DE69210892T2

DE69210892T2 - Triglyceride enthaltende trockene Zellfragmente und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE69210892T2
Application number: DE69210892T
Authority: DE
Inventors: Tomoya Aoyama; Toshio Sano; Masahiko Touda
Original assignee: Idemitsu Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1991-07-11
Filing date: 1992-07-03
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2012-07-04
Also published as: EP0522470B1; AU640875B2; AU1946792A; EP0522470A1; DE69210892D1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Triglycerid-haltige, trockene Zellfragmente, die als Futter fiir die Viehzucht und als Haustierfutter verwendet werden können, sowie auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Zellfragmente.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine Futterzusammensetzung, welche Triglycerid haltige, trockene Zellfragmente enthält
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Extraktion und Rückgewinnwig von Lipiden (Triglyceride) aus Triglycerid-haltigen, mikrobiellen Zellen, wobei das Verfahren sehr effizient und sicher ist.
Unter den Mikroorganismen haben Schimmelpilze und Hefen die Fähigkeit zur Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie γ-Linolensäure (GLA), Dihomo-γ-Linolensäure (DGLA), Arachidonsäure (AA), Eicosapentaensäure (EPA) und andere. Es ist bekannt, solche Mikroorganismen als futter für Tiere zu verwenden (z.B. JP-A-61-149054) 63- 98355 und 1-215245 - der Ausdruck "JP-A", so wie er hier verwendet wird, bedeutet eine "nicht geprüfte, veröffentlichte japanische Patentanmeldung" und Britisches Patent 2114442).
Da Lipide, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthalten, wie Triglyceride und andere, sich im Inneren von mikrobiellen Zellen anhäufen, müssen sie direkt aus den Zellen oder durch mechanisches oder enzymatisches Aufbrechen der Zellwände extrahiert werden, um sie verwenden zu können.
Es ist beispielsweise ein Aufbrech- und Extraktionsverfahren für in Ethanol suspendierte, mikrobielle Zellen bekannt, wobei die Zellen in dem Ethanol aufgebrochen werden, das Ethanol durch Filtration und/oder Zentrifugation entfernt wird, ein Extraktionslösungsmittel hinzugefügt wird, um die so aufgebrochenen Zellen in dem Lösungsmittel wieder zu suspendieren, und wobei die erwünschten, mehrfach ungesättigten Fettsäuren aus der Suspension extrahiert werden (JP-A 61-170397, 61-227790, 62-44170, 62-179598, etc.).
Bei diesem Verfahren werden jedoch zwei verschiedene Lösungsmittel verwendet, wobei eine Abtrennung von festen Gegenständen (Zelltrummer) von dem organischen Lösungsmittel notwendig ist. Da diese Operation kompliziert ist, ist dieses Verfahren nachteilig. Da ferner die Zellen in einem organischen Lösungsmittel aufgebrochen werden, besteht die Gefahr des Entstehens von Feuer, wobei ferner die Verwendung von geeigneten Ausrüstungen notwendig ist.
Da die mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Kontakt mit dem Luftsauerstoff gebracht werden, können diese Fettsäuren relativ leicht mit dem Sauerstoff reagieren und Peroxide bilden, wodurch der Gehalt der mehrfach ungesättigten Fettsäuren bei der Lagerung oder während der Hitzebehandlung für die Granulierwig reduziert wird Mit den Peroxiden und deren Abbauprodukten können abstoßende Gerüche entstehen, die ein weiteres Problem hervorrufen, da das gelagerte oder hitzebehandelte Futter, welches die mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthält, von den Tieren nicht mehr angenommen wird.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die oben erwähnten Nachteile bei der Verwendung von mikrobiellen Zellen, die Triglyceride mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten, als Futter für die Viehzucht oder als Haustierfutter zu überwinden, und ferner ein Verfahren bereitzustellen, mit dem ein Absinken des Gehaltes an mehrfäch ungesättigten Fettsäuren in den Zellen bei deren Hitzebehandlung vermieden wird.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren für die Extraktion und Rückgewinnung von Lipiden bzw. von Triglyceriden aus mikrobiellen Zellen anzugeben, welches sehr effizient und sicher ist.
Für den Zweck der Erreichung der oben erwähnten Aufgaben stellt die Erfindung zunächst ein Verfahren fig die Herstellung von Triglycerid-haltigen, trockenen Zellftagmenten bereit, bei dem die Abnahme des Gehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsäuren nach einer Hitzebehandlung bei 150ºC für 2 Minuten nicht mehr als 10 Gew.-% beträgt, und wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß Triglycerid-haltige, mikrobielle Zellen aufgebrochen, wobei die Zellen in Wasser dispergiert sind, und anschließend entwässert werden.
Die Erfindung stellt zweitens Triglycerid-haltige, trockene Zellfragmente bereit, bei denen die Abnahme des Gehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsäuren nach einer Hitzebehandlung bei 150ºC für 2 Minuten nicht mehr als 10 Gew.-% beträgt, wobei die Zellfragmente durch Aufbrechen von Triglycerid-haltigen mikrobiellen Zellen, wobei die Zellen in Wasser dispergiert sind, und deren anschließende Entwässerung erzielt werden.
Die Erfindung stellt drittens Triglycerid-haltige, trockene Zellfragmente bereit, bei denen die Abnahme des Gehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsäuren nach einer Hitzebehandlung bei 150ºC fig 2 Minuten nicht mehr als 10 Gew.-% beträgt.
Die Erfindung stellt viertens eine Futterzusammensetzung bereit, welche die Zellfragmente gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung enthält
Gemäß dem fünften und letzten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für die Rückgewinnung von Triglyceriden aus Triglycerid-haltigen, mikrobiellen Zellen bereitgestellt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß Triglycerid-haltige, mikrobielle Zellen aufgebrochen, wobei die Zellen in Wasser dispergiert sind, und anschließend entwässert und mit einem Lösungsmittel extrahiert werden.
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Abfolge eines Verfahrens für die Herstellung von Hundefutter.
Figur 2 zeigt eine Ansicht einer Säule, die in dem Beispiel 1 venvendet wird, wobei a Zellen, b Saugwatte und c einen Sperrhahn bezeichnen.
Triglycerid-haltige, mikrobielle Zellen, die nach der Erfindung zu venvenden sind, sind solche, die durch die Kultivierung von Mikroorganismen erzielt werden, welche die Fähigkeit zur Herstellung von Triglyceriden durch normale Verfahren besitzen.
Unter den Mikroorganismen gibt es verschiedene Schimmelpilze, Hefen und Algen, wie oben erwähnt, welche die Fähigkeit zur Herstellung von Triglyceriden besitzen.
Unter den Mikroorganismen, welche die Fähigkeit zur Herstellung von γ-Linolensäure enthaltende Lipide besitzen, sind beispielsweise Mikroorganismen zu nennen, die zu der Gattung Mortierella gemäß der Beschreibung in JP-A 60-168391 gehören, Mikroorganismen, die zu der Gattung Mucor gehören gemäß der Beschreibung in JP-A 63-283589 sowie Mikroorganismen, die zu der Gattung Rhizopus gehören, wie dies in JP-A 63-133994 beschrieben ist.
Unter den Mikroorganismen, welche die Fähigkeit zur Herstellung von Dihomo-γ-Linolensäure enthaltende Lipide und Arachidonsäure enthaltende Lipide besitzen, sind beispielsweise Mikroorganismen zu erwähnen, die gemäß der Beschreibung in JP-A 63-14696, 63-12290 und 63-44891 zu der Gattung Mortierella gehören, sowie Mikroorganismen, die zu der Gattung Conidiobolus gehören, wie dies in JP-A-64-47384, 64-47385 und 63-102688 beschrieben ist.
Als Mikroorganismen, die zu der Gattung Mortierella gehören, können beispielsweise genannt werden Mortierella isabellina IFO 7824, Mortierella ramaniana var. angrispora IFO 8187, etc.
Als Mikroorganismen, die zu der Gattung Mucor gehören, können beispielsweise Mucor circinelloides HUT 1121 (BP-3883), Mucor javanicus HUT 1162 (FERM BP-3884), genannt werden.
Als Mikroorganismen, die zu der Gattung Conidiobolus gehören, können beispielhaft Conidi- obolus heterosporus ATCC 12941, Conidiobolus nanodes CBS 183/62 (ATCC 14651), Coni- diobolus lamprauges ATCC 12585 genannt werden.
Alle diese Mikroorganismen haben die Fähigkeit zur Herstellung von Lipiden (Triglyceride), wobei sie große Mengen von Lipiden (Triglyceride) im Innern ihrer Zellen speichern können. Die Kultivierung von diesen Mikroorganismen kann mit bekannten Verfahren durchgeführt werden. Die für die Kultivierung der oben erwähnten Mikroorganismen zu benutzenden Medien können solche Medien sein, in denen in bekannter Weise die Mikroorganismen gut wachsen können, um die erwünschten Lipide (Triglyceride) heruustelleit Die Medien können beispielsweise Glucose, Starke und ähnliche Kohlenstoffquellen zusammen mit Ammoniumsulfat sowie Harnstoff und entfettetes Sojapulver, entfettete Reiskleie und ähnliche organische Stickstoffquellen enthalten. Ferner können diese Medien, falls notwendig, Phosphate und Metallsalze wie Magnesiumsalze, Mangansalze und Calciumsalze, sowie Vitamine und Aminosäuren enthalten.
Die Kultbedingungen bezüglich pH, Temperatur und Zeit können so in geeigneter Weise gesteuert werden, daß die gewünschten Lipide (Triglyceride) in zufriedenstellender Weise hergestellt werden und sich in den kultivierten Mikroorganismen anhäufen.
Da sich die Trigiyceride im Innern der mikrobiellen Zellen anhäufen, werden die kultivierten Zellen aus der Nährstofflösung mittels Filtration, Zentrifugation oder einer ähnlichen Fest- Flüssig-Trennung geerntet.
Gemäß dem Verfahren nach der Erfindung werden die geernteten Zellen aufgebrochen, wobei sie in Wasser dispergiert vorliegen. Dies bedeutet, daß die geernteten Zellen aufgebrochen werden, wobei sie wieder dispergiert und suspendiert in Wasser vorliegen oder nachdem sie wieder in Wasser dispergiert und suspendiert wurden.
Wenn die Zellen in Wasser dispergiert und suspendiert sind, ist die Konzentration der Zellen vorzugsweise größer. Jedoch wird unter Berücksichtigung der Fließfähigkeit der Zelldispersion oder Suspension während des Transportes mit einer Pumpe die Konzentration der Zellen auf einen Wert von 3 bis 18 Gew.-% eingestellt, insbesondere auf 8 bis 15 Gew.-%. Um ein Verstopfen der Vorrichtung bei dem Schritt des Aufbrechens der Zellen mit einem Zellbrecher oder einer ähnlichen Vorrichtung zu verhindern, ist es wünschenswert, daß die Zellen zuvor mit einer Dispergiervorrichtung, wie einer Disper Mill (Handelsname) oder einer ähnlichen Maschine, grob zermahlen werden Falls die Zellkonzentration in der Kulturflüssigkeit ausreichend hoch ist, oder falls die Kulturflüssigkeit frei von nicht erwünschten Nebenprodukten ist, die bei den nachfolgenden Schritten oder bei den Produkten zu Schwierigkeiten führen können, können die Zellen direkt einem Brecher zugeführt werden, ohne daß sie zuvor isoliert werden.
Normalerweise wird das Aufbrechen der Zellen mechanisch durchgeführt. Beispielsweise können die Zellen in einer French-Press, einem Ultraschallhomogenisator oder einer ähnlichen Vorrichtung aufgebrochen werden, oder sie werden in Gegenwart von Glaskugeln homogenisiert oder sie werden mit einer Kugelmühle zermahlen.
Für die kontinuierliche Durchführung der Dispersion, Suspension und des Aufbrechens der Zellen kann ferner in effektiver Weise eine Hochdruckhomogenisatorvorrichtung benutzt werden, die im allgemeinen für die Emulgierung oder Homogenisierung von feinen Pulver- Suspensionen zur Anwendung kommt. Ferner kann auch eine DYNO-MILL und PERL MILL (beides sind Handelsnamen) verwendet werden.
Falls gewünscht, können die Zellen auch in heißem Wasser anstelle von kaltem Wasser dispergiert werden, um eine Zellsuspension zu bilden, die eine Temperatur von 50 bis 80ºC aufweist, um so die Lipasen der Mikroorganismen zu inaktivieren. Ein Abbau der Triglyceride aufgrund der Lipaseaktivitaten, der während der Verarbeitung von dem Aufbrechen bis zu dem Trocknen auftreten würde, kann so verliindert werden, so daß ein Anstieg des Säurewertes der Lipide, die in dem Produkt sind, dainit verhindert werden kann.
Anschließend werden die so aufgebrochenen Zellfragmente entwässert. Die Entwässerung kann in solch einer Weise durchgeführt werden, daß der Wassergehalt in den Zellfragmenten 10 Gew.-% oder weniger, vorzugsweise 5 Gew.-% oder weniger beträgt Es ist nicht immer notwendig, die Entwässerung bis zu einem Wassergehalt von 0 % oder bis zur kompletten Trockenheit der Zellfragmente durchzuführen. Das Entwässern kann beispielsweise unter Verwendung eines Gefriertrockners, Vakuumtrockners, pneumatischen Trockners, Sprühtrockners, Pudeltrockners, Trommeltrockners oder einer ähnlichen Vorrichtung durchgeführt werden.
Die Triglycerid-hattigen, trockenen Zellfragmente nach der Erfindung, die nach der oben erwahnten Weise erzielt werden, zeigen einen Abfall des mehrfach ungesättigten Fettsäuregehaltes von nicht mehr als 10 Gew.-% nach einer Hitzebehandlüng bei 150ºC für 2 Minuten Solche Zellfragmente, die einer Abnahme des Gehaltes an mehrfäch ungesättigten Fettsäuren voll 10 Gew.-% oder mehr unterliegen, sind unstabil und werden leicht zerstört, so daß sie als Futter nicht geeignet verwendet werden können. Die Zellfragmente zeigen wünschenswerterweise einen Peroxidwert (POV) von nicht mehr als 10. Falls sie einen POV von mehr als 10 aufweisen, wird das diese Zellfragmente enthaltende Futter von den Tieren ggf. nicht mehr angenommen.
Wenn die Triglycerid-haltigen trockenen Zellfragmente nach der Erfindung mit den oben erwähnten Eigenschaften als Futter verwendet werden, können sie mit normalen Futtergrundstoffmaterialien gemischt werden, wie Körner, Getreide, Reiskleie und Gärniederschläge, Vitamine, Mineralien und ähnliche Substanzen. Der Anteil der Triglycerid-haltigen trockenen Zellfragmente an den Futtergrundstoffen ist nicht in spezifischer Weise definiert, kann aber in geeigneter Weise unter Berücksichtigung der Verwendung und der Aufgabe des Futters festgelegt werden. Im allgemeinen beträgt der Anteil der trockenen Zellfragmente 0,001 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 20 Gew.-%.
Die Futterzusammensetuung mit den Triglycerid-haltigen trockenen Zellfragmenten nach der Erfindung wird durch Mischen von bestimmten Mengen der notwendigen Bestandteile, einem optionalen Kneten unter Wärme und durch Fornien der Mischung in die gewünschten Zustände, wie Pulver, Granulate oder Tafeln, hergestellt.
Um die Triglyceride nach der Erfindung wiederzugewinnen, werden die nach obiger Weise entwässerten Zellfragmente mit einem Lösungsmittel extrahiert. Nach der Entwässerung werden die Zellfragmente mit einem Lösungsmittel extrahiert, um aus ihnen die Triglyceride zu gewinnen. Als geeignete Lösungsmittel für die Extinktion können beispielsweise n-Hexan, Ethanol, Aceton, Methylethylketon, Cyclohexanon, Diethylether, Ethylacetat und andere verwendet werden. Von dem Gesichtspunkt des Extraktionsertrages und der Anwendbarkeit der gewonnenen Triglyceride für Futter wird n-Hexan besonders bevorzugt.
Das Extraktionsverfahren mit dem Lösungsmittel ist nicht spezifisch definiert Insbesondere wird eine Extraktion mit einer Säule bevorzugt. Für die Extraktion und die Rückgewinnung der Glyceride mit einer Säule werden beispielsweise die entwässerten Zellfragmente in eine zylindrische Säule gegeben und ein Extraktions-Lösungsmittel wird von oben in die Säule eingeführt, wobei das Lösungsmittel, das unten aus der Säule herausläuft, gesammelt und kondensiert wird, um die erwünschten Triglyceride zu gewinnen. Auf diese Weise kann die Menge des zu verwendenden Lösungsmittels reduziert werden. Um eine Leckage von festen Bestandteilen (Zellfragmenten) aus dem Säulenboden zu verhindern, ist es wünschenswert, daß ein Drahtgitter mit einer geeigneten Größe an dem Boden der Säule vorgesehen ist, oder daß der Boden der Säule mit einem Filterhilfsmittel bedeckt ist, wie Diatomeenerde oder ähnliches.
Die Menge des zu verwendenden Lösungsmittels für die Extraktion beträgt vorzugsweise 2 bis 121 pro kg der zu behandelnden Zellfragmente. Unter Berücksichtigung des Extraktionsertrages und ökonomischen Bedingungen werden 3 bis 5 l bevorzugt
Das aus der Säule unten herausfließende Lösungsmittel wird mittels bekannter Kondensation unter reduziertem Druck destilliert, wobei Rohlipide (Roh-Triglyceride) erzielt werden. Falls gewünscht, können diese mit bekannten Methoden weiter aufgereinigt werden.
Anhand der folgenden Beispiele wird die Erfindung im folgenden detailliert erläutert werden.

PRODUKTIONSBEISPIEL 1

Mucor circinelloides HUT 1121 (FERM BP-3883) wurde in einem Medium mit der in der Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung und unter den unten erwähnten Bedingungen in einem 300-Liter Fermenter für 5 Tage kultiviert, um eine große Menge an Zellen zu erzielen. Nach der Kultivierung wurde die Fermentationsnährlösung abfiltriert, um die Zellen zu ernten.
Die so geernteten Zellen wurden einheitlich in Wasser dispergiert und suspendiert, um eine Zellsuspension mit einer Zellkonzentration von 12 % zu erzielen. Tabelle 1: Zusammensetzung des Mediums (für die Produktion von Lipiden) Glucose Ammoniumsulfät Kaliumdihydrogenphosphat Magnesiumsulfät-7-Hydrat Hefeextrakt Eisensulfat-7-Hydrat Calciumchlorid-2-Hydrat Kupfersulfat-5-Hydrat Zinksulfat-7-Hydrat Manganchlorid-4-Hydrat Entschäumungsmittel "CC-118" Dionisiertes Wasser (Anfangsphase) Liter
Unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators (HV-OH-0,7; 3,7 S); hergestellt von Izumi Food Machinery Co.) wurden die Zellen in der Zellsuspension anschließend kontinuierlich unter einem Druck von 700 kg/cm² und einer Rate von 60 Liter/Stunde aufgebrochen. Die so erzielten Zellfragmente wurden entwässert und mit einem Zweitrommeltrockner getrocknet, um so 12 kg eines trockenen Zellfragmentpulvers mit einem Wassergehalt von 3,8 Gew.-% zu erzielen.
Nach alkalischer Hydrolyse des trockenen Zellfragementpulvers wurde eine Probe mittels Gaschromatographie analysiert, wobei ein Gehalt von 73,4 g/kg von γ-Linolensäure festgestellt wurde.
Die Lipide wurden mit n-Hexan aus dem trockenen Zellfragmentpulver extrahiert und gemaß einem Standardöl- und Fettanalysetestverfahren analysiert (aufgestellt von The Japan Oil Chemist Society), um den POV-Wert zu bestimmen. Es wurde ein POV-Wert von 0,9 bestimmt.

PRODUKTIONSBEISPIEL 2

Mucor circinelloides HUT 1121 (FERM BP-3883) wurde in der gleichen Weise wie in dem Produktionsbeispiel 1 kultiviert, wobei die Zellen aus der Fermentationsnährlösung durch Filtration abgeerntet wurden. Die so geernteten Zellen wurden einheitlich in Wasser dispergiert und suspendiert, um eine Suspension mit einer Zellkonzentration von 12 % zu erreichen. Diese Suspension wurde entwässert und mit einem Zweitrommeltrockner getrocknet, wobei 12 kg eines trockenen Zellpulvers mit einem Wassergehalt von 4 Gew.-% erzielt wurden.
Das trockene Zellpulver wurde in der gleichen Weise wie in dem Produktionsbeispiel 1 analysiert. Das Pulver enthielt 74,2 g/kg von γ-Linolensäure. Die mit n-Hexan aus dem Zellpulver extrahierten Lipide hatten einen großen POV-Wert von 0,9.

TESTBEISPIEL 1

Die Stabilität gegenüber einer Selbstoxidation der γ-Linolensäure enthaltenden Zellen, die nach den oben erwähnten Produktionsbeispielen 1 und 2 hergestellt wurden, wurde getestet. Die in den Produktionsbeispielen 1 und 2 erzielten Zellen wurden in 4 Petrischalen in einer Menge von 5 g gegeben, wobei die Petrischalen einen Durchmesser von 9 cm und eine Tiefe von 1,5 cm aufwiesen. Die Schalen wurden in einen Inkubator mit einer Temperatur von 40ºC und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % gegeben. Alle 10 Tage wurden die Schalen herausgenommen und der γ-Linolensäuregehalt in den Proben wurde mit dem gleichen Verfahren wie in dem Produktionsbeispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2: Veranderung des γ-Linolensäuregehaltes während der Lagerung der γ-Linolensäurehaltigen Zellen γ-Linolensäuregehalt (g/kg) Zeit der Lagerung (Tage) Zellen des Produktionsbeispiels 1 Zellen des Produktionsbeispiels 2
Zellen des Produktionsbeispiels 2 etwa 30 Gew.-% nach einer Lagerzeit von 40 Tagen betrug, während der γ-Linolsäuregehalt in den Zellen des Produktionsbeispiels 1 selbst nach einer Lagerung von 40 Tagen sich nicht verändert hafte. Die Zellen zeigten keinen unangenehmen Geruch nach der Lagerung

TESTBEISPIEL 2

Die Veränderung des γ-Linolensäuregehaltes in den Zellen gemäß den Produktionsbeispielen 1 und 2 wurde während des Schritts der Herstellung von Hundefutter bestimmt Es wurden jeweils 2,5 kg der Zellen, die in den Produktionsbeispielen 1 und 2 erzielt wurden, verwendet, um ein trockenes Hundefütter gemäß der Zusammensetzung von Tabelle 3 herzustellen. Tabelle 3 - Zusammensetzung des Trockenhundefutters Mais Maizenafutter Knochenmehl Sojagärniederschlag tierische Lipide γ-Linolensäure-haltige Zellen Mineralstoffmischung Vitaminmischung Gesamt
Die Figur 1 zeigt das Ablaufschema eines Verfahrens für die Herstellung von Hundefutter, wobei die Rohstoffkomponenten einer hohen Temperatur von 150ºC in dem Hitzeschritt ausgesetzt werden, wobei γ-Linolensäure bei diesem Schritt zerstört wird.
Vor und nach dem Hitzeschritt wurden Proben genommen, um den γ-Linolensäuregehalt in jeder Probe vor und nach dem Schritt zu bestimmeit Die Ergebnisse sind. in der Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 - Veränderung des γ-Linolensäuregehaltes bei dein Verfahren zur Herstellung von Trockenhundefutter Zellen des Produktionsbeispiels 1 Zellen des Produktionsbeispiels 2 vor Erhitzen nach Erhitzen * γ-Linolensäuregehalt: g/kg der Hundefutterprobe
Aus obiger Tabelle 4 wird deutlich, daß keine Veränderung des γ-Linolnsäuregehaltes vor und nach dem Erhitzen in der Probe festgestellt wurde, welche die mikrobiellen Zellen des Produktionsbeispiels 1 enthielt, während der γ-Linolensäuregehalt in der Probe mit den mikrobiellen Zellen des Produktionsbeispiels 2 um etwa 20 Gew.-% nach dem Hitzeschritt abnahm.

TESTBEISPIEL 3

5 kg der γ-Linolensäure-enthaltenden Zellpräparate gemäß den Produktionsbeispielen 1 und 2 wurden in einen Polyethylenbeutel gegeben und für einen Monat bei 25ºC gelagert. Die so gelagerten Zellpräparate wurden an Hunde verfüttert, bei denen ein Seborrhoe-Syndrom diagnostiziert wurde, wobei der Geschmack der Zellpräparate sowie der Heileffekt bestimmt wurde. Bei den für einen Monat gelagerten Zellpräparaten der Produktionsbeispiele 1 und 2 wurde kein Unterschied des γ-Linolensäuregehaltes festgestellt, wobei aber der POV-Wert der aus den Präparaten extrahierten Lipide auf 7,5 bzw. 114,4 zunahm.
Mehrere Gruppen von jeweils 20 Hunden mit einem Körpergewicht von 5 bis 6 kg und mit einem Seborrhoe-Syndrom wurden für den Test verwendet. Ein oder zwei g/Tag der Zellen von dem Produktionsbeispiel 1 und 2 wurden in Müch suspendiert und jeden Tag den Testhunden von jeder Gruppe über einen Zeitraum von 20 Tagen angeboten, wobei der Geschmack der zugeführten Zellsuspension sowie der Heileffekt auf die Krankheit mit dem nackten Auge bestimmt wurde Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 - Hundegeschmack der γ-Linolensäure enthaltenden Zellen und Heileffekt auf das Hundeseborrhoe-Syndrom 1) Zellen des Produktionsbeispiels 1 Art der Nahrungsaufnahme Heileffekt Gefütterte Menge Gut Normal Nicht gut * gefütterte menge: Zellen in Gramm/Tag/Hund 2) Zellen des Produktionsbeispiels 2 Art der Nahrungsaufnahme Heileffekt Gefütterte Menge Gut Normal Nicht gut * gefütterte Menge: Zellen in Gramm/Tag/Hund
Aus obiger Tabelle 5 wird deutlich, daß die Zellsuspension des Produktionsbeispiels 1 von den Testhunden in einem großen Maße favorisiert wurde, und daß kein Testhund diese Zell- Suspension verweigerte. Zusätzlich war der Heileffekt der Zellsuspension des Produktionsbeispiels 1 gut. Im Gegensatz dazu lehnten etwa 40 % der Testhunde die Suspension der Zellen des Produktionsbeispiels 2 ab, wobei auch ein entsprechend herabgesetzter Heileffekt auftrat.

REFERENZBEISPIEL

In den folgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen wurden die Gesamtlipidmengen in den Zellen als Standard für die Berechnung der Extraktionsausbeute von allen Lipiden mittels des unten erwähnten Verfahrens gemessen.
Mucor circinelloides HUT 1121 (FERM BP-3883) wurden in einem 30 l-Fermenter unter den Bedingungen, die in der Tabelle 6 gezeigt sind, kultiviert. Durch Filtration wurden die γ-Linolensäure-haltigen Zellen geerntet.
Die so geemteten Zeilen wurden wieder in Wasser dispergiert, um eine 12 % Suspension zu erzielen. Ein Teil davon wurde mit einem Zweitrommeltrockner entwässert, um trockene Zellen mit einer Wassergehalt von 4 Gew.-% herzustellen.
100 ml Glasskugeln mit einem Durchmesser von 0,6 mm und 100 ml n-Hexan wurden zu 5 g der trockenen Zellen hinzugefügt, die anschließend mit einem Homogenisator (Excell Autohomogenisator DX-3 Modell hergestellt von Nippon Seiki Co.) mit einer Drehgeschwindigkeit von 10000 rpm für 3 Minuten homogenisiert und anschließend gefiltert wurden, um die Glaskugeln und die Zellfragmente zu entfernen Anschließend. wurden 100 ml n-Hexan den Zellen hinzugefügt, die zweimal in der gleichen Weise, wie oben angegeben, homogenisiert wurden. Die so erzielten Filtrate wurden kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch 1,9 g von gelben Lipiden erzielt wurden. Im Ergebnis wurde berechnet, daß die Zellen 38 % Lipide enthielten.

BEISPIEL 1

Mucor circinelloides HUT 1121 (FERM BP-3883) wurde in einem 30 l-Fennenter unter den Bedingungen, die in der Tabelle 6 angegeben sind, kultiviert. Die γ-Linoiensäure-haltigen Zellen wurden mittels Filtration geerntet.
Die so geemteten Zellen wurden in Wasser einheitlich dispergiert und suspendiert, um eine 10 % Suspension zu erzielen, wobei die Zellen dann mit einem Homogenisator (Microfluidizer M110Y Modell, hergestellt von Microfluidize Co.) unter einem Druck von 700 kg/cm² aufgebrochen wurden.
Danach wurden die Zellfragmente gefriergetrocknet, wobei ein trockenes Zellpulver mit einem Wassergehalt von 3,4 Gew.-% erzielt wurde.
10 g des trockenen Zellfragmentpulvers wurden in eine Glassäule mit einem inneren Durchmesser Voll 20 mm gefüllt, wie dies in der Figur 2 dargestellt ist. 100 ml n-Hexan wurden von oben in die Säule eingeführt. Die n-Hexan/Lipid-Fettmischung (Micelle) wurde am unteren Ende der Säule gesammelt, wobei das n-Hexan durch Kondensation und Destillation unter reduziertem Druck von dieser Mischung entfernt wurde. Im Ergebnis wurden 3,4 g Lipide erzielt. Die Extraktionsausbeute betrug 90 %.

BEISPIEL 2

Mucor circinelloides HUT 1121 (FEEM BP-3883)wurde in einem 300 l-Fermenter unter den Bedingungen gemäß der Tabelle 6 kultiviert. Die Zellen wurden mittels Filtration geerntet Die so gewonnenen Zellen wurden in Wasser einheitlich dispergiert und suspendiert, um eine 12 % Suspension zu erzielen.
Die erzielte Suspension wurde dann mit einem Hochdruckhomogenisator (HV-OH-0,7-3,7 S Modell; hergestellt von Izumi Food Machinery Co.) unter einem Druck von 700 kg/cm² bei einer Strömungsrate von 60 Liter/Stunde aufgebrochen. Die aufgebrochenen Zellen wurden mit einem Zweitrommeltrockner entwässert, wodurch ein trockenes Zellpulver mit einem Wassergehalt von 3,8 Gew.-% erzielt wurde.
700 g des trockenen Zellpulvers wurde in läst die gleiche Säule, die in der Figur 2 gezeigt ist, gefüllt (die Ausnahme bestand darin, daß die erste Säule einen inneren Durchmesser von 55 mm und eine Gesamtlänge von 1400 mm aufwies und daß sie keinen Hahn hatte). Von der Spitze der Säule wurde n-Hexan in einer Menge des Vierfachen der Menge des trockenen Zellfragmentpulvers in die Säule eingeführt (oder 2,8 l von n-Hexan), wobei 2,3 l einer Hexanflüssigkeit aus dem Ausfluß von dem Boden der Säule gewonnen wurde, bevor die Flussigkeit keine gelbe Lipidfarbe mehr aufwies. Die Flussigkeit wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch 215 g Lipide gewonnen wurden. Die Extraktionsausbeute betrug 94%

BEISPIELE 3 BIS 8

Verschiedene Lipid-herstellende Mikroorganismen, die in der Tabelle 7 angezeigt sind, wurden unter den Bedingungen gemäß Tabelle 6 kultiviert, aufgebrochen, getrocknet und extrahiert und zwar in der gleichen Weise wie in dem Beispiel 1. Die Extraktionsausbeute für jeden Fall ist in der Tabelle 7 gezeigt.

VERGLEICHSBEISPIEL 1

Mucor circinelloides HUT 1121 (FERM BP-3883) wurde in einem 30 l-Fermenter kultiviert, wobei die γ-Linolensäure-haltigen Zellen mittels Filtration geerntet wurden.
Die so geernteten Zellen wurden wieder in Wasser dispergiert, um eine 12 % Suspension zu erzielen. Ein Teil von dieser Suspension wurde dann mit einem Zweitrommeltrockner getrocknet, wobei trockene Zellen mit einem Wassergehalt von 4 Gew.-% erzielt wurden.
10 g der trockenen Zellen wurden in eine Säule gefüllt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durch die Säule extrahiert. Im Ergebnis wurden 1,2 g gelbe Lipide erzielt. Die Extraktionsausbeute betrug 31 %.

VERGLEICHSBEISPIEL 2

300 ml Ethanol wurden zu 100 g nassen Zellen (Wassergehalt 65 %), die gemäß dem Vergleichsbeispiel 1 erzielt wurden, hinzugefügt, wobei anschließend eine Mahlung in einer 11 Kugelmühle für 5 Stunden erfolgte.
Nach dem Mahlen wurde durch Filtration unter reduziertem Druck das Ethanol entfernt und die zurückbleibenden Zellen wurden gesammelt. 300 ml n-Hexan wurden hinzugefügt und wieder wurde in der Kugelmühle für 5 Stunden für die Extraktion gemahlen.
Durch Filtration unter reduziertem Druck wurden die Zellreste und das n-Hexan voneinander getrennt Die so erhaltene Hexanfraktion wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch 9,2 g Lipide gewonnen wurden. Die Extraktionsausbeute betrug 69 %. Tabelle 6 Mikroorganismus Mucor javanicus Mucor circinelloides Mortierella isabellina Mortierella ramaniana var. angrispora Conidiobolus heterosporus Conidiobolus nanodes Conidiobolus lamprauges Zusammensetzung des Mediums Glucose Ammoniumsulfat Kaliumdihydrogenphosphat Hefeextrakt Polypepton Spurenmineralstofflösung (*) Kulturbedingungen Temperatur g/Liter ml/Liter (eingestellt mit NaOH) nicht definiert (*) Spurenmineralstofflösung deionisiertes Wasser Tabelle 7 Beispiel Nr. Mikroorganismus Extraktionsausbeute Mortierella isabelliana Mortierella ramaniana var. angrispora Conidiobolus heterosporus Conidiobolus nanodes Conidiobolus lamprauges Mucor javanicus
Gemäß der Erfindung werden trockene Zellfragmente von Triglycerid-haltigen, mikrobiellen Zellen durch Aufbrechen eiiier waßrigen Dispersion von Zellen und deren anschließenden Entwässerung erzielt Die nach der Erfindung erzielten, trockenen Zellfragmente sind dadurch gekennzeichnet, daß nach einer Hitzebehandlung der Zellfragmente bei 150ºC für 2 Minuten eine Abnahme des Triglyceridgehaltes von nicht mehr als 10 Gew.-% auftritt. Die Zellfragmente zeigen somit eine sehr gute Lagerstabilität und sind gegenüber der Hitzebehandlung bei ihrer Herstellung stabil. Somit sind sie nützlich für die Herstellung von Futter für Tiere und für die Herstellung von Haustierfutter, wobei dieses Futter von den Tieren und Haustieren gerne angenonunen wird.
Das Verfahren nach der Erfindung hat lerner eine hohe Extraktionsausbeute und erlaubt eine sehr effiziente Extraktion von Lipiden (Triglyceriden) aus mikrobiellen Zellen.
Das Verfahren nach der Erfindung hat ferner industrielle Vorteile, da die Menge des zu verwendenden Lösungsmittels bei der Durchführung des Verfahrens klein sein kann, da der Verfahrensablauf sicher und einfach ist.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Triglycerid-haltigen, trockenen Zellfragmenten, bei dem die Abnahme des Gehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsäuren nach einer Hitzebehandlung bei 150ºC für 2 Minuten nicht mehr als 10 Gew.-% beträgt, und wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß Triglycerid-haltige, mikrobielle Zellen aufgebrochen, wobei die Zellen in Wasser dispergiert sind, und anschließend entwässert werden.

2. Verfahren nach Anspruch. 1, bei dem die Zellen durch die Kultivierung von Mucor circinelloides HUT 1121 (FERM BP-3883) oder Mucor javanicus HUR 1162 (FERM BP-3884) erzielt werden.

3. Triglycerid-haltige, trockene Zellfragmente, bei denen die Abnahme des Gehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsauren nach einer Hitzebehandlung bei 150ºC für 2 Minuten nicht mehr als 10 Gew.-% beträgt und die durch Aufbrechen von Triglycerid-haltigen, mikrobiellen Zellen, wobei die Zellen in Wasser dispergiert sind, und anschließender Entwässerung erzielt werden.

4. Triglycerid-haltige, trockene Zellfragmente, bei denen die Abnahme des Gehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsäuren nach einer Hitzebehandlung bei 150ºC für 2 Minuten nicht mehr als 10 Gew.-% beträgt.

5. Futterzusammensetzung, welche die Zellfragmente nach Anspruch 4 enthält.

6. Futterzusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Zellfragmente in einem Anteil von 0,001 bis 100 Gew.-% vorliegen,

7. Verfahren zur Rückgewinnung von Triglyceriden aus Triglycerid-haltigen, mikrobiellen Zellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Triglycerid-haltige, mikrobielle Zellen aufgebrochen, wobei die Zellen in Wasser dispergiert sind, und anschließend entwässert und mit einem Lösungsmittel extrahiert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Extraktion mit einem Lösungsmittel in einer Säule durchgeführt wird, wo die aufgebrochenen und entwässerten Zellfragmente in Kontakt mit dem Lösungsmittel gebracht werden.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Lösungsmittel n-Hexan ist