasser komple xiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1,57 g (97,3% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 7,71%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,22; H 4,96; N 9,85; S 3,29; Gd 12,91; Na 1,89;
gef.: C 42,30; H 5,02; N 9,78; S 3,31; Gd 13,01; Na 1,78;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 44% Gd-DPTA und 56% D-Mannose (entsprechend 16 Gd-DTPA-Einheiten und 20 D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 9 36er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₆-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D-glucopy ranosyl]₂₀-Konjugat a) 36er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₆-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₂₀-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 2,5 g (0,20 mmol; entsprechend 4,0 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 8a) mit 5,58 g (17,6 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β-D- glucopyranose nach Aufarbeitung 3,26 g (90,2% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 8,44%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,52; H 5,35; N 10,62; S 3,55; Na 8,14;
gef.: C 45,61; H 5,42; N 10,57; S 3,49; Na 8,13;

Der Ninhydrinfarbreaktionstest auf das Vorhandensein von freien Aminofunk tionen in der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält somit keine freien Aminofunktionen mehr. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 56,2% D-Glucose (entsprechend 20 Glucoseresten pro Molekül).

b) 36er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₆-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₂₀-Konjugat

3,0 g (0,166 mmol; entsprechend 2,65 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 9a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit einer Lö sung von 717 mg (2.72 mmol) Gadoliniumchlorid in 15 ml Wasser komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 3,18 g (98,4% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 6,43%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,22; H 4,96; N 9,85; S 3,29; Gd 12,91; Na 1,89;
gef.: C 42,24; H 4,93; N 10,01; S 3,27; Gd 12,99; Na 1,91;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 44% Gd-DPTA und 56% β-D- Glucose (entsprechend 16 Gd-DTPA-Einheiten und 20 β-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 10 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(α-D-Mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₁

20,0 g (26,8 mmol) Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester (Titelverbindung aus Bei spiel 31f) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 3,7 g (32,16 mmol) N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei die ser Temperatur portionsweise mit insgesamt 6,6 g (32,16 mmol) Dicyclo hexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 8,8 g (1,86 mmol; entsprechend 44,8 mmol an freien Aminofunktionen) 24er-Kaskadenpolyamin und 4,5 g (44,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der ver bleibende Rückstand mit 250 ml Dichlormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organische Phase nacheinander mit 5%iger Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und zweimal mit Was ser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Na triumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man er hält 14,03 g (84,3% d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nach folgenden Syntheseschritte eingesetzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreak tion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 13 freie Aminfunktio nen pro Molekül vor.

Elementaranalyse:
ber.: C 63,06; H 9,68; N 15,65;
gef.: C 63,20; H 10,02; N 15,71;

b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₁- [3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-α-D-mannopyranosyl-3-propion-Amid]₁₃- Konjugat

Eine gerührte Lösung von 3,5 g (0,39 mmol; entsprechend 5,1 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a) in 100 ml absolutem Dichlormethan, wird bei Raumtemperatur mit 617 mg (6,1 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 2,97 g (5,61 mmol) 3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid ester (Darstellung in Analogie zu: J. Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4, 85, (1993); Chipowsky, S., and Lee, Y. C (1973), Synthesis of 1-Thio-aldosides; Carbohydrate Research 31, 339-346) in 60 ml Dichlormethan, bei Raumtempe ratur tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019728954 00004 99880Dichlormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Va kuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 5,0 g (89,7% d. Th.) der Titelver bindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Elementaranalyse:
ber.: C 57,67; H 8,03; N 9,73; S 2,90;
gef.: C 57,53; H 7,92; N 9,79; S 2,87;

Somit ergibt sich aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der oben genannten Titelverbindung ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 55% D-Mannose-tetraacetatresten (entsprechend 13 D-Mannoseeinheiten pro Molekül).

c) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁- (-α-D-Mannopyranosyl-1-thio-3-propion-Amid)₁₃-Konjugat

4,5 g (0,312 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 10b) werden in 100 ml ab solutem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32%igen wässrigen Ammoniaklösung ver setzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert. Die wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit 10%iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht mit Wasser auf ein Ge samtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltra tionsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der ver bleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 2,80 g (81,6% d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver
Wassergehalt: 7,78%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 49,42; H 7,09; N 12,67; S 3,77;
gef.: C 49,18; H 7,13; N 12,81; S 3,69;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein Beladungsgrad mit Gly Me-DOTA des Polymers von 44,8% (entsprechend 11 Gly-Me DOTA-Einheiten pro Molekül). Nach Ninhydrinreak tion liegen im Polymer keine freien Aminofunktionen vor.

d) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(α-D-Mannopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat

2,5 g (0,22 mmol; entsprechend 2,48 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbin dung aus Beispiel 10c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10%iger wässrigen Salz säure auf 2,0 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid gelöst in 10 ml Wasser hinzu und rührt die Re aktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reak tionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3-Ultrafiltra tionsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrock net. Man erhält 2,7 g (97,3% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 9,37%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,77; H 6,05; N 19,96; S 3,26; Gd 13,54;
gef.: C 42,69; H 6,18; N 11,04; S 3,38; Gd 13,67;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium (1,21) er gibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,2% Gd-Gly- Me-DOTA und 54,8% α-D-Mannose (entsprechend 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Ein heiten und 13-α-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 11 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(β-D-Glucopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₁- [3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-β-D-glucopyranosyl-3-propion-Amid]₁₃- Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,0 g (0,33 mmol; entsprechend 4,3 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 10a) mit 2,76 g (5,2 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-β-D-glucopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester, 4,0 g (85,3 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 57,67; H 8,03; N 9,73; S 2,90;
gef.: C 57,39; H 8,14; N 9,87; S 2,96;

Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentua len Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 13 D-Glucoseresten pro Molekül.

b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(β-D-Glucopyranosyl-1-thio- 3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 3,5 g (0,24 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 11a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,2 g (83,6% d. Th.) der oben genann ten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 4,73%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 49,42; H 7,09; N 12,67; S 3,77;
gef.: C 50,01; H 7,14; N 12,62; S 3,81;

c) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(β-D-Glucopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10d) beschrieben, führt die Komplexierung von 2,0 g (0,176 mmol; entsprechend 1,94 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titel verbindung aus Beispiel 11b) mit 520 mg (1,98 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 2,75 g (98,1% d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 9,36%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,77; H 6,05; N 10,96; S 3,26; Gd 13,54;
gef.: C 42,73; H 6,14; N 11,06; S 3,30; Gd 13,61;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten
und 13 D-Glucopyranosylreste

Beispiel 12 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(β-D-Galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₁- [3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-β-D-galactopyranosyl-3-propion-Amid]₁₃- Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,5 g (0,165 mmol; entsprechend 2,14 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a) mit 1,36 g (2,57 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O- acetyl-1-thio-β-D-galactopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester 2,0 g (87,2% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 57,67; H 8,03; N 9,73; S 2,90;
gef.: C 57,78; H 8,14; N 9,80; S 2,97;

Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentua len Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 13 D-Galactoseresten pro Molekül.

b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(β-D-Galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 1,8 g (0,12 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 12a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 1,15 g (87,2% d. Th.) der oben genann ten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 4,22%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 49,42; H 7,09; N 12,67; S 3,77;
gef.: C 49,66; H 7,13; N 12,54; S 3,70;

c) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(β-D-Galactopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10d) beschrieben, führt die Komplexierung von 1,0 g (0,088 mmol; entsprechend 1,94 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titel verbindung aus Beispiel 12b) mit 262 mg (1,0 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 1,08 g (96,4% d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 9,32%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,77; H 6,05; N 10,96; S 3,26; Gd 13,54;
gef.: C 42,56; H 6,12; N 10,93; S 3,24; Gd 13,51;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten
und 13 D-Galactopyranosylreste

Beispiel 13 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Acetyl-β-D-glucosamino pyranosyl-1-thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₁- [3-(N-Acetyl-3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio)-β-D-glucosaminopyranosyl-3- propion-Amid]₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 2,0 g (0,22 mmol; entsprechend 2,86 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 10a) mit 1,74 g (3,43 mmol) 4-[(Acetylamino-4-deoxy)]- 3-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-glucosaminopyranosyl)-propionsäure-N-hy droxysuccinimidester 2,6 g (83,5% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 57,77; H 8,04; N 11,02; S 2,90;
gef.: C 57,68; H 8,12; N 11,13; S 2, 87;

Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentua len Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Belastungsgrad des Polymers mit Tetraacetyl-glucosaminresten pro Molekül.

b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Acetyl-β-D- glucosaminopyranosyl-1-thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 2,5 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 13a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 1,74 g (88,3% d. Th.) der oben genann ten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 10,02%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 49,84; H 7,10; N 13,65; S 3,60;
gef.: C 50,02; H 7,18; N 13,72; S 3,67;

c) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Acetyl-β-D- glucosaminopyranosyl-1-thio-3-propionsäure-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 10d) beschrieben, führt die Komplexierung von 1,5 g (0,13 mmol; entsprechend 1,42 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelver bindung aus Beispiel 13b) mit 380 mg (1,45 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 1,69 g (98,0% d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 7,44%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,48; H 5,95; N 11,91; S 3,14; Gd 13,02;
gef.: C 43,55; H 6,04; N 11,88; S 3,18; Gd 12,98;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und
13 N-Acetyl-D-glucosaminopyranosylreste

Beispiel 14 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₂₉-Konjugat a) 48er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₉-Konjugat

5,0 g (0,47 mmol; entsprechend 22,6 mmol an freien Aminfunktionen) 48er- Starburst-Kaskadenamin (Tomalia D. A.,et al.; Polym. J. (Tokyo) 1985, 17, 117; Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1986, 19, 2466; Tomalia D. A.,et al.; Macromolecules 1987, 20, 1164) werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. An schließend gibt man insgesamt 10,9 g (27,12 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mo no-ethylester portionsweise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32%iger Na tronlauge auf 11,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultra filtriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Vo lumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 8,06 g (88,3%; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 7,32%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,18; H 6,50; N 17,59; Na 8,99;
gef.: C 45,26; H 6,61; N 17,32; Na 9,04;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 40,1% (entsprechend 19 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion [Lit.: Chem. Rev., 60, 39 (1960); Tetrahedron, 34, 1285 (1978); 47, 8791 (1991)] lie gen im Mittel im Polyamin 29 freie Aminofunktionen pro Molekül vor.

b) 48er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₂₉-Konjugat

1,0 g (0,051 mmol; entsprechend 1,5 mmol an freien Aminofunktionen) der Ti telverbindung aus Beispiel 14a) werden in 80 ml entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 molarer Salzsäure auf 9,5 eingestellt. Anschließend wird portionsweise mit insgesamt 1,55 g (4,9 mmol) p-Iso thiocyanatophenyl-β-D-galactopyranose versetzt, wobei der pH-Wert der Reak tionslösung mittels 0,1 molarer Natronlauge bei 9,5 konstant gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei 22°C wird filtriert und mit destillier tem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml aufgefüllt. Dreimalige Ultra filtration der Reaktionslösung über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON ®) gefolgt von Gefriertrocknung des verbleibenden Rückstands liefert 1,34 g (92% d. Theorie) eines amorphen und farblosen Feststoffs.
Wassergehalt: 4,9%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,62; H 6,06; N 13,39; S 3,26; Na 6,12;
gef.: C 46,71; H 6,13; N 13,28; S 3,20; Na 6,21;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer lie gen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Poly mers mit 60% D-Galactose (entsprechend 29 Galactoseresten pro Molekül).

c) 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)- β-D-galactopyranosyl]₂₉-Konjugat

1,0 g (6,035 mmol; entsprechend 0,66 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 14b) werden in 40 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raum temperatur mit einer Lösung von 0,18 g (0,7 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet.
Ausbeute: 1,0 g (95% d. Th.) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 5,23%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,06; H 5,67; N 12,66; S 13,08; Gd 9,89; Na 1,45;
gef.: C 44,20; H 5,71; N 12,59; S 13,11; Gd 10,01; Na 1,47;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 40% Gd-DPTA und 60% D-Galactose (entsprechend 19 Gd-DTPA-Einheiten und 29-D-Galactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktionen keine frei en Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 15 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₂₉-Konjugat a) 48er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₂₉-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,75 g (0,038 mmol; entsprechend 1,12 mmol an freien Aminfunktionen) der Ti telverbindung aus Beispiel 14a) mit 1,2 g (3,8 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-α- D-mannopyranose [Darstellung gemäß: Monsigny, M. et al., Biol. Cell, 51, 187 (1984)] nach Aufarbeitung 0,94 g (89,2% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 5,03%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,62; H 6,06; N 13,39; S 3,26; Na 6,12;
gef.: C 46,70; H 6,01; N 13,42; S 3,24; Na 6,09;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 60% D-Mannose (entsprechend 29 Mannoseresten pro Mo lekül).

b) 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₂₉-Konjugat

0,85 g (0,029 mmol; entsprechend 0,56 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 15a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 0,15 g (0,58 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, kom plexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 854 mg (97,5% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 6,14%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,06; H 5,76; N 12,66; S 3,08; Gd 9,89; Na 1,45;
gef.: C 44,10; H 5,66; N 12,71; S 3,12; Gd 9,94; Na 1,38;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 40% Gd-DPTA und 60% D-Mannose (entsprechend 19 Gd-DTPA-Einheiten und 29-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktionen keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 16 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₂₉-Konjugat a) 48er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₂₉-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,051 mmol; entsprechend 1,5 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 14a) mit 1,44 g (4,56 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β- D-glucopyranose [Kaufware: Sigma oder Darstellung in Analogie zu: Monsigny et al., Biol. Cell., 51, 187 (1984)] nach Aufarbeitung 1,36 mg (94% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 5,08%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,62; H 6,06; N 13,39; S 3,26; Na 6,12;
gef.: C 46,55; H 6,12; N 13,29; S 3,24; Na 6,01;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 60% D-Glucose (entsprechend 29 Glucoseresten pro Mole kül).

b) 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-β -D-glucopyranosyl]₂₉-Konjugat

1,0 g (0,034 mmol; entsprechend 0,646 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 16a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 0,17 g (0,66 mmol), gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, einer Gadolinium chloridlösung komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 998 mg (97,2% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 3,94%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,06; H 5,67; N 12,66; S 3,08; Gd 9,89; Na 1,45;
gef.: C 44,12; H 5,67; N 12,74; S 3,00; Gd 10,01; Na 1,38;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 40% Gd-DPTA und 60% D-Glucose (entsprechend 19 Gd-DTPA-Einheiten und 29-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktionen keine frei en Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 17 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-α-L- fucopyranosyl]₂₉-Konjugat a) 48er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- L-fucopyranosyl]₂₉-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,051 mmol; entsprechend 1,48 mmol an freien Aminfunktionen) der Ti telverbindung aus Beispiel 14a) mit 1,65 g (5,57 mmol) p-Isothiocyanatophenyl- α-L-Fucopyranose [Darstellung gemäß: Tamio et al., Jpn. Kokai Tokio Koho, Jp 4211099 und Hilditch et al., J. Appl. Phycol. 3 (4), 345, (1991)] nach Aufarbei tung 1,36 g (94% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 7,24%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,39; H 6,16; N 13,62; S 3,31; Na 6,22;
gef.: C 47,42; H 6,08; N 13,57; S 2,98; Na 6,30;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 60% L-Fucose (entsprechend 29 α-L-Fucoseresten pro Mo lekül).

b) 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-[1-(4-Thioureidophenyl)- α-L-fucopyranosyl]₂₉-Konjugat

1,2 g (0,042 mmol; entsprechend 0,81 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 17a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 0,21 g (0,83 mmol) einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung, gelöst in 10 ml destillier tem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1,25 g (98,5% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 4,39%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,72; H 5,81; N 12,89; S 3,12; Gd 10,04; Na 1,47;
gef.: C 44,81; H 5,79; N 12,78; S 3,16; Gd 10,09; Na 1,40;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 40% Gd-DPTA und 60% α-L-Fucose (entsprechend 19 Gd-DTPA-Einheiten und 29 α-L-Fucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktionen keine frei en Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 18 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₀-Konjugat

Eine Lösung von 5,0 g (0,97 mmol, entsprechend 23,3 mmol an freien Amin funktionen) 24er-Starburst-Dendrimer-Polyamin (Darstellung gemäß: Tomalia D. A. et al.; Macromolecules 1986, ii, 2466; Tomalia D. A. et al.; Macromo lecules 1987, 20, 1164) wird in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 11,2 g (27,9 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mono-ethylester portions weise hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 mola rer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH- Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32%iger Natronlauge auf 11,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wurde dreimal mittels einer YMB-Ultrafiltra tionsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der ver bleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 4,6 g (92% d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amor phes Pulver
Wassergehalt: 8,37%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,72; H 6,58; N 17,29; Na 9,38;
gef.: C 44,64; H 6,51; N 17,36; Na 9,42;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, er gibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 41,6% (entsprechend 10 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion liegen im Mittel im Polymer 14 freie Aminofunktionen pro Molekül vor.

b) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,10 mmol; entsprechend 1,43 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 18a) mit 1,60 g (5,03 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β- D-galactopyranose nach Aufarbeitung 1,32 g (93,3% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 7,31%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,25; H 6,13; N 13,31; S 3,16; Na 6,47;
gef.: C 46,32; H 6,19; N 13,28; S 3,09; Na 6,51;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59% D-Galactose (entsprechend 14 Galactoseresten pro Molekül).

c) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₁₄-Konjugat

1,0 g (0,07 mmol; entsprechend 0,7 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 18b) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 0,18 g (0,72 mmol) einer wässrigen Gadoliniumchloridlösung, gelöst in 10 ml destillier tem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1,05 g (97,3% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 5,67%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,59; H 5,77; N 12,53; S 2,98; Gd 10,42; Na 1,52;
gef.: C 43,61; H 5,81; N 12,49; S 2,94; Gd 10,48; Na 1,47;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41% Gd-DPTA und 59% D-Galactose (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14-D-Galactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 19 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,95 g (0,096 mmol; entsprechend 1,344 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 18a) mit 1,29 g (94,6 mmol) p-Isothiocyanato phenyl-α-D-mannopyranose nach Aufarbeitung 1,29 g (94,6% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 6,88%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,25; H 6,13 N 13,31; S 3,16; Na 6,41;
gef.: C 46,09; H 6,07; N 13,33; S 3,24; Na 6,51;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59% D-Mannose (entsprechend 14 Mannoseresten pro Mo lekül).

b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₁₄-Konjugat

1,1 g (0,077 mmol; entsprechend 0,77 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 19a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 194,2 mg (0,79 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komplexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1,14 g (98,6 d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 4,72%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,55; H 5,77; N 12,53; S 2,98; Gd 10,42; Na 1,52;
gef.: C 43,61; H 5,82; N 12,48; S 3,04; Gd 10,38; Na 1,49;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41% Gd-DPTA und 59 D-Mannose (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14-D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 20 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₀-(1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,2 g (0,12 mmol; entsprechend 1,21 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 18a) mit 1,92 g (6,03 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β- D-glucopyranose nach Aufarbeitung 1,59 g (93,6% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 5,97%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,25; H 6,13; N 13,31; S 3,16; Na 6,27;
gef.: C 46,20; H 6,21; N 13,32; S 3,08; Na 6,37;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59% D-Glucose (entsprechend 14 Glucoseresten pro Mole kül).

b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₁₄-Konjugat

1,40 g (0,089 mmol; entsprechend 0,89 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 20a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 219 mg (0,90 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, kom plexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1,32 g (98,7% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 7,33%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,55; H 5,77; N 12,53; S 2,98; Gd 10,42; Na 1,52;
gef.: C 43,62; H 5,80; N 12,49; S 2,96; Gd 10,47; Na 1,58;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41% Gd-DPTA und 59% D-Glucose (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktionen keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 21 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-α-L- fucopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-α-L- fucopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,10 mmol; entsprechend 1,4 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 18a) mit 1,50 g (5,03 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-α -L-fucopyranose nach Aufarbeitung 1,3 g (94,2% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 6,08%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,00; H 6,23; N 13,53; S 3,21; Na 6,58;
gef.: C 46,94; H 6,19; N 13,55; S 3,25; Na 6,60;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59% L-Fucose (entsprechend 14 Fucoseresten pro Molekül).

b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- L-fucopyranosyl]₁₄-Konjugat

1,1 g (0,078 mmol; entsprechend 0,78 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 21a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 197 mg (0,79 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komple xiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1,14 g (98,6% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 6,97%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,20; H 5,86; N 12,72; S 3,02; Gd 10,58; Na 1,55;
gef.: C 44,28; H 5,88; N 12,69; S 2,99; Gd 10,62; Na 1,51;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41% Gd-DPTA und 59% D-Glucose (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14-D-Glucoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 22 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-N- acetyl-β-D-glucosaminopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-N- acetyl-β-D-glucosaminopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 14b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,10 mmol; entsprechend 1,4 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 18a) mit 2,50 g (7,04 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β- D-glucopyranose nach Aufarbeitung 1,4 g (95% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 8,06%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,73; H 6,18; N 14,12; S 3,04; Na 6,22;
gef.: C 46,69; H 6,21; N 14,20; S 3,00; Na 6,24;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 59% N-Acetyl-D-Glucosamin (entsprechend 14 N-Acetyl-D- Glucosaminresten pro Molekül).

b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-N- acetyl-β-D-glucosaminopyranosyl]₁₄-Konjugat

1,6 g (0,10 mmol; entsprechend 1,08 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 22a) werden in Analogie wie für Beispiel 14c) beschrieben mit 278 mg (1,10 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komple xiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1,54 g (98,7% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 5,51%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,10; H 5,83; N 13,33; S 2,87; Gd 10,04; Na 1,47;
gef.: C 44,19; H 5,91; N 13,41; S 2,80; Gd 10,08; Na 1,44;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 41% Gd-DPTA und 59% N-Acetyl-D-Glucosamin (entsprechend 10 Gd-DTPA-Einheiten und 14 N-Acetyl- D-Glucosaminresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrin reaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 23 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(α-D-mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat a) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₁

20,0 g (26,8 mmol) Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester (Titelverbindung aus Bei spiel 31f) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 3,7 g (32,16 mmol) N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei die ser Temperatur portionsweise mit insgesamt 6,6 g (32,16 mmol) Dicyclo hexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 8,8 g (1,18 mmol; entsprechend 42,8 mmol an freien Aminofunktionen) 36er-Kaskadenpolyamin und 4,3 g (44,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der ver bleibende Rückstand mit 250 ml Dichlormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organisierte Phase nacheinander mit 5%iger Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natrium sulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 12,5 g (86,2% d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfol genden Syntheseschritte eingesetzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreaktion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 20 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.

Elementaranalyse:
ber.: C 67,65; H 10,32; N 8,72;
gef.: C 67,50; H 10,41; N 8,91;

b) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₆- [3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-thio)-α-D-mannopyranosyl-3-propion- Amid]₂₀-Konjugat

Eingerührte Lösung von 3,5 g (0,28 mmol; entsprechend 5,6 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 23a) in 100 ml absolutem Dichlormethan wird bei Raumtemperatur mit 708 mg (7,0 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 3,6 g (6,8 mmol) 3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid ester (Darstellung in Analogie zu: J. Haensler et al., Bioconjugate Chem 4, 85, (1993); Chipowsky, S., and Lee, Y. C (1973), "Synthesis of 1-Thio-aldosides"; Carbohydrate Research 31, 339-346) in 60 ml Dichlormethan tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Dichlormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organi sche Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne ab gezogen. Man erhält 5,25 g (90,4% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Elementaranalyse:
ber.: C 59,99; H 8,38; N 5,19; S 3,09;
gef.: C 60,41; H 8,52; N 5,08; S 3,00;

Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 55,5% D-Mannose tetraacetat (entsprechend 20 D-Mannoseresten pro Molekül).

c) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(α-D-mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat

5,0 g (0,24 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 23b) werden in 100 ml abso lutem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32%igen wässrigen Ammoniaklösung ver setzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert. Die wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit 10%iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht mit Wasser auf ein Ge samtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltra tionsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der ver bleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 2,69 g (94,1% d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver
Wassergehalt: 7,78%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,03; H 6,62; N 9,06; S 5,19;
gef.: C 46,98; H 6,73; N 9,10; S 5,24;

d) 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(α-D-mannopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat

2,0 g (0,16 mmol; entsprechend 2,6 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbin dung aus Beispiel 23c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweiser Zugabe mit 10%iger wässrigen Salz säure auf 5,0 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur 709 mg (2,7 mmol) Gadoliniumchlorid hinzu, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 ge bracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufge füllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefrier getrocknet. Man erhält 2,31 g (97,5% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 6,7%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 39,24; H 5,11; N 7,56; S 4,33; Gd 16,98;
gef.: C 39,42; H 5,21; N 7,52; S 4,39; Gd 17,02;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 44% Gd-Gly-Me-DOTA und 56% D-Mannose (entsprechend 16 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 20-D- Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreak tion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 24 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(β-D-glucopyranosyl-1-thio- 3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat a) 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)₁₆- [-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-β-D-glucopyranosyl-3-propionsäure- Amid)]₂₀-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 23b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,5 g (0,28 mmol; entsprechend 5,6 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 23a) mit 3,6 g (6,8 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-β-D-glucopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (Darstellung in Analogie zu: J. Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4, 85, (1993); Chipowsky, S., and Lee, Y. C. (1973), Synthesis of 1-Thio-aldosides; Carbohydrate Re search 31, 339-346) 5,4 g (93% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 59,99; H 8,38; N 5,19; S 3,09;
gef.: C 60,32; H 8,30; N 5,09; S 3,18;

Die Titelverbindung zeigt eine negative quantitative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Bela dungsgrad des Polymers mit 20 D-Glucoseresten pro Molekül.

b) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(β-D-glucopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 23c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5 g (0,24 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 24b) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,6 g (88,6% d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 6,03%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,03; H 6,62; N 9,06; S 5,19;
gef.: C 47,12; H 6,71; N 9,02; S 5,30;

c) 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(β-D-glucopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 23d) beschrieben, führt die Komplexierung von 2,0 g (0,16 mmol; entsprechend 2,6 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titel verbindung aus Beispiel 24b) mit 709 mg (2,7 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 2,35 g (98% d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 5,2%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 39,24; H 5,11; N 7,56; S 4,33; Gd 16,98;
gef.: C 39,61; H 5,20; N 7,49; S 4,41; Gd 16,94;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
16 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 44,4%)
und 20 D-Glucopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 55,6%)

Die Polymerbeladungsgrade wurden aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ermittelt.

Beispiel 25 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(β-D-galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat a) 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)₁₆- [3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-β-D-galactopyranosyl-3-propion säure-Amid)]₂₀-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 23b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,5 g (0,28 mmol; entsprechend 5,6 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 23a) mit 3,6 g (6,8 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-β-D-galactopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester [Darstellung in Analogie zu: J. Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4, 85, (1993); Chipowsky, S., and Lee, Y. C (1973), "Synthesis of 1-Thio-aldosides; Carbohydrate Re search 31, 339-346] 5,1 g (87,8% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 59,99; H 8,38; N 5,19; S 3,09;
gef.: C 60,03; H 8,46; N 5,24; S 3,14;

Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentua len Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 20 D-Galactoseresten pro Molekül.

b) 36er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(β-D-galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 23c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5,0 g (0,24 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 25b) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,64 g (90,2% d. Th.) der oben genann ten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 8,3%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,03; H 6,62; N 9,06; S 5,19;
gef.: C 47,12; H 6,71; N 9,00; S 5,07;

c) 36er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₆-(β-D-galactopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid)₂₀-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 23d) beschrieben, führt die Komplexierung von 2,5 g (0,2 mmol; entsprechend 3,2 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbin dung aus Beispiel 24b) mit 867 mg (3,3 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 2,88 g (97,3% d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 9,3%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 39,24; H 5,11; N 7,56; S 4,33; Gd 16,98;
gef.: C 39,21; H 5,04; N 7,63; S 4,41; Gd 17,07;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
16 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 43,8%)
und 20 D-Galactopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 56,2%)

Beispiel 26 48er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(α-D-mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat a) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)₂₁

20,0 g (26,8 mmol) Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester (Titelverbindung aus Bei spiel 31f) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 3,7 g (32,16 mmol) N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei die ser Temperatur portionsweise mit insgesamt 6,6 g (32,16 mmol) Dicyclo hexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 6,0 g (0,92 mmol; entsprechend 4,4 mmol an freien Aminofunktionen) 48er-Kaskadenpolyamin und 4,5 g (46,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der ver bleibende Rückstand mit 250 ml Dichlormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organisierte Phase nacheinander mit 5%iger Salzsäure, gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natrium sulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 13,75 g (83,2% d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfol genden Syntheseschritte eingesetzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreaktion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 27 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.

Elementaranalyse:
ber.: C 63,35; H 9,61; N 16,36;
gef.: C 63,18; H 9,70; N 16,44;

b) 48er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)₂₁- [3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-α-D-mannopyranosyl-3-propion-Amid]₂₇- Konjugat

Eine gerührte Lösung von 3,5 g (0,19 mmol; entsprechend 5,13 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 26a) in 100 ml absolutem Dichlormethan wird bei Raumtemperatur mit 657 mg (6,5 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid ester in 60 ml Dichlormethan tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Dichlormethan auf ein Gesamt volumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zwei mal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 5,07 g (92,6 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die quantitative Ninhydrinreak tion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Elementaranalyse:
ber.: C 58,65; H 7,98; N 10,21; S 3,00;
gef.: C 58,90; H 8,08; N 10,14; S 2,96;

Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 56,2% D-Mannose tetraacetat (entsprechend 27 D-Mannoseresten pro Molekül).

c) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(α-D-mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat

5,0 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 26b) werden in 100 ml abso lutem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32%igen wässrigen Ammoniaklösung ver setzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert. Die wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit 10%iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht mit Wasser auf ein Ge samtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltra tionsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der ver bleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 3,47 g (90,6% d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver
Wassergehalt: 9,11%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 51,08; H 7,12; N 13,32; S 3,92;
gef.: C 50,97; H 7,21; N 13,30; S 3,86;

d) 48er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(α-D-mannopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat

3,0 g (0,136 mmol; entsprechend 285 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbin dung aus Beispiel 26c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10%iger wässrigen Salz säure auf 5,0 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur 787 mg (3,0 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 ge bracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufge füllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefrier getrocknet. Man erhält 3,31 g (96,3% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 4,9%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,54; H 5,96; N 11,62; S 3,42; Gd 13,04;
gef.: C 44,59; H 6,04; N 11,55; S 3,41; Gd 13,10;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 43,8% Gd-Gly-Me-DOTA und 56,2% D-Mannose (entsprechend 21 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 27- D-Mannoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrin reaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 27 48er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(β-D-glucopyranosyl-1-thio-3- propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat a) 48er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)₂₁- [3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1-thio)-β-D-glucopyranosyl-3-propion- Amid]₂₇-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 26b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,5 g (0,19 mmol; entsprechend 5,13 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 26a) mit 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-β-D-glucopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester 5,57 g (93 d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 58,65; H 7,98; N 10,21; S 3,00;
gef.: C 58,68; H 8,10; N 10,20; S 3,07;

Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentua len Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Belastungsgrad des Polymers mit 27 D-Glucoseresten pro Molekül.

b) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(β-D-glucopyranosyl-1-thio-3- propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 26c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 27a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,23 g (84,7% d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 7,44%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 51,08; H 7,12; N 13,32; S 3,92;
gef.: C 51,11; H 7,10; N 13,26; S 4,01;

c) 48er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(β-D-glucopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 26d) beschrieben, führt die Komplexierung von 3,0 g (0,136 mmol; entsprechend 2,85 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titel verbindung aus Beispiel 27b) mit 787 mg (3,0 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 3,36 g (98% d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 4,41%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,54; H 5,96; N 11,62; S 3,42; Gd 13,04;
gef.: C 44,39; H 5,88; N 11,74; S 3,40; Gd 13,00;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
21 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 43,8%)
und 27 D-Glucopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 56,2%)

Beispiel 28 48er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(β-D-galactopyranosyl-1-thio- 3-propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat a) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-tert.butylester-Amid)₂₁-[3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio)-β-D-galactopyranosyl-3-propion-Amid]₂₇-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 26b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,5 g (0,19 mmol; entsprechend 5,13 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 26a) mit 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-β-D-galactopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester 5,23 g (90,2 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 58,65; H 7,98; N 10,21; S 3,00;
gef.: C 58,66; H 8,00; N 10,31; S 3,11;

Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentua len Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 27 D-Galactoseresten pro Molekül.

b) 48er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(β-D-galactopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 26c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5,0 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 28a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 3,48 g (91,4% d. Th.) der oben genann ten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 6,79%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 51,08; H 7,12; N 13,32; S 3,92;
gef.: C 51,12; H 7,19; N 13,27; S 3,99;

c) 48er-Kaskadenamin-(Gd- Gly-Me-DOTA-Amid)₂₁-(β-D-galactopyranosyl- 1-thio-3-propionsäure-Amid)₂₇-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 26d) beschrieben, führt die Komplexierung von 3,0 g (0,136 mmol; entsprechend 2,85 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titel verbindung aus Beispiel 28b) mit 787 mg (3,3 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 3,32 g (96,9% Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 8,70%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,54; H 5,96; N 11,62; S 3,42; Gd 13,04;
gef.: C 44,50; H 5,94; N 11,58; S 3,37; Gd 12,98;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
21 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 43,6%)
und 27 D-Galactopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 56,4%)

Beispiel 29 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-(O-β-D-Galactopyranosyl-(1→4)- D-glucono-1,5-lacton-Amid)₂₉-Konjugat a) 48er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₉-(O-β-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1,5-lacton-Amid)₂₉-Konjugat

Zu einer gerührten Lösung von 4,0 g (0,20 mmol; entsprechend 6,0 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 14a) werden bei Raumtemperatur in 40 ml absolutem Dimethylsulfoxid suspendiert. An schließend wird eine Lösung von 13,3 g (37,2 mmol, entsprechend 6,26 g Lacton pro vorliegender Aminofunktion) O-β-D-Galactopyranosyl-(1-4)-D- glucono-1,5-lacton (Darstellung gemäß (a) Williams, T. J.; Plessas, N. R., Gold stein, I. J. Carbohydr. Res. 1978, 67, CI. (b) Kobayashi, K.; Sumitomo, H.; Ina, Y. Polym. J. 1985, 17, 567, (c) Hiromi Kitano, Katsuko Sohda, and Ayako Kosaka, Bioconjugate Chem. 1995, 6, 131-134) in 40 ml absolutem Dimethylsulfoxid bei 22°C tropfenweise addiert. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 14 Stunden bei 40°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei Raumtemperatur mit 500 ml absolutem Methanol versetzt und der entstehende farblose Niederschlag mittels einer G4-Fritte abgesaugt und gut mit insgesamt 250 ml absolutem Methanol nachgewaschen. Der so erhaltene Feststoff wird nun in 500 ml destil liertem Wasser gelöst und über eine Ultrafiltrationsmembran (YM-3, Amicon, Ausschlußgrenze 3 kD) insgesamt dreimal ultrafiltriert. Der verbleibende Rück stand wird vollständig in destilliertem Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5,42 g (92,7% d. Th.) als farbloses Lyophilisat
Wassergehalt: 8,34%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,23; H 6,31; N 11,66; Na 5,96;
gef.: C 44,41; H 6,28; N 11,60; Na 6,03;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, er gibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 39,4% (entsprechend 19 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach Ninhydrinreaktion sind in der oben genann ten Titelverbindung keine Aminofunktionen mehr nachweisbar.

b) 48er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₉-(O-β-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1,5-lacton-Amid)₂₉-Konjugat

4,0 g (0,136 mmol; entsprechend 2,6 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 29a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 691 mg (2,65 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komple xiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 4,14 g (98,7% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 6,94%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,84; H 5,96; N 11,03; Gd 9,64; Na 1,41;
gef.: C 41,90; H 6,03; N 10,97; Gd 9,61; Na 1,39;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode der Titelverbindung verlau fen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen.

Beispiel 30 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-(O-β-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1,5-lacton-Amid)₁₄-Konjugat a) 24er-Starburst-Dendrimer-(DTPA-Amid)₁₀-(O-β-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1,5-lacton-Amid)₁₄-Konjugat

Zu einer gerührten Lösung von 4,0 g (0,4 mmol), entsprechend 5,7 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 18a) werden bei Raumtemperatur in 40 ml absolutem Dimethylsulfoxid suspendiert. An schließend wird eine Lösung von 12,66 g (35,4 mmol, entsprechend 6,2 g Lacton pro vorliegende Aminofunktion) O-β-D-Galactopyranosyl-(1-4)-D- glucono-1,5-lacton in 40 ml absolutem Dimethylsulfoxid bei 22°C tropfenweise addiert. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 14 Stunden bei 40°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei Raumtemperatur mit 500 ml absolutem Methanol versetzt und der entstehende farblose Niederschlag mittels einer G4- Fritte abgesaugt und gut mit insgesamt 200 ml absolutem Methanol nachge waschen. Der so erhaltene Feststoff wird nun in 350 ml destilliertem Wasser gelöst und über eine Ultrafiltrationsmembran (YM-3, Amicon, Ausschlußgrenze 3 kD) insgesamt dreimal ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird vollstän dig in destilliertem Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5,6 g (96,0% d. Th.) als farbloses Lyophilisat
Wassergehalt: 10,2%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,95; H 6,37; N 11,63; Na 6,31;
gef.: C 44,06; H 6,22; N 11,59; Na 6,40;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 41,5% (entsprechend 10 DTPA-Einheiten pro Molekül).

Nach Ninhydrinreaktion als auch TNBS-Methode sind in der oben genannten Titelverbindung keine Aminofunktionen mehr nachweisbar.

b) 24er-Starburst-Dendrimer-(Gd-DTPA-Amid)₁₀-(O-β-D-Galactopyranosyl- (1→4)-D-glucono-1,5-lacton-Amid)₁₄-Konjugat

5,0 g (0,343 mmol; entsprechend 10,34 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 30a) werden in Analogie wie für Beispiel 1c) beschrieben mit 2,72 g (10,45 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, komple xiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 5,17 g (97,6% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 8,11%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,44; H 6,00; N 10,97; Gd 10,18; Na 1,49;
gef.: C 41,51; H 5,96; N 11,03; Gd 10,24; Na 1,46;

Beispiel 31 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-Konjugat

Eine gerührte Suspension von 5,0 g (7,95 mmol) der Titelverbindung aus Bei spiel 31 h) in 15 ml absolutem Dimethylsulfoxid wird bei 70°C mit 0,68 g (15,9 mmol) Lithiumchlorid versetzt. Nach 30 Minuten bei 70°C wird die nun klare Reaktionslösung portionsweise mit insgesamt 1,83 g (15,9 mmol) N-Hydroxy succinimid versetzt und das Reaktionsgemisch noch 1 Stunde bei dieser Tem peratur gehalten. Nach dem Abkühlen auf 0°C wird mit 4,52 g (23,85 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und die Reaktionslösung noch 1 weitere Stun de bei 0°C, gefolgt von 12 Stunden bei 22°C, gerührt. Die so erhaltene Reak tionslösung des N-Hydroxysuccinimidesters der Titelverbindung aus Beispiel 31h) wird nun bei 22°C tropfenweise mit einer Lösung von 2,61 g (0,55 mmol, entsprechend 13,23 mmol an freien Aminfunktionen, 24er Kaskadenpolyamin, gelöst in 15 ml absolutem Dimethylsulfoxid versetzt und weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wird die Reaktionslösung bei 22°C in 1,5 l Aceton eingetropft, wobei die Titelverbindung als farbloser Niederschlag ausfällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) dreimal ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird in 300 ml destilliertem Wasser gelöst, filtriert und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 4,0 g (82,0% bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes und farbloses Pulver.
Wassergehalt: 7,38%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,10; H 6,07; N 14,97; Gd 17,69;
gef.: C 43,18; H 5,99; N 15,03; Gd 17,74;

Nach Elementaranalyse ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 41,5% Gd-Gly-Me-DOTA (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten pro Molekül). Die Bestimmung der im Polymer verbliebenen freien Aminofunktionen mittels Ninhydrin und TNBS-Methode liefert als Mittelwert 58,1% an freien Aminogrup pen, d. h. im Polymermolekül liegen 14 freie Aminofunktionen vor.

b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)- β-D-galactopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1d) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,112 mmol; entsprechend 1,57 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 31a) mit 2,5 g (7,87 mmol; entsprechend 5 Molequivalente bezogen auf eingesetztes Polyamin) p-Isothiocyanatophenyl-β- D-galactopyranose nach Aufarbeitung 1,33 g (93,2% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 7,41%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,32; H 5,66; N 11,50; S 3,78; Gd 11,84;
gef.: C 45,40; H 5,72; N 11,61; S 3,42; Gd 11,88;

Die Ninhydrinreaktion als auch in TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem molaren Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 58,3% D-Galactopyranose (entsprechend 14 Galactoseresten pro Molekül) sowie 41,7% Gd-Gly-DOTA (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexe pro Molekül).

c) N-(2-Brompropionyl)-glycinbenzylester

Zu 100 g (296,4 mmol) Glycinbenzylester p-Toluolsulfonsäuresalz und 89,98 g (889,2 mmol) Triethylamin in 500 ml Methylenchlorid tropft man bei 0°C 60,97 g (355,7 mmol) α-Brompropionylchlorid zu. Dabei hält man die Temperatur zwi schen 0°C-5°C. Man gibt 1000 ml 5%ige aqu. Salzsäure zu und trennt die or ganische Phase ab. Die organische Phase wird noch einmal mit 500 ml 5%iger aqu. Salzsäure extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Di-isopropylether umkristallisiert.
Ausbeute: 69,39 g (78% d. Th.)

Elementaranalyse:
ber.: C 48,02; H 4,70; N 4,67; Br 26,62;
gef.: C 47,91; H 4,82; N 4,51; Br 26,47;

d) 1-[1-Benzyloxycarbonylmethylcarbamoyl)-ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclodo decan

Zu 86,14 g (500 mmol) 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan gelöst in 1000 ml Chlo roform gibt man 50 g (166,6 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31c) und rührt 24 Stunden bei Raumtemperatur. Man extrahiert 3 mal mit 600 ml Wasser, trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum zur Trockne ein.
Ausbeute: 53,48 g (82% d. Th.) eines leicht gelb gefärbten Öls
Wassergehalt: 1,5%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 61,36; H 8,50; N 17,89;
gef.: C 62,03; H 8,75; N 17,36;

e) 10-[1-Benzyloxycarbonylmethylcarbamoyl)-ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclodo decan-1,4,7-triessigsäure-tri-tert-butylester, Natriumbromid

Zu 50 g (127,7 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31d) und 54,14 g (510,8 mmol) Natriumcarbonat in 500 ml Acetonitril gibt man 82,20 g (421,4 mmol) Bromessigsäure-tert.-butylester und rührt 12 Stunden bei 60°C. Man kühlt auf 0°C und filtriert von den Salzen ab. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Laufmittel : Methylenchlo rid/Methanol = 20 : 1).
Ausbeute: 90,83 g (85% d. Th.) eines farblosen Feststoffes

Elementaranalyse:
ber.: C 54,54; H 7,59; N 8,37; Na 2,75; Br 9,55;
gef.: C 54,37; H 7,71; N 8,21; Na 2,83; Br 9,69;

f) 10-[1-Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecan- 1,4,7-triessigsäure-tri-tert-butylester, Natriumbromid

90 g (107,5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31e) löst man in 1000 ml Isopropanol und gibt 5 g Palladiumkatatlysator (10% Pd/C) zu. Man hydriert über Nacht bei Raumtemperatur. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Fil trat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Dioxan umkristallisiert.
Ausbeute: 77,06 g (96% d. Th.) eines kristallinen Feststoffes

Elementaranalyse:
ber.: C 49,86; H 7,69; N 9,38; Na 3,08; Br 10,70;
gef.: C 49,73; H 7,79; N 9,21; Na 3,19; Br 10,83;

g) 10-[1-Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecan- 1,4,7-triessigsäure

77 g (103,1 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31f) werden in 500 ml Trifluoressigsäure gelöst und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man dampft zur Trockne ein, nimmt den Rückstand in 300 ml Wasser auf und gibt die Lösung auf eine Säule, gefüllt mit Reillex® 425 PVP. Man eluiert mit Was ser. Die produkthaltigen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne einge dampft, der Rückstand wird aus Methanol/Aceton umkristallisiert.
Ausbeute: 44,04 g (84% d. Th.) eines farblosen, hygroskopischen Feststoffes
Wassergehalt: 6,5%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,99; H 6,99; N 14,73;
gef.: C 47,83; H 7,12; N 14,55;

h) Gadolinium-Komplex der 10-[1-Carboxymethylcarbamoyl)-ethyl]-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure

Zu 40 g (84,12 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 31 g), gelöst in 400 ml Wasser, gibt man 15,27 g (42,06 mmol) Gadoliniumoxid und erwärmt 3 h auf 90°C. Man dampft zur Trockne ein (Vakuum) und kristallisiert den Rückstand aus 90% aqu. Ethanol um. Die Kristalle werden abgesaugt, einmal mit Ethanol, dann mit Aceton und zum Schluß mit Dimethylether gewaschen und im Va kuumofen bei 130°C getrocknet (24 Stunden).
Ausbeute: 50,53 g (93% d. Th.) eines farblosen kristallinen Pulvers
Wassergehalt: 2,5%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 36,24; H 4,80; N 11,12; Gd 24,97;
gef.: C 36,35; H 4,95; N 10,98; Gd 24,80;

Beispiel 32 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)- α-D-mannopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)- α-D-mannopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,11 mmol; entsprechend 1,57 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 31g) mit 2,5 g (7,87 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-α- D-mannopyranose nach Aufarbeitung 1,38 g (94,7% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 5,76%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,32; H 5,66; N 11,50; S 3,38; Gd 11,84;
gef.: C 45,42; H 5,72; N 11,47; S 3,41; Gd 11,81;

Die Ninhydrinreaktion als auch in TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 56,8% D-Mannopyranose (entsprechend 14 Mannoseresten pro Molekül) sowie 41,2% (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexen pro Molekül).

Beispiel 33 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- glucopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)- β-Dglucopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,2 g (0,13 mmol; entsprechend 1,89 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 31g) mit 2,34 g (7,87 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β- D-glucopyranose nach Aufarbeitung 1,53 g (88,9% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 6,44%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,05; H 5,85; N 11,68; S 7,44; Gd 12,03;
gef.: C 45,96; H 5,90; N 11,71; S 3,40; Gd 12,10;

Die Ninhydrinreaktion als auch in TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 57,9% D-Glucopyranose (entsprechend 14 Glucoseresten pro Molekül) und 42,1% (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexen pro Molekül).

Beispiel 34 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)-α-L- fucopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-(4-Thioureidophenyl)- α-L-fucopyranosyl]₁₄-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,112 mmol; entsprechend 1,57 mmol an freien Aminfunktionen) der Ti telverbindung aus Beispiel 31a) mit 2,34 g (7,87 mmol) p-Isothiocyanatophenyl- α-L-fucopyranose nach Aufarbeitung 1,37 g (93,7% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 4,92%

Die Ninhydrinreaktion als auch in TNBS-Methode der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 54,1% α-L-Fucose (entsprechend 13 α-L-Fucoseresten pro Molekül) sowie 40,6% (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexen pro Molekül).

Beispiel 35 a) 1-[4-Nitrophenyl]-tetraethylenglycol

863,2 (5 mol) Tetraethylenglycol werden in 2,5 l wasserfreiem Toluol gelöst und bei Raumtemperatur nacheinander mit 159,4 g (2,5 mol) 88%igem Kalium hydroxydpulver und 7,5 g Tetrabutylammoniumhydrogensulfat versetzt. Bei 0°C wird dann unter starkem Rühren eine Lösung von 53 ml (500 mmol) 4-Fluor nitrobenzol in 500 ml wasserfreiem Toluol tropfenweise addiert. Nach beende ter Zugabe wird nach 4 Stunden bei 0°C und 12 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Zur Aufarbeitung wird das Reaktionsgemisch in 2000 ml Eiswasser eingerührt und anschließend wird die Toluolphase abgetrennt und die wässrige Phase erschöpfend mit Toluol extrahiert. Nach dem Waschen der vereinigten organischen Phasen mit Wasser wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der verbleibende, leicht gelblich gefärbte, ölige Rückstand wird säulenchromatographisch gerei nigt (Eluent : Essigester/Hexan = 3 : 1). Man erhält 135,8 g (86,1% d. Th.) eines leicht gelblich gefärbten Öls.

Elementaranalyse:
ber.: C 53,33; H 6,71; N 4,44;
gef.: C 53,27; H 6,68; N 4,50;

b) 2,3,4,6-Tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl-1-O-[(4-Nitrophenyl)- tetraethylenglycol]

10 g β-D-Galactosepentaacetat (Kaufware Aldrich) wird in 40 ml absolutem 1,2- Dichlorethan gelöst und mit einer Lösung von 8,0 g (25,6 mmol) der Titelverbin dung aus Beispiel 35a) in 15 ml 1,2-Dichlorethan versetzt. Anschließend werden 3,9 ml (33,3 mmol) Zinntetrachlorid bei Raumtemperatur langsam zugetropft und die so erhaltene Reaktionslösung wird noch 12 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Zur Aufarbeitung wird mit Wasser versetzt, die organische Phase abgetrennt und die verbleibende wässrige Phase erschöpfend mit Dichlor methan extrahiert. Nach dem Trocknen der organischen Phasen über Natrium sulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezo gen. Der verbleibende ölige Rückstand wird mittels Säulenchromatographie aufgereinigt (Eluent : Dichlormethanol/Methanol = 20 : 1). Man erhält 14,6 g (88,2% d. Th.) eines farblosen Öls.

Elementaranalyse:
ber.: C 52,09; H 6,09; N 2,17;
gef.: C 52,13; H 6,11; N 2,21;

c) β-D-Galactopyranosyl-1-O-[(4-Nitrophenyl)-tetraethylenglycol]

33,93 g (52,56 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 35b) werden in 680 ml absolutem Methanol gelöst und mit 0,8 g Natriummethanolat versetzt. Nach ei ner Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird die Reaktions lösung durch portionsweise Zugabe von IRA-120 (H⁺)-Kationenaustauscher neutralisiert, vom Austauscher abgesaugt und das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Die so erhaltene Titelverbindung (23,3 g, 95,5% d. Th.) wird ohne weitere Reinigung direkt für den nachfolgenden Reduktions schritt eingesetzt.

Elementaranalyse:
ber.: C 50,31; H 6,54; N 2,93;
gef.: C 50,48; H 6,74; N 3,07;

d) β-D-Galactopyranosyl-1-O-[(4-aminophenyl)-tetraethylenglycol]

Die Reduktion von 14,61 g (30,6 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 35c) erfolgt nach den in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen (vgl. hierzu: Taylor, J. K. et al., J. Chem. Soc., Chem. Commun.; 1993, 1410; Goldstein I. J., Methods in Enzymologie, Vol. XXVII, Part B., 212-219, 1972) unter Verwendung von Wasserstoff (1 atm.) als Reduktionsmittel, Palladium (10%) auf Bariumsulfat als Katalysator und wasserfreiem Methanol als Lö sungsmittel. Nach Aufarbeitung erhält man 13,15 g (96% d. Th.) der Titelver bindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 53,04; H 6,57; S 6,74;
gef.: C 53,13; H 6,60; S 6,84;

f) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-O-(4-Thioureido tetraethylenglycolyl-pheny)-β-D-galactopyranosyl]₁₄-Konjugat

Auf analoge Weise wie in Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 4,0 g (0,448 mmol der Titelverbindung aus Beispiel 31a) entsprechend 6,28 mmol an freien Aminfunktionen) mit 14,93 g (31,4 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 35e) nach Aufarbeitung 6,01 g (86,3% d. Th. bezogen auf einge setztes Polyamin) als farbloses Lyophilisat.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,36; H 6,28; N 8,56; S 2,89; Gd 10,11;
gef.: C 47,41; H 6,31; N 8,49; S 2,93; Gd 10,18;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem molaren Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Bela dungsgrad des Polymers mit 58,3% D-Galactopyranose (entsprechend 14 Galactoseresten pro Molekül) sowie 41,7% Gd-Gly-DOTA (entsprechend 10 Gd-Gly-Me-DOTA Komplexe pro Molekül).

Beispiel 36 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-O-(4-Thioureido tetraethylenglycolyl-pheny)-α-D-mannopyranosyl]₁₄-Konjugat a) α-D-Mannopyrannosyl-1-O-[(4-isothiocyanatophenyl)-tetraethylenglycol]

Auf analogem Wege, wie in den Beispielen 35b)-35e) für die Synthese der Ti telverbindung aus Beispiel 35e) beschrieben, führt die Umsetzung von 15 g α- D-Mannosepentaacetat (38,4 mmol, Kaufware Sigma) zur Bildung von 13,22 g (72,4% d. Th.; über 4 Syntheseschritte) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 53,04; H 6,57; S 6,74;
gef.: C 53,14; H 6,60; S 6,68;

b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-O-(4-Thioureido tetraethylenglycolyl-pheny)-α-D-mannopyranosyl]₁₄-Konjugat

Durch eine analoge Reaktionsführung, wie in Beispiel 1b) beschrieben, führt die Umsetzung von 5,0 g (0,56 mmol, entsprechend 7,85 mmol an freien Amino funktionen, der Titelverbindung aus Beispiel 31a) mit 18,66 g (39,25 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 36a) zur Bildung von 7,5 g (86,3% d. Th.) bezogen auf eingesetztes Polyamin der oben genannten Titelverbindung als farbloses Lyophilisat.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,36; H 6,28; N 8,56; S 2,89; Gd 10,11;
gef.: C 47,31; H 6,36; N 8,49; S 2,94; Gd 10,22;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode verlaufen negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem molaren Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Bela dungsgrad des Polymers mit 58,8% D-Mannopyranose (entsprechend 14 Man noseresten pro Molekül) sowie 41,2% Gd-Gly-DOTA (entsprechend 10 Gd-Gly- Me-DOTA Komplexe pro Molekül).

Beispiel 37 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-O-(4-Thioureido tetraethylenglycolyl-pheny)-N-Acetyl-β-D-glucosaminopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 1-O-[4-Isothiocyanatophenyl]-tetraetylenglycolyl-N-acetyl-β-D- glucosaminopyranose

Auf analogem Wege wie in den Beispielen 35b-35e) beschrieben, führt die Um setzung von 10 g (25,68 mmol) N-Acetyl-β-D-glucosaminpentaacetat zur Bil dung von 9,85 g (74,3% d. Th. über 4 Syntheseschritte) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 53,48; H 6,63; N 2,71; S 6,21;
gef.: C 53,60; H 6,59; N 2,74; S 6,28;

b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-O-(4-Thioureido tetraethylenglycolyl-pheny)-N-Acetyl-β-D-glucosaminopyranosyl]₁₄- Konjugat

Durch analoge Reaktionsdurchführung wie in Beispiel 1b) beschrieben, führt die Umsetzung von 4,0 g (0,45 mmol, entsprechend 6,3 mmol an freien Aminfunk tionen) der Titelverbindung aus Beispiel 31a) mit 16,2 g (31,5 mmol) der Titel verbindung aus Beispiel 37a) zur Bildung von 6,15 g (85% d. Th., bezogen auf eingesetztes Polyamin) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Lyo philisat.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47,75; H 6,32; N 9,47; S 2,78; Gd 9,75;
gef.: C 47,84; H 6,38; N 9,59; S 2,86; Gd 9,80;

Beispiel 38 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-O-(4-Thioureido tetraethylenglycolyl-pheny)-β-D-glucopyranosyl]₁₄-Konjugat a) 1-O-[4-Isothiocyanatophenyl]-tetraetylenglycolyl-β-D-glucopyranose

Auf analogem Wege wie in den Beispielen 35b-35e) beschrieben, führt die Um setzung von 8,52 g (25,68 mmol) β-D-glucopyranosyltetraacetat (Darstellung gemäß: Rosemann S., et al., Biochemistry, Vol. 8, No. 4, 1969, 1351-1359; Pri har, Behrmann, Biochemistry 1973, 12, 997-1000) zur Bildung von 9,92 g (76,8 % d. Th. über 4 Syntheseschritte) der oben genannten Titelverbindung als farb loses Öl (zur analogen Synthese vgl. Lit. Monsigny, M., et al., Biol. Cell., 51, 187 (1984)).

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 50,09; H 5,80; N 2,78; S 6,37;
gef.: C 50,14; H 5,86; N 2,86; S 6,40;

b) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly Me-DOTA-Amid)₁₀-[1-O-(4-Thioureido tetraethylenglycolyl-pheny)-β-D-glucopyranosyl]₁₄-Konjugat

Die analoge Reaktionsdurchführung wie in Beispiel 1b) beschrieben, führt durch Umsetzung von 4,0 g (0,45 mmol, entsprechend 6,3 mmol an freien Amin funktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 31a) mit 15,86 g (31,5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 38a) zur Bildung von 6,04 g (84,2% d. Th., bezo gen auf eingesetztes Polyamin) der oben genannten Titelverbindung als farblo ses Lyophilisat.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,19; H 5,95; N 9,58; S 2,82; Gd 9,87;
gef.: C 46,28; H 5,91; N 9,63; S 2,76; Gd 9,80;

Beispiel 39 12er-Kaskadenpolyamin-(¹¹¹In-DTPA-Amid)₄-[β-1-O-(6-Thioureidohexyl)- sialyl-Le^x]₈-Konjugat a) 12er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₄-Konjugat

Eine Lösung von 5,0 g (4,07 mmol; entsprechend 48,8 mmol an freien Amino funktionen) 12er Kaskadenpolyamin (Darstellung gemäß: Schmitt-Willich et al.; EP 0271180) wird in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Na tronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 14,7 g (36,5 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mono-ethylester hinzu, wobei der pH- Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktions lösung durch Zugabe von 32%iger Natronlauge auf 11,5 eingestellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Was ser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 11,2 g (89,3% d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 9,41%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,99; H 5,78; N 14,98; Na 11,92;
gef.: C 44,08; H 5,82; N 14,90; Na 11,87;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 32,94% (entsprechend 4 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion als auch der quantitativen Aminogruppenbestimmung mit der TNBS-Methode (vgl. hierzu Fields, R., J. Biochem. 1971, 124, 581-590) liegen im statistischen Mittel pro Polymermolekül 13 freie Aminofunktionen vor.

b) β-1-O-[6-Isothiocyanatohexyl]-sialyl-Le^x-glycosid

150 mg (0,146 mmol) β-1-O-[6-Aminohexyl]-sialyl-Le^x-glycosid (Darstellung gemäß: Kunz, H. et al., Angew. Chem. 1994, 106, Nr. 20; Kretzschmar et al., Tetrahedron, Vol.51, No. 47, 13015-13030, 1995) werden in 20 ml 80%igem, wässrigem Ethanol gelöst und bei 0°C mit 0,028 ml (0,365 mmol) Thiophosgen durch Zugabe über eine Mikrospritze versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 22°C wird das Ethanol im Vakuum abgezogen und der erhaltenen wässrigen Rückstand des rohen Isothiocyanats direkt für die nachfolgende Reaktion eingesetzt, wobei der Gehalt an oben genannter Titelverbindung der so erhaltenen wässrigen Rohproduktlösung mit 0,138 mmol (entspricht einem 95%igen Umsatz) angenommen wird. Dünnschichtchromatographie (Ethylacetat/Methanol/Wasser/Eisessig = 5 : 3 : 3 : 0,5; R_f = 0,72) zeigt eine einheit liche Umsetzung zur oben genannten Titelverbindung an.

Elementaranalyse (Schwefelbestimmung; bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: S 3,00;
gef.: S 2,92;

c) 12er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₄-[β-1-O-(6-Thioureidohexyl)- sialyl-Le^x]₈-Konjugat

Die Umsetzung von 26,6 mg (0,00842 mmol; entsprechend 0,0673 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 39a) mit der gesamten wässrigen Lösung des Rohprodukts aus Beispiel 39b) (0,138 mmol) liefert nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung 88,7 mg (90,6% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 8,74%

Elementaranalyse (Natrium- und Schwefelbestimmung; bezogen auf wasserfreie Substanz):
ber.: S 2,20; Na 3,16;
gef.: S 2,17; Na 3,24;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung ver laufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 67,4% sialyl-Le^x-Einheiten (entsprechend 8 sialyl-Le^x-Resten pro Molekül).

Aus der quantitativen Sialinsäurebestimmung mittels TBA (Thiobarbitursäure) durch literaturbekannte Vorgehensweise [vgl. Lit.: Aminoff, D. (1961); "Methods for the quantitative estimation of N-acetylneuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids", J. Biochem., 81: 384-392; Uschida, Y. and Su gimori, T. (1977); "Distribution of neuraminidase in Arthrobacter and its purifica tion by affinity chromatography", J. Biochem. (Tokio), 82, 1425-1433] wird der Beladunsgrad der oben genannten Titelverbindung mit 69,2% an Tetrasaccha rid (entsprechend 8 sialyl-Le^x-Resten pro Molekül) ermittelt. Nach erneuter colorimetrischer Titration der Titelverbindung mit 0,0025 molarer Gadoliniumsul fat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator konnte der DTPA- Beladungsgrad des Polymers von 32,9% (entsprechend 4 DTPA-Einheiten pro Molekül) bestätigt werden.

d) 12er-Kaskadenpolyamin-(¹¹¹In-DTPA-Amid)₄-[β-1-O-(6-Thioureidohexyl)- sialyl-Le^x]₈-Konjugat

1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 39c) werden in 2 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von ¹¹¹Indium chlorid, welche eine Anfangsaktivität von 20,1 MBq besitzt, versetzt. Nach einer Rührzeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und anschließend sterilfiltriert. Die so hergestellte Lösung ist direkt für die entsprechenden radio diagnostischen Zwecke einzusetzen.

Beispiel 40 12er-Kaskadenpolyamin-(¹¹¹In-DTPA-Amid)₄-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₈-Konjugat a) 12er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₄-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₈-Konjugat

Auf analoge Weise wie für die Synthese der Titelverbindung aus Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 0,5 g (0,16 mmol; entsprechend 1,3 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 39a) mit 2,07 g (6,63 mmol) p-Isothio-cyanatophenyl-α-D-mannopyranose nach Aufarbei tung und Gefriertrocknung 794 mg (88,7% d. Th.) der Titelverbindung als farb loses und amorphes Pulver mit einem Wassergehalt von 8.31%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,61; H 5,35; N 10,27; S 4,59; Na 6,58;
gef.: C 46,57; H 5,41; N 10,30; S 4,63; Na 6,52;

Sowohl die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbin dung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titel verbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 67,3% D-Mannose (entsprechend 8 Mannoseresten pro Molekül). Die colorimetrische Phenol- Schwefelsäure-Bestimmung zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungs grades des Konjugats liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 8 α-D- Mannoseresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad (8 D-Mannoseresten pro Molekül), welcher durch den prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ermittelt wurde. Mit dem so ermittelten Beladungsgrad der Titelverbindung aus Beispiel 39a) von 32,94% ergibt sich somit eine stati stische, mittlere Gesamtbeladung des Polymers von 4-DTPA- und 8-α-D-Man noseresten pro Molekül.

b) 12er-Kaskadenpolyamin-(¹¹¹In-DTPA-Amid)₄-[1-(4-Thioureioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₈-Konjugat

In analoger Weise wie für die Synthese der Titelverbindung aus Beispiel 39d) beschrieben, wird die Titelverbindung aus Beispiel 40a) mit ¹¹¹-Indiumchlo rid (als Lösung mit einer spezifischen Anfangsaktivität von 19,83 MBq) komplexiert. Nach Sterilfiltration erhält man ein Präparat, welches direkt für die entsprechenden radiodiagnostischen Zwecke eingesetzt werden kann.

Beispiel 41 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-[(β-D-galactopyranosyl)-1- thio-2-imino-2-amidin]₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-Konjugat

2,0 g (0,22 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 10a) werden in 60 ml absolu tem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Tri fluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verblei bende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen, anschließend in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und die wässrige Produktlösung zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extra hiert. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit Was ser auf ein Gesamtvolumen von 300 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultra filtriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Vo lumen von 300 ml aufgefüllt und durch Versetzen mit 15%iger Natronlauge ein pH-Wert von 10,0 eingestellt. Die basische Produktlösung wird erneut zweimal ultrafiltriert und der verbleibende Rückstand nach dem Auffüllen mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml, gefriergetrocknet. Man erhält 1,42 g (82,8% d. Th) der Titelverbindung als amorphes Lyophilisat in der Form des freien Polyamins.
Wassergehalt: 5,37%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 51,94; H 7,83; N 17,92; S 3,77; Na 4.32;
gef.: C 51,89; H 7,80; N 18,01; S 3,69; Na 4.28;

Nach Elementaranalyse ist die Titelverbindung frei von Fluoridionen.

Nach quantitativer Ninhydrinreaktion liegen im Mittel 13 freie Aminofunktionen in der Titelverbindung vor. Nach colorimetrischer Titration der Titelverbindung mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung bei 60°C, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit Gly-Me-DOTA von 46, 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019728954 00004 998803% (entsprechend 11 Gly-Me-DOTA-Einheiten) pro Mo lekül.

b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-[(β-D-galactopyranosyl)- 1-thio-2-imino-2-amidin]₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise, wie in der Literatur für die Umsetzungen mit Proteinen be schrieben, (vgl. hierzu: Lee, Y. C. et al., Methods of Enzymologie, Vol. 83, 1982, 278) liefert die Umsetzung von 1,0 g (0,128 mmol; entsprechend 1,66 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 41a) mit 11,4 g (42,8 mmol) 2-Imino-2-methoxyethyl-1-thio-β-D-galactopyranose (IME-thio galactosid) 1,06 g (76,3% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Lyophilisat [ Zur Synthese und den Reaktionsbedingungen analoger Kupplungsreaktionen von IME-thiopyranosiden an Proteine vgl.: Y. C. Lee, C. P. Stowell, M. J. Krantz, Biochemistry 1976, 15, 3956; R. Roger, D. G. Neilson, Chem. Rev. 1961, 61, 179; L. Wofsy, S. J. Singer, Biochemistry 1963, 2 104; M. J. Hunter, M. L. Lud wig, this series, Vol. 25, 585; J. E. Zull, J. Chung, J. Biol. Chem. 1975, 250, 1668; C. P. Stowell, Doctoral Dissertation, The Johns Hopkins University, Balti more, Maryland, 1978].

c) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-[(β-D-galactopyra nosyl)-1-thio-2-imino-2-amidin]₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 23d) beschrieben, führt die Komplexierung von 900 mg (0,082 mmol; entsprechend 0,90 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titel verbindung aus Beispiel 41b) mit 241 mg (0,92 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 990 mg (96,0% d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 9,32%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,19; H 6,06; N 12,58; S 3,31; Gd 13,75;
gef.: C 42,23; H 6,10; N 12,57; S 3,28; Gd 13,80;

Der mittlere Beladungsgrad des Polymers der oben genannten Titelverbindung wurde aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium zu 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13 β-D-Glucopyranosylresten bestimmt, was mit den auf den Vorstufen bestimmten Beladungsgraden der Titelverbin dung sehr gut korreliert.

Beispiel 42 24er-Kaskadenamin-(Yb-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D-galacto pyranosyl]₁₃-Konjugat

1,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 4b) werden in 40 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raum temperatur mit einer Lösung von 243 mg (0,87 mmol) Ytterbiumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet.
Ausbeute: 969 mg (96,2% d. Th.) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 4,93%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,48; H 4,91; N 9,74; S 3,19; Yb 14,54; Na 1,93;
gef.: C 41,52; H 4,96; N 9,80; S 3,22; Yb 14,60; Na 1,88;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung ver laufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers von 55,2% D-Galactose (entsprechend 13 Galactoseresten pro Molekül) während aus dem prozentualen Ytterbium Wert ein Beladungsgrad des Polymers mit Ytterbium-DTPA von 44,8 % resultiert (entsprechend 11 Yb-DTPA-Einheiten pro Molekül). Die colorimetri sche Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung [Dubois et al., Anal. Chem. 1956, 28, 3, 350; Koch et al., Cereal Chem. 1951, 28, 424] als auch die quantitative Kohlenhydratbestimmungsmethode nach Nelson und Somogyi [Cheronis et al., Mikrochim. Acta, 6, 769 (1957); Somogyi, J. Biol. Chem. 195, 19 (1952); Nel son, J. Biol. Chem., 153, 375 (1944); vgl. auch Hodge et al., Meth. Carbohydra te Chem., Vol. 1,; Whistler and Wolfrom, eds. p. 388, Academic Press, New York, 1962; So and Goldstein, J. Biol. Chem. 242, 1617 (1967)] zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Polyamins liefert als Ergebnis ei nen Beladungsgrad von 32,68 D-Galactoseresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die prozentualen Element verhältnisse ermittelt wurde.

Beispiel 43 24er-Kaskadenamin-(Dy-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₁₃-Konjugat

1,4 g (0,108 mmol; entsprechend 1,18 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 5a) werden in 40 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raum temperatur mit einer Lösung von 325 mg (1,21 mmol) Dysprosiumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet.
Ausbeute: 1,35 g (97,0% d. Th.) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 6,74%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,86; H 4,95; N 9,83; S 3,21; Dy 13,78; Na 1,95;
gef.: C 41,84; H 4,99; N 9,78; S 3,25; Dy 13,81; Na 1,89;

Aus den molaren Elementarverhältnissen von Dysprosium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 46,2% Gd-DPTA und 53,8% D-Mannose (entsprechend 11 Dy-DTPA-Einheiten und 13 D-Mannose resten pro Molekül).

Die qualitative Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelver bindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Die colorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung, als auch die quantitative Kohlenhydratbestimmungsmethode nach Nelson und Somogyi zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Polyamins liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 32,68 D-Mannoseresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die prozentualen Ele mentverhältnisse ermittelt wurde.

Beispiel 44 24er-Kaskadenamin-(Mn-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-β-D- glucosaminopyranosyl]₁₃-Konjugat

1,0 g (0,077 mmol; entsprechend 0,85 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 4b) werden in 40 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raum temperatur mit 100 mg (0,87 mmol) Mangan-II-carbonat versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet.
Ausbeute: 911 mg (98,3% d. Th.) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 7,46%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,09; H 5,33; N 10,59; S 3,46; Mn 5,02; Na 4,20;
gef.: C 45,11; H 5,38; N 10,61; S 3,42; Mn 5,10; Na 4,13;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung ver laufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 53,8% N-Acetylglucosamin (entsprechend 13 N-Acetyl-β-D-Glucosaminresten pro Molekül), während aus dem prozentualen Mangan Wert ein Beladungsgrad des Polymers mit Mangan- DTPA von 46,0% resultiert (entsprechend 11 Mn-DTPA-Einheiten pro Mole kül). Die colorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung, als auch die quantitative Kohlenhydratbestimmungsmethode nach Nelson und Somogyi zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Polyamins, liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 13 N-Acetyl-β-D-glucosaminresten pro Mo lekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die pro zentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde.

Beispiel 45 24er-Kaskadenamin-(Eu-DTPA-Amid)₁₁-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D-gluco pyranosyl]₁₃-Konjugat

1,4 g (0,108 mmol; entsprechend 1,18 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 7b) werden in 40 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raum temperatur mit einer Lösung von 312 mg (1,21 mmol) Europiumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet.
Ausbeute: 1.30 g (97,6% d. Th.) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 8,34%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,23; H 4,99; N 9,92; S 3,24; Eu 13,00; Na 1,97;
gef.: C 42,24; H 5,03; N 9,89; S 3,19; Eu 13,07; Na 1,93;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Europium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45% Eu-DTPA-Einheiten und 55% β-D-Glucoseresten (entsprechend 11 DTPA-Einheiten und 13 β-D- Glucoseeinheiten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrin reaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Die qualitative Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelver bindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Die colorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung, als auch die quantitative Kohlenhydratbestimmungsmethode nach Nelson und Somogyi zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Konjugats liefert als Ergebnis einen mittleren Beladungsgrad von 13 D-Glucoseresten pro Molekül und ist somit identisch mit dem Beladungsgrad, welcher durch die prozentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde.

Beispiel 46 Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-β-D- glucopyranosid (m = 13, n = 11) a) 1-Tert.butoxycarbonylmethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosid

Zu einer gerührten Lösung von 661 mg (5,0 mmol) Glycolsäure-tert.butylester in 25 ml absolutem 1,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinan der feinst gepulvertes Molsieb 4 O (5.0 g) und Silbersilicat (5.0 g). An schließend wird bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung von 3,02 g (5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-α-D-glucopyranosylbromid, gelöst in 40 ml ab solutem 1,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird an schließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0°C mit 250 ml 1,2-Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite ab gesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydro gencarbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge trocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol : Essigsäureethylester = 10 : 1).

Man erhält 488,7 mg (15,3% d. Th.) der oben genannten Titelverbindung, als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 73.37; H 7.08;
gef.: C 73.21; H 7.24;

b) 1-Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosid

Zu 30 g (45.81 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 46a) gelöst in 300 ml 1,2-Dichlorethan gibt man bei -10°C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stun den bei dieser Temperatur. Anschließend wird eine Stunde bei 0°C nachge rührt. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel : n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1).
Ausbeute: 3,02 g (11.4% d. Th.) eines glasigen Feststoffs.

Elementaranalyse:
ber.: C 72.22; H 6.40;
gef.: C 72.09; H 6.61;

c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1- Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosid (m = 13, n = 11)

12,28 g (19.5 mmol) des in Beispiel 31h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7- triessigsäure, 2,0 g Natriumbromid (19.5 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy succinimid und 9,88 g (16.5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 46b) wer den in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50°C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtem peratur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimid ester-Lösung gibt man eine Lösung von 1,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polya mins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis [2.(trilysyl-amino)-ethyl]-tri mesinsäuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung ver setzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermoleku laren Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet.
Ausbeute: 8.13 g (95% d. Th.)
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 7,8%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 54,19; H 5.98; N 9.00; Gd 11.95;
gef.: C 54.06; H 6.10; N 8.87; Gd 11.81;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 13 : 11 berechnen.

d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxy methyl-β-D-glucopyranosid (m = 13, n = 11)

8,0 g (0,467 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 46c) werden in einer Mi schung aus 50 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10% Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtempe ratur. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrock net.
Ausbeute: 6.08 g (99% d. Th.) glasiger Feststoff.
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 11%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42.39; H 5.76; N 11.72; Gd 15.55;
gef.: C 42.21; H 5.89; N 11.61; Gd 15.42;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 13 : 11 berechnen.

Beispiel 47 Thioharnstoff Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex auf der Basis der 4-Isothiocyanatobenzyl-DOTA und 1-Carboxymethyl-α-D-mannopyranosid (m = 10, n = 14) a) Thioharnstoff-Konjugat des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]-trimesinsäuretriamids mit 1-Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosid (m = 10, n = 14).

Zu 1,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis(2-(trilysyl-amino)-ethyl)-trimesinsäuretriamids gelöst in 50 ml. Wasser gibt man 5,46 g (54 mmol) Triethylamin. Zu dieser Lösung tropft man bei 10°C eine Mischung aus 4,11 g (7.5 mmol) 4-Isothiocyanatobenzyl-DOTA (US- 4,923,985; Gansow O. A. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1992, 1173- 1178) und 3,28 g (10,5 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-α-D-mannopyranose, gelöst in 75 ml Wasser/50 ml Ethanol (Zutropfzeit: 2 Stunden). Man rührt 12 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend gibt man 3,54 g (10.6 mmol) Gadoliniumacetat hinzu und stellt mit 10%iger Salzsäure auf pH 4,5. Man rührt 5 Stunden bei 80°C, läßt auf Raumtemperatur kommen und stellt mit 5%iger wässriger NaOH auf pH 7.5. Die Lösung wird über eine AMICON® YM-3 Ultra filtrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Be standteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet.
Ausbeute: 6,76 g (94% d. Th.) glasiger Feststoff.
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 9.8%

Elementaranalyse: (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46.01; H 4.91; N 10.61; Gd 10.93; S 5.35; Na 1.60;
gef.: C 45.87; H 4.99; N 10.50; Gd 10.82; S 5.21; Na 1.42;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.

Beispiel 48 Thioharnstoff Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex auf der Basis der 4-Isothiocyanatobenzyl-DTPA und 1-Carboxymethyl-β-D-galactopyranosid (m = 8, n = 16) a) Thioharnstoff Konjugat des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2-(trilysyl-amino)ethyl]-trimesinsäuretriamids mit 4-Isothiocyanatobenzyl-DTPA (n = 8, n = 16)

Zu 1,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)ethyl]-trimesinsäuretriamids gelöst in 50 ml Wasser gibt man 5,46 g (54 mmol) Triethylamin. Zu dieser Lösung tropft man bei 10°C eine Mischung aus 3,22 g (6,0 mmol) 4-Isothiocyanotobenzyl-DTPA (WO 91/14459; Gansow, O. A. et al., Bioconjugate Chem. 1992, 3, 108-117) und 3,75 g (12,0 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β-D-galactopyranose, gelöst in 75 ml Wasser/50 ml Ethanol (Zutropfzeit: 2 Stunden). Man rührt 12 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend gibt man 2,04 g (6,1 mmol) Gadoliniumacetat zu und stellt mit 10%iger Salzsäure auf pH 4,5. Man rührt 3 Stunden bei 60°C. Man läßt auf Raumtemperatur kommen und stellt mit 5%iger NaOH auf pH 7.5. Die Lösung wird über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Re tentat wird anschließend gefriergetrocknet.
Ausbeute: 6,55 g (96% d. Th.) glasiger Feststoff.
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 10%

Elementaranalyse: (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45.15; H 4.66; N 9.54; Gd 9.22; S 5.64; Na 2.70;
gef.: C 45.03; H 4.81; N 9.44; Gd 9.10; S 5.48; Na 2.51;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 8 : 16 berechnen.

Beispiel 49 Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-α-D- mannopyranosid (m = 13, n = 11) a) 1-Tert.butoxycarbonylmethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosid

Zu einer gerührten Lösung von 661 mg (5,0 mmol) Glycolsäure-tert.butylester in 25 ml absolutem 1,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinan der feinst gepulvertes Molsieb 4 Å (5.0 g) und Silbersilicat (5.0 g). An schließend wird bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung von 3,02 g (5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosylbromid, gelöst in 40 ml absolutem 1,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0°C mit 250 ml 1,2-Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite ab gesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydro gencarbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge trocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol : Essigsäureethylester = 10 : 1).

Man erhält 472,7 mg (14.8% d. Th.) der oben genannten Titelverbindung, als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 73,37; H 7,08;
gef.: C 73,25; H 7.19;

b) 1-Carboxycarbonylmethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosid

Zu 28 g (42,76 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 49a) gelöst in 300 ml 1,2-Dichlorethan gibt man bei -10°C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stun den bei dieser Temperatur. Anschließend eine Stunde bei 0°C. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel : n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1).
Ausbeute: 2,58 g (10,4% d. Th.) eines glasigen Feststoffs.

Elementaranalyse:
ber.: C 72.22; H 6.40;
gef.: C 72.10; H 6.58;

c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-2,3, 4,6-tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosid (m = 13, n = 11)

10,39 g (16.5 mmol) des in Beispiel 31h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10- (4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7- triessigsäure, 1,7 g Natriumbromid (16.5 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy succinimid und 11,67 g (19.5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 49b) wer den in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50°C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtem peratur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimid esterlösung gibt man eine Lösung von 1,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2.(trilysyl-amino)-ethyl]-trimesin säuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und an schließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultra filtrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Be standteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet.
Ausbeute: 8.1 g (95% d. Th.)
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 9,7%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 56.78; H 6.09; N 8.21; Gd 10.14;
gef.: C 56.64; H 6.18; N 8.14; Gd 10.01;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 11 : 13 berechnen.

d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-α-D- mannopyranosid (m = 13, n = 11)

7,0 g (0,41 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 49c) werden in einer Mi schung aus 50 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10% Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtempe ratur und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5.03 g (99% d. Th.) glasiger Feststoff.
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 9,8%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42.94; H 5.86; N 11.33; Gd 13.99;
gef.: C 42.86; H 5.97; N 11.24; Gd 13.74;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 11 : 13 berechnen.

Beispiel 50 Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N, N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-β-D- galactopyranosid (m = 6, n = 18) a) 1-Tert.butoxycarbonylmethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosid

Zu einer gerührten Lösung von 661 mg (5,0 mmol) Glycolsäure-tert.butylester in 25 ml absolutem 1,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinan der feinst gepulvertes Molsieb 4 Å (5.0 g) und Silbersilicat (5.0 g). An schließend wird bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung von 3,02 g (5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-α-D-galactopyranosylbromid, gelöst in 40 ml absolutem 1,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0°C mit 250 ml 1,2-Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite abge saugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydrogen carbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrock net und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol : Es sigsäureethylester = 10 : 1).

Man erhält 456,7 mg (14, 3% d. Th.) der oben genannten Titelverbindung, als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 73,37; H 7,08;
gef.: C 73,18; H 7.19;

b) 1-Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosid

Zu 29 g (44,29 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 50a) gelöst in 300 ml 1,2-Dichlorethan gibt man bei -10°C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stun den bei dieser Temperatur. Anschließend eine Stunde bei 0°C. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel : n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1.
Ausbeute: 3,79 g (14,7% d. Th.) eines glasigen Feststoffs.

Elementaranalyse:
ber.: C 72.22; H 6.40;
gef.: C 72.10; H 6.51;

c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-β-D- 2,3,4,6-tetra-O-benzyl-galactopyranosid (m = 6, n = 18)

5,67 g (9 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10-(4- Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-tri essigsäure, 0,93 g Natriumbromid (9 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxysucci nimid und 16,16 g (27 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 50b) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50°C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimidester-Lö sung gibt man eine Lösung von 1,39 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2.(trilysyl-amino)-ethyl]-trimesinsäuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclo hexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltra tionsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandtei len gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet.
Ausbeute: 8.03 g (95% d. Th.)
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 9,0%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 63,34; H 6.39; N 6.22; Gd 5.58;
gef.: C 63.18; H 6.47; N 6.13; Gd 5.47;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 6 : 18 berechnen.

d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-β-D- galactopyranosid (m = 6, n = 18)

7,0 g (0,414 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 50c werden in einer Mi schung aus 75 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10% Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtempe ratur bei einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 4.27 g (99% d. Th.) glasiger Feststoff.
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 10,3%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44.67; H 6.19; N 10.09; Gd 9.07;
gef.: C 44.53; H 6.28; N 9.91; Gd 8.94;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 6 : 18 berechnen.

Beispiel 51 Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-α-L- fucopyranosid (m = 10, n = 14) a) 1-Tert.butoxycarbonylmethyl-2,3,4-tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosid

Zu einer gerührten Lösung von 661 mg (5,0 mmol) Glycolsäure-tert.butylester in 25 ml absolutem 1,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nacheinan der feinst gepulvertes Molsieb 4 Å (5.0 g) und Silbersilicat (5.0 g). An schließend wird bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung von 2.49 g (5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-α-D-fucopyranosyl bromid, gelöst in 40 ml absolutem 1,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0°C mit 250 ml 1,2- Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite abgesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydrogencarbonat lösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verblei bende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol : Essigsäure ethylester = 10 : 1).

Man erhält 407,5 mg (15,3% d. Th.) der oben genannten Titelverbindung, als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 72.24; H 7,35;
gef.: C 72,10; H 7.45;

b) (1-Carboxymethyl)-2,3,4-tri-(O-benzyl)-α-L-fucopyranosid

Zu 24 g (43.74 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 51a) gelöst in 300 ml 1,2-Dichlorethan gibt man bei -10°C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stun den bei dieser Temperatur. Anschließend eine Stunde bei 0°C. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel : n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1).
Ausbeute: 3,36 g (16,2% d. Th.) eines glasigen Feststoffs.

Elementaranalyse:
ber.: C 70.71; H 6.55;
gef.: C 70.58; H 6.71;

c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethyl-2,3,4- tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosid (m = 10, n = 14)

9,45 g (15 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10-(4- Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-tri essigsäure, 1,54 g Natriumbromid (15 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy succinimid und 10,34 g (21 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 51b) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50°C gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtempera tur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxysuccinimidester- Lösung gibt man eine Lösung von 1,386 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2.(trilysyl-amino)-ethyl]-trimesinsäure triamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Suspension wird filtriert und an schließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, von unlöslichem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultra filtrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Be standteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend gefriergetrocknet.
Ausbeute: 7.3 g (94% d. Th.)
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer: 8.6%)

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 56.06; H 6.20; N 8.57; Gd 10.12;
gef.: C 55.91; H 6.32; N 8.49; Gd 9.97;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.

d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 1-Carboxymethymethyl-α-L- fucopyranosid (m = 10, n = 14)

7,0 g (0,41 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 51c) werden in einer Mi schung aus 75 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10% Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtempe ratur und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5.24 g (99% d. Th.) glasiger Feststoff.
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 11,1%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44.06; H 6.03; N 11.33; Gd 13.38;
gef.: C 43.95; H 6.17; N 11.24; Gd 13.29;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.

Beispiel 52 Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-β-D- galactopyranosid (m = 10, n = 14) a) 6-Tertbutoxycarbonylhexyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosid

Zu einer gerührten Lösung von 3,54 g (5,0 mmol) 1-Tertbutoxycarbonylhexan- 6-ol in 25 ml absolutem 1,2-Dichlorethan gibt man bei Raumtemperatur nach einander feinst gepulvertes Molsieb 4 Å (5.0 g) und Silbersilicat (5.0 g). An schließend wird bei 0°C tropfenweise mit einer Lösung von 3,02 g (5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-α-D-galactopyranosylbromid, gelöst in 40 ml absolutem 1,2-Dichlorethan, versetzt. Die so erhaltene Reaktionslösung wird anschließend für 3 Stunden bei -10°C gerührt. Zur Aufarbeitung wird bei 0°C mit 250 ml 1,2-Dichlorethan versetzt und die Reaktionslösung über Celite ab gesaugt. Das Filtrat wird nacheinander mit je 200 ml wässriger Natriumhydro gencarbonatlösung sowie 220 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge trocknet und filtriert. Nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand an Kieselgel chromatographiert (Eluent : Toluol : Essigsäureethylester = 10 : 1).

Man erhält 449,6 mg (12,7% d. Th.) der oben genannten Titelverbindung, als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 76,27; H 7.96;
gef.: C 76,41; H 7.80;

b) 6-Carboxyhexyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosid

Zu 32,4 g (45.81 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 52a) gelöst in 300 ml 1,2-Dichlorethan gibt man bei -10°C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stun den bei dieser Temperatur. Anschließend eine Stunde bei 0°C nachgerührt. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel : n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1).
Ausbeute: 3,52 g (11.8% d. Th.) eines glasigen Feststoffs.

Elementaranalyse:
ber.: C 75,43; H 7,41;
gef.: C 75,56; H 7,32;

c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-2,3,4,6- tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosid (m = 10, n = 14)

9,45 g (15 mmol) des in Beispiel 31h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10-(4- Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-tri essigsäure, 1,54 g Nartriumbromid (15 mmol) und 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy succinimid und 14.88 g (21 mmol) 6-Carboxyhexyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D- galactopyranosid werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50°C gelöst. Nach Ab kühlen auf Raumtemperatur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexyl carbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestell ten N-Hydroxysuccinimidester-Lösung gibt man eine Lösung von 1,386 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2- (trilysyl-amino)-ethyl]-trimesinsäuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die erhaltene Sus pension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollstän digen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser auf genommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von niedermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend ge friergetrocknet.
Ausbeute: 8,55 g (96% d. Th.)
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 9,2%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 59.30; H 6.52; N 7.47; Gd 8.83;
gef.: C 59.15; H 6.69; N 7.38; Gd 8.74;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.

d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-β-D- galactopyranosid (m = 10, n = 14)

8,0 g (0,449 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 52c) werden in einer Mi schung aus 75 ml. Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10% Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtempe ratur und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5.67 g (99% d. Th.) glasiger Feststoff.
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 10,5%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45.85; H 6.44; N 10.43; Gd 12.33;
gef.: C 45.74; H 6.55; N 10.39; Gd 12.23;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 10 : 14 berechnen.

Beispiel 53 Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-α-D- mannopyranosid (m = 7, n = 17) a) 6-Tertbutoxycarbonyl-hex-1-ol-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosid

Auf analoge Weise wie für die Titelverbindung aus Beispiel 52a) beschrieben, führt die Umsetzung von 3,54 g (5,0 mmol) 1-Tertbutoxycarbonylhexan-6-ol mit 3,02 g (5,0 mmol) 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl bromid in absolutem 1,2-Dichlorethan bei Raumtemperatur zur Bildung von 368,5 mg (11,9% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 76,27; H 7.96;
gef.: C 76,38; H 7.89;

b) 1-Carboxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosid

Zu 30 g (45.81 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 53a) gelöst in 300 ml 1,2-Dichlorethan gibt man bei -10°C 50 ml Trifluoressigsäure und rührt 2 Stunden bei dieser Temperatur. Anschließend wird eine Stunde bei 0°C nach gerührt. Man dampft im Vakuum zur Trockne ein und chromatographiert den Rückstand an Kieselgel (Laufmittel : n-Hexan/2-Propanol = 5 : 1).
Ausbeute: 3,86 g (14,6% d. Th.) eines glasigen Feststoffs.

Elementaranalyse:
ber.: C 75,43; H 7,41;
gef. C 75,40; H 7,54;

c) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7, 10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-2,3,4,6- tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosid (m = 7, n = 17)

6,61 g (10,5 mmol) des in Beispiel 31 h) beschriebenen Gd-Komplexes der 10- (4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7- triessigsäure, 1,08 g Nartriumbromid (10,5 mmol), 8,28 g (72 mmol) N-Hydroxy succinimid und 16,70 g (25,5 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 53b) werden in 200 ml Dimethylsulfoxid bei 50°C gelöst. Nach Abkühlen auf Raum temperatur werden 14,86 g (72 mmol) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid zugesetzt und es wird 60 Minuten voraktiviert. Zu der so hergestellten N-Hydroxy succinimidester-Lösung gibt man eine Lösung von 1,386 g (0,5 mmol) des 24mer-Polyamin auf der Basis des N,N,N',N',N",N"-Hexakis[2-(trilysyl-amino)- ethyl]-trimesinsäuretriamids und 7,28 g (72 mmol) Triethylamin in 10 ml Wasser und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die so erhaltene Suspension wird filtriert und anschließend mit ausreichend Aceton bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag abgesaugt, getrocknet, in Wasser aufgenommen, vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat über eine AMICON® YM-3 Ultrafiltrationsmembran (cut off 3000 Da) entsalzt und von nie dermolekularen Bestandteilen gereinigt. Das Retentat wird anschließend ge friergetrocknet.
Ausbeute: 8,49 g (95% d. Th.)
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 7,6%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 63.28; H 6.76; N 6.27; Gd 6.16;
gef.: C 63.17; H 6.83; N 6.15; Gd 6.09;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 7 : 17 berechnen.

d) Amid-Konjugat des 24er-Polyamins auf der Basis des N,N,N',N',N",N"- Hexakis[2-(trilysyl-amino)-ethyl]trimesinsäuretriamids mit dem Gadoliniumkomplex der 10-(4-Carboxy-1-methyl-2-oxo-3-azabutyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure und 6-Carboxyhexyl-α-D- mannopyranosid (m = 7, n = 17)

8,0 g (0,447 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 53c) werden in einer Mi schung aus 75 ml Ethanol/100 ml Wasser gelöst und 2 g Palladiumkatalysator (10% Pd auf Aktivkohle) zugegeben. Man hydriert 12 Stunden bei Raumtempe ratur und einem Wasserstoffdruck von 1 Atm. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 300 ml. Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 5,21 g (99% d. Th.) glasiger Feststoff.
H₂O-Gehalt (Karl-Fischer): 12%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 47.63; H 6.78; N 9.54; Gd 9.37;
gef.: C 47.52; H 6.88; N 9.48; Gd 9.28;

Daraus läßt sich ein Verhältnis von m : n = 7 : 17 berechnen.

Beispiel 54 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Glutaroyl-2-aminoethyl- 1-thio-β-D-lactose-Amid)₁₃-Konjugat a) N-Glutaroyl-2-aminoethyl-1-thio-β-D-lactose-2,3,6,2",3",4",6"-heptaacetat

Zu einer gerührten Lösung von 12,0 g (15 mmol) (2-Aminoethyl)-1-thio-β-D- lactose-heptaacetat (zur Synthese vgl.: Yoshiaki Miura, Tsutomu Arai, Tatsuya Yamagata, Carbohydrate Reserarch 289 (1996) 193-199) in 200 ml absolutem Tetrahydrofuran gibt man bei 22°C insgesamt 2,05 g (18 mmol) Glutarsäure anhydrid portionsweise hinzu und läßt die Reaktionslösung nach 12 Stunden bei Raumtemperatur nachrühren.

Zur Aufbereitung wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und der ver bleibende Rückstand mit Dichlormethan (250 ml) sowie 1 N Salzsäure (100 ml) versetzt. Nach dem Abtrennen der organischen Produktphase wird diese noch zweimal mit jeweils 75 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrock net. Es wird vom Trockenmittel abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum ab gezogen. Kristallisation aus Diethylether/Pentan (1 : 10) liefert 13,86 g (92,4% d. Th.) der Titelverbindung als farblosen und kristallinen Feststoff.

Elementaranalyse:
ber.: C 49,01; H 5,73; N 1,73; S 3,96;
gef.: C 49,10; H 5,89; N 1,83; S 3,92;

b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₁-[N- Glutaroyl-(2-aminoethyl-1-thio-β-D-lactose-2,3,6,2",3",4",6"-hepta acetyl)-Amid-]₁₃-Konjugat

14 mg (18,96 mmol) der Verbindung aus Beispiel 54a) werden bei Raumtempe ratur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und bei 0°C mit 2,56 g (22,2 mmol) N-Hydroxysuccinimid gefolgt von 4,55 g (22,2 mmol) Dicyclo hexylcarbodimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 0°C und 3 Stunden bei 22°C filtriert man vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff ab und tropft die so erhaltene klare Aktivesterlösung der oben genannten Titelver bindung bei 0°C langsam zu einer gerührten Lösung von 4,0 g (0,446 mmol; entsprechend 5,8 mmol an freier Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Bei spiel 10a). Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und mit Dichlormethan auf ein Ge samtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 7,7 g (92,6% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Po lymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwe felwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 53,4% Lactoseheptaacetat-Einheiten (entsprechend 13 Lactoseester pro Molekül).

Elementaranalyse:
ber.: C 57,35; H 7,74; N 8,41;
gef.: C 57,41; H 7,78; N 8,37;

c) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Glutaroyl-2-aminoethyl-1- thio-β-D-lactose-Amid)₁₃-Konjugat

5,87 g (0,312 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 54b) werden in 100 ml absolutem Dichlormethan gelöst und anschließend bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32%igen wässrigen Ammoniaklösung ver setzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit je weils 60 ml Diethylether extrahiert und anschließend durch Versetzen mit 10 %iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht. Es wird mit Wasser auf ein Gesamtvolu men von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmem bran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml auf gefüllt und gefriergetrocknet.

Elementaranalyse:
ber.: C 47,58; H 6,61; N 8,27; S 3.62;
gef.: C 47,61; H 6,58; N 8,32; S 3,68;
Wassergehalt: 6,43%
Ausbeute: 3,29 (89,6% d. Th) als amorphes und farbloses Pulver.

Für die oben genannte Titelverbindung wurde ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,4% Gly-Me-DOTA und 54,6% Lactose (entsprechend 11 Gly- Me-DOTA-Einheiten und 13-D-Lactoseresten pro Molekül) ermittelt. In der Ti telverbindung sind mittels der Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

d) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Glutaroy-2- aminoethyl-1-thio-β-D-lactose-Amid)₁₃-Konjugat

2,53 g (0,22 mmol; entsprechend 2,42 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbin dung aus Beispiel 54c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10%iger wässriger Salz säure auf 5,0 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Ver setzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultra filtration gegen destilliertes Wasser über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Man erhält 2,7 g (98,6% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 6,12%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,47; H 5,51; N 7,21; S 3,16; Gd 13,10;
gef.: C 41,54; H 5,60; N 7,16; S 3,09; Gd 13,18;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,2% Gd-Gly-Me-DOTA und 54,8% Lactose (entsprechend 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13-D- Lactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreak tion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 55 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Glutaroyl-2-aminoethyl-1- O-β-D-lactose-Amid)₁₃-Konjugat a) N-Glutaroyl-2-aminoethyl-1-O-β-D-lactose-2,3,6,2",3",4",6"-heptaacetat

In analoger Weise wie für Beispiel 54a) beschrieben, liefert die Umsetzung von 14,0 g (21,6 mmol) (2-Aminoethyl)-β-latosidheptaacetat (Yoshiaki Miura, Tsu tomu Arai, Tatsuya Yamagata, Carbohydrate Reserarch 289 (1996) 193-199) in 250 ml wasserfreiem THF mit 2,96 g (26 mmol) Glutarsäureanhydrid nach Aufarbeitung 14,9 g (87,0% d. Th.) der Titelverbindung als farblosen Feststoff.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 50,00; H 5,85; N 1,77;
gef.: C 49,89; H 5,92; N 1,80;

b) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-tri-t.-butylester-Amid)₁₁-[N-Gluta royl-(2-aminoethyl-1-O-β-D-lactose-2,3,6,2",3",4",6"-heptaacetyl)- Amid-]₁₃-Konjugat

14,4 g (18,16 mmol) der Verbindung aus Beispiel 55a) werden bei Raumtempe ratur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und bei 0°C mit 2,51 g (21,8 mmol) N-Hydroxysuccinimid gefolgt von 4,46 (28,8 mmol) Dihydro hexylcarbodimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei 0°C und 3 Stunden bei 22°C filtriert man vom unlöslichen Dicyclohexylharnstoff ab und tropft die so erhaltene klare Aktivesterlösung der oben genannten Titelver bindung bei 0°C langsam zu einer gerührten Lösung von 3,9 g (0,435 mmol; entsprechend 5,65 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 10a). Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und mit Dichlormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinan der zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 7,48 g (90,4% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Po lymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwe felwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 54,5% Lactoseheptaacetat-Einheiten (entsprechend 13 Lactoseresten pro Molekül.)

Elementaranalyse:
ber.: C 56,72; H 7,65; N 8,31;
gef.: C 56,82; H 7,69; N 8,41;

c) 24er-Kaskadenamin-(Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Glutaroyl-2-aminoethyl- 1-O-β-D-lactose-Amid)₁₃-Konjugat

5,93 g (0,312 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 55b) werden in 100 ml ab solutem Dichlormethan gelöst und bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluor essigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der so erhaltene, ölige Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32%igen wässrigen Ammoniak lösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rück stand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert und anschließend durch Ver setzen mit 10%iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht. Es wird mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltra tionsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der ver bleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Wassergehalt: 9,30%
Ausbeute: 3,23 g (91,7% d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 48,46; H 6,73; N 7,33;
gef.: C 48,52; H 6,59; N 7,40;

d) 24er-Kaskadenamin-(Gd-Gly-Me-DOTA-Amid)₁₁-(N-Glutaroyl-2-amino ethyl-1-O-β-D-lactose-Amid)₁₃-Konjugat

2,48 g (0,22 mmol; entsprechend 2,42 mmol an Gly-Me-DOTA) der Titelverbin dung aus Beispiel 55c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH- Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10%iger wässriger Salz säure auf 5,0 eingestellt. Anschließend gibt man bei Raumtemperatur 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml auf gefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet. Man erhält 2,75 g (96,1% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 4,19%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 42,13; H 5,50; N 7,33; Gd 13,31;
gef.: C 42,20; H 5,60; N 7,26; Gd 13,28;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,7% Gd-Gly-Me-DOTA und 54,3% Lactose (entsprechend 11 Gd-Gly-Me-DOTA-Einheiten und 13-D- Lactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der quantitativen Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 56 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-(α-D-mannopyranose-1-thio-3-propi on-Amid)₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-tetra-t.-butylester-Amid)₁₁

20,0 g (32,37 mmol) 3,9-Bis(t-butoxycarbonylmethyl)-3,6,9-triazaundecandi carbonsäure-di-t-butylester (Darstellung wie in den europäischen Patentanmel dungen: EP 0430863; EP 0331616 und EP 0271180 beschrieben) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rüh ren mit 4,47 g (38,84 mmol) N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur porti onsweise mit insgesamt 7,97 g (38,84 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raum temperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so er haltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 9,0 g (1,9 mmol; entsprechend 44,8 mmol an freien Aminofunktio nen) 24er-Kaskadenpolyamin und 4,6 g (45,8 mmol) Triethylamin in 60 ml abso lutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt und der verbleibende Rückstand mit 250 ml Dichlormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organische Phase nacheinander mit 5%iger Salzsäure, gesättigte Natrium hydrogencarbonatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natriumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 14,0 g (79,2% d. Th.; bezo gen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfolgenden Syntheseschritte einge setzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreaktion der oben genannten Titelver bindung liegen im Mittel 13 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.

Elementaranalyse:
ber.: C 58,84; H 9,01; N 11,66;
gef.: C 57,79; H 9,24; N 11,80;

b) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-tetra-tert.butylester-Amid)₁₁-[(3-(2,3,4, 6-Tetra-O-acetyl)-1-thio-α-D-mannopyranosyl-3-propion-Amid)₁₃- Konjugat

Einge gerührte Lösung von 3,5 g (0,27 mmol; entsprechend 3,5 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 56a) in 100 ml absolutem Dichlormethan wird bei Raumtemperatur mit 617 mg (6,1 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 2,97 g (5,61 mmol) 3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid ester (Lee, Y. C. et al., Biochemi., Vol. 15, No. 18, 1976, 3956-3963; Krohn, K. A. et al., J. Nucl. Med., Vol. 26, 10, 1985, 1157-1167) in 60 ml Dichlormethan tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtem peratur wird mit Dichlormethan auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 3,55 g (92,6% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Elementaranalyse:
ber.: C 55,10; H 7,73; N 7,37; S 2,81;
gef.: C 55,20; H 7,78; N 7,31; S 2,79;

Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 55% D-Mannose tetraacetat (entsprechend 13 D-Mannoseresten pro Molekül).

c) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₁-(α-D-mannopyranose-1-thio-3- propion-Amid)₁₃-Konjugat

4,5 g (0,30 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 56b) werden in 100 ml abso lutem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32%igen wässrigen Ammoniaklösung ver setzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert Die und anschließend durch Versetzen mit 10%iger Salzsäure auf pH 3.0 gebracht, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Nach erneuter Ultrafiltra tion wird der verbleibende Rückstand mit entionisiertem Wasser auf ein Volu men von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet. Anschließend wird in 300 ml Wasser aufgenommen und der pH-Wert der resultierenden Produktlösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf 7,2 eingestellt.
Ausbeute: 2,80 g (81,3% d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver.
Wassergehalt: 6,39%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,20; H 5,65; N 9,82; Na 9,09; S 3,75;
gef.: C 43,22; H 5,71; N 9,79; Na 9,12; S 3,70;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

d) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-(α-D-mannopyranose-1-thio-3- propion-Amid)₁₃-Konjugat

2,5 g (0,22 mmol; entsprechend 2,47 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 56c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird durch tropfenweiser Zugabe mit 10%iger wässrigen Salzsäure auf 5,2 eingestellt. Abschließend gibt man bei Raumtemperatur eine Lösung von 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei Raumtemperatur. Die Reak tionslösung wird durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 ge bracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufge füllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefrier getrocknet. Man erhält 2,6 g (98,3% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 8,11%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 39,73; H 5,20; N 9,03; S 3,45; Gd 14,30;
gef.: C 39,81; H 5,20; N 9,07; S 3,49; Gd 14,28;

Aus den molaren Elementarverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 45,2% Gd-DTPA und 54,8% D-Mannose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-D-Mannose resten pro Molekül). In der Titelverbindung sind durch Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 57 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)_11-(β-D-galactopyranose-1-thio-3-propi on-Amid)₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-tetra-tert.butylester-Amid)₁₁-[(3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl)-1-thio-β-D-galactopyranosyl-3-propion-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 56b) beschrieben, führt die Umsetzung von 3,0 g (0,32 mmol; entsprechend 4,2 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 56a) mit 2,76 g (5,2 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-1- thio-β-D-galactopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (Darstellung gemäß: Lee, Y. C. et al., Biochemi., Vol. 15, No. 18, 1976, 3956-3963; Krohn, K. A. et al., J. Nucl. Med., Vol. 26, 10, 1985, 1157-1167) zur Bildung von 4,15 g (87,6% d. Th.) der oben genannten Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 55,10; H 7,73; N 7,37; S 2,81;
gef.: C 55,14; H 7,80; N 7,31; S 2,88;

b) 24er-Kaskadenamin-(DTPA-Amid)₁₁-(β-D-galactopyranose-1-thio-3- propion-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 56c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 3,5 g (0,23 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 56b) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 2,26 g (88,6% d. Th.) der oben genann ten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 5,74%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,20; H 5,65; N 9,82; Na 9,09; S 3,75;
gef.: C 43,22; H 5,68; N 9,77; Na 9,12; S 3,70;

c) 24er-Kaskadenamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-(β-D-galactopyranose-1-thio- 3-propion-Amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 56d) beschrieben, führt die Komplexierung von 2,0 g (0,180 mmol; entsprechend 1,97 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 57b) mit 525 mg (2,00 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 2,14 g (98,4% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses und amor phes Pulver
Wassergehalt: 7,22%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 39,73; H 5,20; N 9,03; Na 2,09; S 3,45; Gd 14,30;
gef.: C 39,84; H 5,22; N 9,10; Na 2,12; S 3,40; Gd 14,27;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
11 Gd-DTPA-Einheiten
und 13 D-Galactopyranosylresten

Beispiel 58 24er-Kaskadenpolyamin-(¹¹¹Indium-DTPA-Amid)₈-[β-(1-Deoxy-1-thioureido)- sialyl-Le^x]₁₆-Konjugat a) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-tetra-t.butylester-Amid)₈-Konjugat

12,35 g (20,00 mmol) 6,9-Bis(t-butoxycarbonylmethyl)-3-carboxymethyl-3,6,9- triazaundecandicarbonsäure-di-t-butylester werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolutem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 2,9 g (24 mmol) N- Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur portionsweise mit insgesamt 49 g (24 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 9,0 g (1,9 mmol; entspre chend 45,8 mmol an freien Aminofunktionen) 24er-Kaskadenpolyamin und 4,6 g (45,8 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne einge engt und der verbleibende Rückstand mit 250 ml Dichlormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organische Phase nacheinan der mit 5% Salzsäure, gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natriumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 12,38 g (94,6% d. Th.; bezogen auf eingesalztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nach folgenden Syntheseschritte eingesetzt wird. Nach quantitativer Ninhydrinreak tion der oben genannten Titelverbindung liegen im Mittel 16 freie Aminfunktio nen pro Molekül vor.

b) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₈-Konjugat

4,5 g (0.58 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 58a) werden in 100 ml abso lutem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 200 ml destillierten Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jewels 60 ml Diethylether extrahiert. Anschließend wird die wässrige Produktlösung durch Versetzen mit 10%iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht, mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YMA-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Anschließend wird in 300 ml Wasser aufgenommen und der pH-Wert der resultierenden Produktlösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Nach erneuter Ultrafiltration wird der verbleibende Rückstand mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 3,16 g (84,3% d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver.
Wassergehalt: 7,33%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,70; H 6,0; N 14,92; Na 11,36;
gef.: C 44,77; H 6,6; N 14,90; Na 11,31;

c) 1-Deoxy-1-isothiocyanato-sialyl-Le^x-

270 mg (0,293 mmol) 1-Deoxy-1-amino-sialyl-Le^x (Darstellung gemäß: Kunz, H.; et al., Angew. Chem. 1994, 106. Nr. 20; Kunz, H.; et al., Angew. Chem. 1996, 108, Nr. 3, 359-362; Kunz, H. et al., Angew. Chem. 1995, 107, Nr. 9; Kretzschmar et al., Tetrahedron, Vol.51, No. 47, 13015-13030, 1995) werden in 40 ml 80%igem, wässrigem Ethanol gelöst und bei 0°C mit 0,056 ml (0,73 mmol) Thiophosgen durch Zugabe über eine Mikrospritze versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 22°C wird das Ethanol im Vakuum abgezogen und der erhaltene wässrige Rückstand des rohen Isothiocyanats direkt für die nachfolgende Reaktion eingesetzt, wobei der Gehalt an oben genannter Titel verbindung der so erhaltenen wässrigen Rohproduktlösung mit 0,276 mmol (entspricht einem 95%igen Umsatz) angenommen wird, welche in einem Ge samtvolumen von 7.6 ml wässriger Lösung enthalten sind.

Dünnschichtchromatographie (Ethylacetat/Methanol/Wasser/Eisessig = 5 : 3 : 3 : 0,5; R_f = 0,54) der Reaktionslösung zeigt vollständige und einheitliche Umsetzung zur oben genannten Titelverbindung an.

Schwefelbestimmung (bezogen auf wasserfreie Probe):
ber.: S 3,31;
gef.: S 3,24;

d) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₈-[β-(1-Deoxy-1-thioureido)- sialyl-Le^x]₁₆-Konjugat

Die Umsetzung von 54.5 mg (0,00842 mmol; entsprechend 0,134 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 58b) mit der gesamten wässrigen Lösung des Rohprodukts der Titelverbindung aus Beispiel 58c, entsprechend 0,276 mmol), liefert nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung 164,7 mg (89% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 10.01%

Elementaranalyse (Natrium- und Schwefelbestimmung; bezogen auf wasser freie Probe):
ber.: S 2,34; Na 3,35;
gef.: S 2,36; Na 3,29;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung ver laufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 67,4% sialyl-Le^x (entsprechend 8 sialyl-Le^x-Resten pro Molekül). Aus der quantitativen Schwefelsäurebestim mung mittels TBA (Thiobarbitursäure) durch literaturbekannte Vorgehensweise (vgl. Beispiel 39) wird der Beladungsgrad der oben genannten Titelverbindung mit 67,2% an Tetrasaccharid (entsprechend 16 sialyl-Le^x Resten pro Molekül) ermittelt. Nach erneuter colorimetrischer Titration der Titelverbindung mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indi kator konnte der DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 32,8% (entsprechend 8 DTPA Einheiten pro Molekül) bestätigt werden.

e) 24er-Kaskadenpolyamin-(¹¹¹Indium-DTPA-Amid)₈-[β-(1-Deoxy-1- thioureido)-sialyl-Le^x]₁₆-Konjugat

1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 58d) werden in 2 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von ¹¹¹Indiumchlorid (Anfangsaktivität: 17,2 MBq) versetzt. Nach einer Reakti onszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt und sterilfiltriert.

Die so hergestellte Lösung ist direkt für die entsprechenden radiodiagnosti schen Zwecke einzusetzen

Beispiel 59 24er-Kaskadenpolyamin-(¹⁵⁷Gadolinium-DTPA-Amid)₈-[β-1-O-(6- Thioureidohexyl)-sialyl-Le^x]₁₆-Konjugat a) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₈-Konjugat

5,0 g (1.80 mmol; entsprechend 43.2 mmol an freien Aminofunktionen) 24er- Kaskadenpolyamin werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 8.0 g (20.0 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mono-ethylester hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32%iger Natronlauge auf 11,5 einge stellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhal tene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleiben de Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml auf gefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 10.63 g (91.2% d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 7.88%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,70; H 6,04; N 14,92; Na 11,36;
gef.: C 44,81; H 6,10; N 14,90; Na 11,32;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 33,47% (entsprechend 8 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion als auch der quantitativen Aminogruppenbestimmung mit der TNBS-Methode liegen im statistischen Mittel pro Polymermolekül 16 freie Aminofunktionen vor.

b) β-1-O-(6-Isothiocyanatohexyl)-sialyl-Le^x

250 mg (0,243 mmol) β-1-O-[6-Aminohexyl]-sialyl-Le^x (Darstellung gemäß: Kunz, H.; et al., Angew. Chem. 1994, 106. Nr. 20; Kretzschmar et al., Tetra hedron, Vol. 51, No. 47, 13015-13030, 1995) werden in 30 ml 80%igem, wässrigem Ethanol gelöst und bei 0°C mit 0,046 ml (0,60 mmol) Thiophosgen durch Zugabe über eine Mikrospritze versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde bei 22°C wird das Ethanol im Vakuum abgezogen und der erhaltenen wässrigen Rückstand des rohen Isothiocyanats direkt für die nachfolgende Reaktion eingesetzt, wobei der Gehalt an oben genannter Titelverbindung der so erhaltenen wässrigen Rohproduktlösung mit 0,23 mmol (entspricht einem 95 %igen Umsatz) angenommen wird, welche in einem Gesamtvolumen von 5.6 ml wässriger Lösung enthalten sind.

Dünnschichtchromatographie (Ethylacetat/Methanol/Wasser/Eisessig = 5 : 3 : 3 : 0,5; R_f = 0,72) der Reaktionslösung zeigt vollständige und einheitliche Umsetzung zur oben genannten Titelverbindung an.

Elementaranalyse (Schwefelbestimmung; bezogen auf eine wasserfreie Probe):
ber.: S 3,00;
gef.: S 2,90;

c) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₈-[β-1-O-(6-Thioureidohexyl)- sialyl-Le^x]₁₆-Konjugat

Die Umsetzung von 50.0 mg (0,00770 mmol; entsprechend 0,123 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 59a) mit der gesamten wässrigen Lösung des Rohprodukts der Titelverbindung aus Beispiel 59b) (0,23 mmol) liefert nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung 167,7 mg (92,4% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes.
Wassergehalt: 9.04%

Elementaranalyse (Natrium- und Schwefelbestimmung; bezogen auf wasser freie Probe):
ber.: S 2,18; Na 6.95;
gef.: S 2,29; Na 7.03;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung ver laufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 67,0% sialyl-Le^x-Einheiten (entsprechend 16 sialyl-Le^x-Resten pro Molekül).

Aus der quantitativen Sialinsäurebestimmung mittels TBA (Thiobarbitursäure) durch literaturbekannte Vorgehensweise [vgl. Lit.: Aminoff, D., (1961), "Methods for the quantitative estimation of N-acetylneuraminic acid and their application to hydrolysates of sialomucoids", J. Biochem., 81, 384-392; Uschi da, Y. and Sugimori, T. (1977), "Distribution of neuraminidase in Arthrobacter and its purification by affinity chromatography", J. Biochem. (Tokio), 82, 1425- 1433] wird der Beladunsgrad der oben genannten Titelverbindung mit 68.1 an Tetrasaccharid (entsprechend 16 sialyl-Le^x-Resten pro Molekül ermittelt. Nach erneuter colorimetrischer Titration der Titelverbindung mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung, in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, konnte der DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 32,1% (entsprechend 8 DTPA Einheiten pro Molekül) bestätigt werden.

d) 24er-Kaskadenpolyamin-(¹⁵⁷Gadolinium-DTPA-Amid-)₈-[sialyl-Le^x-1- (6-hexyl-thioharnstoff)]₁₆-Konjugat

1 mg der Titelverbindung aus Beispiel 59c) werden in 2 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von ¹⁵⁷Gadolinium chlorid (Anfangsaktivität: 16,2 MBq) versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natron lauge auf pH 7,2 eingestellt und sterilfiltriert. Die so hergestellte Lösung ist direkt für die entsprechenden radiodiagnostischen Zwecke einzusetzen

Beispiel 60 24er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-(N-Glutaroyl-3-aminoethyl-β- 1-thiolactosid-amid)₁₃-Konjugat a) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-tetra-t.-butylester-Amid)₁₁-(N-glutaroyl- 3-aminoethyl-β-1-thiolactosid-amid)₁₃-Konjugat

Auf analoge Weise wie in Beispiel 54b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 5,40 g (0,58 mmol, 7,54 mmol an freien Amin) der Titelverbindung aus Beispiel 56a), welche zuvor in 25 ml absolutem N,N-Dimethylformamid gelöst und die so enthaltene Lösung auf 0°C gekühlt wurde, mit einer Lösung von 12,16 g (13,92 mmol) N-Glutaroyl-3-aminoethyl-β-1-thiolactosylheptaacetat-glutarsäure- N-hydroxysuccinimidester [(zur Darstellung vgl. Beispiel 54b)] in 75 ml abso lutem N,N-Dimethylformamid zur Bildung der gewünschten Titelverbindung. Dazu wird nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und mit Dichlormethan auf ein Gesamtvo lumen von 500 ml aufgefüllt. Zur Aufarbeitung wird die organische Phase nacheinander zweimal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydro gencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 10,0 g (90,1% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrin reaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen mehr vor. Aus dem pro zentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 52,9% Lactoseheptaacetateinheiten (entsprechend 13 Lactoseresten pro Molekül).

b) 24er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₁₁-(N-glutaroyl-3-aminoethyl-β- 1-thiolactosid-amid)₁₃-Konjugat

6,1 g (0,312 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 60a) werden in 100 ml ab solutem Dichlormethan gelöst und anschließend bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der so erhaltene, ölige Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32%igen wässrigen Ammoniaklösung versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der ver bleibende Rückstand in 200 ml destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Pro duktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert und an schließend durch Versetzen mit 10%iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht. Es wird mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mit tels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 3,95 g (88,7% d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver
Wassergehalt: 4,88%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,44; H 5,85; N 8,90; S 2,91; Na 7,06;
gef.: C 44,49; H 5,92; N 8,79; S 2,87; Na 6,98;

c) 24er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₁-(N-glutaroyl-3-aminoethyl β-1-thiolactosid-amid)₁₃-Konjugat

3,15 g (0,22 mmol; entsprechend 2,42 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 60b) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird durch tropfenweise Zugabe mit 10%iger wässrigen Salzsäure auf 4,0 eingestellt. Anschließend gibt man bei Raumtemperatur 670 mg (2,55 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reak tionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 gebracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufgefüllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3-Ultrafiltra tionsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrock net. Man erhält 3,3 g (98,4% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 7,39%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,71; H 5,28; N 8,35; Na 1,66; S 2,73; Gd 11,33;
gef.: C 41,81; H 5,34; N 8,29; Na 1,62; S 2,69; Gd 11,40;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 46% DTPA und 54% Lactose (entsprechend 11 Gd-DTPA-Einheiten und 13-Lactoseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktio nen mehr nachweisbar.

Beispiel 61 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₈-(α-D-mannopyranosyl-1-thiopro pionsäureamid)₃₀-Konjugat a) 48er-Kaskadenpolyamin-[DTPA-tetra-t.-butylester-Amid (terminal)]₁₈- Konjugat

16,55 g (26,8 mmol) DTPA-tetra-tert.butylester (Darstellung: Deutsche Patent anmeldung Nr. 195 08 058 A) werden bei Raumtemperatur in 100 ml absolu tem Dimethylformamid gelöst und unter Rühren mit 3,7 g (32,16 mmol) N-Hy droxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das klare Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur portionsweise mit insgesamt 6,6 g (32,16 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bei 0°C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat tropft man nun langsam bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung von 6,5 g (0,99 mmol; entspre chend 47,8 mmol an freien Aminofunktionen) 48er-Kaskadenpolyamin und 4,8 g (50,0 mmol) Triethylamin in 60 ml absolutem DMF. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne einge engt und der verbleibende Rückstand mit 250 ml Dichlormethan versetzt. Nach dem Abfiltrieren von unlöslichen Anteilen wird die organische Phase nacheinan der mit 5%iger Salzsäure, gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der organischen Produktphase über Natriumsulfat wird filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 14,5 g (85,2% d. Th.; bezogen auf eingesetztes Polyamin) eines leicht gelb gefärbten Öls, welches ohne weitere Reinigung unverzüglich für die nachfolgenden Syntheseschritte eingesetzt wird.

Nach quantitativer Ninhydrinreaktion der oben genannten Titelverbindung lie gen im Mittel 30 freie Aminfunktionen pro Molekül vor.

Elementaranalyse:
ber.: C 59,87; H 9,20; N 8,88;
gef.: C 59,80; H 9,28; N 8,90;

b) 48er-Kaskadenpolyamin-[DTPA-tetra-t.-butylester-Amid (terminal)]₁₈- [3-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl)-1-thiopropionsäure amid]₃₀-Konjugat

Eine gerührte Lösung von 3,26 g (0,19 mmol; entsprechend 5,7 mmol an freien Aminfunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 61a) in 100 ml absolutem Dichlormethan wird bei Raumtemperatur mit 657 mg (6,5 mmol) Triethylamin versetzt. Anschließend wird mit einer Lösung von 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2,3,4,6- Tetra-O-acetyl-1-thio-α-D-mannopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimid ester in 60 ml Dichlormethan tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit Dichlormethan auf ein Gesamt volumen von 500 ml aufgefüllt. Die organische Phase wird nacheinander zwei mal mit Wasser und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel beim Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Man erhält 5,07 g (90,3% d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl. Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. im Polymer sind keine freien Aminofunk tionen mehr nachweisbar.

Elementaranalyse:
ber.: C 53,52; H 7,48; N 7,22; S 3,16;
gef.: C 53,90; H 7,52; N 7,18; S 3,21;

Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers mit 62,83% α-D-Manno se-tetraacetateinheiten (entsprechend 30 α-D-Mannoseresten pro Molekül).

c) 48er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₁₈-(α-D-mannopyranosyl-1-thio- 3-propionsäure-amid)₃₀-Konjugat

5,17 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 61b) werden in 100 ml ab solutem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird bei 0°C mit insgesamt 75 ml Trifluoressigsäure tropfenweise versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stun den bei Raumtemperatur wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der ver bleibende Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und erneut im Vakuum bis zur Trockne abgezogen. Der Rückstand wird in 100 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur mit 50 ml einer 32%igen wässrigen Ammoniaklösung ver setzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird im Vakuum vom Lösungsmittel abgezogen und der verbleibende Rückstand in 200 m) destilliertem Wasser gelöst. Die wässrige Produktlösung wird zweimal mit jeweils 60 ml Diethylether extrahiert. Die wässrige Produktlösung wird durch Versetzen mit 10%iger Salzsäure auf pH 3,0 gebracht mit Wasser auf ein Ge samtvolumen von 800 ml aufgefüllt und dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltra tionsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der ver bleibende Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und gefriergetrocknet.
Ausbeute: 3,47 g (91,6% d. Th.) als amorphes und farbloses Pulver.
Wassergehalt: 7,34%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,91; H 6,09; N 9,82; S 4,29; Na 7,39;
gef.: C 43,89; H 6,12; N 9,84; S 4,34; Na 7,42;

d) 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₈-(α-D-mannopyranosyl-1- thio-3-propionsäure-amid)₃₀-Konjugat

3,04 g (0,136 mmol; entsprechend 2.45 mmol an DTPA der Titelverbindung aus Beispiel 61c) werden in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung durch tropfenweise Zugabe mit 10%iger wässrigen Salzsäure auf 5,0 eingestellt. Anschließend gibt man bei Raumtemperatur 655,8 mg (2,5 mmol) Gadoliniumchlorid, in Form von 10 ml einer wässrigen Lösung, hinzu und rührt die Reaktionslösung für 12 Stunden bei 60°C. Bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung durch Versetzen mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 ge bracht und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml aufge füllt. Nach dreimaliger Ultrafiltration gegen destilliertes Wasser über eine YM3- Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefrier getrocknet.

Man erhält 3,21 g (98,6% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes, farbloses Pulver mit einem Wassergehalt von 7.30%.

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,00; H 5,68; N 9,17; S 4,01; Gd 11,80; Na 1,72;
gef.: C 41,09; H 5,71; N 9,10; S 4,08; Gd 11,74; Na 1,74;

Aus den molaren Elementverhältnissen von Schwefel zu Gadolinium ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 37,8% Gd-DTPA und 62,2 % α-D-Mannose (entsprechend 18 Gd-DTPA-Einheiten und 30 α-D-Mannose resten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrinreaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Beispiel 62 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₈-[3-(1-thio-β-D-glucopyranosyl)- propionsäure-amid]₃₀-Konjugat a) 48er-Kaskadenpolyamin-[DTPA-tetra-t.-butylester-Amid (terminal)]₁₈ und [3-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-1-thio-β-D-glucopyranosyl)-propionat]₃₀- Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 61b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 3,26 g (0,19 mmol; entsprechend 5,70 mmol an freien Aminfunktionen) der Ti telverbindung aus Beispiel 61a) mit 3,3 g (6,3 mmol) 3-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl- 1-thio-β-D-glucopyranosyl)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidester 5,45 g (94.3 % d. Th.) der Titelverbindung als farbloses Öl.

Elementaranalyse:
ber.: C 53,52; H 7,48; N 7,22; S 3,16;
gef.: C 53,88; H 7,46; N 7,20; S 3,20;

Die Titelverbindung zeigt eine negative Ninhydrinreaktion. Aus dem prozentua len Schwefelwert der Elementaranalyse ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 30 β-D-Glucoseresten pro Molekül.

b) 48er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₁₈-[3-(1-thio-β-D-glucopyra nosyl)-propionsäure-amid]₃₀-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 61c) beschrieben, führt die Abspaltung der Schutzgruppen von 5,17 g (0,17 mmol) der Titelverbindung aus Beispiel 62a) nach Gefriertrocknung zur Bildung von 3,35 g (88,0% d. Th.) der oben genann ten Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 7,44%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 43,91; H 6,09; N 9,82; S 4,29;
gef.: C 43,94; H 6,11; N 9,77; S 4,30;

c) 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₈-[3-(1-thio-β-D- glucopyranosyl)-propionsäure-amid]₃₀-Konjugat

Auf analoge Weise wie für Beispiel 61d) beschrieben, führt die Komplexierung von 3,04 g (0,136 mmol; entsprechend 2,45 mmol an DTPA) der Titelverbin dung aus Beispiel 62b) mit 556 mg (2,5 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, zur Bildung der oben genannten Titelverbindung.
Ausbeute: 3,21 g (98,4% d. Th.) als farbloses und amorphes Pulver
Wassergehalt: 5,03%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41,00; H 5,68; N 9,17; S 4,01; Gd 11,80; Na 1,72;
gef.: C 40,96; H 5,75; N 9,20; S 3,97; Gd 11,78; Na 1,69;

Mittlerer Beladungsgrad pro Molekül der oben genannten Titelverbindung:
18 Gd-DTPA-Einheiten (Polymerbeladungsgrad von 43,8%)
und 30 D-Glucopyranosylreste (Polymerbeladungsgrad von 56,2%)

Beispiel 63 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-β- D-glucosaminopyranosyl]₃₃-Konjugat a) 13 kD-poly-L-Lysin-(DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl-β- D-glucosaminopyranosyl]₃₃-Konjugat

1,5 g (0,047 mmol; entsprechend 1,54 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 1a) werden in 80 ml entionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 molarer Salzsäure auf 9,5 eingestellt. Anschließend wird portionsweise mit insgesamt 2,35 g (6,63 mmol) p-Iso thiocyanatophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminopyranose (Darstellung gemäß: Jonas Adam J, Jobe Helgi, Biochem. J. (1990), 268(1), 41-5) versetzt, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung mittels 0,1 molarer Natronlauge bei 9,5 kon stant gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei 22°C wird fil triert und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml aufgefüllt. Dreimalige Ultrafiltration der Reaktionslösung über eine YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) gefolgt von Gefriertrocknung des verbleibenden Rück stands liefert 1,93 g (93,8% d. Theorie) eines amorphen und farblosen Fest stoffs.

Wassergehalt: 7,43%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,78; H 5,60; N 11,74; S 2,42; Na 9,87;
gef.: C 44,82; H 5,63; N 11,70; S 2,37; Na 9,79;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Methode, welche zur quantitativen als auch zur qualitativen Bestimmung von freien Aminofunktionen allgemein einge setzt werden können, verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementarana lyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 41,6% N-Acetylglucosamin (entsprechend 26 N-Acetylglucosaminresten pro Molekül). Die colorimetrische Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungsgrades des Konjugats liefert als Ergebnis einen mittleren statistischen Beladungsgrad von 41.1% N-Acetylglucosamin pro Molekül und ist somit als identisch anzusehen mit dem Beladungsgrad (33 N- Acetyl-glucosamineinheiten pro Molekül), welcher aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse ermittelt wurde.

b) 13-kD-poly-L-Lysin-(Gd-DTPA-Amid)₄₇-[1-(4-Thioureidophenyl)-N-acetyl- β-D-glucosaminopyranosyl]₃₃-Konjugat

1,03 g (0,023 mmol; entsprechend 1,50 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 63a) werden in Analogie wie in Beispiel 1c) beschrieben, mit 0,40 g (1,51 mmol) Gadoliniumchlorid, gelöst in 10 ml destilliertem Wasser, kom plexiert. Nach Aufarbeitung und Gefriertrocknung erhält man 1,48 g (99,4% d. Th.) der Titelverbindung als amorphes Pulver.
Wassergehalt: 0,31%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 40,90; H 5,11; N 10,72; S 2,21; Gd 15,41; Na 2,25;
gef.: C 40,87; H 5,03; N 10,68; S 2,27; Gd 15,48; Na 2,30;

Aus den molaren Elementarverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 60% Gd-DPTA und 40% N-Acetyl-glucosamin (entsprechend 47 Gd-DTPA-Einheiten und 33 -N-Acetyl-β- D-glucosaminresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels Ninhydrin reaktion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Die T₁ und T₂-Relaxivitäten der Titelverbindung wurden jeweils in Wasser, als auch im Plasma bestimmt.

Die Messungen erfolgten bei 40°C, einer Magnetfeldstärke von 0.47 Tesla, und
der T₁-Sequenz: 180°-TI-90° [Inversion Recovery]
sowie der T₂-Sequenz: 90°-TE-180° [CPMG].

R₁(Wasser) = 13.8 ± 0.2 (L/mmol . s)
R₁(Plasma) = 16.1 ± 0.3 (L/mmol . s)
R₂(Wasser) = 15.8 ± 0.2 (L/mmol . s)
R₂(Plasma) = 18.0 ± 0.1 (L/mmol . s)

Beispiel 64 24er-Kaskadenpolyamin-{10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7- (carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-Gadolinium-Komplex}₁₂-[1-(4-Thioureidophenyl)-β-D- galactopyranosyl]₁₂-Konjugat a) 24er-Kaskadenpolyamin-{10-[7-(4-Thioureidophenyl)-2-hydroxy-5-oxo- 7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-Gadolinium-Komplex}₁₂-Konjugat

Bei Raumtemperatur werden 5,0 g (1,06 mmol; entsprechend 25,44 mmol an freien Aminfunktionen) 24er-Kaskadenpolyamin in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der resultierenden Lösung wird durch tropfenweises Ver setzen dieser Lösung mit 1 molarer Natronlauge wird ein pH-Wert von 9,5 ein gestellt. Anschließend gibt man insgesamt 15,77 g (20,0 mmol) des 4-Iso thiocyanatophenyl-DO3A-β-hydroxy-Gadolinium-Komplexes (Darstellung ge mäß: Deutsche Patentanmeldung Nr. 44 24 923 A1) portionsweise hinzu, wo bei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und durch Zugabe von destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhaltene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleibende Rückstand wird mit entioni siertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml aufgefüllt und die wässrige Pro duktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 10,2 g (78,6% bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 6,94%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 45,38; H 5,77; N 12,58; S 3,05; Gd 14,35;
gef.: C 45,42; H 5,81; N 13,02; S 2,98; Gd 14,90;

Aus dem Gehalt, welcher durch Elementaranalyse für Gadolinium und Schwefel ermittelt wurde, ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit Gadolinium Komplexen von 39.7% (entsprechend 12 Gd-DO3A-Einheiten pro Molekül). 06762 00070 552 001000280000000200012000285910665100040 0002019728954 00004 06643 Nach quantitativer Ninhydrinreaktion liegen im Mittel pro Polymermolekül noch 12 freie Aminofunktionen vor.

b) 24er-Kaskadenpolyamin-{10-[7-(4-Isothiocyanatophenyl)-2-hydroxy-5-oxo- 7-(carboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10- tetraazacyclododecan-Gadolinium-Komplex}₁₂-[1-(4-Thioureidophenyl)- β-D-galactopyranosyl]₁₂-Konjugat

In analoger Weise wie für Beispiel 1b) beschrieben, liefert die Umsetzung von 2,0 g (0.16 mmol; entsprechend 1,90 mmol an freien Aminfunktionen) der Titel verbindung aus Beispiel 64a) mit 2,65 g (8,36 mmol) p-Isothiocyanatophenyl-β- D-galactopyranose nach Aufarbeitung 2,34 g (89,3% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffes. Wassergehalt: 4,97%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 46,40; H 5,55; N 11,03; S 4,70; Gd 11,52;
gef.: C 46,91; H 5,60; N 11,00; S 4,68; Gd 11,49;

Die Ninhydrinreaktion der Titelverbindung verläuft negativ, d. h. das polymere Produkt enthält keine freien Aminofunktionen. Aus dem prozentualen Schwefel wert als auch dem Gadoliniumgehalt der Elementaranalyse der Titelverbindung ergibt sich ein Beladungsgrad des Polymers von 51.2% β-D-Galactose (entsprechend 12 β-D-Galactoseresten pro Molekul) sowie ein Komplex beladungsgrad des Polymers von 48,8% (entsprechend 12 Gadoliniumkom plexen pro Molekül).

Beispiel 65 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₈-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl)₃₀-Konjugat a) 48er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₁₈

Eine Lösung von 5,0 g (1.7 mmol; entsprechend 81.7 mmol an freien Amino funktionen) 48er-Kaskadenpolyamin wird in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und mit 1 molarer Natronlauge ein pH-Wert von 9,5 eingestellt. Anschließend gibt man insgesamt 16,5 g (41,0 mmol) DTPA-Monoanhydrid-mono-ethylester hinzu, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 1 molarer Natronlauge konstant bei 9,5 gehalten wird. Nach beendeter Zugabe wird noch 15 Minuten bei Raumtemperatur nachgerührt und anschließend der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von 32%iger Natronlauge auf 11,5 einge stellt. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei Raumtemperatur wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 800 ml aufgefüllt. Die so erhal tene wässrige Produktlösung wird dreimal mittels einer YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) gegen destilliertes Wasser ultrafiltriert. Der verbleiben de Rückstand wird mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 500 ml auf gefüllt und die wässrige Produktlösung gefriergetrocknet.
Ausbeute: 15,63 g (81.4%; bezogen auf eingesetztes Polyamin) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 6,94%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 40,82; H 5,26; N 12,64; Na 14.65;
gef.: C 40,91; H 5,30; N 12,59; Na 14,58;

Nach Elementaranalyse als auch colorimetrischer Titration mit 0,0025 molarer Gadoliniumsulfat-Maßlösung in Gegenwart von Xylenolorange als Indikator, ergibt sich ein DTPA-Beladungsgrad des Polymers von 38,2% (entsprechend 18 DTPA-Einheiten pro Molekül). Nach quantitativer Ninhydrinreaktion als auch der quantitativen Aminogruppenbestimmung mit der TNBS-Methode liegen im Mittel pro Polymermolekül 30 freie Aminofunktionen vor.

b) 48er-Kaskadenpolyamin-(DTPA-Amid)₁₈-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₃₀-Konjugat

3.0 g (0,134 mmol; entsprechend 4.03 mmol an freien Aminofunktionen) der Titelverbindung aus Beispiel 65a) werden in 150 ml entionisiertem Wasser ge löst und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 molarer Salzsäure auf 9,5 einge stellt. Anschließend wird portionsweise mit insgesamt 5.4 g (17.33 mmol) p- Isothiocyanatophenyl-α-D-mannopyranose versetzt, wobei der pH-Wert der Reaktionslösung mittels 0,1 molarer Natronlauge bei 9,5 konstant gehalten wird. Nach einer Reaktionszeit von 12 Stunden bei 22°C wird filtriert und mit destillier tem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 250 ml aufgefüllt. Dreimalige Ultrafil tration der Reaktionslösung über eine YM3-Ultrafiltrationsmembran (AMICON gefolgt von Gefriertrocknung des verbleibenden Rückstands liefert 2.45 g (87,9% d. Th.) eines amorphen und farblosen Feststoffs.
Wassergehalt: 7.48%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 44,65; H 5,18; N 8,88; S 4,62; Na 8,39;
gef.: C 44,70; H 5,23; N 8,81; S 4,57; Na 8,44;

Die Ninhydrinreaktion als auch die TNBS-Bestimmung der Titelverbindung verlaufen negativ, d. h. im Polymer liegen keine freien Aminofunktionen vor. Aus dem prozentualen Schwefelwert der Elementaranalyse der Titelverbindung er gibt sich ein Beladungsgrad des Polymers mit 61.9% α-D-Mannose (entsprechend 30 α-Mannoseresten pro Molekül). Die colorimetrische Phenol- Schwefelsäure-Bestimmung zur Ermittlung des mittleren Pyranose-Beladungs grades des Polyamins liefert als Ergebnis einen Beladungsgrad von 62.3% α- D-Mannose, d. h. es liegen 30 α-D-Mannosereste pro Molekül vor. Der so er mittelte Beladungsgrad der Titelverbindung ist identisch mit dem Beladungs grad, welcher durch die prozentualen Elementverhältnisse ermittelt wurde.

c) 48er-Kaskadenpolyamin-(Gd-DTPA-Amid)₁₈-[1-(4-Thioureidophenyl)-α- D-mannopyranosyl]₃₀-Konjugat

2.0 g (0,096 mmol; entsprechend 1,73 mmol an DTPA) der Titelverbindung aus Beispiel 64b) werden in 60 ml Natriumcitratpuffer (pH 5,3) gelöst und bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 465 mg (1,76 mmol) Gadoliniumchlorid in 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktionslösung mit 1 molarer Natronlauge auf pH 7,2 eingestellt. Nach dreimaliger Ultrafiltration über eine YM3-Ultrafiltrations membran (AMICON®) wird der verbleibende Rückstand gefriergetrocknet.
Ausbeute: 2,1 g (98,2% d. Th.) als amorphes Pulver
Wassergehalt: 4.55%

Elementaranalyse (berechnet auf wasserfreie Substanz):
ber.: C 41.65; H 4.83; N 8.28; S 4.31; Gd 12.68; Na 1.85;
gef.: C 41.72; H 4.88; N 8.24; S 4.30; Gd 12.71; Na 1.79;

Aus den molaren Elementarverhältnissen von Gadolinium zu Schwefel ergibt sich somit ein mittlerer Beladungsgrad des Polymers von 36,5% Gd-DPTA und 63,1% α-D-Mannose (entsprechend 18 Gd-DTPA-Einheiten und 30-α-D-Man noseresten pro Molekül). In der Titelverbindung sind mittels der Ninhydrinreak tion keine freien Aminofunktionen mehr nachweisbar.

Claims

1. Konjugate bestehend aus einem aminogruppen-enthaltenden Polymeren, Metallion(en) enthaltenden signalgebenden Chelatkomplex-Gruppe(n) für die diagnostische Bildgebung und Mono- oder Oligosacchariden.

2. Konjugate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie gemäß der allgemeinen Formel I aufgebaut sind
P(K)_m (L-Z)_n(I),
worin
P für ein k Aminogruppen - von denen (n + m) jeweils um ein Wasserstoffatom vermindert sind - enthaltendes Polymer, wobei (n + m) ≦ k sein soll,
n und m jeweils für die ganzen Zahlen 1 bis 149,
k für die Zahlen 12 bis 150,
K für eine Metallion(en) enthaltende signalgebende Gruppe,
L für einen Linker und
Z für ein um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid stehen.

3. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Summe (n + m) der signalgebenden Gruppen (K) und der über L gebundenen jeweils um eine Hydroxylgruppe verminderten Mono- oder Polysaccharide (Z) gleich der Anzahl k der im Polymeren enthaltenden Aminogruppen ist.

4. Konjugate gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß k für die Zahlen 12, 24, 32, 36, 40, 48, 64 oder 80 steht.

5. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß P für ein k Aminogruppen, von denen (n + m) jeweils um ein Wasserstoffatom vermindert sind, enthaltendes Dendrimer, Polylysin, Poly peptid, Polyallylamin, Poly[N-(2-aminoethyl)]methacrylamid oder Polysaccha rid steht.

6. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß sie als signalgebende Gruppe K einen Chelatkomplex beste hend aus einem Rest der allgemeinen Formel II, III, IV, V oder VI enthalten.
worin
R¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquiva lent der Elemente der Ordnungszahlen 20-32, 37-39, 42-44, 49 oder 57- 83,
R² ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten C₁-C₇-Alkyl rest, einen Phenyl- oder Benzylrest,
o in der Bedeutung der Zahlen 0 bis 10,
p und I jeweils in der Bedeutung der Ziffern 0 oder 1, mit der Maßgabe, daß p nur dann für die Ziffer 1 steht wenn I die Ziffer 1 bedeutet,
T¹ eine -NHCS- oder -CO-gruppe,
U eine -CHR³-CONR³-M¹- oder -CH₂-CH(OH)-M²- gruppe mit R³ unabhän gig voneinander in der Bedeutung von R² oder der Gruppe -CH₂-(CH₂)_o- COOH und M¹ und M² jeweils in der Bedeutung eines Phenylenrestes oder einer geradkettigen, verzweigten, gesättigten oder ungesättigten C₁-C₂₀- Alkylenkette, die gegebenenfalls substituiert ist durch 1-5 (CH₂)O-COOH, 1- 5 OR²-reste oder 1-8 Sauerstoffatome, 1-2-NH-, 1-2-C(=NH)-, 1-5-CONR³-, 1-5-NR³CO-, 1-2 Phenylen- oder 1-2 Phenylenoxygruppen enthält, bedeu ten, mit der Maßgabe, daß mindestens zwei der Reste R¹ für Metall ionenäquivalente der Elemente der oben genannten Ordnungszahlen ste hen.

7. Konjugate gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß M¹ für eine Gruppe
steht, wobei α die Verknüpfungsstelle an den Rest-CONR³ und β die Verknüp fungsstelle an T¹ angibt.

8. Konjugate gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß M² für eine Gruppe
steht, wobei α die Verknüpfungsstelle an den Rest-CH(OH)- und β die Ver knüpfungsstelle an T¹ angibt.

9. Konjugate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Mono saccharide Hexosen, Pentosen oder N-Acetyl-neuraminosäure, die jeweils in der Pyranose- oder Furanose-Form vorliegen, oder deren Derivate ent halten.

10. Konjugate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Mono saccharide Hexosen, die in der Pyranose-Form vorliegen, oder deren Deri vate enthalten.

11. Konjugate gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mono saccharide als 2-Amino-2-deoxy-, N-Acetyl-2-amino-2-deoxy-, 6-Deoxy-, 2- Deoxy-, 5-Carboxy- oder 1-Amino-1-deoxy-Derivate vorliegen.

12. Konjugate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Oligo saccharide aufgebaut aus den Monosacchariden gemäß Anspruch 9 enthal ten.

13. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß Z für ein am C-1-Atom um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid steht.

14. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß Z für ein am C-2-Atom um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid steht.

15. Konjugate der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß L für eine Gruppe T²-M³-X steht, wobei M³ für eine direkte Bindung steht oder die für M1 angegebene Bedeutung hat, T² für eine -NHCS-, -C(=NH)-, -CH₂- oder CO-gruppe steht und an P bindet, X für NH, CO, O und S steht und an Z bindet.

16. Konjugate gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß M³ für eine direkte Bindung oder für die Gruppen
steht, wobei γ die Verknüpfungsstelle an X und δ die Verknüpfungsstelle an T² angibt.

17. Konjugate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nicht durch das Zentralion substituierte acide Wasserstoffatome ganz oder teilweise durch Kationen anorganischer und/oder organischer Basen oder Amino säuren oder Aminosäureamide ersetzt sind.

18. Verfahren zur Herstellung von Konjugaten der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1,
P(K)_m (L-Z)_n(I),
worin
P für ein k Aminogruppen - von denen (n + m) jeweils um ein Wasserstoffatom vermindert sind - enthaltendes Polymer, wobei (n + m) k sein soll,
n und m jeweils für die ganzen Zahlen 1 bis 149,
k für die Zahlen 12 bis 150,
K als eine magnetische(s) Metallion(en) enthaltende signalgebende Gruppe für einen Chelatkomplex bestehend aus einem Rest der allgemeinen Formel II, III, IV, V oder VI
worin
R¹ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquiva lent der Elemente der Ordnungszahlen 20-32, 37-39, 42-44, 49 oder 57- 83,
R² ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten C₁-C₇-Alkyl rest, einen Phenyl- oder Benzylrest,
o in der Bedeutung der Zahlen 0 bis 10,
p und I jeweils in der Bedeutung der Ziffern 0 oder 1, mit der Maßgabe, daß p nur dann für die Ziffer 1 steht, wenn I die Ziffer 1 bedeutet,
T¹ eine -NHCS- oder -CO-gruppe,
U eine -CHR³-CONR³-M¹- oder -CH₂-CH(OH)-M²- gruppe mit R³ unabhängig voneinander in der Bedeutung von R² oder der Gruppe -CH₂-(CH₂)_o-COOH und M¹ und M² jeweils in der Bedeutung eines Phenylenrestes oder einer geradkettigen, verzweigten, gesättigten oder ungesättigten C₁-C₂₀-Alkylen kette, die gegebenenfalls substituiert ist durch 1-5 (CH₂)_o-COOH, 1-5 OR²- reste oder 1-8 Sauerstoffatome, 1-2-NH-, 1-2-C(=NH)-, 1-5-CONR³-, 1-5- NR³CO-, 1-2 Phenylen- oder 1-2 Phenylenoxygruppen enthält, bedeuten, mit der Maßgabe, daß mindestens zwei der Reste R¹ für Metallionenäquivalente der Elemente der oben genannten Ordnungszahlen stehen,
L für einen Linker und
Z für ein um eine Hydroxylgruppe vermindertes Mono- oder Oligosaccharid stehen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein Polymer-komplex(bildner)-Konjugat der allgemeinen Formel VII
P(K')_m(VII),
worin
K' für einen Rest der allgemeinen Formel II', III', IV', V' oder VI'
worin
R^1' unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom, eine Säureschutzgruppe oder ein Metallionenäquivalent der Elemente der Ordnungszahlen 20-29, 39, 42, 44 oder 57-83 steht und
R², V, o, p, T¹ und U die oben genannte Bedeutung haben,
mit n' Mono- oder Oligosacchariden der allgemeinen Formel VIII
L*-Z' (VIII),
worin
n' = 1-3 n,
L* für eine Gruppe T^2'-M^3'-X mit
T^2' in der Bedeutung von -NCS, -C(=NH)OCH₃, -CHO, einer -CO-Fg-gruppe wobei
Fg für -Cl, -F, -OH,
-N₃, O-CO-R⁴ mit R⁴ in der Bedeutung einer geradkettigen oder verzweigten C₁-C₇-Alkylkette,
M^3' die für M³ angegebene Bedeutung hat, wobei jedoch die in M³ gegebenen falls enthaltenen Carboxygruppen gegebenenfalls geschützt sind, und
X für NH, CO, O und S steht, oder
b) ein Polymersaccharid-Konjugat der allgemeinen Formel IX
P(L'-Z')_n(IX),
worin
L' die für L genannte Bedeutung hat, wobei jedoch die in L gegebenenfalls enthaltenen Carboxygruppen gegebenenfalls geschützt sind und
P, Z' und n die oben genannte Bedeutung haben, mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K*, wobei m' = 1-3 m ist und K* für Verbindungen der allgemeinen Formeln
worin
R^1', R², V, U und Fg die oben genannte Bedeutung haben, und
T^1' für -NCS, -CO-Fg, -C(=NH)OCH₃ oder -CHO steht oder
c) ein Polymer der allgemeinen Formel X
P-(H)_k(X),
worin
P und k die oben angegebenen Bedeutungen haben, in einer Eintopfreaktion mit n' Mono- oder Oligosacchariden der allgemeinen Formel VIII
L*-Z' (VIII),
worin
n', L* und Z' die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit m' Komplexen oder Komplexbildnern K*, wobei K* für Verbindungen der allgemeinen For meln
worin
m', R^1', R², V, T^1', U und Fg die oben genannte Bedeutung haben, umgesetzt wird, wobei die gegebenenfalls notwendige Metallioneneinfüh rung vor oder nach der gegebenenfalls notwendigen Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt, mit der Maßgabe, daß falls R^1' für Schutzgruppen steht, diese vor der Metallioneneinführung abzuspalten sind.

19. Verwendung von mindestens einem physiologisch verträglichen Konjugat gemäß Anspruch 1 für die Herstellung von diagnostischen Mitteln für die NMR-Diagnostik.

20. Verwendung von mindestens einem physiologisch verträglichen Konjugat gemäß Anspruch 1 für die Herstellung von diagnostischen Mitteln für die NMR-Lymphographie.