DE4113602A1

DE4113602A1 - Endotoxinadsorber und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE4113602A1
Application number: DE4113602A
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr Loth; Steffen Mitzner; Dieter Dr Falkenhagen; Jana-Maria Schneidewind
Original assignee: SCHNEIDEWIND JANA MARIA DR MED
Current assignee: SCHNEIDEWIND JANA MARIA DR MED
Priority date: 1991-04-23
Filing date: 1991-04-23
Publication date: 1992-10-29

Description

Die Erfindung betrifft einen Adsorber zur Entfernung von Endotoxinen aus wäßrigen Lösungen, Blutplasma und Vollblut sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung. Anwendungsgebiete sind vor allem die Medizin und die Pharmazie.

Endotoxine sind komplexe Verbindungen mit überwiegend Liposaccharidstruktur, die in der äußeren Zellwand gram-negativer Bakterien verankert sind und bei deren Zerfall in das umgebende Medium freigesetzt werden können. Aufgrund ihrer pyrogenen und antigenen Wirkung sind sie u. a. maßgeblich verantwortlich für die Fieberreaktion, für die Entstehung der Disseminierten Intravasalen Gerinnung, des Sanarelli-Shwartzman-Phänomene, des septischen Schocks und des Coma hepaticum. Besonders bei Leberausfällen reagiert der menschliche Körper sehr empfindlich auf Endotoxine, wobei 0,2 ng/kf KM fiebererzeugend sind und höhere Konzentrationen in 80% zum Tode führen.

Eine Möglichkeit zur Behandlung derartig erkrankter Patienten besteht darin, die Endotoxine aus dem Blutkreislauf zu entfernen. Das kann entweder durch Plasmapherese bzw. Plasmaaustausch oder durch den Einsatz geeigneter endotoxinbindender Adsorbentien erfolgen. Nachteile der Plasmapherese bzw. des Plasmaaustausches sind bsp. die relativ geringe Effektivität, die hier stärker zu berücksichtigende Infektionsgefahr. Als Alternativen setzen sich immer mehr die Endotoxinadsorber durch. Am weitesten verbreitet sind Adsorber auf Basis von Aktivkohle/A. S. Pegues u. a.: Int. J. Artif. Organs 2 (1979) 153, die jedoch nicht selektiv sind. Wesentlich bessere Selektivität würden Adsorber besitzen, die aus einem polymeren Trägermaterial und daran fixierten Antikörpern bestehen. Bisher ist es jedoch nur gelungen, Antikörper mit absoluter Serospezifität monoklonal zu erzeugen, jedoch gelang es bisher nicht, monoklonale Antikörper allgemein gegen Endotoxine hervorzubringen - K. T. CHONG: J. Infect. Dis. 156/5 (1978) 713; H. E. FARELLY: J. Med. Microbiol. 23 (1987) 1; A. FOMSGAARD: The Lancet Feb. 28 (1987) 514; M. C. LUC: Hepat. 8 (1987) 117; K. SAUKKONEN. J. Infect. Dis. 158 (1988) 209; E. J. ZIEGLER. New Engl. J. Med. 307 (1982) 1225. Nachteilig sind hier der hohe Kostenaufwand für die Gewinnung der Antikörper und die Instabilität der Produkte bei den üblichen Sterilisationsverfahren sowie die technich aufwendige Herstellung zu nennen.

Der Nachteil des hohen Kostenaufwandes trifft auch für Adsorber zu, die aus einer perlförmigen Polysaccharidmatrix (Agarose, Dextran, Cellulose bestehen, an die Polymyxin-B als Ligant gekoppelt wurde - M. UMEDA u. a.: Biomat., Art. Cells, Art. Org. 18 (1990) 4, 491-497 -.

Ökonomisch günstiger herstellbar sind Polysaccharidadsorber, die als endotoxinbindende funktionelle Gruppe Diethylaminoethyl gruppen - US-PS 38 97 309 - oder andere stickstoffhaltige Gruppen - US-PS 43 81 239 - verwenden. Nachteile dieser Adsorber ergeben sich aus einer zum Teil ungünstigen Blutverträglichkeit. Weiterhin beschrieben sind Endotoxinadsorber unter Verwendung von Aminen - EP-PS 03 08 239, EP-PS 03 33 474 - sowie von an Agarose gekoppelten Protamin - I. M. HELANDER: Feb. 1987, 51-55. - Auch hier treffen die Nachteile der ungünstigen Selektivität und zu geringen Effektivität der Adsorber zu. Die Herstellungsverfahren für die angeführten Adsorber basieren mit Ausnahme der Aktivkohle im wesentlichen alle darauf, daß ein geeigneter polymerer Träger - meist eine perlförmige Polysaccharidmatrix - zumächst durch Einführung reaktionsfähiger Gruppen aktiviert und anschließend mit dem zur Endotoxinbindung befähigten Liganden kovalent gekoppelt wird. Diese Verfahrensweise hat insofern Nachteile, als die vor geschlagenen Liganden entweder sehr kostenintensiv und technisch aufwendig hergestellt werden müssen oder nicht die gewünschten Bindungs- und Kompatibilitätseigenschaften aufweisen.

Von Seiten der verwendeten Trägermatrix ergeben sich ebenfalls oft Nachteile, da diese z. T. nicht die gewünschte mechanische Stabilität oder eine genügende Porosität besitzen.

Ziel der Erfindung war es daher, einen Adsorber zur Bindung von Endotoxinen aus Blutplasma, Vollblut oder wäßrigen Lösungen zu entwickeln, der verbesserte Eigenschaften aufweist, sowie ein ökonomisch günstigeres Verfahren zur Herstellung derartiger Adsorber aufzuzeigen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Endotoxinadsorber zu entwickeln, der sich durch eine hohe Bindungskapazität und Selektivität sowie gute mechanische Eigenschaften und einfache Herstellbarkeit auszeichnet.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß als Endotoxinadsorber poröse Träger auf Basis von Celluloseprodukten verwendet werden, die Polyethylenimin als Ligand gebunden enthalten. Das Polyethylenimin kann dabei adsorptiv, ionisch oder kovalent an der inneren und äußeren Oberfläche des porösen Perlcellulosematerials gebunden sein. Der Adsorber ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Polyethylenimin im Endprodukt 1 bis 25 Masse-%, bezogen auf die Trockenmasse des Adsorbers, beträgt, entsprechend einem Stickstoffgehalt von 0,3 bis 8 Masse-%. Als poröses Cellulosematerial werden erfindungsgemäß unmodifizierte Regeneratcelluloseperlen mit Teilchengrößen von 0,1 bis 5 mm anionisch modifiziert, insbesondere Carboxyl-, Sulfat- oder Phosphatgruppen enthaltende Perlcelluloseprodukte oder auch reaktive funktionelle Gruppen, wie z. B. Aldehydgruppen oder Epoxigruppen enthaltende Perlcelluloseprodukte eingesetzt. Die Anwendung des Endotoxin adsorbers erfolgt im wasserfeuchten, gequollenen Zustand, wobei der Wassergehalt des Adsorbers 50 bis 95 Masse-%, vorzugsweise 80 bis 90 Masse-% beträgt.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Adsorber erfolgt in einfacher Weise dadurch, daß die genannten porösen, perlförmigen Celluloseprodukte, deren Teilchengröße 0,1 bis 5 mm beträgt, mit einer wäßrigen 0,1- bis 20masse-%igen Lösung von Polyethylenimin 1 min bis 6 h bei 0 bis 50°C behandelt werden und anschließend überschüssiges bzw. nicht gebundenes Polyethylenimin durch Absaugen und Waschen mit Wasser bzw. physiologischer NaCl-Lösung entfernt wird.

In Versuchen zeigte sich, daß das adsorptiv oder ionisch gebundene Polyethylenimin durch Wasser, NaCl-Lösung oder andere gepufferte wäßrige Lösungen nicht mehr von dem erfindungsgemäßen Adsorber entfernt werden kann. Außerdem besitzen diese Produkte eine gute Selektivität gegenüber Endotoxinen und nur geringe Nachteile hinsichtlich der Blutverträglichkeit. Plasmaproteine, Lipide und Thrombocyten werden nur in vertretbarem Maße adsorbiert. Der Adsorber läßt sich ohne Beeinträchtigung seiner vorteilhaften Eigenschaften autoklavieren und aufgrund seiner guten mechanischen Stabilität auch abriebfrei behandeln. Bei der Anwendung in Säulen oder Plasmaperfusionskapseln zeigt er ein stabiles Laufverhalten. Er läßt sich regenerieren und mehrfach einsetzen.

Der erfindungsgemäße Adsorber wurde mit endotoxinhaltigen wäßrigen Lösungen und Plasma sowohl im batch-Verfahren als auch unter Kreislaufbedingungen getestet. Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Beschreibung der Erfindung.

Beispiel 1

100 g makroporöse, wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Cellulosegehalt von 10 Masse-% und einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,2 mm werden mit 200 ml einer 10masse-%igen Polyethyleniminlösung vermischt und 60 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die behandelte Perlcellulose auf einer Fritte abgesaugt und 5mal mit je 200 ml 1%iger NaCl-Lösung und 5mal mit je 200 ml Wasser gewaschen. Der erhaltene Adsorber wies einen Stickstoffgehalt von 0,8 Masse-% auf, bezogen auf die Adsorbertrockenmasse. Zur Bestimmung der Endotoxinbindung wurde zunächst der Adsorber wie folgt aktiviert: 2 g des Adsorbers wurden mit 10 ml NaOH in einer Konzentration von 500 mmol/l 20 min lang inkubiert und anschließend mit Wasser so lange gespült, bis ein neutraler pH-Wert erreicht wurde, dann wurden die gleichen 2 g des Adsorbers mit 10 ml HCl in einer Konzentration von 500 mmol/l 20 min inkubiert und anschließend mit Wasser so lange gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht war, es schloß sich eine 5malige Spülung mit einem pH-neutralen Puffer an. Die Reaktionstemperatur betrug konstant 21°C.

Bei den Versuchen zur Endotoxinadsorption wurde sowohl im batch als auch im Kreislauf ein Verhältnis Adsorber zu endotoxin haltiger Lösung von 1 : 10 gewählt. Die Reaktionstemperatur betrug konstant 37°C.

Oben beschriebener Adsorber hatte bereits nach 30 min Inkubation mit der endotoxinhaltigen Lösung von der Ausgangskonzentration von 100 000 pg/ml Lösung 98 350 pg/ml adsorptiv gebunden. Zum quantitativen Endotoxinnachweis wurde das handelsübliche Limulus- Amoebocyten-Lysat-Assay verwendet.

Beispiel 2

100 g wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Cellulosegehalt von 15 Masse-% und einem mittleren Teilchendurchmesser von 2,5 mm wurden wie in Beispiel 1 mit Polyethylenimin behandelt und gewaschen. Der Stickstoffgehalt in der resultierenden Probe betrug 2,6 Masse-%, bezogen auf die Trockenmasse.

Die Untersuchung der Adsorber auf Endotoxinbindung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach 90 min Reaktionszeit waren bei einer Ausgangskonzentration von 100 000 pg/ml Lösung 99 000 pg/ml gebunden.

Beispiel 3

100 g abgesaugte, wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Carboxylgehalt von 1,2 meq/g Trockensubstanz, einem Wassergehalt von 92 Masse-% und einer mittleren Teilchengröße von 0,2 mm werden mit 200 ml einer 5masse-%igen Polyethyleniminlösung vermischt und 360 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Produkt wie unter Beispiel 1 beschrieben gewaschen und auf Endotoxinbindung untersucht. Der auf die Trockenmasse bezogene Stickstoffgehalt betrug 5,8 Masse-%. Bei den Testungen zur Endotoxinadsorption ergaben sich bereits nach 15 min Inkubationszeit bei einer Ausgangskonzentration von 100 000 pg/ml eine Adsorption von 99 240 pg/ml.

Beispiel 4

100 ml abgesaugte, wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Phosphat gehalt von 95 Masse-% und einer mittleren Teilchengröße von 0,25 mm werden wie in Beispiel 1 mit Polyethylenimin behandelt und auf Endotoxinbindung untersucht. Der auf die Trockenmasse bezogene Stickstoffgehalt betrug 8,7 Masse-%. Bei einer Ausgangskonzentration der endotoxinhaltigen Lösung von 100 000 pg/ml waren nach 90 min Reaktionszeit 99 440 pg/ml adsorbiert.

Beispiel 5

100 ml abgesaugte, wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Sulfatgehalt von 1,5 meq/g Trockensubstanz, einem Wassergehalt von 92 Masse-% und einer mittleren Teilchengröße von 0,2 mm werden wie in Beispiel 1 beschrieben mit Polyethylenimin behandelt und untersucht. Der auf die Trockenmasse bezogene Stickstoffgehalt betrug 4,25 Masse-%. Bei der Testung auf Endotoxinadsorption waren bei einer Ausgangskonzentration von 100 000 pg/ml Lösung nach 15 min Reaktionszeit 99 850 pg/ml adsorptiv gebunden.

Beispiel 6

100 ml abgesaugte, wasserfeuchte vernetzte, perlförmige Carboxy methylcellulose mit einem Substitutionsgrad von 0,7 und einer mittleren Teilchengröße von 3 mm wird wie in Beispiel 1 mit Polyethylenimin behandelt und auf Endotoxinbindung untersucht. Der auf die Trockenmasse bezogene Stickstoffgehalt betrug 8,9 Masse-%. Bei einer Ausgangskonzentration von 100 000 pg/ml Lösung wurden in 90 min 96 000 pg/ml an Edotoxinen adsorbiert.

Beispiel 7

100 ml abgesaugte, wasserfeuchte Perlcellulose mit einem Dialdehydgehalt von 20 µmol/ml sedimentiertes Material und einer mittleren Teilchengröße von 0,8 mm werden mit einer 20masse-%igen Polyethyleniminlösung 10 min bei 50°C gerührt. Anschließend wird das Produkt abgesaugt, mit 5%iger NaCl-Lösung und mit Wasser nach Vorschrift gewaschen und auf Endotoxinbindung untersucht. Der auf die Trockenmasse bezogene Stickstoffgehalt betrug 8,8%.

Bei einer Ausgangskonzentration von 100 000 pg/ml Endotoxingehalt wurden in 15 min 99 100 pg/ml adsorbiert.

Claims

1. Endotoxinadsorber auf Basis einer porösen, perlförmigen Polysaccharid-Matrix und einem funktionellen Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse, perlförmige Polysaccharid-Matrix ein wassergequollenes Cellulose produkt ist, an das als Ligand 0,1 bis 25 Masse-% Poly ethylimin, bezogen auf die Adsorbertrockenmasse, gebunden ist.

2. Endotoxinadsorber auf Basis einer porösen, perlförmigen Polysaccharid-Matrix und einem funktionellen Liganden, erhältlich durch Bindung von 0,1 bis 25 Masse-% Polyethylenimin, bezogen auf die Adsorbertrockenmasse, an ein poröses, perlförmiges Celluloseprodukt durch Behandlung des wassergequollenen Celluloseproduktes mit einer wäßrigen Polyethyleniminlösung bei 0 bis 50°C innerhalb 1 min bis 6 h, nachfolgendes Entfernen von ungebundenem Polyethylenimin sowie Behandeln des Produktes mit Wasser und/oder 0,5- bis 5masse-%iger Kochsalzlösung.

3. Endotoxinadsorber nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das Celluloseprodukt unmodifizierte Regenerat cellulose ist und das Polyethylenimin adsorptiv gebunden ist.

4. Endotoxinadsorber nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das Celluloseprodukt ein anionisches Cellulose derivat ist, welches Carboxyl-, Sulfat- oder Phosphatgruppen enthält, und das Polyethylenimin ionisch gebunden ist.

5. Endotoxinadsorber nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das Polyethylenimin über reaktionsfähige, funktionelle Gruppen, insbesondere Dialdehyd- und Epoxi gruppen an die Cellulosematrix gekoppelt ist.

6. Endotoxinadsorber nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch charakterisiert, daß die Größe der Perlen 0,1 bis 5 mm, vorzugsweise 0,5 bis 3 mm, beträgt und der Adsorber 50 bis 95%, vorzugsweise 80 bis 90%, Wasser enthält.

7. Verfahren zur Abtrennung von Endotoxinen aus endotoxin haltigen wäßrigen Flüssigkeiten, Blutplasma oder Vollblut durch Kontaktieren der Flüssigkeit mit einem Adsorber auf Cellulosebasis, charakterisiert dadurch, daß die endotoxin haltige Flüssigkeit mit einem 50 bis 95% Wasser enthalten den perlförmigen Celluloseprodukt, das mit 0,1 bis 25 Masse-% Polyethylenimin, bezogen auf die Adsorbertrockenmasse, be laden ist und einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,1 bis 5 mm aufweist, bei 20 bis 37°C 1 min bis 3 h lang in Kontakt gebracht wird und die endotoxinfreie Flüssigkeit von dem Adsorber abgetrennt wird.

8. Verfahren zur Herstellung eines Endotoxinadsorbers durch Umsetzung einer porösen, perlförmigen Polysaccharid-Matrix mit einem funktionellen Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß poröse, perlförmige Celluloseprodukte mit einer wäßrigen 0,1- bis 20masse-%igen Lösung von Polyethylenimin 1 min bis 6 h bei 0 bis 50°C behandelt werden und anschließend unge bundenes Polyethylenimin durch Absaugen und Auswaschen mit Wasser und/oder 0,5- bis 5masse-%iger Kochsalzlösung ent fernt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch charakterisiert, daß als perlförmiges Celluloseprodukt makroporöse Regeneratcellulose perlen mit einer Teilchengröße von 0,1 bis 5 mm und einem Wassergehalt von 50 bis 95 Masse-% eingesetzt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als perlförmiges Celluloseprodukt anionische Perlcellulosederivate mit Carboxyl-, Sulfat- oder Phosphatgruppen eingesetzt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch charakterisiert, daß als perlförmiges Celluloseprodukt Celluloseperlen verwendet werden, die reaktionsfähige Aldehyd- oder Epoxigruppen aufweisen.

12. Verwendung des Adsorbers nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur selektiven Entfernung von Endotoxinen aus wäßrigen Lösungen, Blutplasma oder Vollblut.