DE69426879T2

DE69426879T2 - Plasma-artige lösung

Info

Publication number: DE69426879T2
Application number: DE69426879T
Authority: DE
Inventors: E. Segall; M. Segall; Hal Sternberg; D. Waitz
Original assignee: Biotime Inc
Current assignee: Lineage Cell Therapeutics Inc
Priority date: 1993-06-04
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 2001-10-18
Anticipated expiration: 2014-06-04
Also published as: CA2164321A1; DK0701455T3; CN1102851C; KR100267604B1; US5733894A; WO1994028950A1; US5723281A; US6080538A; EP0701455B1; HK1010698A1; US20020009783A1; US20020012957A1; RU2142282C1; US5613944A; JP3715312B2; US6387612B1; US6406839B1; US5968726A; EP0701455A4; US5747071A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der wässrigen Lösungen wie plasmaartige Lösungen, die verwendet werden, um ein Lebewesen, das einer Perfusion bedarf, zu perfundieren, und die als effektiver Blutersatz wirken. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Bewahrung der biologischen Unversehrtheit der Organe eines Säugerspenderorganismus (wie es durch die überlegene anatomische Unversehrtheit kältekonservierter Organe und Gewebe von Lebewesen deutlich wird, die mit der erfindungsgemäßen Lösung perfundiert worden sind) und Verfahren zur Aufrechterhaltung eines Lebewesens mit teilweisem oder im Wesentlichen vollständigen Blutverlust bei Temperaturen, die wesentlich unterhalb der normalerweise von einem Säuger aufrechterhaltenen Temperatur liegt.
Es sind zwei klinisch angewandte Konservierungsverfahren für Organe bekannt: (1) anfängliche Perfusion für etwa 5 min mit anschließender Lagerung in der Kälte (2ºC) und (2) kontinuierliche Perfusion unter Verwendung von Lösungen, die Albumin oder Plasma enthalten.
Viele der für die anfängliche Perfusion mit anschließender Lagerung in der Kälte verwendeten Lösungen beruhen auf den Lösungen von Collins et al., Lancet 2, 1219 (1969) und Sacks et al., Lancet 1, 1024 (1973). Ross et al., Transplantation 21, 498 (1976) verglichen die Konservierung von Kaninchennieren nach dem Spülen und der Lagerung für 72 Stunden in verschiedenen Lösungen. Es wurde gefunden, dass lediglich Nieren, die in einer hypertonischen Zitrat-(HC)-Lösung (umfassend u. a. 80 mM K&spplus;, 55 mM Zitrat, 400 mOsmol/kg, pH 7,1) nach 72 Stunden überlebt hatten. Die Lösungen von Collins und Sacks enthielten u. a. 115-126 mM K&spplus;, 290-430 mOsmol/kg, pH 7,0-7,3. Wall et al., Transplantation 23, 210 (1977) berichten über die hypothermale Konservierung menschlicher Lebern bis zu etwa 4 Stunden in einer Lösung, die u. a. 250 mg Dextrose und 15 mÄqu. Kaliumphosphat umfasst. Bishop und Ross, Transplantation 25, 235 (1978) berichteten, dass die Nierenfunktion im Vergleich zu vielen anderen verfügbaren Lösungen am besten in der HC-Lösung von Ross et al., supra (1976) bewahrt wurde. Fischer et al., Transplantation 39, 122 (1985) fanden, dass eine neue Konservierungslösung für die hypothermale ischämische Lagerung (umfassend u. a. 110 mM Na&spplus;, 115 mM K&spplus;, 400 mOsm/kg, Lösungsmittel D&sub2;O, 110 mM HEPES) anderen klinisch verwendeten Lösungen überlegen war, einschließlich der Lösungen von Collins, Sacks und HC.
Bezüglich der für die kontinuierliche Organperfusion verwendeten Lösungen berichteten Belzer et al., Transplantation 39, 118 (1985) über eine neu entwickelte Lösung, welche die Nierenfunktion bewahrte, wenn Nieren 48 Stunden perfundiert und 24 Stunden gelagert wurden (umfassen u. a. 80 mM Natriumgluconat, 22 mÄqu./l K&spplus;, 128 mÄqu./l Na&spplus;, 4,9 mM Adenosin, 10 mM HEPES, 3,0 mM Glutathion, 3,75 g% Albumin, pH 7,45). Kallerhoff et al., Transplantation 39, 485 (1985) untersuchten die Auswirkung der Temperatur auf den pH- Wert von Organen, die kontinuierlich mit zwei verschiedenen Lösungen perfundiert wurden (Euro-Collins: 10 mM Na&spplus;, 115 mM K&spplus;, 198 mM Glucose, 406 mOsm/l, pH 7,2 bei 20ºC; HTK: 15 mM Na&spplus;, 10 mM K&spplus;, 2,0 mM Tryptophan, 180 mM Histidin, 30 mM Mannitol, 310 mOsm/l, pH 7,3 bei 8ºC). Bei Inkubationstemperaturen zwischen 5ºC und 35ºC blieb der pH-Wert der HTK-Lösung durchweg bei höheren Werten als der pH-Wert der Euro-Collins- Lösung.
Klebanoff und Phillips, Cryobiology 6, 121 (1969) beschreiben die hypothermale blutlose Perfusion von Hunden, die mit gepuffertem Lactat nach Ringer bei 7,1 bis 16ºC perfundiert worden sind. Segall et al. (US-PS 4,923,442) beschreiben einen Blutersatz, der ein Lebewesen und dessen Organe bei Temperaturen von unterhalb 20ºC aufrechterhalten kann. Dieser Blutersatz weist vier verschiedene Lösungen auf: eine Basislösung, eine Kardioplegie-induzierende Lösung, eine Kardioplegie-aufrechterhaltende Lösung und eine Wiederherstellungslösung. Die Basislösung enthält Elektrolyte in physiologischen Konzentrationen, ein makromolekulares onkotisches Mittel, einen herkömmlichen biologischen Puffer, der bei physiologischem pH-Wert wirksam ist, Zucker und K&spplus; in einem Bereich von 4-5 mÄqu. Die Kardioplegie-induzierende Lösung wies eine K&spplus;-Konzentration von 25-45 mÄqu. auf, die Kardioplegie-erhaltende Lösung hatte eine K&spplus;-Konzentration von 15-45 mÄqu und die Wiederherstellungslösung hatte eine K&spplus;-Konzentration von 6-10 mÄqu. Segall et al. (US-PS 5,130,230) beschrieben ferner dieses System mit vier Lösungen, wobei die Wiederherstellungslösung 0-10 mAqu. K&spplus; enthielt.
Die WO-A-92/18136 beschreibt einzelne Perfusionslösungen, die keine Kaliumionen, aber einen herkömmlichen biologischen Puffer enthalten.
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung einer einzelnen Lösung, die geeignet ist, um ein Lebewesen mit teilweisem oder vollständigem Blutverlust bei normalen Temperaturen oder Temperaturen am Leben zu halten, die wesentlich unter den normalerweise von einem Säuger aufrechterhaltenen Temperaturen liegen, und zwar im Allgemeinen weniger als 37-38ºC und mehr als -2ºC, wobei die Lösung subphysiologische und/oder physiologische Konzentrationen von K&spplus; und Mg²&spplus;, physiologische Konzentrationen von Na&spplus;, Ca²&spplus;, Cl&supmin;, ein makromolekulares onkotisches Mittel, eine organische Carbonsäure oder ein Salz davon und einen Zucker umfasst.
Die erfindungsgemäße Lösung kann als Plasmaextender bei normaler Körpertemperatur verwendet werden. Die erfindungsgemäße Lösung ist auch geeignet, das Leben oder die biologische Unversehrtheit eines perfundierten Lebewesens und/oder dessen Organe während und nach dem Aussetzen gegenüber stark hypothermalen Bedingungen aufrechtzuerhalten. Die Lösung kann auch verwendet werden, um ein euthermes Lebewesen in einer mit Druck beaufschlagten Umgebung mit erhöhter Sauerstoffkonzentration von bis zu 100% O&sub2; für einen ausreichenden Zeitraum aufrechtzuerhalten, um eine angemessene Wiederherstellung der Blutkomponenten des Lebewesens zuzulassen.
Die erfindungsgemäße Lösung kann verwendet werden, um einen Säuger zu perfundieren und auf Temperaturen abzukühlen, die wesentlich unter der normalen Temperatur des Lebewesens liegen. Die Lösung kann verwendet werden, um das Lebewesen für einen langen Zeitraum unter starker Hypothermie zu halten, gewöhnlich länger als eine Stunde, wovon sich ein intaktes Lebewesen ohne sichtbare, dauerhafte Krankheitseffekte erholen kann.
Ein deutlicher Unterschied der erfindungsgemäßen Lösung ist, dass dafür nicht mehrere Lösungen erforderlich sind, um sie an ein Lebewesen zum Zwecke des Blutersatzes effektiv zu verabreichen oder dass ein Säuger auch nicht bei niedrigen Temperaturen gehalten werden muss. Die erfindungsgemäße Lösung kann in allen Phasen der Plasmaextension oder des Blutersatzes eingesetzt werden.
Ein weiterer wichtiger Unterschied der erfindungsgemäßen Lösung ist das Merkmal einer subphysiologischen K&spplus;-Menge bei allen Verabreichungsschritten. Dieses Erfordernis verringert das Risiko einer Hyperkaliämie-induzierten Herzinsuffizienz, die bei der Blutübertragung in Primaten und Menschen auftritt.
Ein weiterer wichtiger Unterschied der erfindungsgemäßen Lösung ist die Abwesenheit eines üblichen biologischen Puffers. Die Abwesenheit eines üblichen biologischen Puffers in der Lösung führt zu dem wichtigen medizinischen Vorteil, dass die Lösung am Ende hitzesterilisiert werden kann, ohne dass die Komponenten der Lösung abgebaut werden.
Die erfindungsgemäße Lösung erfordert die Gegenwart einer organischen Carbonsäure, eines Salzes oder eines kurzkettigen Esters davon. Die organische Carbonsäure, das Salz oder der Ester davon ist eine Komponente eines dynamischen Puffersystems der Lösung, das bei dem Gebrauch in einem Säuger einen biologisch geeigneten pH-Wert aufrechterhalten kann.
Die erfindungsgemäße Lösung erfordert die Gegenwart eines makromolekularen onkotischen Mittels, das ausreichend ist, um einen physiologischen osmotischen Druck aufrechtzuerhalten. Das (Die) in der erfindungsgemäßen Lösung verwendete(n) makromolekulare(n) onkotische(n) Mittel kann (können) ein Protein(e) oder Stärke(n) sein.
Ein Vorteil der Lösung ist, dass sie in einem Säuger während aller Phasen des Blutzersatzes vom anfänglichen Auswaschen des Blutes des Lebewesens bis zu dem vollständigen Ersatz des gesamten oder im Wesentlichen des gesamten zirkulierenden Blutes eingesetzt werden kann.
Ein Merkmal der Erfindung ist, dass sie einen Säuger ohne Blut und auch während der Reperfusion mit Blut aufrechterhalten kann.
Es soll beachtet werden, dass die hier und in den beigefügten Patentansprüchen verwendeten Singularformen "ein", "eine" und "der, die, das" auch die Pluralformen umfassen, falls sich aus dem Zusammenhang nicht ein anderes ergibt. Folglich umfasst beispielsweise die Bezugnahme auf "eine Formulierung" Gemische verschiedener Formulierungen und die Bezugnahme auf "das Behandlungsverfahren" die Bezugnahme auf dem Fachmann bekannte äquivalente Schritte und Verfahren, usw.
Falls nicht auf andere Weise definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die dem Fachmann auf dem für diese Erfindung einschlägigen Fachgebiet geläufigen Bedeutungen. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die den hier beschriebenen entsprechen oder zu ihnen äquivalent sind, bei der Ausführung oder dem Testen der Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben.
Rote Blutzellen von Primaten enthalten hohe Konzentrationen an Kaliumionen (K+). Wenn Primatenblut gelagert wird (wie es bei nahezu dem gesamten von Blutbanken erhaltenen Blut der Fall ist) führen selbst niedrige Lysegrade der roten Blutzellen im Allgemeinen zu hohen Kaliumionenkonzentrationen. Dies ist auf die Freisetzung von Kaliumionen vom Inneren der aufgelösten roten Blutzellen in das die Zellen umgebende Plasma zurückzuführen. Demgemäß wird das Blut bei der Infusion hyperkaliämisch sein. Die erhöhte Kaliumkonzentration kann vermindert werden, wenn Blut in Patienten mit ausreichend zirkulierendem Blut infundiert wird, da die hohe Kaliumionenkonzentration verdünnt wird. Das Problem verstärkt sich jedoch, wenn Primatenblut in eine Lösung zur Aufrechterhaltung mit hohen Kaliumkonzentrationen, wie sie in der US-PS 4,923,442 beschrieben ist, übertragen wird. Die Kaliumionenkonzentration in dem übertragenen Blut wird nicht auf sichere Konzentrationen verdünnt werden. Als Ergebnis kann eine Herzinsuffizienz auftreten, was häufig auch der Fall sein ist. Hyperkaliämie tritt auch zusammen mit Gewebeschäden auf, die von Verbrennungen, Unfällen, der Chirugie, der Chemotherapie und anderen physischen Traumata stammen. Der Stand der Technik lehrt, dass die Organkonservierung bei niedrigen Temperaturen zur Aufrechterhaltung eines unversehrten Gewebes die Gegenwart hoher Kaliumionenkonzentrationen erfordert.
Die erfindungsgemäße Lösung enthält eine subphysiologische Kaliummenge. Demgemäß kann die Kaliumionenkonzentration in gelagertem Transfusionsblut durch die Lösung verringert werden. Als Ergebnis können dadurch verursachte potenzielle Herzarrhythmien und Herzinsuffizienz einfacher kontrolliert werden. Die eine subphysiologische Kaliummenge enthaltende Lösung kann auch zum Zwecke des Blutersatzes und der Aufrechterhaltung eines Lebewesens bei niedriger Temperatur verwendet werden. Mit "subphysiologischer Kaliummenge" sind 0 bis 5 mÄqu./l K&spplus; (0 bis 5 mM), vorzugsweise sind 2 bis 3 mÄqu./l K&spplus; (2 bis 3 mM) gemeint.
Die erfindungsgemäße Lösung umfasst ein Gemisch von Materialien, das zur Perfusion eines Lebewesens, welches der Perfusion bedarf, verwendet werden kann, wenn es als wässrige Lösung eingesetzt wird. Während die Materialien als trockenes Gemisch bereitgestellt werden können, dem vor der Hitzesterilisation Wasser zugesetzt wird, wird die Lösung vorzugsweise in Form einer sterilen wässrigen Lösung bereitgestellt.
Die erfindungsgemäße Lösung kann als Einzellösung für alle Phasen des Verfahrens eingesetzt werden, bei dem das Blut eines Lebewesens entfernt und ersetzt wird oder bei der ein Lebewesen gekühlt wird. Derartige Phasen umfassen die Blutverdünnung oder Plasmaextension bei normalen Körpertemperaturen, den Blutersatz und -austausch bei hypothermalen Körpertemperaturen, den Blutersatz bei im Wesentlichen hypothermalen Körpertemperaturen und das Wärmen eines Lebewesens. "Hypothermale Körpertemperaturen" sind als Temperaturen von 4 bis 5ºC unterhalb der normalen Körpertemperatur von 37 bis 38ºC definiert. Mit anderen Worten kann ein hypothermaler Zustand so betrachtet werden, dass er bei Körpertemperaturen von etwa 32 bis 35ºC beginnt. "Im Wesentlichen hypothermale Körpertemperaturen" sind als Körpertemperaturen definiert, die gerade unterhalb des Gefrierpunktes (-2ºC) bis etwa 10ºC liegen. Daher umfasst der Begriff "hypothermale Körpertemperatur" oder "Hypothermie", wie er hier verwendet wird, Körpertemperaturen von etwa -2 bis 3ºC bis etwa 32 bis 35ºC.
Die erfindungsgemäße Lösung umfasst keinen üblichen biologischen Puffer. "Üblicher Puffer" steht für eine Verbindung, die in Lösung in vitro den pH-Wert in einem bestimmten Bereich hält. "Üblicher biologischer Puffer" steht für eine Verbindung, die den pH-Wert in einem zellfreien System im biologischen Bereich von 7 bis 8 hält. Beispiele für übliche biologische Puffer umfassen N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-hydroxypropansulfonsäure (HEPES), 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure (MOPS), 2-([Hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]amino)ethansulfonsäure (TES), 3-[N-Tris(hydroxymethyl)methylamino]-2- hydroxyethyl]-1-piperazinpropansulfonsäure (EPPS), Tris[hydroxylmethyl]aminomethan (THAM) und Tris[hydroxylmethyl]methylaminomethan (TRIS). Übliche biologische Puffer wirken unabhängig von normalen biologischen Prozessen. Beispielsweise werden übliche Puffer in vivo nicht metabolisiert und wirken am stärksten in zellfreien Systemen.
Bei der erfindungsgemäßen Lösung werden normale biologische Komponenten eingesetzt, um in vivo den biologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten, ein Konzept, das als "dynamisches Puffersystem" bezeichnet wird. Das Konzept des dynamischen Puffersystems beruht auf der Erkenntnis der Erfinder, dass Verbindungen ohne intrinsische Pufferkapazität im biologischen Bereich wie Lactat, welches in vivo metabolisiert werden kann, mit anderen Lösungskomponenten zusammenwirken, um einen biologisch geeigneten pH-Wert in einem Tier aufrechtzuerhalten, und zwar selbst bei hypothermalen Temperaturen und bei im Wesentlichen blutlosen Bedingungen. Das erfindungsgemäße dynamische Puffersystem hängt teilweise von der Oxygenierung und der Entfernung von Kohlendioxid (CO&sub2;) ab und lässt zusätzliches Hydrogencarbonat (NaHCO&sub3;) zu, wobei dieses jedoch nicht erforderlich ist. Der erfindungsgemäße dynamische Puffer kann außerhalb eines biologischen Systems nicht oder im Wesentlichen nicht als Puffer wirken, d. h. ein dynamischer Puffer hält den pH- Wert in vivo aufrecht, jedoch nicht in einer zellfreien Umgebung. Eine Komponente des erfindungsgemäßen dynamischen Puffersystems umfasst eine Carbonsäure, ein Salz oder einen Ester davon. Carbonsäure, Salz oder Ester davon bedeutet eine Verbindung der allgemeinen Strukturformel RCOOX, worin R eine Alkyl-, Alkenyl- oder Arylgruppe ist, verzweigt oder geradkettig, die 1 bis 30 Kohlenstoffatome enthält, welche substituiert sein können, und vorzugsweise eine der Kohlenstoffketten von Lactat, Acetat, Citrat, Pyruvat oder anderer biologischer Metaboliten ist und worin X ein Proton oder ein Natriumion oder ein anderer biologisch verträglicher ionischer Substituent ist, der an der Sauerstoffposition binden kann, oder eine kurze geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, z. B. -CH&sub3;, -CH&sub2;CH&sub3;.
Wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, weist eine typische übliche Pufferlösung (25 mM TRIS) einen anfänglichen pH-Wert von etwa 7,7 auf und hält bei der Zugabe von bis zu 0,12 ml einer 1,25 M HCl-Lösung einen pH-Wert von über 7,2 aufrecht. Im Gegensatz dazu fällt der pH- Wert einer HLB-Lösung (anfänglicher pH-Wert 7,7) bei der Zugabe von etwa 0,01 ml einer 1,25 M HCl-Lösung auf unter 7,2.
Wenn die erfindungsgemäße Lösung als Blutersatz bei hypothermalen Temperaturen verwendet wird, wird der erhitzten sterilisierten Lösung (HL-Lösung) medizinisches steriles NaHCO&sub3; zugesetzt. Die NaHCO&sub3;-enthaltende Lösung wird als HLB-Lösung bezeichnet. Die Pufferkapazität der HLB-Lösung relativ zu einem üblichen biologischen Puffer in einem zellfreien System ist in Tabelle 1 gezeigt. Unter in vivo-Bedingungen mit Oxygenierung zeigt sich, dass die HLB-Lösung den pH-Wert bei Temperaturen im Bereich von 1,6 bis 36,1ºC über 7,3 hält (Tabellen 2 und 3).
Wenn die erfindungsgemäße Lösung als Plasmaextender bei normalen Körpertemperaturen verwendet wird, dann wird der in vivo-pH-Wert ohne die Zugabe von NaHCO&sub3; im biologischen Bereich gehalten.
Die Abwesenheit eines üblichen biologischen Puffers in der erfindungsgemäßen Lösung führt zu dem wichtigen medizinischen Vorteil, dass die Lösung hitzeendsterilisiert werden kann. Im Allgemeinen ist es bevorzugt, dass medizinische Lösungen vor dem Gebrauch in einem Patienten hitzeendsterilisiert werden. Der Begriff "hitzeendsterilisiert" oder "hitzesterilisiert", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf das Verfahren, welches das Erhitzen einer Lösung 15 min unter Druck auf 120ºC umfasst, d. h. das Aufrechterhalten von Hitze- und Druckbedingungen für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um alle oder im Wesentlichen alle Bakterien in der Lösung abzutöten und um alle oder im Wesentlichen alle Viren in der Lösung zu inaktivieren. Dieses Verfahren wird normalerweise in einem Autoklaven durchgeführt und ist auch als "Autoklavieren" bekannt. Der Zweck der Hitzesterilisierung ist, möglicherweise in der Lösung vorliegende infektiöse Krankheitserreger abzutöten. Es ist bekannt, dass infektiöse Krankheitserreger Temperaturen von bis zu 100ºC tolerieren. Auf diesem Fachgebiet wird im Allgemeinen angenommen, dass ein Erhitzen einer Lösung unter Druck auf 120ºC für etwa 15 min ausreichend ist, um die Sterilität sicherzustellen.
Alle Transplantations- oder Blutersatzlösungen, die den Erfindern bekannt sind, tolerieren keine Hitzeendsterilisierung. Es ist bekannt, dass die Hitzesterilisierung einer Lösung mit einem pH-Wert von über 7,0 zu einem wesentlichen Abbau anderer Lösungskomponenten führt.
Im Gegensatz dazu ist die erfindungsgemäße Lösung so aufgebaut, dass sie bei einem minimalen Abbau anderer Lösungskomponenten wie Zucker hitzesterilisierbar ist. Die HL- Lösung wird vor dem Gebrauch hitzesterilisiert. Wenn es erwünscht ist, NaHCO&sub3; unter Bildung einer HLB-Lösung zuzusetzen, wird NaHCO&sub3; als käuflich erhältliche sterile 1 M- Lösung einer sterilen HL-Lösung zugesetzt. Im Allgemeinen werden 5 ml einer 1 M NaHCO&sub3;- Lösung pro Liter HL-Lösung zugesetzt, um 1 l einer HLB-Lösung zu bilden. Es kann jedoch auch mehr NaHCO&sub3; zugesetzt werden.
Die erfindungsgemäße HLB-Lösung oder deren organische Puffersäuren und -salze können auch verwendet werden, um kultivierte Gewebe und Zellen in vitro aufrechtzuerhalten. Das dynamische Puffersystem der Lösung hält kultivierte Gewebe und Zellen bei dem zweckmäßigen biologischen pH-Wert. Wir haben gezeigt, dass die Zugabe von Lactat und Hydrogencarbonat zu kultivierten Zellen ausreichend ist, um ein normales Zellwachstum und eine normale Zellmorphologie aufrechtzuerhalten.
Die erfindungsgemäße Lösung umfasst eine organische Carbonsäure oder ein Salz davon. Der Ausdruck "organische Carbonsäure oder ein Salz davon" umfasst jegliche Carbonsäure oder jegliches Carbonsäurederivat, die/das von einem Säuger metabolisiert werden kann. Beispiele für Carbonsäuren und Carbonsäuresalze, die zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Lösung geeignet sind, umfassen Lactat und Natriumlactat, Citrat und Natriumcitrat, Gluconat und Natriumgluconat, Pyruvat und Natriumpyruvat, Succinat und Natriumsuccinat sowie Acetat und Natriumacetat. In den nachstehenden Beispielen, welche die Verwendung einer HLB-Lösung beschreiben, wird Natriumlactat verwendet. Wenn es in vivo metabolisiert wird, unterstützt das Lactat bei der Aufrechterhaltung der Hydrogencarbonatkonzentrationen und wirkt dadurch als Komponente des dynamischen Puffersystems der Lösung, um einen biologischen in vivo-pH-Wert aufrechtzuerhalten.
Um die Erfindung weiter zu erläutern, wird das erfindungsgemäße Gemisch in Form einer wässrigen Lösung diskutiert. Es wird erwartet, dass der Fachmann durch die nachstehende Beschreibung der Erfindung in die Lage versetzt wird, das Gemisch als trockenes Gemisch bereitzustellen und die Anpassungen der Mengen von Natriumchlorid und organischen Natriumsalzen je nach Bedarf vorzunehmen, um die Natriumchloridmengen aufzunehmen, die in normaler physiologischer Kochsalzlösung vorliegen, welche als Verdünnungsmittel für das erfindungsgemäße trockene Gemisch verwendet werden kann.
Die Menge an organischen Natriumsalzen wird so berechnet, dass die im Blut des Lebewesens vorliegende Natriumionenkonzentration sowie die Natriumchloridkonzentration einer beliebigen Lösung, der die trockenen Komponenten zugesetzt werden, berücksichtigt werden. Es wird eine derartige Menge zugesetzt, dass die von dem organischen Natriumsalz stammende Natriumionenkonzentration ausreichend ist, um die Natriumionenkonzentration in der Lösung auf einen Wert zu bringen, der etwa dem des physiologisch normalen Plasmas entspricht. Wenn daher die Menge oder die Konzentration der von dem organischen Natriumsalz und Natriumchlorid erhaltenen Natriumionen berücksichtigt wird, entspricht die Natriumionenkonzentration in der Lösung etwa der Natriumionenkonzentration, wie sie in physiologisch normalem Plasma gefunden wird.
Die Lösung umfasst auch eine Calcium-, Natrium- und Magnesiumionenkonzentration, die innerhalb des Bereichs normaler physiologischer Konzentrationen dieser Ionen im Plasma liegt. Im Allgemeinen wird die gewünschte Konzentration dieser Ionen von den gelösten Chloridsalzen von Calcium, Natrium und Magnesium und im Fall des Natriums von einem gelösten organischen Natriumsalz erhalten, das ebenfalls in Lösung vorliegt.
Die Natriumionenkonzentration liegt vorzugsweise in einem Bereich von 70 mM bis etwa 160 mM und mehr bevorzugt in einem Bereich von etwa 130 bis 150 mM.
Die Calciumionenkonzentration liegt in einem Bereich von etwa 0,5 mM bis 4,0 mM und vorzugsweise in einem Bereich von etwa 2,0 bis 2,5 mM.
Die Magnesiumionenkonzentration liegt in einem Bereich von 0 bis 10 mM und vorzugsweise in einem Bereich von etwa 0,3 bis 0,45 mM. Es ist wichtig, dass in die erfindungsgemäße Lösung keine überschüssigen Mengen an Magnesiumionen eingebracht werden, da hohe Magnesiumionenkonzentrationen die Stärke der Kontraktionsaktivität des Herzens negativ beeinflussen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Lösung subphysiologische Mengen von Mg²&spplus;.
Die Chloridionenkonzentration liegt in einem Bereich von 70 mM bis 160 mM und vorzugsweise in einem Bereich von 110 bis 125 mM Cl&supmin;.
Die Lösung umfasst auch eine Menge eines einfachen Hexosezuckers wie z. B. Glucose, Fructose und Galactose, wobei Glucose bevorzugt ist. In der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Hexose-Nährzucker verwendet und es kann auch ein Zuckergemisch verwendet werden. Im Allgemeinen liegt die Zuckerkonzentration in einem Bereich zwischen 2 mM und 10 mM, wobei Glucosekonzentrationen von 5 mM bevorzugt sind. Manchmal ist es erwünscht, die Konzentration des Hexose-Zuckers zu erhöhen, um die Flüssigkeitsretention in den Geweben eines Lebewesens abzusenken. Folglich kann der Konzentrationsbereich des Hexose-Zuckers gegebenenfalls bis etwa 50 mM ausgedehnt werden, um bei dem behandelten Lebewesen Ödeme zu begrenzen oder zu verhindern.
Das onkotische Mittel umfasst Moleküle, deren Größe ausreichend ist, um deren Austreten aus dem Kreislauf durch Durchqueren der Fenestrierungen des Kapillarbetts in das Interstitium Körpergewebe zu verhindern. Ein Beispiel für onkotische Mittel ist die Gruppe der Plasmaexpander.
Menschliches Serumalbumin ist ein Blutplasmaprotein, das zur Vergrößerung des Plasmavolumens verwendet wird. Es sind auch Polysaccharide bekannt, die im Allgemeinen als Glucanpolymere charakterisiert werden und als Blutplasmaexpander verwendet werden. Im Allgemeinen ist es bevorzugt, dass das Polysaccharid nicht-antigen ist.
Hetastärke (McGaw, Inc.) ist ein künstliches Kolloid, das von einer wachsartigen Stärke abgeleitet ist, die nahezu vollständig aus Amylopectin zusammengesetzt ist, wobei Hydroxylethergruppen in die alpha-1,4-verbundenen Glucoseeinheiten eingebaut sind. Die Kolloideigenschaften einer 6%igen Lösung (w/w) von Hetastärke kommen denjenigen von menschlichem Serumalbumin nahe. Andere Polysaccharidderivate können als onkotische Mittel in den erfindungsgemäßen Lösungen geeignet sein, einschließlich Hydroxymethylalpha-1,4- oder-1,6-Polymere. Cyclodextrine sind geeignete onkotische Mittel.
D-Glucosepolymere können verwendet werden. Beispielsweise kann Dextran, das vorwiegend mit alpha-1,6-Bindungen verbundene D-Glucose ist, in der erfindungsgemäßen Lösung als onkotisches Mittel verwendet werden. Polysaccharide wie Dextran mit einem Molekulargewichtsbereich von 30000 bis 50000 Dalton (D) sind bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt ist Dextran 40 mit einem Molekulargewicht von etwa 40000 D.
Polysaccharide mit hohem Molekulargewicht wie Dextran 70 mit einem Molekulargewicht von etwa 70000 D sind im Allgemeinen weniger bevorzugt, da sie die Viskosität der kolloidalen Lösung erhöhen und dadurch hohe Fließgeschwindigkeiten beeinträchtigen. Bei manchen Anwendungen sind Lösungen von Dextran mit hohem Molekulargewicht jedoch dahingehend bevorzugt, dass sie aufgrund ihrer geringeren Austrittsgeschwindigkeiten aus Kapillaren bei der Vermeidung des Anschwellens von Gewebe wirksamer sind. Folglich sind solche Lösungen von Dextran mit hohem Molekulargewicht besonders zur Behandlung von zerebraler Ischämie bei hyperbaren Sauerstoffspannungen und bei der effektiven Behandlung von Zerebralödem geeignet. Unter solchen Umständen kann es erwünscht sein, Polysaccharide mit höherem Molekulargewicht wie Dextran in einem Molekulargewichtsbereich von 50000 bis 70000 D zu verwenden.
Wenn Dextran 40 in den erfindungsgemäßen Lösungen verwendet wird, werden etwa 8% Dextran 40 (w/w) oder etwa 80 Gramm (g) pro Liter (l) Wasser eingesetzt. Die Molarität des erfindungsgemäßen Blutersatzes wird in einem Bereich von etwa 290 bis 330 mM liegen, wobei etwa 300 mM bevorzugt ist. Ganz besonders bevorzugt ist eine Endmolarität von etwa 298 mM.
Die Konzentration des Polysaccharids ist ausreichend, um (wenn es zusammen mit den vorstehend diskutierten Chloridsalzen von Natrium, Calcium und Magnesium, den organischen Ionen des organischen Natriumsalzes und des Hexose-Zuckers eingesetzt wird) einen osmotischen Druck des Kolloids zu erreichen, der den osmotischen Druck von normalem menschlichen Serum von etwa 3,7 kPa (28 mm Hg) erreicht.
Die Lösung kann als zirkulierende Lösung in Verbindung mit Sauerstoff oder hyperbarem Sauerstoff bei normalen Körpertemperaturen oder mit oder ohne hyperbarem Sauerstoff in Lebewesen während deren Behandlung verwendet werden. Die Lösung kann auch als zirkulierende Lösung in Lebewesen während der Behandlung verwendet werden, wenn die Körpertemperatur des Lebewesens signifikant unterhalb dessen normaler Temperatur abgesenkt ist. Wenn warmblütige Lebewesen während einer chirurgischen Behandlung niedrigen Temperaturen ausgesetzt sind und bei der Organspende von Leichen bei niedrigen Temperaturen, ist es im Allgemeinen erwünscht, das Blut des Lebewesens durch die kalte zirkulierende Lösung der Erfindung zu ersetzen oder die Lösung für eine gewisse Zeit im Kreislauf zu belassen, um das Lebewesen und dessen Organe während der Behandlung zu perfundieren und intakt zu halten.
Die erfindungsgemäße Lösung kann intravenös oder intraarteriell an ein euthermes Lebewesen verabreicht werden, das sich in einer mit Druck beaufschlagten Atmosphäre mit erhöhter Sauerstoffkonzentration von bis zu 100% Sauerstoff befindet, oder an ein Lebewesen, das behandelt wird, wobei die Körpertemperatur des Lebewesens während der Behandlung signifikant unter die normale Temperatur des Lebewesens abgesenkt wird, gleich ob hyperbarer Sauerstoff eingesetzt wird oder nicht. Während die Lösung an das Lebewesen verabreicht wird und durch das Lebewesen im Kreislauf geführt wird, können verschiedene Mittel wie kardioplege Mittel entweder direkt in das Kreislaufsystem des Lebewesens, direkt an das Myokard des Lebewesens verabreicht werden oder der zirkulierenden Lösung der Erfindung zugesetzt werden. Diese Komponenten werden zugesetzt, um gewünschte physiologische Wirkungen zu erzielen, wie z. B. die Aufrechterhaltung einer regelmäßigen Kontraktionsaktivität des Herzens, das Stoppen von Herzflimmern oder die vollständige Hemmung der Kontraktionsaktivität des Myokards oder Herzmuskels.
Kardioplege Mittel sind Materialien, welche die Beendigung der Myokardkontraktion verursachen und umfassen Anästhetika wie Lidocain, Procain und Novocain und monovalente Kationen wie Kaliumionen in Konzentrationen, die ausreichend sind, um die Hemmung der Myokardkontraktion zu erreichen. Kaliumionen-Konzentrationen, die zum Erreichen dieser Wirkung ausreichend sind, liegen im Allgemeinen über 15 mM.
Während der Wiederbelebung eines Lebewesens (nach einem Zeitraum bei einer Temperatur unterhalb des normalen Werts oder einem unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lösung hervorgerufenen Kältezustands zur Aufrechterhaltung des Lebewesens) kann das Lebewesen mit einem Gemisch der erfindungsgemäßen Lösung zusammen mit Blut, das von dem Lebewesen stammt oder von Blutspendern erhalten worden ist, reinfundiert werden. Wenn das Lebewesen aufgewärmt ist, wird solange Vollblut infundiert, bis das Lebewesen einen akzeptablen Hämatokrit-Wert erreicht, im Allgemeinen Hämatokrit-Werte von mehr als etwa 30%. Wenn ein akzeptabler Hämatokrit-Wert erreicht worden ist, wird die Perfusion unterbrochen und das Lebewesen nach Verschluss der chirurgischen Wunden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wiederbelebt.
Im Allgemeinen wird die erfindungsgemäße Lösung unter Verwendung einer intravenösen Leitung (wenn sich das Lebewesen bei normaler Temperatur befindet) oder an ein gekühltes Lebewesen unter Verwendung einer Pumpumwälzvorrichtung wie einer Zentrifugalpumpe, einer Walzenpumpe, einer peristaltischen Pumpe oder einer anderen bekannten und verfügbaren Umwälzpumpe verabreicht. Die Umwälzvorrichtung ist mit dem Lebewesen über eine Kanüle verbunden, die chirurgisch in geeignete Venen und Arterien eingebracht worden ist. Wenn die Lösung an ein gekühltes Lebewesen verabreicht wird, wird sie im Allgemeinen über eine Arterienkanüle verabreicht und aus dem Lebewesen über eine Venenkanüle entfernt und entsorgt oder gelagert.
Die Lösung kann in einer Vielzahl von chirurgischen Situationen und Verfahren eingesetzt werden. Sie kann bei heiklen neurochirurgischen Eingriffen nützlich sein, bei denen klare chirurgische Gebiete unerläßlich sind und eine verringerte Aktivität des zentralen Nervensystems erwünscht sein kann, was durch Ausführen des Verfahrens an einem Patienten erreicht werden kann, dessen Kerntemperatur und/oder Zerebraltemperatur wesentliche verringert worden ist.
Die Lösung kann verwendet werden, um ein Lebewesen (das eine signifikante Blutmenge verloren hat, z. B. 20% bis 98% des Blutes) bei normalen Körpertemperaturen in einer mit Druck beaufschlagten Umgebung bei erhöhter Sauerstoffkonzentration über atmosphärischer Sauerstoffspannung bis zu 100% Sauerstoff aufrechtzuerhalten. Das Lebewesen wird in einer hohen Sauerstoffkonzentration gehalten, bis vom Lebewesen genügend Blutkomponenten synthetisiert werden können, um ein Leben bei atmosphärischem Druck und atmosphärischer Sauerstoffkonzentration zu ermöglichen. Die erfindungsgemäße Lösung kann verwendet werden, um ein Lebewesen bei Temperaturen aufrechtzuerhalten, die unter der normalen Körpertemperatur liegen und bei einer verringerten Metabolismusgeschwindigkeit nach einer traumatischen lebensbedrohlichen Verletzung, bis geeignete Unterstützungsmaßnahmen oder korrigierende chirurgische Verfahren durchgeführt werden können. Darüber hinaus kann die Lösung dazu verwendet werden, einen Patienten aufrechtzuerhalten, der einen seltenen Blut- oder Gewebetyp aufweist, bis ein geeigneter und passender Spender gefunden werden kann und Blutersatzeinheiten oder ein anderes Organ erhalten werden können.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass es möglich ist, im Wesentlichen das gesamte zirkulierende Blut eines Säugers durch die erfindungsgemäße Lösung zu ersetzen und das Lebewesen am Leben zu halten, ohne Blut in das Lebewesen zu reinfundieren. Im Wesentlichen gilt das gesamte zirkulierende Blut eines Säugers dann als ersetzt, wenn der Hämatokrit-Wert des Lebewesens unter 10% fällt. Der Hämatokrit-Wert kann unter 10% liegen, wenn das Lebewesen mit Sauerstoff versorgt wird, oder wesentlich unter 10% in einer hyperbaren O&sub2;-Kammer. Die erfindungsgemäße Lösung kann natürlich auch dazu verwendet werden, um ein Lebewesen aufrechtzuerhalten, das einen Hämatokrit-Wert von mehr als 10% aufweist.
Das Verfahren zum Ersatz von im Wesentlichen des gesamten zirkulierenden Bluts eines Säugers kann durchgeführt werden, während die Körpertemperatur des Säugers bei seinem im Wesentlichen normalen Wert gehalten wird. Darüber hinaus kann das Verfahren unter Kühlung des Lebewesens und Verringerung der Körpertemperatur des Säugers unter dessen normale Körpertemperatur durchgeführt werden. Das Kühlen kann durch Kühlen des Lebewesens in einem Eisbad, einer Eis-Salz-Aufschlämmung oder einer Kühldecke erreicht werden. Das Lebewesen kann durch Kühlen der erfindungsgemäßen Lösung vor der Perfusion des Lebewesens mit der Lösung weiter gekühlt werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren für den Ersatz von im Wesentlichen dem gesamten zirkulierenden Blut des Säugers ist es bevorzugt, dass das Lebewesen gekühlt und mit der Lösung perfundiert wird. Dies wird unter Verwendung eines Arterienkatheters durchgeführt, um die Lösung in das Kreislaufsystem des Lebewesens einzubringen und eines Venenkatheters, um Blut und das Perfusat aus dem Lebewesen zu entfernen. Auf diese Weise wird im Wesentlichen das gesamte zirkulierende Blut des Lebewesens entfernt, wie es durch Messung des Hämatokrit-Wertes des Ausflusses vom dem Venenkatheter bestimmt werden kann. Wenn im Wesentlichen das gesamte zirkulierende Blut des Lebewesens entfernt worden ist, wird die Perfusion gestoppt.
Darüber hinaus kann das Verfahren für den Ersatz von im Wesentlichen des gesamten Bluts des Lebewesens mit Hilfe von hyperbarem O&sub2; durchgeführt werden. Das Lebewesen wird in eine hyperbare Kammer eingebracht, die mit Sauerstoffdruck beaufschlagt ist, wobei die Sauerstoffkonzentration höher als 20% und vorzugsweise 100% Sauerstoff ist. Der Druck der hyperbaren Kammer wird während des größten Teils des Verfahrens im Bereich zwischen 3,45 kPa über Atmosphärendruck bis zu zweifachem Atmosphärendruck gehalten. In einer Ausführungsform wird das Verfahren mit dem Lebewesen in einer hyperbaren Kammer bei hyperbaren Drücken von etwa 3,5 kPa bis etwa 207 kPa (etwa 0,07 bis etwa 2 atm (0,5 bis 30 psi)) mit 100% Sauerstoff durchgeführt. Gegebenenfalls kann der Druck in der hyperbaren Kammer während des Wundverschlusses auf Atmosphärendruck abgesenkt werden. Das Lebewesen wird dann bei einem hyperbaren Druck und hoher Sauerstoffkonzentration gehalten. Der Druck wird langsam auf einen nach wie vor hyperbaren Druck abgesenkt. Der Druck wird vorzugsweise über mehrere Stunden bis mehrere Tage unterhalb von 68,9 kPa bis 34,5 kPa (10 psi bis etwa 5 psi) gehalten. Anschließend wird der Druck nach und nach unterhalb von 6,9 kPa (1 psi) und vorzugsweise etwa 3,5 kPa (0,5 psi) abgesenkt und bei diesem Wert über einen zusätzlichen Zeitraum von bis zu einem Tag oder mehr gehalten.
Die Lösung kann auch verwendet werden, um die physiologische Unversehrtheit eines Organspenders unmittelbar nach dem Gehirntod aufrechtzuerhalten. Das Lebewesen kann gekühlt, das Blut des Lebewesens entfernt und durch eine zirkulierende Lösung, die unterhalb von 37ºC gehalten wird, ersetzt werden, oder es kann eine kalte erfindungsgemäße Lösung umgewälzt werden. Durch die Verwendung dieser Lösung kann die Ischämie lebenswichtiger Organe minimiert werden. Durch Umwälzen der kalten erfindungsgemäßen Lösung durch das Kreislaufsystem des Lebewesens bei niedrigen Temperaturen, und zwar unter Einbringen des Lebewesens in eine hyperbare Sauerstoffkammer oder auch ohne diese Maßnahme, können lebenswichtige Organe für längere Zeiträume aufrechterhalten werden, wodurch die Anzahl der Organe, die von einem Spender effektiv für potenzielle Transplantatempfänger verwendet werden können, maximiert wird.
Bei einem anderen Aspekt der Erfindung wurde gefunden, dass es unter Verwendung bestimmter Addukte, insbesondere Propandiol und Glucose in hoher Konzentration zur Verbesserung der Lösung, möglich sein kann, die Temperatur des Spenderorgans und insbesondere von Spenderherzen, unter den Gefrierpunkt des Wassers (0ºC) abzusenken und sie von dem gefrorenen Zustand in einen brauchbaren Zustand zu bringen, d. h., einen Zustand, bei dem eine koordinierte Herzkontraktion aufrechterhalten werden kann. Ferner wurde es durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Lösung mit derartigen Addukten möglich, die Temperatur intakter Säugerspender unterhalb des Gefrierpunkts von Wasser (0ºC) zu verringern und sie von dem gefrorenen Zustand in einen Zustand zu bringen, bei dem eine koordinierte Herzkontraktion aufrechterhalten werden kann. Es wird vermutet, dass auch andere Organsysteme mit einem hohen Grad an biologischer Unversehrtheit aufrechterhalten werden können, d. h., in einem physiologischen Zustand, der lebenserhaltend ist.
Die Addukte für die Lösung umfassen aliphatische Polyalkohole mit niedrigem Molekulargewicht. Diole wie z. B. Ethylendiol, Propandiol und Butandiol sind bevorzugt. Von diesen Diolen ist Propandiol besonders bevorzugt. Andere Polyalkohole, die für die Niedrigtemperaturkonservierung bei Temperaturen unterhalb von 0ºC von Organen und Organspendern geeignet sein können, sind Polyethylenglycole mit niedrigem Molekulargewicht. Bei diesem Aspekt der Erfindung ist es bevorzugt, dass das Addukt der Lösung bis zu einer Endkonzentration in einem Bereich von etwa 0,2 M bis 1 M zugesetzt wird. Für Propandiol ist insbesondere ein Bereich von 0,2 M bis 0,6 M bevorzugt. Eine Konzentration von etwa 0,4 M Propandiol ist ganz besonders bevorzugt. 1,2-Propandiol ist als Addukt für die erfindungsgemäße Lösung zur Verwendung bei der Niedrigtemperatur- Organ- und Spenderkonservierung bevorzugt, obwohl auch 1,3-Propandiol verwendet werden kann.
Die Glucosekonzentration in der Lösung, die für die Konservierung von Organen und Organspendern bei einer Temperatur von unter 0ºC geeignet ist, liegt im Bereich zwischen etwa 0,6 M bis etwa 1,4 M. Eine Konzentration von etwa 1 M Glucose ist bevorzugt.
Ein weiteres Addukt, das in der Lösung, die für die Konservierung von Organen und Organspendergeweben bei niedrigen Temperaturen und Temperaturen von unter 0ºC geeignet ist, ist Trimethylaminoxid (TMAO). TMAO kann der unmittelbar vorstehend beschriebenen Lösung bis zu einer Endkonzentration im Bereich zwischen 0,2 M und 7 M zugesetzt werden. Wenn die TMAO-enthaltende Lösung in ein Lebewesen perfundiert wird, führt dies zu einer verbesserten biologischen Unversehrtheit der Gewebe des Lebewesens, was sich durch eine überlegene anatomische Konservierung der Gewebe zeigt.
Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung und deren Einsatz veranschaulichen und sind nicht beschränkend aufzufassen.

BEISPIELE

Die nachstehenden Beispiele liefern dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung dahingehend, wie die Synthese der Erfindung durchgeführt wird und sind nicht beschränkend aufzufassen. Es wurde versucht, die Genauigkeit bezüglich der angegebenen Zahlen sicherzustellen (z. B. Mengen, Temperatur, usw.). Es sollten jedoch experimentelle Fehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Falls nicht ein anderes angegeben ist, sind Teile Gewichtsteile, das Molekulargewicht ist das Gewichtsmittel des Molekulargewichts, die Temperatur ist in ºC angegeben und der Druck ist Atmosphärendruck oder liegt nahe bei Atmosphärendruck.

Beispiel 1: Herstellung der Lösung

Herstellung von 10 l Lösung A

Ein geeigneter Behälter wird mit 80 g/l (oder 800 g für 10 l) pyrogenfreiem Dextran 40 (Pharmachem oder Pharmacia) beschickt. Durch Zugabe von entionisiertem Wasser wird das Volumen auf 6 bis 9 Liter gebracht. Das Dextran 40 wird durch Schütteln vollständig in Lösung gebracht. Die nachstehenden Komponenten können in jedweder Reihenfolge zugegeben werden, wobei jede Komponente vollständig gelöst wird, bevor die nächste Komponente zugegeben wird. Die nachstehenden Reagenzien können von Chemikalienhandlungen bezogen werden. In diesem Beispiel wurden die aufgeführten Reagenzien von Sigma bezogen: NaCl (5,2 g/l), CaCl&sub2; (0,29 g/l,), MgCl&sub2; (0,40 g/l), Glucose (0,9 g/l), TRIS (3,03 g/l) und Natriumgluconat (6,54 g/l).
Anschließend wird die Lösung durch tropfenweise Zugabe von 0,25 M HCl bei Raumtemperatur unter Schütteln und Überwachen mit einem pH-Meter auf pH 7,80 gebracht. Die Lösung wird dann durch Zugabe von entionisiertem Wasser auf das gewünschte Endvolumen gebracht (d. h., 10 Liter).
Schließlich wird die Lösung durch ein 0,2 u -Filter (Gelman-, Whatman- oder idealerweise Pall-Filtereinheiten können verwendet werden) in sterile Behälter oder Beutel gepumpt. Die abgefüllte und verpackte Lösung wird bis zum Gebrauch auf Eis gelagert.
Die Lösung kann dann nach dem Gefriertrocknen unter geeigneten Bedingungen als steriles trockenes Pulver in Behältern hergestellt werden, die zur Herstellung steriler IV-Lösungen geeignet sind.

Herstellung der HL-Lösung

Um 50 Liter HL-Lösung herzustellen (BioTime HextendTM-Lactat) werden 3,0 kg Hetastärke mit hohem Molekulargewicht (HES) 25 Liter Wasser zugesetzt. Es wird ausreichend NaCl zugegeben, um die NaCl-Endkonzentration auf 6,72 g/l zu bringen. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sowohl die HES als auch das NaCl gelöst sind. Die Lösung kann gegebenenfalls auch 50ºC erhitzt werden. Das Gesamtvolumen wird auf 45 Liter gebracht und die nachstehenden Komponenten werden zugegeben und gemischt, bis vollständige Auflösung eingetreten ist: 18,5 g CaCl&sub2; · 2H&sub2;O, 4,5 g MgCl&sub2; · 6H&sub2;O, 11,0 g KCl, 45,0 g Glucose und 4,03 ml einer 60%igen (w/w) Natriumlactatlösung. Die Lösung wird auf ein Volumen von 50 Liter gebracht. Die Lösung wird zur Entfernung von ungelöstem Material filtriert, in autoklavierbare Behälter eingebracht und in einem Autoklaven 15 min auf eine Temperatur von 120ºC erhitzt.

HLB-Lösung

Jedem hitzesterilisierten Liter der HL-Lösung werden 5 ml einer sterilen 1 M Lösung von medizinischem NaHCO&sub3; unter Bildung einer HLB-Lösung zugesetzt (BioTime HextendTM- Lactat-Hydrogencarbonat).

L-Lösung

Die L-Lösung wird so hergestellt, wie es vorstehend für die HL-Lösung beschrieben worden ist, ohne dass Hetastärke (HES) zugegeben wird.

Beispiel 2: Ein nach einstündiger Behandlung mit eiskaltem Blutersatz wiederbelebter Hamster

Einem etwa 1 Monat alten weiblichen Hamster mit einem Gewicht von 41 g (Mesocricetus auratus) wurden 0,04 ml Vetalar, eine 100 mg/ml-Lösung des Anästhetikums Ketamin, i. m. injiziert. Das Tier wurde in zerstoßenes Eis eingepackt und abgekühlt, bis seine Rektaltemperatur 10ºC betrug. Das Tier wurde aus dem zerstoßenen Eis entfernt und mit der ventralen Seite nach oben auf einem speziell angefertigten Tisch so positioniert, dass spezifische Abschnitte des Tieres während des chirurgischen Eingriffs durch ein Stereomikroskop beobachtet werden konnten. Die Gliedmaßen des Tieres wurden fixiert und das Tier wurde mit EKG-Ableitungen und einer rektalen Telethermometersonde versehen.
Im rechten Leistenbereich wurde eine Inzision vorgenommen und die rechte Oberschenkelvene und anschließend die rechte Oberschenkelarterie wurden unter Verwendung von speziell konstruierten Mikrokanülen kanüliert, die mit der Lösung A gefüllt waren. Nach der Kanülierung wurden 0,02 ml Heparin (1000 U/ml) in Lösung A durch die Venenkanüle injiziert, die anschließend verschlossen wurde.
Nach der Kanülierung der rechten Oberschenkelarterie wurde die Kanüle mit einem mit einer Luer-Spitze ausgestatteten Segment eines sterilen Kunststoffschlauchs verbunden, der mit einem auf dem chirurgischen Tisch befestigten Hahn verbunden war. Der Hahn war mit einem weiteren Schlauchsegment verbunden, das wiederum mit einem weiteren, dickeren und elastischeren Schlauchsegment verbunden war, das durch den Kopf einer Walzenpumpe verlief. Das Ende dieses weiteren Schlauchsegments enthielt ein Rohr zum Aufziehen von Flüssigkeit aus einem Vorrat. Dieses Rohr zum Aufziehen von Flüssigkeit von einem Vorrat, das hier als "Pick-up" bezeichnet wird, wurde aus dem Luer-Ende einer Hypodermalnadel der Größe 18 hergestellt. Dieser "Pick-up" wurde mit Blutfiltermaterial bedeckt, das durch einen kleinen Kautschuk-"O"-Ring befestigt wurde. Der "Pick-up" wurde in einen Vorrat der Lösung A eingebracht, der sich in einem in zerstoßenes Eis eingetauchten Zentrifugenröhrchen befand. Der Lösung (15 ml) wurden 0,06 ml einer 1 M KCl-Lösung zugesetzt, was eine molare Konzentration von etwa 4 mM KCl ergab. Die Leitung wurde unter Verwendung des Hahns geschlossen, um ein Zurückströmen in die Arterienkanüle zu verhindern.
Der Hamster wurde mit zerstoßenem Eis umgeben und auf 4ºC gekühlt. Dann wurden 0,2 ml einer 1 M KCl-Lösung in den Hahn injiziert, der geöffnet wurde, so dass die injizierte Lösung in die mit der Arterienkanüle verbundene Leitung und von dort in die Oberschenkelarterie des Tieres fließen konnte. Das Herz des Hamsters kam zum Stillstand. Man ließ das Tier weiter abkühlen und es wurde durch die Arterienkanüle mit 8 ml der Lösung A/4 mM KCl perfundiert. Der Abfluss, der den größten Teil des Hamsterblutes enthielt, wurde von der Venenkanüle aufgefangen. Nachdem der Hämatokrit-Wert unter 5 gefallen war, wurde die Walzenpumpe für 67 min abgestellt.
Der Hamster wurde dann durch die Arterienkanüle mit 8 ml der Lösung A ohne KCl perfundiert, gefolgt von 8 ml heparinisiertem Blut, das von anderen Hamstern durch Herzpunktion entnommen worden ist. Eine entsprechende Menge des Abflusses wurde von der Venenkanüle aufgefangen. Nachdem der Hämatokrit-Wert 40% überschritten hatte, wurde die Perfusion mit Vollblut beendet und die Kanülen wurden entfernt.
Der Hamster wurde mit einer Schreibtischlampe erwärmt, bis er auf eine Stimulation reagierte. Die Kanülen wurden entfernt, offene Blutgefäße liegiert und Inzisionen geschlossen. Das Erwärmen wurde fortgesetzt. Das Tier erholte sich vollständig und lebte noch mehrere Wochen nach dem Experiment.

Beispiel 3: Konservierung des Herzens nach Lagerung unter 0ºC

Einem weiblichen Hamster mit einem Gewicht von 40 g, der (über Nacht) keine Nahrung aufgenommen hatte, wurden 0,02 ml Ketamin-Anästhetikum (100 mg/ml) i. m. injiziert. Der Hamster wurde so lange in zerstoßenes Eis eingetaucht, bis seine Körpertemperatur auf +14ºC abgesunken war. Der Hamster wurde dann auf einem chirurgischen Tisch plaziert und mit EKG-Ableitungen und einer rektalen Temperatursonde versehen. Die Halsschlagader und die Jugularvene wurden chirurgisch freigelegt, während die Körpertemperatur des Tieres zwischen 10 und 14ºC gehalten und Kanülen in die Arterie und die Vene eingebracht wurden. Die Arterienkanüle wurde mit einem mit einer peristaltischen Pumpe verbundenen Schlauch verbunden. Der Schlauch wurde mit der Lösung A gefüllt, die zusätzlich 20 mM KCl enthielt. Die Venenkanüle blieb mit einer Kappe verschlossen, bis die Körpertemperatur des Tieres durch Einsatz von zerstoßenem Eis und einem Tisch mit einer auf -1,0ºC eingestellten Temperatursteuerung auf 5ºC abgesunken war.
Das Tier hörte von selbst zu atmen auf, als die Körpertemperatur auf unter 10ºC gefallen war. Die Beatmung mit 100% Sauerstoff wurde eingeleitet. Bei 5ºC wurde die Kappe der Venenkanüle entfernt und 3,5 ml der Lösung A wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,3 ml/min in die Arterie gepumpt. Danach wurden 4,5 ml einer Kälteschutzlösung infundiert, die aus Lösung A und zusätzlich 4 mM KCl, 1,0 M Glucose und 4% Propandiol (d. h., 1,8 g Glucose + 0,4 g Propandiol pro 10 ml Lösung) zusammengesetzt war. Während der Perfusion wurde der venöse Abfluss aufgefangen. Die Temperatur des Tieres wurde während der Perfusion nach und nach auf 0ºC abgesenkt. Die Beatmung wurde 5 min nach dem Einsetzen der Perfusion unterbrochen. Zu dieser Zeit waren mehr als 30% des Blutvolumens des Lebewesens entfernt worden. Das Herz schlug weiter, bis es schließlich aufhörte zu schlagen. Nach der Perfusion mit der im vorstehenden Absatz beschriebenen Kälteschutzlösung wurde das Tier in eine pastöse NaCl-Lösung (0,6 M) mit einer Temperatur von unter 0ºC gelegt, die über Nacht in einem Gefrierschrank aufbewahrt wurde.
Die Temperatur des Gefrierschranks wurde durchschnittlich bei -5ºC gehalten. Fünfzehn Minuten nachdem das Tier in den Gefrierschrank eingebracht wurde, sank dessen Rektaltemperatur von 0 auf -1,0ºC ab. 12 Stunden später betrug die Rektaltemperatur des Tieres -2,5ºC. Das Tier wurde dann in einem käuflichen Quasar-Küchenmikrowellenofen unter Verwendung von 7 Sekunden-Pulsen auf eine Temperatur von etwa 2,5ºC aufgewärmt, wobei die Einstellung "Aufwärmen" gewählt wurde. Die Pulse wurden in einem Abstand von 1 min erzeugt. Um das Tier aufzutauen, waren 18 Pulse nötig.
Das Tier wurde erneut auf dem chirurgischen Tisch plaziert und mit EKG-Ableitungen und einer rektalen Telethermometersonde versehen. 3,5 ml der Lösung A wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,2 ml/min in die Halsschlagader perfundiert. Die Körpertemperatur des Tieres wurde bei unter 5ºC gehalten. Der Hamster wurde dann mit Vollblut perfundiert und nach und nach erwärmt.
Nachdem 2 ml Blut infundiert worden waren und die Temperatur des Tieres auf 13ºC angestiegen war, wurden rhythmische EKG-Signale nachgewiesen. Mit fortgesetzter Perfusion und fortgesetzem Aufwärmen wurde die Amplitude der Signale größer und ihre Frequenz nahm zu. Nachdem 5,5 ml Blut infundiert worden waren und die Temperatur des Tieres 25ºC erreicht hatte, wurde der Brustkorb des Tieres geöffnet und es wurde ein kontinuierlich schlagendes Herz beobachtet.

Beispiel 4: Synthetischer Lösungsersatz für Blut in einer hyperbaren Kammer

Einem Hamster mit einem Gewicht von 40 g, der über Nacht keine Nahrung erhalten hatte, wurden i. m. 0,03 ml Ketamin (100 mg/ml) injiziert. Der Hamster wurde in zerstoßenes Eis eingebracht, bis seine Körpertemperatur auf unter 15ºC gefallen war. Der Hamster wurde aus dem zerstoßenen Eis herausgenommen und mit der ventralen Seite nach oben auf einem temperaturgesteuerten Tisch für die Mikrochirurgie unter einem Stereomikroskop positioniert. Die Temperatur des Hamsters lag zwischen 12 und 15ºC.
Nach einer Inzision im Bereich der rechten Leiste wurden die rechte Oberschenkelvene und -arterie freigelegt. Die Oberschenkelvene wurde kanüliert, 0,1 ml Heparin (1000 U/ml) wurden injiziert und die Kanüle wurde mit einer Kappe verschlossen, um ein Austreten von Blut zu verhindern.
Anschließend wurde die rechte Oberschenkelarterie kanüliert und die Kanüle wurde kurz mit einem Schlauch verbunden, der mit der Lösung A gefüllt war. Der Schlauch wurde durch den Kopf einer peristaltischen Pumpe geführt. Ein kleines Volumen der Lösung (etwa 0,3 ml) wurde infundiert, um die Arterienkanüle frei von Blut zu halten. Sowohl die Venenkanüle als auch die Arterienkanüle wurden mit einer chirurgischen Naht an dem Tier befestigt.
Die Arterienkanüle wurde mit einer Kappe verschlossen und das Tier wurde auf dem Tisch in eine hyperbare Sauerstoff (HBO)-Kammer überführt. In das Rektum wurde eine Temperatursonde eingeführt.
Die Arterienkanüle wurde mit einem Schlauch verbunden, der durch eine peristaltische Pumpe und in einen Vorrat lief. Der Schlauch und der Vorrat waren mit Lösung A gefüllt, die 4 mM KCl enthielt.
Die Kappe wurde von der Venenkanüle entfernt und die HBO-Kammer wurde verschlossen und mit Druck beaufschlagt. Die peristaltische Pumpe wurde eingeschaltet und das Tier mit Lösung perfundiert, welche den größten Teil seines Blutes ersetzte. Dieses Blut ließ man als venösen Abfluss von dem Tier ablaufen. Der konstant gehaltene Enddruck der Kammer betrug 152 kPa (1,5 atm) über Umgebungsdruck. Die Fließgeschwindigkeit der Lösung in das Tier betrug etwa 0,3 ml/min. Der Hamster wurde unter Verwendung des temperaturgesteuerten Tisches, auf dem der Hamster in der HBO-Kammer plaziert wurde, zwischen 14 und 16ºC gehalten.
Die Herzaktitivät und die Atmung wurden über diesem Zeitraum während der Perfusion aufrechterhalten. Nachdem unter Ersatz des Blutes 15 ml der Lösung A zusammen mit 4 mM KCl in den Hamster perfundiert worden waren, wurde der Druck in der Kammer nach und nach abgesenkt.
Die Kammer wurde dann geöffnet und eine Hämatokrit-Probe wurde entnommen. Der Hämatokrit-Wert betrug 5%. Die Venenkanülen und die Arterienkanülen wurden mit einer Kappe verschlossen. Dann wurde die Kammer geschlossen und mit einem Druck von 152 kPa (1,5 atm) über Umgebungsdruck beaufschlagt.
4 Stunden nach der Entnahme seines Blutes atmete das Tier weiterhin von selbst. Nach dieser Zeit wurde der Druck in der Kammer nach und nach abgesenkt. Gleichzeitig wurde das Tier auf 12ºC abgekühlt. Die Kammer wurde geöffnet und das Tier wurde auf einen anderen chirurgischen Tisch überführt. Das Tier wurde mit Eis bedeckt und Vollblut wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min in das Tier perfundiert, wobei man Lösung als venösen Abfluss ablaufen ließ.
Nachdem 1 ml Blut infundiert worden war, wurde das Eis entfernt. Die Körpertemperatur des Hamsters betrug 4ºC. Dann ließ man das Tier bei fortgesetzter Blutinfusion nach und nach mit steigendem Hämatokrit-Wert aufwärmen.
Nachdem 1 ml Blut infundiert worden war, wurde die künstliche Beatmung angestellt. Das Herz des Tieres schlug stets rhythmisch. Bei 21ºC atmete das Tier ununterbrochen von selbst. Die künstliche Beatmung wurde unterbrochen und das Aufwärmen sowie die Blutinfusion fortgesetzt, bis die Temperatur des Tieres 25ºC erreichte. Der gemessene Hämatokrit-Wert betrug 40%. Die Perfusion wurde unterbrochen, die Kanülen entfernt, die Blutgefäße ligiert und die chirurgischen Schnitte geschlossen.
Eine Stunde nach dieser Prozedur war das Tier sehr aktiv und munter. Vier Stunden nach dem Experiment nahm das Tier Nahrung auf und trank. 24 Stunden nach dem Abschluss der vorstehend beschriebenen Prozedur schien das Tier bezüglich Körperhaltung und Verhalten vollkommen normal zu sein und lebte noch Wochen nach dem Experiment.

Beispiel 5: Eiskalter Blutersatz bei einem Hamster

Einem etwa 1 Monat alten Hamster mit einem Gewicht von 46 g wurden 0,02 ml Vetalar, eine 100 mg/ml Ketaminlösung i. m. injiziert. Das Tier wurde in zerstoßenes Eis eingepackt, bis seine Rektaltemperatur etwa 12ºC betrug. Das Tier wurde dann aus dem zerstoßenen Eis entfernt und mit der ventralen Seite nach oben auf einem Tisch positioniert, der so konstruiert ist, dass er das Tier kalt hält, das sich unter einem Stereomikroskop befindet. Die Gliedmaßen des Tieres wurden fixiert und das Tier wurde mit EKG-Ableitungen und einer rektalen Telethermometersonde versehen.
Im rechten Leistenbereich wurde eine Inzision vorgenommen. In die rechte Oberschenkelvene wurde eine Kanüle eingebracht und 0,02 ml Heparinlösung (250 U/ml) wurden dem Tier durch die Kanüle injiziert, die dann mit einer Kappe verschlossen wurde. Anschließend wurde die rechte Oberschenkelarterie kanüliert. Die Kanüle wurde mit einem mit einer Luer-Spitze versehenen Segment eines Kunststoffschlauchs verbunden und der Schlauch wurde durch eine peristaltische Walzenpumpe in einen Vorrat geführt, der 0,05 M Glucose-enthaltende Lösung A enthielt. Am Ende des Schlauchs wurde eine 18 G- Hypodermalnadel eingeführt, wobei an deren Ende ein Netz-Blutfiltermaterial an der Hülse mittels eines Kautschuk-"O"-Rings befestigt war. Die Pumpe wurde eingeschaltet und Flüssigkeit in dem Vorrat wurde durch den Schlauch in die Oberschenkelarterie des Tieres gepumpt. Als die Temperatur des Tieres unter 9ºC gefallen war, wurde die Beatmung (mit 20 Beatmungen/min) unter Verwendung von 100% Sauerstoff eingeleitet. Das Tier wurde weiter bis zu einer Rektaltemperatur von 4ºC abgekühlt und 0,1 ml einer 0,2 M KCl-Lösung wurden in den 24 G Angiocath injiziert, der in die Oberschenkelvene eingeführt worden war. Diese Injektion brachte das Herz zum Stillstand und die EKG-Signale endeten. Die Pumpe wurde eingeschaltet und Lösung A wurde in die Arterie mit etwa 0,2 ml/min perfundiert, während der venöse Abfluss aufgefangen wurde. Während der Perfusion fiel die Temperatur des Tieres auf nahe 1ºC. Nachdem 4 ml Lösung in das Tier perfundiert worden waren, wurde die Pumpe ausgeschaltet und das Tier wurde bei Kreislaufstillstand 2 Stunden von Eis umgeben gehalten. Anschließend wurde das Tier mit etwa 7 ml Vollblut (das von anderen Hamsterblutspendern gesammelt wurde) perfundiert, während das Tier unter Verwendung einer Schreibtischlampe nach und nach erwärmt wurde. Während der Perfusion wurde der venöse Abfluss aufgefangen. Das dem in die Arterie gepumpten Volumen entsprechende Volumen wurde als venöser Abfluss aufgefangen. Nachdem das Tier 3 Stunden und 11 min bei Herzstillstand verblieb, wurden bei 10ºC Herzschläge zuerst durch Überwachung der EKG-Signale beobachtet. Dann wurde eine Beatmung (6 Beatmungen/min) des Tieres mit 100% Sauerstoff eingeleitet. Nachdem das Tier weiter erwärmt worden war und die Herzschläge stärker und schneller wurden, wurde diese Geschwindigkeit auf etwa 15 Beatmungen/min erhöht. Als die Temperatur des Tieres mehr als 28ºC betrug, begann das Tier von selbst zu atmen und reagierte. Die Perfusion wurde unterbrochen (der Hämatokrit-Wert betrug 44%), die Kanülen wurden entfernt und die chirurgischen Wunden verschlossen. Dieser Hamster blieb bei offensichtlich normaler Gesundheit nach dem Experiment noch viele Wochen am Leben.

Beispiel 6: Wiederaufnahme des Herzschlags in einem eiskalten Hamster

Einem weiblichen Hamster mit einem Gewicht von 45 g, der (über Nacht) keine Nahrung aufgenommen hatte, wurden 0,03 ml Ketamin-Anästhetikum (100 mg/ml) i. m. injiziert. Der Hamster wurde so lange in zerstoßenes Eis eingetaucht, bis seine Körpertemperatur auf etwa 14ºC abgesunken war. Das Tier wurde dann auf einen chirurgischen Tisch plaziert und mit EKG-Ableitungen und einer rektalen Temperatursonde versehen. Die Halsschlagader und die Jugularvene wurden unter Verwendung eines Stereomikroskops chirurgisch freigelegt. Die Körpertemperatur des Tieres wurde zwischen 10 und 14ºC gehalten. Kanülen wurden in die Halsschlagader und die Jugularvene eingebracht. Die Arterienkanüle wurde mit einem Schlauch verbunden, der durch eine peristaltische Pumpe in einen Vorrat lief, der eine Kälteschutzlösung enthielt, die aus Lösung A zusammengesetzt war, welche zusätzlich 11 mM KCl, 1,0 M Glucose und 4% Propandiol enthielt. Die Venenkanüle blieb zunächst mit einer Kappe verschlossen, bis die Körpertemperatur des Tieres durch Einsatz von zerstoßenem Eis und einem Tisch mit einer auf -1,0ºC eingestellten Temperatursteuerung auf 5ºC abgesunken war.
Das Tier hörte von selbst zu atmen auf, als die Körpertemperatur auf unter 10ºC gefallen war. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Tier mit etwa 15 Beatmungen/min mit 100% Sauerstoff beatmet. Als die Temperatur des Tieres auf 5ºC gesunken war, wurde die Venenkappe entfernt und die Pumpe bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,20 ml/min eingeschaltet. Das Herz der Tieres hörte 21 min später zu schlagen auf und die Beatmung wurde 5 min nach Beginn der Perfusion unterbrochen. Während der Perfusion wurde Blut als venöser Abfluss gesammelt. Etwa 4 ml der Kälteschutzlösung A wurden in das Tier infundiert. Anschließend wurde das Tier mit einer Salz-Eis-Aufschlämmung umgeben, deren Temperatur -2ºC betrug. Der Behälter, der die Aufschlämmung und das Tier enthielt, wurde in ein auf -5ºC eingestelltes Temperaturbad gestellt. Die Rektaltemperatur des Tieres sank langsam auf -3,4ºC am Morgen (18 Stunden nachdem das Tier in das Kühlbad eingebracht worden ist). Der Behälter wurde aus dem Kühlbad entfernt. Die Aufschlämmung war ein gefrorener Feststoff. Die Aufschlämmung wurde unter Verwendung eiskalten Wassers geschmolzen. Nach der Entfernung der "Aufschlämmung" fühlte sich das Tier gefroren an. Das Tier wurde dann in einen Küchenmikrowellenofen eingebracht. Der Ofen wurde 7 Sekunden auf "Aufwärmen" eingestellt. Das Tier wurde während 20 min etwa 20 Heizzyklen mit etwa 7 Sekunden Dauer ausgesetzt. Dies führte zum Auftauen des Tieres und seine Rektaltemperatur stieg auf etwa 2ºC.
Das Tier wurde erneut auf dem chirurgischen Tisch plaziert und in die Halsschlagader mit Lösung infundiert. Die Kälteschutzlösung wurde als venöser Abfluss aufgefangen. Etwa 3 ml Lösung A wurden in das Tier bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,15 ml/min perfundiert. Von Hamsterblutspendern gesammeltes Blut wurde dann bei der gleichen Fließgeschwindigkeit perfundiert. Nachdem 2 ml Blut in die Arterie des Hamsters perfundiert worden waren, wurde der Hamster langsam unter Verwendung einer Schreibtischlampe erwärmt. Mit fortgesetzter Blutperfusion und fortgesetztem Erwärmen stieg die Temperatur des Tieres auf über 15ºC und es wurden starke rhythmische EKG-Signale aufgenommen. Nach einer chirurgischen Brustkorberöffnung konnten die Herzschläge beobachtet werden.

Beispiel 7: Synthetische Lösungen als Blutersatz in einer hyperbaren Sauerstoffkammer

Einem weiblichen Hamster mit einem Gewicht von 43 g (der über Nacht keine Nahrung aufgenommen hatte) wurden 0,02 ml Ketamin (100 mg/ml) i. m. injiziert. Der Hamster wurde in zerstoßenes Eis eingepackt, bis seine Körpertemperatur auf etwa 14ºC gefallen war. Der Hamster wurde dann mit der ventralen Seite nach oben auf einem temperaturgesteuerten Tisch plaziert, der für die Mikrochirurgie unter einem Stereomikroskop angeordnet war. Die Temperatur des Hamsters wurde zwischen 12 und 15ºC gehalten. Nach einer Inzision im rechten Leistenbereich wurden die rechte Oberschenkelvene und -arterie freigelegt. Die Oberschenkelvene wurde kanüliert, 0,1 ml Heparin (250 U/ml) wurden injiziert und die Kanüle wurde mit einer Kappe verschlossen, um ein Austreten zu verhindern. Dann wurde die rechte Oberschenkelarterie kanüliert und die Kanüle wurde an einem Schlauch angebracht, der durch eine peristaltische Pumpe und in einen mit Lösung A gefüllten Vorrat lief. Ein kleines Volumen der Lösung (d. h., 0,2 ml) wurde infundiert, um die arterielle Leitung frei von Blut zu halten. Sowohl die Venenkanüle als auch die Arterienkanüle wurden an dem Tier befestigt. Die Arterienkanüle wurde mit einer Kappe verschlossen und das Tier wurde auf den temperaturgesteuerten Tisch einer hyperbaren Sauerstoff (HBO)-Kammer überführt. Die rektal gemessene Temperatur des Tieres wurde zwischen 13 und 18ºC gehalten. Der Hamster wurde in diesem Temperaturbereich gehalten, um die Aktivität des Tieres gering zu halten, während sichergestellt war, dass das Tier von selbst atmete und reflexartig auf Stimulation reagierte.
Die Arterienkanüle war mit einem Schlauch verbunden, der außerhalb der Kammer durch eine peristaltische Pumpe und in einen Vorrat lief (innerhalb der Kammer), der Lösung A und 2,5 mM KCl enthielt. Die Kappe wurde von der Venenkanüle entfernt und die Pumpe wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,2 ml/min eingeschaltet. Als die Lösung in das Tier perfundiert wurde, wurde venöser Abfluss (Blut) aufgefangen. Die Kammer wurde schnell verschlossen und nach und nach mit einem Druck von 138 kPa bis 165 kPa (20 bis 24 psi) beaufschlagt (100% Sauerstoff). Nach etwa 1 Stunde Perfusion unter Druck wurde der Druck in der Kammer während eines Zeitraums von etwa 1 Stunde nach und nach aufgehoben. Die Perfusion wurde unterbrochen. Es wurden insgesamt etwa 13 ml Lösung in das Tier perfundiert. Die Kanülen wurden verschlossen, nachdem eine Probe des venösen Abflusses entnommen wurde, um den Hämatokrit-Wert zu bestimmen. Das Tier wurde erneut auf einem chirurgischen Tisch plaziert, die Kanülen wurden herausgezogen und die Wunden verschlossen. Das Tier zeigte während dieser Zeit eine sehr geringe Reflexaktivität, obwohl das Tier nur wenig Blut enthielt und Raumluft atmete. Das Tier wurde schnell in einen Kasten innerhalb der Kammer plaziert, der nach und nach mit etwa 138 kPa (20 psi) Druck beaufschlagt wurde. In die Kammer wurde Nahrung und Wasser für den Hamster eingebracht. Eine Wärmelampe wurde verwendet, um die Kammer und das Tier zu erwärmen. Der Druck in der Kammer wurde nach und nach (während 1 Stunde) auf 35 kPa (5 psi) abgesenkt. Die Aktivität des Tieres erhöhte sich während des einstündigen Zeitraums, bis es relativ aktiv wurde. Das Tier wurde etwa 16 Stunden bei 35 kPa (5 psi) in der Kammer gehalten. Der Druck wurde dann nach und nach auf 3,5 kPa (0,5 psi) (100% Sauerstoff) abgesenkt und 24 Stunden bei diesem Wert gehalten. Anschließend wurde das Tier aus der Kammer herausgenommen und in einen normalen Käfig gesetzt. Das Tier schien viele Wochen nach dem Experiment völlig normal zu sein.

Beispiel 8: Verwendung von Lösung A, die mit Kaliumchlorid verbessert ist um einen Blutersatz für Primaten bereitzustellen

In diesem Beispiel wurden einem jungen männlichen Pavian der Art Papio anubis mit einem Gewicht von 8 kg 60 mg Ketamin i. m. injiziert. Ein 22G · 3,2 cm Katheter wurde in die rechte Cephalica eingeführt und 3 ml 2,5%iges Pentothal wurden i. v. injiziert. Das Tier wurde dann mit einem Endotrachealtubus versehen, auf einem chirurgischen Tisch plaziert und mit einem 0,7 bis 2,5%igen Gemisch von Flether in 100% O&sub2; beatmet, das auf die Aktivität des Tieres abgestimmt war. Die Augen wurden zum Schutz mit Lacrylube bedeckt.
Das Beatmungsgerät wurde auf 18 Beatmungen pro Minute (bpm) eingestellt. Das Hubvolumen des Beatmungsgerätes betrug 240 ml und das Einatem/Ausatemverhältnis betrug 37%. Der Druck der Atemwege wurde bei etwa 1,3 kPa (10 mm Hg) gehalten und das bei jeder Einatmung abgegebene Volumen wurde durch Prüfen der Luftwege- Druckaufzeichung auf einem Bildschirm- oder Diagrammstreifen-Aufzeichnungsgerät überprüft. Der Luftwege-Druck wurde online durch einen Computer überwacht.
Das Tier wurde rasiert und eine Ringers Lactat-Tropfinfusion wurde i. v. bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 bis 3 ml/min eingeleitet, wobei die Geschwindigkeit dem arteriellen Blutdruck des Tieres angepasst wurde. Es wurde Terramycin verabreicht.
Der außerhalb des Körpers befindliche Kreislauf bestand aus einem Blutoxygenator, einem Blutvorrat und einer Pumpe und war mit einem zwischengeschalteten Sekundärwärmetauscher aufgebaut, der so nahe wie möglich am Tier angeordnet war. Der Kreislauf war ferner mit einem externen Eiswasservorrat ausgestattet. Der Eiswasservorrat wies eine Pumpe auf, um den im Oxygenator eingebauten Wärmetauscher sowie den Sekundärwärmetauscher mit umgewälztem Eiswasser zu versorgen. Alle Schläuche, die mit Blut oder Blutersatz in Kontakt standen, waren steril. Der Vorrat des Oxygenators und der Kreislauf waren mit 2 Liter Lösung A gefüllt.
2 Liter der Lösung A in dem Oxygenatorvorrat und dem Bypasskreislauf wurden KCl (4 ml einer 2,0 M-Lösung) zugesetzt, wobei eine KCl-Konzentration von 4 mM erhalten wurde. Ein 5F NIH-Katheter zur Überwachung des arteriellen Drucks wurde in die linke Armarterie eingeführt. Daran wurde ein Dreiwegehahn befestigt (um alle 10 bis 60 min während der gesamten Prozedur eine Probenahme von arteriellem Blut zu ermöglichen). Blutgase, der pH-Wert, K&spplus; und der Hämatokrit-Wert wurden in jeder Probe gemessen und in manchen Fällen auch Elektrolyte und Enzyme. Der Katheter wurde mit einem Druckmesswertwandler verbunden. Der Messwertwandler wurde mit einem Computer verbunden, um den Druck der Aa. centrales (CAP) zu messen. Andere Temperatur- und Druckparameter wurden auch online von demselben Computer gemessen.
Ein 6F NIH-Katheter wurde in einen distalen Zweig der linken Armvene eingeführt, um eine computergestützte Überwachung des Zentralvenendrucks (CVP) zu messen. Es wurde eine Brustkorberöffnung durchgeführt und ein 6F Koronarkathether wurde in den linken Vorhof eingeführt, um den Druck im linken Vorhof zu überwachen.
Eine 10F Arterienkanüle wurde in der linken Oberschenkelarterie und eine 16F Venenkanüle wurde in der linken Oberschenkelvene plaziert. Methylprednisolon (80 mg) wurde i. v. injiziert. Ein Speiseröhrenschlauch wurde eingebracht und 3 ml Maalox wurden verabreicht. Der Speiseröhrenschlauch wurde mit einer Thermistorsonde zur Aufzeichnung der Temperatur im unteren Teil der Speiseröhre ausgestattet.
Aufgrund der ausgedehnten chirurgischen Prozeduren befand sich der Pavian etwa 5 Stunden in Narkose. Nach dem Anordnen der EKG-Ableitungen wurde das Tier in eine netzförmige Schlinge eingebracht und in einen isolierten Eiseimer abgesenkt. Das Tier wurde dann in zerstoßenes Eis eingetaucht. Nach 1 Stunde und 6 min des Abkühlens in zerstoßenem Eis sank die Körpertemperatur auf 23ºC. Eine Nipridinfusion (25 mg Natriumnitroprussid in 500 ml einer 5%igen wässrigen Dextroselösung) wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 6 ml/Stunde eingeleitet. Das Tier wurde 17 min später an den Bypass angeschlossen, als die Temperatur auf 21ºC gefallen war.
Zu diesem Zeitpunkt wurden dem Pavian 200 ml Vollblut als venöser Abfluss entnommen. Die Klammern, die den Kreislauf des Affen von dem Bypasskreislauf trennten, wurden gelöst und 2 Liter Lösung A, der 2 ml einer 2 M KCl-Lösung (Endkonzentration 2 mM KCl) zugesetzt worden sind, wurden als Blutersatz für das Tier verwendet. Danach wurde der Herzschlag des Tieres mit einer i. v.-Verabreichung von 15 ml einer 2 M KCl-Lösung gestoppt.
Ein Blut-Blutersatz-Gemisch wurde kontinuierlich als venöser Abfluss entfernt, bis 4 Liter Lösung A (der 22 ml einer 2 M KCl-Lösung zugesetzt worden waren) die Kreislauflösung ersetzt hatten. Nach 50 Minuten des gekühlten Blutersatzes war die Temperatur des Primaten auf 3ºC gefallen. Der Fluss durch das Tier erschien gut und es lag nur eine geringe Tendenz des pulmonalen Kapillardrucks vor, während der Perfusion der Oberschenkelarterie anzusteigen. Die Ursache dieses erhöhten Flusses und des relativ raschen Temperaturabfalls könnte mit der Verwendung von Nitroprussid zusammenhängen und auch mit der relativ sparsamen Verwendung von Anästhetika während des Abkühlens, was dazu führte, dass das Tier bei der Abkühlung etwas aktiver war.
Nach dem Blutersatz wurde das Tier für eine Stunde und 40 min in einen Zustand des Kreislaufstillstands versetzt. Am Ende der Stillstandsperiode wurde dem Kreislauf 2 Liter einer eiskalten Lösung A zugesetzt, die 2 Liter ersetzten, die als venöser Abfluss entfernt worden waren. Die minimale aufgezeichnete Körpertemperatur betrug 2,8ºC. Anschließend wurde mit dem Aufwärmen begonnen. Nach 13 min Erwärmen erreichte die Körpertemperatur des Tieres 10ºC und dem Kreislauf wurden 800 ml eines 1 : 3-Gemisches aus Blut und Blutersatz, gefolgt von 450 ml eines 1 : 1-Gemisches und schließlich etwa 1 Liter Vollblut zugesetzt, wodurch die Lösung A ersetzt wurde.
Unmittelbar nachdem Blut in das Tier infundiert wurde, konnte ein Herzschlag nachgewiesen werden. Während der folgenden Stunde und 22 min wurden 40 ml NaHCO&sub3; i. v. injiziert. Die mechanische Beatmung wurde eingeleitet und eine Dopamin-Tropfinfusion (200 mg in 250 ml) wurde mit 30 ml/Stunde verabreicht. Auch CaCl&sub2; (50 mg) wurde i. v. injiziert. Etwa eine Stunde später, als die Körpertemperatur auf einen nahezu normalen Wert angestiegen war, wurde das Tier vom Bypass entfernt und mit einer Vollblut-Tropfinfusion verbunden. Die Blutgase des Tieres und der Blutdruck stabilisierten sich im normalen Bereich.
Eine Stunde später wurden die Kanülen entfernt. Da das Tier nach einer Brustkorberöffnung katheterisiert wurde, wurde entschieden, dass die chirurgische Langzeit-Nachbehandlung des Tieres nicht versucht werden würde, und zwar aufgrund der Verhaltensprobleme beim Einsperren eines ungezähmten Pavians während der potentiellen Behandlung von Brustkorbinfektionen. Als die Beatmung nach einer Stunde unterbrochen wurde, zeigte das Tier Agoniebewegungen und erlitt einen Herzstillstand. Da sich die Blutdruckwerte und die Blutgase des Affen stabilisiert hatten, ist offensichtlich, dass das Tier das Potenzial hatte, nach dem Blutersatz unterhalb von 10ºC (Temperatur im unteren Bereich der Speiseröhre) 2 Stunden und 30 min zu überleben.

Beispiel 9: Verwendung der Lösung A ohne Verbesserung bei dem Blutersatz von Primaten

In diesem Beispiel wurden ein junger männlicher Pavian der Art Papio anubis gekühlt und sein Blut wurde durch einen Blutersatz bei unter 10ºC 1 Stunde und 22 min ersetzt. Vor dem Kühlen und dem Blutersatz wurde ein 4F 60 cm Swan-Ganz Pfeilkapillarkatheter über die rechte Oberschenkelvene in der Lungenschlagader plaziert. Dies erlaubte die Messung des pulmonalen Kapillardrucks ohne eine Brustkorberöffnung durchzuführen.
Der Fluss durch den Bypass-Kreislauf wurde durch eine schwache Narkose des Tieres und durch die Verwendung von Nitroprussid, als die Temperatur auf 28ºC abfiel, verbessert. Obwohl die gesamte Prozedur glatt verlief, verursachte eine i. v.-Injektion von 50 mg Calciumchlorid, nachdem Citratblut während des Aufwärmens eingeführt worden war, eine massive Gerinnselbildung und führte zum Abbruch des Experiments. Zu dieser Zeit lag im kardiovaskulären System kein Heparin vor.
Prozedur: Dem Pavian wurden 70 mg Ketamin i. m. injiziert. Ein 22G · 3,2 cm Katheter wurde in die linke Cephalica eingeführt und 3 ml 2,5%iges Pentothal wurden i. v. injiziert. Der Affe wurde dann mit einem Endotrachealtubus versehen und in den Röntgenraum gebracht. Der Affe wurde auf einem Röntgentisch plaziert und mit einem 1%igen Gemisch von Isofluoran (Flether) in 100% O&sub2; beatmet und ein 4F 60 cm Pfeilkapillarkatheter wurde über die rechte Oberschenkelvene in die Lungenarterie implantiert.
Das Beatmungsgerät wurde auf 20 bpm eingestellt. Das Hubvolumen des Beatmungsgerätes betrug 200 ml und das Einatem/Ausatemverhältnis betrug 37%. Der Druck der Atemwege wurde bei etwa 1,3 kPa (10 mm Hg) gehalten und das bei jeder Einatmung abgegebene Volumen wurde durch Prüfen der Luftwege-Druckaufzeichung auf einem Bildschirm- oder Diagrammstreifen-Aufzeichnungsgerät überprüft. Der Luftwege- Druck wurde online durch einen Computer überwacht.
Das Tier wurde rasiert und eine Ringers Lactat-Tropfinfusion wurde i. v. bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 bis 3 ml/min eingeleitet, wobei die Geschwindigkeit dem arteriellen Blutdruck des Tieres angepasst wurde.
Der außerhalb des Körpers befindliche Kreislauf entsprach dem in dem vorstehenden Beispiel beschriebenen Kreislauf. Der Oxygenatorvorrat und der Kreislauf waren mit 2 Liter Lösung A gefüllt.
Ein Hydromer-Katheter der Größe 20 wurde in die rechte Oberschenkelvene eingebracht, um die computergesteuerte Überwachung des Zentralvenendrucks (CVP) zu ermöglichen. Ein Dreiwegehahn wurde zwischengeschaltet, um eine Probenahme zu ermöglichen. Ein Hydromer-Katheter der Größe 20 zur Überwachung des arteriellen Drucks wurde in die rechte Armarterie eingebracht. Daran wurde ein Dreiwegehahn befestigt (um eine Probenahme von arteriellem Blut alle 10 bis 60 min während des gesamten Verfahrens zu ermöglichen). Blutgase, der pH-Wert, K&spplus; und der Hämatokrit-Wert wurden in jeder Probe gemessen und in manchen Fällen auch Elektrolyte und Enzyme. Der Katheter wurde mit einem Druck-Messwertwandler verbunden. Der Messwertwandler wurde mit einem Computer verbunden, um den Druck der Aa. centrales (CAP) zu überwachen. Andere Temperatur- und Druckparameter wurden auch von dem gleichen Computer online gemessen.
Eine 14F Venenkanüle wurde in der linken Oberschenkelvene und eine 10F Arterienkanüle wurde in der linken Oberschenkelarterie plaziert. Nach der Implantation der Venenkanüle wurden 2,6 ml Heparin i. v. injiziert. Ein Speiseröhrenschlauch wurde eingebracht und 3 ml Maalox wurden verabreicht. Der Speiseröhrenschlauch wurde mit einer Thermistorsonde zur Aufzeichnung der Temperatur im unteren Teil der Speiseröhre ausgestattet. Methylprednisolon (80 mg) wurde i. v. injiziert. Die Augen wurden zum Schutz mit Lacrylube bedeckt. Bei schwacher Narkose des Tieres wurde 1 ml Pentothal i. v. verabreicht.
Die EKG-Ableitungen wurden angebracht, das Tier wurde in eine netzförmige Schlinge eingebracht und in einen isolierten Eiseimer abgesenkt. Das Tier wurde dann in zerstoßenes Eis eingetaucht. Nach 29 min Abkühlen in zerstoßenem Eis sank die Körpertemperatur auf 28ºC. Das Tier wurde unter schwacher Narkose gehalten und der Flether wurde abgestellt, als die Temperatur unter 30ºC gefallen war. Eine Nipridinfusion (Natriumnitroprussid, 25 mg in 500 ml 5%iger wässriger Dextrose) wurde mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/Stunde eingeleitet und dann auf 40 ml/Stunde erhöht. Während der folgenden 20 min wurde die Niprid-Tropfinfusion mit fallendem Blutdruck und fallender Temperatur gelegentlich an- und ausgestellt. Sie wurde schließlich ganz abgestellt, als das Tier 27 min später mit dem Bypass verbunden wurde und die Temperatur auf 23ºC gefallen war. An diesem Zeitpunkt wurden die Klemmen, welche den Kreislauf des Affen von dem Bypass-Kreislauf trennten, gelöst. 2 Liter der Lösung A wurden als Blutersatz für das Tier verwendet und Vollblut sowie verdünntes Blut wurden als venöser Abfluss entfernt und zur Wiederbelebung aufbewahrt. Danach wurde durch die i. v.-Verabreichung von 10 ml einer 2 M KCl-Lösung ein Herzstillstand ausgelöst.
Ein Blut-Blutersatz-Gemisch wurde kontinuierlich als venöser Abfluss entfernt, bis 4 Liter Lösung A die zirkulierende Lösung ersetzt hatten. Nach 39 min des gekühlten Blutersatzes war die Temperatur des Primaten unter 4ºC gefallen. Der Fluss durch das Tier war schnell. Der Druck im Lungenkreislauf, der einfach gemessen werden konnte, zeigte, dass der Kreislauf gut war und dass der Kapillardruckkatheter richtig angeordnet war.
Nach 50 min des Blutersatzes bei unter 10ºC lag die aufgezeichnete minimale Körpertemperatur bei 2,9ºC. Anschließend wurde mit dem Aufwärmen begonnen und nach 28 min Aufwärmen erreichte die Körpertemperatur des Tieres 10ºC. Dem Kreislauf wurde zum Ersatz der Lösung A 750 ml Vollblut zugesetzt.
Ein Herzschlag trat 8 min nach der Blut-Reinfusion in das Tier auf. Während der folgenden 30 min. während sich das Tier erwärmte, wurden 10 ml NaHCO&sub3;, 50 mg CaCl&sub2; sowie 80 mg Methylprednisolon i. v. injiziert. Innerhalb weniger Minuten nach Zugabe des CaCl&sub2; zeigte sich eine massive Gerinnselbildung. Es wird vermutet, dass das Blut, das mit Citrat antikoaguliert worden ist, als Folge der CaCl&sub2;-Zugabe gerann. Das Experiment wurde anschließend abgebrochen.
Bei diesem Experiment schien die Fließgeschwindigkeit des Blutersatzes durch das Tier und den Bypass-Kreislauf hoch zu sein, während der linke Vorhofdruck akzeptabel niedrig blieb. Es wird vermutet, dass die Faktoren, die zu diesem Ergebnis beitrugen, die Verwendung von Nitroprussid und die Aufrechterhaltung eines schwachen Narkosezustands während des Abkühlungsvorgangs waren. Vor der erneuten Zuführung in das Tier werden dem Blut 1 bis 2 ml Heparin zugesetzt. Es wird vermutet, dass die Heparinisierung des erneut zugeführten Blutes die massive Gerinnung ausschließen wird, die diesem Experiment ein unerwartetes Ende bereitete.

Beispiel 10: Eiskalter Blutersatz mit HLB-Lösung bei einem Hund

Ein Hund mit einem Gewicht von 25 bis 30 kg wird mit einem kardiopulmonalen Bypass verbunden. Die Oberfläche und der Kern des Hundes werden bis nahe dem Gefrierpunkt (1 bis 3ºC) gekühlt. Das Blut des Hundes wird durch den in Beispiel 1 beschriebenen hypothermalen HLB-Lösung-Blutersatz ersetzt. Das Blut wird für die Transfusion während des Aufwärmens zurückgehalten. Die Körpertemperatur des Tieres wird bis nahe an den Gefrierpunkt (unter 4ºC) verringert und anschließend wird das Tier wieder aufgewärmt. Der Blutersatz wird durch Blut ersetzt, wobei sich das Tier erwärmt und es wiederbelebt wird.
Prozedur: Der Hund wird an der rechten Vv. Radiales katheterisiert. Es wird Pentothal i. v. injiziert, ein Endotrachealtubus eingebracht und mit Isofluran (oder Flether) in 100% O&sub2; beatmet. Es wird eine Ringer's Lactat-Tropfinfusion mit einer Geschwindigkeit eingeleitet, die auf den arteriellen Blutdruck des Hundes abgestimmt ist (etwa 40 ml/Stunde i. v.). Der Hund wird auf eine mit umgewälztem Eiswasser gekühlte Kühldecke gelegt. Die rechte Halsschlagader wird katheterisiert, um eine Überwachung des Blutdrucks (CAP) zu ermöglichen. Ferner wird ein Dreiwegehahn zwischengeschaltet, um während der gesamten Prozedur alle 10 bis 60 min eine Probenahme von arteriellem Blut zu ermöglichen. Es wird ein Foley-Katheter zum Sammeln und Messen des Urinvolumens während der Prozedur eingebracht. Es wird ein 2-Lumen 7F Swan-Ganz Kapillarkatheter über die rechte Jugularvene oder die rechte Oberschenkelvene implantiert, die von der rechten Herzkammer in die Lungenarterie versorgt wird. Die distale Öffnung wird zur Messung des pulmonalen Kapillardrucks (PAW) und die proximale Öffnung wird zur Messung des Zentralvenendrucks (CVP) verwendet. (Gegebenenfalls kann der CVP mit einem Katheter gemessen werden, der in eine der Armvenen eingebracht worden ist.) Die linke Oberschenkelarterie und -vene werden isoliert und für die Kanülierung vorbereitet. Das Tier wird heparinisiert (etwa 5000 U). Es wird eine Biomedicus-Venenrückstromkanüle (15 bis 19F) in die Oberschenkelvene eingebracht und eine Biomedicus-Arterienkanüle (12 bis 15F) in die Oberschenkelarterie. Die aktivierte Gerinnungszeit (ACT) wird (bis zum Blutersatz) alle 45 min gemessen und das Heparin wird derart eingestellt, dass es länger als 400 s verbleibt. Ein Thermoelement wird etwa in der Mitte eines Speiseröhrenschlauchs angebracht und die Einheit wird derart eingeführt, dass der Schlauch in den Magen eintritt. Ein zweites Thermoelement wird rektal plaziert. Es werden ECG-Ableitungen angebracht. Es werden 80 mg Solu-Delta-Cortef (Upjohn, tiermedizinisches Prednisolon-Na-succinat) durch i. v.-Injektion zugesetzt. Die Augen werden mit Terrimycin (oder Lacrylube) bedeckt und DiGel (oder Maalox, 20 ml) werden durch den Speiseröhrenschlauch zugesetzt.
Messungen: Die arteriellen Blutgase, der pH-Wert und der Hämatokrit-Wert werden in jeder Blutprobe gemessen und in manchen Fällen Elektrolyte, Enzyme und andere chemische Stoffe. Die Speiseröhren- und Rektaltemperatur werden wie der arterielle Zufluss und die Temperatur des Venenrückstromblutes überwacht. CAP, PAW, CVP, ECG und der Luftwegedruck werden überwacht. Die Temperaturen sollten digital angezeigt und als Funktion der Zeit in einem computergestützten Datenerfassungssystem gespeichert werden. Die Drücke und das ECG sollten als Echtzeit-Wellenformen oder als numerische Daten angezeigt und von dem Computer gespeichert werden.
Bypass-Kreislaufkomponenten: Der Kreislauf umfasst eine Zentrifugenblutpumpe von Biomedicus und einen Strömungsmesser, einen Terumo-Hohlfasermembran-Oxygenator mit eingebautem Wärmetauscher, einen venösen Shiley-Hartgehäusevorrat mit Filter und einen Sekundärwärmetauscher mit integrierter Blasenfalle (Electromedics), die so nahe wie möglich am Tier angeordnet ist. Ein Ablaufsegment ist nahe am Einlass des venösen Vorrats angeordnet und endet mit einem Rückschlagventil. Dies lässt einen schnellen und effizienten Blut/Blutersatz-Austausch zu. Es liegt auch ein arteriovenöser Shunt-Abschnitt vor, der auch ohne Bypass einen Kreislauf ermöglicht.
Der venöse Vorrat kann entweder von dem 1-Liter Scheidetrichter durch die "Quick-prime"- Öffnung oder von Zweifach-Infusionsbeuteln durch eine der Kardiotomieöffnungen gefüllt werden. Die arterielle Leitung von dem Oxygenator zu der Arterienkanüle und der arteriovenöse Shunt bestehen aus einem 0,64 cm-Schlauch. Die venöse Rückstromleitung, die Ablaufleitung und die Pumpenkopfleitung bestehen aus 0,95 cm-Schläuchen. In denjenigen Segmenten, bei denen eine starke Biegung auftreten kann, werden dickwandige Schläuche verwendet oder der Schlauch wird mit einer "Spiralumhüllung" umgeben. Die Patientenschleife wird zweifach eingehüllt und der gesamte Kreislauf (ohne den fabriksterilisierten Vorrat, den Sekundärwärmetauscher und den Oxygenator) wird mit Ethylenoxidgas an sechs Basisabschnitten sterilisiert (Pumpenkopf, Strömungsmessabschnitt, zentrale Bypassschleife, Trichter, Infusionsleitung und Gasfilterleitung).
Versorgung des Bypass-Kreislaufs: Eiswasser, das aus einem von zwei isolierten 37,9 l (10 Gallonen)-Vorräten gepumpt wird, wird verwendet, um den Oxygenator und die Sekundärwärmetauscher zu kühlen. Der andere Vorrat versorgt die Kühldecke. Zu Beginn des chirurgischen Eingriffs wird Eiswasser durch die Kühldecke umgewälzt. Zu Beginn des Bypasses wird Wasser, das Raumtemperatur aufweist, durch die Wärmetauscher des Kreislaufs umgewälzt.
Die Temperatur wird langsam durch Zusatz von Eis zu dem Vorrat abgesenkt, und zwar in Mengen, die ausreichend sind, um einen Temperaturunterschied von 7 bis 10ºC zwischen der Speiseröhrentemperatur und der Blutstromtemperatur aufrechtzuerhalten. Nach dem Blutersatz (d. h., bis zu einem Hämatokrit-Wert von weniger als etwa 4%), wird mit dem vollen Eiswasserstrom fortgefahren.
Bei dem Aufwärmen wird Eis von dem Vorrat entfernt und die Heizeinrichtung wird aktiviert. Die Temperatur des Aufwärmstroms wird durch manuelle Einstellung des Heizthermostats auf ein Maximum von 10ºC höher als die Temperatur des venösen Rückstroms eingestellt.
Der Oxygenator wird mit sterilem, gefilterten 100%igem O&sub2; versorgt.
Blutersatz: Der Kreislauf wird mit 2 Liter L-Lösung (Beispiel 1) gefüllt und durch den arteriovenösen Shunt rezirkuliert, um ein Temperatur-Gas-Gleichgewicht sicherzustellen. Die Kanülen werden mit den arteriellen und venösen Leitungen des Bypass-Kreislaufs verbunden und die Leitungen bleiben mit einer Klemme versehen. Die Kühldecke wird um den Patienten gewickelt, dessen Oberfläche gekühlt wird, bis eine Temperatur der unteren Speiseröhre von 35ºC erreicht ist.
Die Klemmen werden entfernt und der Bypass wird dem mit der L-Lösung verdünnten Blutstrom bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) fortgesetzt. Zu Beginn der Kühlung wird die Gasanästhesie unterbrochen und der Hund wird mit 2,5%igem Pentothal behandelt.
Der Blutstrom wird nach und nach abgekühlt, bis das Tier eine Speiseröhrentemperatur von 20ºC aufweist. Zu diesem Zeitpunkt wird Blut durch Klemmen des venösen Rückstroms an dem Vorratseinlass und Ablaufenlassen von dem Ablaufsegment entfernt, während die L- Lösung infundiert wird. Während dieses Austausches werden dem venösen Vorrat zusätzlich 2 Liter L-Lösung zugesetzt und wenn das Niveau der L-Lösung auf 250 ml gefallen ist, werden etwa 6 Liter HLB schrittweise zugesetzt, bis das gesamte Blut entfernt worden ist (HCT weniger als 2%, visuelle Beobachtung). Etwa 4 Liter Blut/Blutersatz-Gemische werden in sterilen Flaschen gesammelt und für die Reinfusion aufbewahrt. Das stark verdünnte Blutgemisch (etwa 5,5 Liter) wird verworfen.
Nachdem 4 Liter ausgetauscht worden sind (d. h., nach der Zugabe von 2 Liter L-Lösung und 2 Liter HLB-Lösung) werden 20 mÄqu. KCl über einen Hahn des Sekundärwärmetauschers injiziert, um einen Herzstillstand auszulösen. Während des Austauschs wird der Zufluss so eingestellt, das der PAW unter 0,67 kPa (5 mm Hg) gehalten wird und die Abflussgeschwindigkeit gleich der Zuflussgeschwindigkeit ist, d. h., so volumenkonstant wie möglich. Am Ende des Austauschs wird das Vorratsendniveau etwa 500 ml betragen, der PAW wird unter 0,67 kPa (5 mm Hg) liegen und der CVP wird weniger als 0,67 kPa (5 mm Hg) betragen. Der Fluss wird derart eingestellt, dass die Volumenkonstanz aufrechterhalten wird (konstantes Vorratsniveau und die vorstehend genannten Druckniveaus, d. h. PAW < 0,67 kPa (5 mm Hg) und CVP < 0,67 kPa (5 mm Hg)).
Wenn nahezu das gesamte Blut entfernt worden ist (HCT weniger als 4%, visuelle Beobachtung), kann der Kühlstrom auf die Temperatur von Eiswasser abgesenkt werden (Füllen des Vorrats mit Eis) und der Hund kann schnell auf seine Minimumtemperatur gekühlt werden. Wenn beobachtet wird, dass der HCT zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Kälteperfusion ansteigt, kann das Blutgemisch durch Austausch mit 2 bis 4 Liter HLB-Lösung durch das vorstehend beschriebene Verfahren entfernt werden.
Während der gesamten Prozedur werden Proben von arteriellem Blut und Blutgasen entnommen und der pH-Wert, der HCT und in manchen Fällen werden Elektrolyte und andere chemische Stoffe des Blutes überwacht.
Nach etwa 1 bis 2 Stunden des Blutersatzes unter Kühlung wird die Temperatur des Hundes etwa 1 bis 4ºC betragen und die Aufwärmung wird eingeleitet. Der Hund wird durch Entfernen des Eises von dem Versorgungsvorrat und Aufwärmen von dessen Inhalt durch die Heizeinrichtung, die wiederum die Decken wärmt, aufgewärmt. Wenn die Speiseröhrentemperatur 15ºC erreicht hat, werden 4 Liter L-Lösung mit 25 g Mannit durch die HLB-Lösung ausgetauscht, gefolgt von den 4 Liter gesammeltem Blutgemisch. Der Abfluss wird verworfen.
Das Tier wird sanft erwärmt, und zwar mit einer Blutstromtemperaturdifferenz von weniger als 10ºC und niemals mehr als 40ºC. Das Herz wird spontan zu schlagen beginnen. Wenn die Temperatur des Tieres (Speiseröhre und rektal) etwa 35ºC erreicht, stabilisieren sich die physiologischen Parameter. Das Tier kann von selbst überleben und kann von dem außerhalb des Körpers angeordneten Kreislauf getrennt werden.

Beispiel 11: Wiederbelebung eines Hundes, der einen eiskalten Blutersatz erhalten hat

Ein männlicher Hund mit einem Gewicht von 26,8 kg wurde mit Nembutal anästhetisiert und intubiert. Der Hund wurde in den Operationssaal gebracht, beatmet und mit Venen-, Foley-, Arterien- und Swan-Ganz-Kathetern katheterisiert und nach einer i. v.-Verabreichung von Heparin wurden die rechte Oberschenkelarterie und -vene des Hundes kanüliert. Es wurde ein Speiseröhrenschlauch eingebracht und ein Antazidum wurde verabreicht. Temperatursensoren wurden in der Speiseröhre und im Rektum plaziert. Methylprednisolon wurde i. v. injiziert.
Das Tier wurde in eine Kühldecke eingehüllt und die Kühlung der Oberfläche wurde eingeleitet. Die Kanülen wurden mit einem Bypasskreislauf verbunden, der aus einer Wirbel- Blutpumpe, einem Oxygenator mit eingebautem Wärmetauscher, einem zwischengeschalteten Sekundärwärmetauscher und einem Trichter für die schnelle Verabreichung von Blut und Blutersatz bestand. Dem Hund wurde Vollblut (225 ml) entnommen und für das Aufwärmen aufbewahrt. Das Blutvolumen wurde schnell durch HLB- Lösung ersetzt. Der Bypasskreislauf, der 1,05 Liter HLB-Lösung enthielt, wurde zum Tier hin geöffnet und die Kernkühlung wurde eingeleitet.
Es wurden 33 Liter des Blutersatzes ausgetauscht. Als der Gefrierpunkt erreicht war, lag der Hämatokrit-Wert weit unter 1%. Die Temperatur in der unteren Speiseröhre des Tieres lag für 4 Stunden und 5 min unter 10ºC, wobei eine Minimaltemperatur von 0,7ºC aufgezeichnet wurde (Tabelle 2).
Nach der hypothermalen Periode wurde das Tier aufgewärmt. Als die Körpertemperatur auf über 10ºC gestiegen war, wurden venöser Abfluss und Vollblut, das vorher aufgefangen bzw. gesammelt wurde, sowie Spenderblut in den Kreislauf zurückgeführt. Der Hämatokrit- Wert stieg mit steigender Temperatur. Es wurden Lidocain und Hydrogencarbonat verabreicht, das Herz wurde defibrilliert und die Beatmung wurde eingeleitet. Als der Blutdruck und die Körpertemperatur normale Werte erreicht hatten, wurde das Tier vom Bypass getrennt und Protamin sowie Lasix wurden injiziert. Mehrere Stunden nach dem Aufwärmen war das Tier bei Bewußtsein und reagierte. Das Tier blieb nach der Prozedur am Leben und wohlauf.

Beispiel 12: Wiederbelebung eines Pavians, der einen eiskalten Blutersatz erhalten hat

Ein männlicher Pavian der Art Papio annubis mit einem Gewicht von 24 kg wurde zunächst mit Ketamin und Acepromazin i. m. und anschließend i. v. mit Pentothal anästhetisiert. Der Pavian wurde dann mit Pancuroniumbromid ruhiggestellt. Der Pavian wurde intubiert, beatmet und mit Venen-, Foley- und Arterienkathetern katheterisiert. Das Tier wurde in eine Kühldecke eingehüllt und die Oberflächenkühlung wurde eingeleitet. Nachdem Heparin i. v. verabreicht worden war, wurden die rechte Oberschenkelarterie und beide Oberschenkelvenen des Pavians kanüliert. Temperatursensoren wurden in der Speiseröhre, im Rektum und im Gehirn plaziert. Das Tier wurde für EKG, somatosensorisch hervorgerufene Potentiale (SSEP's) und EEG instrumentiert. Dexamethazon wurde i. v. injiziert.
Die Kanülen wurden mit einem Bypasskreislauf verbunden, der aus einer Wirbel-Blutpumpe, einem Oxygenator mit eingebautem Wärmetauscher und einem Trichter für die schnelle Verabreichung von Blut und Blutersatz bestand. Dem Pavian wurde Vollblut (300 ml) entnommen und für das Aufwärmen aufbewahrt. Das Volumen wurde schnell durch 300 ml physiologische Kochsalzlösung ersetzt. Der Bypasskreislauf, der 2 Liter Plasmalyte (käufliche Elektrolytlösung) enthielt, wurde zum Tier hin geöffnet und die Kernkühlung wurde eingeleitet.
Nachdem die Temperatur in der unteren Speiseröhre auf unter 13ºC gefallen war, wurden weitere 2 Liter Plasmalyte, das 12,5 g Mannit enthielt, dem Kreislauf zugesetzt, die das Gemisch aus Blut und Plasmalyte ersetzte, das vorher den Kreislauf gefüllt hatte. Dieses verdünnte Blut wurde zur Verwendung während des Aufwärmens aufbewahrt. Unmittelbar danach wurden 10 Liter HLB-Lösung zugesetzt, um das Plasmalyte zu ersetzen. Als der Gefrierpunkt erreicht worden war, lag der Hämatokrit-Wert bei weit unter 1%. Als das Tier eine Gehirntemperatur von 3,4ºC und eine Temperatur in der unteren Speiseröhre von 2,8ºC erreicht hatte, wurde die Blutpumpe ausgeschaltet und das Tier wurde 45 min im Zustand des Kreislaufstillstands (Stillstand) gehalten. Nach diesem Zeitraum wurde der Kreislauf wieder angestellt.
Nach der hypothermalen Periode wurden dem Bypasskreislauf 4,2 Liter HLB-Lösung zugesetzt und das Tier aufgewärmt. Als die Körpertemperatur 15ºC erreicht hatte, wurden dem Kreislauf 2 Liter Plasmalyte zugesetzt, um die HLB-Lösung zu ersetzen. Dem Plasmalyte in dem Kreislauf wurde Mannit (6,25 g/l) zugesetzt. Zusätzlich wurden venöser Abfluss und Vollblut, das vorher aufgefangen bzw. gesammelt wurde, sowie Spenderblutzellen und frisch gefrorenes Plasma in den Kreislauf zurückgeführt. Der Hämatokrit-Wert des Tieres stieg mit steigender Körpertemperatur. Dem Kreislauf wurden weitere 12,5 g Mannit zugesetzt. Als die Speiseröhren- und Rektaltemperaturen normal erschienen, flimmerte das Herz während des Aufwärmens und begann zu schlagen. Die Beatmung wurde eingeleitet. Als der Blutdruck und die Körpertemperatur normale Werte erreicht hatten, wurde Protamin i. v. injiziert. Das Tier wurde vom Bypass getrennt, von den Kanülen und Kathetern befreit und die Inzisionen geschlossen.
Die Temperatur in der unteren Speiseröhre des Tieres lag 3 Stunden bei unter 15ºC und 2 Stunden und 17 min unter 10ºC, wobei eine Minimaltemperatur von 2,8ºC aufgezeichnet wurde (Tabelle 3). Am folgenden Morgen konnte das Tier in seinem Käfig aufrecht sitzen und Bananenstücke aufnehmen und zu sich nehmen sowie Apfelsaft trinken. Das Tier blieb am Leben und war wohlauf, bis es mehr als eine Woche später für eine histologische Bewertung getötet wurde. Tabelle 2: Wiederbelebung eines Hundes, der einen eiskalten Blutersatz erhalten hat
TE: Speiseröhrentemperatur; TR: Rektaltemperatur; MAP: mittlerer arterieller Druck; HR: Herzfrequenz; PAW: pulmonaler Kapillardruck; CVP: Zentralvenendruck Tabelle 3: Wiederbelebung eines Pavians, der einen eiskalten Blutersatz erhalten hat
TE: Speiseröhrentemperatur; TR: Rektaltemperatur; TB: Gehirntemperatur; MAP: mittlerer arterieller Druck; HR: Herzfrequenz; ICP: Intrakranialer Druck
Die vorstehend beschriebene und hier beanspruchte Erfindung umfasst neue Lösungen, die in einer Anzahl von Verfahren bzw. Prozeduren geeignet sein können. Im Lichte der Lehre der Beschreibung und der Ansprüche kann der Fachmann der Erfindung etwas Hinzufügen oder sie ändern, ohne von dem Wesen der hier beschriebenen Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Eine Blutersatzlösung auf wässriger Basisumfassend ein onkotisches Mittel, Na&spplus; und eine organische Carbonsäure, oder deren Salz oder Ester, und 0 bis 5 mM an K&spplus;, wobei die Lösung einen konventionellen biologischen Puffer nicht enthält.

2. Lösung geeignet zur Verwendung als Blutersatz, umfassend:

0 bis 5 mM an K&spplus;-Ionen,

eine Konzentration an Na&spplus;, Mg²&spplus;, Ca²&spplus; und Cl&supmin;-Ionen, die dem physiologischen Niveau entspricht oder unterhalb des physiologischen Niveaus liegt,

ein makromolekulares onkotisches Mittel;

eine organische Carbonsäure, oder deren Salz oder Ester;

und

ein Zucker;

mit der Maßgabe, daß die Lösung keinen konventionellen biologischen Puffer enthält.

3. Lösung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die K&spplus;-Konzentration in einem Bereich von 2 bis 3 mM liegt.

4. Lösung nach Anspruch 2 oder 3, wobei Na&spplus; in einer Konzentration von 130 bis 150 mM, Mg²&spplus; in einer Konzentration von 0,20 bis 0,45 mM, Ca²&spplus; in einer Konzentration von 2,0 bis 2,5 mM vorliegen, und wobei der Zucker eine einfache Hexose, wie z. B. Glukose, Fruktose oder Galactose, sowie eine Mischung daraus, ist.

5. Lösung nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, wobei die organische Carbonsäure, deren Salz oder Ester mit der nachstehenden allgemeinen Formel dargestellt wird:

RCOOX

wobei R eine Alkyl-, Alkenyl, oder Arylgruppe in Form einer geraden oder verzweigten Kette mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, die substituiert sein können, ist; und

X ein Waserstoffatom oder Natrium oder ein anderer biologisch verträglicher ionischer Substituent ist, der an der Position des Sauerstoff binden kann, oder eine kurze C&sub1;&submin;&sub4; Alkylgruppe als gerade oder verzweigte Kette.

6. Lösung nach Anspruch 5, wobei die organische Carbonsäure Lactat, Acetat, Pyruvat oder Citrat ist.

7. Lösung nach Anspruch 3, wobei die Lösung zusätzlich NaHCO&sub3; umfasst.

8. Verfahren zur Herstellung eines hitzesterilierten Blutersatzes, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

Placieren einer Lösung umfassend

0 bis 5 mM an K&spplus;-Ionen,

ein makromolekulares onkotisches Mittel;

eine organische Carbonsäure, deren Salz oder Ester;

und ein Zuckeres,

in einen hitzesterilisiererbaren Behälter;

erhöhen der Temperatur der unter Druck stehenden Lösung und für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um alle oder im wesentlichen alle Bakterien abzutöten und alle oder im wesentlichen alle Viren in der vorstehenden Lösung zu inaktivieren.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Lösung als Blutersatz oder Plasmaextender zur Infusion in ein Subjekt geeignet ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 mit der Maßgabe, daß die Lösung keinen konventionellen biologischen Puffer enthält.