DE3935066A1 - Verfahren zur isolierung von violacein und seine verwendung zur prophylaxe und therapie von viruserkrankungen - Google Patents
Verfahren zur isolierung von violacein und seine verwendung zur prophylaxe und therapie von viruserkrankungenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung von Violacein und seine Verwen
dung zur Prophylaxe und Therapie von Viruserkrankungen.
Violacein ist der Hauptbestandteil eines blauschwarzen Pigmentes in Chromobacte
rium violaceum, ein aus Erde und Gewässer tropischer Gebiete erhältlicher Mikro
organismus, wobei als Nebenbestandteil Desoxyviolacein auftritt. Violacein und
Desoxyviolacein sind seit langem bekannt [vgl.: J. of Infect. Dis. 76, 1, 47
(1945); Black, M.E. and Shaphan, J., J.A.M.A. 110, 1270 (1938); R.D. De Moss: An
tibiotics, Vol. 2, Ed: D. Gottlieb and P.D. Shaw, Seite 77, Springer 1967; N. Du
ran et. al., An. Acad. bras. Cienc. 55 (3), 231 (1983)].
Chemisch ist Violacein 3-[1,2-dihydro-5-(5-hydroxy-1H-indol-3-yl)-2-oxo-3-H-pyr
rol-3-yliden]-1,3-dihydro-2H-indol-2-on mit der Summenformel C₂₀H₁₃N₃O₃
(Molekulargewicht 343,33). Violacein ist in Wasser nahezu unlöslich, jedoch lös
lich in Aceton, Ethanol und Dioxan.
Die Strukturformel für Violacein wurde durch NMR spektrometrische Untersuchungen
wie folgt gefunden:
Violacein kann weiterhin durch sein UV/VIS-Absorptionsspektrum in Methanol cha
rakterisiert werden:
λmax = 570 nm; λmin = 426 nm; λmax = 366 nm.
Zum Vergleich das Absorptionsspektrum des Nebenbestandteils Desoxyviolacein:
λmax = 560 nm; λmin = 434 nm; λmax = 370 nm.
Es ist auch bekannt, daß Roh-Violacein eine bakteriostatische Wirkung be
sitzt (vgl. Lichtstein et. al., J. of Infect. Dis. 76, No. 1, 47 (1945); De Moss in
Antibiotics, Vol. 2, Seite 77 Ed: D. Gottlieb and P.D. Shaw, Springer 1967).
Neuere Untersuchungen haben ergeben, daß die isolierte Pigment-Rohfraktion in
mehrere Einzelkomponenten aufgetrennt werden kann, die strukturverwandte Verbin
dungen darstellen, wobei die jeweiligen Einzelverbindungen jedoch ein deutlich
unterschiedliches Löslichkeitsverhalten sowie unterschiedliche antibakterielle
Wirkungen besitzen. Siehe zum Beispiel N. Duran et. al, An. Acad. brasil.
Cienc., 55 (3), 231 (1983).
Eine antivirale Wirksamkeit ist bisher jedoch weder für das Roh-Violacein noch
für eine der Einzelkomponenten bekannt.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Violacein aus Chromobacterium viola
ceum eine gute antivirale Wirkung gegen DNS- und RNS-Viren aufweist.
Roh-Violacein kann aus Kulturen von Chromobacterium violaceum, Janthinobacterium
lividum und Chromobacterium livium isoliert werden.
Die als Ausgangsmaterial verwendeten Bakterien kann man auf festen oder flüssigen
Nährmedien kultivieren, zum Beispiel nach dem von P. H. A. Sneath beschriebenen
Verfahren [P. H. A. Sneath, J. Gen. Microbiol. 15, 70-98 (1956)]. Vorzugsweise
werden die Bakterien in flüssigen Nährmedien gezüchtet, da sie aus dem Nährmedium
durch Zentrifugation leicht abgetrennt werden können. Zur Züchtung auf festen
Nährböden ist ein Medium der folgenden Zusammensetzung geeignet:
| Fleischextrakt:|3,0 g | |
| Pepton aus Fleisch: | 5,0 g |
| Agar: | 18,0 g |
| Aqua dest.: | 1000 ml |
| pH-Wert 7,5 |
Der nach Bebrütung gewachsene Bakterienrasen wird abgelöst und gefriergetrocknet.
Die Extraktion des Roh-Violaceins erfolgt mit Ethanol im Soxhlet. Das Ethanol
wird im Vakuum abdestilliert.
Zur Züchtung in flüssigen Kulturen sind verschiedene Nährmedien geeignet. Als op
timal für das Bakterienwachstum und die Pigmentausbeute hat sich folgendes Medium
erwiesen:
| Casein-Pepton:|7,8 g/l | |
| Glucose: | 1,0 g/l |
| Kochsalz: | 5,6 g/l |
| pH-Wert 6,3 |
Dieses Medium ist für Fermenterkulturen sowie auch für Stand- oder Schüttelkul
turen geeignet.
Bei der Kultur im Fermenter kann sowohl der batch- wie auch der semikontinuierli
che Betrieb durchgeführt werden.
Nach Abernten der Kulturen wird die flüssige Phase abgetrennt und der Farbstoff
extraktiv aus dem Sediment isoliert.
Zur Isolierung von Violacein extrahiert man das Roh-Violacein zweimal mit n-Hep
tan und filtriert ab. Den Rückstand löst man in einem Gemisch aus Chloro
form/Aceton/Pyridin 50:40:10 und trennt das Farbstoffgemisch mittels Kieselgel-
Dünnschichtchromatographie auf.
Im fertigen Chromatogramm lassen sich vier Einzelfraktionen mit folgenden Charak
teristika identifizieren:
- a) eine blaue Zone mit Rf 0,58
- b) eine schwach blau gefärbte Zone mit Rf 0,2
- c) eine tief preußisch blaue bis violette Zone mit Rf 0,64
- d) eine schwach violette Zone mit Rf 0,71.
Die Zone (c), die auf der Platte tief preußischblau gefärbt erscheint, entspricht
Violacein und die Zone (d), die auf der feuchten DC-Platte rein violett gefärbt
erscheint, entspricht Desoxyviolavein.
Zur Weiterreinigung löst man das Kieselgel im Bereich der Zonen mit Violacein
und/oder Desoxyviolacein ab und eluiert den Farbstoff mit Chloroform/Methanol
50 : 50 für Violacein und Chloroform oder Chloroform/Methanol 80 : 20 für Desoxyvio
lacein.
Nach Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum reinigt man den Rückstand wiederum
durch DC-Chromatographie, und zwar mit dem Lösungsmittelgemisch Chloro
form/Aceton/Pyridin 50 : 50 : 10 für Violacein und Chloroform/Aceton/Pyridin
60:30:10 für Desoxyviolacein.
Man löst das Kieselgel im Bereich der entsprechenden Zonen wiederum ab, eluiert
den Farbstoff mit Chloroform/Methanol 50 : 50 für Violacein und Chloroform/Methanol
80:20 für Desoxyviolacein und entfernt das Lösungsmittel durch Abdampfen im Va
kuum bei 35°C Badtemperatur. Den Rückstand nimmt man in wenig Pyridin auf. An
schließend entfernt man das Pyridin im Vakuumexsikkator über konzentrierter
Schwefelsäure. Den schwarz-violetten Rückstand trocknet man bei 65°C im Vakuum.
Die Prüfung der virustatischen Wirkung erfolgt mit virusinfizierten tierischen
Zellkulturen in einem Farbtest wie von Finter (J. Gen. Virol. 5, 419 (1969)) be
schrieben. Der Test beruht darauf, daß die durch die Viren zerstörten Zellen
nicht mehr gefärbt werden können. Je mehr Zellen durch die virustatische Wirkung
einer Substanz geschützt werden, um so mehr Farbstoff wird gebunden. Der Farb
stoff läßt sich aus den gefärbten Zellen extrahieren, und seine Menge kann in ei
nem Fotometer z. B. bei Verwendung von Kristallviolett bei 546 nm gemessen werden.
Damit erlaubt der Test meßbare und reproduzierbare Angaben sowohl über die viru
statische, wie auch durch Parallelversuche mit Zellkulturen ohne Viren über die
zytotoxische Wirkung von Substanzen.
5 mg Violacein wurden in 100 ml Ethylalkohol gelöst. Unter Verwendung des Mediums
für die Zellkultur wurde eine Konzentration von 0,25 µg/ml Violacein eingestellt.
Diese Lösung wird in Zweierstufen weiterverdünnt und auf 24 Stunden alte Hela-
Zellen gegeben, nachdem diese vorher 45 Minuten zur Infektion mit einer Sus
pension von Herpes simplex-Viren überschichtet worden waren. Zur Prüfung der
Zytotoxität werden Parallelansätze ohne Viruszugabe analog mit den verschie
denen Verdünnungsstufen der Prüfsubstanz überschichtet. Die Versuchsansätze mit
Virus und Violacein bzw. nur Violacein werden mit 72 Stunden bei 37°C bebrütet. An
schließend werden die Zellen fixiert und für 15 Minuten gefärbt. Nach Spülen mit
Wasser wird der an die Zellen gebundene Farbstoff mit Ethanol extrahiert und in
einem Fotometer die Extinktion bei 546 nm (Kristallviolett) gemessen. Die ent
sprechenden Ergebnisse sind in Tabelle I wiedergegeben. Die Extinktion mit 50%-
Zellschutz (ZK+VK)/2 liegt bei 0,355. Eine Konzentration von 0,198 µg/ml Viola
cein bewirkt einen Zellschutz von 50%.
Da das Violacein keine wesentliche zytotoxische Eigenschaft besitzt, kann seine
antivirale Schutzwirkung in Prozent auch nach folgender Formel berechnet werden:
E₃=Extinktion der Zellkontrolle, E₂=Extinktion der Viruskontrolle, E₃=Ex
tinktion der Versuchsansätze mit Virus und Violacein.
Die Ergebnisse dieser Auswertung sind in Tabelle II angegeben.
Mit der gleichen Versuchsanordnung (s. o.) kann die Wirkung des Violaceins gegen
Polio-Viren bestimmt werden. Die Untersuchung für das Poliovirus Typ I ergab die
in Tabelle III angegebenen Werte für den Zellschutz bei Hela-Zellen.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß Violacein über ausgezeichnete virustati
sche Eigenschaften verfügt, die seine Verwendung in der Therapie und Prophylaxe,
insbesondere für Herpes- und Poliovirusinfektionen, als vorteilhaft erkennen
lassen.
Claims (11)
1. Verwendung von Violacein zur Behandlung von Viruserkrankungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein
Herpes Virus ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein
Poliovirus ist.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn
zeichnet, daß Violacein aus der Suspensionskultur eines zur Bildung dieses
Pigmentes befähigten Bakteriums, vorzugsweise Chromobakterium violaceum, iso
liert wird.
5. Verwendung nach Anspruch 4, bei dem man Chromobakterium violaceum in einem be
lüfteten Fermenter unter turbulenter Durchmischung kultiviert, dadurch
gekennzeichnet, daß
- (i) die Fermentation satzweise mit einer Kulturdauer von 5-7 Tagen erfolgt,
- (ii) die Temperatur in der Kultur zwischen 20-25° Celsius beträgt,
- (iii) als Medium eine Nährlösung aus Pepton, Glucose und Kochsalz verwendet wird,
- (iv) der pH-Wert der Kulturbrühe zwischen 6 und 7 gehalten wird.
6. Verwendung nach Anspruch 4, bei dem man Chromobakterium violaceum in einem be
lüfteten Fermenter unter turbulenter Durchmischung kultiviert, dadurch
gekennzeichnet, daß
- (i) die Fermentation semikontinuierlich mit einem Erntecyclus von 3-6 Tagen erfolgt,
- (ii) die Temperatur in der Kultur zwischen 20-25° Celsius beträgt,
- (iii) als Medium eine Nährlösung aus Pepton, Glucose und Kochsalz verwendet wird,
- (iv) der pH-Wert der Kulturbrühe zwischen 6 und 7 gehalten wird.
7. Verfahren zur Isolierung des nativen Violaceins (Gemisch von Violacein mit bis
zu 10% Desoxyviolacein) aus Suspensionskulturen nach Anspruch 5 oder 6, da
durch gekennzeichnet, daß man
- (i) die Suspension durch Mikrofiltration auf weniger als 10% des Ausgangsvolumens einengt,
- (ii) die angedickte Suspension trocknet, vorzugsweise durch Sprüh oder Gefriertrocknung,
- (iii) das Trockenprodukt mit einem geeigneten Lösemittel, vorzugsweise THF oder Sioxan, extrahiert,
- (iv) den Extrakt nach 7 (iii) mittels Destillation oder Vakuumver dampfung aufkonzentriert,
- (v) das Konzentrat nach 7 (iv) zur Ausfällung des Violaceins mit Wasser versetzt,
- (vi) den gebildeten Niederschlag abfiltriert,
- (vii) Verunreinigungen durch Behandlung des Niederschlages mit geeigneten unpolaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Chloroform, abtrennt,
- (viii) eine Endreinigung durch Rekristallisation aus geeigneten organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise THF oder Dioxan, durchführt.
8. Verfahren zur Isolierung des nativen Violaceins (Gemisch von Violacein mit bis
zu 10% Desoxyviolacein) aus Suspensionskulturen nach Anspruch 5 oder 6, da
durch gekennkeichnet, daß man
- (i) die Bakterien und das Pigment aus dem Zellmedium durch Zentrifugation abtrennt,
- (ii) das Sediment vorzugsweise durch Sprüh- oder Gefriertrocknung trocknet,
- (iii) das Trockenprodukt mit einem geeigneten Lösemittel, vorzugsweise THF oder Dioxan, extrahiert,
- (iv) den Extrakt nach 8 (iii) mittels Destillation oder Vakuumver dampfung aufkonzentriert.
- (v) das Konzentrat nach 8 (iv) zur Ausfällung des Violaceins mit Wasser versetzt,
- (vi) den gebildeten Niederschlag abfiltriert,
- (vii) Verunreinigungen durch Behandlung des Niederschlages mit geeigneten unpolaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Chloroform, abtrennt,
- (viii) eine Endreinigung durch Rekristallisation aus geeigneten organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise THF oder Dioxan, durchführt.
9. Verfahren zur Isolierung des nativen Violaceins (Gemisch von Violacein mit bis
zu 10% Desoxyviolacein) aus Suspensionskulturen nach Anspruch 5 und 6, da
durch gekennzeichnet, daß man
- (i) die Bakterien und das Pigment gem. 7 (i) bzw. 8 (i) anreichert,
- (ii) die angedickte Suspension mit einem geeigneten Lösemittel, vorzugsweise THF oder Dioxan, extrahiert,
- (iii) die festen, unlöslichen Bestandteile mittels Filtration oder Zentrifugation entfernt,
- (iv) den Extrakt nach 9 (iii) mittels Destillation oder Vakuumver dampfung aufkonzentriert,
- (v) das Konzentrat nach 9 (iv) zur Ausfällung des Violaceins mit Wasser versetzt,
- (vi) den gebildeten Niederschlag abfiltriert,
- (vii) Verunreinigungen durch Behandlung des Niederschlages mit geeigneten unpolaren organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Chloroform, abtrennt,
- (viii) eine Endreinigung durch Rekristallisation aus geeigneten organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise THF oder Dioxan, durchführt.
10. Verfahren zur Isolierung von Violacein aus Chromobacterium violaceum, bei dem
man die Bakterien durch Zentrifugation vom Medium abtrennt, das Sediment lyo
philisiert, daraus durch Ethanol-Extraktion Roh-Violacein isoliert, da
durch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Violacein
- (i) das Roh-Violacein zweimal mit n-Heptan extrahiert,
- (ii) den Rückstand einer DC-Chromotographie mit dem Lösungsmittelgemisch Chloroform/Aceton/Pyridin 50 : 40 : 10 unterwirft,
- (iii) die Zone mit einem Rf von 0,64 ablöst, den Farbstoff mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol 80 : 20 oder 50 : 50 eluiert und die Substanz einer nochmaligen DC-Chromotographie wie in Schritt (ii) unterwirft, die in diesem Chromatogramm enthaltene Zone mit dem Rf 0,64 wiederum ablöst und wie oben beschrieben isoliert, anschließend
- (iv) das Lösungsmittel entfernt, den Rückstand in Pyridin aufnimmt und das Pyridin im Vakuum über Schwefelsäure abdampft und den Rückstand bei 65°C im Vakuum trocknet.
11. Verfahren zur Isolierung von Desoxyviolacein aus Chromobacterium violaceum,
bei dem man die Bakterien durch Zentrifugation vom Medium abtrennt, das Sedi
ment lyophilisiert, daraus durch Ethanol-Extraktion Roh-Violacein isoliert,
dadurch gekennzeichnet, daß man zur Isolierung von Desoxyviolacein
- (i) das Roh-Violacein zweimal mit n-Heptan extrahiert,
- (ii) den Rückstand einer DC-Chromotographie mit dem Lösungsmittelgemisch Chloroform/Aceton/Pyridin 50 : 40 : 10 unterwirft,
- (iii) die Zone mit einem Rf von 0,71 ablöst, den Farbstoff mit Chloroform eluiert und die Substanz einer nochmaligen DC-Chromotographie wie in Schritt (ii) unterwirft, die in diesem Chromatogramm enthaltene Zone mit dem Rf 0,71 wiederum ablöst und wie oben beschrieben isoliert, anschließend
- (iv) das Lösungsmittel entfernt, den Rückstand in Pyridin aufnimmt und das Pyridin im Vakuum über Schwefelsäure abdampft und den Rückstand bei 65°C im Vakuum trocknet.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3935066A DE3935066A1 (de) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | Verfahren zur isolierung von violacein und seine verwendung zur prophylaxe und therapie von viruserkrankungen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3935066A DE3935066A1 (de) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | Verfahren zur isolierung von violacein und seine verwendung zur prophylaxe und therapie von viruserkrankungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3935066A1 true DE3935066A1 (de) | 1991-04-25 |
Family
ID=6391904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE3935066A Ceased DE3935066A1 (de) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | Verfahren zur isolierung von violacein und seine verwendung zur prophylaxe und therapie von viruserkrankungen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3935066A1 (de) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993018766A1 (en) * | 1992-03-20 | 1993-09-30 | The Wellcome Foundation Limited | Further indole derivatives with antiviral activity |
| WO2002050299A3 (de) * | 2000-12-20 | 2003-03-13 | Stiftung A Wegener Inst Polar | Mikrobiologisches verfahren zur biosynthese der natürlichen blau-violetten farbstoffe violacein und desoxyviolacein und deren verwendung |
| DE102005051869A1 (de) * | 2005-10-25 | 2007-04-26 | Beiersdorf Ag | Kosmetische Zubereitungen enthaltend Violacein |
| WO2011110932A1 (en) | 2010-03-12 | 2011-09-15 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the production of violacein and its derivative deoxyviolacein containing bioactive pigment from chromobacterium sp. (mtcc 5522) |
-
1989
- 1989-10-20 DE DE3935066A patent/DE3935066A1/de not_active Ceased
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Patentanmeldung P 38 13 465.9 vom 21.4.1988 * |
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| US7901914B2 (en) | 2000-12-20 | 2011-03-08 | Stiftung Alfred-Wegener-Institut Fuer Polar- Und Meeresforschung | Microbiological method of the biosynthesis of natural blue-violet colorants violacein and deoxyviolacein and the utilization thereof |
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| US8883461B2 (en) | 2010-03-12 | 2014-11-11 | Council Of Scientific & Industrial Research | Process for the production of violacein and its derivative deoxyviolacein containing bioactive pigment from Chromobacterium sp. (MTCC5522) |
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