DE60031410T2

DE60031410T2 - Mutiertes gen der gras familie und pflanzen mit reduzierter entwicklung, die dieses gen enhalten

Info

Publication number: DE60031410T2
Application number: DE60031410T
Authority: DE
Inventors: Michel Renard; Regine Delourme; Pierre Barret; Dominique Brunel; Nicole Froger; Xavier Tanguy
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2020-08-03
Also published as: AR025009A1; AU778595B2; DE60031410D1; AU6848300A; EP1198577A1; DK1198577T3; CA2380847C; FR2797274A1; WO2001009356A1; CA2380847A1; FR2797274B1; EP1198577B1; US7645920B1; ATE342995T1

Description

Die Erfindung betrifft den Erhalt von Pflanzen mit verminderter Entwicklung und insbesondere Cruciferen.
Der Einsatz zwergwüchsiger Pflanzen im Rahmen der Landwirtschaft birgt zahlreiche Vorteile; bei Getreide zum Beispiel erlaubt die Verwendung von Mutantenpflanzen mit kurzem Stroh den Erhalt von Kulturen, die gegenüber großen Mengen stickstoffhaltigem Dünger tolerant sind, von den klimatischen Bedingungen weniger betroffen sind und die insbesondere viel widerstandsfähiger gegen Regengüsse sind als die Pflanzen mit normaler Größe. Darüber hinaus erleichtert die geringe Größe der Pflanzen deren Haltung, insbesondere das Aufbringen von Pflanzenschutzmitteln, ebenso ihre Ernte.
Zwergmutanten von anderen Pflanzen als Getreide wurden ebenso in der Literatur beschrieben. Insbesondere werden nachfolgend Mutanten erwähnt, die ähnliche Eigenschaften aufweisen, wie die, die durch ein Fehlen von Gibberellinen induziert werden und die gegenüber der Gabe von exogenen Gibberellinen unempfindlich sind. Solche Mutanten wurden insbesondere bei Arabidopsis [Koornneef et al., Physiol. Plant., 65, 33–39, (1985)] beschrieben. Diese Mutanten, die gai (für Gibberellic Acid Insensitive) genannt werden weisen eine verminderte Größe auf und sprechen nicht auf Gaben von exogenen Gibberellinen an. Die gai-Mutation ist eine Art der semi-dominanten „Funktionsgewinn"-Mutation. Die Heterozygoten GAI/gai-Mutanten weisen einen Phänotyp auf, der zwischen dem der gai/gai-Zwergmutanten und dem der GAI/gai-Wildtyp-Pflanzen liegt.
Mutanten, die dieselben Eigenschaften wie die gai-Mutanten von Arabidopsis aufweisen wurden von ZANEWICH et al. [J. Plant Growth Regul., 10, 121–127, (1991)] bei Brassica napus (die Mutanten werden dwf1 und dwf2 genannt) beschrieben.
Die Gruppe der Erfinder hat eine Zwergmutante von B. rapa erhalten [FOISSET et al., Theor. Appl. Genet., 91, 756–761, (1995)]. Die Mutation, die bzh genannt wird zeigt Eigenschaften der „Semi-Dominanz" und der Unempfindlichkeit gegenüber Gibberellinen, die denen der gai-Mutation ähneln.
Eine Rapslinie, die ISN1770 genannt wird und homozygot für das mutierte bzh-Allel ist, war der Gegenstand eines Sortenschutz-Zertifikats, das am 18 Mai 1998 bei der CPOV (11 rue Jean Nicaud, 75007 PARIS) unter der Referenznummer 10751 hinterlegt wurde. Eine Rapshybride, die „LUTIN" (B017) genannt wird und die in ihrem Genom das mutierte bzh-Allel in der heterozygoten Form enthält, wurde für den Eintrag in den französischen Sortenschutzkatalog am 31 Juli 1999, unter der Referenznummer 072426, vorgeschlagen.
Das GAI-Gen von Arabidopsis wurde kürzlich kloniert und sequenziert [PENG et al., Genes and developmenet, 11, 3194–3205, (1997), PCT-Anmeldung WO97/29123 im Namen von JOHN INNES CENTRE INNOVATIONS LTD]. Dieses Gen codiert für ein Protein (GAI) von 532 Aminosäuren. Das gai-Allel, das für den Zwergwuchs verantwortlich ist enthält eine Deletion von 51 Basenpaaren, die phasengleich mit dem Leserahmen ist, was zum Fehlen von 17 Aminosäuren führt, die nahe dem N-terminalen Ende des GAI-Proteins liegen. Das GAI-Protein ist an der Wahrnehmung und dem Ansprechen auf Gibberelline beteiligt und wirkt bei den Wildtyp-Pflanzen bei Fehlen von Gibberellinen als negativer Regulator der Zellverlängerung.
Der Vergleich der GAI-Sequenz mit der von Transduktionsprodukten anderer bekannter Gene erlaubte es sie der Familie, die GRAS [PYSH et al., The Plant Journal, 18(1), 11–119, (1999)] oder VHIID [SCHUMACHER et al., P. N. A. S., 96, 1, 290–295, (1999)] genannt wird, zuzuordnen.
Diese Familie umfasst, neben GAI, die Gene RGA [SILVERSTONE et al., Genetics, 146, 1087–1099, (1998)] und SCARECROW [DI LAURENZIA et al., Cell, 86, 423–433, (1996)] von Arabidopsis, ebenso wie das Gen LS (Lateral suppressor) der Tomate [SCHUMACHER et al., P. N. A. S., 96, 1, 290–295, (1999)]. Derzeit wurden etwa zwanzig Gene, die zur GRAS Familie gehören bei Arabidopsis identifiziert.
Die Proteine, die die GRAS-Familie bilden weisen eine hochvariable N-terminale Region und eine hochkonservierte C-terminale Region, mit 5 wiedererkennbaren Motiven insbesondere dem VHIID-Motiv, auf.
Die biologischen Funktionen der Mehrheit dieser Proteine sind nicht genau bekannt, aber ihre Rolle als Transkriptionsfaktoren wird stark vermutet. Die Arbeiten, die an den vier derzeit am besten untersuchten Genen (SCR, GAI, RGA und LS) durchgeführt wurden, zeigten, dass diese Gene Transkriptionsfaktoren codieren, die an der Steuerung der Wahrnehmung und dem Ansprechen auf Gibberelline beteiligt sind und weisen auf die mögliche Bedeutung dieser Familie bei der Kontrolle der Morphogenese und der Entwicklung der höheren Pflanzen hin.
Die Erfinder haben jetzt das BZH-Gen und sein mutiertes bzh-Allel von B. napus charakterisiert und sequenziert, das mit dem vorher von FOISSET et al. (1995, vorher zitierte Veröffentlichung) beobachteten Zwergwuchs verbunden ist.
Die Sequenz des BZH-Wildtyp-Gens ist in der Sequenzliste im Anhang unter der Nummer SEQ ID Nr. 1 wiedergegeben und die Sequenz seines Transduktionsprodukts wird unter SEQ ID Nr. 2 wiedergegeben. Die Sequenz des mutierten bzh-Allels ist in der Sequenzliste im Anhang unter der Nummer SEQ ID Nr: 3 wiedergegeben und die Sequenz seines Transduktionsprodukts wird unter SEQ ID Nr. 4 wiedergegeben.
Der codierende Teil des BZH-Gens ist 1716 Basenpaare lang und das entsprechende Protein weist 572 Aminosäuren auf.
Die Sequenzanalyse des BZH-Gens und seines Transduktionsprodukts erlaubt es, dasselbe der GRAS-Familie zuzuordnen, insbesondere der Untergruppe, die GAI, RGA und RGA-like umfasst. Der Abgleich der abgeleiteten Polypeptidsequenzen der BZH-Gene mit anderen Genen der GRAS-Familie, nämlich den Genen GAI, RGA, RGA-LIKE, SCARECROW und LS ist in der 1 wiedergegeben.
Die Sequenzanalyse des mutierten bzh-Allels und seines Transduktionsprodukts zeigt, dass die bzh-Mutation eine G → A Substitution an Position 1695 der codierenden Sequenz ist. Sie führt zu einer Veränderung der Aminosäure Glutaminsäure → Lysin an Position 546 der Polypeptidsequenz.
Überraschenderweise ist die bzh-Mutation von der gai-Mutation in Arabidopsis völlig verschieden. Insbesondere betrifft, während die gai-Mutation in Arabidopsis eine im N-terminalen Teil des Proteins liegende Region betrifft, die bzh-Mutation eine im C-terminalen Teil des BZH-Proteins liegende Region.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, dessen Expression in einer Pflanze eine Verminderung ihrer Größe bedingt, die gegenüber Gibberellinen unempfindlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass es durch die SEQ ID Nr. 4 definiert wird.
Die Erfindung umfasst ebenso die Nukleinsäuresequenzen, die für ein erfindungsgemäßes Protein codieren, zum Beispiel die Sequenz des mutierten bzh-Allels, die in der Sequenzliste im Anhang unter der Nummer SEQ ID Nr. 3 wiedergegeben wird.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Verfahren zum Erhalt von Pflanzen mit verminderter Entwicklung, die eine oder mehrere Kopien einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz umfassen, nämlich:

– Verfahren zum Erhalt von Mutantenpflanzen ausgehend von Wildtyp-Pflanzen der Familie der Brassicaceen, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für ein bestimmtest Protein codiert, das durch die Sequenz SEQ ID Nr. 2 definiert ist, mittels der klassischen Mutageneseverfahren, zum Beispiel durch Behandeln der Samen mit einem physikalischen oder chemischen Mutagenesemittel, durch Selektieren der Pflanzen, die aus den behandelten Samen hervorgegangen sind, wobei diese einen Zwergwuchs zeigen, der unempfindlich gegenüber Gibberellinen ist und durch Selektieren, mittels den klassischen Detektionsverfahren für die Hybridisierung von Nukleinsäuren von denjenigen aus diesen, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für ein erfindungsgemäßes Protein codiert.
– Verfahren zum Erhalt transgener Pflanzen durch Transgenese einer Wirtspflanze, insbesondere einer Crucifere und vorteilhafterweise einer Brassicacee, mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Pflanzen mit einer verminderten Entwicklung, die ein erfindungsgemäßes Protein exprimieren. Es handelt sich um Mutantenpflanzen oder um transgene Pflanzen, die geeignet sind mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten zu werden, ebenso wie ihre Nachkömmlinge, die durch sexuelle Reproduktion oder durch vegetative Vermehrung erhalten werden könnten.
Vorteilhafterweise sind die erfindungsgemäßen Pflanzen Brassicaceen, die aus Raps und Rübsen ausgewählt sind.
Die Pflanzen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz exprimieren, zeigen, im Verhältnis zu den Wildtyp-Pflanzen, gemäß dem Expressionsgrad der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz der Pflanze, eine mehr oder weniger beträchtliche Verminderung der Größe. Dieser Expressionsgrad hängt insbesondere von der Kopienzahl der Sequenz ab. Zum Beispiel haben im Fall des Rapses die heterozygoten BZH/bzh-Pflanzen eine Größe, die zwischen der homozygoten zwergwüchsigen bzh/bzh-Pflanze und den BZH/BZH-Wildtyp-Pflanzen liegt.
Die erfindungsgemäßen Pflanzen zeigen, insbesondere im Fall des Rapses folgende Vorteile:

– die Möglichkeit der sehr frühen Aussaat, die ohne das Risiko der Verlängerung der Stängel vor dem Winter die Aufnahme von Nitraten erlaubt;
– eine höhere Kältewiderstandsfähigkeit;
– eine bessere Weiterverfolgung der Kultur, da eine kleine Größe die Behandlung mit Pflanzenschutzmitteln erleichtert;
– eine sehr gute Beständigkeit gegen Regengüsse;
– die Leichtigkeit der Ernte.

Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Ergänzung der Beschreibung, die sich auf nicht beschränkende Beispiele bezieht, die die Charakterisierung des Raps BZH-Gens und einer erfindungsgemäßen Sequenz, die von diesem Gen abgeleitet ist, beschreibt, besser verstanden werden.
BEISPIEL 1: CHARAKTERISIERUNG UND SEQUENZIERUNG DES BZH-WILDTYP-GENS UND DES MUTIERTEN bzh-GENS
Das BZH-Gen wurde aus einem DNA-Fragment mit 2352 Basenpaaren, das ausgehend von der Raps-Linie „STELLAR" erhalten wurde, isoliert. Dieses Fragment enthält eine für 1716 Basenpaare codierende Sequenz und die abgeleitete Polypeptidsequenz weist 572 Aminosäuren auf. Die codierende Sequenz und die abgeleitete Polypeptidsequenz werden entsprechend in der Sequenzliste im Anhang unter den Nummern SEQ ID Nr. 1 und 2 dargestellt.
Zum Vergleich der Wildtyp-Sequenz des Gens und des mutierten bzh-Allels wurden 5 Linien untersucht: Wildtyp PRIMOR (PS), zwergwüchsiger PRIMOR (PN), Wildtyp DARMOR (DS), zwergwüchsiger DARMOR (DN) und Wildtyp STELLAR (STE).
Die DNA-Fragmente, die dem BZH-Locus aus diesen Linien entsprechen wurden mit Hilfe von Sonden amplifiziert, die von der Sequenz der SEQ ID Nr. 1 abgeleitet sind.
Der Sequenzvergleich der erhaltenen Amplifikationsprodukte erlaubte die Feststellung, dass der einzige gemeinsame Unterschied zwischen dem zwergwüchsigen PRIMOR und dem zwergwüchsigen DARMOR, mit Bezug auf die Wildtyp-Genotypen, eine Substitution von G → A an Position 1695 der codierenden Sequenz ist. Diese Substitution führt zu einem Austausch der Aminosäuren Glu → Lys an Position 546 der Peptidsequenz.
Die codierende Sequenz, die von dem amplifizierten Nukleinsäurefragment der ersten zwergwüchsigen Linie getragen wird und die zugehörige Peptidsequenz werden entsprechend in der Sequenzliste im Anhang unter den Nummern SEQ ID Nr. 3 und 4 dargestellt.
BEISPIEL 2: DETEKTION DES MUTIERTEN bzh-ALLELS BEI ZWERGWÜCHSIGEN PFLANZEN
49 Linien, die aus der Kreuzung zwergwüchsiger DARMOR × YUDAL hervorgegangen sind, sowie die Paare der folgenden [Wildtyp]/[bzh] isogenen Linien: ISL1770/ISN1770, DOUBLOL/DOUBLOL-Bzh, GASPARD/GASPARD-Bzh, TAPIDOR/TAPIDOR-Bzh, wurden mittels PCR-Amplifikation einer Region von ungefähr 400 Basenpaaren der codierenden Sequenz, die dem C-terminalen Anteil des Proteins entspricht, und Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Amplifikationsprodukte, analysiert.
Die Linien des Phänotyps „zwergwüchsig" zeigten auf dem Gel eine charakteristische Bande mit dem Vorliegen der G → A Substitution.
SEQUENZLISTE

Claims

Protein, dessen Expression in einer Pflanze eine Verminderung ihrer Größe bedingt, die gegen Gibberelline unempfindlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass es durch die Sequenz SEQ ID Nr.: 4 definiert wird.
Isoliertes Polynucleotid, das für ein Protein nach Anspruch 1 codiert.
Verfahren zum Erhalt von Pflanzen mit verminderter Entwicklung, ausgehend von Pflanzen der Familie der Brassicaceae, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die für ein bestimmtes Protein codiert das durch die Sequenz SEQ ID Nr.: 2 definiert ist, mit Mutagenese und Selektion der mutieren Pflanzen, die einen Zwergwuchs aufweisen, der gegenüber Gibberellinen unempfindlich ist, dadurch gekennzeichnet, dass es unter anderem eine Selektion unter den genannten Mutantenpflanzen, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die für das Protein nach Anspruch 1 codiert, umfasst.
Verfahren zum Erhalt einer Pflanze mit verminderter Entwicklung, dadurch gekennzeichnet, dass es die Transgenese einer Wirtspflanze mit einem Polynucleodid nach Anspruch 2 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Pflanze eine Crucifere ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Pflanze eine Brassicacee ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Brassicacee ausgewählt ist aus Raps und Rübsen.
Pflanze mit verminderter Entwicklung, die ein Protein nach Anspruch 1 exprimiert und die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7 erhältlich ist.
Pflanze mit verminderter Entwicklung, die ein Protein nach Anspruch 1 exprimiert und von einer Pflanze nach Anspruch 8 abstammt.