DE19801090A1 - Lysis-Filtrations-Assay LYFA - Google Patents

Lysis-Filtrations-Assay LYFA

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DE19801090A1
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Gerhard Haase
Uwe Bales
Norbert Schnitzler
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Zur Isolierung von Mikroorganismen aus Flüssigkeiten werden verschiedene Verfahren eingesetzt. US-Patent Nr. 4.212.948 (hergestellt von Whampole Laboratories, Cranburry, NJ, USA als Isolator® 10) zeigt beispielsweise ein System, in welchem durch eine Lyse von Blutzellen von diesen vorher aufgenommene Mikroorganismen freigesetzt werden, die dann anschließend kulturell nachgewiesen werden können. Andere Verfahren stellen mikrobielles Wachstum in Flüssigkulturen aufgrund von Stoffwechselaktivitäten automatisch über entsprechende Indikatorsysteme fest (z. B. BacT/Alert®, Organon Teknika Corporation, Eppelheim, Deutschland).
Nachteile der bisherigen Verfahren sind zum einen die fehlende Trennung der Mikroorganismen von Blutzell-Trümmern oder im Verfahren angewandten Substanzen (z. B. US-Pat Nr. 4.212.948), welche sich besonders bei einem anschließenden molekularbiologischen Nachweisverfahren wie der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) störend auswirken, bzw. zum anderen die langen Kulturzeiten und damit verbundenen langen Nachweiszeiten beim automatisierten oder konventionellen kulturellen Nachweisverfahren.
Aufgabe der Erfindung ist eine schnelle und einfache Isolierung von Mikroorganismen aus zellhaltigen Flüssigkeiten.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
Die Lyse von Zellen, welche Mikroorganismen enthalten können, ist ein äußerst sensitives Verfahren zum Nachweis dieser Mikroorganismen in zellhaltigen und flüssigen Proben (z. B. Blut). Die Art und Weise der beschriebenen Lyse ermöglicht eine anschließende Filtration dieser zellhaltigen Probeflüssigkeit, und die beschriebene Filtrationsprozedur gewährleistet eine sehr hohe Rückhaltequote der nachzuweisenden Mikroorganismen.
Fakultativ kann der Nachweis von abfiltrierten Mikroorganismen unmittelbar nach der Filtration durch mikroskopische Betrachtung des Filters ggf. nach vorheriger Anfärbung erfolgen. Dies stellt damit eine extreme zeitliche Beschleunigung des Nachweises dar, welche angesichts der lebensbedrohlichen Erkrankung von entscheidender Bedeutung für die Therapie des Patienten ist. Diese Filter können nach der Mikroskopie auch weiter für molekulargenetische bzw. kulturelle Nachweisverfahren benutzt werden.
Die beschriebene Prozedur beeinträchtigt nicht die Lebensfähigkeit und somit auch nicht die Kultivierbarkeit der nachzuweisenden Mikroorganismen. Die so isolierten und anschließend kulturell angezüchteten Mikroorganismen können dann mittels etablierter Standardverfahren identifiziert und bezüglich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika getestet werden. Der besondere Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht dabei in der nahezu vollständigen Entfernung aller bei diesen Nachweisverfahren störenden Stoffen (z. B. Blutzelldebris, welcher das Koloniewachstum maskiert; antimikrobielle Substanzen aus der Probeflüssigkeit, die das Wachstum unterdrücken). Außerdem wird dadurch die unmittelbare Verwendung der kultivierten Mikroorganismen für Identifikationsverfahren (z. B. Gaschromatographie, molekulargenetische Identifizierung mittels speziesspezifischer Gensondenhybridisierung) ermöglicht, die ansonsten nur nach einer weiteren Subkultivierung der Mikroorganismen (wegen der dadurch sich ergebenden Entfernung von störenden Begleitsubstanzen) dafür eingesetzt werden können. Dies resultiert in einer zeitlichen Beschleunigung der Diagnostik.
Alternativ zu dem konventionellen kulturellen Nachweisverfahren können die mit der beschriebenen Prozedur abfiltrierten Mikroorganismen auch direkt (d. h. ohne vorherige kulturelle Vermehrung) auf dem Filter mittels moderner molekularbiologischer Nachweisverfahren (z. B. mittels markierter Antikörper) oder entsprechender molekulargenetischer Nachweisverfahren (z. B. mittels Gensondenhybridisierung) ggf. nach vorheriger in-vitro Amplifikation (z. B. mittels PCR) sichtbar gemacht werden und auch identifiziert werden. Der besondere Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht dabei wiederum in der nahezu vollständigen Entfernung aller bei diesen Nachweisverfahren störenden Stoffen (z. B. Hämoglobin bei der PCR u. LCR [Ligase-Kettenreaktion]). Dies ist ansonsten nur durch aufwendige Prozeduren zu bewerkstelligen, die immer mit einem Verlust von Mikroorganismen einhergehen und deshalb die Nachweissensitivität herabsetzen.
Es ist bei der beschriebenen Prozedur von Vorteil, daß die Isolierung von nachzuweisenden Mikroorganismen sehr schnell, sensitiv und preiswert (u. a. durch Verwendung von Standard-Probeentnahme-Systemen) durchgeführt werden kann.
Beispielbeschreibung zur Patentanmeldung
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.
Fig. 1 Probe mit Patientenblut in einem Standard-Blutentnahme-Röhrchen. (Beispielsweise 4 ml S-Monovette KE®, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland).
Fig. 2 Vorgelöstes Reagenz zum Lysieren von Blutzellen wird mittels einer kleinen Spritze (a: Vol. ca. 1 ml) über zwei Adapter (b1: Multi-Adapter, Sarstedt; b2: Luer-Lock weibl. / Luer-Lock weibl. Adapter, Rometsch GmbH, Heilbronn, Deutschland) der Blutprobe zugefügt. Durch die beiden zwischengeschalteten Adapter erreicht man eine Zugabe des Reagenzes in einem geschlossenen System und gewährleistet damit eine kontaminationsfreie Bearbeitung der Untersuchungsprobe.
Fig. 3 Über die bereits beschriebenen Adapter (Fig. 2: b1, b2) wird die dann durch das hinzugefügte Lysereagenz lysierte Blutprobe in eine größere Spritze (c: Volumen 20 ml oder größer) überführt, in welcher sich bereits eine Elektrolyt- Lösung (d) befindet. Diese dient zur Vorverdünnung der lysierten Blutprobe und erleichtert die anschließende Filtration.
Fig. 4 Auf die beschriebene großvolumige Spritze (Fig. 3: c), welche die lysierte und vorverdünnte Blutprobe enthält, ist ein Spritzenfilterhalter (e: beispielsweise aus V4A-Stahl, 13 mm Durchmesser, Costar GmbH, Bodenheim, Deutschland) mit darin vorher steril eingesetztem Filter (beispielsweise Polycarbonat- Membran, 13 mm Durchmesser, Costar GmbH) aufgesetzt.
Fig. 5 Metallscheibe mit rasterartig angeordneten Bohrungen, welche bei der Filtration als Unterstützungsplatte unter der Filterscheibe liegt. Dadurch sammelt sich strömungsbedingt mehr abfiltriertes Material (z. B. nachzuweisende Mikrooganismen, zugesetzter inerter Farbstoff) dort auf der Filterscheibe an, wo sich die Bohrungen der Unterstützungsplatte befinden. Auf diese Weise wird auf der Filterscheibe eine dem Lochmuster der Unterstützungsplatte korrespondierende rasterartige Orientierungshilfe (Farbstoff) erzeugt, die z. B. eine mikroskopische oder fluoreszenzmikroskopische Betrachtung der Filterscheibe ggf. unter Zuhilfenahme von automatisierten Bilderkennungsvorrichtungen stark erleichtert.
Fig. 6 Filterscheibe mit rasterartig angeordnetem abfiltriertem Material aus einer lysierten Blutprobe. Diese Filterscheibe kann nun mikroskopisch betrachtet werden und/oder sie kann molekularbiologischen Nachweisverfahren zugeführt werden (z. B. in situ Hybridisierung ggf. nach vorhergehender in-vitro Amplifikation [PCR, LCR]). Weiterhin können aus der Blutprobe abfiltrierte Mikroorganismen auf dem Filter kulturell angezüchtet werden. So gewonnenes Zellmaterial der Mikroorganismen kann der gaschromatographischen oder konventionellen Spezies-Bestimmung zugeführt werden. Außerdem kann die Empfindlichkeit der angezüchteten Mikroorganismen gegenüber Antibiotika bestimmt werden.

Claims (10)

1. Vorrichtung zum Isolieren von Mikroorganismen aus zellhaltigen Flüssigkeiten, wie z. B. Blut dadurch gekennzeichnet, daß Proben der Flüssigkeit in Standard-Entnahme-Systeme (z. B. S-Monovetten® KE, Sarstedt) entnommen werden können.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen in der Flüssigkeit zunächst lysiert werden und die dadurch aus ihnen freigesetzten bzw. sich frei in der Flüssigkeit befindlichen Mikroorganismen anschließend durch Filtration isoliert werden.
3. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Reagenz zur Durchführung der Lyse ein Detergenz, z. B. 3-(3-Cholomidopropyl)-dimethylammonio-1- propansulfonat (CHAPS), eingesetzt wird.
4. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Verdünnen der lysierten Probe von Patientenmaterial vor der Filtration eine Elektrolyt-Lösung, z. B. Ringerlösung, verwendet wird.
5. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse- und Filtrationsprozedur die Vitalität und damit den kulturellen Nachweis der abzufiltrierenden Mikroorganismen nicht beeinträchtigt.
6. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mikroskopisch betrachtbare Filter, z. B. Polycarbonat- Membranen Durchmesser 13 mm, verwendet werden.
7. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß während der Filtration unter dem Filtermedium eine perforierte Unterstützungslochplatte liegt, welche auf dem Filtermedium eine rasterartige Orientierungshilfe erzeugt.
8. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Filtration eine Anfärbung der abfiltrierten Mikroorganismen erfolgt, beispielsweise zum erleichterten Auffinden der Mikroorganismen bei mikroskopischer Betrachtung des Filters unter Auflicht-Fluoreszenz.
9. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die abfiltrierten Mikroorganismen auf dem Filter mikroskopisch, molekularbiologisch, und/oder kulturell nachgewiesen bzw. identifiziert werden können.
10. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtrationsdruck manuell, mit mechanischen Hilfsmitteln, mittels Zentrifugation, mittels Unter-/Überdruck oder osmotisch erzeugt wird und somit die Filtration der lysierten zellhaltigen Probeflüssigkeit ermöglicht.
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