DE2247832A1

DE2247832A1 - Alkalische cellulase und verfahren zu ihrer erzeugung

Info

Publication number: DE2247832A1
Application number: DE19722247832
Authority: DE
Inventors: Koki Horikoshi; Yonosuke Ikeda; Masami Nakao
Original assignee: RIKEN
Current assignee: RIKEN
Priority date: 1971-09-30
Filing date: 1972-09-29
Publication date: 1973-04-05
Also published as: JPS5028515B2; JPS4840992A; DE2247832C3; DE2247832B2; US3844890A

Description

18.629 '

RIKAGAKU KEWKYUSHO Hirosawa, Wako-shi (Saitama-ken, Japan)

Alkalische Oellulase und Verfahren zu ihrer Erzeugung

Die Erfindung betrifft eine neue alkalische Cellulase und ein vorteilhaftes Verfahren zu ihrer Erzeugung durch Züchtung eines neuartigen, alkalische Cellulase erzeugenden Mikroorganismus in einem alkalischen iiährmedium, das ein Garbonat enthält.

Das Vorhandensein von Cellulasen ist bisher in bestimmten Arten von Pilzen, Bakterien, Mollusken und höheren Tieren nachgewiesen worden. Von Tieren und Pilzen stammende Cellulasen haben eine optimale Aktivität bei pH-Werten von 5,0-6,0. Von Bakterien der Gattung Pseudomonas oder dergleichen stammende Cellulasen haben eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 7,0. Hinsichtlich der Hitzebeständigkeit derartiger Cellulasen ist bekannt, daß ihre Aktivität bei einer Temperatur von 60-70 nach zehn Minuten verlorengeht. Es ist ferner bekannt, daß ihre Aktivität durch Schwermetalle allgemein gehemmt wird.

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun in der Schaffung einer neuen alkalischen Cellulase, die eine optimale Aktivität in einem pH-Bereich von 5,0-10,0 besitzt, die auch noch eine Aktivität besitzt, nachdem

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sie 10 Minuten lang auf 70° C erhitzt worden ist, und deren Aktivität durch Schwermetalle nicht behindert wird.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst, in dem eine neue alkalische Cellulase erzeugende Bakterien der Gattung Bacillus in einem geeigneten Medium gezüchtet und die erzeugte neue alkalische Cellulase aus der Nährbouillon gewonnen wird.

Die neue alkalische Cellulase gemäß der Erfindung hat bei einer Temperatur von 40° C eine optimale Aktivität in einem pH-Bereich von etwa 5-10 und kann dadurch erzeugt werden, daß ein alkalisches Nährmedium, das ein Cfirbonat enthält, mit Hilfe eines Mikroorganismus vom Stamm Bacillus N₁ oder Stamm Bacillus H. ver-

Ί 4

goren wird.

Der Erfindungsgegenstand wird nachstehend anhand der beigefügten Zeichnungen erläutert. In diesen zeigen

Fig. 1 und 2 elektronenmikroskopische Photograph! en von im Rahmen der Verwendung zu verwendenden Mikroorganismen vom Stamm Bacillus H₁ bzw. vom Stamm

Bacillus N-.
4

Pig. 3 stellt in einem Eurvenbild die Aktivitäten der gemäß der Erfindung erzeugten, alkalischen Cellulasen dar,

Fig. 4 in einem Kurvenbild die Aktivitäten von bekannten Cellulasen,

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Fig. 5 in einem KurvenMld die" Aktivitäten der erfindungsgemäßen alkalischen Cellulasen nach einer 10 Minuten langen Behandlung bei 70° C,

i^!ig. 6 in einem Kurvenbilä die Beständigkeit der Aktivität der alkalischen Cellulase gemäß der Erfindung bei verschiedenen pH-Werten,

Pig. 7 in einem Kurvenbild die Temperaturabhängigkeit der Aktivität der alkalischen Cellulase gemäß der Erfindung und

Fig» _8._in' einem Kurvenbild die Temperaturbeständigkeit der alkalischen Cellulasen gemäß der Erfindung. . „

Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind neue Arten, die zu der Gattung Bacillus gehören, in dem nachstehend beschriebenen Uährmedium gut wachsen und eine alkalische Cellulase erzeugen. Diese Arten wurden erstmals in den Böden von Hirosawa, Wako-shi (Präfektur Saitama, Japan) entdeckt und aus ihnen isoliert und von der Anmelderin als Stämme Bacillus iL und Bacillus ίΓ. bezeichnet.

Die genannten Mikroorganismen der Stämme ^ und Bacillus Ή. w
beschriebenen Weise isoliert.

Bacillus N^ und Bacillus Ή. wurden in der nachstehend

Der Boden wurde in steriliertem Wasser suspendiert und in einer Schale in dem nachstehend angegebenen Uährmedium gezüchtet:

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(Zusammensetzung des lit.hrMieäiuniB

a) Lösliche Stärke E₂HPO₄ Hefeextrakt Pepton MgSO .7H.0

4 *- Agar-Agar

Wasser

b) Ka₂CO, Wasser'

20	g
1	ε
5	g
10	e
0,	2g
20	g
900	ml
10	g
100	ml

a) und b) wurden 15 Minuten lang bei 115 C sterilisiert und dann vermischt.

Die Schale wurde 24-48 Stunden lang bei 37 C

bebrütet.

Danach wurde von den auf der Schale vorhandenen Kolonien eine Kolonie eines Mikroorganismus isoliert, welcher die genannte alkalische Cellulase erzeugte.

Dieser Mikroorganismus wurde als "Bacillus K₁" bezeichnet. Der genannte Bacillus Έ. wurde nach demselben Verfahren isoliert.

Die als Bacillus N₁ und Bacillus N. bezeich-

1 4

neten Stämme wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter den ATCC-Zugüngsnununern 21832 und 21833 deponiert. Diese Depots bei der ATCC unterliegen keiner Beschrankung, so daß die Kulturen für die Öffentlichkeit ohne weiteres zugänglich sind. Beide genannten Stämme wurden am 13. September 1970 für die Abgabe an die Öffentlichkeit freigegeben. Die Erfinder haben entdeckt, daß die Mikroorganismen Bacillus N₁ und Bacillus EL

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unter den nachstehend angegebenen Züchtungsbedingungen eine neue alkalische Cellulase erzeugen und anreichern, und haben ein Verfahren für die Erzeugung der alkalischen Oellulase gemäß der Erfindung geschaffen.

Die Eigenschaften des Bacillus K* und des Bacillus IT. sind nachstehend angegeben. Die mikrobiologischen Eigenschaften wurden nach den .Verfahren festgestellt, die in "Aerobic Spore-forming Bacteria" von Ii at hau R. Smith, R.E. Gordon und I¹. E. Clerk (United States Department of Agriculture, November 1952) und in "Berge.y ^rs Iianual of Determinative Bacteriology" (1957) beschrieben sind.

ooweit nichts anderes ausdrücklich, angegeben ist, wurden Medien mit den nachstehend angegebenen Zusammensetzungen verv/endet, wobei jedes Liedium durch den Zusatz von 1 ,0$ wasserfreiem Kaliumcarbonat auf einen pE-Wert von etv.a 10 eingestellt wurde. (Jeder Viert in der Tabelle gibt das Gewicht in g in 1 1 Wasser an) .

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BAD ORIGINAL

Art des Nährme diums

Bestandteile

Na- Pep- Fleisch- Hefe- Trau- Star- Sonstige

trium- ton extrakt ex- ben- ke

carbo- . trakt zuk-

nat ker

C D E P G H I J K L M 1Ϊ 0 P

10

10 od. n.z.

ti

Il

ti

10

10 10

10

10 od. n.z.

10 10

10

5 5

5 5 5 5 5 5

5 7 5 5

10

20

	Agar- Agar : 15
	NaCl:70
10
10	Agar- Agar:^ Gelatine;5

20	D
	NaGl15
	IHO₃Ii
20	D
	3)
	I₂HPO₄IS
	4)
	.5)
	D

3098U/111Ö

A Selektives Medium

B Bouillon

G Bouillon mit Agar-Agar

Ί) KaCl-Bouillon

E Traubenzucker-Bouillon

P Traubenzucker-Bouillon· mit Agar-Agar

G- ' Gelatine-Medium

H Peptonwasser

I Kartoffelmedium

J Medium zur Bestimmung der Wachstumsbedingungen

K Medium für den Voges-Proskauer-Test

L Medium für den ITitratreduktions-Test

M Medium für den Stärkehydrolyse-Test

]Y Medium für den Citronensäureverwertungs-Test

0 Medium für den anaeroben Wachstums-Test

P Medium für den ^uckerverwertungs-Test

Q Medium^ für den Kaseinzersetzungs-Test

R Medium für den Katalasereaktions-Test

¹⁾ K₂HPO₄:1

Agar-Agar:15 MgSO₄.7H₂O: 0,2

²' Handelsüblicher Kartoffeiextrakt (Difco): Agar-Agar: 15

⁵^ HaCIxI

MgSO₄.7H₂Ot 0,2 (

KH₂PO₄: 0,5 Uatriumcitrat: Agar-Agar: 15

KCl: 0,2 MgSO₄: 0,2 Hefeextrakt: 0,2 Zuckerarten: 5

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KaBein: 5

K₀HPO.ί 1 2 4

Agar-Agarί 15 MgSO

0,2

nicht zugesetzt

Die Stämme N₁ und N. wurden während ihres 1 4

Wachstums auf dem vorerwähnten selektiven Medium morphologisch beobachtet.

1. Mikrobiologische Eigenschaften des Stammes K^

a) Morphologiet

Der Mikroorganismus hat eine Größe von 0,5-0,8 pm mal 1,5-2,0 pm. Die Spore ist oval und hat* eine Größe von 0,8-1,2 pm mal 1,8-2,2 pm. Das Sporangium ist gequollen. Wie aus der elektronenmikroskopischen Photographie in ^£ ig. 1 erkennbar ist» hat der Mikroorganismen peritrichöse Geissein, die eine Motilität besitzen.

b) Wachstumeeigenschaften auf verschiedenen Midien:

Medium	Bouillon	Wachstumszustand	beim pH-Wert 10
	Bouillon mit Agar-Agar	beim pH-V/ert 7	gutes Wachstum
D	Traubenzucker- Bouillon	kein Wachstum	gutes Wachstum
II)	Traubenzucker- Bouillon mit Agar-Agar	kein Wachstum	sehr gut.Wachstum
III)	Gelatine-Medium	kein Wachstum	sehr gut.Wachstum
IV)	Peptonwasser	kein Wachstum	gutes Wachstum
V)	Kartoffelmedium 30981	kein Wachstum	V/a ehe turn
VI)	kein iVachstum	gutes Wachstum
VII)	kein Wachstum A/1119

Das Wachstum des Stammes wurde auf einem Medium beobachtet, das 0,5 $> Pepton, 0,5 i° Hefeextrakt, 1,0 <ft Traubenzucker, 0,01 ?fi K₂HPO., 0,002 $ MgSO., 1,0 fo Na₂CO₅ und 1,5 Io Agar-Agar (pH-Wert = 10,0) enthielt. Von diesen Bestandteilen war das Na₂OO, zugesetzt worden, nachdem es getrennt sterilisiert worden war.

I) Schalenkultur:

Die Kolonie ist kreisförmig'und hat eine ebene Oberfläche. Der Rand der Kolonie ist wellig oder ohrmuschelförmig. Die Kolonie hat eine gelblichbraune, glänzende Oberfläche.

II) Schrägrohrkultur (slant culture):

Sich ausbreitende Kultur mit glänzender Oberfläche.

III) Einstichkultur (stab culture)

Ein Wachstum wird nur an der Oberfläche, nicht in der liefe beobachtet,
c) Biologische Eigenschaften:

I) Optimale Wachstumsbedingungen:

pH-Wert 9,0-10,0 Temperatur 30-42° C aerob

II) Wachstumsbedingungen:

pH-Wert 8,0-11,0 Temperatur kein v/achstum bei 4.5 C

(alkalisches Medium) aerob

III) Gram-Färbungs-Test: Positiv (in dem vorgenannten selektiven Medium)

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IV) Voges-Proskauer-Beaktiorii Positiv

V) Nitratreduktion: Positiv

VI) Katalasereaktiont Positiv

VII) Gelatineverflüssigungi'Sehr schwach

VIII) Stärkehydrolyse: Positiv

IX) Gitronexisaures Agar-Agar-Medium (alkalisch): Sehr schlechtes Wachstum

X) Unter anaeroben Bedingungen: Kein Wachstum

XI) Bouillon mit 7 i» Kochsalz» Gutes WaohetiUL unter alkalischen Bedingungen (Bildung von Niederschlägen) aber kein Wachstum im neutralen Medium

XII) Bildung von Sporen auf Bouillon mit Agar-Agar* Es bilden sich kaum Sporen und «achsen höchstens sehr langsam.

XIII) Zersetzung von Kaseins Sehr schwach d) Verwertung von Kohlenatoffquellent

Der Stamm IL wächst nicht im neutralen Medium. Im alkalischen Medium wächst er, aber die Erzeugung von Säure kann nicht bestimmt werden, weil das Medium 1 Jt Carbonat enthält. Im alkalischen Medium kann der Stamm Galaktose, Raffinose, Sorbit oder Glycerin nicht verwerten. - .

2) Mikrobiologische Eigenschaften des Stammes V.

a) Morphologie»

Der Mikroorganismus hat eine Größe von 0,1-0,2 pm mal 4,0-6,0 μια. Sie Spore ist kreisförmig und hat eine Größe von 1,5-2,0 um mal 1,5-2,0 um. Die _t Sporozyste ist gequollen. Wie aus der elektronenmikroskopischen Photographic in ^ig. 2 hervorgeht, hat der I wachsende Mikroorganismus perltrichöse Geißeln mit |

Motilität, ■*'

301814/1111 ;

b) Wachstumseigenschaften auf verschiedenen Medien:

Medium	Βομχΐΐοη	Wachstumszustand	pH-Wert 7	beim	pH-Wert 10
	Bouillon mit Agar-Agar	beim	Wachstum	kein	Wachstum
I)	Traub enzucker- bouillon	kein	Wachstum	kein	Wachstum
II)	Traubenzucker- Bouillon mit Agar-Agar	kein	Wachstum	sehr	gutes Wachstum
III)	G-elatine-Medium	kein	Wachstum	sehr	gutes Wachstum
IV)	Peptonwasser	kein	Wachstum	kein	Wachstum
V)	Kartoffelmedium	kein	Wachstum	kein	Wachstum
VI)	kein	Wachstum	gutes	Wachstum
VII)	kein

Das Wachstum des Stammes wurde auf einem Medium beobachtet, das 0,5 # Pepton, 0,5 # Hefeextrakt, 1,0 % Traubenzucker, 0,01 ^ K₂HPO., 0,002 % MgSO., 1,0 fo Ha₂OO₅ und 1,5 # Agar-Agar (pH-Wert = 10,0) enthielt.. Von diesen Bestandteilen war das Na₂CO, zugesetzt worden, nachdem es getrennt sterilisiert worden war.

Die Kolonie hat eine unregelmäßige Form und eine ebene Oberfläche. Der Rand der Kolonie ist wellig oder ohrmuschelförmig. Die Kolonie hat eine gräulichweiße, glänzende Oberfläche.

II) Schrägrohrkultur (slant culture):

Sich ausbreitende Kultur mit glänzender Oberfläche.

III) Einstichkultur (stab culture)

.' Ein Wachstum wird nur an der Oberfläche, nicht in der Tiefe beobachtet.

309814/1119

c) Biologische Mgenschaften:

I) Optimale Wachstumsbedingungen: pH-Wert 9,0-10,0

Tempej
aerob

Temperatur 30-42° C

II) ϊΐ/achstumsbedingungen:

pH-,7ert 8,0-11,0 aerob

III) Grram-i'ärbun£f3-Test: Positiv (in dem vorgenannten selektiven Ledium)

IV) Voges-Proskauer-Reaktion: Positiv

V) Nitratreduktion: Positiv

VI) Katalasereaktion: Positiv

VII) GelatineverflüsBigung: Sehr schwach

VIII) Stärkehydrolyse: Positiv

IX) Citronensaures Agar-Agar-Lied ium (alkalisch): Sehr schlechtes Wachstum

X) Unter anaeroben Bedingungen: Kein Wachstum

XI) Bouillon mit 7 i° Kochsalz: Gutes Wachstum unter alkalischen Bedingungen (Trübung) aber kein Wachstum im neutralen Medium

XII) Bildung von Sporen auf Bouillon mit Agar-Agar: Es bilden sich kaum Sporen.

XIII) Zersetzung von Kasein: sehr schwach, d) Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Der Stamm N. wächst nicht im neutralen I.ledium.

Im alkalischen Kedium wachst er, aber die Erzeugung von Säure kann nicht bestimmt werden, weil das Medium 1 > Carbonat enthält. Im alkalischen i./odium kann der Stumm Inositol, ooibit oder Glycerin nicht verwerten.

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Diese mikrobiologischen Eigenschaften der Stämme W₁ und Ii. sind in der nachstehenden tabelle z s&n.-engef aßt, aus der deutlich hervorgeht, daß diese Stämme verschiedene mikrobiologische Eigenschaften haben \xv.d zu verschiedenen Arten gehören.

Eigen- Stamm K₁
schaft

Stamm

I - 0,5-0,8 μπι mal -1,5-2,0 μια

II 0,8-1,2 pm mal 1,8-2,2 pm

III kreisförmig, ebenflächig, gelblichbraun, glänzend

IV ausgedehnte, stoffartige Form, glänzend

V ^T/7achstum

YI hydrolysierend

VII sehr schwach

VIII sehr schwach

IX Bildung von Niederschlägen

X keine Verwertung von Galaktose, Raffinose, Sorbit oder Glycerin 0,1-0,2 pm mal 4,0-6,0 pm 1,5-2,0-pm mal 1,5-2,0 pm lichtundurchlässig, ebenflächig, gräulichweiß, glänz eriu

ausgedehnte, stoffartige !Form, glänzend kein Wachstum hydrolysierend sehr schwach sehr schwach Trübung

keine Verwertung von Inositol, Sorbit oder Glycerin

Dabei ist

Ii Grö3e des Bakteriums
II: GröiBe der Spore-III: Beschreibung der Schalenkultur. IV: Beschreibung der Schrägrohrkultur V: '.Vachstum auf Bouillon mit

*■ -

VI: Stürkehydrolyse VII: Gelatineverflüssigung VIII: Kaseinhydrolyse

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-H-

IX: Zustand beim Wachstum auf Bouillon mit 7 f> Kochsalz

X: "bei der obersten Temperatur, bei der ein Wachstum beobachtet werden kann.

Aufgrund dieser Eigenschaften wurden die

Stämme N. und N. nach den Klassifikationsmethoden unter-1 4

sucht, die in den vorgenannten Veröffentlichungen angegeben sind. Dies sind: N.R. Smith u.a., "Aerobic Sporeforming Bacteria" und "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1957)", S. 61Y ff. Dabei wurde festgestellt, daß jeder Stamm in manchen Punkten bekannten Bakterien der Gattung Bacillus ähnlich ist, daß sich aber jeder der Stämme N₁ und N. in charakteristischen Eigenschaften von diesen bekannten Bakterien unterscheidet. Da unter den bekannten Bakterien kein Stamm gefunden werden konnte, der dieselben mikrobiologischen Eigenschaften besitzt wie der Stamm N₁ oder Ή_Λ , kann man

l 4

diese Stämme als neue Arten der Gattung Bacillus bezeichnen.

Da jeder der Stämme N₁ und N. ein aerobes sporenbildendes Bakterium darstellt, gehören beide Stämme zu der Gattung Bacillus. Für die Stämme N* und N. ist es charakteristisch, daß sie nur in einem alkalischen, aber nicht in einem neutralen Medium wachsen.

Zur Bestimmung der Stämme N₁ und N. wurden bekannte Stämme untersucht. Dabei hat es sich gezeigt, daß der Stamm N₁ dem Bacillus polymyxa und dem Bacillua alvei ähnelt und daß der Stamm N. dem Bacillus pasteurii ähnelt. Jedoch wuchst der Stamm N, in einem 7 ß> Kochsalz enthaltenden Medium, während der Bacillus polymyxa und der Bacillus alvei in einem 5 /° Kochsalz enthaltenden Medium nicht wachsen. Der Stamm N. hydrolysiert Stärke

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und hat eine positive Voges-Froskauer-Reaktion. Dagegen kann der Bacillus pasteurii Stärke nicht hydrolysieren und hat er eine negative Voges-Proskauer-Reaktion. Ein charakteristischerer Unterschied besttht zwischen den ein Wachstum ermöglichenden pB-.Verten." Im allgemeinen wachsen Bakterien der Gattung Bacillus bei pH-i/erten von etwa 5>O~8,O. Der Bacillus polymyxa wächst bei pH-Werten von 4>8-7j2, der Bacillus alvel bei pH-«Verten von 4,8-5,6 und der Bacillus pasteurii bei pH-V/erten bis zu 8,6 unter anaeroben Bedingungen. Dagegen wachsen die Stämme N-. und N. bei pH-Werten von etwa 8,0 bis 11,0. Man erkennt somit, daß die Stämme EL und Έ. von den vorerwähnten, bekannten, ähnlichen Arten gut unterschieden werden können.

file vorstehend beschrieben wurd, ist keine Art bekannt, die mit dem Stamm N^ oder dem Stamm N- · identisch ist. Angesichts von charakteristischen mikrobiologischen Eigenschaften kann man annehmen, daß es sich um neue Arten handelt.

Die Stämme N₁ und N. wurden daher als Stämme bzw. N. der -Gattung Bacillus bezeichnet.

Jeder der Stämme N.. und N- kann in einer Nährbouillon eine alkalische Oellulase erzeugen und in hoher Konzentration anreichern. Beim Züchten dieser Stamme verwendet man als Kohlenstoffquellen vorzugsweise verschiedene Zuckersubstanzen, beispielsweise Traubenzucker, Saccharose, CMC, Kleie, Cellulosepulver usw. und als Stickstoffquellen Pepton, Fleischextrakt, Ifiaisquellwasser, entfetete Sojabohnen usw. Kan kann auch anorganische Substanzen verwenden, beispielsweise , Phosphate und Kitrate.

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'■' ·■ - 16 -

Bessere Ergebnisse erzielt .maß bei MitVerwendung von winzigen Li eng en von .anorganischem ^etallsalzen, Vitaminen, wachstumsfordernden Faktoren» wie Hefeextrakt usw. Um den pH-fert einer Hährbouillon etwa bei 10 zu halten, setzt aian zweckmäßig 0,5-1 »5 ;'*> wasserfreies natriumcarbonat zu. ^:

Vorzugsweise erfolgt die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 20-40 C unter Schütteln oder -Bewegung durch durchperl ende Luft. Die Urzeugung der'gewünschten alkalischen Cellulase erreicht wehrend etwa 2-6 Tagen ihr "laximum. Man kann eine RoheneyaflÜeeigkeit gewinnen, indem man die Eährbouillon zentrifugiert, mit Hilfe eines Filterhilfsßtoffs filtiiert oder Filzkörper und ein Salz, wie Calciumacetat, einer kicch-■fällung unterwirft.

Lian kann diese Eohenzymflüsßigkeit als solche Verwender, oder ein gereinigtes Enzym gewinnen, indem die Itohenfcymflüssigkeit einem bekannten Isolierverfahren unterworfen wird, z.E. einem -Mis.salzen nit Amiaoniumsulfat, .einen .Ausfüllen in einem Lösungsmittel oder einer Dialyse, wobei festes Rohensym gewonnen wird, das danach gereinigt und kristallisiert wird.

Die beiden aus der Sährbouillon des St antue β K- und des Staianes N. gewonnenen alkalischen Cellulace-Kormalsubstanzen haben gemäß i'ig. 3 eine cptimalt Aktivität' in pH-£ereieh von etwa 8-10. Diese aktivität iet für diese alkalische Cellulase charakteristisch, weil bekannte von Llikroorganismen (Asp. niger» Tricliodtisa rp._f Penicillium sp. und Pseudosonas ε;.) staaüüenaic ivikrooxganisßien eine optiaal« .Aktivität ie plinEereieii toft . etvm 4-7 haben, wie aus der Fig. 4

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Die """ktiVitLt der erfindungsgemäß erzeugten alkalischen Cellulasenormalsubstanz wird wie folgt bestimmt:

Verfahren zur Aktivitätsbestiminung und Aktivitätseinheit

0,5 ml einer Enzymflüssigkeit werden zu 1 ml GLiG (2,0 fo) und 1 ml einer Glycin- NaGI-NaOH- Pufferlösung (pH-Wert 9,0) zugesetzt. Die Reaktion wird 20 Minuten lang bei 40 C durchgeführt.

lach der Durchführung der Heaktion wird mit Hilfe der 3,5-Dinitrosalicylsäure (-DHS) der reduzierte Zucker bestimmt. Dazu wird 1 ml des DNS-ßeagens zu 0,25 ml der Eeaktionsflüssigkeit zugesetzt und das Gemisch zur Färbung 5 Minuten lang auf 100 G erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die flüssigkeit mit 4 ml destilliertem Wasser verdünnt. Danach wird das Absorptionsvermögen bei 500 mn bestimmt.

Die Aktivitätseinheit des Enzyms wird wie folgt bestimmt: iienn unter den vorgenannten Bedingungen reduzierter Zucker in einer 1 mg Traubenzucker entsprechenden Menge gebildet wird, beträgt die -Aktivität 100 Einheiten.

Die alkalische Gellulase gemäß der Erfindung hat eine relative Aktivität von 200-1000 Einheiten pro g, und es kann nachgewiesen werden, daß sie ein neues Enzym mit neuartigen physikalischen und chemischen Eigenschaften ist, die nachstehend angegeben sind.

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Physikalische und chemische Eigenschaften dea Enzyms (1) Funktion und ^ubstrateigenschaften:

Die durch Züchtung des Stammes K^ und dea Stammes N. erzeugten, alkalischen Cellulasen haben eine spezifische zersetzende Wirkung auf folgende Cellulosen.

Zur Erzeugung der alkalischen Cellulase verwendeter Mikroorganismus

Stamm IL Stamm II.

Zersetzte CMC CMC

Substanzen Cellulose Cellulose

(2) Optimaler pH-Bereichs

Mit Hilfe der Mcllvaineschen Pufferlösung und der Glycin-Pufferlösung wurden pH-Werte in den Bereichen von 3-8 bzw. 8-11 eingestellt.

Die optimalen pH-Werte jeder aus N&hrbouillone des Stammes IL und des Stammes N. erzeugten, alkalischen Cellulase 7</urden für das Rohenzym (f'ig. 3) und noch einer 10 Iiiinuten dauernden Erhitzung auf 7C° C (Pig. 5) bestimmt.

Optimaler pH-.ifert

Mkroorganismus

Stamm N₁ Stamm'

Hohenzy« G-9 6

Each 10 ein. bei 7O⁰C - 10,0

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Y/ie aus der vorstehenden Tabelle hervorgeht, haben die von dem Stamm IT^ und dem Stamm U, erzeugten, alkalischen Cellulasen eine Aktivität in dem pH-Bereich von etwa 7-10 bzw. etwa 5-10.

(3) pH-Beständigkeit ' . " .

Die aus Uährbouillons des Stammes N. und des

Stammes Ii-. gewonnenen, alkalischen Cellulasen wurden ■

ο durch 10 Minuten langes Erhitzen auf 60 inaktiviert. Danach wurde die,Restaktivität bestimmt. Aus der nächst^henden Tabelle und der Pig. 6 geht hervor, in welchen pH-Bereichen diese Cellulasen beständig sind.

Mikroorganismus

Stamm IiL Stamm IJ,

pH-Bereich ; 6,5-11,0 5,5-11,0

Aus -der Jig. 6 geht hervor, in welchen pH-Bereichen die Restaktivität höher ist als 50 >o, wenn man mit 10Q. fo die Maximalaktivität der jeweiligen alkalischen Cellulase bezeichnet, die aus einer Hährbouil-lon des Stammes IL· oder 35, gewonnen wurde.

Aus der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß sich die von dem Stamm ±L· und dem Stamm 1\F. stammenden, alkalischen Cellulasen dadurch kennzeichnen, daß sie in einem großen pH-Bereich beständig sind.

(4) Inaktivierungsbedingungen (Temperaturbeständigkeit)

■Für alkalische Cellulasen, die aus Nährbouillons des Stammes Ή* und des Stammes ΪΓ, gewonnen worden waren, wurden durch Veränderung der Temperatur bei dem

pH-Wert 9»0 die Inaktivierungsbedingungen bestimmt. Die Ergebnisse dieses Versuchs gehen aus der Fig¹· 7 hervor. Die Inaktivierung begann bei folgender Temperatur.

Mikroorganismus

Stamm IL· Stamm ih Temperaturbestl-ndig bis 50° C 60° C

(5) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Für die von dem Stamm U₁ und dem Stamm IL erzeugten, alkalischen Cellulasen wurden die Hemoenden oder aktivierenden Einflüsse von Ketallionen und erhöhten Temperaturen bestimmt. Die Ergebnisse■dieser Versuche sind nachstehend angegeben. Jedes Metallion wurde

in einer Konzentration vom 10 HL verwendet.

Fig. 8 zeigt in einem Kurvenbild die Temperaturbeständigkeit , ausgedrückt durch die bei eiiiemi pH-Wert von 9»0 gemessene Restaktivität, die nach einer 10 Minuten dauernden Inaktivierung bei der angegebenen Temperatur vorhanden war. Dabei ist in dem Kuryenbild der Bereich angegeben, in dem die Eestaktirit&t höher ist als 50 yo, wenn als 100 $ die Maximal aktivität der jeweiligen alkalischen Cellulase bezeichnet wird·

Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, wurde beim Zusatz von Ithylendiamintetraacetat (IDTA) oder von p-Chloromercuribenzoesäure (PCMB) zu den alkalischen Cellulasen keinerlei Hemmung festgestellt.

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Mikroorganismus

	Stamm	V	Stamm	Mn⁺⁺
Hemmende Metallionen	0d⁺⁺, Pb⁺⁺,	Hg⁺, Cu⁺⁺	Pb⁺⁺
Aktivierende Metallionen	Ka⁺, Mn⁺⁺,	K⁺, Ga⁺⁺, Fe⁺⁺	0a⁺⁺,	beobachtet
Temperaturbeständig- bis	70°	G	70° C	beobachtet
Hemmung durch SDTA	nicht	beobachtet	nicht
Hemmung durch PCMB	nicht	beobachtet	nicht

(6) Molekulargewicht:

Aufgrund der Bestimmung durch das' GeIfiltrationsverfahren unter Verwendung von "Sephadex G-100" nimmt man an, daß die von dem Stamm IL und dem Stamm "N. erzeugten, alkalischen Cellulasen folgende Molekulargewichte haben: - .

Verwendeter Stamm

Molekulargewicht

etwa 3.10

etwa 3.10* und etwa 1 ,5."1O*

(7) Verfahren zur Reinigung des Enzyms:

Nachstehend wird die Reinigung beispielsweise des von dem Stamm N. erzeugten Enzyms erläutert.

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Von der Nährbouillon des Stammes N. werden

die Bakterienzellen abzentrifugiert. Danach wird die Bouillon auf DEAE-Sephadex (erzeugt von der Firma IJhamacia in Schweden) adsorbiert, das mit einer Pufferlösung von 0,1 M Na₂CCu, die mit Essigsäure auf den pH-Wert 9»0 eingestellt worden war, dem pH-iVert der Lösung genügend angeglichen worden ?;ar. Hach genügendem ,Väschen der vorstehenden Pufferlösung wurde mit dieser der 0,5 M ITaGl zugesetzt worden war, eluiert. Das Eluat wurde einer Gelfiltration mit Sephadex G-100 (erzeugt von der Firma Pharmacia, Schweden) unterworfen, dessen pH-./ert mit Hilfe einer -Pufferlösung (pH-./ert 3) vor. 0,1 L tris-HCl genügend angeglichen worden, war.

Man erhalt auf diese Weise eine Snd-IToruialsubstanz.

(8) Elementaranalyse:

Aufgrund der mit üephadex G-100 durchgeführten Gelfiltration wird angenommen, daß die von dem Stamm N₁ und dem Stamm N. erzeugten, alkalischen Cellulasen ein Molekulargewicht von etwa 3·10 haben. Bei Enzymen mit hohen Molekulargewichten kann man durch Elementaranalyse und Berechnung der Analye-enwerte. für Kohlenstoff, Stickstoff, ,Vasserstoff' und Sauerstoff keine charakteristischen Eigenschaften bestimmen. Aus diesem Grunde wurden diese alkalischen Cellulasen keiner Elementaranalyse unterworfen.

Zusammenfassend ergibt der Vergleich der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Enzyms bzw. der alkalischen Cellulase gemäß der Erfindung mit denen der bekannten Cellulasen deutlich, daß es sich um eine neue, von allen bekannten Cellulasen verschiedene alkalische Cellulase handelt.

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Wirksamkeit im Gebraucht

Das Enzym bzw. die alkalische Cellülase ge-. maß der Erfindung ist ein cellulosezersetzendes Enzym, das eine optimale Aktivität in.einem pH-Bereich auf der alkalischen Seite besitzt und bei Verwendung zur Abwasserreinigung eine enzymatisch^ Wirksamkeit zeigt.

Die enzymatisch^ Wirksamkeit des Enzyms bzw. der alkalischen- Cellulase gemäß der Erfindung wird nachstehend anhand von Versuchsergebnissen erläutert.

1) Verwendungί

Bei Verwendung zur Abwasserreinigung kann das Enzym gemäß der Erfindung in Pulverform direkt dem Abwasser zugesetzt werden. Dabei ist keine Begrenzung, z.B. hinsichtlich des pH-Wertes des Abwassers, zu beachten.

2) Enzymatische Wirksamkeit in Detergentien*

Das erfindungsgemäße Enzym wurde im Abwasser während einer bestimmten Zeit auf 40° C gehalten und die Zersetzung der Cellulose gemessen.

Versuchsverfahren?

1 g mit Alkali behandelter Cellulose (Avicel SP) und 100 ml des Enzyms mit 300Q Einheiten pro 100 ml wurden während eines Zeitraums von 24 Stunden bei 37° C unter Rühren umgesetzt.

Außerdem wurde der pH-Wert des verwendeten Enzyms während der Reaktionszeit mit Hilfe einer Glycin-NaCl-IlaüIi-Pufferlö&ung auf 10,0 eingestellt.

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l'ach durchgeführter Reaktion wurde unlösliche Cellulose abgetrennt und das Trockengewicht der unlöslichen Stoffe bestimmt.

Ergebnisse:

Aktivität des erfindungsgemäßen

I.Iikro- Trockengewicht des Zersetzter Organismus unlöslichen Substrats Anteil

(g) io

Bacillus N₁ 0,83 17

Bacillus N₄ 0,72 28

Nachstehend wird der Erf indungsgegenetand ■■ anhand von Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Ein Nährmedium (pH-Wert etwa 10) mit 1 ,0 ',& Pepton, 1,0 $> Fleischextrakt, 1,0 f» CIiC, 0,5 i» Natriumchlorid, 0,1 φ KHpPu₄.und· 0,1 io (getrennt stabilisiertes) wasserfreies Natriumcarbonat enthielt, wurde mit dem^tamm Bacillus U₁ (ATCC 21832) geimpft und 72 Stunden lang in einer Schüttelkultur bei 37 C gezüchtet. Durch Abzentrifugieren der Zellen erhielt man eine Rohenzymflüssigkeit. Liese wurde danri mit Äthanol getrocknet und mit Hilfe eines üblichen Verfahrens pulverisiert. Eine alkalische Cellulase-Hormaleubstanz mit einer relativen Aktivität von 330 Einheiten pro g wurde in einer l.ienge von 16 g pro 1 der Ilährbouillon erhalten.

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Jeispiel 2

Ein ITährxedium mit derselben Zusarmnensetzung wie aas im Beispiel 1 verwendete wurde mit. dem Stamm Bacillus IT, (Al¹CC 21833) geimpft und 72 Stunden lang in einer Schüttelkultur bei 37° C gezüchtet. In der im Beispiel 1 angegebenen v7eise wurde das äthanolgetrocknete Pulver erzeugt. Es wurde eine alkalische Cellulase-lTormalsubstanz mit einer relativen Aktivität von 1000 -Eiinheiten pro g in einer Menge von 10 g pro 1 der !»ährbouillon erhalten.

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Claims

- 26 Patentansprüche:

^ Alkalische Cellulase, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Jinzym ist, das bei einer Temperatur von 40° eine optimale Aktivität bei einem pH-'Vert von 5-10 hat.
2. Verfahren zum Erzeugen der neuen alkali*» cchen Cellulase mit den physikalisch-chemischen &igenschaften nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Rährmedium, das aus einem Carbonat, einer Kohlenstoff quelle, einer 3tickstoffquelle· und einem anorganischen Material mit einem Mikroorganismus von dem ött-.mm Bacillus N₁ (ATCC 21832) und Bacillus Ii. (ATCG 21833) geimpft und der Mikroorganismus in dem iiährmedium bei Temperaturen von etwa 20-40 C gezüchtet wird, bis in dem Nährmedium eine beträchtliche enzymatische Wirksamkeit vorhanden ist und die genannte alkalische Cellulase in dem Hälirnedium erzeugt wird, worauf die genannte alkalische Cellulase aus dem !iährEedium gewonnen wird.
3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in einer aeroben Submerskultur unter Rühren erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung während eines Zeitraums von etwa 24-75 Stunden erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das iTährmedium einen pH-Wert von 8-11 hat.

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