DE69018246T2

DE69018246T2 - Vorrichtung zur Sammlung und Verarbeitung von fetten Geweben zur Herstellung von Endothel-Zellprodukt.

Info

Publication number: DE69018246T2
Application number: DE69018246T
Authority: DE
Inventors: Paul G Alchas; Bruce E Jarrell; Alfred W Prais; Stuart K Williams
Original assignee: Thomas Jefferson University; Becton Dickinson and Co
Current assignee: Thomas Jefferson University; Becton Dickinson and Co
Priority date: 1990-02-09
Filing date: 1990-12-13
Publication date: 1995-11-02
Anticipated expiration: 2010-12-14
Also published as: EP0446450B1; DE69018246D1; IL96675A; EP0446450A1; JPH04218146A; AU6868091A; ES2071733T3; ATE120355T1; BR9100022A; IL96675A0; AU648768B2; CA2033927A1; ZA9120B

Description

Autologe Venen sind zwar nach wie vor das Implantat der Wahl, doch kann die Verfügbarkeit von autologen Implantaten durch eine fortgeschrittene Gefäßerkrankung und eine vorherige chirurgische Intervention eingeschränkt werden. Mit synthetischen Implantaten kann die Durchblutung von blutleeren Bereichen wiederhergestellt werden, wenn keine Alternative zur Verfügung steht. In den letzten drei Jahrzehnten ist mit künstlichen Implantaten die Durchblutung von Bereichen wiederhergestellt worden, die infolge der atherosklerotischen Gefäßerkrankung blutleer waren. Ferner sind sie zum Herstellen von Gefäßen für die Hämodialyse von Patienten mit clironischem Nierenversagen und zur Reparatur von Arterienerweiterungen verwendet worden. Diese Implantate waren zwar zunächst bei der Wiederherstellung der Perfusion zu blutleeren Geweben erfolgreich, doch ist die langfristige Prognose für diese Implantate nicht aussichtsreich. Die im Handel erhältlichen Implantate sind wegen ihrer Thrombogenizität durchaus nicht ideal. Während eines längeren Zeitraums verlieren Implantate mit einem Durchmesser unter 4 mm ihre Durchgängigkeit, weil sie durch abgelagertes Fibrin und anhaftende Zellen verlegt werden. Dieser Vorgang ist offenbar sekundär und teilweise auf die Thrombogenizität der nackten, d.h. nichtendothelialisierten, Oberfläche einer implantierten Prothese zurückzuführen. Siehe Berger et al., "Healing of Arterial Prostheses in Man: It's Incompleteness", Ann. Surg. 175: 118-27 (1972). Infolgedessen befaßt sich die Forschung derzeit stark mit dem Auskleiden von Prothesen mit Humanendothelzellen in der Hoffnung, dadurch eine Oberfläche aus nichtthrombogenen Endothelzellen bilden zu können, wie sie in natürlichen Humangefäßen vorhanden ist. Bei Hunden hat es sich gezeigt, daß durch das Ansäen von Endothelzellen auf im Durchmesser kleinen und großen Implantaten in 1 bis 4 Monaten eine vollständige Auskleidung aus Endothelzellen gebildet werden kann. Da das Gefäßendothel angeblich eine einzigartige nichtthrombogene Oberfläche darstellt, ist angegeben worden, daß Endothelzellen "die erste logische Wahl zum Auskleiden von im Durchmesser kleinen Gefäßimplantaten sind. In Tiermodellen hat es sich gezeigt, daß durch die Transplantation einer funktionellen Auskleidung aus Endothelzellen die Durchgängigkeit erhöht und die Gefahr einer Thrombenbildung auf der bestrichenen Fläche vermindert wird. Frühere Studien und die vorliegende Studie haben sich auf die Abtrennung von Endothelzellen von großen Gefäßen und zwar Venensegmenten, und auf das darauffolgende Ansäen dieser Zellen auf der Innenwandung des Implan-Lats konzentriert. Durch Fortschritte in der Gewebekultur ist auch die Erzeugung von Endothelzellen in großer Zahl zum Ansäen in hoher Dichte auf Gefäßprothesen ermöglicht worden. Diese Techniken haben aber in der klinischen Praxis große Nachteile. Nach dem Ansäen in geringer Dichte findet die Endothelbildung nur langsam statt. Für ein Ansäen von gezüchteten Endothelzellen in hoher Dichte werden undefinierte Medien benötigt, die in der klinischen Parxis nicht leicht verwendbar sind.
Es ist erkannt worden, daß nicht nur mit Zellen von großen Gefäßen, sondern auch mit Endothelzellen von Human-Mikrogefäßen, d.h. von Kapillaren, Arteriolen und Venolen abgeleitete Zellen einwandfreie Ergebnisse erzielt werden können, obwohl zwischen Endothelzellen von großen Gefäßen und Endothelzellen von Mikrogefäßen in ihrem natürlichen Gewebe morphologische und funktionelle Unterschiede vorhanden sind. Endothelzellen von Mikrogefäßen sind im Körpergewebe, vor allem in Fettgewebe, reichlich vorhanden und können vor dem Implantieren zu mindestens 50% zusammenwachsen, so daß dadurch die Prognose bei den meisten Implantaten entscheidend verbessert werden dürfte. In der weiteren Beschreibung wird Fettgewebe als Beispiel einer Quelle von Endothelzellen von Mikrogefäßen erwähnt. Es ist aber erkannt worden, daß auch Endothelzellen von anderen Geweben verwendet werden können.
Zum Vermeiden der Probleme, die beim Ansäen von Endothelzellen von großen Gefäßen auf zu implantierenden Prothesen auftreten, sind Verfahren zum Isolieren der Endothelzellen von Mikrogefäßen von autologem Fettgewebe und zum nachfolgenden Ansäen dieser Zellen in hoher Dichte auf einer Gefäßprothese entwickelt worden.
Es hat sich zwar gezeigt, daß Endothelzellen von Mikrogefäßen zur Endothelbildung auf einer vom Blut berührten Fläche befähigt sind. In Verfahren zum Beschaffen dieser Zellen und zum Auftragen derselben unter den Bedingungen im Operationssaal müssen aber besondere Anforderungen erfüllt werden. Mit von Mikrogefäßen stammenden Endothelzellen, die von zu Beginn eines ununterbrochenen Operationsvorganges erhaltenem Fett abgetrennt worden sind, wird ein Gefäßimplantat oder ein anderes Implantat bis zum Zusammenwachsen der Zellen behandelt. Fettgewebe wird dem Patienten entnommen, nachdem sterile Bedingungen hergestellt worden sind. Dann werden in diesem Fett vorhandene Endothelzellen von Mikrogefäßen durch enzymatisches Digerieren und durch Zentrifugieren schnell abgetrennt und dann zur Behandlung einer Fläche verwendet, die während der späteren Phasen derselben Operation in dem Patienten implantiert wird. In diesem Verfahren kann ein Patient ein Implantat erhalten, das bis zum Zusammenwachsen oder danach mit den eigenen frischen Endothelzellen des Patienten behandelt worden ist.
Das mikrogefäßreiche Fett ist perirenales Fett, subkutanes Fett, Omentum oder der Brusthöhle oder Bauchfellhöhle zugeordnetes Fett. Dieses Gewebe wird dann mit einem proteolytischen Enzym, wie der Collagenase, die Caseanase und Trypsin enthält, digeriert, indem das Enzym mit dem Gewebe inkubiert wird, bis die Gewebemasse unter Bildung eines Gewebeaufschlußprodukts dispergiert worden ist. Von dem Aufschlußprodukt werden dann durch mit niedriger Drehzahl durchgeführtes Zentrifugieren die von Mikrogefäßen stammenden Endothelzellen unter Bildung eines endothelzellenreichen Pellets abgetrennt, das mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen wird. Danach werden die so erhaltenen Endothelzellen von Mikrogefäßen vorzugsweise in einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, die Plasmaprotein, und zwar vorzugsweise etwa 1% Plasmaprotein, enthält. In dieser Suspension beträgt das Volumenverhältnis von Feststoff zu Lösung 1:5 bis 1:15, oder vorzugsweise 1:10. Mit dieser Suspension wird dann die Fläche behandelt, indem Zellen mit dieser Fläche inkubiert werden, bis die Endothelzellen von Mikrogefäßen so fest an der Fläche haften, daß das Zusammenwachsen mindestens 50% beträgt. Auf diese Weise wird ein verbessertes Implantat erhalten, das von Endothel bedeckte Flächen besitzt, auf denen Endothelzellen nach der Implantation entweder zusammengewachsen sind oder schnell (innerhalb einer Verdoppelung der Population) zusammenwachsen.
Zu den Implantaten, die zum Ausbilden einer derartigen Auskleidung mit Endothelzellen behandelt werden können, gehören ohne Einschränkung darauf z.B. intravaskuläre Einrichtungen, wie künstliche Gefäßprothesen, künstliche Herzen und Herzklappen. Der hier angegebene Gerätesatz und die Verfahren zum Ausbilden von endothelisierten Flächen können zum Behandeln von Flächen verwendet werden, die von bekannten synthetischen Werkstoffen gebildet werden, z.B. Polyester, Polytetrafluorethylen, oder von natürlich vorkommenden Materialien, wie der Nabelvene, der Rosenvene und der natürlichen Arterie eines Rindes.
In den derzeit verwendeten Verfahren werden normale Laborgeräte verwendet, z.B. Bechergläser, Kolben, Zentrifugengläser, Schüttelbäder, Pipetten, Spritzen, sterile Abzugshauben. In dem von Jarell und Williams angegebenen Verfahren wird das entnommene Gewebe sofort in eiskalte gepufferte physiologische Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) eingebracht, in der als Pufferungsmittel vorzugsweise ein Phosphat verwendet wird, so daß es sich um eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS) handelt. Das Gewebe wird mit feinen Scheren zerkleinert, und die Pufferlösung wird dekantiert. Das Caseanase und Trypsin enthaltende proteolytische Enzym Collagenase wird dem Gewebe zugesetzt und bei 37ºC inkubiert, bis die Gewebemasse dispergiert ist. Die Digestion findet innerhalb von 30 min statt und dürfte im allgemeinen nicht weniger als 20 min dauern. Das Aufschlußprodukt wird in ein steriles Reagenzglas überführt und in einer mit niedriger Drehzahl (700 mal g) laufenden Tischzentrifuge bei Zimmertemperatur 5 min zentrifugiert. Das auf diese Weise erhaltene Zellenpellet besteht zu mehr als 95% aus Endothelzellen. Diese Endothelzellen werden hier als Endothelzellen von Mikrogefäßen (MEC) bezeichnet, weil sie von den Arteriolen, Kapillaren und Venolen stammen, die alle Mikrogefäße sind. Das MEC-Pellet wird durch Zentrifugieren mit gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, vorzugsweise PBS, einmal gewaschen. Danach wird die MEC-Suspension vorzugsweise pelletisiert, und zwar durch Zentrifugieren (200 mal g), und wird das Pellet mit einer proteinhaltigen Pufferlösung erneut suspendiert. Bei diesem erneuten Suspendieren soll das Volumenverhältnis von dichtgepackten Endothelzellen von Mikrogefäßen zu Pufferlösung etwa 1:5 bis 1:15 oder etwa 1:10 betragen. Die Zellensuspension wird in rohrförmige Implantate eingebracht, die an den Enden zugeklemmt werden, oder es wird auf der zu behandelnden Fläche eine aus den Zellen bestehende Schicht gebildet. Die optimale Dauer der Wechselwirkung mit den Zellen ist von dem Material der Prothese, der Art der gegebenenfalls vorgenommenen Vorbehandlungen dieses Materials und davon abhängig, ob die Oberfläche der Prothese modifiziert worden ist, um ihre Akzeptanz für die MEC zu verbessern. Nachdem so lange inkubiert worden ist, daß die Endothelzellen an der Oberfläche der Prothese haften können, wird diese Oberfläche mit einem proteinhaltigen Puffer gewaschen. Danach wird die Prothese normal implantiert. In der US-PS 4 820 626 (Williams und Jarrell) und ihr zugeordneten Patentanmeldungen sind Verfahren zum Behandeln einer Implantatoberfläche mit Endothelzellen angegeben. In diesen Verfahren wird subkutanes Fettgewebe mit einer Kanüle angesaugt und durch ein Vakuum in einen Schleimabscheider überführt, der dann für die Weiterverarbeitung in eine sterile Abzugshaube überführt wird. Das Fettgewebe wird auf ein Sieb in einem Trichter aufgegeben, der in einem sterilen Glasbecher eingesetzt ist. Dann wird eine Spüllösung auf das Gewebe gegossen, um Blutzellen und gelöstes Fett zu entfernen. Das Gewebe wird von Hand in einen sterilen Erlenmeyerkolben gegossen, der eine Collagenaselösung enthält, und wird darin 20 min bei 37ºC geschüttelt. Die Collagenasesuspension wird von Hand in sterile konische Zentrifugengläser gegossen und bei 700 mal g 7 min geschleudert. Danach werden die Endothelzellen aus dem Glas pipettiert. Ein Implantat wird an einen Fortsatz einer Lüerschen Injektionsspritze gebunden und in einem Glas befestigt. Die Zellen werden in Serumprotein enthaltender Flüssigkeit erneut suspendiert und dann mit einer Spritze angesaugt. Mit einer Nadel und einer Spritze werden die Zellen in das Lumen des Implantats eingebracht. Das Implantat wird von Hand 2 Stunden lang gedreht.
Trotz dieser Fortschritte besteht noch ein Bedürfnis nach einem einfachen, zuverlössigen Verfahren zum Bilden von Überzügen aus Endothelzellen auf einem Implantat unter den Bedingungen im Operationssaal. Gemäß der Erfindung können in einem Operationssaal ohne weiteres Endothelzellen in großen Mengen isoliert werden. Endothelzellen können zwar auch aus anderen als Fettgeweben isoliert werden, z.B. aus Gehirn-, Lungen-, Netzhaut-, Nebennieren-, Leber- und Muskelgewebe, doch wird vorzugsweise Fettgewebe als Quelle der Zellen verwendet, weil es reichlich vorhanden und leicht erhältlich ist und seine entnahme für den zu behandelnden Pateinten nicht unangenehm sein dürfte. In einer weniger bevorzugten Arbeitsweise kann perinephrines Humanfett anstatt dem Patienten von der Leiche eines hirntoten Spenders, dessen Herz noch schlägt, während der Operation des Spenders entnommen werden. Eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Erzeugen eines Endothelzellenprodukts durch Digestion und Weiterverarbeitung von Gewebe sind aus der EP-A-0 265 176 bekannt.
Die Erfindung schafft einen einfachen, zuverlässigen Gerätesatz zum Herstellen eines endotheliierten Implantats mit von Mikrogefäßen stammenden Endothelzellen, die von dem Patienten gewonnen worden sind, der das Implantat erhalten soll. Dieser Gerätesatz dient zum Isolieren von Endothelzellen von Humanfett, zum Erzeugen eines aufzutragenden Zellenprodukts durch Verarbeiten dieses Fetts und zum Auftragen dieses Produkts auf der Oberfläche eines Implantats, wobei in den Bestandteilen des Gerätesatzes sterile Bedingungen hergestellt und ständig aufrechterhalten werden. Der Gerätesatz bildet ein geschlossenes System, durch das die Wahscheinlichkeit einer Verunreinigung, der erforderliche Arbeitsaufwand und die Gefahr eines Fehlers des Benutzers vermindert werden.
Die Erfindung schafft eine Vorrichtung zum Aufschließen und Verarbeiten von Gewebe zur Herstellung eines Endothelzellenproduktes, gekennzeichnet durch ein einziges Gefäß, das drei Kammern umfaßt eine Digestionskammer, eine getrennte Abfallkammer und eine getrennte Isolierkammer, die wahlweise mit der Abfallkammer verbunden ist, und das weiterhin folgendes umfaßt: ein Sieb, das zwischen der Isolierkammer und der Digestionskammer angeordnet ist, ein Ventil, das wahlweise die Isolierkammer mit einer Ampulle zur Aufnahme des Endothelzellenproduktes verbindet, und die Digestionskammer und die Isolierkammer können wahlweise und abwechselnd mit der Abfallkammer verbunden werden, so daß in der Vorrichtung durch Verbinden der Digestionskammer mit der Abfallkammer Gewebe aufgeschlossen werden kann und durch Verbinden der Digestionskammer mit der Isolierkammer verarbeitet werden kann, um in dem einzigen Gefäß unter sterilen Bedingungen ein Endothelzellenprodukt herzustellen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Aufschließen und Verarbeiten von Gewebe zur Herstellung eines Endothelzellenprodukts, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung ein einziges Gefäß besitzt, welches vier Kammern umfaßt eine Enzymvorratskammer, eine getrennte Abfallkammer, eine getrennte Digestionskammer, die abwechselnd wahlweise mit der Abfallkammer verbunden werden kann, und eine getrennte Isolierkammer, die wahlweise mit der Abfallkammer verbunden werden kann, daß ein Sieb zwischen der Isolierkammer und der Digestionskammer angeordnet ist, und daß die Isolierkammer wahlweise über ein erstes Ventil mit einer Ampulle zur Aufnahme des Endothelzellenproduktes verbunden werden kann, so daß in der Vorrichtung durch Verbinden der Digestionskammer mit der Enzymvorratskammer und der Abfallkammer Gewebe aufgeschlossen werden kann und durch Verbinden der Digestionskammer mit der Isolierkammer verarbeitet werden kann, um in dem einzigen Gefäß unter sterilen Bedingungen ein Endothelzellenprodukt herzustellen.
Ferner schafft die Erfindung ein Verfahren zum Sammeln und Verarbeiten von Gewebe zur Herstellung eines Endothelzellenproduktes, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Bereitstellen einer Vorrichtung zum Sammeln und Verarbeiten von Gewebe zur Herstellung eines Endothelzellenproduktes, die eine Enzymvorratskammer, eine Abfallkammer, eine Digestionskammer und eine Zellenisolierkammer umfaßt, Einleiten des zu verarbeitenden Gewebes in die Digestionskammer, Einleiten von Enzym in die Enzymvorratskammer, Einleiten einer Spüllösung in die Digestionskammer, Rühren der Vorrichtung, Zentrifugieren der Vorrichtung in einer bevorzugten Richtung, so daß die Spüllösung und die Abfallstoffe in die Abfallkammer geleitet werden, Zentrifugieren der Vorrichtung in einer zweiten bevorzugten Richtung, so daß das Enzym von der Enzymvorratskammer in die Digestionskammer geleitet wird, Rühren der Vorrichtung und Zentrifugieren der Vorrichtung in einer zweiten bevorzugten Richtung, um das Endothelzellenprodukt in der Zellenisolierkammer zu isolieren.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden in der nachstehenden ausführlichen Beschreibung näher erläutert: eine spezielle Ausführungsform ist in den beigefügten Zeichnungen dargestellt.
Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Fettsammeleinheit, die dazu dient, dem Patienten, der das Implantat erhalten soll, Fett zu entnehmen, das in Mikrogefäßen Endothelzellen enthält und das schließlich in einer Fettsammelvorrichtung gesammtelt wird.
Figur 2 ist eine schematische Darstellung einer Digestionseinheit, in der die Digestionsvorrichtung der Fettsammelvorrichtung der Fettsammeleinheit nach Figur 1 zugeordnet ist. Die Digestionseinheit dient zum Erzeugen eines Aufschlußprodukts, das in die in Figur 2 ebenfalls gezeigte Vorrichtung zum Isolieren von Endothelzellen überführt wird.
Figur 3 zeigt schematisch die Einheit zum Isolieren von Endothelzellen.
Figur 4 zeigt schematisch die Einheit zum Behandeln des Gefäßimplantats und die Einheit zum Auftragen von Endothelzellen als die Bestandteile, mit denen das Endothelzellenprodukt erzeugt und überführt wird, so daß es auf ein Gefäß implantat aufgetragen werden kann.
Figur 5 zeigt in einem stark vergrößerten Querschnitt die Fettsammelvorrichtung nach Figur 1.
Figur 6(a) zeigt in einem stark vergrößerten Längsschnitt die Digestionsvorrichtung nach Figur 2.
Figur 6(b) zeigt in einer stark vergrößerten Untersicht die Dlgestionsvorrichtung nach Figur 2.
Figur 6(c) zeigt in einer stark vergrößerten Draufsicht die Digestionsvorrichtung nach Figur 2.
Figur 7(a) zeigt in einer vergrößerten Vorderansicht die Vorrichtung nach Figur 2 zum Isolieren von Endothelzellen.
Figur 7(b) zeigt in einer vergrößerten Seitenansicht die Vorrichtung nach Figur 2 zum Isolieren von Endothelzellen.
Figur 8 zeigt in einem schematischen Querschnitt die in Figur 4 gezeigte Anordnung von Behandlungsrohren in der Einheit zum Auftragen von Endothelzellen. Diese Anordnung von Behandlungsrohren dient zum Auftragen des Endothelzellenprodukts auf die Innenwandung des Implantatlumens.
Figur 9 zeigt in einem vergrößerten schematischen Querschnitt das innere und das äußere Behandlungsrohr der in Figur 8 dargestellten Einheit zum Behandeln von Gefäßimplantaten.
Figur 10 zeigt in einer stark vergrößerten Seitenansicht die Bestandteile des inneren Behandlungsrohrs nach Figur 9.
Figur 11 zeigt in einer stark vergrößerten Seitenansicht die Bestandteile des äußeren Behandlungsrohrs nach Figur 9.
Figur 12 stellt in einem Balkendiagramm die durchschnittliche Endothelzellendichte dar, die pro Stück des behandelten Implantats erzielt wird, wenn die Implantate mit dem bevorzugten Gerätesatz gemäß der Erfindung bzw. nach bekannten Verfahren behandelt werden.
Figur 13 ist eine REM-Aufnahme eines mit dem bevorzugten Gerätesatz gemäß der Erfindung behandelten Implantats.
Figur 14 zeigt in einem stark vergrößerten Längsschnitt eine Ausführungsform der Sammel- und Behandlungsvorrichtung.
Figur 15 zeigt in einem stark vergrößerten Längsschnitt die bevorzugte Ausführungsform der Sammel- und Behandlungsvorrichtung.
In den bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung wird dem Patienten mit modifizierten Fettabsaugtechniken subkutanes Fett entnommen und in eine komplette geschlossene Vorrichtung überführt, in der das Fett unter sterilen Bedingungen gelagert werden kann, bis es gebraucht wird. Das Fett wird steril in eine Digestionsvorrichtung überführt, in der es zunächst zum Entfernen von roten Blutkörperchen und anderen Gewebestrümmern gewaschen wird und dann 20 min bei 37ºC einer gesteuerten Digestion mit Collagenase unterworfen wird. Danach wird die Fettaufschlämmung wieder unter sterilen Bedingungen in eine Vorrichtung zum Isolieren von Endothelzellen überführt, in der die Endothelzellen sich absetzen, so daß die isolierten Endothelzellen automatisch gewonnen werden können. Danach wird die Zellensuspension steril in eine Verarbeitungseinheit überführt, in der die Zellen unter sterilen Bedingungen schnell filtriert und auf die Oberfläche aufgetragen werden. Mit Hilfe des hier beschriebenen Gerätesatzes können die Endothelzellen schon in etwa 40 min isoliert und aufgetragen werden. Nach einer Inkubation kann das Implantat dem Patienten implantiert werden. Beim Vergleich des Gesätesatzes mit den bisher angewendeten Verfahren wurde festgestellt, daß hinsichtlich der Anzahl der isolierten Endothelzellen und ihres Haftens an der Implantatoberfläche gleichwertige, reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Mit dem System werden Endothelzellen in einer solchen Anzahl erhalten, daß sie danach in hoher Dichte (im Bereich von 5,14 . 10&sup6; bis 4,24 . 10&sup7; Zellen von 50 cm³ Fett) auf dem Implantat angesät werden können und an der Implantatoberfläche haften. Mit dem Gerätesatz werden Zellen auf der ganzen Länge und dem ganzen Durchmesser gleichmäßig aufgetragen, wobei die Varianzanalyse keine signifikanten Unterschiede in der Zellenkonzentration ergibt. Die Verwendung des Gerätesatzes führt zu folgenden wichtigen Vorteilen: 1) Geschlossener, steriler Weg für das Fluid; 2) minimaler Arbeitsaufwand des Benutzers; 3) Kompatibilität mit dem Klima im Operationssaal; 4) Optimierung der Bedingungen für eine von Patient zu Patient in hohem Maße reproduzierbares Verfahren.
Das System besteht aus fünf primären Untersystemen: 1) Fettsammeleinheit (Figur 1); 2) Digestionseinheit (siehe Figur 2); Einheit zum Isolieren von Endothelzellen (siehe Figur 3); Einheit zum Behandeln des Gefäßimplantats (siehe Figur 4); und 5) Einheit zum Auftragen von Endothelzellen (siehe Figur 4).
In der Fettsammeleinheit (Figur 1) wird dem Patienten eine Probe aus subkutanem Fettgewebe entnommen. Diese Einheit hat folgende Bestandteile: Zuführungsleitung (12), Fettsammelvorrichtung (14), Saugleitung (15), Ansaugkanüle (10) und Saugpumpe (18). Mit der Saugpumpe (18) wird von dem Patienten subkutanes Fettgewebe durch die Kanüle (10) und die Zuführungsleitung (12) angesaugt und der Fettsammelvorrichtung (14) zugeführt.
Die in der Figur 5 gezeigte Fettsammelvorrichtung besteht aus einer zylindrischen Kammer (54), die oben mit zwei Saugleitungsanschlüssen (59 und 61) und unten mit einem Auslaßanschluß (60) versehen ist, der mit einem Zwelwege-Absperrhahn (62) verbunden ist. Eine die Decke der Kammer durchsetzende Kolbenstange (57) ist mit einem spritzenartigen Stopfen (56) verbunden, der zwei Löcher besitzt, durch die die Saugleitungsanschlüsse (59 und 61) führen. Bei in der "unteren" Stellung befindlichem Kolben sind die Unterseite des Stopfens und die Löcher mit einer flexiblen Gummimembran (58) abgedeckt. In der "oberen" Stellung des Kolbens wird die Gummimembran (58) von den Saugleitungsanschlüssen (59 und 61) im Abstand von der Unterseite des Stopfens gehalten, so daß zwischen dem Innern der Kammer und den Saugleitungen (12 und 15) eine Strömungsverbindung vorhanden ist. Für den Gebrauch der Vorrichtung muß diese mit den Knierohren (63 und 65) in die Saugleitung eines Fettabsaugsystems eingeschaltet und die Kolbenstange in die "obere" Stellung bewegt werden. Beim Absaugen von Fett wirkt die Vorrichtung als ein Abscheider für das Fettgewebe. Nach dem Sammeln einer genügenden Fettmenge werden die Knierohre (63 und 65) von der Saugleitung abgenommen und wird die Kolbenstange (57) abwärtsbewegt, so daß die Gummimembran (58) wieder ihre Ausgangsstellung einnimmt, in der sie die Unterseite des Stopfens abdeckt und dicht abschließt; dabei wird das Fettgewebe durch den Austrittsanschluß herausgedrückt. Die vorliegende Vorrichtung hat zwei Funktionen: Sie sammelt fett und erleichtert dessen steriles überführen in die Digestionseinheit.
In der Digestionseinheit (Figur 2) wird die Fettgewebeprobe mit Spüllösung gespült und mit dem Enzym Collagenase digeriert: Sie hat folgende Bestandteile: Digestionsvorrichtung (16), Abfallgefäß (32), Vorrichtung (30) zum Isolieren von Endothelzellen, Digestionsständer (17), Beutel/Beutelsätze (20 und 22) für Kollagenaselösung IV, Beutel/Beutelsätze (21 und 24) für Spüllösung IV, Steuerkasten (27) mit Einrichtungen zur Steuerung der Temperatur und des Fluidtransports und mit der Vakuumquelle des Systems, sortierte Schlauchverbinder, Luftfilter, Ventile. Das Fettgewebe wird von Hand aus der Fettsammelvorrichtung (14) durch eine geschlossene Leitung in die Digestionsvorrichtung (16) überführt. In dieser wird das Fettgewebe mit der Spüllösung gespült, die aus den Beuteln/Beutelsätzen (21 und 24) für die Spüllösung IV in die Kammer eingeleitet worden ist. Nach dem Spülen läßt man die Spüllösung aus der Kammer in das Abfallgefäß (32) ablaufen. Danach wird aus den Beuteln/Beutelsätzen (20 und 22) für die Collagenaselösung IV diese in die Digestionsvorrichtung (16) überführt. Das Fettgewebe wird mit der Collagenaselösung digeriert, während das Gemisch mit filtrierter Luft bewegt und auf 37ºC gehalten wird. Danach wird das Gemisch aus dem digerierten Fettgewebe und der Collagenaselösung für die Weiterverarbeitung in die Vorrichtung (30) zum Isolieren von Endothelzellen gesaugt.
Die in der Figur 6 gezeigte Digestionsvorrichtung besteht aus einer Kammer (64) die oben mit mehreren Einlaßanschlüssen (66, 67, 68, 69 und 70) versehen ist, von denen einer ein Filter enthält und mit einem Rohr (72) verbunden ist, das in der Nähe des Bodens der Kammer endet. Mit dem Ende des Rohrs sit eine Reihe von radialen "Fingern" (74) stoffschlüssig verbunden. Am Boden der Kammer befindet sich ein konisches Naschenfilter (76), und unterhalb desselben sind zwei Auslaßanschlüsse (80 und 82) und eine Hülle (78) für eine Temperatursonde vorgesehen. Im Betrieb wird gesammeltes Fettgewebe durch einen der oben an der Kammer (64) vorgesehenen Einlaßanschlüsse (66) in die Kammer (64) eingebracht. Danach wird durch einen anderen der Einlaßanschlüsse (67) die Spüllösung (Media 199E, Hanks, physiologische Kochsalzlösung, PBS oder eine andere gepufferte physiologische Lösung) eingeleitet. Durch eine mit einem anderen Einlaßanschluß (68) verbundene Saugleitung wird filtrierte Luft zum Eintritt durch den zentralen Anschluß (69) und das Rohr (72) veranlaßt. Diese Luft steigt in Bläschen durch das Fettgemisch auf und bewegt dieses. Durch die "Finger" wird die bläschenbildende Luft so verteilt, daß eine gleichmäßige Bewegung gewährleistet ist und eine Reibfläche gebildet wird, die das Aufbrechen des Fetts erleichtert. Dann wird die Spüllösung durch den Boden des Maschenfilters angesaugt und durch einen der Auslaßanschlüsse (80) abgezogen, so daß ein relativ blutfreies Fettgewebe zurückbleibt. Die digerierende Enzymlösung (Collagenase, Dispase, Trypsin oder ein anderes gewebedissoziierendes Enzym) wird durch einen anderen der oben vorgesehenen Einlaßanschlüsse (70) eingeleitet und danach durch Luftbläschen bewegt. Während dieses ganzen Vorganges wird die Behandlungstemperatur durch eine in der Sondenhülle (78) angeordnete Temperatursonde (79) überwacht, die eine Rückmeldung an einen in dem Steuerkasten (27) angeordneten externen Temperaturregler abgibt. Nach vollständiger Digestion wird die an von Mikrogefäßen stammenden Endothelzellen reiche digerierte Fettlösung durch das unten vorgesehene Maschenfilter abgezogen und durch einen Auslaßanschluß (82) ausgetragen, so daß sie weiterverarbeitet werden kann. In dem Maschenfilter (76) werden nichtdigeriertes Gewebe und große Stücke aus Fasermaterial zurückgehalten; dieses Material wird zusammen mit der Vorrichtung entsorgt. Die vorliegende Vorrichtung bildet ein geschlossenes System, das die Gefahr einer Verunreinigung, den Arbeitsaufwand und die Wahrscheinlichkeit eines Benutzerfehlers vermindert wird.
In der in Figur 3 gezeigten Einheit zum Isolieren von Endothelzellen werden die in der digerierten Fettgewebeprobe befindlichen Endothelzellen abgetrennt und isoliert. Sie hat folgende Bestandteile: Zentrifuge (33), Zentrifugenabschirmungen (31), Vorrichtung (30) zum Isolieren von Endothelzellen. Die Vorrichtung (30) zum Isolieren von Endothelzellen wird in einer Zentrifugenabschirmung angeordnet; dann wird diese Anordnung in die Zentrifuge (33) eingesetzt. Durch das Zentrifugieren werden die Endothelzellen isoliert. Danach wird die Vorrichtung (30) zum Isolieren von Endothelzellen an die Einheit zum Behandeln des Gefäßimplantats angeschlossen und auf der Einheit zum Auftragen von Endothelzellen montiert.
Die in Figur 7 gezeigte Vorrichtung zum Isolieren von Endothelzellen besteht aus einer Primärkammer (88), die sich zu einer Sekundärkammer oder Ampulle (90) verjüngt, die einen Einlaßanschluß (92) und einen Auslaßanschluß (94) besitzt, an die je ein Zweipositionsventil (91 bzw. 93) angeschlossen ist. In der ersten Stellung ist zwischen der Primärkammer und der Sekundärkammer eine Strömungsverbindung vorhanden. In der zweiten Stellung ist eine Strömungsverbindung zwischen der Sekundärkammer und dem außen angeordneten Anschluß vorhanden. Jedes Ventil (91 und 93) wird zunächst in die erste Stellung gedreht. Durch den oben vorgesehenen Anschluß (84) wird digeriertes Fettgewebe eingebracht. Dann wird die Vorrichtung in eine Zentrifuge eingesetzt und schnell gedreht. Durch das Zentrifugieren gelangen abgetrennte Endothelzellen in die Ampulle (90), die optimale Abmessungen für das Isolieren eines "Pellets" von Endothelzellen zwischen den beiden Anschlüssen hat. Dann wird durch Drehen der Ventile in die zweite Stellung das "Pellet" von der darüber angeordneten Primärkammer (88) und den darunter befindlichen, dichtgepackten roten Blutkörperchen abgetrennt. Danach kann zum Herausspülen des "Pellets" aus Endothelzellen an den Einlaßanschluß (92) eine Druckluftleitung oder an den Auslaßanschluß (94) eine Saugleitung angeschlossen werden. Diese Vorrichtung ist ein geschlossenes System, das sterile Bedingungen aufrechterhält und den Arbeitsaufwand und die Gefahr von Benutzerfehlern verringert.
Das Sammeln und Verarbeiten des Fetts kann gemäß der Figur 14 auch in einer einzigen Einheit vorgenommen werden. Diese Vorrichtung ist ein Verarbeitungsgefäß zum Sammeln, Spülen und Digerieren von Fettgewebe und zum darauffolgenden Trennen und Isolieren von Endothelzellen von Mikrogefäßen für Zwecke der Forschung, Diagnose oder Therapie, z.B. zum Endotheliieren einer Protheseoberfläche oder natürlichen Oberfläche. Die Vorrichtung besteht aus einem Gefäß mit drei Kammern; einer Digestionskammer (210), einer Abfallkammer (212) und einer Isolierkammer (214). Die Digestionskammer (210) ist von der Abfallkammer (212) durch eine Platte (218) getrennt, die ein entsperrbares Sperrventil (220) enthält. Ein ein Kugelrückschlagventil (224) enthaltendes Entlüftungsrohr (222) führt von der Abfallkammer (212) in die Isolierkammer (214). Die Digestionskammer (210) steht mit der Umgebung über eine Reihe von Anschlüssen (228, 229, 230) in Verbindung. Die Digestionskammer (210) ist von der Isolierkammer (214) durch ein Maschensieb (232) getrennt. Die Isolierkammer (214) ist mit zwei Anschlüssen (234 und 236) versehen, die je ein Zweistellungsventil (238 bzw. 240) enthalten. In der ersten Stellung ist eine Strömungsverbindung zwischen der Mitte der Ampulle (235) und deren oberem und unterem Teil vorhanden. In der zweiten Stellung ist eine Strömungsverbindung zwischen der Mitte der Ampulle (235) und den nach außen führenden Anschlüssen (234 und 236) vorhanden. Zunächst befinden sich die beiden Ampullenventlle (238 und 240) in der ersten Stellung. Die Vorrichtung dient als ein Abscheider und ist in eine an die Anschlüsse (228 und 230) angeschlossene Fettsaugleitung eingeschaltet. Nach dem Sammeln von Fett werden die Fettsaugleitungen abgenommen und die Anschlüsse 228 und 230 mit Kappen verschlossen und wird Spüllösung (Media 199E, Hanks, physiologische Kochsalzlösung, PBS oder eine andere gepufferte physiologische Lösung) durch den Anschluß (229) eingeleitet. Das Fett wird in der Spüllösung von außen durch beliebige Mittel, z.B. durch Schütteln, bewegt. Dann wird die Vorrichtung mit aufwärtsgekehrter Ampullenseite in eine Zentrifuge eingesetzt und schnell gedreht, bis das normalerweise geschlossene Sperrventil (220) öffnet und die Spüllösung in die Abfallkammer (212) ablaufen kann. Während dieses Zentrifugierens ist das Kugelventil (224) in dem Entlüftungsrohr (222) offen, damit aus der Abfallkammer (212) durch die Spüllösung verdrängte Luft entweichen kann. Dann wird die zur Digestion verwendete Enzymlösung (Collagenase, Dispase, Trypsin oder ein anderes gewebedissoziierendes Enzym) durch den Anschluß (229) eingeleitet, worauf wieder bewegt wird. Nach vollständiger Digestion wird die Vorrichtung mit abwärtsgekehrter Ampullenseite erneut zentrifugiert. Zum Isolieren der in die Ampulle (235) gelangten,abgetrennten Endothelzellen werden beide Ventile (238 und 240) in ihre zweite Stellung gedreht, worauf das von den Zellen gebildete "Pellet" herausgespült wird, wenn an einen der Ampullenanschlüsse (234 oder 236) eine Druckleitung angeschlossen wird.
In der in Figur 15 gezeigten bevorzugten Ausführungsform besteht die Vorrichtung aus einem Gefäß mit vier Kammern: einer Digestionskammer (210), einer Abfallkammer (212), einer Enzymkammer (213) und einer Isolierkammer (214). Die Digestionskammer (210) ist von der Abfallkammer (212) durch eine Platte (218) getrennt, die ein entsperrbares Sperrventil (220) enthält, dessen Einlaß von einem Maschensieb (216) bedeckt ist. Von der Abfallkammer (212) führt ein eine Kugelrückschlagventil (224) enthaltendes Entlüftungsrohr (222) in die Isolierkammer (214). Die Abfallkammer ist von der Enzymkammer durch eine Platte (217) getrennt. Die Digestionskammer (210) ist von der Enzymkammer (213) durch eine Platte (218) getrennt, die ein entsperrbares Sperrventil (221) enthält. Von der Digestionskammer (210) führt ein ein Kugelrückschlagventil (225) enthaltnedes Entlüftungsrohr (223) in den oberen Teil der Enzymkammer (213). Die Enzymkammer (213) steht mit der Umgebung durch einen Anschluß (226) in Strömungsverbindung. Die Digestionskammer (210) steht mit der Umgebung durch eine Reihe von Anschlüssen (228, 229, 230) in Strömungsverbindung. Die Digestionskammer (210) ist von der Isolierkammer (214) durch ein Maschensieb (232) getrennt. Die Isolierkammer (214) ist mit zwei Anschlüssen (234 und 236) versehen, die je ein Zweistellungsventil (238 bzw. 240) enthalten. In der ersten Stellung ist eine Strömungsverbindung zwischen der Mitte der Ampulle (235) und dem oberen und dem unteren Teil der Ampulle vorhanden. In der zweiten Stellung ist eine Strömungsverhindung zwischen der Mitte der Ampulle (235) und den nach außen führenden Anschlüssen (234 und 236) vorhanden.
Zunächst befinden sich beide Ampullenventile (238 und 240) in der ersten Stellung und ist die als Abscheider verwendete Vorrichtung in einer mit an die Anschlüsse (228 und 230) angeschlossenen Fettsaugleitung eingeschaltet. Nach dem Sammeln von Fett werden die Fettsaugleitungen abgenommen und die Anschlüsse (228 und 230) mit Kappen verschlossen. Durch den Anschluß (229) wird Spüllösung (Media 199E, Hanks, physiologische Kochsalzlösung, PBS oder eine andere gepufferte physiologische Lösung) eingeleitet, und durch den Anschluß (226) wird eine digerierende Enzymlösung (Collagenase, Dispase, Trypsin oder ein anderes gewebedissoziierendes Enzym) eingeleitet. Das Fett in der Spüllösung wird durch eine Einwirkung von außen, z.B. durch Schütteln, in Bewegung gesetzt. Dann wird die Vorrichtung mit aufwärtsgekehrter Ampullenseite in eine Zentrifuge eingesetzt und schnell gedreht, bis das entsperrbare Sperrventil (220) öffnet und die Spüllösung in die Abfallkammer (212) abläuft. Während dieses Zentrifugierens öffnet das im Entlüftungsrohr (222) befindliche Kugelventil (224) so daß durch Spüllösung verdrängte Luft aus der Abfallkammer (212) entweichen kann. Dann wird die Vorrichtung müt abwärtsgekehrter Ampullenseite in eine Zentrifuge eingesetzt und schnell gedreht, bis das entsperrbare Sperrventil (221) öffnet und Enzymlösung in die Digestionskammer (210) abläuft. Während dieses Zentrifugierens öffnet das im Entlüftungsrohr (223) befindliche Kugelventil (225), so daß von der Enzymlösung verdrängte Luft aus der Digesitonskammer (210) entweichen kann. Zum Fördern der Digestion wird dann das Fett in der Enzymlösung bewegt. Nach vollständiger Digestion wird die Vorrichtung mit abwärtsgekehrter Ampullenseite erneut zentrifugiert. Zum Isolieren der abgetrennten und in die Ampulle (235) gelanten Endothelzellen werden beide Ventile (238 und 240) in die zweite Stellung gedehnt. Dann kann das von den Zellen gebildete Pellet herausgespült werden, indem an einen der Ampullenanschlüsse (234 oder 236) eine Druckleitung angeschlossen wird.
Die in der Figur 4 gezeigte Einheit zum Behandeln des Gefäßimplantats hat die Aufgabe, das Implantat beim Manipulieren, Vorbenetzen und Auftragen von Zellen zu schützen und sterilzuhalten und das Behandeln des Implantats zu erleichtern. Die Einheit hat folgende Bestandteile: eine Behandlungsrohranordnung mit einem Innen- und einem Außenrohr (46), das Implantat, die Anordnung (44) aus einer Saugleitung und einem Abscheider, den mit einem Maschensieb versehenen Verwirbeler (34) und Beutel/Beutelsätze (36 und 38) mit für Lösung IV aus autologem Serum und Media. Das Implantat wird in dem Innenrohr der Behandlungsrohranordnung montiert. Das Außenrohr soll das Innenrohr sterllhalten. Vor dem Auftragen der Zellen wird das Implantat vorbenetzt, indem die aus dem autologen Serum und Media bestehende Lösung aus einem IV-Beutel durch den mit einem Maschensieb versehenen Verwirbeler in das Lumen des Implantats und durch dessen Wand gesaugt wird, bis alle Luft aus dem Innenrohr der Behandlungsrohranordnung herausgespült worden ist. Dann wird die Einheit zum Behandeln des Implantats in die Einheit zum Auftragen von Endothelzellen überführt.
In Figur 8 ist das komplett zusammengesetzte Behandlungsrohr gezeigt, das aus zwei Hauptgruppen besteht, und zwar aus dem inneren Behandlungsrohr (100) und dem äußeren Behandlungsrohr (112) (siehe Figur 9). Gemäß der Figur 10 besteht das innere Behandlungsrohr aus folgenden Baugruppen: der Entlüftungskappe (104), der Griffkappe (108), dem Körper 102 des inneren Behandlungsrohrs, einem Tunnelrohr (110) und einer Tunnelrohrspitze (106). Vor dem Zusammenbau wird ein Implantat durch das Lumen des Tunnelrohrs (110) gefädelt und an der Griffkappe (108) angebracht. Gemäß der Figur 11 besteht das äußere Behandlungsrohr aus folgenden Baugruppen: dem Körper (113) des äußeren Behandlungsrohrs, der Einlaß-Endkappe (116) und der Auslaß- Endkappe (114). Die vollständig zusammengesetzte Behandlungsrohranordnung hät folgende Aufgaben: Sie nimmt während des Versandes und der Manipulation im Operationssaal das Implantat auf, schützt es und hält es steril; beim Endotheliieren stützt sie das Implantat ab und ermöglicht einen Zutritt von Fluid zu dem Implantatlumen; sie ist zur Bildung einer Baugruppe zerlegbar, die das Implantieren des Implantats erleichtert und dabei die Endothelauskleidung schützt. Beim Endotheliieren wird die Elnlaß-Endkappe der Vorrichtung (116) mit einem Behälter einer Endothelzellensuspension und die Auslaß-Endkappe (114) mit einer im Steuerkasten (27) angeordneten Vakuumquelle verbunden. Ein an das poröse Implantat angelegter Saugdruck bewirkt, daß die Endothelzellensuspension in das Implantatlumen hinein und durch dessen Wand herausfließt, wobei auf die Innenwandung des Implantats Endothelzellen filtriert werden. Die filtrierte Lösung fließt durch die Löcher (111) in der Tunnelrohrwand (110) und die Entlüftungskappe (104) weiter auswärts. Wenn an den Endkappen des äußeren Behandlungsrohrs Drehkupplungen vorgesehen sind, kann die Vorrichtung um ihre Mittelachse gedreht werden. Nach vollständigem Endotheliieren wird das innere Behandlungsrohr (100) aus dem äußeren Behandlungsrohr (112) herausgenommen und wird die aus der Griffkappe (108), dem Tunnelrohr (110) und der Spitze (106) bestehende Anordnung aus dem Körper (102) des inneren Behandlungsrohrs herausgenommen. Zum richtigen Anordnen des Implantats ohne Berührung mit demselben oder Beeinträchtigung desselben kann das Implantat dann mittels des Tunnelrohrs beispielsweise durch das Beingewebe des Patienten geführt werden. Nach dem Positionieren wird die Griffkappe (108) von dem Tunnelrohr (110) abgenommen und das Tunnelrohr (110) herausgezogen, so daß das Implantat in der Stellung für die distale Anastomose zurückbleibt. Um während des chirurgischen Positionierens die Benetzung des Implantatlumens aufrechtzuerhalten, kann man mit der Griffkappe (108) eine IV-Leitung verbinden, die eine Lösung von autologem Serum und Media enthält. Nach vollständiger distaler Anastomose wird das Implantat an seinem proximalen Ende abgeschnitten und dadurch von der Griffkappe (108) getrennt und für die proximale Anastomose vorbereitet.
Die in Figur 4 gezeigte Einheit zum Auftragen von Endothelzellen fördert das Auftragen von Endothelzellen im Lumen des Implantats. Sie hat folgende Bestandteile: die Vorrichtung (48) zum Drehen des Behandlungsrohrs, den Isolierbehälter (50), das Heizkissen (52) und die wasserumwälzende iieizeinrichtung (53). In dem Isolierbehälter wird die Behandlungsrohranordnung (46) auf der Drehvorrichtung angeordnet und in dem Heizkissen eingewickelt, das mit der Wasserumwälzeinrichtung geheizt wird. Zum Einleiten des Auftragens von Zellen werden durch Anlegen eines Vakuums die autologes Serum und Media enthaltende Lösung und die isolierten Endothelzellen aus der Vorrichtung (30) zum Isolieren von Endothelzellen gesaugt, wobei die Endothelzellen und die autologes Serum und Media enthaltende Lösung durch den ein Maschensieb enthaltenden Verwirbeler (34) tritt, in dem das Endothelzellenpellet aufgebrochen wird und grobe Teilchen abfiltriert werden. Die wieder in der Lösung suspendierten Endothelzellen werden durch Druckbeaufschlagung in das Lumen des Implantats eingebracht. Das Implantat bewirkt, daß die Lösung filtriert wird, wobei Endothelzellen auf der Lumenwandung zurückbleiben.
Beim Druckbeaufschlagen und beim darauffolgenden Auftragen der Zellen auf dem Implantat wird dieses mit konstanter Drehzahl um seine Achse gedreht und auf 37ºC gehalten.
Es sind folgende Hilfseinrichtungen vorgesehen: zum Sammeln von Blut und zum Abtrennen von Serum, das zum Herstellen der Lösung von autologem Serum und Media dient, ein Blutsammelbeutel und ein Überführungsbeutel ohne Antikoagulans, und ein zusätzlicher Lösung IV-Beutel, der mit einer Lösung von autologem Serum und Media gefüllt ist, sowie ein Sauerstoffzuführsatz zum lebensfähighalten der Zellen beim Implantieren des Implantats.

BEISPIEL 1

Mit Hilfe des Gerätesatzes und der patentierten Verfahren wurden von Mikrogefäßen stammende Zellen isoliert und auf Implantaten von 4 mm x 80 mm aus Polytetrafluorethylen-Schaumstoff (ePTFE) aufgetragen. Nach dreistündigem Drehen wurden die Implantate mit Medium gespült und in 8 Stücke geschnitten. Die Zellen wurden bei PI eingeleitet. Das entgegengesetzte Ende ist mit PS bezeichnet. Die Implantatstücke wurden mit Hämatoxylin gefärbt. Die Zellen wurden mit einem automatischen Bildanalysesystem gezählt. In der Figur 12 ist die durchschnittliche Zellendichte dargestellt, die pro Implantatstück auf aus derartigen schlauchförmigen Implantaten aus Gore-Tex erzielt wurde.

BEISPIEL 2

Mit Hilfe des Gerätesatzes wurde ein Endothelzellenprodukt hergestellt und auf ein Implantat aus ePTFE aufgetragen. Figur 13 ist eine Rasterelektronenmikroskopaufnahme der von Mikrogefäßen kommenden Endothelzellen, die auf das Implantat aufgetragen worden waren. Das Endothelzellenprodukt wurde und ohne nennenswerte Streuung der Zellenkonzentration über die ganze Länge des Implantats gleichmäßig aufgetragen.
Aus Vorstehenden ergibt sich, daß zum Herstellen eines endotheliierten Implantats mit von Mikrogefäßen stammenden Endothelzellen ein einfacher, zuverlässig arbeitender Gerätesatz geschaffen worden ist. Diese Zellen werden von einem Patienten gewonnen, der das Implantat erhalten soll, und werden mit Hilfe des Gerätesatzes verarbeitet, in dem diese Zellen zum Erzeugen eines auftragbaren Zellenprodukts isoliert werden, das auf die Oberfläche eines Implantats aufgetragen wird. Bei all diesen Vorgängen werden in den Bestandteilen des Gerätesatzes sterile Bedingungen hergestellt und aufrechterhalten.

Claims

1. Vorrichtung zum Aufschließen und Verarbeiten von Gewebe zur Herstellung eines Endothelzellenproduktes, gekennzeichnet durch ein einziges Gefäß, das drei Kammern umfaßt: eine Digestionskammer (210), eine getrennte Abfallkammer (212) und eine getrennte Isolierkammer (214), die wahlweise mit der Abfallkammer (212) verbunden ist, und das weiterhin folgendes umfaßt: ein Sieb (232), das zwischen der Isolierkammer (214) und der Digestionskammer (210) angeordnet ist, ein Ventil, das wahlweise die Isolierkammer (214) mit einer Ampulle (235) zur Aufnahme des Endothelzellenproduktes verbindet, und die Digestionskammer (210) und die Isolierkammer (214) können wahlweise und abwechselnd mit der Abfallkammer (212) verbunden werden, so daß in der Vorrichtung durch Verbinden der Digestionskammer mit der Abfallkammer Gewebe aufgeschlossen werden kann und durch Verbinden der Digestionskammer mit der Isolierkammer verarbeitet werden kann, um in dem einzigen Gefäß unter sterilen Bedingungen ein Endothelzellenprodukt herzustellen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Digestionskammer (210) von der Abfallkammer (212) durch ein normalerweise geschlossenes Absperrventil (220) getrennt ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein inneres Entlüftungsrohr (222) von der Abfallkammer (212) in die Isolierkammer (214) erstreckt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes Zweipositionsventil (238) in einer ersten offenen Position eine Verbindung zwischen dem oberen und dem mittleren Abschnitt der Ampulle (235) ermöglicht, und ein zweites Zweipositionsventil (240) in einer ersten offenen Position eine Verbindung zwischen dem mittleren und dem unteren Abschnitt der Ampulle (235) ermöglicht, so daß dann, wenn sich jedes der beiden Zweipositionsventile in einer zweiten geschlossenen Position befindet, das Endothelzellenprodukt in dem mittleren Abschnitt der Ampulle (235) isoliert ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einlaßöffnung (229) an dem Gefäß angebracht ist, um gesammeltes Fett, sowie Spül- und Enzymlösung in die Digestionskammer einzuleiten.

6. Vorrichtung zum Aufschließen und Verarbeiten von Gewebe zur Herstellung eines Endothelzellenprodukts, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung ein einziges Gefäß besitzt, welches vier Kammern umfaßt: eine Enzymvorratskammer (213), eine getrennte Abfallkammer (212), eine getrennte Digestionskammer (210), die abwechselnd wahlweise mit der Abfallkammer verbunden werden kann, und eine getrennte Isolierkammer (214), die wahlweise mit der Abfallkammer (212) verbunden werden kann, daß ein Sieb (232) zwischen der lsolierkammer (214) und der Digestionskammer (210) angeordnet ist, und daß die Isolierkammer wahlweise über ein erstes Ventil mit einer Ampulle (235) zur Aufnahme des Endothelzellenproduktes verbunden werden kann, so daß in der Vorrichtung durch Verbinden der Digestionskammer (210) mit der Enzymvorratskammer (213) und der Abfallkammer (212) Gewebe aufgeschlossen werden kann und durch Verbinden der Digestionskammer (210) mit der Isolierkammer (214) verarbeitet werden kann, um in dem einzigen Gefäß unter sterilen Bedingungen ein Endothelzellenprodukt herzustellen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymvorratskammer (213) mit der Digestionskammer (210) und der Außenumgebung in Verbindung steht, daß die Abfallkammer (212) mit der Digestionskammer (210) in Verbindung steht, und daß die Digestionskammer (210) mit der Enzymvorratskammer (213) und der Zellenisolierkammer (214) in Verbindung steht.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung zwischen der Enzymvorratskammer (213) und der Digestionskammer (210) durch ein normalerweise geschlossenes Absperrventil (221) hergestellt wird, das öffnet, wenn der Druck in der Enzymvorratskammer beim Zentrifugieren der Vorrichtung ansteigt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung zwischen der Digestionskammer (210) und der Zellenisolierkammer (214) eine direkte Verbindung über ein Sieb (232) ist, das nichtaufgeschlossene Stoffe in der Digestionskammer zurückhält.

10. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellenisolierkammer (214) des weiteren eine Einrichtung zum Isolieren des in dem Gefäß hergestellten Endothelzellenproduktes umfaßt, wobei die Einrichtung zwei Zweipositionsventile (238, 240) umfaßt, die bei geschlossenem Ventil das Endothelzellenprodukt in dem Abschnitt der Zellenisolierkammer zwischen den zwei Ventilen isolieren.

11. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein inneres Entlüftungsrohr (223) zwischen der Enzymvorratskammer (213) und der Digestionskammer (210) angeordnet ist.

12. Verfahren zum Sammeln und Verarbeiten von Gewebe zur Herstellung eines Endothelzellenproduktes, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: Bereitstellen einer Vorrichtung zum Sammeln und Verarbeiten von Gewebe zur Herstellung eines Endothelzellenproduktes, die eine Enzymvorratskammer, eine Abfallkammer, eine Digestionskammer und eine Zellenisolierkammer umfaßt, Einleiten des zu verarbeitenden Gewebes in die Digestionskammer, Einleiten von Enzym in die Enzymvorratskammer, Einleiten einer Spüllösung in die Digestionskammer, Rühren der Vorrichtung, Zentrifugieren der Vorrichtung in einer bevorzugten Richtung, so daß die Spüllösung und die Abfallstoffe in die Abfallkammer geleitet werden, Zentrifugieren der Vorrichtung in einer zweiten bevorzugten Richtung, so daß das Enzym von der Enzymvorratskammer in die Digestionskammer geleitet wird, Rühren der Vorrichtung und Zentrifugieren der Vorrichtung in einer zweiten bevorzugten Richtung, um das Endothelzellenprodukt in der Zellenisolierkammer zu isolieren.