DE69015233T2

DE69015233T2 - Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Bernsteinsäure.

Info

Publication number: DE69015233T2
Application number: DE69015233T
Authority: DE
Inventors: Rathin Datta; David A Glassner
Original assignee: Michigan Biotechnology Institute
Current assignee: Michigan Biotechnology Institute
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-02-20
Publication date: 1995-08-24
Anticipated expiration: 2010-02-21
Also published as: JP2872723B2; AU4938590A; JPH02283289A; DE69015233D1; NZ231315A; AU626381B2; US5143834A; EP0389103B1; CA1334583C; EP0389103A1; ATE116003T1

Description

Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung van Bernsteinsäure durch anaerobische Fermentation, Elektrodialyse und Ionenaustausch.
Bernsteinsäure und ihre Derivate werden in großem Umfang als Spezialchemikalien zur Verwendung in Polymeren, Nahrungsmitteln, Pharmazeutika und Kosmetika benutzt. Darüber hinaus ist Bernsteinsäure ein wertvolles 4-Kohlenstoffatome enthaltendes Zwischenprodukt für die Herstellung van 1,4-Butandiol, Tetrahydrofuran und Gamma-Butyrolacton.
Das Succinat-Ion ist ein übliches Zwischenprodukt beim Stoffwechsel verschiedener anaerobischer Mikroorganismen. Succinat ist ein Zwischengrundstoff für anaerobische Fermentationen durch Propionat erzeugende Bakterien; es wird jedoch nur mit geringen Ausbeuten und in niedrigen Konzentrationen erzeugt.
Um ein technisch brauchbares Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure durch Fermentation zu erhalten, müssen mehrere wesentliche Kriterien bei der Fermentation und der Reinigung des Produktes erfüllt werden. Die Fermentation sollte mit einer hohen Ausbeute (Gew. %) erfolgen und zu einem Endprodukt mit hoher Konzentration bei Verwendung kostengünstiger Rohmaterialien und Nährstoffe führen. Da anaerobische Fermentationen im neutralen Bereich oder bei annähernd neutralen pH-Werten ablaufen, werden mehr Salze organischer Säuren als die Säuren selbst erzeugt. Die Fermentationsbrühe enthält außerdem Zellenmaterial, Proteine oder andere unerwünschte Stoffe. Das mit dem Verfahren erhaltene gewünschte Produkt ist die gereinigte Säure, die für die Herstellung spezieller oder handelsüblicher chemischer Produkte verwendet werden kann. Ein ökonomisches Fermentationsverfahren mit hoher Ausbeute muß daher mit einem wirksamen Reinigungs- und Rückgewinnungsverfahren gekoppelt werden.
Aus der EP-A-249773 ist ein Verfahren zur anaerobischen Fermentation von Kohlenhydraten zu Succinaten bekannt, bei dem unter anderen Anaerobiospirilium succiniciproducens benutzt wird.
Es besteht ein Bedarf für ein verbessertes, wirtschaftlich interessantes Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Bernsteinsäure.
Es wurden ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure, das darin besteht, eine Fermentation durchzuführen, bei der ein widerstandfähiger Stamm eines anaerobischen, Succinat erzeugenden Mikroorganismus benutzt wird, der Bernsteinsäuresalz in hoher Konzentration aus einem kostengünstigen Fermentationsmedium erzeugt und ein Reinigungssystem gefunden, bei dem eine übliche Elektrodialyse benutzt wird, um das Succinat aus der Gesamtbrühe, die Zellen und stickstoffhaltige Verunreinigungen enthält, wiederzugewinnen und zu konzentrieren; eine wasserabspaltende Elektrodialyse wird benutzt, um das erhaltende Succinat in Bernsteinsäure und die Base umzuwandeln; durch eine Behandlung mit Ionenaustauschern werden die geladenen Verunreinigungen aus der Bernsteinsäure entfernt.
Bei einem Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Bernsteinsäure, bei dem ein anaerobischer, Succinat erzeugender Mikroorganismus in einem Fermentor auf einem Substrat gezüchtet wird, das Kohlenhydrat und andere Nährstoffe enthält, bis der größte Teil des in der Fermentierungsbrühe enthaltenen Kohlenhydrats in ein Succinatsalz umgewandelt ist, wobei das Substrat Kohlenhydrat in einer anfänglichen Konzentration zwischen etwa 20 g/l und etwa 100 g/l enthält und einen zwischen etwa 5,8 und 6,6 liegenden pH-Wert hat und der Partialdruck des CO&sub2; wenigstens bei 0,1013 bar (0,1 atm) liegt, besteht die Erfindung darin, daß
(a) die das Succinatsalz enthaltende Brühe zunächst einer üblichen Elektrodialyse unterworfen wird, um bevorzugt das Succinatsalz in einer wässrigen Lösung wiederzugewinnen und zu konzentrieren und die stickstoffhaltigen Verunreinigungen zu entfernen,
(b) die wässrige Lösung, die das konzentrierte Succinatsalz enthält, einer wasserspaltenden Elektrodialyse unterworfen wird, um das Succinatsalz in die entsprechende Base und eine Bernsteinsäurelösung umzuwandeln,
(c) die Bernsteinsäurelösung mit einem stark sauren Ionenaustauscher in Säureform behandelt wird, um Natrium oder andere Kationen aus der Lösung zu entfernen, ohne die Bernsteinsäure zu entfernen und daß
(d) die so behandelte Bernsteinsäure mit einem schwach basischen Ionenaustauscher in der freien Basenform behandelt wird, um die Schwefelsäure oder Sulfatverunreinigungen aus der Lösung zu entfernen, ohne Bernsteinsäure zu entfernen und ein gereinigtes Bernsteinsäureprodukt zu erhalten.
Die Erfindung ermöglicht es, ein Bernsteinsäureprodukt herzustellen, das weniger als 1 % stickstoffhaltige Stoffe (Protein) und weniger als 10 ppm verunreinigende Sulfationen enthält. Das Produkt kann außerdem bis zu 20 % Essigsäure enthalten.
Bevorzugte Verfahrensschritte und Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden anhand der Zeichnung beispielsweise erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein Fließbild, das das erfindungsgemäße Verfahren verdeutlicht,
Fig. 2 eine schematische Darstellung des bevorzugten Elektrodialysesystems und
Fig. 3 eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Tryptophan auf die Fermentationsgeschwindigkeit wiedergibt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine im wesentlichen reine Kultur von A. succiniciproducens (ATCC 53488) anaerobisch bei einem überwachten pH-Wert zwischen etwa 5,8 bis etwa 6,6 in einem Fermentor auf einem Kohlenhydrate, andere Nährstoffe, wie z. B. Getreideextrakt (corn steep liquor), Tryptophan und Natriumionen enthaltenden Medium bei einem Partialdruck von wenigstens 0,1 atm CO&sub2; gezüchtet bis eine Ausbeute von etwa 75 Gew.-% Succinatsalz, bezogen auf das Gewicht des Kohlenhydrats erhalten wird und die Fermentationsbrühe wenigstens 20 g/l Succinat enthält.
Das in der Praxis erfindungsgemäß benutzte Kohlenhydrat kann irgendein Kohlenhydrat sein, das durch den benutzten Bakterienstamm fermentiert wird. Für A. succiniciproducens sind diese Kohlenhydratquellen Dextrose, Succharose, Fruktose, Lactose, lösliche Stärke und Getreideextrakte. Die Fermentation wird in einem wässrigen Medium durchgeführt, das Tryptophan, Natriumionen und gelöstes Kohlendioxid enthält. Andere Nährstoffe und Wachstumsfaktoren, die für das Wachstum und die Reproduktion der verwendeten Mikroorganismen benutzt werden, werden dem Medium ebenfalls zugefügt.
Die Konzentration des Kohlenhydrats in dem Medium liegt zwischen etwa 20 g/l bis etwa 100 g/l, vorzugsweise zwischen etwa 40 g/l und etwa 80 g/l. Konzentrationen an Kohlenhydrat über etwa 100 g/l führen zu Lösungen mit derart hohen osmotischen Drucken, daß der Organismus nicht gut wächst. Obwohl der Organismus in Lösungen wächst, die weniger als 20 g Kohlenhydrat pro Liter enthalten, ist die Konzentration des Produktes so gering, daß seine Wiedergewinnung sich in den meisten Fällen nicht lohnt.
Kohlendioxid kann dem Fermentationsmedium in unterschiedlicher Weise zugegeben werden. Das Medium kann mit Kohlendioxidgas besprüht werden. Die Fermentation kann in einem unter Druck stehenden Reaktor durchgeführt werden, der Kohlendioxid unter Überdruck enthält. Das Kohlendioxid kann mit anderen Gasen gemischt werden, vorausgesetzt, daß die verwendeten Gase das Wachstum und den Stoffwechsel der verwendeten Organismen nicht stören. Kohlendioxid kann dem Fermentationsmedium ferner durch Zusatz von Carbonaten oder Bicarbonaten, die das Gas unter den Fermentationsbedingungen erzeugen, zugegeben werden. Das Medium sollte gelöstes CO&sub2; im Gleichgewicht mit einem minimalen CO&sub2;-Partialdruck von etwa 0,1013 bar (0,1 atm) oder höher enthalten. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist das Medium mit Kohlendioxid gesättigt und die Atmosphäre enthält Kohlendioxid mit einem Partialdruck von etwa 0,3039 bar (0,3 atm) oder darüber.
Um eine gute Succinatsalzerzeugung zu erhalten, wird der pH-Wert des Mediums etwa zwischen 5,8 und etwa 6,6 gehalten. Bei höheren pH-Werten ist das Hauptprodukt eher ein Lactat als ein Succinat, während bei niedrigeren pH-Werten die Fermentation gestoppt wird. Der pH-Wert wird üblicherweise durch Zugabe von Alkalicarbonaten, Erdalkalihydroxiden oder Mischungen dieser Stoffe aufrechterhalten.
Der Fermentationsprozeß gemäß vorliegender Erfindung wird bei einer Temperatur zwischen etwa 200 und 49 ºC ausgeführt. Ein optimales Wachstum des A. succiniciproducens-Organismus erfolgt bei etwa 39 ºC. Da es sich dabei um einen strengen Anaerobier handelt, werden Fermentationen, bei denen der Organismus benutzt wird, unter anaerobischen Bedingungen in einem Medium durchgeführt, das durch Erwärmung oder andere bei der Fermentation bekannte Mittel keimfrei gemacht ist.
Die das Succinatsalz enthaltende Gesamtbrühe, einschließlich der Zellen, wird von dem Fermentor abgezogen und der Elektrodialyse unterworfen, um das Succinatsalz in einem wässrigen Strom wiederzugewinnen und zu konzentrieren. Die lebensfähigen Zellen werden in den Fermentor zurückgeführt. Der das Succinatsalz enthaltende wässrige Strom wird der wasserspaltenden Elektrodialyse unterworfen, um eine wässrige Lösung von Bernsteinsäure und eine Base zu bilden, die in den Fermentor zurückgegeben werden kann. Die wässrige Bernsteinsäurelösung wird dann einer Endreinigung durch Ionenaustausch unterworfen, wobei zunächst ein Kationenaustauscher und anschließend ein Anionenaustauscher benutzt wird, um positiv und negativ geladene Verunreinigungen zu entfernen und eine Bernsteinsäure mit höchstem Reinheitsgrad zu erzielen. Das Endprodukt enthält vorzugsweise etwa 70 bis 95 % Bernsteinsäure bis zu 30 %, üblicherweise zwischen etwa 5 und 20 % Essigsäure, weniger als 1 % stickstoffhaltige Verunreinigungen und weniger als 10 ppm Sulfationen oder andere verunreinigende Ionen.
Beispiele für Mikroorganismen, die für das Verfahren benutzt werden können, sind Stämme von Anaerobiospirillum succiniciproducens, B. amylophilus und B. ruminicola.
Der bevorzugte Mikroorganismus, A. succiniciproducens (ATCC 53488) hat sich als gut wachsend auf einem Kohlenhydrate enthaltenden Medium, vorzugsweise Dextrose, andere Nährstoffe, einschließlich Getreideextrakte, Natriumionen und wenigstens 10 ppm Tryptophan in Anwesenheit eines CO&sub2;-Partialdruckes von wenigstens 0,1013 bar (0,1 atm.) bei einer Temperatur von etwa 39 ºC erwiesen. Dieser Stamm ist in der Lage, Succinat in hohen Konzentrationen (35 bis 50 g/l) bei großer Produktivität (1,5 bis 2,0 g/l Std.) zu erzeugen. Er kann auch Succinatsalz in einer bezogen auf die Zellenpopulation hohen Konzentation erzeugen, so daß eine Elektrodialyse, bei der spezielle lonenaustauschmembranen benutzt werden, mit Erfolg für Zellen enthaltende Gesamtbrühe, ebenso wie für zellenfreie, geklärte Brühe benutzt werden kann, um das Succinatsalz zu einem gereinigten Salzprodukt zu reinigen und zu konzentrieren. Die Durchführung des Trennprozesses bei der Gesamtbrühe ist identisch mit der bei geklärter Brühe. Überraschenderweise verschmutzen die in der Gesamtbrühe enthaltenen Zellen die Elektrodialysemembranen nicht. Dadurch ist es möglich, die Zellen enthaltenden Brühen ohne Vorbehandlung, z. B. durch Filtration oder Zentriefugieren direkt dem Elektrodialysesystem zuzuleiten.
Die Elektrodialyse des Succinats und des Acetates aus der Fermentationsbrühe hat ferner zu der überraschenden Erkenntnis geführt, daß, obwohl sowohl Succinat als auch Acetat wiedergewonnen werden, das Succinat bevorzugt wiedergewonnen wird. Diese Erkenntnis macht die sehr spezifische Rückgewinnung durch Elektrodialyse noch selektiver. Eine mögliche Erklärung kann mit der divalenten Natur des Succinats, verglichen mit dem monovalenten Acetat zusammenhängen; die bevorzugte Überführung konnte jedoch nicht erwartet werden und ist bisher nirgendwo beschrieben worden.
Es wurde von der Fachwelt bislang nicht empfohlen, die Elektrodialysemembranen mit der Gesamtbrühe aus der Fermentation zu behandeln, die Zellen enthält. Vielmehr wurde durch Ultrafiltration, Mikrofiltration, Zentrifugieren oder umständliche Methoden zur Zerstörung der Zellen ein Kontakt zwischen Zellen und den ED-Membranen vermieden. Jedoch zeigen die Ergebnisse, bei denen der bevorzugte Mikroorganismus und das bevorzugte Elektrodialysesystem benutzt wird, daß die direkte Verarbeitung der Gesamtbrühe vor der Entfernung der Zellen durchführbar ist. Auf diese Weise ist es möglich, das Produkt aus dem Fermentor kontinuierlich verlustlos zu entfernen.
Im Anschluß an die Reinigung und Wiedergewinnung des Succinatsalzes durch Elektrodialyse kann die Entfernung der Natriumionen oder anderer geeigneter Kationen durch eine wasserspaltende Elektrodialyse erfolgen. Energetisch wirksame bipolare Membranen (Aquatech-Allied Signal) werden verwendet, um den größten Teil der Kationen des Salzes zu entfernen, was zu einem reine Säure enthaltenden Strom und einem Basenstrom zur Rückführung in den Fermentor führt.
Der Säurestrom enthält Natriumkationen und Sulfat, sowie andere Anionen, die leicht aus dem Verfahrensstrom entfernt werden können, indem man reinigende Ionenaustauschsäulen benutzt. Die Behandlung des Säurestroms erfolgt zunächst mit einem stark sauren Ionenaustauscher und dann mit einem schwach basischen Ionenaustauscher (Dowex 50Wx8 bzw. Röhm und Haas IRA 94), um Natrium und andere Kationen und dann Sulfate und andere Anionen zu entfernen. Durch diese Verfahrensweise werden auch einige restliche aus Aminosäuren bestehende Verunreinigungen entfernt. Das Endprodukt ist ein gereinigtes Gemisch aus Bernsteinsäure und Essigsäure, das zur Herstellung von speziellen und handelsüblichen Chemikalien Verwendung finden kann.
Auf Fig. 1 ist schematisch ein Fließdiagramm des Verfahrens zur Herstellung von Bernsteinsäure und deren Reinigung dargestellt. Die erste Stufe ist die Fermentation mit hoher Ausbeute und Produktivität. Kohlenhydrate, Nährstoffe und Kohlendioxid werden in dem Fermentor in Succinat und Acetatsalze umgewandelt. Die Gesamtbrühe wird dann einem üblichen Elektrodialysator zugeführt. Von diesem wird eine von Succinatsalz abgereicherte, Zellen enthaltende Brühe in den Fermentor zurückgeleitet oder aus dem System entfernt. Das gereinigte und (3 bis 4-fach) konzentrierte Succinatsalz aus der üblichen Elektrodialyseeinheit wird direkt, oder vorzugsweise nach Konzentration durch Verdampfen oder andere mit Membranen arbeitende Verfahren, einem wasserspaltenden Elektrodialysator zugeführt. Diese wasserspaltende Elektrodialyseeinheit erzeugt einen nahezu kationenfreien Bernsteinsäurestrom und eine Base, z. B. Natriumhydroxid oder Ammoniumhydroxid für die Rückführung in den Fermentor. Der Bernsteinsäurestrom, der restliche Kationen sowie Sulfat und andere Anionen enthält, wird dann durch die beiden Ionenaustauschsäulen geleitet. Durch die erste Behandlung mit einem stark sauren Ionenaustauscher in der Säureform werden Natrium und andere Kationen und durch die anschließende Behandlung mit einem schwach basischen Ionenaustauscher in der freien Basenform Schwefelsäure und Sulfatverunreinigungen entfernt, ohne Bernsteinsäure aus dem Strom zu entfernen. Bernsteinsäure und Essigsäure mit stickstoffhaltigen Verunreinigungen in einer Menge von weniger als 1 % (Trockensubstanz) und weniger als 10 ppm Sulfat oder anderen verunreinigenden Ionen ist das Produkt, das bei dem Verfahren anfällt. Auf diese Weise ist eine wirksame und wirtschaftliche Herstellung und Reinigung von Bernsteinsäure möglich.
Auf Fig. 2 der Zeichnung ist ein Elektrodialysator 10 dargestellt, der aus einem Zellenstapel 11, einem Fermentor 12, einem Sieb 13, einem Injektor für die Beschickungslösung, einem Kreislauf- und Abzugssystem 14, einem Kreislauf und Abzugssystem 15 für das Konzentrat und einem Spülsystem 16 für den Anolyten und einem Spülsystem 17 für den Katholyten besteht.
Die Vorrichtung ist auf der Zeichnung als Beispiel dargestellt; durch von Fachleuten vorgenommene Änderungen wird der Schutzumfang der Erfindung nicht verlassen.
Der Zellenstapel oder -block 11 kann eine beliebige bekannte Membrananordnung sein, z. B. eine Platten- oder Rahmenanordnung, bei der eine Vielzahl von mit passenden Bohrungen für die Verteilung der Strömung versehene Dichtungen 18 den Umfang einer Vielzahl von für Anionen durchlässige Membranen 19 und für Kationen durchlässige Membranen 20 halten und abdichten, die parallel zueinander mit Abstand angeordnet sind und eine Vielzahl paralleler Zellen 21 und Endzellen 22 und 23 bilden. Jede Zelle 21 besteht aus einem Membranenpaar 19 und 20 und einer Dichtung 18. Die Endzellen 22 und 23 werden durch eine Membran 19 bzw. eine Membran 20 und Endabdeckungen 24 begrenzt. Innerhalb der Zelle 22 ist eine geeignete Anode 25 und in der gegenüberliegenden Endzelle 23 eine Kathode 26 angeordnet. Die Anode 25 und die Kathode 26 sind jeweils mit der positiven oder negativen Klemme einer (nicht dargestellten) geeigneten Stromquelle über Leitungen 27 und 28 verbunden. Der Zellenblock 11 enthält ebenfalls geeignete, nicht dargestellte Anschlüsse zum Zuführen oder Abführen von Flüssigkeiten aus jeder Zelle 21. Die Bestandteile des Zellenblocks 11 können durch geeignete (nicht dargestellte) Klemmen oder Zugstangen so gehalten werden, daß sie gegeneinander stoßen.
Die Membranen 19 sind für Anionen durchlässig und für Kationen undurchlässig, während die Membranen 20 für Kationen durchlässige und für Anionen undurchlässige Membranen sind. Zur Verwendung für die Membranen 19 und 20 geeignete Stoffe sind Anionen- und Kationenaustauschharze mit entsprechenden aktiven Stellen zum Einfangen von Ionen. Die bevorzugt für die Membranen 19 benutzten Membranen bestehen aus mit Gewebe verstärkten mikroheterogenen, interpolymeren Membranen, z. B. die Anionenaustauschmembranen, die von der Firma Asahi Glas Co. unter der Bezeichnung SELEMION AMV vertrieben werden, während für die Membranen 20 vorzugsweise Kationenaustauschmembranen benutzt werden, die unter der Bezeichnung SELEMION Typ CMR von der gleichen Firma angeboten werden. Die Membranen sind beispielsweise in dem US-Patent 4 678 553 beschrieben. Eigenschaften dieser beiden Membranen sind in Tabelle I aufgeführt. Tabelle 1 Typen und Eigenschaften von SELEMION -Membranen Bezeichnung Bemerkungen Typ Transport Nummer Widerstand Bereich Stärke Durchbruchstärke Verwendung stark saure kationendurchlässige Membran (Na&spplus; Typ) stark basische anionendurchlässige Membran (Cl&supmin; Typ) über unter Allgemeine Entsalzung/Komzentration Seewasserentsalzung berechnet von dem Membranpotential: 0,5/1,0 mol/P NaCl Lösung bei 20 ºC gemessen durch Elektrodialyse von Seewasser bei 2A/dm² gemessen durch 1000 Hz-AC 0,5 mol/P NaCl bei 25 ºC *Nach Behandlung
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sieht eine Verfahrensweise vor, bei der die Gesamtbrühe von dem Fermentor 12 durch das Sieb 13 gepumpt wird, das Teile entfernt, die größer sind als die Zellenteilchen. Die Gesamtbrühe, abzüglich derartiger Bestandteile, wird über das System 14 den Zellen 21 zugeführt, wo sie einem elektrischen Strom unterworfen wird, der die Wanderung der Succinationen durch die durchlässige Membran 19 in eine konzentrierte Succinatsalzlösung verursacht, die in dem System 15 auf der anderen Seite der Membran 19 umläuft. Wie sich aus Fig. 1 ergibt, wird die angereicherte Succinatsalzlösung, die auch als Konzentrat bezeichnet wird, in eine Vorrichtung zur wasserspaltenden Elektrodialyse überführt, um das Succinatsalz in Bernsteinsäure umzuwandeln. Der Produktstrom, ohne das Succinatsalz, der jedoch die lebensfähigen Zellen enthält, wird in den Fermentor zurückgeleitet. Während die Elektrodialyse weiterläuft werden die Elektroden mit einer geeigneten elektrolytischen Lösung, von z. B. NA&sub2;SO&sub4; oder Succinatsalz in Wasser gespült, die im Kreislauf durch die Waschsysteme 16 und 17 geleitet wird. Das Verfahren kann entweder chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Versuchsergebnissen erläutert:
Probeläufe anaerobischer Fermentationen wurden in 2l-Fermentoren vom Typ New Brunswick Multigen durchgeführt. Das anfängliche Volumen der Brühe betrug 1,0 Liter. Sofern nichts anderes erwähnt ist, enthielt die Brühe die folgenden Komponenten:
50 g/l Dextrose,
10 g/l Getreideextrakt (Trockenbasis).
Der flüssige Medienstrom wurde in den Fermentor eingefüllt und im Autoklaven behandelt. Nach Entfernung aus dem Autoklaven wurde der Fermentor mit CO&sub2;-Gas behandelt und es wurden 10 ml 3M Natriumkarbonat oder 3,5 g/l Natriumclorid, um Natriumionen zuzufügen, 25 ppm Tryptophan und 125 ppm Cystein HCL/Natriumsulfid dem Fermentor zugegeben. Der CO&sub2;-Strom wurde durch Abklemmen der Auslaßleitung unterbrochen. Anschließend ließ man das Medium und den Fermentor etwa eine Stunde lang reduzieren. Der Fermentor war dann fertig für die Inokulation durch Verwendung eines 5 %igen v/v Inokulums. Bei allen Versuchen wurde Kohlendioxid mit einer Geschwindigkeit von 10 cm³/min. eingeleitet, soweit nichts anderes erwähnt ist.
Die Produktströme für die Rückgewinnung des Natriumsuccinats durch Elektrodialyse wurden durch Verwendung eines 80 l Fermentors in der Pilotanlage hergestellt.
Die anaerobische Fermentation wurde bei 39 ºC in einem Fermentor mit einem anfänglichen Volumen von 55 l während 29 Stunden durchgeführt. Der benutzte Fermentor war ein 80 Liter New Brunswick Scientific Pilot Plant-Fermentor. Das Medium enthielt annähernd 35 g/l Dextrose 10 g/l Getreideextrakt, 3,5 g/l NaCl und 25 ppm Tryptophan. Es wurde ein 5 %iges Inokulum benutzt. Der pH-Wert wurde zwischen 6,1 und 6,3 durch Zugabe von Natriumkarbonat auf einer Bedarfsbasis gehalten. Die Rührgeschwindigkeit betrug 100 U/min.
Die Zellen in der Fermentationsbrühe wurden, wenn es erforderlich war, dadurch entfernt, daß die Brühe durch eine Ultrafiltrationsanlage geleitet wurde, deren Hohlfaserkartusche eine Porengröße von 0,2 Mikron hatte.
Frisch hergestellte Gesamtbrühe (die lebensfähige Zellen enthielt) von der gleichen Fermatation wurde für die Untersuchungen der Gesamtbrühe benutzt. Die Gesamtbrühe wurde in einem Sieb mit 200 Maschen gesiebt, um größere Partikel zu entfernen, bevor sie der Elektrodialyse zugeführt wurde.
Das Fermentationprodukt wurde dann gereinigt, indem es zunächst durch eine übliche Elektrodialyseeinheit geleitet wurde, die mit für Anionen und Kationen selektiven Membranen ausgestattet war.
Der Elektrodialyseblock besteht aus abwechselnden Reihen von für Anionen und Kationen selektiven Membranen, die durch die die Strömung verteilenden Abdichtungen getrennt sind. Die Membranen sind an einem Ende durch ein anolytisches Abteil und eine Anode und am anderen Ende durch ein katholytisches Abteil und eine Kathode begrenzt, wie Fig. 2 zeigt. Der Block enthielt folgende Teile:
10 Zellenpaare
Anionenmembran - AMV
Kationenmembran - CMR,
wirksame Fläche - 178 cm² und
Elektrolyt - 1 M Natriumsuccinat in Wasser.
Die Einheit enthält drei unabhängige Strömungsbahnen, die dem Block des Elektrodialysegerätes zugeführt werden. Die drei Ströme sind:
1) Verdünnungsstrom - Ausgangsmaterialien, Brühe
2) Konzentrationsstrom - Produkt
3) Elektrolyt - Natriumsuccinat oder Natriumsulfat
Von jedem Speicherbehälter wurde Material durch ein Ventil, einen Rotamesser (Durchflußmesser), einen Druckmesser, ein Druckgerät, die Packung des Blockes und dann zurück zu dem Speicher gepumpt. Ein anderer Satz von fünf Gallonen-Behältern wurde zur Entnahme unter jedem Speicherbehälter angeordnet.
Der elektrische Strom wurde durch eine regulierbare Wechselstromquelle geliefert, die mit der Anode und der Kathode der Membranenpackung verbunden wurde und 0-20 Ampere und 0-50 Volt liefern konnte. Ein Vielfachmeßgerät (Fluke A 75) wurde benutzt, um den Spannungsabfall durch die Membranen (mit Ausnahme der Elektroden) zu messen. Die Platindrähte wurden zwischen 8 Zellenmembranpaaren eingelegt und dann an das Voltmeter angeschlossen.
Ein aus zwei Abteilen bestehender Block mit bipolaren Membranen wurde verwendet, um organische Salze in organische Säuren und ihre entsprechende Base umzuwandeln. Der Block, der für dieses Verfahren entwickelt wurde, bestand aus sich abwechselnden für Kationen durchlässigen und bipolaren Membranen. Das Anodenabteil und das Kathodenabteil wurden durch eine Nafion-Membran an beiden Enden des Membranblockes begrenzt. Die Membranpackung enthielt folgende Teile:
- 8 Zellenpaare
- Kationmembran
- bipolare Membran
- wirksame Fläche 102,4cm² und
- Elektrolyt (2,5 N NaOH)
Die Einheit enthält drei unabhängige Strömumgsbahnen, die zu dem Block des Elektrodialysators führen. Die drei Ströme sind:
1) Säurestrom (anfänglich der Strom des Natriumsuccinatsalzes);
2) Basenstrom (wird mit fortschreitendem Verfahrensablauf konzentriert)
3) Spülstrom für die Elektroden (2,5 N NaOH)
Vor dem ersten Durchlauf wurde die zulässige Stromdichte (PCD) ermittelt, um einen sicheren Bereich für die Betriebsstromdichte zu bestimmen.
Die Anlage wurde mit niedrigem Strom betrieben und die Spannung alle 30 sec. während eines Zeitraumes von 30 min. bis 2 Std. aufgezeichnet. Wenn die Spannung über die Zeit konstant blieb, wurde das Verfahren mit einem höheren Strom wiederholt. Diese Arbeitsweise wurde fortgeführt bis ein Punkt erreicht wurde, an dem die Spannung anfing, sich über die Zeit zu erhöhen, wodurch das Einsetzen der Polarisation und der Zersetzung angezeigt wurde. Die PCD an diesem Punkt war die Stromdichte für diese Arbeitsbedingungen (Salzkonzentration, pH-Wert, Temperatur und lineare Geschwindigkeit). Die anfängliche Betriebsstromdichte (8 A., 45 mA/cm²) wurde aufgrund der PCD-Ergebnisse ausgewählt.
Das System wurde chargenweise betrieben. Die Succinatbrühe wurde daher kontinuierlich entmineralisiert. Das Elektrodialyseverfahren wurde fortgeführt bis die Lösung bis zu einem gewünschten Grad entmineralisiert war.
Nach der wasserspaltenden Elektrodialyse enthält das Säureprodukt restliches Natrium und Sulfat (und andere Anionen). Es wurden Ionenaustauscher benutzt, um die Natriumionen (Dowex 50Wx8) und die Sulfationen (Röhm und Haas IRA-94 zu entfernen. Glassäulen mit einem Durchmesser von 2 inch (5,08 cm) wurden für die Behandlung der Produktströme aus der wasserabspaltenden ED durch Ionenaustausch benutzt.
Bei der kontinuierlichen Arbeitsweise wurden zwei Säulen verwendet. Die Ionenaustauschharze wurden beladen, rückgewaschen und aufbereitet aufgrund der Angaben der Hersteller. Das Bettvolumen (Volumen des Harzes unter den obigen Bedingungen) wurde zu diesem Zeitpunkt bestimmt. In der Adsorbtionsstufe wurde eine Durchflußgeschwindigkeit von 0,01 Bettvolumen/min. benutzt. Die Bernsteinsäure/Essigsäurelösung betrug annähernd 1 N, die Natriumkonzentration 0,2 bis 0,3 N. Das Bettvolumen für den Kationenaustauscher betrug das Doppelte bezogen auf das benötigte Dowex 50 Wx8-Volumen von 1,8 Milliäquivalenten pro ml.
Das Bettvolumen für den Anionenaustauscher betrug das Doppelte der benötigten Ionenaustauschkapazität, bezogen auf den Sulfatgehalt der Lösung. Das IRA-94 Austauschvolumen betrug 1,3 Milliäquivalente pro ml.
Die Leitfähigkeit wurde mit einem tragbaren Gerät zur Messung der Leitfähigkeit (Cole Parmer Modell 1484-10) gemessen.
Die angegebenen Succinat- und Acetatkonzentrationen entsprechen der Anionenkonzentration und wurden nach geeigneter Verdünnung und Ansäuerung mittels eines HPLC-Verfahrens unter Verwendung einer 1 Fuß (30,48 cm) hohen HPx87 H&spplus;-Säule gemessen.
Der Gesamtgehalt an Proteinen wurde nach der Kjeldahl-Methode gemessen und ist als Stickstoff x 6,25 % angegeben.
Die Sulfatkonzentration wurde durch gravimetrische Bestimmung des Bariumsulfatniederschlages bestimmt. Die Natriumkonzentration wurde mittels eines selektiven Ionenmeßgerätes (Orion SA 720) und einer Natriumelektrode bestimmt.

Beispiele 1 bis 5

A. succiniciproducens-Fermentationen wurden durchgeführt, um eine hohe Ausbeute und eine hohe Produktivität des Succinates zu erhalten. Die Fermentationen wurden in einem 2 l New Brunswick Multigen-Fermentor bei unterschiedlich eingestellten pH-Werten durchgeführt, wobei unterschiedliche CO&sub2;-Konzentrationen mit und ohne Anwendung Carbonat gepufferter Bedingungen und verschiedene monovalente Alkalikationen benutzt wurden.
Das Ergebnis einer A. succiniciproducens-Fermentation bei mehreren unterschiedlich gesteuerten pH-Werten sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Der pH-Wert wurde auf Werte zwischen 5,5 und 7,2 eingestellt. Der Organismus wuchs nicht und verbrauchte kein Substrat bei einem pH-Wert von 5,5. Der optimale pH-Bereich für eine hohe Ausbeute an Succinat liegt bei 5,8 bis 6,6. Der optimale pH-Wert für die Ergiebigkeit an Succinat liegt bei 5,9 bis 6,3. Die maximale Succinatausbeute liegt bei 87-90 Gew.-% bezogen auf verbrauchte Dextrose. Bei pH-Werten höher als 6,6 ist der Succinatgehalt gering und es wird Lactat produziert. Unter optimalen ph-Wert-Bedingungen (5,8-6,6) ist das hauptsächliche Nebenprodukt, das kein Succinat ist, Acetat. Tabelle 2 Fermentationsprodukte von A. succiniciproducens bei unterschiedlichen pH-Werten Beisp. Dextrose (Beginn), g/l Dextrose (Ende), g/l Fermentationszeit/Std. Produkte Succinat, g Acetat, g Formiat, g Lactat, g Succinatausbeute, Gew.-% Lactatausbeute, Gew.-% Bemerkung:
Bei einem pH-Wert von 5,5 wurde nur eine kleine Menge an Glukose verbraucht.

Beispiele 6-8

Mehrere unterschiedliche Konzentrationen an Kohlendioxid wurden in dem durchgeleiteten Gas verwendet, um festzustellen, wie die Fermentation durch den Partialdruck des Kohlendioxid beeinflußt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Bei einem niedrigen CO&sub2;-Partialdruck ist die Succinatausbeute gering und die Fermentation verläuft langsam und nicht vollständig. Es ist daher ein CO&sub2;-Partialdruck notwendig, der größer als 0,1013 bar (0,1 atm.) ist, um Succinat mit hoher Ausbeute und Geschwindigkeit zu erzeugen. Tabelle 3 Wirkung des CO&sub2;-Partialdrucks bei einer A. succiniciproducens Fermentation Beisp. CO&sub2; Partialdruck (atm)&spplus; 0%* Dextrose (Beginn), g Dextrose (Ende), g Fermentationszeit, Std. Succinatergiebigkeit, g/l/Std. Produkte, g Succinat Acetat Formiat Lactat Äthanol Succinatausbeute (Gew.-%) Lactatausbeute (Gew.-%) pH-Werte +Gesamtgasgeschwindigkeit 10 cm³/min

Beispiel 9

Die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Tryptophan ist auf Figur 3 dargestellt. Aus der graphischen Darstellung ergibt sich, daß etwa 25 ppm Tryptophan der optimale Gehalt ist, der für den Verbrauch einer großen Menge Dextrosesubstrat notwendig ist. Die Verwendung von kleineren Gehalten an Tryptophan, z. B. 10 ppm ist vorteilhaft; sie ermöglichen jedoch keine so vollständige Ausnutzung von hohen Substratmengen.

Beispiel 10

Basen zur Neutralisation sind nicht allein an das Natriumkation gebunden. Tabelle 4 zeigt Ergebnisse bei Verwendung von Ammoniumhydroxid als Neutralisationsmittel. Die Fermentationsausbeute lag bei 88 %. Tabelle 4 A. succiniciproducens Fermentation, neutralisiert WFit Ammoniumhydroxid Beisp. 10 Dextrose (Beginn), g Dextrose (Ende), g Fermentationszeit, Std. Ergiebigkeit, g/l/Std. Produkte, Succinat, g Acetat, g Lactat, g Formiat, g Succinatausbeute, % Lactatausbeute, % pH-Wert
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß die Succinatfermentation mit hoher Ausbeute und Produktivität unter bestimmten, sorgfältig gesteuerten Bedingungen des pH-Wertes, des CO&sub2;-Partialdruckes, der Nährstoffe und des Alkalizusatzes bei der Fermentation abläuft.

Beispiel 11

Der Rückgewinnungsprozeß durch Elektrodialyse erfordert größere Mengen an Brühe als die 2 Liter, die bei den Probefermentationen benutzt wurden. Aus diesem Grunde und um die Fermentation in größerem Maßstab zu untersuchen, wurden 80-l Fermentationen durchgeführt.
Der Verfahrensablauf und die bei diesen Fermentationen benutzten Stoffe wurden vorstehend beschrieben. Es wurde Cystein-HCL statt Cystein-Sulfid für die anfängliche Reduktion des Mediums benutzt. Das Kohlendioxid wurde unter einem Druck von 0,344 bar (5 psig) (0,34 atm.) zugeführt mit dem Ergebnis, daß eine Succinatausbeute von nahezu 90 % erzielt wurde, was zeigt, daß ein höherer CO&sub2;-Druck zu höheren Succinatausbeuten führt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Tabelle 5 A. succiniciproducens-Fermentation für die Elektrodialyse-Rückgewinnung in größerem Maßstab Beisp. 11 Dextrose (Beginn), g Dextrose (Ende), g Fermentationsvolumen, l Fermentationszeit, Std. Ergebnis, g/l/Std. Produkte, g Succinat Acetat Lactat Formiat Succinatausbeute, Gew.-% pH-Wert

Beispiel 12-13

Nach Verbrauch des gesamten Substrates wurden 10 l der Gesamtbrühe unmittelbar für die Rückgewinnung des Succinatsalzes durch Elektrodialyse verwendet. Der Rest der Brühe wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Hohlfasermembran mit einem Abscheidewert einer Porengröße von 0,2 Mikron geklärt. Dieses Succinatsalz, das Brühe mit entfernten Zellen enthielt, wurde für Vergleichsversuche für die Rückgewinnung und Reinigung durch Elektrodialyse verwendet.
Die gesamte Zellenbrühe und die angefallene Brühe wurden einer üblichen Elektrodialyse mit einer Membranpackung unterworfen. Die Durchführung der Trennung erfolgte unabhängig davon, ob die gesamte Zellenbrühe oder geklärte Brühe benutzt wurde, in der gleichen Weise. Die Konzentration der Brühe in dem Verdünnungsabteil lag anfänglich in der Größenordnung von 20-25 g/l. Das Endkonzentrat enthielt 90-95 g/l Succinat. Die anfängliche Acetatkonzentration in dem Verdünnungsabteil lag bei annähernd 6,0 g/l, die Endkonzentration des Acetats in dem Konzentrat bei annähernd 13 g/l.
Das Verhältnis von Succinat zu Acetat in dem Brühenabteil ist anfänglich höher als am Ende des Rückgewinnungsprozesses. Das Gewichtsverhältnis von Succinat zu Acetat (S/A) in dem Brühenabteil betrug anfänglich 3,7. Nach 120 Minuten lag das Verhältnis bei 2,4. Nahezu 80 % des Succinates wurden bei jeden Chargendurchlauf zurückgewonnen. Die Wiedergewinnung des Acetats betrug nur 60 % bei jedem Durchgang. Eine Materialbilanz von Succinat und Acetat, das von der Brühe in das konzentrierte Produkt überführt wird, zeigt, daß das Succinat unter diesen Arbeitsbedingungen vorzugsweise durch die bevorzugten Membranen transportiert wird. Dies ist eine sehr wichtige und unvorhersehbare Erkenntnis, die die bevorzugte Rückgewinnung des gewünschten Succinats aus der Brühe ermöglicht, wobei seine Konzentration in dem Produkt angereichert und das unerwünschte Acetat in dem erschöpften Boden zurückgelassen wird.
Die Stromausbeute sowohl für die Gesamtzellen als auch für die geklärte Brühe betrug etwa 80 % bezogen auf die Gesamtmenge der transportierten organischen Säuren.
Das Protein in der verdünnten Brühe und das Konzentrat wurden durch Bestimmung des Gesamtstickstoffs nach der Kjeldahl-Methode gemessen. Basierend auf dem Gesamtstickstoffwert nach Kjedahl wurden 80-90 % aller Stickstoff enthaltenden Verbindungen in dem verdünnten Strom zurückgehalten.

Beispiel 14-15

Der konzentrierte und gereinigte Strom des Succinatsalzes aus der konventionellen Elektrodialyse wurde anschließend einer bipolaren, wasserspaltenden Membranpackung zugeführt. Die Ergebnisse, die bei Verwendung der bipolaren Membranpackung erhalten wurden, die vorstehend beschrieben wurde, sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Beispiel 14 wurde mit einem Material durchgeführt, das direkt von der üblichen ED kam. Beispiel 15 wurde mit einem Strom aus der konventionellen ED durchgeführt, der durch Verdampfen konzentriert wurde, bevor er der bipolaren Membranpackung zugeführt wurde. Tabelle 6 Übersicht der Bernsteinsäurerückgewinnung aus Natriumsuccinat bei Verwendung einer wasserspaltenden Elektrodialyse Beisp. Natriumentfernung, % Natriumkonzentation nach ED, g/l Salzstrom Anfängliche Succinatkonzentration, g/l Endkonzentration des Succinats, g/l anfängliche Acetatkonzentration, g/l Endkonzentration des Acetats, g/l Dauer des Durchlaufs, min. Temperatur ºC Stromausbeute, % 7 Anfängliche Stromdichte Mamp/cm² Strombedarf, KW Std./lb Basis Bernsteinsäure Basis gesamt organischer Säuren
Der Hauptunterschied zwischen der Verwendung der niedrigeren und der höheren Anfangskonzentration an Succinat zeigt sich durch die elektrischen Anforderungen und die restlichen Natriumkonzentrationen. Höhere Anfangskonzentrationen an Succinatsalz führen zu einem geringeren Stromverbrauch und einer niedrigeren Konzentration an Natriumkationen. Es ist daher zweckmäßig, das Produkt aus der üblichen ED durch einfache Verdampfung zu konzentrieren, um den Stromverbrauch und die mit der Entfernung des Natriumkations verbundenen Kosten zu reduzieren. Dies ist insbesondere der Fall, wenn die Konzentration des Bernsteinsäureproduktes höher sein muß als sie durch die übliche ED Rückgewinnung erhalten wird.

Beispiel 16

Der Bernsteinsäurestrom enthält nach der wasserspaltenden ED restliche Natriumionen, Aminosäuren und Sulfationen. Es wurde ein Reinigungssystem durch Ionenaustausch entwickelt, um zunächst das Natriumkation und dann das Sulfatanion zu entfernen. Zusammen mit der Entfernung der Natrium- und der Sulfationen wurden einige der Aminosäuren enfernt.
Ein stark saurer Kationenaustauscher (Dowex 50Wx8) in der Säureform wurde verwendet, um Natrium aus dem Bernsteinsäurestrom zu entfernen. Ein schwach basisches Anionenaustauschharz in der freien Basenform (Röhm und Haas IRA-94) wurde dann benutzt, um bevorzugt das Sulfat aus dem Bernsteinsäurestrom zu entfernen. Natrium- und Sulfatkonzentrationen wurden auf unter 5 ppm verringert. Die Ionenaustauschharze, insbesondere das Kationenaustauschharz tragen dazu bei, die Aminosäuren in dem Produkt zu reduzieren. Der Reinheitsgrad des Bernsteinsäure/Essigsäureproduktes liegt bei 99,5 Trockenbasis nach dem Ionenaustauschverfahren, wobei das Produkt weniger als 0,5 stickstoffhaltige Verunreinigungen enthielt.
Auf diese Weise kann mittels des erfindungsgemäßen Fermentations- und Reingungsprozeßes durch sorgfältige Auswahl der Verfahrensstufen ein Produkt erzeugt werden, das weniger als 1 % stickstoffhaltige Verunreinigungen und weniger als 10 ppm Sulfat und Natrium und andere Kationen enthält.
Für Fachleute ist selbstverständlich, daß die Kombination des speziellen Stammes von A. succiniciproducens und der Verwendung von mit Gewebe verstärkten, mikroheterogenen interpolymeren Membranen (Asahi Glas AMV und CMR) es möglich macht, gleichzeitig die Elektrolyse und die Rückführung der Zellen von der Gesamtbrühe durchzuführen, ohne daß Verluste des Wirkungsgrades entweder in dem Fermentor oder bei der Trennung durch Elektrodialyse auftreten. Die reifen Zellen bleiben lebensfähig und werden in den Fermentor zurückgeführt, wo die Fermentation unter Zusatz von Kohlenhydraten und Nährstoffen weiterläuft; das gereinigte und konzentrierte Succinat aus der Elektrodialyse kann dazu benutzt werden, das wasserspaltende Elektrodialysesystem zu speisen, in dem das Succinatsalz in Essigsäure und die entsprechende Base umgewandelt wird. Die erhaltene Base kann in den Fermentor zur Neutralisation zurückgeleitet werden und gereinigte, konzentrierte Bernsteinsäure, die mit Ionenaustauschern weiter gereinigt wird, dient zur Verwendung als Spezialchemikalie oder als übliches chemisches Zwischenprodukt.
Es ist äußerst wichtig, daß der Strom des Succinatsalzes aus der Fermentation zunächst durch eine übliche Elektrodialyse behandelt wird, um das Succinatsalz zu gewinnen und die stickstoffhaltigen Verunreinigungen zu entfernen, daß es anschließend einer wasserspaltenden Elektrodialyse unterworfen wird, um das Succinatsalz in Bernsteinsäure umzuwandeln, und daß der erhaltene Bernsteinsäurestrom zunächst mit einem stark sauren Ionenaustauscher und dann mit einem schwach basischen Ionenaustauscher behandelt wird, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Wenn diese Reihenfolge der Stufen nicht eingehalten wird, kann ein zufriedenstellendes Produkt nicht erhalten werden.
Einem Fachmann ist ferner geläufig, daß es für einen Fermentationsprozeß zur wirtschaftlichen Erzeugung von Bernsteinsäure und ihren Derivaten, die in wirtschaftlicher Weise als Spezialchemikalien oder übliche Chemikalien Verwendung finden sollen, notwendig ist, daß der Prozeß mit nicht kostspieligen Nährstoffen durchgeführt wird, bei großer Produktivität ein hoch konzentriertes Produkt erzielt und daß in den Prozeß ein wirtschaftliches Reinigungsverfahren integriert werden kann.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Bernsteinsäure, bei dem ein anaerobischer Succinat erzeugender Mikroorganismus in einem Fermentor auf einem Substrat gezüchtet wird, das Kohlenhydrat und andere Nährstoffe enthält, bis der größte Teil des in der Fermentierungsbrühe enthaltenen Kohlenhydrats in ein Succinatsalz umgewandelt ist, wobei das Substrat Kohlenhydrat in einer anfänglichen Konzentration zwischen etwa 20 g/l und etwa 100 g/l enthält und einen zwischen etwa 5,8 und 6,6 liegenden pH-Wert hat und der Partialdruck des CO&sub2;, wenigstens bei 0,1013 bar (0,1 atm) liegt, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) die das Succinatsalz enthaltende Brühe zunächst einer üblichen Elektrodialyse unterworfen wird, um bevorzugt das Succinatsalz in einer wässrigen Lösung wiederzugewinnen und zu konzentrieren und die stickstoffhaltigen Verunreinigungen zu entfernen,

(b) die wässrige Lösung, die das konzentrierte Succinatsalz enthält, einer wasserspaltenden Elektrodialyse unterworfen wird, um das Succinatsalz in die entsprechende Base und eine Bernsteinsäurelösung umzuwandeln,

(c) die Bernsteinsäurelösung mit einem stark sauren Ionenaustauscher in Säureform behandelt wird, um Natrium oder andere Kationen aus der Lösung zu entfernen, ohne die Bernsteinsäure zu entfernen und daß

(d) die so behandelte Bernsteinsäure mit einem schwach basischen Ionenaustauscher in der freien Basenform behandelt wird, um die Schwefelsäure oder Sulfatverunreinigungen aus der Lösung zu entfernen, ohne Bernsteinsäure zu entfernen und ein gereinigtes Bernsteinsäureprodukt zu erhalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Organismus ist, der die typischen Eigenschaften von A. succiniciproducens (ATCC 53488) hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Natriumionen und Tryptophan enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Tryptophan in einer Menge von wenigstens 10 ppm vorhanden ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß lebensfähige Zellen in der Brühe, aus der das Succinatsalz entfernt worden ist, zu dem Fermentor zurückgeführt werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Base, die durch die wasserspaltende Elektrodialyse erhalten wird, zu dem Fermentor zurückgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das in der wässrigen Lösung vorhandene Succinatsalz vor der wasserspaltenden Elektrodialyse durch Verdampfen konzentriert wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bernsteinsäureprodukt Bernsteinsäure, Essigsäure, weniger als 1 % stickstoffhaltige Verunreinigungen und weniger als 10 ppm Sulfationen enthält.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bernsteinsäureprodukt weniger als 30 % Essigsäure enthält.