DE68921982T4

DE68921982T4 - Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.

Info

Publication number: DE68921982T4
Application number: DE68921982T
Authority: DE
Inventors: I Greenfield; Margaret Moreland; Danute Nitecki
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Cetus Oncology Corp
Priority date: 1988-06-14
Filing date: 1989-06-12
Publication date: 1996-04-25
Anticipated expiration: 2009-06-13
Also published as: DE68921982T2; DE68921982D1; AU631802B2; AU3839089A; ATE120454T1; WO1989012624A2; EP0428534B1; EP0428534A1; WO1989012624A3

Description

Diese Erfindung betrifft den Bereich der Biochemie im allgemeinen und heterobifunktionale Kupplungsmittel zur Herstellung einer umfangreiche Reihe molekularer Konjugate mit zahlreichen Anwendungen im besonderen. Insbesondere enthalten die Mittel sterisch gehinderte Thiolreste, welche durch eine Zwischenkette an eine zweite reaktive Gruppe hin zu Nucleophilen, wie primären oder sekundären Aminen oder reaktiven Thiolresten, wie sie in biologischen oder organischen Materialien vorhanden sind, gebunden sind. Die Kupplungsmittel sind nützlich zur Herstellung von Konjugaten, die eine sterisch gehinderte Disulfidbindung enthalten, deren Konjugate besonders für bestimmte in vivo-Anwendungen, wie die gezielte Abgabe von Immuntoxinen, Arzneimitteln und Radionukleiden zur Krebstherapie und -diagnose, wertvoll sind.

Hintergrund des Fachgebiets

Konjugate zwischen Verbindungen mit wesentlich verschiedenen chemischen oder biologischen Wirkungen finden breite Verwendung in der analytischen Chemie, der klinischen Chemie und der Medizin. Direkt oder indirekt an Antikörper gebundene Enzyme finden allgemeine Verwendung bei Immuntests [Ishikawa et al., Journal of Immunoassay, 4 (1983), 209 - 327]. Direkt oder indirekt an Nukleinsäuresonden gebundene Enzyme finden zunehmend Verwendung bei Nukleinsäurehybridisierungstests [Sheldon et al., Clin. Chem., 33 (1987), 1368 - 1371]. Konjugate zwischen verschiedenen Antikörpern können bei der Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität [Titus et al., J. Immunol., 138 (1987), 4018 - 4022], einem möglichen Verfahren zur Behandlung von Krebs, Autoimmun-Krankheiten und immunologischen Abstoßungsreaktionen, welche auf Gewebetransplantationen folgen, therapeutisch nützlich werden. Die gleichen therapeutischen Anwendungen werden für Konjugate zwischen Toxinen und Antikörpern, welche als Immuntoxine bekannt sind [Vitette et al., Science, 238 (1987), 1098 - 1104], wie auch für Konjugate zwischen Antikörpern und anderen therapeutischen Wirkstoffen, einschließlich Radionukliden und Arzneimitteln mit verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht, ins Auge gefaßt. Wie dem auch sei, der gesamte Anwendungsbereich von molekularen Konjugaten ist lediglich durch die Vorstellungskraft begrenzt, da es derart viele molekulare Funktionen gibt, und innerhalb des Gebietes von Bindungsreaktionen, so viele Moleküle mit nützlichen Bindungsbesonderheiten (z.B. Lectine für bestimmte Kohlenhydrate, Hormone und Zytokine für bestimmte Rezeptoren, Staphylococcus-Protein A und bestimmte Komplementkomponenten für Immunglobuline), daß die Gesamtzahl an nützlichen funktionalen Kombinationen schwer abzuschätzen ist.
Bei einigen Anwendungen molekularer Konjugate ist es förderlich, eine Verknüpfung zwischen den konjugierten Molekülen zu verwenden, die unter vorhersagbaren oder steuerbaren Bedingungen spaltbar ist. Im Bereich der pharmazeutischen Chemie wurde im allgemeinen angenommen, daß für die wirksamsten Immuntoxine eine spaltbare Bindung zwischen dem Toxin und dem Antikörper, welcher das Toxin auf eine bestimmte Klasse von Zellen hin ausrichtet, erforderlich ist. Von solchen Immuntoxinen vermutet man, daß sie auf einem mehrstufigen Weg wirken: Bindung an die Zelloberfläche, Aufnahme in das Zellinnere, Spaltung der Verknüpfung zwischen Antikörper und Toxin, und Abtöten der Zelle durch das freigesetzte Toxin.
Drei Formen der chemischen Spaltbarkeit, die im allgemeinen für eine molekulare Konjugation anwendbar sind, wurden an Immuntoxinen bewerkstelligt. Eine verwendet eine säure-labile Verknüpfung, wobei die Tatsache ausgenutzt wird, daß einige der intrazellulären Kompartimente pH-Werte aufweisen, die um einige pH-Einheiten niedriger sind als außerhalb der Zelle [Blattner et al., Biochemistry, 24 (1985), 1517 - 1524]. Eine zweite Spaltungsmöglichkeit ist, ein Peptid zur Verknüpfung zu verwenden, mit einer Aminosäuresequenz, welche durch eine spezifische Protease erkannt wird [U.S. Patent Nr. 4.571.958]. Als drittes erfolgt die Verwendung von disulfid-haltigen Verknüpfungen zwischen Antikörper und Toxin. Die Verknüpfungen können nach Zugabe einer verhältnismäßig geringen (zumeist ungefähr stöchiometrischen) Konzentration an Thiol schnell gespalten werden. Wenn die Thiolkonzentration in der extrazellulären Flüssigkeit (z.B. Blutplasma oder Lymphe) im mikromolaren Bereich liegt, übersteigt die intrazelluläre Thiolkonzentration 1 mM, weitgehend aufgrund des Tripeptids Glutathion [Meister und Anderson, Annual Review of Biochemistry, 52 (1983), 711 - 760, insbesondere 715 - 718]. Disulfid-gebundene Konjugate, wie Immuntoxine, überstehen den Blutkreislauf innerhalb einer Zeitskala von zumindest einigen Stunden gut, werden aber dennoch, wenn sie erst einmal an die Zielzellen gebunden haben und eingedrungen sind, schnell gespalten, um das wirksame Toxin freizusetzen.
U.S. Patent Nr. 4.340.535 offenbart solche Disulfid-gebundenen Immuntoxine für den Fall, daß das Toxin die Ricin-A-Kette und der Antikörper entweder ein Immunglobulin insgesamt oder ein Immunglobulinfragment mit Bindungsspezifität für ein von einer Zelle getragenes Antigen ist. U.S. Patente Nrn. 4.350.626 und 4.450.154 beanspruchen Immuntoxine, bei welchen ein Fab- [oder Fab'-]-Fragment eines tumorspezifischen Antikörpers an die Ricin-A-Kette gebunden ist, wobei die Verknüpfung zwischen den von Cystein stammenden Thiolresten auf den beiden Proteinen mit oder ohne eine dazwischen liegende, bifunktionelle Verknüpfungsgruppe erfolgt. U.S. Patente Nrn. 4.357.273 und 4.638.049 beschreiben die entsprechenden Immuntoxine, wobei die Ricin-A-Kette durch das Diphtherietoxin ersetzt ist. U.S. Patent Nr. 4.543.211 offenbart Konjugate, bei welchen zytotoxische Substanzen an einen zellspezifischen Antikörper oder sein Fragment, über wenigstens ein Schwefelatom verknüpft sind. Das erste der vorstehend genannten Patente erfordert innerhalb der Verknüpfung eine Disulfidbindung. Die letzten vier gestatten das Herstellen derartiger spaltbarer Bindungen. Keine zeigt wie eine sterisch gehinderte Disulfidbindung gemacht werden könnte.
Neuere pharmakokinetische Untersuchungen an Disulfid-gebundenen Immuntoxinen zeigen, daß diese gegenüber der Spaltung im extrazellulären Kreislauf weniger inert sind, als man zuvor annahm [Blakey et al., Cancer Research, 47 (1987), 947 - 952; Worrell et al., Anti- Cancer Drug Design, 1 (1986), 179 - 188; Letvin et al., J. Clin. Invest., 77 (1986), 977 - 984]. Von dem Konjugat, welches nicht von den verschiedenen Geweben aus dem Blut aufgenommen wurde, wurde ein wesentlicher Teil innerhalb von acht Stunden nach der intravenösen Verabreichung gespalten; im wesentlichen war alles innerhalb von 24 Stunden gespalten, lange bevor die Gelegenheit zum Abtöten von Zielzellen ausgeschöpft war. Diese zerstörerische Nebenreaktion wird die Hauptbegrenzung der Immuntoxinwirksamkeit in vivo sein, da Antikörper das Toxin nicht auf die Zielzellen hin ausrichten können, wenn die zwei Moleküle erst einmal getrennt sind. Zudem kann der vom Konjugat freigesetzte Antikörper mit intaktem Immuntoxin um Bindungsstellen auf der Zelloberfläche konkurrieren. Entsprechend könnte der pharmazeutische Kenntnisstand durch die Gestaltung von verknüpften Wirkstoffen mit gesteigertem Widerstand gegen die Spaltung unter extrazellulären Bedingungen, welche aber eine genügende Unbeständigkeit zum intrazellulären Auseinanderbrechen innerhalb einer wirksamen Zeitskala beibehalten, weit vorangebracht werden.
Die Verknüpfung von Molekülen, insbesondere von Proteinmolekülen, kann mit homobifunktionalen oder heterobifunktionalen Reagenzien ausgeführt werden. Die Ersteren brauchen, um verbunden zu werden, Moleküle mit den gleichen reaktiven Gruppen. Aufgrund dieser Eingrenzung finden homobifunktionale Reagenzien wenig Verwendung auf dem aktuellen Fachgebiet der makromolekularen Konjugation. Heterobifunktional verknüpfte Reagenzien erfordern, um verbunden zu werden, Moleküle, nachstehend als Partner B bezeichnet, welche eine reaktive Gruppe besitzen, wie sie nicht auf dem Anderen, nachstehend als Partner A bezeichnet, gefunden werden, oder es ist ansonsten erforderlich, daß eine oder zwei funktionale Gruppen blockiert oder auf andere Weise stark in der Reaktivität verringert werden, während die andere Gruppe mit dem Partner A umgesetzt wird. In einem typischen zweistufigen Verfahren zur Herstellung von Heterokonjugaten wird Partner A mit dem heterobifunktionalen Agens umgesetzt, um ein derivatisiertes Partner A-Molekül zu bilden. Wenn die unumgesetzte funktionale Gruppe der Verknüpfung blockiert ist, dann wird sie entschützt. Nach dem Entschützen wird Partner B mit dem derivatisierten Partner A verbunden, um das Konjugat zu bilden. Primäre Aminoreste auf Partner A werden mit einem aktivierten Carboxylat- oder Imidatrest auf dem Verknüpfungsmolekül im Derivatisierungsschritt umgesetzt, und ein reaktiver Thiolrest oder ein blockierter und aktivierter Thiolrest am anderen Ende der Verknüpfung wird mit einer elektrophilen Gruppe oder mit einem reaktiven Thiolrest, beziehungsweise Partner B, umgesetzt. Wenn die Verknüpfung einen reaktiven Thiolrest besitzt, wird das Elektrophil auf Partner B vorzugsweise ein blockierter und aktivierter Thiolrest, ein Maleinimid oder ein Halogenmethylencarbonylrest (z.B. eine Bromacetyl- oder eine Iodacetylgruppe) sein. Da biologische Makromoleküle solche Elektrophile nicht von Natur aus enthalten, müssen sie Partner B in einer separaten Derivatisierungsreaktion hinzugefügt werden. Wenn die Verknüpfung einen blockierten und aktivierten Thiolrest besitzt, kann der Thiolrest auf Partner B, mit welchem er umgesetzt wird, natürlicher Herkunft sein. Nur wenn ein Thiolrest mit einem blockierten und aktivierten Thiolrest umgesetzt wird, kann man darauf vertrauen, daß ein Heterokonjugat mit einer spaltbaren Disulfidbindung hergestellt wird; welcher Partner welche Thiolart bereitstellt beeinflußt die Endstruktur des Konjugats nicht.
Bis vor kurzem wurden drei heterobifunktionale Verknüpfungsreagenzien, überwiegend unter vollständigem Ausschluß von anderen, bei der Herstellung von Disulfid-gebundenen Konjugaten, einschließlich den Immuntoxinen verwendet, nämlich 3-(2-pyridyldithio)propionsäure-N-succinimid (SPDP) [Carlson et al., Biochem. J., 173 (1978), 727 - 737], 2-Iminothiolan (IT) [Jue et al., Biochemistry, 17 (1978), 5399 - 5406] und S-Acetyl-mercaptobernsteinsäure-anhydrid (SAMSA) [Klotz und Heiney, Arch. Biochem. Biophys., 96 (1962), 605 - 612]. Alle drei reagieren bevorzugt mit primären Aminen (z.B. Lysinseitenketten), um einen Amid- oder Amidinrest zu bilden, welche einen Thiolrest über eine kurze verbindende Zwischenkette, die ein bis drei Kohlenstoffatome lang ist, an das derivatisierte Molekül (z.B. ein Protein, wie einen Antikörper) bindet. Die Unterschiede zwischen diesen Molekülen veranschaulichen die taktischen Möglichkeiten bei der Herstellung von Disulfid-gebundenen Konjugaten.
Mit SPDP derivatisierte Moleküle besitzen einen blockierten und aktivierten Thiolrest, welcher für den Angriff durch einen anderen Thiolrest auf einem anderen Molekül bereit ist, um ein Disulfid-gebundenes Konjugat zwischen den zwei Molekülen zu bilden. In einer anderen Ausführungsform ersetzt die Behandlung mit einer ausreichenden Konzentration eines Thiolrests mit niedrigem Molekulargewicht, wie 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, die Blockierungsgruppe, um einen reaktiven Thiolrest auf dem derivatisierten Molekül zu hinterlassen, welches einen blockierten und aktivierten Thiolrest eines anderen Moleküls angreifen kann, um ein Konjugat zu bilden, welches in der Struktur mit dem eben zuvor beschriebenen identisch ist. Das Schwefelatom, welches das SPDP zu der endgültigen Disulfidbindung beitragt, erfahrt auf die eine oder andere Art eine kleinstmögliche sterische Hinderung, wenn es an eine Methylengruppe eines geradenkettigen Zwischenstücks gebunden ist. Mit IT derivatisierte Moleküle besitzen einen reaktiven Thiolrest, welcher entweder mit einem blockierten und aktivierten Thiolrest auf einem anderen Molekül reagieren kann oder selbst, durch die Umsetzung mit einem chromogenen Aryldisulfid, wie 2,2'-Dithiopyridin 4,4'-Dithiopyridin oder 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure), blockiert und aktiviert sein kann. Andere Reagenzien zur Blockierung von Thiolresten, welche zahlreiche Aktivierungsgrade hin zu einem weiterem Thiol-Disulfid-Austausch, erzeugen können, schließen Alkyl-alken-thiosulfonate, Alkoxycarbonylalkyl-disulfide und zahlreiche Sulfenylchloride [Smith et al., Biochemistry, 14 (1975), 766-771; Carlsson et al., s.o.] ein. Auch hier ist das Schwefelatom, welches die Verknüpfung zum endgültigen Konjugat beiträgt, an eine Methylengruppe eines geradkettigen Zwischenstücks gebunden. Mit SAMSA derivatisierte Moleküle besitzen einen blockierten Thiolrest, welcher nicht für eine Reaktion mit einem anderen Thiolrest aktiviert ist. Der blockierende Alkylrest muß durch ein starkes Nucleophil, am üblichsten ist Hydroxylamin, ersetzt werden, um einen reaktiven Thiolrest, welcher wie im Falle von IT umgesetzt werden kann, freizusetzen. Jedoch ist dieser Thiolrest sterisch stärker gehindert als im Fall von SPDP oder IT, wo entweder ein Carboxylat- oder ein Carboxymethylrest von der Zwischenkette des Kohlenstoffatoms, an welchem der Thiolrest gebunden ist (eine "alpha"- Position für den Thiolrest), abzweigt. Die Zweideutigkeit im Hinblick auf den Verzweigungsrest ist zurückzuführen auf die Asymmetrie von SAMSA, welche es dem nucleophilen Aminrest gestattet, entweder mit der Carbonylgruppe, die an dem schwefel-tragenden Kohlenstoffatom angebracht ist, oder an einer, ein Kohlenstoffatom weiter entfernten Carbonylgruppe zu reagieren. Außerdem kann der Thiolrest, der von SAMSA abstammt, chemisch durch die negative Ladung des Carboxylat- oder Carboxymethylzweigs aktiviert oder deaktiviert werden; die genaue Art diese Nachbargruppeneffekts hängt wahrscheinlich von der spezifischen Reaktion ab, in welche der Thiolrest miteinbezogen ist.
Vor kurzem wurden zwei neue Familien von verknüpfenden Reagenzien offenbart, welche blockierte Thiolreste enthalten und in der α-Position zum Thiolrest, wie in der Weise bei SAMSA, einfach verzweigt sind, und welche dazu verwendet wurden, Moleküle über sterisch gehinderte Disulfidbindungen zu verbinden. 3-(2-pyrdidyldithio)butansäure-N-succinimid (SPDB) [Worrell et al., s.o.] ist strukturell mit SPDP identisch, ausgenommen, daß es in der α-Position zum Schwefelatom, welches durch 2-Thiopyridin blockiert und aktiviert wird, einen einfachen Methylgruppenzweig enthält. SMPT und SMBT [Thorpe et al., Cancer Research 47 (1987), 5924 - 5931] enthalten eine Phenylmethyl-Zwischenkette zwischen einem N-Hydroxysuccinimid-aktivierten Carboxylrest und dem blockierten Thiolrest; beide, der Thiolrest und ein einfacher Methylgruppenzweig, sind an das aliphatische Kohlenstoffatom der Zwischenkette gebunden. Das SMBT-Thiol wird durch Sulfit blockiert, um ein Thiosulfat zu bilden, welches gespalten werden muß, um einen reaktiven Thiolrest freizusetzen, bevor die Verknüpfung erfolgen kann. Das SMPT-Thiol wird in der Weise des SPDP über eine Disulfidbindung an 2-Thiopyridin blockiert und aktiviert. Angaben von Thorpe et al. [s.o.] legen nahe, daß der Benzolring in der SMBT- und in der SMPT-Zwischenkette die Reaktivität des Thiolrests stärker behindert, als es die aliphatischen, geradkettigen Zwischenstücke in SPDP, IT oder SPDB tun, wahrscheinlich, weil er in der β-Position zum Thiolrest Verzweigung hervorruft und möglicherweise aufgrund der verminderten Beweglichkeit. Bis heute wurde die Verwendung von SPDB und SMPT lediglich für Kupplungsreagenzien berichtet, bei welchen der reagenz-derivatisierte Antikörper mit einem anderen Molekül, das einen freien Thiolrest trägt, umgesetzt wird. Es scheint, daß das Deblockieren der Reagenzien für den Thiolangriff auf den aktivierten Thiolrest eines anderen Moleküls nicht durchgeführt wurde.
Der wichtige, funktionelle Vorteil dieser neuartigen disulfid-bildenden Verknüpfungen, welche nur am α-Kohlenstoffatom verzweigt sind, ist, daß sie zu weniger einfach gespaltenen Disulfidbindungen führen, als es unverzweigte Verknüpfungen tun; über einen Vergleich mit SAMSA wurde unter diesem Hinblick nichts berichtet. Diese Ergebnis wurde in modellhaften Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen in vitro und durch Studien des Überlebens von Immuntoxinen im Blutkreislauf in vivo herausgefunden [Worrell et al., s.o.; Thorpe et al., s.o.]. Der erhöhte Widerstand gegen Spaltung in vivo steht in Beziehung mit verlängerten Bluttoleranzzeiten, welche die Abgabe von Immuntoxin an die Zielzellen erhöhen soll, insbesondere, wenn die Letzteren Teil eines festen Tumors sind. Jedoch haben weder Worrell et al. [s.o.] noch Thorpe et al. [s.o.] erfolgreich Immuntoxin mit Disulfid-Verknüpfungen synthetisiert, welche in der α-Position zum Thiolrest einfach verzweigt sind und die eine verbesserte Tumor- Wachstumsunterdrückung oder -Abtragung zeigen.
Die Entwicklung von sterisch gehinderten Disulfid-Verknüpfungen, wie Moleküle mit zwei Methylgruppen, welche an das thiol-tragende Kohlenstoffatom der Zwischenkette gebunden sind, ist vor der augenblicklichen Erfindung erfolglos gewesen. Worrell et al. [s.o.] haben 3-(2-Pyridyldithio)isovaleriansäure, eine mögliche Zwischenstufe in der Synthese eines zweifach verzweigten Analogen zu SPDP, hergestellt, aber waren nicht in der Lage diese durch Aktivierung der Carboxylgruppe mit N-Hydroxysuccinimid in eine Verknüpfung zu überführen.
Worrell et al. [s.o.] haben die Reaktivität des Thiol-Disulfid-Austauschs von sterisch gehinderten, aktivierten Disulfiden dieses Moleküls mit den Reaktivitäten von Analoga, welche in der α-Position zum aktivierten Thiolrest einfach verzweigt und unverzweigt sind, verglichen. Eine einzelne Methylgruppe in der α-Position verminderte die Reaktivität um eine Größenordnung, eine zweifache Verzweigung verminderte die Reaktivität um drei Größenordnungen. Wenn ein Weg gefunden werden könnte, die gehinderten Disulfide in ein Konjugat einzubringen, könnte das Letztere ein von Grund auf verbessertes Überleben in vivo, gegenüber den Disulfid-gebundenen Konjugaten mit einzelner Verzweigung, welche den derzeitigen Stand der Technik darstellen, besitzen. Jedoch besteht auch die Möglichkeit, daß diese Konjugate dermaßen inert gegen den Thiol-Disulfid-Austausch wären, daß sie nicht mehr wirksam die Zielzellen abtöten könnten.
Vor der vorliegenden Erfindung wurden sterisch gehinderte Disulfid-Verknüpfungen, welche an dem thiol-tragenden Kohlenstoffatom der Zwischenkette zwei Methylgruppen gebunden haben, nicht synthetisiert; und es gab keine Garantie, daß, falls solche Verbindungen hergestellt werden könnten, diese auch Immuntoxine mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften ergeben würden. Die vorliegende Erfindung offenbart Verfahren zur Synthese sterisch gehinderter Disulfid-Verknüpfungen, die unter denen die bekannt sind ausdrücklich einzigartig sind. Mit diesen Kupplungsmitteln hergestellte Immuntoxinkonjugate besitzen ein verbessertes in vivo Überleben und eine erhöhte tumortötende Aktivität.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung überwindet die vorstehend beschriebenen Probleme durch die Bereitstellung einer Familie heterobifunktionaler Kupplungsmittel, welche, wenn sie nach den beschriebenen Verfahren verwendet werden, Konjugate mit gehinderten Disulfidbindungen ergeben, bei denen das thiol-tragende Kohlenstoffatom des Kupplungsmittels an zwei Methylgruppen gebunden ist.
Durch die Verwendung dieser Kupplungsmittel können Materialien, die primäre und sekundäre Amine enthalten, zu thiol-haltigen Materialien verbunden werden, oder thiol-haltige Materialien können zu anderen thiol-haltigen Materialien verbunden werden. Außerdem kann das Kupplungsmittel, welches die verbundenen Materialien trennt, bezüglich dem Gehalt und der Länge der bivalenten organischen Zwischenkette verändert werden.
Als ein Gesichtspunkt stellt die Erfindung Reagenzien und Verfahren zur Kupplung von Materialien, die primäre und sekundäre Amine enthalten, mit thiol-haltigen Materialien bereit.
In einer ersten Ausführungsform dieses Gesichtspunktes werden Kupplungsmittel der folgenden allgemeinen Struktur beschrieben
R&sub1;-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;,
wobei n zwischen 1 und 20 beträgt, R&sub1;
ist, R&sub2; -H, -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; oder -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt dieser Gesichtspunkt Derivate von an die Kupplungsmittel gebundenen Materialien, die primäre und sekundäre Amine enthalten, der folgenden Formel
A[-NH-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;]x,
wobei A ein Material ist, das ein primäres oder sekundäres Amin enthält, welches durch das Stickstoffatom des Amins an das Kupplungsmittel gebunden ist, x die Zahl der derivatisierten Amine auf A ist und R&sub2; -H, -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; oder -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; ist.
In einer dritten Ausführungsform umfaßt dieser Gesichtspunkt Konjugate und Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate, welche die Amin-an-Thiol-Kupplungsmittel verwenden und die folgende Struktur besitzen
A[-NH-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-C(CH&sub3;)&sub2;-S-S-B]x,
wobei A ein Material sein kann, das entweder ein primäres oder ein sekundäres Amin enthält, welches durch das Stickstoffatom seines Amins an das Kupplungsmittel gebunden ist; -CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-C(CH&sub3;)&sub2;-S- das Kupplungsmittel ist, welches ein gehindertes Schwefelatom enthält, das an ein Kohlenstoffatom mit zwei gebunden Methylgruppen gebunden ist, B ein thiol-haltiges Material ist, welches an das gehinderte Schwefelatom durch die Disulfidbindung gebunden ist, n zwischen 1 und 20 beträgt, und x die Zahl der gebundenen Amine auf A ist.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt dieser Erfindung werden Reagenzien und Verfahren zur Kupplung der thiol-haltigen Materialien mit anderen thiol-haltigen Materialien bereitgestellt.
In einer ersten Ausführungsform dieses zweiten Gesichtspunktes werden Kupplungsmittel der folgenden Formel beschrieben
R&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;,
wobei R&sub1;
ist, Z Cl, Br oder I ist; R&sub2;
ist, wobei n zwischen 1 und 20 und w zwischen 1 und 100 beträgt; und R&sub3; -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; oder -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt dieser zweite Gesichtspunkt an die Kupplungsmittel gebundene Derivate eines thiol-haltigen Materials, der folgenden Formel
A-[S-R'&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;]x,
wobei A das thiol-haltige Material ist, welches durch das Schwefelatom seines Thiolrests kovalent an das Kupplungsmittel gebunden ist, x die Zahl der gebunden Schwefelatome an A ist; R'&sub1;
ist, R&sub2;
ist, wobei n zwischen 1 und 20 und w zwischen 1 und 100 beträgt; und R&sub3; -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5;, -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; oder -H ist.
In einer weiteren Ausführungsform schließt dieser Gesichtspunkt Konjugate und Verfahren zur Herstellung derartiger Konjugate, welche die Thiol-an-Thiol-Kupplungsmittel der folgenden Formel
A-[S-R'&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-S-B]x,
verwenden, ein, wobei A das thiol-haltige Material ist, welches durch das Schwefelatom seines Thiolrests an das Kupplungsmittel gebunden ist, x die Zahl der Schwefelatome auf A ist, welche durch das Kupplungsmittel an B gebunden sind; R'&sub1;
ist; R&sub2;
ist, wobei n 1 bis 20 beträgt, w 1 bis 100 beträgt; und B das gleiche oder ein anderes thiolhaltiges Material ist.
In einem dritten Gesichtspunkt der Erfindung werden Verfahren zur Synthese der Aminan-Thiol-Kupplungsmittel der Formel
R&sub1;-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub2;
beschrieben, wobei R&sub1;
ist, R&sub2; ein Alkyl- oder ein Arylrest ist, und n zwischen 1 und 20 beträgt, umfassend die Schritte:
(a) Umsetzen eines Dimethylacryloylhalogenids der Formel
W-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;,
wobei W ein Chlor- oder Bromatom ist, mit einen Aminoalkylencarbonsäure-alkylester mit kurzer Alkylkette der Formel
Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH&sub2;,
wobei Y gewählt wird aus
(CH&sub3;)&sub3;C-, H&sub3;C- und H&sub5;C&sub2;-
in einem Lösemittel, welches eine säureneutralisierende Verbindung enthält, um ein Produkt der Formel
Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;
zu bilden;
(b) Umsetzen des Produkts aus Schritt (a) mit einer Thiosäure der Formel
H-S-CO-R&sub2;,
bei welcher R&sub2; wie vorstehend definiert ist, in einer Reaktion vom Michael-Typ, um ein Produkt der Formel
Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub2;
zu bilden;
(c) Umsetzen des Produkts aus Schritt (b) mit einer Säure, um ein Produkt der Formel:
HOOC-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub2;
zu bilden;
(d) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel in Gegenwart eines Carbodiimids mit Natrium[4-hydroxy-3-nitro]benzol-sulfonat (HNSA), um ein Produkt der Formel
zu bilden;
oder
(e) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel in Gegenwart eines Carbodiimids mit Sulfo-N-hydroxysuccinimid, um ein Produkt der Formel
zu bilden;
oder
(f) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel in Gegenwart eines Carbodiimids mit N-Hydroxysuccinimid, um ein Produkt der Formel
zu bilden.
Als vierten Gesichtspunkt beschriebt diese Erfindung Verfahren zur Synthese von Thiolan-Thiol-Kupplungsmitteln der Formel
R&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;,
wobei R&sub1; gewählt wird aus
wobei Z ein aus der Gruppe, bestehend aus Cl, Br und I gewähltes Halogenatom ist; R&sub2; eine acylische aliphatische Zwischenkette, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus
ist, wobei n zwischen 1 und 20 beträgt, w zwischen 1 und 100 beträgt; und R&sub3; ein Alkyl- oder Arylrest ist, umfassend die Schritte:
(a) Umsetzen eines Dimethylacryloylhalogenids der Formel
W-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;,
in welcher W ein Chlorid oder Bromid ist, mit entweder einem 1-t-Butoxycarbonylalkandiamin oder einem 1-t-Butoxycarbonylalkyloxydiamin der Formel
(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;-NH&sub2;,
in welcher R&sub2; wie vorstehend definiert ist in einem Lösemittel, welches eine säureneutralisierende Verbindung enthält, um ein Produkt der Formel
(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;
zu bilden;
(b) Umsetzen des Produkts aus Schritt (a) mit einer Thiosäure der Formel
H-S-CO-R&sub3;,
bei welcher R&sub3; wie vorstehend definiert ist, in einer Reaktion vom Michael-Typ, um ein Produkt der Formel
(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;
zu bilden;
(c) Umsetzen des Produkts aus Schritt (b) mit einer Säure, um ein Produkt der Formel
NH&sub2;-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;
zu bilden;
(d) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel mit 6-Maleinimidohexansäure-Natrium(4-hydroxy-3-nitro)benzol-sulfonat, um ein Produkt der Formel
zu bilden;
oder
(e) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel mit 4-(N-Maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure-succinimid, um ein Produkt der Formel
zu bilden;
oder
(f) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel mit einer Verbindung der Formel
in welcher Z wie vorstehend definiert ist, um ein Produkt der Formel
Z-CH&sub2;-CO-NH-(CH&sub2;)&sub5;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;
zu bilden;
oder
(g) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel mit einer Verbindung der Formel
in welcher Z wie vorstehend definiert ist, um ein Produkt der Formel
Z-CH&sub2;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;
zu bilden.
Als fünften Gesichtspunkt beschreibt die Erfindung Verfahren zum Abtöten menschlicher Krebszellen mit einer zytocidal wirksamen Menge eines Konjugats eines Toxins und eines Anti-Tumor-Antikörpers, wobei die gehinderten Disulfid-Kupplungsmittel verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die chemischen Formeln der Amin-an-Thiol-Kupplungsmittel.
Figur 2 zeigt das Reaktionsschema zur Synthese des HNSA-Esters, des NHS-Esters und des Sulfo-NHS-Esters der in Figur 1 gezeigten Amin-an-Thiol-Kupplungsmittel.
Figur 3 zeigt die chemischen Formeln der Thiol an-Thiol-Kupplungsmittel.
Figur 4 zeigt das Reaktionsschema zur Synthese eines in Figur 3 gezeigten Thiol-an- Thiol-Kupplungsmittels.
Figur 5 ist ein Autoradiogramm eines SDS-PAGE-Gels, welches die in vivo-Stabilität von mit ³&sup5;S-Methionin-markiertem 260F9-IT-rRTA zeigt.
Figuren 6 (a) - (d) sind Autoradiogramme von SDS-PAGE-Gelen, welche die in vivo- Stabilität von ³&sup5;S-Methionin-markiertem 260F9-PL-rRTA zeigen.
Figur 7 ist eine graphische Darstellung, die das Tumorvolumen gegen die Zeit als Antwort auf die Dosis an 260F9-PL-rRTA und 260F9-IT-rRTA im MX-1-Tumormodell zeigt.
Figur 8 ist eine graphische Darstellung, welche die pharmakokinetischen Pararmeter von 260F9-PL-rRTA, 260F9-IT-rRTA und 260F9-SMCC-rRTA bei nackten Mäusen zeigt.
Figur 9 ist eine graphische Darstellung, welche die pharmakokinetischen Pararmeter von 260F9-PL-rRTA, 260F9-IT-rRTA und 260F9-SMCC-rRTA bei Craig-Dawley-Ratten zeigt.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

A. Definitionen

Wie hier verwendet, haben die Bezeichnungen die folgenden Bedeutungen:
"Amin-haltiges Material" steht für andere Verbindungen als Aminosäuren, welche primäre oder sekundäre Amine enthalten, die frei sind, um mit dem(n) Kupplungsmittel(n) dieser Erfindung unter Bildung einer Amidbindung zu reagieren. Derartige Materialien schließen nicht nur natürlich vorkommende Materialien, sondern auch die rekombinanten, durch Mutation oder chemisch veränderten Äquivalente ein. Am meisten werden Materialien bevorzugt, die primäre Amine enthalten, wie zum Beispiel Proteine oder Peptide, die Lysin-Aminosäuren enthalten, wobei ein primäres Amin an der &epsi;-Position der aliphatischen Kette vorliegt. Beispiele für solche Materialien schließen Antikörper oder Antikörperfragmente, Trägerproteine, wie Rinderserumalbumin, "Key-hole-Limpet"- Hämocyanin (KLH), Ovalbumin, Enzyme, Toxine, Hormone, Wachstumsfaktoren, aminhaltige Lipidvesikel, Polypeptide, Zellen, Viruspartikel, chromatographische Matrizes, Lymphokine und Zytokine, wie in der Definition der thiol-haltigen Materialien beispielhaft ausgeführt, Polyamine, einschließlich Polymere, die sekundäre Amine enthalten, wie Poly(ethylenamin), Poly(vinylamin), aminierte, chromatographische Trägersubstanzen, wie aminierte Sepharose, aminiertes Kieselgel, und amin-haltige Membranen, wie aminiertes Nylon, oder aminierte Kunststoffe, wie Poly(styrol), ein.
Das amin-haltige Material ist vorzugsweise ein Protein, Peptid oder Polypeptid, welches ein primäres Amin enthält, stärker bevorzugt eines, das spezifisch an Zellen bindet, stärker bevorzugt ein Antikörper oder ein Antikörperfragment, und am meisten bevorzugt ein monoklonaler Anti-Tumor-Antikörper (einer, der menschliche Krebszellen erkennt), wie diejenigen, welche gegen Brust- und/oder Eierstockkrebs gerichtet sind. Es sollte angemerkt werden, daß ein Material, je nach Wunsch, ein natürlich vorkommendes Material sein kann oder von synthetischer Herkunft sein kann, z.B. Poly(lysin) oder synthetische Polypeptide, oder ähnliche.
"Thiol-haltiges" Material steht für andere Verbindungen als Aminosäuren, welche Thiolreste enthalten, die frei sind, um mit den konjugierten Verbindungen hierin zu reagieren, um eine Disulfid- oder eine Thioetherbindung zu bilden. Derartige Materialien schließen nicht nur natürlich vorkommendes Material ein, sondern auch die rekombinanten, durch Mutation oder chemisch veränderten Äquivalente ein. Beispiele sind die Ricintoxin-A- oder -B-Kette, Diphtherietoxin-A- oder -B-Kette, Fab'-Fragmente, Toxin, Zytokine mit Thiolresten, die nicht für ihre biologische Aktivität notwendig sind, wie z.B. Interleukin-2, Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs), wie M-CSF, GM-CSF und G-CSF, Interleukin-1, Interleukin-3, Interleukin-4, Interferone (IFNs), wie IEN-α, 1FN-β und 1FN-γ, ebenso wie andere therapeutisch wichtige Proteine, wie Gewebeplasminogenaktivatoren. Als thiol-haltige Materialien sind auch unlösliche Matrizes, wie chromatograpische Materialien, derivatisierte Polysaccharide, Kieselgel- Derivate, welche einen Thiolrest enthalten, eingeschlossen. Zudem umfaßt die Bezeichnung inerte Materialien, wie Polystyrol-Perlen, die derivatisiert wurden, um Thiolreste zu enthalten. Enzymatisch aktive Toxine aus Bakterien, Pilzen oder Pflanzen, oder Fragmente derartiger Toxine werden bevorzugt und als Beispiele dienen: Diphtherietoxin-A-Kette, Exotoxin-A- Kette (von Pseudomonas aeruginosa), Ricintoxin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A- Kette, α-Sarkin, Aleurites fordii-Proteine, Dianthinproteine, Phytolacca americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica Charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Saponaria officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin und Enomycin. Stärker bevorzugt werden die Ricintoxin-A-Kette, nichtbindende, aktive Fragmente des Diphtherietoxins, Abrin-A-Kette, PAPII und Fab'-Fragmente. Besonders werden die Ricintoxin-A-Kette und Fab'-Fragmente bevorzugt.
"Ricintoxin-A-Kette" steht für ein Protein, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen der des Ricin-A-Peptids des Ricintoxins ähnhch ist, welches aus den Samen der Ricinusbohne extrahiert werden kann. Das Ricin-A der Ricinusbohne weist eine Länge von ungefähr 265 Aminosäuren auf und hat ein Molekulargewicht von ungefähr 32.000 Dalton. Es ist jedoch bekannt, daß sich die genaue Abfolge in Abhängigkeit von der Bohnensorte ändert, und daß sogar wenigstens zwei leicht unterschiedliche Formen von Ricin-A in einer einzelnen Sorte vorkommen können.
Die Ricintoxin-A-Kette kann aus natürlichen Quellen oder durch rekombinante Mittel erhalten werden. Gemäß einem Verfahren kann zum Beispiel die Ricin-Untereinheit-A aus natürlichen Quellen durch Extraktion und Reinigung des Ricins aus den Samen von Ricinus communis und Abtrennen der Untereinheit-A vom Ricin, nach dem Verfahren von S. Olsnes und A. Pihl, Biochemistry, 12 (1973), 3121 - 3126, erhalten werden. Die derart erhaltene Lösung der Untereinheit-A enthält 2-Mercaptoethanol (ME) und wird daher unmittelbar vor ihrer Verwendung einer Chromatographie an einer Sephadex G25-Säule unterworfen, welche mit 5 mM Acetatpuffer - 0,14 M Natriumchlorid - 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) äquilibriert wird (pH 5,5), um ME zu entfernen. Um festzustellen, ob Untereinheit-B oder intaktes Ricin vorhanden ist, kann SDS-PAGE verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform kann die Ricin-Untereinheit-A durch rekombinante Mittel erhalten werden, wie beispielsweise nach dem in U.S. Patent Nr. 4.689.401 offenbarten Verfahren, veröffentlicht am 25. August 1987, dessen Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist.
"F(ab)'-Fragmente", wie hier verwendet, steht für die F(ab)'-Bereiche oder -Fragmente des Immunglobulinmoleküls. Diese Bereiche können durch enzymatischen Abbau des Antikörpers, wie den Pepsinabbau, gefolgt von einer reduktiven Spaltung des derart hergestellten Fragments, erzeugt werden. Der Abbau kann unter beliebigen, einem Fachmann bekannten Bedingungen erfolgen. Eine naheliegende Bedingung ist, eine Lösung von gereinigtem IgG in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5) zu erhalten und diese bei 37ºC etwa 18 Stunden lang mit Pepsin umzusetzen. Das Abbauprodukt wird dann der Chromatographie an einer Sephadex G200- Säule in Kochsalzlösung unterzogen, um Protein zu entfernen, das bei einem Molekulargewicht entsprechend dem besonderen Fragment, das gewünscht wird, eluiert wird. Die Reinheit und die Identität des Fragments kann z.B. mittels Elektrophorese mit SDS-PAGE bestimmt werden. Nach der Reduktion kann das Produkt der Chromatographie an einer Sephadex G25-Säule, die mit 5mM Acetatpuffer - 0,14 M Natriumchlorid - 1 mM EDTA äquilibriert worden ist (pH 5,5), unterzogen werden, um das Reduktionsmittel (z.B. 2-Mercaptoethanol) zu entfernen und um das Fab'-Fragment mit einem Thiolrest zu ergeben.
Die Antikörpertypen, welche verwendet werden können, schließen Immunglobuline, die durch Immunisieren eines Saugers mit einem geeigneten Antigen unter auf dem Fachgebiet gut bekannten Bedinungen erhalten wurden, oder monoklonale Antikörper, die typischerweise mit Hilfe der Hybridoma-Technologie erhalten werden, welche ebenfalls auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (siehe z.B. Taylor-Papadimitriou et al., Int. J. Cancer, 28 (1981), 17 - 21, und Yuan et al., JNCI, 68 (1982), 719 - 728), ein.
Beispiele für die Arten von hier wirksamen, monoklonalen Antikörpern schließen die in der Europäischen Veröffentlichung Nr. 153.114, veröffentlicht am 28. August 1985, beschriebenen, deren Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, ein. Solche Antikörper binden selektiv an menschliche Brustkrebszellen, sind vom G- oder M-Isotyp, und weisen, wenn sie an die Ricin-A-Kette konjugiert sind, gegenüber der Proteinsynthese eine Gewebekulturenhemmungsdosis, die um 50% niedriger als bei der unbehandelten Kontrolle (TCID 50%) von weniger als etwa 10 mM ist, auf, wenn sie an zumindest einer der Zell- Linien MCF-7, CAMA-1, SKBR-3 oder BT-20 getestet werden. Für die Beschreibung repräsentative monoklonale Antikörper schließen 260F9, 113F1, 2G3, 280D11, 266B2, 245E7, 33F8, 454C11, 317G5, 520C9, 369F10, 260F9-1C9, 317G5 (CTCC 0055), 106A10, 452F2, 650E2, 741F8 und 759E3 ein. Die Hybridome, die diese Antikörper herstellen, sind alle bei Hinterlegungsstellen gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt und nachstehend beschrieben.
Andere Arten von monoklonalen Antikörpern werden durch die Europäische Veröffentlichung Nr. 226.419, veröffentlicht am 24. Juni 1987, deren Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, beschrieben. Die Antikörper binden an menschliches Eierstockkrebsgewebe, sind IgGs oder IgMs und haben eine der folgenden Fähigkeiten: ein TCID 50 von 10 nM oder weniger gegen menschliche Eierstockkrebszellen, die Fähigkeit die Wachstumsgeschwindigkeit menschlicher Eierstockkrebszellen, welche von einem mit einem Immuntoxin eines solchen Antikörpers behandelten Säuger getragen werden, zu verlangsamen oder sie besitzen die Fähigkeit die Lebensdauer eines Säugers, das einen menschlichen Eierstockkrebstumor trägt, zu verlängern, wenn der Säuger mit dem Immuntoxin behandelt wird. Die bevorzugten Antikörper schließen z.B. 2G3, 280D11, 266B2, 245E7, 317G5, 369F10, 454C11, 788G6, 33F8, 260F9, 9C6, 44B2, 44F4, 120H7, 200F9, 204F4, 219F3, 388D4, 421E8, 871E3, 451C3, 650E2 und 454A12 oder dazu äquivalente, monoklonale Antikörper ein. Die Hybridome, die diese Antikörper herstellen, sind alle bei einer Hinterlegungsstelle nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
"Säureaktivierende Austrittsgruppe" steht für den OR-Teil eines Esters (COOR), d.h. eine Austrittsgruppe in der Umsetzung zwischen dem Ester und einem primären oder sekundären Amin, um eine Amidbindung zu bilden. Beispiele für derartige Austrittsgruppen schließen
ein.
"Thiolblockierende Einheit" steht für Verbindungen, die an das Schwefelatom eines Thiolrests kovalent binden und auf diese Wiese die nucleophile und reduktive Reaktivität der Thiolreste schützen. Beispiele für solche thiol-blockierende Einheiten schließen -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; und -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; ein.
"Thiol-reaktive Einheit" steht für Alkylierungsverbindungen, die mit dem Schwefelatom des Thiolrest reagieren können, um eine neue Kohlenstoff-Schwefel-Bindung zu bilden und dadurch eine Thioetherbindung zu erzeugen. Beispiele für thiol-reaktive Einheiten schließen
ein, wobei Z ein Cl, Br oder I ist.
"Thiolrest(e) wurde(n) aktiviert" steht für die Umsetzung des Schwefelatoms eines thiol-haltigen Materials mit einem elektrophilen, aromatischen Disulfid, wie zum Beispiel 5,5'-Dithiobis(2-nitro-benzoesäure) (DTNB), 2,2'-Dithiodipyridin (2,2'-DTDP) und 4,4'-Dithiodipyridin (4,4'-DTDP).
"Reaktion vom Michael-Typ" steht für eine nucleophile Addition eines Nucleophils an ein Substrat der Form -C=C-Z, wobei Z CHO, COR, COOR, CONH&sub2;, CN, NO&sub2;, usw. ist, wobei das Nucleophil an das vom Z-Rest entfernte Kohlenstoffatom bindet. Zum Beispiel wird die Addition des nucleophilen Schwefelatoms einer Thiosäure, H-S-CO-R, wobei R für -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5; oder -(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; steht, an ein Substrat -CH=C(CH&sub3;)&sub2; das Produkt
-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R
ergeben.
"1-t-Butoxycarbonylalkandiamin" steht für ein Alkan, welches ein Butoxycarbonyldiamin enthält, wobei das Alkan eine zweiwertige, kovalente Zwischenketteneinheit, -(CH&sub2;)n-, ist, und n zwischen 1 und 20, jeweils einschließlich, beträgt.
"1-t-Butoxycarbonylalkyloxydiamin" steht für eine Alkoxy-Verbindung, welche ein Butoxycarbonyldiamin enthält, wobei als Beispiele für den Alkoxyrest oder die zweiwertigen, kovalenten Zwischenketteneinheiten Dioxadodecan derivatisiert aus Polyethylenglykol derivatisiert aus Jeffamine ED, Texaco Chemical Co.
dienen und w eine ganze Zahl zwischen 1 und 100 ist.
Zweiwertige, kovalente Zwischenketteneinheiten werden gewählt, um eine Trennung zwischen der thiol oder der amin-reaktiven Gruppe am eine Ende des Kupplungsmittels und der thiol-reaktiven Gruppe am anderen Ende des Kupplungsmittels zu schaffen. Üblicherweise wird beobachtet, daß eine enge Nähe zwischen den Kupplungseinheiten (zum Beispiel einem Antikörper und einem Toxinprotein) nachteilig ist und daß eine zunehmende Trennung von Vorteil ist.
Bei der Auswahl der Zwischenketteneinheiten ist es im allgemeinen wünschenswert Reste zu meiden welche in physikalischem, chemischem oder immunologischem Sinn mit den Einheiten, die innerhalb der verwendeten Umgebung vorhanden sind, in bedeutsamer Weise wechselwirken. Da das Kupplungsmittel üblicherweise in einem wäßrigen Medium verwendet wird, sollten die Zwischenketteneinheiten typischerweise nicht mit dem wäßrigen Medium reagieren und sollten nicht übermäßig hydrophob sein. Falls die Zwischenkette wesentliche hydrophobe Bereiche besitzt, können diese an hydrophobe Bereiche der gekoppelten Materialien binden und gemeinsam ausfallen.
Mit diesen allgemeinen Überlegungen im Kopf, sind acyclische, aliphatische Verbindungen als Zwischenketteneinheiten am meisten zu bevorzugen. Typische acyclische, aliphatische Zwischenketten können verzweigte oder gerade Ketten sein. Sie können von 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatome in der Kette enthalten. Bevorzugte acyclische, aliphatische Zwischenketten enthalten von etwa 2 bis etwa 8 Kohlenstoffatome in der Zwischenkette und sind gesättigt. Beispiele für acyclische, aliphatische Zwischenketten schließen Ethylen, Propylen, Butylen, 2,4-Dimethylbutylen, Pentylen, 2-Methylpentylen, n-Hexylen, Decylen und ähnliche ein.
Eine andere Gruppe von nützlichen Zwischenketten schließt sauerstoff-haltige, zweiwertige Einheiten ein. Die Sauerstoffatome können als Ether-Sauerstoffatome vorhanden sein. Ether neigen dazu die Hydrophobie zu vermindern und den hydrophilen Charakter der Zwischenkette zu verstärken. Sie sind auch aus dem sehr pragmatischen Grund von Vorteil, daß deratige Materialien im Handel erhältlich sind.
Stellvertretende sauerstoff-haltige Zwischenketten schließen Poly(ethylenglykol)ether und Poly(oxyalkylamin)e, wie die Jeffamine, ein.
"Zytocidal wirksame Menge" steht für eine Menge an Konjugat, welche wirksam ist, die fraglichen, menschlichen Krebszellen abzutöten.
Die thiol-haltigen Materialien können entweder an das gleiche oder an verschiedene andere thiol- oder amin-haltige Materialien, welche Thiolreste oder Amine enthalten, mittels der hierin beschriebenen Kupplungsmittel gebunden werden, um verknüpfte Proteine oder Peptide, Immuntoxine, markierte Antikörper, stätionäre, unlösliche Antikörper oder chromatograpische Absorbentien zu bilden.
Die hier für die Kupplungsmittel verwendeten Verbindungen werden typischerweise am Anfang mit der geeigneten funktionalen Gruppe des amin- oder thiol-haltigen Materials und nachfolgend mit der Thiol-Funktion des thiol-haltigen Materials umgesetzt, um eine Disulfidbindung zu bilden.

B. Arten zur Durchführung der Erfindung

1. Verbindungen, die als konjugierende Mittel nützlich sind
Zwei Typen von Verbindungen sind zum Kuppeln von hierein beschriebenen Materialien nützlich. Einer ist zum Kuppeln von amin-haltigen Materialien an die thiol-haltigen Materialien nützlich, und der andere ist zum Kuppeln thiol-haltiger Materialien untereinander nützlich.
Die Amin-an-Thiol-Kupplungsmittel haben die Formel
R&sub1;-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;,
wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 20 ist, R&sub1;
oder jeder andere aktive Ester, der eine gute säureaktivierende Austrittsgruppe besitzt, ist; und R&sub2; -H, -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5;, -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; oder jede andere thiol-blockierende Gruppe ist.
Die Amin-an-Thiol-Kupplungsmittel können synthetisiert werden, indem zuerst ein Dimethylacryloyl-halogenid der Formel
W-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;
mit einem Aminoalkylencarbonsäure-alkylester mit einer kurzen Alkylkette der Formel:
Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH&sub2;
in einem Lösemittel, das eine säureneutralisierende Verbindung enthält, umgesetzt wird, um ein Produkt der Formel:
Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;
zu bilden.
Die Umsetzung wird am besten bei Zimmertemperatur mit einem Lösemittel, welches die beiden Reaktanten löst und gegenüber der Umsetzung inert ist, durchgeführt. Für bevorzugte Lösemittel dienen Methylenchlorid, Ether, Chloroform, Benzol, Tetrahydrofuran, Dioxan und Hexan als Beispiel. Am meisten bevorzugt wird Methylenchlorid. Zudem ist eine säureneutralisierende Verbindung, die in der Lage ist, die im Verlauf der Umsetzung gebildete HCl zu neutralisieren, eingeschlossen. Die wirksamsten säureneutralisierenden Verbindungen sind tertiäre Amine, wie Triethylamin, ebenso wie Pyridin. Zudem kann das Halogenid des Dimethylacryloyl-halogenids (W) entweder ein Chlorid oder ein Bromid sein, wobei Chlorid besonders bevorzugt wird.
Eine Vielzahl von kurzkettigen Alkylresten (Y) kann mit dem Ester der Aminoalkylencarbonsäure verknüpft sein. Wirksame Reste sind die Methyl- und Ethylgruppe und der tert.-Butylgruppe als der am meisten bevorzugten. Die Zahl der Methylengruppen (n) kann irgendwo zwischen 1 und 20 betragen, wobei 2 am stärksten bevorzugt wird. Ein besonders bevorzugter kurzkettiger Alkylester der Aminoalkylcarbonsäure ist t-Butyl-β-alanin-hydrochlorid, [(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-(CH&sub2;)&sub2;-NH&sub2;].
Der erste Reaktionsschritt ergibt ein Produkt, das am einen Ende eine Carbonsäure aufweist, die durch einen sperrigen, kurzkettigen Alkylrest (Y), wobei die t-Butylgruppe bevorzugt wird, gegen die nucleophilen Angriffe im nächsten Reaktionsschritt geschützt ist. Das andere Ende des Produkts wirkt als gutes Substrat für eine nucleophile Addition des Schwefelatoms einer Thiosäure in einer Reaktion vom Michael-Typ.
Die Reaktion vom Michael-Typ des Produkts der ersten Umsetzung mit einer Thiosäure, wie Thioessigsäure (H-S-CO-CH&sub3;), addiert ein Schwefelatom an das Dimethyl- Kohlenstoffatom, um in der zweiten Umsetzung ein Produkt mit einem gehinderten Thiolrest zu bilden, welches an eine thiol-blockierende Einheit der Formel
Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub2;
gebunden ist.
Die thiol-blockierende Einheit R&sub2; kann in Abhängigkeit von der Thiosäure, die in der Reaktion vom Michael-Typ verwendet wird, variiert werden. Zum Beispiel ergibt Thioessigsäure als wirksame thiol-blockierende Einheit -CH&sub3;.
Der Carbonsäureether wird als nächstes mit einer geeigneten Säure umgesetzt, um die kurzkettigen Alkylreste (Y) zu entfernen, um das zugehörige Carbonsäure-Produkt
HOOC-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub2;.
herzustellen.
Welche Säure verwendet wird, hängt vom kurzkettigen Alkylrest ab. Wenn eine t- Butylgruppe schützt, wird Trifluoressigsäure bevorzugt. Wenn eine Methyl- oder Ethylgruppe schützt, wird wäßrige HCl oder wäßrige H&sub2;SO&sub4; bevorzugt.
Das Carbonsäure-Produkt kann nach jedem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gereinigt werden, wie beispielsweise durch Dünnschichtchromatographie und Umkristallisation aus CHCl&sub3;/Hexan. Das gereinigte Carbonsäure-Produkt kann zu jedem der vorstehend beschriebenen amin-reaktiven Ester verarbeitet zu werden.
Um das Amin-an-Thiol-Kupplungsmittel zu synthetisieren, wobei R&sub1;
ist, wird das gereinigte Carbonsäure-Produkt mit Natrium[4-hydroxy-3-nitro]benzol-stufonat (HNSA) in Gegenwart eines Carbodiimids, wie Diisopropylcarbodiimid oder stärker bevorzugt Dicyclohexylcarbodiimid, in einem geeigneten Lösemittel, wie Dimethylsulfoxid oder stärker bevorzugt Dimethylformamid, umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, in Abhängigkeit vom verwendeten Carbodiimid fällt Diisopropylharnstoff oder Dicyclohexylharnstoff aus und wird abfiltriert, und das Produkt
fällt aus, wenn Diethylether zugegeben wird.
Um das Amin-an-Thiol-Kupplungsmittel zu synthetisieren, wobei R&sub1;
ist, wird das gereinigte Carbonsäure-Produkt mit Sulfo-N-Hydroxy-succinimid (Sulfo-NHS) unter den gleichen Reaktionsbedingungen, wie für die Herstellung des vorstehend beschriebenen HNSA-aktiven Ester genannt, umgesetzt, um die Verbindung
herzustellen.
Um das Amin-an-Thiol-Kupplungsmittel zu synthetisieren, wobei R&sub1;
ist, wird das gereinigte Carbonsäure-Produkt mit N-Hydroxy-succinimid in Gegenwart eines vorstehend beschriebenen Carbodiimids in einem geeigneten Lösemittel, wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Methylenchlorid oder stärker bevorzugt Chloroform, umgesetzt. Wieder wird das Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, um einen Niederschlag zu bilden, der Abfiltriert wird, und auf Zugabe von Diethylether fällt das gewünschte Produkt der Formel
aus.
Das zweite hierin beschriebene Kupplungsmittel verknüpft zwei thiol-haltige Materialien und hat die Formel
R&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;,
wobei R&sub1; eine thiol-reaktive Einheit ist, wie beispielsweise
wobei Z für Cl, Br oder I, vorzugsweise Br steht, R&sub2;
ist, wobei n zwischen 1 und 20 beträgt, und w zwischen 1 und 100 beträgt; und R&sub3; -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; oder -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; und jede andere wirksame thiol-blockierende Einheit, vorzugsweise -CO-CH&sub3; ist.
Die Thiol-an-Thiol-Kupplungsmittel können dadurch synthetisiert werden, daß zuerst ein Dimethylacryloylhalogenid der Formel W-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2; in einem Lösemittel, das eine säureneutralisierende Verbindung enthält, mit entweder einem 1-t-Butoxycarbonylalkylendiamin oder einem 1-t-Butoxycarbonylalkylenoxydiamin der Formel
(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;-NH&sub2;
(wobei R&sub2; vorstehend definiert ist, mit -(CH&sub2;)&sub3;O(CH&sub2;)&sub4;O(CH&sub2;)&sub3;- als am meisten bevorzugt) umgesetzt wird, um ein Produkt der Formel
(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;
zu bilden.
Die Umsetzung wird am besten bei Zimmertemperatur mit einem Lösemittel, welches die beiden Reaktanten löst und gegenüber der Umsetzung inert ist, durchgeführt. Für bevorzugte Lösemittel dienen Ether, Chloroform, Benzol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Hexan und als besonders bevorzugt Methylenchlorid als Beispiel. Zudem ist eine säureneutralisierende Verbindung, die in der Lage ist, die im Verlauf der Umsetzung gebildete HCl zu neutralisieren, eingeschlossen. Die wirksamsten säureneutralisierenden Verbindungen sind tertiäre Amine, wie Triethylamin, ebenso wie Pyridin. Zudem kann das Halogenid des Dimethylacryloyl-halogenids (W) entweder ein Chlorid oder ein Bromid sein, wobei Chlorid besonders bevorzugt wird.
Der erste Umsetzungsschritt ergibt ein Produkt, das am einem Ende ein durch eine t-Butoxycarbonylgruppe (BOC) geschütztes Stickstoffatom aufweist. Die BOC-Gruppe ist wichtig, da sie erlaubt, daß die nucleophile Addition selektiv am anderen Ende des Moleküls ausgeführt werden kann, welches als gutes Substrat für eine nucleophile Addition des Schwefelatoms einer Thiosäure in einer Reaktion vom Michael-Typ wirkt.
Die Reaktion vom Michael-Typ des ersten Reaktionsproduktes mit einer Thiosäure, wie Thioessigsäure (H-S-CO-CH&sub3;), fügt dem Dimethyl-Kohlenstoffatom ein Schwefelatom hinzu, um ein zweites Reaktionsprodukt mit einem gehinderten Thiolrest, welcher an eine thiolblockierende Einheit der Formel
(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;
gebunden ist, herzustellen. Die thiol-blockierende Einheit R&sub3; kann in Abhängigkeit vom Typ der in der Reaktion vom Michael-Typ verwendeten Thiosäure, variiert werden. Zum Beispiel ergibt Thioessigsäure -CH&sub3; als wirksame thiol-blockierende Einheit.
Als nächstes wird die BOC-Schutzgruppe durch Umsetzen des dritten Reaktionsproduktes mit einer Säure, wie Ameisensäure oder stärker bevorzugt Trifluoressigsäure, entfernt "entBOCt", um eine Verbindung der Formel
NH&sub2;-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;
herzustellen. Diese Verbindung kann mit einem von vier Reagenzien umgesetzt werden, um eine spezifische, thiol-reaktive Einheit R&sub1; zu erhalten.
Um ein Thiol-an-Thiol-Kupplungsmittel zu synthetisieren, wobei R&sub1;
ist, wird das Produkt der vierten Reaktion mit N-Maleinimido-6-aminocapronsäure-HNSA- ester in Gegenwart eines Lösemittels, wie Methylenchlorid, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder stärker bevorzugt Chloroform, umgesetzt, um
herzustellen.
Um ein Thiol-an-Thiol-Kupplungsmittel zu synthetisieren, wobei R&sub1;
ist, wird das Produkt der vierten Reaktion mit 4-(N-Maleinimidoniethyl)-cyclohexan-1- carbonsäure-succinimid (SMCC) in Gegenwart eines Lösemittels, wie Dimethylsulfoxid oder stärker bevorzugt Dimethylformamid, umgesetzt, um
herzustellen.
Um ein Thiol-an-Thiol-Kupplungsmittel zu synthetisieren, wobei R&sub1;
Z-CH&sub2;-CO-NH-(CH&sub2;)&sub5;--
ist, wird das Produkt der vierten Reaktion mit dem aktiven 1-Hydroxy-2-nitro-4-benzolsulfonsäureester (HNSA) des Acetylhalogenids von 6-Aminocapronsäure in einem Lösemittel, wie Dimethylsulfoxid oder stärker bevorzugt Dimethylformamid, umgesetzt, um
Z-CH&sub2;-CO-NH-(CH&sub2;)&sub5;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-CH&sub3;
herzustellen.
Um ein Thiol-an-Thiol-Kupplungsmittel zu synthetisieren, wobei R&sub1; Z-CH&sub2;- ist, wird das Produkt der vierten Reaktion mit dem HNSA-aktiven Ester des Acetylhalogenids in einem Lösemittel, wie Dimethylsulfoxid oder stärker bevorzugt Dimethylformamid, umgesetzt, um
Z-CH&sub2;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-CH&sub3;
herzustellen.
Ein anderer Weg zur Synthese dieses zweiten Verbindungstyps ist, eine Verbindung der Formel
BOC-NH-CH(COOH)-C(CH&sub3;)&sub2;-S-S-C(CH&sub3;)&sub2;-CH(COOH)-NH-BOC
(wobei BOC die t-Butoxycarbonylgruppe ist) mit einem Reduktionsmittel, wie Dithiothreit oder 2-Mercaptoethanol, umzusetzen, gefolgt von einer Umsetzung mit einem Acetylierungsmittel, wie Essigsäureanhydrid, um eine Verbindung
BOC-NH-CH(COOH)-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-CH&sub3;
herzustellen. Diese Verbindung wird dann mit Trifluoressigsäure umgesetzt, um die BOC- Schutzgruppe zu entfernen. Danach wird das gebildete Amin mit einem der vier vorstehend beschriebenen Reagenzien umgesetzt, um eine der vier Verbindungen herzustellen.

Derivatisierung und Konjugation

Erfindungsgemäß können amin-haltige Materialien mit thiol-haltigen Materialien konjugiert werden, oder thiol-haltige Materialien können untereinander oder mit anderen thiol-haltigen Materialien verknüpft werden. Die Wahl des Kupplungsmittels wird zum Teil von den zu verknüpfenden Materialien abhängen.

A. Amin-haltige Materialien an thiol-haltige Materialien

Typischerweise wird bei einer solchen Konjugation das amin-haltige Material zuerst mit dem Kupplungsmittel derivatisiert, und das Produkt wird dann mit dem thiol-haltigen Material, bei welchem der Thiolrest durch Umsetzung mit einer Verbindung, die ein gemischtes Aryl-Alkyl-Disulfid bilden wird, aktiviert wurde, umgesetzt. Beispiele für solche Verbindungen schließen 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), 2,2'-Dipyridyl-disulfid, 4,4'-Dipyridyl-disulfid, usw. ein. Vorzugsweise wird 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) verwendet.
In diesem bevorzugten Verfahren wird das amin-haltige Material, wie ein Antikörper, mit einer der Kupplungsverbindungen
R&sub1;-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;,
wobei n 1 bis etwa 20 beträgt; R&sub1; eine säureaktivierende Austrittsgruppe ist, wie
und R&sub2; eine thiol-blockierende Einheit ist, wie -H, -CO-CH&sub3; , -CO-C&sub2;H&sub5; oder -CO- (CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;, derivatisiert. Das Ergebnis ist ein amin-haltiges Derivat der Formel
A[-NH-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;]x,
wobei A ein Material ist, das ein primäres oder sekunderes Amin enthält, welches durch das Stickstoffatom des Amins an das Kupplungsmittel gebunden ist, und x ist die Zahl der derivatisierten Amine auf A. Der Wert von x hängt beispielsweise von den Reaktionsbedingungen und dem besonderen biologischen Material ab, beträgt aber vorzugsweise 1 bis 5, besonders bevorzugt 1.
In Abhängigkeit vom verwendeten Reagens kann die Umsetzung im allgemeinen unter Verwendung einer > 1:1 molaren Menge an Kupplungsverbindung zu amin-haltigem Material bei Temperaturen, die im allgemeinen im Bereich von etwa 0 bis 40ºC liegen, stattfinden. Temperaturen von etwa 0 bis 40ºC werden für Reagenzien, die N-Hydroxysuccinimid oder Sulfo-N-Hydroxysuccinimid enthalten, bevorzugt. Die Umsetzung wird für die Dauer, die für die Vollständigkeit genügt, durchgeführt, was beispielsweise von den Reagenzientypen und der Temperatur abhängt. Im allgemeinen findet die Umsetzung wenigstens 5 Stunden, vorzugsweise 5 bis 20 Stunden, lang statt. Wenn das Derivat mit S-CO-CH&sub3; endet, dann wird das derivatisierte Material mit Hydroxylamin bei einem pH-Wert von 8,0 umgesetzt, um einen freien Thiolrest (er ist deacetyliert) freizusetzen, um das Zwischenprodukt
A[-NH-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-H]x
zu ergeben. Diese Umsetzung wird vorzugsweise bei gemäßigten Bedingungen (z.B. Zimmertemperatur) so lange wie notwendig, vorzugsweise etwa 1 Stunde lang, durchgeführt.
Nach dem wahlweisen Entsalzungsschritt wird die Zahl der Thiolreste auf dem Material quantifiziert. Dieses kann durch Titrieren des Materials mit 5,5'-Dithiobis-(nitrobenzoesäure) geschehen, und es wird bestimmt wieviel Thio-(2-nitrobenzoesäure) freigesetzt wird. Ein Verfahren, wie es auf dem Fachgebiet üblich ist.
Ist die Zahl der Thiolreste einmal bestimmt, wird das derivatisierte Material mit einem thiol-haltigen Material umgesetzt, dessen Thiolreste durch die Reaktion mit vorstehend beschriebenen Verbindungen, wie DTNB, aktiviert worden sind. Die Aktivierungsreaktion kann, wie am Beispiel der Ricintoxin-A-Kette gezeigt, folgendermaßen durchgeführt werden: Nachdem die Ricin-Untereinheit-A gründlich gereinigt wurde (z.B. für rekombinantes Ricin- A: Reduzieren mit einem Reduktionsmittel, wie Dithiothreit (DTT), und Dialysieren gegen Phosphatpuffer), dann setzt man die Ricintoxin-Kette mit einem molaren Überschuß (vorzugsweise 2- bis 4fach) an aktivierendem Reagens um und die Zahl der aktivierten Reste je Ricintoxin-A wird bestimmt. Das aktivierte Ricintoxin-A wird dann konzentriert und vor der Umsetzung mit dem derivatisierten amin-haltigen Material entsalzt.
Die Umsetzung zwischen den beiden Materialien findet typischerweise bei 0 bis 30ºC, stärker bevorzugt bei Zimmertemperatur, statt. Die Umsetzungsdauer variiert mit der Temperatur, aber liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 5 bis 48 Stunden, stärker bevorzugt 10 bis 30 Stunden. Das molare Verhältnis von thiol-haltigem Material zu derivatisiertem, amin-haltigem Material kann im Bereich von etwa 1 bis 3 Molen thiolhaltigem Material je Mol derivatisiertem, amin-haltigem Material liegen, stärker bevorzugt werden 1,5 bis 2 Mole.
Nach der Umsetzung kann das konjugierte Protein mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder mittels Molekularsieb-Sephadex-Chromatographie, usw. gereinigt werden. Fraktionen, die das korrekte Molekulargewicht aufweisen, können beispielsweise durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese bestimmt werden; zusammengelegt und konzentriert werden.

B. Thiol-haltiges Material an thiol-haltige Materialien

Typischerweise wird bei einer solchen Konjugation zuerst das thiol-haltige Material, wie zum Beispiel ein Fab'-Fragment, mit der Kupplungsverbindung
R&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;
umgesetzt, wobei R&sub1; eine thiol-reaktive Einheit ist, wie beispielsweise:
ist wobei Z Cl, Br oder I, vorzugsweise Br ist; R&sub2;
ist, wobei n 1 bis 20 und w 1 bis 100 beträgt, und R&sub3; -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5;, -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3; und jede andere wirksame thiol-blockierende Einheit, vorzugsweise -CO-CH&sub3;, ist. Das Ergebnis ist ein Derivat der Formel
A[-S-R'&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;]x,
wobei R'&sub1; die umgesetzte thiol-reaktive Einheit ist, welche durch eine Thioetherbindung an das erste thiol-haltige Material (A) gebunden ist, R&sub2; und R&sub3; sind wie unmittelbar vorstehend definiert und x gibt die Zahl der umgesetzten Thiolreste auf A an.
Derivate, welche den vorstehenden Kupplungsmitteln entsprechen, haben die Formeln
Reaktionsbedingungen sind: ungefähr stöchiometrisch bis zu 3fachem molaren Überschuß an Kupplungsreagens, im allgemeinen 0 bis 30ºC, vorzugsweise Umgebungsbedingungen, im allgemeinen 1 bis 30 Stunden bis eine vollständige Umsetzung eingetreten ist.
Dem Derivat kann seine thiol-blockierende Gruppe durch Reaktion mit Hydroxylamin, wie vorstehend beschrieben, entfernt werden. Danach wird das Derivat mit einem zweiten, identischen oder verschiedenen, thiol-haltigen Material (HS-B), dessen Thiolreste, wie vorstehend beschrieben, mit beispielsweise DTNB aktiviert worden sind, umgesetzt. Die Umsetzung wird besonders begünstigt, wenn 1 bis 3 mol stöchiometrischer Überschuß des aktivienen, zweiten thiol-haltigen Materials gegenüber dem Derivat vorliegt. Die Reaktionsbedingungen sind die gleichen oder ähnliche, wie diejenigen, welche vorstehend beschrieben sind (0 bis 30ºC, vorzugsweise gemäßigte Bedingungen, 1 bis 30 Stunden lang).
Die gebildeten Konjugate der zwei thol-haltigen Materialien haben die folgenden Formeln und sind von den zugehörigen vorstehenden Derivaten abgeleitet
Das Ergebnis dieser Experimente ist eine Familie von Konjugaten, die gehinderte Disulfid-Verknüpfungen enthalten, welche zwei an das thiol-tragende Kohlenstoffatom gebundene Methylgruppen aufweisen, mit der folgenden allgemeinen Formel
A-Z-Zwischenkette-C(CH&sub3;)&sub2;-S-S-B
wobei A-Z ein thiol-haltiges oder amin-haltiges Material ist, welches an das Schwefelatom des Thiolrests oder an das Stickstoffatom des Aminrests gebunden ist, S-B ist ein thiol-haltiges Material, welches an das Schwefelatom des Thiolrests gebunden ist, und Z ist NH oder S, das je nachdem vom an A gebunden Aminrest oder Thiolrest herstammt. Die -C(CH&sub3;)&sub2;-S-S- Einheit ist der durch S-B wiedergegebene, gehinderte Thiolrest des Materials an den Thiolrest der Kupplungsmittels. Die Zwischenketten-Einheit variiert in Abhängigkeit vom verwendeten Kupplungsmittel in ihrem acyclischen, aliphatischen Kohlenstoffgehalt.
Das gebildete Konjugat kann nach jedem geeigneten Verfahren, das einem Fachmann bekannt ist, gereinigt werden. Wenn das Konjugat ein Toxinkonjugat, wie die Ricintoxin-A- Kette an einen Antikörper, ist, so wird ein bevorzugtes Reinigungsverfahren in der parallelen U.S. Anmeldung Seriennr. 917.469, eingereicht am 10. Oktober 1986, deren Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, beschrieben.
Gereinigt werden die Toxinkonjugate durch Herstellen eines Konjugationsgemisches, das ein Toxinkonjugat, ein unkonjugiertes, selektiv bindendes Molekül und ein unkonjugiertes Toxinprotein enthält, Entfernen des unkonjugierten Toxinproteins aus dem Gemisch auf einer Säule, auf der nach Größe getrennt wird, und Entfernen des unkonjugierten, bindenden Moleküls aus dem Toxinkonjugat, welches auf ein hydrophobes Gel aufgebracht wurde, mit einer Elutionslösung, die eine wäßrige Salzlösung umfaßt.
Das gebildete Konjugat, insbesondere dasjenige, bei welchem ein Antikörper an eine Ricintoxin-A-Kette konjugiert ist, weist in vivo eine verminderte Labilität auf und besitzt eine höhere Wirksamkeit als das gleiche Konjugat, ausgenommen daß dieses keine gehinderte Disulfidbindung besitzt. Vorzugsweise sind die Konjugate Immuntoxine, die für die Antitumor-Therapie in vivo nützlich sind. Sie können auch konjugierte Lymphokine, wie IL-2 oder IFN-β, sein, welche an einen Antikörper oder ein Fragment davon konjugiert sind, die für die Antitumor-, Antiifektions- oder Immunmodulations-Therapie nützlich sind. Zudem können die Verbindungen für die diagnostische Überwachung bei der Arzneistofftherapie in vivo nützlich sein, beispielsweise ein an eine Markierungseinheit konjugierter Antikörper.
In den Beispielen, die folgen, wird eine weitere Veranschaulichung der Erfindung präsentiert. Diese Beispiele sind mit ihren besonderen Veranschaulichungen nicht dazu bestimmt die Erfindung auf diese zu beschränken. In den Beispielen sind alle Temperaturangaben in Grad Celsius, sofern nichts anderes angegeben wird.

Beispiel 1

Synthese des Amin-an-Thiol-Kupplungsmittels

Die Synthese von 3-Acetylthio-3-methylbutyl-β-alanin und seines HNSA- und NHS- aktiven Esters wird in Fig. 2 gezeigt, auf welche sich die unten aufgeführten, eingeklammerten Zahlen beziehen.

Schritt 1:

In einem mit einem Tropftrichter ausgerüsteten 100 ml Dreihalsrundkolben wurde Dimethylacryloylchlorid (1) (1,1 ml; 10 mmol) unter N&sub2; in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. In einem 25 ml Erlenmeyerkolben wurde t-Butyl-β-alanin-hydrochlorid (2) (1,82 g; 10 mmol) in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und ein Äquivalent Trimethylamin (1,4 ml) wurde zugegeben. Der sich bildende Niederschlag wurde abfiltriert und mit 3 ml CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die gebildete Lösung des t-Butyl-β-alanins zuzüglich der Waschflüssigkeit wurden in den Tropftrichter gefüllt. Triethylamin (1,4 ml) wurde der Lösung im Trichter hinzugefügt, diese Lösung wurde dann tropfenweise zu der Lösung des Dimethylacryloylchlorids gegeben.
Als die Zugabe vollständig war, wurde der Trichter mit 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; ausgespült. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur (RT) 2 Stunden lang gerührt. Zu diesem Zeitpunkt zeigte Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten (5% Methanol in CHCl&sub3;) keine Dimethylacrylsäure mehr an, aber die Gegenwart eines neuen Heckens, der zum Produkt, t-Butyl-β-alanyl-dimethylacrylat (3), gehört. Das Reaktionsgemisch wurde mit etwa 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; verdünnt, mit H&sub2;O (2 x 15 ml) und mit gesättigter, wäßriger NaCl gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Verdampfen des Lösemittels ergab ein fahlgelbes Öl (1,64 g). Dieses Rohprodukt (3) wurde in zwei Chargen auf einer 4 mm Chromatotron-Platte gereinigt. Die Chromatographie wurde mit 0,5%igem Methanol in CHCl&sub3; begonnen, solange bis die schnellwandernde Bande vorüber war. Das Produkt wurde in 2%igem Methanol in CHCl&sub3; eluiert. Die Ausbeute betrug 1,5 g, 66% der theoretischen Ausbeute.

Schritt 2:

In einem 50 ml Rundkolben wurde zu 2,47 g (10,9 mmol) t-Butyl-β-alanyl-dimethylacrylat 10 ml frisch doppelt-destillierte Thioessigsäure gegeben. Der Kolben wurde mit N&sub2; gespült und mit einem Rückflußkühler und einem Y-Stück zum N&sub2;-Spülen ausgestattet. Das Reaktionsgemisch wurde unter N&sub2; 4 Stunden lang refluxiert. Die Lösung wurde abgekühlt und mit etwa 75 ml Ethylether verdünnt. Die Etherlösung wurde mit 5%iger Essigsäure, H&sub2;O (2 x) und mit gesättigter, wäßriger NaCl gewaschen, dann über MgSO&sub4; getrocknet. Verdampfen des Ethers ergab ein farbloses Öl.

Schritt 3:

Das Rohprodukt (4) wurde mit 15 ml Trifluoressigsäure (TFA) behandelt und bei RT eine Stunde lang gerührt. Dann wurde das TFA verdampft, um ein sehr schwach gelbes Öl zu ergeben. Dieses Rohprodukt wurde in zwei Chargen auf einer 4 mm Chromatotron-Platte gereinigt, beginnend mit CHCl&sub3;, um den schnellwandernden Bestandteil zu entfernen, und Eluieren des Produkts (5) mit 5%igem Methanol in CHCl&sub3;. Das Produkt kristallisierte beim Verdampfen des Lösemittels aus. Das Produkt wurde aus CHCl&sub3;/Hexan umkristallisiert, dies ergab 1,40 g (5,67 mmol), 52% der theoretischen Ausbeute.

Schritt 4:

Der HNSA-Ester des 3-Acetylthio-3-methylbutyryl-β-alanins (6) wurde folgendermaßen hergestellt: 617 mg (2,5 mmol) des Produkts aus Schritt 3 (5) wurden in einen 10 ml Rundkolben eingewogen. 602 mg (2,5 mmol) Natrium[4-Hydroxy-3-nitro]benzol-sulfonat (HNSA) wurden in 2,5 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und in den Kolben gegeben. 515 mg (2,5 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt (geschützt gegen Feuchtigkeit durch ein Trockenrohr). Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und mit 0,5 ml DMF gewaschen. Die filtrierte Lösung wurde tropfenweise zu 50 ml gerührtem Ether gegeben. Nachdem etwa ½ Stunde lang gerührt wurde, ließ man 15 Minuten lang absitzen und der Ether wurde dekantiert. Frischer Ether wurde hinzugefügt und die Schritte des Rührens, Absitzenlassens und Dekantierens wurden für insgesamt viermal wiederhoft. Der Rückstand war ursprünglich gummiartig und wurde zu einem fahlgelben Feststoff Dieser wurde abfiltriert und getrocknet. Die Endausbeute an mit HNSA-Ester geschütztem Linker (PL) betrug 535 mg, 46% der theoretischen Ausbeute.

Schritt 4a:

Der N-Hydroxysuccinimid-ester wurde ebenfalls, wie folgt hergestellt: In einem 25 ml Rundkolben wurden zu 0,494 g (2 mmol) des Produkts aus Schritt 3 (5) 0,23 g (2 mmol) N-Hydroxysuccinimid (NHS) in 7 ml CH&sub2;Cl&sub2; hinzugefügt und 0,412 g DCC wurden zugegeben. Die Umsetzung wurde über Nacht gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Verdampfen des Methylenchlorids ergab ein weißes Pulver, welches aus Ethanol umkristallisiert wurde. Die Ausbeute betrug 0,35 g, 50% der theoretischen Ausbeute.

Schritt 4b:

Der Sulfo-N-Hydroxysuccinimid-ester des 3-Acetylthio-3-methylbutyryl-β-alanins (6b) wurde folgendermaßen hergestellt: 617 mg (2,5 mmol) des Produkts aus Schritt 3 (5) wurden in einen 10 ml Rundkolben eingewogen. 542 mg (2,5 mmol) Sulfo-N-Hydroxysuccinimid (Sulfo-NHS) wurden in 2,5 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und in den Kolben gegeben. 515 mg (2,5 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurden hinzugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt (geschützt gegen Feuchtigkeit durch ein Trockenrohr). Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und mit 0,5 ml DMF gewaschen. Als nächstes wurde die filtrierte Lösung tropfenweise zu 50 ml gerührtem Ether gegeben. Nachdem etwa ½ Stunde lang gerührt wurde und man 15 Minuten lang absitzen ließ, wurde der Ether abdekantiert. Frischer Ether wurde hinzugefügt und die Schritte des Rührens, Absitzenlassens und Abdekantierens wurden für insgesamt viermal wiederholt. Der Rückstand wurde abfiltriert und getrocknet. Die theoretische Ausbeute betrug 1,59 g.

Beispiel II

Synthese der Thiol-an-Thiol-Kupplungsmittel

Die Synthese von 1-(3-Acetylthio-3-methylbutyramido)-12-(6-bromacetamidohexanamido)-4,9-dioxadodecan wird in Fig. 4 gezeigt, auf welche sich die unten aufgeführten, eingeklammerten Zahlen beziehen.
In einem mit einem Stickstoffeinlaß und -auslaß sowie einem Tropftrichter ausgerüsteten 50 ml Dreihalsrundkolben wurde Dimethylacryloylchlorid (1) (0,6 g; 5 mmol) in 5 ml Methylenchlorid gelöst. Die "Mono-BOC-Zwischenkette" (2) (1,52 g, 5 mmol) wurde in 5 ml Methylenchlorid gelöst und in den Tropftrichter gegeben. Die Lösung der Mono-BOC- Zwischenkette wurde bei Zimmertemperatur tropfenweise der gerührten Lösung des Dimethylacryloylchlorids hinzugefügt. Es folgten 0,7 ml (5 mmol) Triethylamin. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit Methylenchlorid auf 50 ml verdünnt, mit Wasser (2 x 10 ml) und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Verdampfen des Lösemittels ergab ein fahlgelbes Öl, welches druch Chromatotron-Chromatographie unter Verwendung von 2%igem Methanol in Chloroform gereinigt wurde. Ausbeute 0,64 g (1,7 mmol) (33%) 1-Dimethylacrylamido-12-BOC-amino-4,9-dioxadodecan (3).
In einem 25 ml Rundkolben wurden zu dem 1-Dimethylacrylamido-12-BOC-amino-4,9- dioxadodecan (0,6 g; 1,6 mmol) 10 ml frisch destillierte Thioessigsäure gegeben. Die Lösung wurde unter Stickstoff 4 Stunden lang gerührt und refluxiert. Die Lösung wurde abgekühlt und mit Diethylether auf 70 ml verdünnt. Die Etherlösung wurde mit Wasser, 5%iger Essigsäure, Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Einengen ergab ein blaßbraunes Öl: 1-(3-Acetylthio-3-methylbutyramido)- 12-BOC-amino-4,9-dioxadodecan (4). Dieses Rohprodukt wurde mit 5 ml Trifluoressigsäure eine ½ Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das TFA wurde durch Verdampfen im Stickstoffstrom entfernt. Ausbeute (Rohprodukt) = 0,59 g (1,6 mmol; 100%) 1-(3-Acetylthio-3-methylbutyramido)-12-amino-4,9-dioxadodecan (5).
Das rohe 1-(3-Acetylthio-3-methylbutyramido)-12-amino-4,9-dioxadodecan (200 mg; 0,53 mmol) wurde in 2 ml Dimethylformamid gelöst und Bromacetyl-Sac-HNSA (280 mg; 0,4 mmol) wurde zugegeben. Triethylamin wurde hinzugefügt bis im Gemisch unter Verwendung von feuchtem pH-Papier ein pH-Wert von 7,5 gemessen wurde. Die Lösung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt, dann mit 40 ml Diethylether verdünnt. Die Etherlösung wurde mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Ausbeute an Rohprodukt = 220 mg (0,36 mmol) (68%) 1-(3-Acetylthio-3-methylbutyramido)-12-(6-bromacetamidohexanamido)-4,9-dioxadodecan (6).

Beispiel III

Konjugation eines monoklonalen Antikörpers an ein rekombinantes Ricintoxin-A (rRTA)

DNA Konstrukte und transformierte Mikroorganismen, die verwendet werden, um lösliches, intrazellulär hergestelltes rekombinantes RTA (rRTA) zu synthetisieren, werden in U.S. Patent Nr. 4.689.401, veröffentlicht am 25. August 1987, dessen Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, beschrieben.
Das rRTA (150 mg, 10 mg/ml) wurde mit 1mM DTT bei 23ºC 60 Minuten lang reduziert. Das reduzierte rRTA wurde gegen 100 mM Natriumphosphat pH 8, 1 mM EDTA, 30% Glycerin (NaP) dialysiert. Die Thiolreste des frisch reduzierten rRTAs wurden durch Umsetzung mit einem 5fachen Überschuß an DTNB bei einer Proteinkonzentration von 10 mg/ml in NaP bei 23ºC 60 Minuten lang aktiviert. Die Zahl der TNB-Gruppen je rRTA wurde zu 0,95 bestimmt.
Das aktivierte rRTA wurde unter Verwendung eines Amicon-Centricon 30-Konzentrators eingeengt und über eine PD 10-Säule zur Trennung nach Größe, die mit NaP äquilibriert wurde, entsalzt, wodurch sich eine rRTA-Konzentration von 5 - 10 mg/ml ergab.
Ein Brusttumor-spezifischer, monoklonaler Antikörper (260F9; hergestellt aus der unter ATCC Nr. 8488 hinterlegten Zell-Linie), wurde wie in der parallelen Anmeldung U.S. Seriennr. 842.476, veröffentlicht am 21. März 1986, deren Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, hergestellt. Insgesamt 166 mg des Antikörpers (9 mg/ml) wurden mit 14 molarem Überschuß an mit HNSA-Ester geschütztem Linker (PL)
in 100 mM Hepes, 0,2 mM NaCl, 1 mM EDTA, bei einem pH-Wert von 7,6 bei RT 14 Stunden lang derivatisiert. Das derivatisierte Protein wurde dann durch Umsetzung mit 50 mM Hydroxylamin bei RT 1 Stunde lang deacetyliert. Nachdem das Reaktionsgemisch über eine mit NaP äquilibrirte PD 10-Säule entsalzt wurde, bestimmte man die Zahl der Thiolreste auf dem Antikörper unter Verwendung eines Gemischs aus der DTNB-Analyse, wie vorstehend beschrieben, zu 1,6.
Der derivatisierte Antikörper und das aktivierte rRTA wurden gemeinsam 72 Stunden lang unter Verwendung eines 1,5 molaren Überschußes an rRTA über die titrierten Thiolreste des Antikörpers (157 mg Mab, 105 mg rRTA) umgesetzt.
Das konjugierte Protein (260F9-PL-rRTA) wurde durch Säulenchromatographie gereinigt. Fraktionen zu 10 ml wurden gesammelt und 10 ul wurden auf einem nichtreduzierenden SDS-PAGE-Gel mit 6/15%igen Sammel/Trenn-Gel analysiert. Fraktionen, die das Konjugat aufwiesen, wurden gesammelt und unter Verwendung einer Amicon-Centricon 30-Membran konzentriert. Das Konjugat wurde in einer Konzentration von 1 - 2 mg/ml bei 4ºC aufbewahrt.

Beispiel IV

Prüfen der in vitro-Zytotoxizität der Immunokonjugate

Die in vitro-Zytotoxizität wurde unter Verwendung eines 24 Stunden-Proteinsynthese- Tests ebenso wie durch einen dreitägigen MTT-Test, welcher den zellulären Gehalt an mitochondrialer Reductase mißt [Green, L.M. et al., J. Immunol. Meth., 70 (1984), 257 - 268], getestet. Dessen Beschreibung ist durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen. 260F9- PL-rRTA wurde analysiert und mit dem Konjugat des gleichen Antikörpers und rRTA, welches aber einen 2-Iminothiolan-Linker (IT) aufweist und nicht durch zwei Methylgruppen am α-Kohlenstoffatom geschützt ist (260F9-IT-rRTA), verglichen. Die Herstellung von Konjugaten unter Verwendung von 2-Iminothiolan ist, wie in der parallelen U.S. Patentanmeldung Seriennr. 842.476, eingereicht am 21. März 1986, dessen Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, offenbart und im allgemeinen anerkannt. Kurz gesagt wurde das DTNB mit dem Antikörper bei RT 15 Minuten lang in einem Phosphat- EDTA-Puffer umgesetzt und auf 0ºC abgekühlt. Es wurde genügend 2-Iminothiolan zugegeben, um 2,5 IT-Moleküle je Antikörper-Molekül zu ergeben. Dann wurde frisch reduziertes RTA gegen Phosphat-EDTA-Puffer dialysiert und zu dem derivatisierten Antikörper gegeben, um 1,0 - 1,2 freie Thiolreste auf dem RTA je blocktertem Thiolrest auf dem Antikörper zu ergeben. Dieses Gemisch wurde bei RT 2 Stunden lang umgesetzt und dann durch Säulenchromatographie gereinigt, dialysiert, und wieder chromatographiert, um das gebildete Immuntoxin zu isolieren und zu reinigen.

24 Stunden-Proteinsynthese-Test

Die Zytotoxizität der zwei Konjugate wurde unter Verwendung von Zell-Linien verglichen; OVCAR3 von einem menschlichen Eierstockkarzinom und MCF-7 von einem menschlichen Brustkarzinom. Der Test wurde durchgeführt, indem vierzigtausend Testzellen (in 1 ml Medium) in jedes von 8 Glasfläschchen gegeben wurde. Als nächstes wurde eine serielle Verdünnung des Konjugats (in PBS + 100 ug/ml Rinderserumalbumin) zu den Fläschchen gegeben. Nach einer Inkubation von 22 Stunden bei 37ºC wurde das Medium abgesaugt, die Monolayers wurden mit phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und methionin-freiem Medium, welches mit ³&sup5;S-Methionin ergänzt war, gewaschen. Die Fläschchen wurden weitere zwei Stunden bei 37ºC inkubiert, das Medium entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit 2 ml 10%iger Trifluoressigsäure, welche 1 mg/ml Methionin enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden getrocknet, eine Szintillationsflüssigkeit zugegeben, und die Radioaktivität an einem Szintillationszähler gemessen. Die Zytotoxizität wurde als die Gewebekultur-Hemmdosis des Konjugats ausgedrückt, die sich als 50% der (unbhandelten) Kontrollproteinsynthese (TCID 50%) ergab, wie durch die Aufnahme von ³&sup5;S-Methionin bestimmt.
Die Ergebnisse dieser in Tabelle 1 aufgeführten Zytotoxizitätstests zeigen an, daß das Konjugat von ähnlicher Toxizität ist wie das auf dem Iminothiolan basierende Konjugat. Tabelle 1 Konjugat

72 Stunden-MTT-Test

Die Hemmung der mitochondrialen Reductase wurde ebenso wie die Spezifität von 260F9-PL-rRTA getestet und mit der eines ähnlichen PL-rRTA-Konjugats verglichen, das an einen Maus-Myelom-Antikörper (MOPC21) gebunden war, der keine bekannte Reaktivität zeigt (MOPC21-PL-rRTA). Bei beiden Konjugate wurde die Zytotoxizität mit einer menschlichen Brustzell-Linie, MX-1, und einen menschlichen Fibroblasten, HS27-F, verglichen. Der Test wurde durchgeführt, indem die Testzellen mit variiernden Konjugatverdünnungen 72 Stunden lang inkubiert wurden. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Farbstoff 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylformazan (MTT) zugegeben, um den Grad der verbliebenen mitochondrialen Reductaseaktivität zu bestimmen.
Die in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse zeigen eine wirksame und spezifische Toxizität von 260F9-PL-rRTA gegen die Brustkarzinomzell-Linie im Vergleich zur Fibroblasten-Zell- Linie an. Tabelle 2 Konjugat

Beispiel V

Konjugatreinheit und in vivo-Toxizität

Die Reinheit von sowohl 260F9-PL-rRTA als auch 260F9-IT-rRTA wurde mit einem nicht-reduzierenden SDS-PAGE-Gel und Anfärben mit Echtgrün und Gel-Scannen untersucht. Zudem wurde der Endotoxingehalt zu ungefähr 1 - 10 ng Endotoxin je mg Konjugat bestimmt, mit dem "Limulus-amebocyte lysate" (LAL)-Test, der von Watson et al., Hrsgg., Proceedings of an International Conference on Endotoxin Standards and Limulus Amebocyte Lysate Use with Parenteral Drugs, Alan R. Liss, Inc., New York (1982), beschrieben wurde, dessen Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist.
Dann wurde die in vivo-Toxizität an Mäusen getestet. Drei verschiedenen Gruppen von Mäusen (3 Mäuse je Gruppe) wurden Einzeldosis-Injektionen von 0; 4,25; 8,5 und 17,0 mg/kg 260F9-PL-rRTA gegeben. Die Mäuse, welche Konjungat erhalten hatten, starben in allen drei Gruppen, wodurch sich eine minimale letale Dosis von 4,25 mg/kg ergibt, bei welcher 100% der Tiere sterben (LD&sub1;&sub0;&sub0;). Dies steht in Widerspruch zu 260F9-IT-rRTA, welches eine letale Dosis von rund 8,5 mg/kg besitzt, bei welcher 50% der Tiere sterben (LD&sub5;&sub0;). Das Konjungat mit dem geschützten Linker wurde daher als sehr viel letaler befiinden.

Beispiel VI

In vivo-Verhalten der Konjugate, welche unter Verwendung des geschützten Linkers hergestellt wurden

In vivo-Stabilität des Konjugats

Die in vivo-Stabilität des Konjugats mit dem geschützten Linker (260F9-PL-rRTA) wurde mit der des Iminothiolan-gebundenen Konjugats (260F9-IT-rRTA) verglichen. Beide Konjugate wurden unter Verwendung eines intern mit ³&sup5;S-Methionin markierten 260F9- Antikörpers synthetisiert. Nackten Mäusen wurden 3,5 ug des markierten Immunokonjugats injiziert und diese wurden zum angegeben Zeitpunkt getötet. Plasmaproben wurden dann auf einem SDS-PAGE-Gel mit einem 5% bis 10%igen Gradienten analysiert und autoradiographiert.
Figur 5 ist ein Autoradiogramm, welches zeigt, daß im Falle von 2-Iminothiol-gebundenem Konjugat nach 24 Stunden nur sehr wenig intaktes Material erhalten bleibt.
Figuren 6(a)-(d) sind eine Reihe von Autoradiogrammen, welche zeigen, daß der geschützte Linker, der das Immunokonjugat enthält, nach dem 7. Tag intakt ist. Das Vorhandensein von freiem Antikörper stellt sehr wahrscheinlich den Zerfall einer Subpopulation an Konjugaten dar, welcher früh eintritt, da der Antikörpergehalt nicht zunimmt, wie es mit dem iminothiolan-gebundenen Konjugat, wie in Figur 5 gesehen, geschieht.

MX-1 Tumormodell

Das, wie von Ovejera, A. A. et al., Annals of Clinical and Laboratory Science, 8 (1978), 51, dessen Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, beschriebene MX-1 Tumormodell wurde verwendet, um die Hemmung des Tumorwachstums und die Abtötungswirksamkeit von 260F9-PL-rRTA und 260F9-IT-rRTA zu untersuchen und zu vergleichen.
Nackten Mäusen (5 - 10 je Gruppe) wurde am 7. Tag menschlicher MX-1 Brusttumor subkutan implantiert. Nachdem man den Tumor 7 Tage (Tag) lang wachsen ließ, wurde mit der Behandlung begonnen, bei welcher den Mäusen die geeignete Dosis Immunkonjugat am 0., 2., 4., 6., 8. und 10. Tag injiziert wurde. Die Größe des Tumors wurde am 0., 3., 7., 10. und 14. Tag gemessen.
Die Werte in den Tabellen 3(a)-(c) stammen von 3 repräsentativen Experimenten. Diese zeigen für jede einzelne Dosierung des Immunkonjugats: die mittlere Veränderung des Körpergewichts der Testgruppe (ΔBW), die Zahl der Todesfälle, die mittlere Veränderung der Tumorgröße (ΔTV) und die prozentuale Hemmung des Tumorwachstums (%TGI).

Beispiel VII

Synthese des geschützten Fab'-Linkers

Figur 10 zeigt das Syntheseschema zur Herstellung eines geschützten Linkers, der allgemeine Anwendungen findet, und insbesondere zur Herstellung von Konjugaten, die aus Fab'-Fragmenten bestehen, nützlich ist. Die verschiedenen Schritte sind nachfolgend beschrieben. Schritt 1:
2,2'-Oxybis(ethylamin)dihydrochlorid (1,0 g; 5,6 mmol), gekauft von Aldrich Chemical Co., wurde in 10 ml Methanol gelöst und 2,3 ml (16,8 mmol) Triethylamin wurden hinzugefügt, gefolgt von 1,4 g (5,6 mmol) 2-(tert-Butoxycarbonyloxyimino)-2-phenylacetonitril, gekauft von Aldrich Chemical Co. (BOC-ON). Die Lösung wurde über Nacht bei Zimmertemperatur (RT) gerührt. Die Lösung wurde eingeengt und auf einer 30 g Kieselgelsäule gereinigt. Die Säule wurde mit 5%igem Methanol (MeOH) in CH&sub2;Cl&sub2; gestartet. Das Bis-BOC-Produkt kam in diesem Lösemittel zusammen mit dem Nebenprodukt des BOC-ON (NC-C=N-OH) heraus. Das Lösemittel wurde auf 10%iges MeOH in CH&sub2;Cl&sub2; gewechselt, welches etwa Triethylamin eluierte. Das Lösemittel wurde dann auf 15%iges MeOH in CH&sub2;Cl&sub2; umgeändert, welches das mono-BOC-Diamin eluierte. Die Säulefraktionen wurden durch TLC (20% MeOH in CH&sub2;Cl&sub2; + 1% HOAc) analysiert. Das mono-BOC-Diamin-Produkt hatte einen Rf = 0,5 und zeigte einen positiven Ninhydrintest. Die Ausbeute betrug 0,45 g (2,2 mmol), dies entspricht 39% der theoretischen Ausbeute. Schritt 2:
In einem 25 ml Rundhalskolben wurde Dimethylacryloyl-chlorid (246 ul: 262 mg; 2,3 mmol), gekauft von Aldrich Chemical Co., in 5 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Mono-BOC-Diamin (0,45 g; 2,2 mmol) in 5 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurde tropfenweise zugegeben, gefolgt von 262 ul (2,2 mmol) Triethylamin in 1 ml CH&sub2;Cl&sub2;. Das Gemisch wurde bei RT 3 Stunden lang gerührt. Dünnschichtchromatographie (5%iges MeOH in CH&sub2;Cl&sub2;) zeigte kein Ausgangsamin und 3 im UV-Licht positive Flecken an. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH&sub2;Cl&sub2; auf 30 ml verdünnt und zweimal mit H&sub2;O gewaschen. Die wäßrige Waschlösung, pH-Wert 2, wurde dann mit 5%igem NaHCO&sub3; (diese Wäsche hatte einen pH-Wert von 7), dann wieder mit H&sub2;O, dann mit Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen wurde die Lösung eingeengt. TLC in Ether zeigte 3 Flecken im UV-Licht und mit Iod an.
Das Rohprodukt wurde auf einer 4 mm Chromatotron-Platte gereinigt. Es wurde mit Diethylether begonnen, welches zwei schnell wandernde Banden eluierte. Ein schrittweiser Gradient zu 2%igem MeOH in Ether eluierte das Produkt. (Die Chromatographie wurde durch TLC mit Ether unter UV-Erkennung überwacht). Die Fraktionen, welche Produkt enthielten, wurden vereinigt und eingedampft, um ein farbloses Öl zu ergeben, die Ausbeute betrug 0,452 g (1,6 mmol), dies entspricht 72% der theoretischen Ausbeute. Schritt 3:
Das Produkt aus Schritt 3 (0,46 g; 1,6 mmol) wurde in etwa 10 ml frischdestillierter Thioessigsäure gelöst, und die Lösung wurde unter N&sub2; 4,5 Stunden lang refluxiert. Die Lösung wurde mit 75 ml Ether verdünnt und mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen. Die Etherlösung wurde über MgSO&sub4; getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch Chromatotron (4 mm Platte), beginnend mit Ether, um die schnell wandernde Verunreinigung zu entfernen, gereinigt. Das Produkt wurde mit 5%igem MeOH in Ether eluiert und getrocknet, um ein fahlgelbes Öl zu ergeben. Die Ausbeute betrug 260 mg (0,72 mmol), dies entspricht 45% der theoretischen Ausbeute. Schritt 4:
Das Produkt aus Schritt 3 (260 mg; 0,72 mmol) wurde in ~4 ml Trifluoressigsäure gelöst und bei RT ½ Stunde lang gerührt. Die Trifluoressigsäure wurde durch einen Stickstoffstrom verdampft. Das entschützte Produkt wurde in ~4 in' Dioxan gelöst und 71 mg (0,73 mmol) Maleinsäureanltydrid wurden hinzugefitgt. Triethylamin wurde tropfenweise zugegeben, um den pH-Wert zwischen 7 und 8 (gegen feuchtes pH-Papier) einzustellen. Die Umsetzung wurde durch TLC (10%iges MeOH in CH&sub2;Cl&sub2;) verfolgt. Ein neuer Fleck erschien (Rf 0,5) und der ursprüngliche Fleck, der einen positiven Ninliydrintest zeigte, verschwand. Das Dioxan wurde verdampft und der Rückstand in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Die Lösung wurde zweimal mit 5%iger HOAc, dann mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösemittels wurde das Rohprodukt durch Chromatotron auf einer 4 mm Platte unter Verwendung von 5%igem MeOH in CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt. Die Ausbeute betrug 130 mg (0,36 mmol), dies entspricht 50% der theoretischen Ausbeute. Schritt 5:
Das Produkt aus Schritt 4 (130 mg; 0,36 mmol) wurde in 4 in' Eisessig gelöst und unter Stickstoff refluxiert. Die Umsetzung wurde mit TLC (10%iges MeOH in CH&sub2;Cl&sub2;) verfolgt und nach 2 Stunden beendet. Der Eisessig wurde entfernt und der Rückstand in Chloroform aufgenommen und durch Chromatotron (1 mm Platte) in 5%igem MeOH in CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt. Die Ausbeute betrug 30 mg (0,1 mmol), dies entspricht einer Rückgewinnung von 25%. Tabelle 3(a) Gruppe Dosis (UG) ΔBW Todesfälle ΔTV %TGI Kontrolle mit PBS* Tabelle 3(b) Gruppe Dosis (UG) ΔBW Todesfälle ΔTV %TGI Kontrolle mit PBS* Tabelle 3(c) Gruppe Dosis (UG) ΔBW Todesfälle ΔTV %TGI Kontrolle mit PBS* * PBS: phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
Die größte Wirksamkeit mit annehmbarer Toxizität wurde für 260F9-PL-rRTA bei einer Dosierung von 0,58 ug/kg, wie in Tabelle 3(b) gezeigt, erreicht. Dies ist eine größere Wirksamkeit und sogar eine geringere Toxizität als bei der 12fach höheren Dosierung von 7,0 ug/kg, wie sie bei 260F9-IT-rRTA verwendet wird. Zudem bleibt, wie in Tabelle 3(b) gezeigt, der Tumor bei der einen überlebenden Maus bei der Dosis von 1,75 ug 260F9-PL- rRTA bei einer Größe von 50% der Injektion, selbst nach dem 21. Tag.
Die verbesserte Wirksamkeit des geschützten Linkers, der das Immunkonjugat enthält, über das mit 2-Iminothiolan gebundene Konjugat wird in Figur 7 gezeigt, wo die Werte der Tabelle 3(a)-(c) graphisch veranschaulicht werden. Die Tumorgröße nimmt mit der Zeit ab, wobei die Dosis sowie die Reaktion darauf gezeigt wird, wobei 260F9-PL-rRTA sehr viel wirksamer ist als 260F9-IT-rRTA.

Pharmakokinetische Parameter

Die Gesamtkörper-Clearance (TBC) von 260F9-PL-rRTA wurde mit derjenigen von 260F9-IT-rRTA und einem ähnlichen Konjugat 260F9-SMCC-rRTA verglichen. Konjugate, die SMCC verwenden haben eine nicht-reduzierbare Verknüpfting. Die Synthese von SMCC (4-(N-maleininidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure-succinimid) wird von Yoshitaki et al., European J. Biochem., 101 (1979), 395 - 399, deren Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, beschrieben. Die pharmakokinetischen Parameter der drei Konjugate wurden an nackten Mäusen und Craig-Dowley-(CD)-Ratten verglichen.

Nackte Mäuse

260F9-IT-(³&sup5;S)rRTA und 260F9-SMCC-(³&sup5;S)rRTA wurden intern im rRTA-Teil markiert und (³&sup5;S) 260F9-PL-rRTA wurde intern im Antikörperteil markiert. Mäusen (4 je Gruppe) wurde das markierte Konjugat injiziert und diese wurden zum angegeben Zeitpunkt getötet, um den Gehak an intaktem Konjugat im Serum zu bestimmen. Intaktes Konjugat, welches IT oder SMCC enthielt, wurde direkt durch Immunpräzipitation unter Verwendung des Antikörpers zu 260F9 bestimmt. Intaktes Konjugat, welches PL enthielt, wurde indirekt bestimmt, weil die Immunpräzipitation sowohl intakte als auch freie, markierte Antikörper nachwies. Dies wurde durch das Scannen von Autoradiogrammen nicht-reduzierender SDS- PAGE-Gel-Analysen von Serumproben erreicht, um die Prozente der Gesamtmarkierung im intakten Konjugat zu bestimmen. Die Menge an immunabgeschiedener Markierung wurde dann mit den Prozenten an intaktem Konjugat multipliziert, um die in Figur 8 gezeigten Datenpunkte zu erhalten.

CD-Ratten

Das Konjugat wurde den CD-Ratten injiziert und die Menge an intaktem Konjugat wurde durch einen Sandwich-ELISA-Test bestimmt. Der Einfangantikörper war anti-rRTA und der Nachweisantikörper war Meerrettichperoxidase-markiertes anti-Maus IgG. Um die Verfahrensunterschiede zu vergleichen wurde intaktes 260F9-SMCC-(³&sup5;S)rRTA sowohl durch ELISA als auch durch Iminunpräzipitation bestimmt. Beide Verfahren ergaben ähnliche Ergebnisse.
Die pharmakokinetischen Parameter werden in Figur 8 (nackte Mäuse) und in Figur 9 (CD-Ratten) gezeigt. Die Gesamtkörper-Clearance und die Halbwertszeit der β-Phase wurden unter Verwendung des Computerprogramms JANA (Dunne, A., Comp. Meth. Prog. Biomed., 20 (1985), 269 - 275) zum Auswerten von Diagrammen, dessen Beschreibung durch den Hinweis an dieser Stelle eingeschlossen ist, bestimmt.
Die TBC und die Halbwertszeit der β-Phase für jedes Konjugat sowohl bei nackten Mäusen als auch bei CD-Ratten wird in Tabelle 4 gezeigt. Die Konjugate, welche PL und SMCC enthaften, zeigen gleichwertige TBC-Ouoten und Halbwertszeiten der β-Phase, wodurch angezeigt wird, daß der gehinderte Disulfid-Linker ebenso stabil ist, wie ein nichtreduzierbarer Linker.
In bezug zu dem mit IT gebundenen Konjugat zeigt das mit dem gehinderten Disulfid gebundene Konjugat eine 10fach langsamere TBC-Quote bei Mäusen und eine doppelt so langsame Ouote bei Ratten. Zudem betrug die Halbwertszeit der β-Phase für das auf IT basierende Konjugat bei Mäusen weniger als die Hälfte deijenigen des auf PL basierenden Konjugats und ein Viertel des Werts, der bei CD-Ratten festgestellt wurde. Tabelle 4 Pharmakokinetische Parameter der 260F9-Immunkonjugate Nackte Mäuse Probe TBC Ml/kg/min Halbwertszeit (Stunden) β-Phase CD-Ratten

Hinterlegungen

Die unten aufgeführten, monoklonale Antikörper produzierenden Hybridome wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC) oder der Invitro International Inc. (IVI) nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren und den Durchführungsbestimmungen dazu (Budapest Vertrag) hinterlegt. Dies stellt die Erhaltung von lebensfähigen Kulturen für 30 Jahre ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung sicher. Die Hybridome werden durch die ATCC oder die IVI nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags zuganglich gemacht, und werden zum Gegenstand einer Vereinbarung zwischen dem Anmelder dieser Anmeldung, Cetus Corporation, und der ATCC oder IVI, wodurch eine unbeschränkte Verfügbarkeit auf Herausgabe nach Erteilung des U.S. Patents sichergestellt wird. Die Verfiigbarkeit der hinterlegten Stämme ist nicht als eine Lizenz auszulegen, um die Erfindung in Übertretung der von jeder Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentrechten übertragenen Rechte auszuführen. Der Anmelder hat zugestimmt, daß wenn die Zellstämme unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden und sterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollten, sie auf Benachrichtigung hin unverzüglich durch eine lebensfähige Kultur der gleichen Zell-Linie ersetzt werden.
Jede in der linken Spalte dieser Tabellen aufgeführte Hybridombezeichnung entspricht der monoklonalen Antikörperzell-Linie, die den bezeichneten monoklonalen Antikörper herstellt. Hybridom Antikörpbezeichnung Datum der Hinterlegung ATCC Zugangs-Nr. * Dieser Klon ist ein Nachkomme des 260F9 und es wurde festgestellt, daß er ein besserer Antikörperhersteller ist als 260F9. Hybridom Antikörperbezeichung IVI Zugangs-Nr.
Zudem wurden die folgenden Plasmiden bei der ATCC zum angegebene Datum unter den vorstehend beschriebenen Bedinungen hinterlegt. Plasmidbezeichnung Datum der Hinterlegung ATCC Zugangs-Nr.
Die vorstehende schriftliche Patentbeschreibung wird als genügend betrachtet, um es einem Fachmann zu ermöglichen, die Erfindung anszufüren. Die vorliegende Erfindung wird nicht durch die hinterlegten Zellstämme in ihrem Anwendungsbereich begrenzt, da die hinterlegte Ausführungsform als eine einzelne Veranschaulichung eines Gesichtspunktes der Erfindung verstanden wird und jeder Zell-Linie, der in funktioneller Hinsicht gleichwertig ist, ihnerhalb des Anwendungsbereichs dieser Erfindung liegt. Die Hinterlegung der Materialien dort begründet weder ein Zugeständnis, daß die hier enthaftene schriftliche Beschreibung ungeeignet wäre, um die Ausführung jeden Gesichtspunkts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsformen davon, zu ermöglichen, noch sind die Hinterlegnngen als Begrenzung des Anwendungsbereichs der Patentansprüche auf die besonderen Veranschaulichungen für welche sie stehen, aufzufassen. Tatsächlich werden verschiedene Abänderungen der Erfindung zusätzlich zu den an dieser Stelle gezeigten und beschriebenen für einen Fachmann nach der vorhergehenden Beschriebung naheliegend sein und in den Anwendungsbereich der beigfügten Patentansprüche fallen.

Claims

1. Verbindungen der folgenden allgemeinen Struktur

R&sub1;-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;,

wobei R&sub1; eine säure-aktivierende Austrittseinlieit ist, n zwischen 1 und 20 beträgt und R&sub2; ein Wasserstoffätom oder eine thiol-blockierende Einheit darstellt.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub1; gewählt wird aus

und/oder wobei R&sub2; gewählt wird aus

-H, -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; und -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;.

3. Verbindung einschließlich eines oder mehrerer derivatisierter Amine der Formel:

A-[NH-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;]x,

wobei A ein amin-haltiges Material ist, R&sub2; gewählt wird aus -H, -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; und -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;, n zwischen 1 und 20 beträgt und x die Zahl der derivatisierten Amine ist.

4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei A ein Protein, gegebenenfalls ein Antikörper ist und x zwischen 1 und 5 beträgt.

5. Konjugat, umlassend ein amin-haltiges Material, welches durch eine Kupplungseinheit an ein thiol-haltiges Material gebunden ist, wobei das Konjugat die Formel

A[-NH-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-C(CH&sub3;)&sub2;-S-S-B]x

aufweist, in welcher A ein amin-haltiges Material ist, das durch ein Stickstoffatom des amin-haltigen Materials an die Kupplungseinheft gebunden ist, die Kupplungseinheit -CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-C(CH&sub3;)&sub2;-S- ist, B das thiol-haltige Material ist, n zwischen 1 und 20 beträgt und x die Zahl der Stickstoffatome auf A, welche an die Kupplungseinheit gebunden sind, ist.

6. Konjugat nach Anspruch 5, wobei A und B Proteine sind, gegebenenfalls A ein monoklonaler Antikörper ist, der an menschliche Krebszellen bindet und/oder B Ricintoxin ist, vorzugsweise eine Ricintoxin-A-Kette.

7. Verbindung nach Anspruch 1 oder nach Anspruch 2 oder nach Anspruch 3 oder nach Anspruch 4 oder ein Konjugat nach Anspruch 5 oder nach Anspruch 6, wobei n jeweils 2 beträgt.

8. Verfahren zur Herstellung eines in einem der Ansprüche 5 bis 7 definierten Konjugats, umfassend:

(a) Umsetzen des Stickstoffatoms des amin-haltigen Materials mit einer Kupplungseinlieit der Formel:

R&sub1;-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;,

wobei R&sub1; eine säure-aktivierende Austrittseinheit ist, gewählt aus

n zwischen 1 und 20 beträgt und R&sub2; eine thiol-blockierende Einheit ist, gewählt aus:

-CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; und -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;,

um ein Produkt zu bilden, in dem das amin-haftige Material durch das Stickstoffatom an die Kupplungseinheit gebunden ist, wobei das Produkt die Formel

A-[NH-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub2;]x

aufiveist, in der A das amin-hakige Material ist und x die Zahl der Stickstoffatome auf A, welche an die Kupplungseinheit gebunden sind, ist;

(b) Umsetzen des Produkts aus Schritt (a) mit Hydroxylamin um R&sub2; durch H zu ersetzen;

(c) Umsetzen des Produkts aus Schritt (b) mit einem thiol-haftigen Material, in welchem der Thiokest aktiviert worden ist, um ein Konjugat der Formel

A[NH-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-(CH&sub3;)&sub2;C-S-S-B]x

zu erhalten, wobei B das thiol-hakige Material ist.

9. Verbindung der folgenden allgemeinen Formel:

R&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;,

wobei R&sub1; eine thiol-reaktive Einheit darstellt, R&sub2; ein acyclischer aliphatischer Zwischenkettenarm ist und R&sub3; eine thiol-blockierende Einheit ist.

10. Verbindung nach Anspruch 9, wobei R&sub1; gewählt wird aus

Z ein aus Cl, Br und I gewähltes Halogenatom ist, R&sub2; gewählt wird aus

n zwischen 1 und 20 und w zwischen 1 und 100 beträgt und R&sub3; gewählt wird aus

-CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; und -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;.

11. Verbindung nach Anspruch 10, wobei u 6 beträgt, w zwischen 1 und 5 beträgt und R&sub3; -CO-CH&sub3; ist oder wobei u 2 beträgt, w zwischen 1 und 5 beträgt, Z ein Br darstellt und R&sub3;-CO-CH&sub3; ist.

12. Verbindung einschließlich einer oder mehrerer derivatisierter Thiole der Formel

A-[S-R'1-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;]x,

wobei A ein thiol-haltiges Material ist; -R'&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S- eine Kupplungseinheit ist, R'&sub1; gewählt wird aus

R&sub2; gewählt wird aus

n zwischen 1 und 20 und w zwischen 1 und 100 beträgt, R&sub3; gewählt wird aus

-H, -CO-CH&sub3;, -CO-C&sub2;H&sub5; und -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;

und x die Zahl der derivatisierten Thiole auf A angibt.

13. Verbindung nach Anspruch 12, wobei A ein Fab'-Fragment ist, R&sub2; -(CH&sub2;)&sub6;- ist und R&sub3; -CO-CH&sub3; ist.

14. Konjugat, umfassend ein erstes thiol-haltiges Material, das durch eine Kupplungseinheit an ein zweites thiol-haltiges Material gebunden ist, wobei das Konjugat die Formel

A[-S-R'&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-S-B]x

aufweist, in der A das erste thiol-haltige Material ist, welches durch ein Schwefelatom des ersten Thiolrests an die Kupplungseinheit gebunden ist, die Kupplungseinheit R'&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S- ist, R'&sub1; gewählt wird aus

R&sub2; gewählt wird aus

n zwischen 1 und 20 und w zwischen 1 und 100 beträgt, B das zweite thiol-haltige Material ist und x die Zahl der Schwefelatome auf A, welche an die Kupplungseinheit gebunden sind, ist.

15. Konjugat nach Anspruch 14, wobei R'&sub1; -CH&sub2;-CO-NH-(CH&sub2;)&sub5;- ist; und R&sub2; -(CH&sub2;)&sub6;- ist.

16. Konjugat nach Anspruch 14 oder nach Anspruch 15, wobei A und B Proteine sind, A gegebenenfalls ein Fab'-Fragment ist, vorzugsweise von einem monoklonalen Antikörper, der an menschliche Krebszellen bindet, und B Ricintoxin ist, vorzugsweise eine Ricintoxin-A-Kette.

17. Verfahren zur Herstellung eines in einem der Ansprüche 14 bis 16 definierten Konjugats, umfassend die Schritte:

(a) Umsetzen des Schwefelatoms des ersten thiol-haltigen Materials mit einer Kupplungseinheit der Formel

R&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;,

wobei R&sub1; eine thiol-reaktive Einheit ist, gewählt aus

Z ein aus Cl, Br und I gewähltes Halogenatom ist, R&sub2; gewählt wird aus

n zwischen 1 und 20 und w zwischen 1 und 100 beträgt und R&sub3; eine thiolblockierende Einheit ist, gewählt aus

-CO-CH&sub3; , -CO-C&sub2;H&sub5; und -CO-(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;,

um ein Produkt zu bilden, in dem das erste thiol-hahige Material durch das Schwefelatom an die Kupplungseinheit gebunden ist, wobei das Produkt die Formel

A-[S-R'1-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-R&sub3;]x

aufweist, in der A das erste thiol-haltige Material ist, R'&sub1; gewählt wird aus

und x die Zahl der Schwefelatome auf A, welche an die Kupplungseinheit gebunden sind, ist;

(c) Umsetzen des Produkts aus Schritt (b) mit dem zweiten thiol-hakigen Material, in dem der/die Thiolrest(e) aktiviert worden ist/sind, um ein Konjugat der Formel

A-[S-R'&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-S-B]x

zu erhahen, wobei B das zweite thiol-hakige Material ist.

18. Verwendung eines in einem der Ansprüche 5 bis 7 oder einem der Ansprüche 14 bis 16 definierten Konjugats, wobei A jeweils ein monoklonaler Antikörper ist, der an menschliche Krebszellen bindet, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs beim Menschen, gegebenenfalls Brustkrebs.

19. Verfahren zur Synthese einer Verbindung der Formel:

R&sub1;-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub2;,

wobei R&sub1;

ist, R&sub2; ein Alkyl- oder Arykest, wahlweise -CH&sub3;, ist und n zwischen 1 und 20, wahlweise 2, beträgt; umfassend die Schritte

(a) Umsetzen eines Dimethylacryloylhalogenids der Formel

W-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;,

wobei W ein Chlor- oder Bromatom ist, mit einem Aminoalkylencarbonsäurealkylester mit kurzer Alkylkette der Formel

Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH&sub2;,

wobei Y gewählt wird aus

(CH&sub3;)&sub3;C-, H&sub3;C- und H&sub5;C&sub2;-

in einem Lösemittel, welches eine säureneutralisierende Verbindung enthält, um ein Produkt der Formel

Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;

zu bilden;

(b) Umsetzen des Produkts aus Schritt (a) mit einer Thiosäure der Formel

H-S-CO-R&sub2;,

in der R&sub2; wie vorstehend definiert ist, in einer Reaktion vom Michael-Typ um ein Produkt der Formel

Y-O-CO-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub2;

zu bilden;

(c) Umsetzen des Produkts aus Schritt (b) mit einer Säure, wahlweise Trifluoressigsäure, um ein Produkt der Formel

HO-OC-(CH&sub2;)n-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub2;

zu bilden;

(d) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel, wahlweise Dimethylformamid, in Gegenwart eines Carbodiimids, wahlweise Dicyclohexylcarbodiimid, mit Natrium[4-hydroxy-3-nitro]benzol-sulfonat (HNSA) um ein Produkt der Formel

zu bilden;

oder

(e) Umsetzen des Produkts aus Schrtt (c) in einem Lösemittel, wahlweise Dimethylformamid, in Gegenwart eines Carbodiimids, wahlweise Dicyclohexylcarbodiimid, mit Sulfo-N-Hydroxysuccinimid um ein Produkt der Formel

zu bilden;

oder

(f) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel, wahlweise Methylenchlorid, in Gegenwart eines Carbodilmids, wahlweise Dicyclohexylcarbodiimid, mit N-Hydroxysuccinimid, um ein Produkt der Formel

zu bilden.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei im Schritt (a) das Lösemittel gewählt wird aus Methylenchlorid, Ether, Chloroform, Benzol, Tetrahydrofuran, Dioxan und Hexan, und die säureneutralisierende Verbindung ein tertiäres Amin oder Pyridin ist, wahlweise ist das Lösemittel Methylenchlorid und die säureneutralisierende Verbindung ist Triethylamin; R&sub2; gewählt wird aus -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5; und -(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;; in Schritt (c), wenn Y (CH&sub3;)&sub3;C- ist, die Säure Trifluoressigsäure ist, wenn Y -CH&sub3; oder -C&sub2;H&sub5; ist, wäßrige HCl oder wäßrige H&sub2;SO&sub4; ist; in den Schritten (d) und (e) das Lösemittel Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid ist; in Schritt (f) das Lösemittel Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Methylenchlorid oder Chloroform ist; und in den Schritten (d), (e) und (f) das Carbodiimid Dicyclohexylcarbodiimid oder Diisopropylcarbodiimid ist.

21. Verfahren zur Synthese einer Verbindung der Formel:

R&sub1;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;,

wobei R&sub1; gewählt wird aus

Z ein aus Cl, Br und I gewähltes Halogenatom ist, R&sub2; ein acylischer aliphatischer Zwischenkettenarm ist, gewählt aus

n zwischen 1 und 20 imd w zwischen 1 und 100 beträgt, und R&sub3; ein Alkyl- oder Arykest, wahlweise -CH&sub3;, ist; umfassend die Schritte

(a) Umsetzen eines Dimethylacryloylhalogenids der Formel

W-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;,

in welcher W ein Chlor- oder Bromatom ist, mit entweder einem 1-t-Butoxycarbonylalkandiamin oder einem 1-t-Butoxycarbonylalkyloxydiamin der Formel

(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;-NH&sub2;

in welcher R&sub2; wie vorstehend definiert ist in einem Lösemittel, welches eine säureneutralisierende Verbindung enthält, um ein Produkt der Formel

(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;NH-CO-CH=C(CH&sub3;)&sub2;

zu bilden;

(b) Umsetzen des Produkts aus Schritt (a) mit einer Thiosäure der Formel

H-S-CO-R&sub3;,

in der R&sub3; wie vorstehend definiert ist, in einer Reaktion vom Michael-Typ um ein Produkt der Formel

(CH&sub3;)&sub3;C-O-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;

zu bilden;

(c) Umsetzen des Produkts aus Schritt (b) mit einer Säure, wahlweise Trifluoressigsäure, um ein Frodukt der Formel

NH&sub2;-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;

zu bilden;

(d) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel, wahlweise Dimethylformamid, mit 6-Maleinimido-hexansäure-Natrium(4-hydroxy-3-nitro)benzolsulfonat um ein Produkt der Formel

zu bilden;

oder

(e) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel, wahlweise Chloroform, mit 4-(N-Maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure-succinimid, um ein Produkt der Formel

zu bilden;

oder

(f) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel, wahlweise Dimethylformamid, mit einer Verbindung der Formel

in der Z wie vorstehend definiert ist, um ein Produkt der Formel

Z-CH&sub2;-CO-NH-(CH&sub2;)&sub5;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;

zu bilden;

oder

(g) Umsetzen des Produkts aus Schritt (c) in einem Lösemittel, wahlweise Dimethylformamid, mit einer Verbindung der Formel

in der Z wie vorstehend definiert ist, um ein Produkt der Formel

Z-CH&sub2;-CO-NH-R&sub2;-NH-CO-CH&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-S-CO-R&sub3;

zu bilden.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei in Schritt (a) das Lösemittel gewählt wird aus Methylenchlorid, Ether, Chloroform, Benzol, Tetrahydrofiiran, Dioxan und Hexan, und die säureneutralisierende Verbindung ein tertiäres Amin oder Pyridin ist, wahlweise ist das Lösemittel Methylenchlorid und die säureneutralisierende Verbindung ist Triethylamin; R&sub3; gewählt wird aus -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5; und -(CH&sub2;)&sub2;-CH&sub3;; in Schritt (c) die Säure Trifluoressigsäure oder Ameisensäure ist; in den Schritten (d), (f) und (g) das Lösemittel Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid ist; und in Schritt (e) das Lösemittel gewählt wird aus Chloroform, Methylenchlorid, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid.

23. Verbindung umfassend die Struktur