DE69930164T2 - Intein-vermittelte cyclisierung von peptiden - Google Patents

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Description

  • Bezugnahme auf verwandte Anmeldungen
  • Die vorliegende Erfindung nimmt die Priorität der US-Provisional Patentanmeldung Nr. 60/112,723, eingereicht am 18. Dezember 1998 und der US-Provisional Patentanmeldung mit dem Titel „Production of Cyclic Peptides and Proteins In Vivo", eingereicht am 7. Oktober 1999 in Anspruch, die beide durch diese Bezugnahme hierin mitaufgenommen sind.
  • Bemerkungen bezüglich öffentlich geförderter Forschung
  • Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung mit der Beihilfe GM13306 und GM19891 vorgenommen, verliehen von den National Institutes of Health. Die Regierung hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft das Gebiet der Biochemie. Die Erfindung betrifft insbesondere zyklische Peptide, Verfahren zur Herstellung von zyklischen Peptiden und Verfahren zum Screenen von zyklischen Peptiden bezüglich spezieller Eigenschaften.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Kleine lineare Peptide sind zur Untersuchung verschiedener physiologischer Phänomene von Nutzen, weil sie einen breiten Bereich biologischer Aktivitäten zeigen und in beinahe unbegrenzt variablen Sequenzen unter Verwendung herkömmlicher Techniken in einer Festphasensynthese und kombinatorischen Chemie synthetisiert werden können. Diese Qualitäten machen kleine lineare Peptide ebenfalls zum Identifizieren und Entwickeln neuer Arzneistoffe nützlich. Beispielsweise können große Bibliotheken bzw. Banken unzähliger unterschiedlicher kleiner linearer Peptide synthetisch hergestellt und danach bezüglich spezieller Eigenschaften in verschiedenen biologischen Assays gescreent werden. Siehe beispielswiese Scott, J. K. und G. P. Smith, Science 249:386, 1990; Devlin, J. J., et al., Science 24:404, 1990; Furka, A. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 37:487, 1991; Lam, K. S., et al., Nature 354:82, 1991. Solche Peptide innerhalb der Bank, die die spezielle Eigenschaft zeigen, können dann als Kandidaten für weitere Untersuchungen isoliert werden. Eine Mikrosequenzierung oder andere chemische Analysen können dann dazu verwendet werden, ausgewählte Peptide beispielsweise durch Aminosäuresequenz zu charakterisieren. Trotz dieser Vorteile wurde nur eine Hand voll kleiner linearer Peptide zu weithin verwendeten pharmazeutischen Arzneistoffen entwickelt. Ein Grund hierfür besteht darin, dass kleine lineare Peptide üblicherweise zu rasch aus dem Körper entfernt werden, um einen therapeutischen Nutzen zu besitzen.
  • Der Ringschluss oder die Zyklisierung können die Geschwindigkeit reduzieren, in der Peptide in vivo abgebaut werden und verbessern deswegen dramatisch ihre pharmakokinetischen Eigenschaften. Der große Teil der zyklischen Peptide, die einen therapeutischen Wert besitzen, wurden nach Isolierung aus natürlichen Quellen identifiziert (beispielsweise Caclitonine, Oxytocin und Vasopressin). Leider ist der Pool natürlich existierender zyklischer Peptide, der bezüglich einer speziellen biologischen Eigenschaft gescreent werden kann, inhärent beschränkt. Und darüber hinaus machen die beschwerlichen Schritte, die zum Isolieren und Aufreinigen zyklischer Peptide aus natürlichen Quellen erforderlich sind, solche Screenings kostenintensiv und unpraktisch. Somit würden Syntheseverfahren zur Erzeugung großer Anzahlen unterschiedlicher Peptide von unbegrenzt variablen Aminosäuresequenzen das Identifizieren spezieller zyklischer Peptide als Kandidaten für neue Arzneistoffe in großem Maße erleichtern.
  • Verschiedene Verfahren zum Erzeugen zyklischer Peptide wurden beschrieben. Beispielsweise wurden chemische Reaktionsvorschriften entwickelt, wie beispielsweise solche, die in den US-Patenten Nr. 4,033,940 und 4,102,877 beschrieben wurden, um zirkularisierte Peptide zu erzeugen. In anderen Techniken werden biologische und chemische Verfahren kombiniert, um zyklische Peptide zu erzeugen. Diese letzteren Verfahren schließen zunächst das Exprimieren linearer Präkursoren zyklischer Peptide in Zellen (beispielsweise Bakterien) ein, um lineare Vorläufer bzw. Präkursoren zyklischer Peptide zu erzeugen und danach ein exogenes Mittel zuzusetzen, wie beispielsweise eine Protease oder ein nukleophiles Reagenz, um diese linearen Präkursoren chemisch zu zyklischen Peptiden umzuwandeln. Siehe beispielsweise Camerero, J. A., und Muir, T. W., J. Am. Chem. Societey. 121:5597 (1999); Wu, H. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:9226 (1998).
  • Wenn sie einmal hergestellt sind, können solche zyklischen Peptide bezüglich ihrer pharmakologischen Aktivität gescreent werden. Beispielsweise kann eine Bibliothek hergestellt werden, die eine große Anzahl unterschiedlicher zyklischer Peptide enthält und kann danach bezüglich spezieller Eigenschaften gescreent werden, wie beispielsweise der Fähigkeit, an einen spezifischen Target bzw. Ziel-Liganden zu binden. Die Bibliothek wird mit dem Ziel-Liganden vermischt und solche Elemente der Bibliothek, die an den Ziel-Liganden binden, können isoliert und durch Aminosäuresequenzierung identifiziert werden. In ähnlicher Weise können Bibliotheken für zyklische Peptide zu Assays bezüglich einer spezifischen biologischen Aktivität zugesetzt werden. Solche zyklischen Peptide, die die biologische Aktivität modulieren, können dann isoliert und durch Sequenzieren identifiziert werden.
  • Leider können diese Screeningassays, weil der Schritt des Identifizierens der aktiven Peptide schwierig sein kann, sich als mühsam und zeitaufwendig erweisen. Beispielsweise erfordern Screeningassays üblicherweise einen Umkehr-Kartierungsschritt, weil die tatsächliche Menge an zyklischem Peptid, die an einen Target-Liganden bindet oder eine biologische Aktivität moduliert, üblicherweise so gering ist, dass sie nicht direkt sequenziert werden kann. Um dieses Problem zu vermeiden, kann eine Karte, die den physischen Ort der verschiedenen zyklischen Peptide, die die Bibliothek ausmachen, anzeigt, hergestellt werden. Teilmengen an zyklischen Peptiden aus den unterschiedlichen Orten werden dann auf entsprechende Orte innerhalb des Screeningassays übertragen; und solche Areale im Assay, die die gescreente Aktivität zeigen (beispielsweise eine Bindung oder Modulierung einer biologischen Aktivität) werden dann zu ihrer entsprechenden Lokalisierung in der Bibliothek bzw. Bank zurückdatiert. Die zyklischen Peptide in diesem Areal der Bibliothek können dann isoliert und sequenziert werden. Schwierigkeiten, die sich aus dem Bedarf einer räumlichen Auftrennung und den Beschränkungen ergeben, die durch die Probenhandhabung auferlegt werden, begrenzen die Anzahl der Kandidatenpeptide, die in einer gegebenen Zeitspanne gescreent werden können.
  • Die Zahl der Peptide, die in einem Assay gescreent werden kann, kann dramatisch erhöht werden, indem Zellen verwendet werden, die die Peptide exprimieren. Beispielsweise können Bakterien, die zum Exprimieren einer Bibliothek linearer Peptide entwickelt wurden, einem Screeningassay zugesetzt werden, und solche Bakterien, die die Gescreenten als charakteristisch exprimieren können direkt aus dem Assay aufgesammelt werden. Die aufgesammelten Bakterien können dann in großen Zahlen derart reproduziert werden, dass die ausgewählten linearen Peptide in großen Mengen hergestellt werden können, um ihre Identifizierung (beispielsweise durch Sequenzierung) und Produktion zu erleichtern. Die Herstellung und Screening kleiner linearer Peptidbibliotheken in vivo hat jedoch sich als etwas schwierig erwiesen, weil kleine lineare Peptide rasch durch normale zelluläre Stoffwechselprozesse abgebaut werden. Die Zyklisierung der Peptide kann dieses Problem umgehen, indem es die Peptide innerhalb einer Zelle stabil macht.
  • Trotz dem war diese intrazelluläre Produktion großer Bibliotheken zyklischer Peptide bis jetzt nicht möglich, weil im allgemeinen leicht durchzuführende Verfahren zum Zyklisieren von Peptiden in vivo nicht verfügbar waren. Beispielsweise verwendet ein bekanntes Verfahren zur Erzeugung zyklischer Peptide in vivo nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS)-Komplexe (Cane et al, Science 282:63, 1998). Derartige NRSP Komplexe jedoch sind weder leicht handzuhaben noch im allgemeinen zur Herstellung von mehr als einem einzigen zyklischen Peptid zu einem Zeitpunkt von Nutzen. Überdies ist anders als bei der ribosomalen Peptidsynthese, bei der die lineare Sequenz von Monomeren (Aminosäuren) durch die lineare Basensequenz im Nukleinsäuremolekül, das dieses codiert, vorgegeben ist, die lineare Sequenz der Monomere in einem Peptid, das durch das NRPS-Verfahren hergestellt wurde, durch die Untereinheitsorganisation des NRPS-Komplexes vorgegeben. Die Veränderung der Sequenz eines zyklischen Peptides, das durch NRPS hergestellt wurde, umfasst das Klonieren der Untereinheit(en), die die erwünschten Monomere einbeziehen und die Einführung der Untereinheit(en) in Wirtszellen, die bereits alle notwendigen Untereinheiten beherbergen. Die Herstellung einer Bibliothek unter Verwendung dieser Techniken würde die Einbringung von Kombinationen (sowohl in der Zusammensetzung als auch in der Reihenfolge) von NRPS Untereinheiten in Wirtszellen und das Entwickeln eines Verfahrens zur Sicherstellung erfordern, dass die Untereinheiten sich in korrekten supramolekularen Strukturen zusammenfügen.
  • HOLFORD M. ET AL.: ,Adding ,splice' to protein engineering' STRUCTURE, Band 6, l5 August 1998 (1998-08-15), Seiten 951-956, XP000864581 GB betrifft die Einführung eines „Spleißens" in die Proteintechnik.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es wurde ein allgemeines Verfahren zur in vivo Produktion und Screening zyklischer Peptidbibliotheken entdeckt. Bei diesem Verfahren ist ein Nukleinsäuremolekül derart konstruiert, dass eine Nukleotidsequenz, die das zu zyklisierende Peptid codiert am einen Ende mit einer Nukleotidsequenz flankiert ist, die den carboxyterminalen Anteil eines getrennten (= split) (oder trans) Inteins (C-Intein oder IC) und an einem anderen Ende mit einer Nukleotidsequenz flankiert ist, die den aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein oder IN) codiert. Die Expression des Konstrukts innerhalb eines Wirtssystems wie beispielsweise einer bakteriellen oder eukaryontischen Zelle hat die Produktion eines Fusionsproteins zur Folge. Die beiden getrennten Inteinbestandteile (d. h. IC und IN) des Fusionsproteins assemblieren dann um ein aktives Enzym zu bilden, das die Amino- und Carboxytermini zusammenspleißt, um ein Grundgerüst für ein zyklisches Peptid zu erzeugen. Die chemische Reaktion ist unten dargestellt. Mechanismus der inteinvermittelten Zyklisierung
    Figure 00050001
  • Die Bildung des aktiven Inteins aus den amino- und carboxyterminalen Fragmenten stabilisiert das Esterisomer einer Aminosäure an der Kontaktstelle bzw. Kreuzung zwischen dem N-Intein und dem zu zyklisierenden Peptid (in B oben, X=S oder 0). Wenn R=XH wird das Heteroatom aus dem C-Intein im Gleichgewicht gehalten, um den Ester anzugreifen und um ein zyklisches Ester-Zwischenprodukt (C) zu erzeugen. Die Inteinkatalysierte Aminosuccinimidbildung (D) setzt das zyklische Peptid (in der Lactonform) frei, das sich spontan umgruppiert, so dass das thermodynamisch vorteilhafte Grundgerüst (Lactamform) zyklische Peptidprodukt (E) gebildet wird. Dieses Verfahren kann angepasst werden, um die Auswahl oder das Screening zyklischer Peptide mit vorher bestimmten Eigenschaften zu erleichtern.
  • Demgemäß beansprucht die vorliegende Erfindung ein nicht natürlich vorkommendes Proteinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit einem ersten Anteil eines getrennten Inteins, einen zweiten Anteil eines getrennten (split) Inteins und ein Zielpeptid codiert, das zwischen dem ersten Anteil eines getrennten Inteins und dem zweiten Anteil eines getrennten Inteins eingebracht ist. Die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem erzeugt ein Polypeptid, das im Wirtssystem spontan spleißt, so dass sich eine zyklisierte Form des Zielproteins ergibt oder ein Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptids, wie beispielsweise ein aktives Inteinzwischenprodukt, ein Thioesterzwischenprodukt oder ein Lariat-Zwischensprodukt.
  • Sowohl der erste Anteil eines getrennten (Split-) Inteins als auch der zweite Anteil eines Splitinteins können aus einem natürlich vorkommenden Splitintein, wie beispielsweise Ssp DnaE gewonnen werden. Bei verschiedenen Variationen können ein oder beide Splitinteinanteile von nicht natürlich vorkommenden Splitinteinen, wie beispielsweise solchen gewonnen werden, die von RecA, DnaB, Psp Pol-I und Pfu-Inteinen abgeleitet sind.
  • In einem weiteren Aspekt beansprucht die Erfindung ein nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid mit einem ersten Anteil eines Splitinteins, einem zweiten Anteil eines Splitinteins, einem dritten Teil eines Splitinteins und einem vierten Anteil eines Splitinteins codiert. Dieses Molekül kann ein erstes Zielpeptid aufweisen, dass zwischen dem ersten Anteil eines Splitinteins und dem zweiten Anteil eines Splitinteins angeordnet ist, und ein zweites Zielpeptid wird zwischen dem dritten Anteil eines Splitinteins und dem vierten Anteil eines Splitinteins eingebracht. Der erste Anteil eines Splitinteins kann zum dritten Anteil eines Splitinteins komplementär sein, jedoch nicht zum zweiten Anteil eines Splitinteins, und der zweite Anteil eines Splitinteins kann zum vierten Anteil eines Splitinteins komplementär sein, jedoch nicht komplementär zum dritten Anteil eines Splitinteins.
  • Ebenfalls im Umfang der Erfindung ist ein Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül innerhalb der Erfindung umfasst. Die Expression des Vektors in einem Wirtssystem erzeugt ein Polypeptid, das im Wirtssystem spontan spleißt, so dass sich ein zyklisches Peptid oder ein Spleißzwischenprodukt ergibt. Der Expressionsvektor der Erfindung kann ebenfalls eine regulatorische Sequenz enthalten, die die Expression des Polypeptids im Wirtssystem erleichtert. Das Nukleinsäuremolekül des Vektors kann eine Nukleotidsequenz einschließen, die ein Peptid codiert, dass das Screening der zyklisierten Form des Zielpeptides bezüglich einer speziellen Eigenschaft erleichtert und/oder einer Nukleotidsequenz, die ein Peptid codiert, dass das Aufreinigen der zyklisierten Form des Zielpeptides aus dem Wirtssystem erleichtert. Der Expressionsvektor kann ebenfalls induzierbar sein.
  • Gemäß eines weiteren Aspektes umfasst die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, der ein Polypeptid mit einem Zielpeptid codiert, das ein erstes Ende fusioniert an einen ersten Anteil eines Splitinteins und ein zweites Ende, fusioniert an einen zweiten Anteil eines Splitinteins aufweist. Die Expressionsvektoren der Erfindung können ein Plasmid, eine Bakteriophage, ein Virus, ein lineares Nukleinsäuremolekül oder eine andere Art von Vektor sein.
  • Die Erfindung umfasst zusätzlich ein im wesentlichen reines Polypeptid mit einem ersten Anteil eines Splitinteins, einem zweiten Anteil eines Splitinteins und ein Zielpeptid, das sich zwischen dem ersten Anteil eines Splitinteins und einem zweiten Anteil eines Splitinteins befindet. Das Polypeptid kann alles sein, das spontan im Wirtssystem spleißt, um eine zyklisierte Form des Zielpeptids zu ergeben oder es kann ein Spleißintermediat sein.
  • Ebenfalls innerhalb der Erfindung liegt ein Wirtssystem, das ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung beherbergt. Das Wirtssystem kann ein Prokaryont, wie beispielsweise ein Bakterium, ein Archaebakterium, eine Eukaryonte wie beispielsweise eine Hefe oder eine Säugetierzelle, eine Pflanzenzelle, ein in vitro Transkriptions/Translationssystem oder ein Zelllysat sein.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Peptidmoleküls. Dieses Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: Bereitstellung eines isolierten Nukleinsäuremoleküls der Erfindung; Bereitstellen eines Wirtssystems; Einbringen des isolierten Nukleinsäuremoleküls in das Wirtssystem; und Exprimieren des isolierten Nukleinsäuremoleküls. In einer Variation hat der Schritt des Exprimierens des isolierten Nukleinsäuremoleküls die Produktion eines Polypeptids zur Folge, das spontan im Wirtssystem spleißt, um die zyklisierte Form des Zielpeptids zu ergeben. Dieses Verfahren kann ebenfalls den Schritt umfassen, die zyklisierte Form des Zielpeptides aus dem Wirtssystem aufzureinigen.
  • Gemäß einer weiteren Variation dieses Verfahrens hat der Schritt des Exprimierens des isolierten Nukleinsäuremoleküls die Produktion eines Spleißzwischenproduktes einer zyklisierten Form des Zielpeptids zur Folge. Dieses Verfahren kann ebenfalls den Schritt der Aufreinigung des Spleißzwischenproduktes einer zyklisierten Form des Zielpeptides aus dem Wirtssystem umfassen. Eine noch weitere Variation dieses Verfahrens schließt den Schritt ein, das zyklische Peptid aus dem Spleißzwischenprodukt zu bilden.
  • Gemäß eines weiteren Aspektes dieser Erfindung wird das Zielpeptid in einer zyklisierten Form im Wirtssystem in Abwesenheit eines exogen zugesetzten Mitteils wie beispielsweise einer Protease oder eines Thiols erzeugt.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek aus Peptidmolekülen. Dieses Verfahren involviert die Schritte der Bereitstellung einer Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von Zielpeptiden codieren, die heterogene Aminosäuresequenzen aufweisen; den Einbau jeweils der Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen in ein Expressionsvektor zur Bildung einer Vielzahl von Expressionsvektoren und die Expression der Expressionsvektoren im Wirtssystem. Die Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen ist zwischen ein Nukleinsäuremolekül, das einen ersten Anteil eines Splitinteins codiert und einem Nukleinsäuremolekül, das einen zweiten Anteils eines Splitinteins codiert, eingebracht, in jeder der gebildeten Expressionsvektoren derart, dass die Expression der Expressionsvektoren in einem Wirtssystem die Erzeugung einer Vielzahl von Peptidmolekülen, wie beispielsweise Polypeptiden zur Folge hat, die spontan im Wirtssystem spleißen, um zyklisierte Formen der Zielpeptide zu ergeben oder das Spleißen von Zwischenprodukten der zyklisierten Formen der Zielpeptide.
  • Und gemäß eines noch weiteren Aspektes schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening eines Peptidmoleküls nach einer vorherbestimmten Eigenschaft ein. Dieses Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: Bereitstellen eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polypeptid codiert, das einen ersten Anteil eines Splitinteins umfasst, einen zweiten Anteil eines Splitinteins umfasst und ein Zielpeptid umfasst, dass sich zwischen dem ersten Anteil eines Splitinteins und dem zweiten Anteil eines Splitinteins befindet; Bereitstellen des Wirtssystems; Einbringen des isolierten Nukleinsäuremoleküls in das Wirtssystem; Anordnen des Wirtssystems unter Bedingungen, die die Erzeugung des Peptidmoleküls verursachen; und Testen des Peptidmoleküls bezüglich vorherbestimmter Eigenschaften. Die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem erzeugt entweder eine zyklisierte Form des Zielpeptids, die sich aus einem spontanen Spleißen des Polypeptids im Wirtssystems ergibt oder ein Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptides.
  • Gemäß einer Variation dieses Verfahrens schließt die vorherbestimmte Eigenschaft die Fähigkeit ein, spezifisch ein Zielmolekül zu binden und der Schritt des Testens des Peptidmoleküls nach vorherbestimmten Eigenschaften schließt die Schritte ein (a) das Peptidmolekül mit dem Zielmolekül in Berührung zu bringen und (b) zu bestimmen, ob das Peptidmolekül an das Zielmolekül bindet. In einer weiteren Variation besteht die vorherbestimmte Eigenschaft darin, eine biochemische Reaktion zu modulieren und der Schritt des Testens des Peptidmoleküls nach vorherbestimmten Eigenschaften umfasst den Schritt (a) das Peptidmolekül mit einem System in Berührung zu bringen, dass die biochemische Reaktion enthält und (b) zu bestimmen, ob das Peptidmolekül die biochemische Reaktion moduliert. Der Schritt der Bestimmung, ob das Peptidmolekül an einem Zielmolekül bindet oder eine biochemische Reaktion moduliert, kann durch Beobachten einer Farbveränderung, eines Fluoreszenzsignals, durch Analysieren des Zellzyklus oder der Reproduktion eines Organismus gemessen werden.
  • Das Zielmolekül in diesem Verfahren kann ein zellassoziiertes Molekül sein, wie beispielsweise ein membranassoziiertes Molekül oder ein intrazelluläres Molekül (beispielsweise ein Kernmolekül oder ein oder mehrere Organellen, wie beispielsweise Mitochondrien, Lysosomen, endoplasmatische Reticula, Chloroplasten, Golgi und Periplasma). Es kann ebenfalls ein extrazelluläres Molekül sein.
  • Die biochemische Reaktion kann ein zellassoziierter Prozess sein, wie beispielsweise ein intrazellulärer Stoffwechselvorgang, ein membranassoziierter Vorgang, ein kernassoziierter Vorgang. Es kann ebenfalls eine extrazelluläre Reaktion sein.
  • In diesem Verfahren kann der Schritt des Testens des Peptidmoleküls bezüglich einer vorherbestimmten Eigenschaft unter Verwendung eines Hybridsystems durchgeführt werden und/oder des Schrittes einer Immobilisierung des Peptidmoleküls an einem Festphasenträger.
  • Die Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zum Aufreinigen eines zyklischen Peptides aus einem Gemisch. Dieses Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: Bereitstellen eines Gemisches, das ein Spleiß-Zwischenprodukt enthält, konjugiert mit einem Affinitäts-Marker; Vermischen des konjugierten Spleiß-Zwischenproduktes mit einem Festphasenträger, der daran einen Liganden aufweist, der spezifischen an den Affinitätsmarker derart bindet, dass der Träger spezifisch mit dem Spleißzwischenprodukt gebunden wird; Waschen des Trägers zur Entfernung und spezifisch gebundenen Materials vom Träger; Zusetzen eines Reagenzes zum Träger, das ein zyklisches Peptid aus dem Spleißzwischenprodukt herstellt; und Eluieren des zyklischen Peptids vom Träger.
  • In einer Variation des vorhergehenden schließt die Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Aufreinigen eines zyklischen Peptides aus einem Gemisch ein, das die folgenden Schritte einschließt: Bereitstellen eines Gemisches, das ein Spleißzwischenprodukt konjugiert mit einem Affinitätsmarker aufweist; Vermischen des konjugierten Spleißintermediats bzw. Zwischenproduktes mit einem Festphasenträger, der daran einen Liganden aufweist, der spezifisch den Affinitätsmarker derartig bindet, dass der Träger spezifisch mit dem Spleißzwischenprodukt gebunden wird; Waschen des Trägers zur Entfernung von unspezifisch gebundenen Material vom Träger; Eluieren des Spleißzwischenproduktes vom Träger; und Zusetzen eines Reagenzes zum eluierten Spleißzwischenprodukt, das ein zyklisches Peptid auf dem Spleißzwischenprodukt herstellt.
  • Zusätzlich in der Erfindung eingeschlossen ist ein Verfahren zur Aufreinigung eines C-Moleküls, das ein Spleißzwischenprodukt aus einem Gemisch bindet. Dieses Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: Bereitstellung eines Festphasenträgers, der daran spezifisch gebunden das Spleißzwischenprodukt aufweist; Inberührungbringen des Trägers mit einem C-Molekül im Gemisch; Waschen des Trägers zur Entfernung und spezifisch gebundenen Materials vom Träger; und Eluieren des Zielmoleküls vom Träger.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Satz „nicht natürlich vorkommend" direkt oder indirekt hergestellt oder so hergestellt, dass eine humane Wirkung verursacht wird. Somit ist ein nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül eines, das durch menschliche Manipulation erzeugt wurde und nicht durch natürliche evolutionäre Prozesse.
  • Der Begriff „Nukleinsäuremolekül" bedeutet irgendeine Kette von zwei oder mehr Nukleotiden, die in Folge gebunden sind. Beispielsweise kann ein Nukleinsäuremolekül eine DNA oder eine RNA sein.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „Peptid" eine Kette von zwei oder mehreren Aminosäuren, die in Folge gebunden sind und schließt Polypeptide und Proteine ein. Der Begriff „Polypeptid" bedeutet ein Polymer, das aus zwei oder mehreren Peptiden besteht, unabhängig von der Länge oder von einer post-translationalen Modifikation. Der Begriff „Protein" bedeutet irgendeine Kette von Aminosäuren und schließt Peptide, Polypeptide, Proteine und modifizierte Proteine, wie beispielsweise Glycoproteine, Lipoproteine, Phosphoproteine, Metalloproteine und dergleichen ein.
  • Ein „lineares Peptid" ist ein Peptid, dass nicht in ringförmiger Form vorliegt und weist im allgemeinen sowohl eine carboxyterminale Aminsosäure mit einem freien Carboxy-Terminus als auch eine aminoterminale Aminosäure mit einem freien Amino-Terminus ein.
  • Im Vergleich ist ein „zyklisches Peptid" ein Peptid, das „zyklisiert" wurde. Der Begriff „zyklisch" bedeutet, dass Atome von Bestandteilen vorliegen, die einen Ring bilden. Wenn ein Peptid bezeichnet wird, soll der Begriff „Zyklisieren" bedeuten, dass das Peptid in eine zyklische oder „zyklisierte" Form ungewandelt wird. Somit ist beispielsweise ein lineares Peptid „zyklisiert", wenn sein freier Aminoterminius kovalent an seinen freien Carboxyterminus (d. h. Kopf an Schwanz Format) gebunden ist, so dass keine freien Carboxy- oder Aminoterminii im Peptid verbleiben.
  • Wie hierin verwendet, ist ein „Spleißzwischenprodukt" ein Polypeptid, dass während der Intein-vermittelten Zyklisierungsreaktion erzeugt wird, die oben dargestellt ist, vor der Bildung des freigesetzten zyklischen Peptidproduktes. Spleißzwischenprodukte schließen „aktive Intein-Zwischenprodukte" (d. h. solche mit einer chemischen Struktur, die dem in der obigen Abbildung als „A" markierten Polypeptid ähnlich sind), „Thioesterzwischenprodukte" (d. h. solche mit einer chemischen Struktur, die den in der obigen Abbildung als „B" markierten Polypeptid ähnlich ist) und „Lariatzwischenprodukte" (d. h. solche mit einer chemischen Struktur, die dem in der obigen Abbildung als „C" markierten Polypeptid ähnlich sind) ein.
  • Der Begriff „Zielpeptid" soll ein Peptid bedeuten, dass zyklisiert oder in einem Spleißzwischenprodukt dargeboten werden soll. Beispielsweise wäre ein Peptid, dass sich zwischen einem carboxyterminalen Anteil eines Splitinteins und einem aminoterminalen Anteil eines Splitinteins in einem Vorläuferprotein befindet ein Zielpeptid, wenn das Peptid nach Spleißen des Vorläuferproteins zyklisiert wird oder ein Teil eines Spleißzwischenproduktes nach Verarbeitung bzw. Prozessierung (beispielsweise Faltung) des Vorläuferproteins wird.
  • Wie hierin verwendet bedeutet das Wort „Intein" eine natürlich vorkommende oder künstlich konstruierte Polypeptidsequenz, die innerhalb eines Vorläuferproteins eingebettet ist, die eine Spleißreaktion während der post-translationalen Prozessierung des Proteins katalysieren kann. Eine Liste bekannter Inteine ist unter http://neb.com/inteins.html veröffentlicht. Ein „Splitintein" ist ein Intein, dass zwei oder mehrere getrennte Bestandteile aufweist, die nicht aneinander fusioniert sind.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „dazwischen angeordnet" sich dazwischen befinden. Somit ist einem Polypeptid, das ein erstes Peptid angeordnet zwischen einem zweiten und einem dritten Peptid aufweist, die Kette der Aminosäuren, die das erste Peptid ausmachen, physisch zwischen der Kette der Aminosäuren, die das zweite Peptid ausmachen und der Kette der Aminosäuren, die das dritte Peptid ausmachen, angeordnet.
  • Eine Vielzahl von Peptiden mit „heterogenen Aminosäuresequenzen" bedeutet, dass die Vielzahl von Peptiden aus zumindest zwei, jedoch im allgemeinen einer größeren Anzahl von unterschiedlichen Peptiden unterschiedlicher Aminosäuresequenzen zusammengesetzt ist.
  • Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Wirtssystem" irgendein Medium oder Träger, bei dem ein Nukleinsäuremolekül transkribiert, repliziert und/oder translatiert werden kann; und/oder irgendein Medium oder Träger, in den ein Polypeptid gespleißt oder in anderer Weise post-translational prozessiert werden kann.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet das Wort „spontan", dass die beschriebene Wirkung ohne Zusatz einer exogenen Substanz eintritt. Beispielsweise spleißt ein Vorläuferpolypeptid innerhalb eines Wirtssystems spontan im Wirtssystem, um ein zyklisches Peptid zu ergeben, wenn nichts dem Wirtssystem zugesetzt wird, als das Vorläuferpolypeptid oder ein Nukleinsäuremolekül, dass das Vorläuferpolypeptid codiert. Im Vergleich spleißt ein Vorläuferpolypeptid innerhalb eines Wirtssystems nicht spontan im Wirtssystem, wenn ein Mittel von außen dem Wirtssystem zugeführt werden muss, um das zyklische Peptid zu erzeugen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Spleiß" oder „Spleißen", einen zentralen Anteil des Polypetids zur Bildung von zwei oder mehreren kleinen Polypeptidmolekülen auszuschneiden. In einigen Fällen schließt das Spleißen ebenfalls den Schritt ein, zwei oder mehrere kleinere Polypeptide zusammen zu fusionieren, um ein neues Polypeptid zu bilden.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet das Wort „abgeleitet", direkt oder indirekt gewonnen von, isoliert von, aufgereinigt aus, abstammend von oder in anderer Weise sich aus etwas ergebend.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Satz „Expressionsvektor" einen Träger, der die Transkription und/oder Translation eines Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem erleichtert. Ein Expressionsvektor ist „induzierbar", wenn eine exogene Substanz einem Wirtssystem zugesetzt wird, das den Expressionsvektor enthält und verursacht, dass der Vektor exprimiert wird (beispielsweise verursacht es, dass ein Nukleinsäuremolekül innerhalb des Vektors in mRNA transkribiert wird).
  • Der Begriff „Expression von" einer Nukleinsäure bedeutet, dass die Nukleinsäure zu einem Polypeptid transkribiert und/oder translatiert und/oder repliziert wird.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „regulatorische Sequenz" eine Nukleotidsequenz, die die Expression „beispielsweise Transkription" eines Nukleinsäuremoleküls moduliert. Beispielsweise sind Promotoren und Enhancer regulatorische Sequenzen.
  • Der Begriff „fusioniert" bedeutet kovalent gebunden. Beispielsweise wird ein erstes Peptid an ein zweites Peptid fusioniert, wenn die beiden Peptide aneinander kovalent gebunden werden (beispielsweise über eine Peptidbindung).
  • Wie hierin verwendet, ist eine „isolierte" oder „im wesentlichen reinen" Substanz eine, die aus Bestandteilen abgetrennt wurde, die diese natürlicherweise begleiten. Typischerweise ist ein Polypeptid im wesentlichen rein, wenn es zumindest 50% (beispielsweise 60%, 70%, 80%, 90%, 95% und 99%) nach Gewicht frei von den anderen Proteinen und natürlich vorkommenden organischen Molekülen ist, mit denen sie natürlicherweise assoziiert ist.
  • Eine „Vorläufer-DNA" ist insbesondere Desoxyribonukleinsäure, aus der Mutationen hergestellt werden oder auf diesen basieren.
  • Der Begriff „Zielmolekül" bedeutet jedes Molekül, das verwendet wird, um die Bindung oder funktionellen Eigenschaften eines anderen Moleküls zu bestimmen.
  • Hierin bedeutet „binden" oder „bindet", dass ein Molekül ein anderes Molekül in einer Probe erkennt und an diesem anhaftet bzw. sich an dieses bindet, jedoch im wesentlichen nicht andere Moleküle in der Probe erkennt oder an diese bindet. Ein Molekül „bindet spezifisch" ein weiteres Molekül, wenn es eine Bindungsaffinität von mehr als 105 bis 106 Liter/Mol für das andere Molekül aufweist.
  • Ein „zellassoziierter Prozess" ist einer, der innerhalb einer Zelle oder in großer Nähe der Zelle stattfindet.
  • Ein „membranassoziiertes Ereignis" ist ein zellassoziierter Prozess, der auf der Plasmamembran einer Zelle stattfindet.
  • Ein „Kernereignis" ist ein zellassoziierter Prozess, der im Kern einer Zelle stattfindet.
  • Im Vergleich zu einem zellassoziierten Ereignis ist eine „extrazelluläre Reaktion" eine, die nicht innerhalb einer Zelle stattfindet.
  • Der Begriff „Hybridsystem" bedeutet zwei Hybridsysteme, reverse Zwei-Hybridsysteme, Einhybridsysteme, Split-Hybridsysteme, kleine Moleküle bzw. small molecule Hybridsysteme und alle ähnlichen Systeme zum Identifizieren von Interaktionen zwischen Peptiden und anderen Molekülen (beispielsweise Proteinen und Nukleinsäuremolekülen). Bezüglich eines Überblicks beispielhafter Hybridsysteme, siehe Vidal und Legrain, Nucleic Acids Res. 27:919, 1999.
  • Soweit nichts anderes definiert, weisen alle hierin genannten technischen Begriff dieselbe Bedeutung auf, wie sie üblicherweise vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet verstanden werden, den die Erfindung betrifft. Obwohl Verfahren und Materialien verwendet werden können, die den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, um die vorliegende Erfindung in der Praxis auszuführen oder zu testen, sind geeignete Verfahren und Materialien unten beschrieben. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere hierin erwähnten Bezugnahmen, sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen. Im Falle eines Konfliktes entscheidet die vorliegende Beschreibung einschließlich der Definitionen. Zusätzlich sind spezielle Ausführungsformen, die unten diskutiert werden, lediglich illustrativ und soll en nicht als Einschränkung gesehen werden.
  • Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und aus den Ansprüchen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die vorliegende Erfindung wird genau in den beiden beigefügten Ansprüchen dargelegt. Die obigen und weiteren Vorteile dieser Erfindung sind besser verständlich, indem auf die nachfolgende Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen Bezug genommen wird, in denen:
  • 1 eine schematische Darstellung eines Überblickes einer allgemeinen Zyklisierungsreaktion innerhalb der Erfindung ist.
  • 2 eine schematische Darstellung einer Reihe von chemischen Reaktionsschritten ist, die in einem Peptidzyklisierungsverfahren der Erfindung auftreten.
  • 3 ist eine Genkarte eines (a) Plasmides pARCB, (b) Plasmid pARCP-DHFR, (c), Plasmid pARCPAH-DHFR, (d) eines modifizierten Vektors, der ein Cystein (TGY) oder Serin (TCN) Codon aufweist, erzeugt durch Klonieren in den Mfel Ort (N repräsentiert eine Nucleobase, S repräsentiert C oder G und Y repräsentiert Pyrmindine), (e) Plasmid pARCP-p und (f) Plasmid pARCBD-p.
  • 4 ist eine fotographische Darstellung einer Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelectrophorose (SDS-PAGE)-Analyse einer Dehydrofolatreductase (DHFR) Zyklisierung auf einen 10-20% Gradienten, Tris/Glycin-Fertiggel (Biorad).
  • 5 ist eine graphische Darstellung einer DHFR Aktivität von Wildtyp (Dreiecke) und zyklischem DHFR (Rauten) Aktivität nach Präinkubation bei 365°C.
  • 6 ist eine schematische Darstellung der erwarteten Endoproteinase Lys-C Verdauungsmuster für lineare und zyklische DHFR.
  • 7 ist eine Fotographie von FeCuY Platten, die in einem in vivo Effekt verwendet werden, um die Tyrosinasehemmung durch Pseudostellarin F nachzuweisen.
  • 8 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Aufreinigung zyklischer Peptide im Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • 9 ist eine schematische Darstellung eines weiteren Verfahrens zur Aufreinigung zyklischer Peptide im Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • 10 ist eine schematische Darstellung eines Festphasenträger/Affinitätschromatographie basierten Verfahrens zum Identifizieren/Aufreinigen von Molekülen, die spezifischen an ein Spleiß-Zwischenprodukt binden.
  • 11 ist eine schematische Darstellung eines weiteren Festphasenträger/Affinitätschromatographie basierten Verfahrens zum Identifizieren/Aufreinigen von Molekülen, die spezifisch an ein Spleißzwischenprodukt binden.
  • 12 ist eine schematische Darstellung eines weiteren Festphasenträger/Affinitätschromatographie basierten Verfahrens zum Identifizieren/Aufreinigen von Molekülen, die spezifisch ein Spleißzwischenprodukt binden.
  • 13 ist eine schematische Darstellung eines weiteren Festphasenträger/Affinitätschromatographie basierten Verfahrens zum Identifizieren/Aufreinigen von Molekülen, die spezifisch ein Spleißzwischenprodukt binden.
  • 14 ist eine schematische Darstellung der Verwendung von Aptamergerüsten in der Erfindung.
  • 15 ist eine schematische Darstellung von zwei Reaktionen zur Herstellung von Aptameren im Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • 16 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Screening innerhalb der Erfindung.
  • 17 ist eine schematische Darstellung eines weiteren Verfahrens zum Screening innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • 18 ist eine schematische Darstellung eines weiteren Verfahrens zum Screening innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • 19 ist eine schematische Darstellung eines weiteren Verfahrens zum Screening innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Die Trans-Spleißfähigkeit von Splitinteinen wurde ausgebeutet, um ein allgemeines Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide und von Spleißzwischenprodukten zu entwickeln, die Peptide in einer Loop- bzw. Schlaufen-Konformation zeigen. In diesem Verfahren ist ein Zielprotein zwischen zwei Anteilen eines Splitinteins in einem Vorläuferpolypeptid angeordnet. In einem geeigneten Wirtssystem kommen die beiden Anteile des Splitinteins physisch zusammen und bilden ein aktives Intein in einer Konformation, die auch das Zielpeptid in eine Loop-Konfiguration zwingt. In dieser Konfiguration wird das Esterisomer der Aminosäure an der Grenze zwischen den einen Inteinanteilen (beispielsweise IN) und dem Zielpeptid derart stabilisiert, dass ein Heteroatom vom anderen Anteil des Inteins (beispielsweise IC) dann mit dem Ester reagieren kann, um ein zyklisches Esterzwischenprodukt zu bilden. Das aktive Intein katalysiert dann die Bildung eines Aminosuccinimids, das eine zyklisierte Form des Zielpeptids freisetzt (d. h. eine Lactonform), die sich dann spontan umordnet, um das thermodynamisch günstige Grundgerüst des zyklischen Peptidproduktes zu bilden (d. h. die Lactamform). Durch Anhalten der Reaktion an gegebenen Punkten vor Freisetzung des zyklischen Peptides können Spleißzwischenprodukte, die das Zielpeptid in einer Loop-Konfiguration tragen, erzeugt werden. Um derartige Peptide zu erzeugen, können Nukleinsäuremoleküle, die ein Polypeptid mit der Zielpeptidsequenz zwischen den beiden Inteinanteilen eingefügt, konstruiert werden. Die Einbringung dieser Konstrukte in einen Expressionsvektor stellt ein Verfahren zur Erzeugung des Polypeptids in einem Wirtssystem bereit, wobei das Polypeptid zu einem zyklischen Peptid oder einem Spleißzwischenprodukt gespleißt werden kann. Unter Anwendung dieses Verfahrens können mehrere unterschiedliche zyklische Peptide oder Spleißzwischenprodukte hergestellt werden, um eine Bibliothek von zyklisierten oder teilweise zyklisierten Peptiden zu erzeugen, die für spezielle Eigenschaften gescreent werden können.
  • Unter Bezugnahme auf 1 schließt ein Überblick über eine Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines zyklischen Peptides aus einem Nukleinsäuremolekül ein. In diesem Verfahren wird ein Nukleinsäuremolekül so hergestellt, dass seine Nukleotidsequenz ein Polypeptid codiert, dass eine aufeinanderfolgende Reihenfolge eines ersten Anteils eines Splitinteins (beispielsweise IC), eines zu zyklisierenden Peptids (d. h. ein Zielpeptid) und einen zweiten Anteil eines Splitinteins (beispielsweise IN) codiert. Das Nukleinsäuremolekül kann in einen Expressionsvektor eingebracht werden, um seine Expression in einem Wirtssystem zu erleichtern, worin die Nukleinsäure transkribiert und in ein Vorläuferpolypeptid translatiert werden kann, dass das zu zyklisierende Peptid zwischen zwei Splitinteinanteilen eingefügt aufweist. Durch die obigen Schritte kommen die beiden Anteile des Splitinteins zusammen und ordnen das Vorläuferprotein in einer Konformation an, die chemische Reaktionen beginnt, die letztendlich ein zyklisches Peptid zur Folge haben (siehe 2).
  • Nukleinsäuremoleküle
  • Nukleinsäuremoleküle innerhalb der Erfindung schließen solche ein, die ein Polypeptid mit einem ersten Anteil eines Splitinteins, einen zweiten Anteil eines Splitinteins und einem Zielpeptid codieren, das sich zwischen dem ersten Anteil eines Splitinteins und dem zweiten Anteil eines Splitinteins befindet. In einer Ausführungsform der Erfindung hat die Expression des Nukleinsäuremmoleküls in einem Wirtssystem ein Polypeptid zur Folge, das spontan im Wirtssystem spleißt, so dass sich eine zyklisierte Form des Zielpeptids ergibt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem ein Polypeptid zur Folge, das ein Spleiß-Zwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptids ist. Die Nukleinsäuren der Erfindung können gemäß der Verfahren hergestellt werden, die hierin beschrieben sind und können ebenfalls unter Verwendung der hierin vorgesehenen Anleitung in Verbindung mit Verfahren zur Herstellung und Manipulierung von Nukleinsäuremolekülen hergestellt werden, die allgemein in der Technik bekannt sind (siehe beispielsweise Ausubel et al., Herausgeber, Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley & Sons, 1997; Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (2nd Edition), Cold Spring Harbor Press, 1998). Beispielsweise kann ein Nukleinsäuremolekül innerhalb des Umfangs der Erfindung hergestellt werden, indem separat ein Polynukleotid hergestellt wird, dass den ersten Anteil eines Splitinteins codiert, ein Polynukleotid, das den zweiten Anteil eines Splitinteins codiert und ein Polynukleotid, das das Zielpeptid codiert. Die drei Polynukleotide können zusammen ligiert werden, um ein Nukleinsäuremolekül zu bilden, das ein Polypeptid codiert, dass das Zielpeptid zwischen dem ersten Anteil eines Splitinteins und dem zweiten Anteil eines Splitinteins eingebracht aufweist.
  • Nukleinsäuren, die Inteine codieren
  • Nukleotidsequenzen, die den ersten Anteil eines Splitinteins und den zweiten Anteil eines Splitinteins der Nukleinsäuremoleküle innerhalb der Erfindung codieren, können aus bekannten Inteinen abgeleitet werden. Eine reichhaltige und beschreibende Liste derartiger Inteine wurde durch das New England Biolabs unter http//wvvw.neb.com/intein/int_reg.html veröffentlicht. Jedes dieser bekannten Intein kann verwendet werden, solang sie mit der Erfindung kompartibel sind.
  • Nukleotidsequenzen, die entweder natürlich vorkommende oder künstlich produzierte Splitinteine codieren, können verwendet werden, um die Inteinanteile von Nukleinsäuremolekülen innerhalb der Erfindung zu erzeugen. Natürlich vorkommende Splitinteine werden in der Natur als zwei getrennte Komponenten expremiert, die aneinander binden um ein aktives Spleißmittel zu bilden. Die Nukleinsäuremoleküle, die diese natürlich vorkommenden Komponenten codieren, können somit in der Erfindung verwendet werden. Ein Beispiel eines natürlich vorkommenden Splitinteins, das verwendet werden kann, ist Ssp DnaE (Wu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226,1998).
  • Inteine, die in ihrem natürlichen Zustand (d. h. solche, die in einer kontinuierlichen Kette von Aminosäuren existieren), nicht getrennt bzw. gespalten bzw. gespleißt sind, können künstlich unter Verwendung bekannter Techniken getrennt werden. Beispielsweise können zwei oder mehr Nukleinsäuremoleküle, die unterschiedliche Anteile solcher Inteine codieren, hergestellt werden, so dass ihre Expression zwei oder mehr künstliche Splitinteinebestandteile mit sich bringt. Siehe Beispielsweise Evans et al, J. Biol. Chem. 274:18359, 1999; Mills et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543, 1998. Die Nukleinsäuren, die derartige nicht natürlich vorkommende Inteinbestandteile (Anteile) codieren, können in der Erfindung verwendet werden. Solche Nukleinsäuremoleküle, die nicht natürlich vorkommende Splitinteinanteile codieren, die effizient am selben Vorläuferpolypeptid interagieren, um zyklische Peptide oder Spleißzwischenprodukte zu ergeben, werden bevorzugt. Beispiele für nicht natürlich vorkommende Splitinteine, von denen solche Nukleinsäuremoleküle abgeleitet werden können, schließen Psp Pol-1 (Southworth, M.W., et al., The EMBO J. 17:918, 1998), Mycobacterium tuberculosis RecA Intein, (Lew, B.M., et al, J. Biol. Chem. 273:15887, 1998; Shingledecker, K., et al, Gene 207:187, 1998; Mills, K.V., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543, 1998) Ssp DnaB/Mxe GyrA (Evans, T.C. et al, J. Biol. Chem. 274:18359, 1999), und Pfu (Otomo et al, Biochemistry 38:16040, 1999; Yamazaki et al, J. Am. Chem. Soc. 120:5591, 1998).
  • Nukleinsäuren die Zielpeptide oder Peptide codieren die in Spleißzwischenprodukten gezeigt werden.
  • Zahlreiche Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren, die Peptide einer bekannten oder eine zufallsbedingten Sequenz codieren, sind in der Technik bekannt. Beispielsweise können Polynukleotide, die eine vorher bestimmte oder eine zufallsbedingte Sequenz aufweisen, chemisch durch Festphasensynthese unter Verwendung kommerziell erhältlicher Ausrüstung und Reagenzien hergestellt werden. Eine polymerase Kettenreaktion kann ebenfalls dazu verwendet werden, Polynukleotide bekannter oder zufallsbedingter Sequenzen herzustellen. Siehe beispielsweise Ausubel et al, oben. Als weiteres Beispiel können Restriktionsendonukleasen dazu verwendet werden, ein größeres Nukleinsäuremolekül oder sogar ganze chromosomale DNA in eine Vielzahl kleinerer Polynukleotidfragmenten enzymatisch aufzuspalten bzw. zu verdauen, die dazu verwendet werden können, Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung herzustellen.
  • Polynukleotide, die Peptidsequenzen codieren, die zyklisiert werden sollen, werden vorzugsweise so hergestellt, dass ein Terminus des Polynukleotides einen Asparagin-, Serin-, Cystein- oder Threoninrest codiert, um die Zyklisierungsreaktion zu vereinfachen. Aus demselben Grund werden Polynukleotide, die Peptidsequenzen zur Herstellung von Spleißzwischenprodukten codieren, vorzugsweise so hergestellt, dass der Terminus eine andere Aminosäure als Asparagin-, Serin-, Cystein oder Threonin-Reste codiert, so dass die Zyklisierungsreaktion vermieden wird.
  • Ligierung von Polynukleotiden die Inteinproteine und Zielpeptide oder Peptide codieren die Spleißzwischenprodukte zeigen
  • Wenn sie einmal etabliert sind, können die herkömmlichen Verfahren verwendet werden, Nukleinsäuremoleküle, die Inteinproteine codieren, an ein Nukleinsäuremolekül zu ligieren, das ein Zielpeptid (oder ein Peptid in einem Spleißzwischenprodukt) codiert, um ein größeres Nukleinsäuremolekül zu bilden, das ein Polypeptid codiert, das die erste Inteinanteil-Zielpeptid-zweite Inteinanteil-Reihenfolge aufweist. Siehe beispielsweise Ausubel et al, oben.
  • Nukleinsäuremoleküle, die vielfache Splitinteine und multiple Peptide codieren
  • Unter Verwendung von Techniken, die den oben beschriebenen ähnlich sind, könnte der Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls Nukleinsäure herstellen, die mehr als einen Satz von zwei Anteilen eines Splitinteins codieren, in dem Peptide eingebracht sind. Beispielsweise schließt die Erfindung Nukleinsäuremoleküle ein, die ein Vorläuferpolypeptidmolekül codieren, das N Polypeptide (N = eine ganze Zahl größer als oder gleich 1) umfassen und die N-Zielpeptide zwischen 2N Inteinproteinen eingefügt aufweisen, derart, dass irgendein Zielpeptid i (i = eine ganze Zahl größer als 1 und repräsentiert die Position eines Zielpeptids im Vorläuferpeptid) zwischen Inteinanteil 2i-1 und 2i eingefügt ist (beispielsweise befindet sich Zielpeptid 1 zwischen Inteinanteil 1 und 2, Zielpeptid 2 zwischen Inteinanteilen 3 und 4 etc.). Solange die Inteinproteine 2i-1 und 2i nicht komplementär sind (d. h. dazu in der Lage sind, physisch Wechsel zu wirken, um ein Spleißereignis zu katalysieren) kann das Zielpeptid i nicht zyklisieren. Wenn jedoch der Inteinanteil 2i mit dem Inteinanteil 2i+1 komplementär ist und der Inteinanteil 2n mit dem Inteinanteil 1 komplementär ist, kann die Gesamtanordnung von N Polypeptiden N-1 Trans-Spleißungen (zwischen 2 Polypeptiden) und eine Cisspleißung (Ligierung der beiden Enden aneinander) durchführen, um ein Produkt entstehen zu lassen, bei dem 1-N Zielpeptide covalent aneinander in einem zyklischen Peptid/Protein gebunden sind (beispielsweise Inteinanteile 2 & 3 transspleißen die Zielpeptide 1 und 2; die Inteinanteile vier & fünf transspleißen die Zielpeptide 2 & 3; die Inteinanteile 2N-2 & 2N-1 transspleißen die Zielpeptide N-1 & N; und die Inteinanteile N & 1 cis-spleißen um das zyklische Produkt zu schließen, das die N-Zielsequenzen enthält). Die Reihenfolge der Trans-/Cisspleißereignisse ist irrelevant. Die am langsamsten spleißende Spezies (gleichgültig, ob sie der komplementäre Inteinanteil 2N&1, 2&3 oder 80&81 ist) wird bei Fehlen das Cis-Spleißen durchführen.
  • Somit können Nukleinsäurekonstrukte hergestellt werden, die zwei oder mehrere Polypeptide exprimieren, die jeweils aus einem Zielpeptid zusammengesetzt sind, das sich zwischen zwei Anteilen eines Splitinteins befindet, wobei die Inteinbestandteile nicht komplementär sind (d. h. nicht vom selben Intein abgeleitet sind oder in anderer Weise kooperieren, um irgendeine der Zyklisierungsreaktionen zu katalysieren). In solchen Konstrukten kann kein Polypeptid zyklisiert werden, bis es in Gegenwart eines zweiten Polypeptids exprimiert wird, das den geeigneten komplementären Inteinbestandteil aufweist. Konstrukte solcher Nukleinsäuren innerhalb des Umfangs der Erfindung können nur eine Polypeptid pro Konstrukt oder mehr als ein Polypeptid pro Konstrukt codieren (beispielsweise ein bifunktionelles Plasmid).
  • Expressionsvektoren
  • Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung können durch Einfügen von Polynukleotiden, die ein Zielpeptid codieren, in einen geeigneten Expressionsvektor hergestellt werden, der die Expression des Polynukleotids in einem Wirtssystem erleichtert. Derartige geeignete Vektoren schließen Plasmide, Bacteriophagen und virale Vektoren ein. Eine große Anzahl von diesen ist in der Technik bekannt und viele sind kommerziell erhältlich oder aus der wissenschaftlichen Wissenschaftsgemeinschaft erhältlich. Der Fachmann auf dem Gebiet kann geeignete Vektoren zur Verwendung in einer speziellen Anwendung auf Grundlage beispielsweise der Art des ausgewählten Wirtssystems (beispielsweise in vitro Systeme, prokaryontische Zellen, wie beispielsweise Bakterien und eukaryontische Zellen, wie beispielsweise Hefe- oder Säugetierzellen) und den ausgewählten Expressionsbedingungen auswählen.
  • Expressionsvektoren im Umfang der vorliegenden Erfindung können eine Strecke von Nukleotiden einschließen, die ein Zielpolypeptid codieren und eine Strecke von Nukleotiden, die als regulatorische Domäne funktionieren, die Expression moduliert oder kontrolliert (beispielsweise die Transkription) von Nukleotidsequenzen innerhalb des Vektors. Beispielsweise kann die regulatorische Domäne ein Promotor oder ein Enhancer bzw. Verstärker sein.
  • Expressionsvektoren innerhalb der Erfindung können Nukleotidsequenzen einschließen, die ein Peptid codieren, dass das Screening der zyklisierten Form des Zielpeptids oder das Spleißen eines Zwischenproduktes bezüglich einer speziellen Eigenschaft (beispielsweise ein Affinitätsmarker, wie beispielsweise eine Chitinbindungsdomäne oder eine Biotinmarkierung; eine farb- oder lichtemittierende Markierung; eine radioaktive Markierung etc.) oder die Aufreinigung der zyklisierten Form des Zielpeptides oder des Spleißzwischenproduktes aus einem Wirtssystem (beispielsweise eine Affinitätsmarkierung, wie beispielsweise eine Chitinbindungsdomäne, eine Biotinmarkierung, eine farb- oder lichtemittierende Markierung, eine radioaktive Markierung etc.) erleichtert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen werden die Expressionsvektoren im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit Restriktionsorten sowohl zwischen als auch innerhalb der Nukleinsäuresequenzen hergestellt, die die Splitinteinanteile codieren, um die Klonierung einer breiten Vielzahl von Zyklisierungstargets oder Spleißzwischenprodukten zu ermöglichen. In einigen Ausführungsformen kann ein Expressionvektor der vorliegenden Erfindung ein induzierbarer Expressionsvektor, beispielsweise ein Arabinose induzierbarer Vektor sein. Solche Vektoren können zur Kontrolle der Expression von Zyklisierungsvorläufern oder Spleißzwischenprodukten innerhalb eines Wirtssystems verwendet werden. Weitere Vektoren können zur Verwendung in der Erfindung auf Grundlage Ihrer Kompatibilität mit bekannten bakteriellen Expressionsstämmen und Hybridsystemen ausgewählt werden. Siehe beispielsweise Zhang et al, Curr. Biol. 9:417, 1999; Pellitier et al, Nat. Biotechnol. 17:683, 1999; Karimova et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5752, 1998; Dmitrova et al, Mol. Gen. Genet., 257:205, 1998; Xu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:151, 1999, Rossi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8405, 1997.
  • Polypeptide
  • Polypeptide im Umfang der Erfindung schließen irgendwelche Polypeptide ein, die durch Expression einer Nukleinsäure der Erfindung hergestellt werden können. Beispielsweise ist ein im wesentlichen reines Vorläuferpolypeptid, das ein Zielpeptid aufweist (oder ein Peptid, das von einem Spleißzwischenprodukt dargeboten wird) zwischen dem ersten Anteil eines Splitinteins und dem zweiten Anteils eines Splitinteins eingefügt ist, in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. In einigen Ausführungsformen des Vorläuferpolypeptids kann das Zielpeptid direkt an den ersten und zweiten Inteinanteilen fusioniert werden. Das Vorläuferpolypeptid spleißt spontan im Wirtssystem, so dass sich eine zyklisierte Form des Zielpeptids ergibt (oder ein Spleißzwischenprodukt, das ein Peptid zeigt).
  • Zyklisierte Formen von Zielpeptiden und Spleißzwischenprodukte, die Peptide darbieten, liegen ebenfalls innerhalb der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise werden diese durch Spleißen bzw. Spalten eines Vorläuferpeptids der Erfindung produziert. Die zyklisierten Formen der Zielpeptide können irgendeine Aminosäuresequenz aufweisen, die durch die Verfahren der Erfindung zyklisiert werden können. Das Spleißzwischenprodukt kann ein aktives Inteinzwischenprodukt, eine Thioesterzwischenprodukt oder ein Lariatzwischenprodukt sein und kann ein Peptid irgendeiner kompatiblen Aminosäuresequenz zeigen.
  • Wirtssysteme
  • Wirtssysteme, die in der Erfindung verwendet werden können, schließen irgendwelche Systeme ein, die die Transkription, Translation und/oder Replikation eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung unterstützen; oder die eine posttranslationale Modifikation (beispielsweise Spleißen) eines Polypeptids oder Proteins der Erfindung unterstützen. Zahlreiche derartige Wirtssysteme sind bekannt. Beispielsweise kann das Wirtssystem in der Erfindung insbesondere wenn es wünschenswert ist, Artefakte oder Störungen zu vermeiden, die durch lebende Wirtssysteme verursacht sind, die Form eines in vitro Transkriptions-/Translationssystems einnehmen. Derartige Systeme können im Labor gemäß veröffentlichter Techniken hergestellt werden oder können kommerziell bezogen werden. Beispielsweise ist STP2-T7 (Katalo Nr. 69950-3) und STP-SP6 (Katalog Nr. 69997-3) von Novagen (Madison, WI) erhältlich. Promega (Madison, WI) vertreibt ebenfalls derartige Systeme (beispielsweise Katalog Nrn. L1170, L2080, L4600, L4610, L4130, L4140, L1130, L1020 und L1030, genausow wie Stratagene (La Jolla, CA), das ein System mit dem Markennamen IN VITRO EXPRESS (Katalog Nr. 200360) vermarktet. Nicht lebende Wirtssysteme zur Verwendung in der Erfindung können ebenfalls von einem lebenden Organismus gewonnen werden. Beispielsweise kann ein Zelllysat, wie beispielsweise ein Reticulocytlysat in einigen Anwendungen verwendet werden.
  • Wirtssysteme können ebenfalls die Form lebender Organismen einnehmen. Lebende Organismen werden für Wirtssysteme bevorzugt, weil diese üblicherweise in zahlreichen Kopien reproduziert werden können, wodurch eine kontinuierliche, leicht expandierbare und leicht manipulierbare Quelle ausgewählter Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt wird. Lebende Organismen, die als Wirtssysteme im Umfang der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Prokaryonten, wie beispielsweise Bakterien (beispielsweise Escherichia coli) und Eukaryonten, wie beispielsweise Hefe- und Säugetier- (beispielsweise Menschen, Maus, Rind, Schaf, Schwein etc.) Zellen ein. Archaebakterien, Pflanzenzellen und andere Organismen, die zur Verwendung mit den Verfahren der Erfindung geeignet sind, können ebenfalls als Wirtssystem dienen.
  • Das spezielle Wirtssystem, das für eine spezielle Anwendung am besten geeignet ist, variiert abhängig von den vielen unterschiedlichen Faktoren. Der Fachmann auf dem Gebiet jedoch sollte dazu in der Lage sein, ein geeignetes Wirtssystem für eine spezielle Anwendung auf Grundlage bekannter Anwendungen der unterschiedlichen Wirtssysteme auszuwählen. Wenn beispielsweise die Produktion eines zyklischen Peptids in großem Maßstab erwünscht wird, wäre ein bakterieller Wirt oder ein Insektenwirt geeignet. Wo es als weiteres Beispiel erwünscht ist, die Interaktion humaner Zellbestandteile zu analysieren, wäre die Anwendung einer humanen Zelle als Wirtssystem wahrscheinlich geeigneter als die Verwendung eines bakteriellen Systems.
  • Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, zyklischen Peptids oder eines Spleißzwischenproduktes
  • Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch konventionelle Verfahren der Herstellung von Polypeptiden einer bekannten Aminosäuresequenz hergestellt werden. Beispielsweise können Polypeptide innerhalb der Erfindung durch Festphasensynthese unter Verwendung kommerziell erhältlicher Geräte und Reagenzien hergestellt werden. Bekannte in vitro Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide können ebenfalls dazu verwendet werden, zyklische Peptide herzustellen. In vielen Fällen jedoch werden die Polypeptide der vorliegenden Erfindung vorzugsweise durch Exprimieren von Nukleinsäuremolekülen hergestellt, die dies in einem Wirtssystem codieren. Beispielsweise können Nukleinsäuremoleküle innerhalb der Erfindung in einen Expressionvektor eingebaut und dann in ein Wirtssystem eingebracht werden. Das Wirtssystem kann dann unter Bedingungen angeordnet werden, die die Expression des Vektors verursachen, was die Bildung eines Vorläuferpeptids und anschließend einer zyklisierten Form des Zielpeptids oder eines Spleißzwischenprodukts, das das Peptid zeigt, resultiert.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines zyklischen Peptides oder eines Spleißzwischenproduktes schließt die folgenden Schritte ein: (a) Bereitstellen eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, das ein Polypeptid mit einem Zielpeptid zwischen dem ersten Anteil eines Splitinteins und dem zweiten Anteil eines Splitinteins eingebracht aufweist; (b) Bereitstellen eines Wirtssystems; (c) Einbringen des isolierten Nukleinsäuremoleküls in das Wirtssystem; und (d) Exprimieren des isolierten Nukleinsäuremoleküls. Die Expression des Nukleinsäuremoleküls im Wirtssystem erzeugt das Peptidmolekül in Form eines Spleißzwischenproduktes einer zyklisierten Form des Zielpeptides oder ein Polypeptid, das spontan spleißt, um eine zyklisierte Form des Zielpeptids zu ergeben.
  • In bevorzugten Ausführungsformen dieses Verfahrens findet die Produktion des Polypeptids, der zyklischen Peptide oder der Spleißzwischenprodukte in vivo statt (beispielsweise mit einem lebenden Wirtssystem) und in Abwesenheit irgendeines exogen zugesetzten Mittels, wie beispielsweise eines Mittels zum katalysieren der Zyklisierung eines Peptids (beispielsweise einer Protease oder eines Thiols).
  • Die Herstellung von Polypeptiden, zyklischen Peptiden oder Spleißzwischenprodukten kann unter Verwendung von Standardtechniken zur Charakterisierung von Proteinen überwacht werden. Siehe beispielswiese Sambrook et al, oben. Beispielhafte Techniken, die dazu verwendet werden können, schließen herkömmliche Chromatographie, HPLC, FPLC und dergleichen ein. Eine Elektrophorese, wie beispielsweise Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgeleletrophorese (SDS/PAGE), 2-dimensionale Gelectrophorese, elektromagnetische strahlungsbasierte Spektroskopie, Massenspektroskopie; Analyse von enzymatischen Verdauungsprodukten; Thermostabilitätsassays; etc.
  • Die Aufreinigung von Polypeptiden zyklischen Peptiden oder Spleißzwischenprodukten der Erfindung
  • Herkömmliche Verfahren zur Aufreinigung von Proteinen können angepasst werden, um die Polypeptide, zyklischen Peptide und Spleißzwischenprodukte der Erfindung aufzureinigen. Die Erfindung schließt ebenfalls ein bevorzugtes Verfahren zur Aufreinigung eines zyklischen Peptids aus einem Gemisch ein. In diesem Verfahren ist ein Affinitätsmarker am zyklischen Peptid angebracht, um dessen Aufreinigung zu unterstützen. Dieses Verfahren schließt die folgenden Schritte ein: (a) Bereitstellen eines Gemisches, das ein zyklisches Peptid mit einem Affnitätsmarker konjugiert, enthält; (b) Mischen des konjugierten zyklischen Peptids mit einem Festphasenträger, der daran einen Liganden aufweist, der spezifisch den Affinitätsmarker so bindet, dass der Träger spezifisch mit dem zyklischen Peptid verbunden wird; (c) Waschen des Trägers zur Entfernung von nicht spezifisch gebundenem Material; und (d) Eluieren des zyklischen Peptids von dem Träger.
  • In diesen Verfahren kann der Affinitätsmarker irgendein Molekül sein, dass einen Liganden an einen Festphasenträger bindet. Beispielsweise kann der Affinitätsmarker eine Chitinbindungsdomäne sein, wobei der Ligand Chitin ist (siehe den Abschnitt Beispiele unten) oder kann eine Biotinmarkierung sein, wobei der Ligand Streptavidin ist. Viele andere Affinitätsmarker-Ligandenpaare sind bekannt und können in der Erfindung verwendet werden. Weil der Affinitätsmarker spezifisch den Liganden am Festphasenträger bindet, werden die zyklischen Peptide (mit dem gebundenen Affnitätsmarker) spezifisch den Träger binden. Der Träger kann dann mit einem Puffer gewaschen werden (beispielsweise salzreichen, saurem oder alkalischen Puffer), der Material im Gemisch entfernt, das nicht am Träger spezifisch gebunden ist. Das affinitätsmarkierte zyklische Peptid kann dann vom Festphasenträger unter Verwendung eines Puffers eluiert werden, der eine Substanz enthält, die die Markierung vom Liganden trennt (beispielsweise einen kompetitiven Inhibitor, wie beispielsweise überschüssigen unkonjugierten Affinitätsmarker; oder Denaturierungsmittel) oder ein Enzym oder chemische Reaktionspartner, den das zyklische Peptid vom Affinitätsmarker abspaltet.
  • In einer analogen Weise können Spleißzwischenprodukte eher als zyklische Peptide aufgereinigt werden. Zyklische Peptide können ebenfalls aus einem Gemisch unter Verwendung von Spleißzwischenprodukten aufgereingt werden. Beispielsweise schließt ein Verfahren zur Aufreinigung eines zyklischen Peptids aus einem Gemisch die folgenden Schritte ein: (a) Bereitstellen eines Gemisches, das ein Spleißzwischenprodukt konjugiert mit einem Affinitätsmarker enthält; (b) Mischen des konjugierten Spleißzwischenproduktes mit einem Festphasenträger, der daran einen Liganden aufweist, der spezifisch den Affinitätsmarker derart bindet, dass der Träger spezifisch mit dem Spleißzwischenprodukt gebunden wird; (c) Waschen des Trägers zur Entfernung von unspezifisch gebundenem Material; (d) Zusetzen eines Reagenzes zum Träger, der ein zyklisches Peptid aus dem Spleißzwischenprodukt herstellt; und (e) Eluieren des zyklischen Peptids vom Träger. Bei einer Variation des vorhergehenden werden die Schritte (d) und (e) umgekehrt, so dass Schritt (d) das Eluieren des Spleißzwischenproduktes vom Träger und Schritt (e) das Zusetzen eines Reagenzes zum eluierten Spleißzwischenprodukt ist, das ein zyklisches Peptid aus dem Spleißzwischenprodukt herstellt. Reagenzien, die zugesetzt werden können, um ein zyklisches Peptid aus einem Spleißzwischenprodukt herzustellen, schließen Thiole, Proteasen und andere Substanzen ein, die die Zyklisierung des Spleißzwischenproduktes katalysieren können.
  • Als spezielles Beispiel kann durch Fusionieren von IC an einen Affinitätsmarker und durch Entfernung des essentiellen Asparaginrestes (siehe d in 3) ein zyklischer Ester an einer Affinitätssäule immobilisiert werden. Die sich ergebende zyklische Peptidsäule kann zur Affinitätsaufreinigung des zyklischen Peptids selbst verwendet werden. Ein breiter Bereich von proteolytischen Verfahren kann verwendet werden, um den zyklischen Ester aus dem Affnitätsmarker und IC abhängig von der Sequenz des zyklischen Peptidproduktes freizusetzen.
  • Unter Bezugnahme auf 8 ist ein Verfahren zur Aufreinigung zyklischer Peptide dargestellt. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, um das katalytische Asparagin (Schritt A) durch eine nicht-katalytische Aminosäure (Y) zu ersetzen, und um einen Affinitätsmarker stromabwärts von IN (Schritt B) einzubringen, um Spezies 2 zu ergeben. Die intein-vermittelte Zyklisierungsreaktion wird fortschreiten, bis das Lariatzwischenprodukt gebildet ist (Schritt C). Dieses Molekül wird dann durch eine Affinitätssäule (Schritt D) mit einem Festphasenträger mit einem Liganden daran passiert, der spezifisch den Affinitätsmarker bindet und somit die Retention und Aufreinigung des IN/IC nicht-kovalenten Komplexes (Spezies 3) ermöglicht. Die IN/IC-Reaktion wird dann gestört, um ein Lariatzwischenprodukt (Spezies 4) zu ergeben, die aus der Affinitätssäule eluiert werden kann. Eine proteolytische oder chemische Spaltung an Aminosäure Y (Schritt F) setzt das Lactonzwischenprodukt (Spezies 5) frei. Acyl-an-N Umordnung (Schritt G) hat das thermodynamisch bevorzugte zyklische Amidprodukt zur Folge (Spezies 6).
  • Unter Bezugnahme auf 9 ist eine Variation des vorhergehenden Verfahrens zur Aufreinigung zyklischer Peptide dargestellt. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, um das katalytische Asparagin (Schritt A) durch eine nicht-katalytische Aminosäure (Y) zu ersetzen und einen Affinitätsmarker stromaufwärts von IC (Schritt B) einzubringen, um Spezies 2 zu ergeben. Die inteinvermittelte Zyklisierungsreaktion wird fortschreiten, bis sich ein Lariatzwischenprodukt gebildet hat (Schritt C). Dieses Molekül wird dann durch eine Affinitätssäule (Schritt D) passiert, die einen Festphasenträger mit einem Liganden daran aufweist, der spezifisch das Affinitätsmarker/IC-Zwischenprodukt bindet (Spezies 3). Die Auftrennung des Affinitätsmarkers (Schritt E) aus dem Liganden (beispielsweise unter Verwendung eines Moleküls, das kompetitiv die Marker-Liganden-Wechselwirkung hemmt, unter Verwendung eines salzreichen Puffers oder Denaturierungsmittels oder unter Verwendung eines chemischen Mittels oder einer Protease zur Spaltung des Markers) ermöglicht die Widergewinnung des Lariatzwischenproduktes (Spezies 4). Eine proteolytische oder chemische Spaltung an Aminosäure Y (Schritt F) setzt das Lactonzwischenprodukt (Spezies 5) frei. Eine Acyl-an-N Umordnung (Schritt G) ergibt das thermodynamisch bevorzugte zyklische Amidprodukt (Spezies 6).
  • Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek zyklischer Peptide und Spleißzwischenprodukte
  • Zahlreiche Verfahren zur Herstellung linearer Peptidbibliotheken sind in der Technik bekannt.
  • Modifikationen solcher bekannter Verfahren können mit den Verfahren zur Herstellung zyklischer Peptide und Spleißzwischenprodukte, die hierin gelehrt werden, verwendet werden, um Bibliotheken zyklischer Peptide und Spleißzwischenprodukte zu erzeugen. Im allgemeinen schließt ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek zyklischer Peptide und/oder von Spleißzwischenprodukten die folgenden Schritte ein: (a) Bereitstellen einer Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von Zielpeptiden mit heterogenen Aminosäuresequenzen codieren; (b) Einbauen jeweils der Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen in einen Expressionsvektor zur Bildung einer Vielzahl von Expressionsvektoren, wobei jeder der Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen zwischen einem Nukleinsäuremolekül, das einen ersten Anteil eines Splitinteins codiert und einem Nukleinsäuremolekül, das einen zweiten Anteil eines Splitinteins codiert, angeordnet wird, in jedem der gebildeten Expressionsvektoren, so dass die Expression der Expressionsvektoren in einem Wirtssystem die Erzeugung einer Vielzahl von Spleißzwischenprodukten zyklisierter Formen der Zielpeptide oder Polypeptide zur Folge hat, die spontan im Wirtssystem spleißen, so dass sich zyklisierte Formen der Zielpeptide ergeben; und (c) Expremieren der Expressionsvektoren im Wirtssystem.
  • Als spezifischere Beispiele können die in Childs et al, in Sequence Specificity in Transcription and Translation (Alan R. Liss, Inc., 1985) beschriebenen Verfahren und das Doppelstrangligationsverfahren beschrieben in Schumacher et al, Science 271:1854, 1996, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Bekannte PCR-basierte Verfahren können ebenfalls dazu verwendet werden, Polynukleotide zu erzeugen, die Peptide mit zufallsbedingten Sequenzen codieren, die zirkularisiert oder als Spleißzwischenprodukt in der Erfindung expremiert werden können. Siehe beispielsweise Caldwell und dJoyce, PCR Methods Appl. 2:22, 1992; Ostermeier et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562, 1999; Nested Deletion Protocol and Reagents from Promega; und Stemmer, W.P. Nature 370:389, 1994 (DNA shuffling). Die Vielzahl von Polynukleotiden, die Peptide mit heterogenen Sequenzen codieren, können das Zielpeptid (oder das in einem Spleißzwischenprodukt darzustellende Peptid) in die Nukleinsäuremoleküle und Expressionsvektoren der Erfindung wie oben beschrieben eingebaut werden und dann in einem Wirtssystem zur Herstellung einer Bibliothek zyklischer Peptide oder Spleißzwischenprodukte expremiert werden.
  • Verfahren zum Screenin eines zyklischen Peptides nach vorherbestimmten Eigenschaften
  • Es existieren zahllose Techniken zum Screening von kleinen Molekülen bzw. small molecules nach speziellen Eigenschaften. Siehe beispielsweise Fernades, P., Current Opin. Chem. Biol. 2:597, 1998, Science 286:1759, 1999; U.S. Patente Nrn. 5,585,277 und 5,989,814. Insbesondere sind ebenfalls Verfahren zur Bestimmung bekannt, welches Peptid in einer kombinatorischen Peptidbibliothek spezifisch an ein Zielprotein bindet.
  • Beispielsweise U.S. Patent Nr. 5,834,318. Viele dieser Verfahren können adaptiert werden, um zyklische Peptide und/oder Spleißzwischenprodukte, die mit den Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, nach speziellen Eigenschaften zu screenen.
  • Ein allgemeines Verfahren zum Screening eines Peptidmoleküls nach einer vorher bestimmten Eigenschaft schließt die folgenden Schritte ein: (a) Bereitstellen eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polypeptid mit einem Zielpeptid zwischen einem ersten Anteil eines Splitinteins und einem zweiten Anteil eines Splitinteins eingebracht aufweist, codiert, derart, dass die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem das Peptidmolekül entweder in zyklisierter Form des Zielpeptids (als Ergebnis eines spontanten Spleißens des Polypeptids im Wirtssystem) oder ein Spleißzwischenprodukt in einer zyklisierten Form des Zielpeptids erzeugt; (b) Bereitstellen des Wirtssystems; (c) Einbringen des isolierten Nukleinsäuremoleküls ins Wirtssystem; (d) Anordnen des Wirtssystems unter Bedingungen, die die Produktion des Peptidmoleküls verursachen; und (e) Testen des Peptidmoleküls bezüglich der vorher bestimmten Eigenschaft.
  • Schritt (a) kann wie anderswo beschrieben durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung von molekularbiologischen Techniken (siehe Ausubel et al und Sambrook et al, siehe oben), um Polynukleotide zu erzeugen, die das Zielpeptid, den ersten Anteil eines Inteins und den zweiten Anteil eines Inteins codieren. Die sich ergebenden drei Polynukleotide können dann fusioniert werden (beispielsweise ligiert), um ein Nukleinsäuremolekül zu bilden. Das bereitgestellte Wirtssystem kann irgendeines von denen sein, die hierin beschrieben wurden, bei denen das Nukleinsäuremoleküls (beispielsweise Bakterien, Hefe, Säugetierzelle) exprimiert werden kann. Die Nukleinsäure kann in ein Wirtssystem durch bekannte Verfahren abhängig von der Form des Nukleinsäuremoleküls und des verwendeten Wirtssystems eingebracht werden. Beispielsweise können die Nukleinsäuremoleküle in eine Zelle durch Elektroporation, Lipofection, unter Verwendung einer kalziumchloridvermittelten Transformation, unter Verwendung einer Gen"kanone" unter Verwendung eines Bacteriophagenvektors (wenn das Wirtssystem ein Bakterium ist) unter Verwendung eines Plasmidkonstruktes, unter Verwendung eines viralen Vektors etc. eingebracht werden.
  • Das Wirtssystem kann unter Bedingungen angeordnet werden, die verursachen, dass das Peptidmolekül durch Einstellen der Bedingungen gemäß der speziellen Form des Nukleinsäuremoleküls und des verwendeten Wirtssystems erzeugt wird. Für ein humanes Zell-Wirtssystem kann dies das Anordnen der Zelle in einem geeigneten nährstoffreichen Medium und das Kultivieren der Zelle in einem 37°C befeuchteten 5-10% CO2 Inkubator bedeuten. Für induzierbare Expressionsvektoren kann dies den Zusatz der Substanz zum Wirtssystem bedeuten, das die Expression des Nukleinsäuremoleküls im Vektor induziert. Beispielsweise kann dieser Schritt, wenn ein arabinoseinduzierbarer Expressionsvektor verwendet wird, den Zusatz von Arabinose zum Wirtssystem einschließen.
  • Das Testen des Peptidmoleküls bezüglich vorherbestimmter Eigenschaften kann durch eine große Vielzahl unterschiedlicher Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch Messen der Bindung des Peptidmoleküls an einen bekannten Liganden und Analysieren der Fähigkeit des Peptidmoleküls zu modulieren (d. h. Erhöhen oder Senken der Geschwindigkeit der (biochemischen) Reaktion. Bezüglich einer Beschreibung verschiedener Verfahren, die zum Testen von Peptiden nach vorherbestimmten Eigenschaften verwendet werden können, siehe Fernades, P., siehe oben.
  • Speziellere beispielhafte Verfahren, die dazu verwendet werden können, zyklische Peptide oder Spleißzwischenprodukte nach speziellen Eigenschaften zu screenen, schließen die Verwendung eines Festphasenträgers und einer Affinitätschromatographie zum Identifizieren von Molekülen ein, die spezifisch zyklische Peptide oder Spleißzwischenprodukte binden; die Verwendung der Phage Display Technologie; und die Verwendung von Aptamerpeptidfusionskonstrukten und/oder Hybridsystemen zum Identifizieren zyklischer Peptide oder von Spleißzwischenprodukten, die eine spezifische biochemische Reaktion oder ein intrazelluläres Ereignis modulieren können.
  • Festphasenträger/Affinitätschromatographie zum Identifizieren von Molekülen die mit zyklischen Peptiden und/oder Spleißzwischenprodukten interagieren
  • Zyklische Peptide oder Spleißzwischenprodukte können an einem Festphasenträger immobilisiert werden, um die Identifizierung und/oder Aufreinigung von Molekülen zu erleichtern, die spezifisch eingegebenes zyklisches Peptid oder Spleißzwischenprodukt binden. Bezüglich eines allgemeinen Überblicks von Peptidaffinitätssäulen zur Aufreinigung siehe Bumbach, G. A. und D. J. Hammon, Biopharm, 5:24, 1992. Unten sind Beispiele angegeben, wie dies im Rahmen der Erfindung durchgeführt werden kann.
  • Nunmehr bezugnehmend auf 10 ist ein Verfahren zum Identifizieren/Aufreinigen von Molekülen, die spezifisch ein gegebenes Spleißzwischenprodukt binden, dargestellt. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinintermediat bzw. Zwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, so dass das katalytische Asparagin (Schritt A) durch eine nichtkatalytische Aminosäure (Y) ersetzt wird und einen Affinitätsmarker stromaufwärts von IC (Schritt B) einzubringen, um Spezies 2 zu erzeugen. Die Intein-vermittelte Zyklisierungsreaktion wird fortschreiten, bis ein Lariatzwischenprodukt gebildet ist (Schritt C). Dieses Molekül wird dann durch eine Affinitätssäule (Schritt D) mit einem Festphasenträger mit einem Liganden daran passiert, der spezifisch den Affinitätsmarker/IC-Zwischenprodukt (Spezies 3) bindet. Eine Lösung, die Zielmoleküle enthält (d. h. Kandidaten zur Bindung des Spleißzwischenproduktes) wird dann durch die Säule passiert (Schritt E). Zielmoleküle, die spezifisch das Spleißzwischenprodukt binden, werden selektiv innerhalb der Säule zurückgehalten. Diese Zielmoleküle können aus der Säule entfernt und biochemisch analysiert (beispielsweise sequenziert) werden.
  • Nunmehr unter Bezugnahme auf 11 ist ein weiteres Verfahren zum Identifizieren/Aufreinigen von Molekülen, die spezifisch ein gegebenes Spleißzwischenprodukt binden, dargestellt. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, so dass das katalytische Asparagin (Schritt A) durch eine nichtkatalytische Aminosäure (Y) ersetzt wird und um ein Affinitätsmarker stromabwärts von IN (Schritt B) einzubringen, um Spezies 2 zu ergeben. Die inteinvermittelte Zyklisierungsreaktion wird fortschreiten, bis sich ein Lariatzwischenprodukt gebildet hat (Schritt C). Dieses Molekül wird dann durch eine Affinitätssäule (Schritt D) passiert, die einen Festphasenträger mit einem Liganden daran aufweist, der spezifisch den Affinitätsmarker bindet, um die Zurückhaltung bzw. Retention und Aufreinigung des IN/IC nicht-kovalenten Komplexes (Spezies 3) zu ermöglichen. Die Spaltung des Affinitätsmarkers (Schritt E) ermöglicht die Wiedergewinnung des Lariatzwischenproduktes (Spezies 4). Eine Lösung, die Zielmoleküle enthält (d. h. Kandidaten zur Bindung der Spleißzwischenprodukte) wird dann durch die Säule passiert (Schritt E). Zielmoleküle, die spezifisch das Spleißzwischenprodukt binden, werden selektiv innerhalb der Säule zurückgehalten.
  • Nunmehr bezugnehmend auf 12 ist ein weiteres Verfahren zum Identifizieren/Aufreinigen von Molekülen dargestellt, die spezifisch ein vorgegebenes Spleißzwischenprodukt binden. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, um das IN Nucleophil (Schritt A) durch eine nicht-katalytische Aminosäure (Z) zu ersetzen und einen Affinitätsmarker stromabwärts von IN (Schritt B) einzubringen, um ein IC-Peptid-IN-Markierungsfusionsprotein (Spezies 2) herzustellen. Die Intein-vermittelte Zyklisierungsreaktion erzeugt das Fusionsprotein (Schritt C). Dieses Protein wird dann durch eine Affinitätssäule (Schritt D) passiert, die einen Festphasenträger aufweist mit einem Liganden daran, der spezifisch den Affinitätsmarker bindet, um die Retention und Aufreinigung des Proteinkomplexes zu ermöglichen (Spezies 3). Eine Lösung, die Zielmoleküle enthält (d. h. Kandidaten zur Bindung der Spleißzwischenprodukte) wird dann durch die Säule (Schritt E) passiert. Zielmoleküle, die spezifisch das Spleißzwischenprodukt binden, werden selektiv innerhalb der Säule zurückgehalten.
  • Nunmehr bezugnehmend auf 13 ist ein noch weiteres Verfahren zum Identifizieren/Aufreinigen von Molekülen dargestellt, die spezifisch eingegebenes Spleißzwischenprodukt binden. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, so dass das IN-Nucleophil (Schritt A) durch eine nicht-katalytische Aminosäure (Z) ersetzt wird und ein Affinitätsmarker stromaufwärts von IC (Schritt B) eingebracht wird, um ein Markierungs-IC-Peptid-IN-Fusionsprotein (Spezies 2) zu ergeben. Die inteinvermittelte Zyklisierungsreaktion erzeugt das Fusionsprotein (Schritt C). Dieses Protein wird dann durch eine Affinitätssäule (Schritt D) passiert, die einen Festphasenträger mit einem Liganden daran aufweist, der spezifisch den Affinitätsmarker bindet und so die Retention und Aufreinigung des Proteinkomplexes ermöglicht (Spezies 3). Eine Lösung, die Zielmoleküle enthält (d. h. Kandidaten zur Bindung der Spleißzwischenprodukte) wird dann durch die Säule passiert (Schritt E). Zielmoleküle, die spezifisch das Spleißzwischenprodukt binden, werden selektiv innerhalb der Säule zurückgehalten.
  • Phage Display
  • Verfahren zum Screening von Molekülen unter Verwendung von Phage Display liegen ebenfalls innerhalb der vorliegenden Erfindung. Konventionelle Verfahren unter Verwendung von Phage Display können modifiziert werden, indem der Phage verwendet wird, um die zyklischen Peptide und/oder Spleißzwischenprodukte der Erfindung darzubieten. Wenn beispielsweise Z in 1 ein Phagenhüllprotein ist, und XH=H in 2 ist, wird die Spleißreaktion nicht über das erste Esterzwischenprodukt hinaus fortschreiten, wodurch sich ergeben wird, dass das Zielprotein als Schleife dargeboten wird. Auf diese Weise können Bibliotheken, die Phagenteilchen umfassen, die Schleifenzielpeptide zeigen, hergestellt und dazu verwendet werden, Moleküle zu isolieren, die die dargestellte Schleife binden. Beispielsweise kann ein Zielmolekül an einem Festphasenträger immobilisiert werden. Phagenbibliotheken, die unterschiedliche Schleifen-Peptide zeigen, können dann mit dem Träger vermischt werden. Solche Phagen, die Schleifen-Peptide zeigen, die das Zielmolekül binden, würden am Träger selektiv zurückgehalten. Nach Elution vom Träger (beispielsweise durch Spaltung der Esterbindung der durch den Phagen dargebotenen Schleifen bzw. Loop-Peptide mit hohen Konzentrationen eines wirkungsvollen Nucleophils) können die Aminosäuresequenzen der Loop-Peptide durch standardmolekularbiologische Verfahren bestimmt werden.
  • Aptamere
  • Peptidaptamere sind Polypeptide, die eine konformationell eingeengte Zielpeptidregion einer variablen Sequenz enthalten, die von einem Gerüst dargeboten wird. Weil zyklische Peptide oder Spleißzwischenprodukte als Aptamere dienen können, können bekannte Verfahren zum Analysieren von Aptameren modifiziert werden, um bei der Identifizierung spezieller Eigenschaften der zyklischen Peptide oder Spleißzwischenprodukte zu assistieren. Siehe beispielsweise Geyer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8567, 1999; Caponigro et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7508, 1998: Mikhail et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14266, 1998; Norman et al, Science 285:591 1999.
  • Beispielsweise, bezugnehmend auf 14 können zyklische Proteine als Apatamergerüste in einer Technik verwendet werden, die es Elementen einer Peptidbibliothek erlaubt, als eingeengte Schleifen bzw. Schlaufen zwischen dem N-Terminus und C-Terminus des zyklischen Proteingerüstes dargeboten zu werden. Wie in 14 dargestellt, kann eine Aptamerbibliothek als ein IC-Gerüst-IN Fusionsprotein (Spezies 1) exprimiert werden. Die Prozessierung der intein-vermittelten Zyklisierungsreaktion in vivo (Schritt A) ergibt ein IN, ein IC und ein zyklisches Gerüstprotein (Spezies 2). Die Aptamerbibliothek wird in der Linkerregion zwischen dem N-Terminus und dem C-Terminus dargeboten. In 14 repräsentiert N irgendeine Aminosäure und das tiefgestellte n und m sind ganze Zahlen gleich oder größer als 0, und X repräsentiert Serin, Threonin oder Cystein.
  • Andere Beispiele der Verwendung von Aptameren liegen ebenfalls innerhalb der vorliegenden Erfindung. Unter Bezugnahme auf 15 sind zwei derartige Verfahren beschrieben. In Reaktion I wird ein aktives Inteinzwischenprodukt mutagenisiert, um die nukleophile Aminosäure von IN (Schritt A) mit einer nicht-katalytischen Aminosäure (Z) zu ersetzen. Diese Prozesse inaktivieren die Spleißreaktion, um Spezies 2 zu ergeben. Wegen der starken Wechselwirkung zwischen IC und IN ermöglicht diese Technik den Elementen eine Peptidbibliothek als eingeengte Schlaufe in der Linkerregion zwischen den beiden Inteinproteinen (Target) dargeboten zu werden. In Reaktion II wird ein aktives Inteinintermediat mutagenisiert, um das katalytische Asparagin (Schritt A) durch eine nichtkatalytische Aminosäure (Y) zu ersetzen, so dass sich Spezies 2 ergibt. Das Fortschreiten der intein-vermittelten Zyklisierungsreaktion schreitet in vivo (Schritt B) fort und stoppt auf der Stufe des Lariatzwischenproduktes (Spezies 3) und ermöglicht den Elementen einer Peptidbibliothek als eingeengtes Lacton dargeboten zu werden.
  • Hybridsysteme
  • Das Hefe Zwei-Hybridsystem ist ein wohl untersuchtes Verfahren zur Analysierung von in vivo Protein-Proteinwechselwirkungen. Fields, S. und O. Song, Nature (London) 340:245, 1989. Dieses und Variationen hiervon, wie beispielsweise Ein-Hybridsysteme, Drei-Hybridsysteme, reverse Zwei-Hybridsysteme, Split-Hybridsysteme, alternative N-Hybridsysteme, Small Molecule basierte Hybridsysteme können dazu verwendet werden, die Eigenschaften zyklischer Peptide zu untersuchen und/oder von Spleißzwischenprodukten zu untersuchen, in dem bekannte Verfahren angepasst werden. Siehe beispielsweise Drees, B. L., Current Opin. Chem. Biol., 3:64, 1999; Vidal, M., and P. Legrain, Nucleic Acids Research, 27:919, 1999; Current Protocols in Molecular Biology, Ausg., Ausubel, F. m., et al, Wiley, New York, 1996; Huang, j. und S.L. Schreiber, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94:13396, 1997; Yang, M., et al, Nucleic Acids Res. 23: 1152, 1995; Colas, P., et al, Nature (London), 380:548, 1996; Xu, C. W., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 94:12473, 1997.
  • Beispielsweise liegt ein Verfahren zum Identifizieren eines Zielproteins, unter Bezugnahme auf 16, das mit einem Spleißzwischenprodukt interagiert, im Rahmen der vorliegenden Erfindung. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, um das katalytische Asparagin (Schritt A) durch eine nichtkatalytische Aminosäure (Y) zu ersetzen und eine DNA-Bindungsdomäne stromabwärts von IN (Schritt B) einzubringen, um Spezies 2 zu ergeben. Die inteinvermittelte Zyklisierungsreaktion wird fortschreiten, bis das Lariatzwischenprodukt (Spezies 3) gebildet ist (Schritt C). IN und IC bilden einen starken nicht kovalenten Komplex. Das sich ergebende Lariatzwischenprodukt wird dann mit einem Zielprotein koexprimiert, das an eine DNA Bindungsdomäne gebunden ist (Schritt D). Eine Interaktion des Lariatzwischenproduktes mit dem Zielprotein (Spezies 4) verursacht eine Aktivierung einer Promotorregion (Schritt E), was zur Expression des Reportergens (*) führt. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Zielmolekülen, die dazu in der Lage sind, das Lariatzwischenprodukt zu binden. Dieses Verfahren kann derart modifiziert werden, dass ein bekanntes Molekül (anstelle eines unbekannten Zielproteins) an eine DNA Bindungsdomäne gebunden wird, so dass Lariatzwischenprodukte identifiziert werden können, die ein Loop-Peptid darbieten, das das bekannte Molekül bindet. Unter Bezugnahme auf 14 ist ein weiteres Verfahren zum Identifizieren eines Zielproteins beschrieben, das mit einem Spleißzwischenprodukt wechselwirkt. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, um das katalytische Asparagin (Schritt A) durch eine nichtkatalytische Aminosäure (Y) zu ersetzen und eine DNA Bindungsdomäne stromaufwärts von IC (Schritt B) einzubringen, um Spezies 2 zu ergeben. Die inteinvermittelte Zyklisierungsreaktion wird fortschreiten, bis das Lariatzwischenprodukt (Spezies 3) gebildet ist (Schritt C). Dieses Molekül wird dann mit einem Zielprotein koexprimiert, das an eine DNA-Bindungsdomäne (Schritt D) gebunden ist. Eine Interaktion des Lariatzwischenproduktes mit dem Zielprotein (Spezies 4) verursacht eine Aktivierung einer Promotorregion (Schritt E), was zur Expression des Reportergens (*) führt. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung eines Zielmoleküls, das dazu in der Lage ist, das Lariatzwischenprodukt zu binden. Dieses Verfahren kann derart modifiziert werden, dass ein bekanntes Molekül (anstelle eines unbekannten Zielproteins) an eine DNA-Bindungsdomäne gebunden wird, so dass Lariatzwischenprodukte identifiziert werden können, die ein Loop-Peptid zeigen, das das bekannte Molekül bindet.
  • Unter Bezugnahme auf 18 ist ein weiteres Verfahren zum Identifizieren eines Zielproteins beschrieben, das mit einem Spleißzwischenprodukt wechselwirkt. In diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, so dass das IN-Nukleophil (Schritt A) durch eine nicht-katalytische Aminosäure (Z) ersetzt wird und das eine DNA-Bindungsdomäne (DBD) stromabwärts von IN eingebracht wird (Schritt B). Diese Verfahren werden die Spleißreaktion inaktivieren und werden ein IC-Peptid-IN-DBD Fusionsprotein (Spezies 2) erzeugen. Dieses Molekül wird dann mit einem Zielprotein koexprimiert werden, das an eine DNA-Bindungsdomäne gebunden ist (Schritt C). Die Interaktion des Fusionsproteins mit dem Zielprotein (Spezies 3) verursacht eine Aktivierung einer Promotorregion (Schritt D), was zur Expression des Reportergens (*) führt. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Zielmolekülen, die dazu in der Lage sind, das Fusionsprotein zu binden. Dieses Verfahren kann derart modifiziert werden, das ein bekanntes Molekül (anstelle eines unbekannten Zielproteins) an eine DNA-Bindungsdomäne so gebunden ist, dass Fusionsproteine identifiziert werden können, die ein Loop-Peptid darbieten, das das bekannte Molekül bindet.
  • Unter Bezugnahme auf 19 wird ein noch weiteres Verfahren zum Identifizieren eines Zielproteins beschrieben, das mit einem Spleißzwischenprodukt interagiert. Bei diesem Verfahren wird ein aktives Inteinzwischenprodukt (Spezies 1) mutagenisiert, so dass das IN-Nukleophil (Schritt A) durch eine nicht-katalytische Aminosäure (Z) mutagenisiert wird und so dass eine DNA-Bindungsdomäne stromaufwärts von IC (Schritt B) eingebracht wird. Diese Verfahren werden die Spleißreaktion inaktivieren und werden ein DBD-IC-Peptid-IN-Fusionsprotein erzeugen (Spezies 2). Dieses Molekül wird dann mit einem Zielprotein koexprimiert, das an eine DNA-Bindungsdomäne gebunden ist (Schritt C). Eine Interaktion des Fusionsproteins mit dem Zielprotein (Spezies 3) in Schritt D verursacht eine Aktivierung einer Promotorregion (Schritt E), was zur Expression des Reportergens (*) führt. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Zielmolekülen, die dazu in der Lage sind, das Fusionsprotein zu binden. Dieses Verfahren kann derart modifiziert werden, dass ein bekanntes Molekül (anstelle eines unbekannten Zielproteins) an eine DNA-Bindungsdomäne so gebunden wird, dass Fusionsproteine identifiziert werden können, die ein Loop-Peptid darbieten, das das bekannte Molekül bindet.
  • Targeting zyklischer Peptide und Spleißzwischenrpodukte In Vivo
  • Die zyklischen Peptide und Spleißzwischenprodukte im Umfang der Erfindung können speziell auf besondere Zellorte oder auf extrazelluläre Sekretion ausgerichtet werden, indem Modifikationen von Targetingverfahren angewendet werden, die in der Technik bekannt sind. Siehe beispielsweise Wilkinson et al, J. Membrane Biol., 155:189, 1997; Komiya et al, The EMBO J., 17:3886, 1998; Kouranov and Schnell, J. Biol. Chem. 271:31009, 1996; Bhagwat et al, J. Biol. Chem, 274:24014, 1999; Adam, S.A., Current Opin. Cell Biol. 11:402-406, 1999; Gorlich, D., Current Opin. Cell Biol. 9:412, 1997; Pemberton et al, Current Opin. Cell Biol. 10:292, 1998; Sakaguchi, M., Current Opin. Cell Biol. 8:595, 1997; Folsch et al., The EMBO J. 17:6508, 1998. Beispielsweise können verschiedene Signalpeptide an die zyklischen Peptide oder Spleißzwischenprodukte der Erfindung gebunden werden, um diese an vorher bestimmte Zellkompartimente zu lokalisieren oder dass diese in den extrazellulären Raum nach der Translation abgesondert werden. In dieser Weise können die zyklischen Peptide oder Spleißzwischenprodukte der Erfindung so auf zelluläre Orte, wie beispielsweise Mitochondrien, Lysosomen, endoplasmatische Reticula, Chloroplasten, Golgi, Periplasma, Kern, Plasmamembran, ausgerichtet werden. Dieses Verfahren zum Targeting kann ebenfalls in den Verfahren zur Erzeugung von Peptidbibliotheken und in den Verfahren zum Screening derartiger Bibliotheken verwendet werden, wo es wünschenswert ist, Moleküle zu identifizieren, die mit einer Aktivität an vorherbestimmten Zellorten interagieren oder diese zeigen.
  • Beispiele
  • Herstellung zyklischer Dihydrofolatreductase (DHFR und zyklischem Pseudostellarin F Materialien und Methoden
  • Vectorkonstruktion
  • Das Gen für das Ssp DnaE N-Intein (IN) wurde aus einer Ssp 6803 genomischen DNA mit Taq-Polymerase und Primern amplifiziert, die 5'-BglII und NsiI und 3'-PstI Restriktionsstellen einbrachten. Das Ssp DnaE IC-Gen wurde in ähnlicher Weise mit Primern amplifiziert, so dass 5'-NcI und 3'-NdeI und SacI Restriktionsstellen eingebracht wurden. Plasmid pDIMCP ergab sich aus dem individuellen Klonieren der Inteinfragmente in pDIMC7 (identisch zu pDIMC6 (siehe Ostermeier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562, 1999) außer der Konversion der BamHI Restriktionsstelle in BgIII). Eine Alinin zu Histidinmutation im IC-Gen (A35H) wurde eine Quick-Change Mutagenese (Stratagene) bewirkt, die pDIMCPAH zur Folge hatte. Ein Ausschneiden der Inteinfragmente als ein NcoI/PstI Digest und eine Ligation in pAR4 (abgeleitet von pAR3 (Perez-Perez, J. und J. Gutierrez, Gene, 158:141, 1995; American Type Culture Collection (ATCC), 87026) mit einer einmal vorkommenden NcoI Stelle in der multiplen Klonierungsstelle) erzeugte pARCP (a in 3) und pARCPAH. E. coli DHFR wurde aus pET22b-DHFR (Miller, G.P. und S. J. Benkovic, Biochemistry 37:6327, 1998) mit Primern amplifiziert, die einen 5'-NdelI Ort einbrachten, gefolgt von (CAC)6 (das sechs Histidinreste codierte) und einer 3'-PstI Stelle, digeriert mit NdeI/PstI und ligiert in NdeI/NsiI, digeriertes pARCP oder pARCPAH, um pARCP-DHFR (b in 3) und pARCPAH-DHFR (c in 3) zu erzeugen. Eine Polyhistidinsequenz wurde synthetisch mit NdeI, NsiI und BspMI Stellen hergestellt und in pARCPAH ligiert, um das Plasmid pARCP2-6H zu erzeugen, das Cyclo-[CHMHHHHHHGAGAA] codiert. Plasmid-pARCP-p wurde in drei Schritte aus pDIMCPAH erzeugt: (1) Quick-Change Mutagenese brachte eine AfIII Stelle in IN ein, und erzeugte pDIMCPMA; (2) das Pseudostellarin F Gen wurde synthetisch hergestellt und in MfeI/AfIII digeriertes pDIMCPMA eingebracht, um pDIMCP-p zu erzeugen; und (3) das Fusionskonstrukt wurde aus pDIMCP-p als ein NcoI/PstI Fragement ausgeschnitten und in NcoI/PstI digeriertes pAR4 ligiert, um pARCP-p (e in 3) zu erzeugen. Um das Plasmid pARCBD-p zu erzeugen, wurde eineKpnI Stelle am Carboxyterminus des IN-Gens von pARCP-p durch Quick-Change Mutagenese eingebracht, um pARCPpK zu erzeugen. Das Gen, das die Chitinbindungsdomäne codierte, wurde aus Plasmid pCYBI (New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts) mit Primern amplifiziert, die eine 5'KpnI Stelle und eine 3'HindII Stelle einbrachten. Sowohl das PCR Produkt, als auch pARCPpK wurden mit KpnI und HindIII digeriert und zusammen ligiert, um pARCBD-p (f in 3) zu erzeugen. Alle Enzyme waren von Promega oder New England Biolabs sowie nichts anderes erwähnt ist.
  • DHFR Aufreinigung
  • XL-1 Blue Zellen, die entweder pARCP-DHFR oder pARCPAH-DFHR beherbergten, wurden in LB Medium plus 50 μg/ml Chloramhenicol bei 37°C gezüchtet, bis die Kultur eine OD600 von 0,7 erreichte. Die Kultur wurde mit L-(+) Arabinose bis zu einer Endkonzentration von 0,5% induziert, und bei 28°C für 24 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (7000 × g, 10 Minuten) geerntet und im flüssigen Stickstoff tiefgefroren. Die Zellen wurden lysiert und die DHFR enthaltenden Proteine wurden wie beschrieben aufgereinigt (Miller und Benkovic, id). Das zyklische Produkt wurde von anderen DHFR-enthaltenden Intermediaten durch FLPC unter Verwendung einer Mono-Q Säule (Amersham Pharmacia) aufgetrennt, eluiert mit einem Gradienten von 0-1 M NaCL in 50 mM Tris-HCl über 30 Minuten. Ein Westernblotting wurde mit Anti-His (Qiagen) durchgeführt und mit Ziegen anti-maus-alkalische phosphatase-konkugierten Antikörpern (Pierce) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  • Endoproteinase Lys-C Digestion
  • Wildtyp oder zyklisches DHFR (50 μg) wurde mit 0,5 μg Endoproteinase Lys-C in 0,5 M NH4HCO3 bei 37°C behandelt. Die Proben wurden bei 6 und 24 Stunden entnommen, auf einem SDS/16% PAGE Gel visualisiert und einer matrixunterstützten, Laserdisorptionsionisierung (MALDI) time-of-flight mass Spektrometrie (Moore, W.T., Methods Enzymol, 289:520, 1997) unterworfen.
  • DHFR Assays
  • Die Thermostabilität wurde durch Präinkubation von 100 nM Wildtyp oder zyklischem DHFR bei entweder 25°C oder 65°C in MTEN Puffer (50 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), 25 mm Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), 25 mM Ethanolamin und l00 mM NaCl) untersucht. Teilmengen wurden bei verschiedenen Zeitpunkten entnommen und bei Raumtemperatur für fünf Minuten in Gegenwart von 100 μm 7,8-Diyhdrofolat equilibriert. Die Aktivitätsassays wurden mit einem reduzierten Nikotinamid Adenindinukleotid (NADHPH), wie kürzlich beschrieben, begonnen (Miller und Benkovic, siehe oben).
  • Synthese von Cyclo-(Ser-Gly-Gly-Tyr-Leu-Pro-Pro-Leu)
  • Einer Lösung von 3,5 mg (4 μmol) NH2-Ser-Gly-Gly-Tyr-Leu-Pro-Pro-Leu-Co2H und 1,8 mg (16 μmol) N-Hydroxysuccinimid in 20 ml Dimethylformamid wurden 3,0 mg (16 μmol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) zugesetzt. Die Reaktion wurde für 10 Stunden bei 25°C gerührt. Zusätzliche 3,0 mg EDC wurden dann zugesetzt und das Rühren wurde bei 25°C für weitere 10 Stunden fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand wurde in 2 ml Wasser zur Aufreinigung durch Umkehrphasen HPLC auf einer Whatman Partisil 10 ODS-3 9,4-mM X 50-cm Säule gelöst, eluiert mit einem linearen Gradienten von 0-50% (V/V) Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure/Wasser über 30 Minuten. Die geeigneten Fraktionen wurde lyophilisiert, so dass sich 2,8 mg (80%) eines weißen Feststoffes ergaben [m/z 785 (MH+)]. 1H-NMR und UV-vis Spektren des synthetisch hergestellten Materials waren mit veröffentlichten Spektren für das isolierte Naturprodukt konsistent (Morita, H., et al, Tetrahedron 50:9975, 1994).
  • Pseudostellarin F Aufreinigung
  • Die E. coli Stämme XL1-Blue, DH5a oder B121-DE3, die pARCP-p beherbergten, wurden gezüchtet, und wie zur DHFR Aufreinigungen beschrieben, geerntet. Die Medien (500 ml) wurden dreimal mit 1-Butanol (3 × 100 ml) extrahiert. Die Extrakte wurden kombiniert und abgedampft und der feste Rückstand wurde in 2 ml 0,1 M K2HPO4 (pH 8,0, Lysepuffer) resuspendiert. Die Zellen wurden in 10 ml Lysepuffer resuspendiert, beschallt und durch Zentrifugation geklärt (20 000 × g, 20 Minuten). Das Lysat wurde extrahiert (3 × 5 ml n-Butanol) und die Extrakte wurden kombiniert, abgedampft und in 500 μl Lysepuffer resuspendiert. Das rekombinante Produkt wurde aus einem Lysat und Medienextrakten durch HPLC wie oben beschrieben, aufgereinigt. Die Lyophilisation der geeigneten Fraktionen aus dem Lysat und den Medienextraktionen ergab einen öligen Rückstand, m/z 785,47 (MH+), 807,43 (MNa+) und 823,44 (MK+). 1H-NMR und UV-vis Spektren des rekombinanten Materials waren mit veröffentlichten Spektren für das isolierte Naturprodukt konsistent (Morita et al, siehe oben). Proteine, die an die Chitinbindungsdomäne fusioniert waren, wurden wie oben beschrieben durch Erzeugung des geklärten Lysates hergestellt. Das Lysat wurde über eine Chitinsäule (New England Biolabs, Inc.) passiert, die mit Lyse-Puffer equilibriert war. Die Säule wurde isokratische eluiert und Fraktionen, die Spleißzwischenprodukte enthielten, wurden gepoolt und einer MALDI Massenspektralanalyse unterworfen.
  • Tyrosinaseklonierung
  • Das Tyrosinasegen (einschließlich ORF 438) aus Streptomyces antibioticus (Bernan et al, Gene 37:101, 1985) wurde mit Vent-Polymerase von piJ702 (ATCC Nr. 35287) mit Primern amplifiziert, die 5'NdeI und 3'EcoRI Restriktionsstellen einbrachten. Das PCR Produkt wurde mit NdeI und EcoRi digeriert und in in ähnlicher Weise digeriertem pDIMN2 (Ostermeier et al., siehe oben) ligiert, um pDIMN-Y zu erzeugen. Transformierte Ligationsgemische wurden bei Umgebungstemperatur für 5 Tage gezüchtet und Kolonien, die Tyrosinase exprimierten, wurden durch Pigmentbildung auf FeCuY Platten identifiziert [LB Agarplatten, die Ampicillin (200 μg/ml), FeCl3·6H2O (0,2 mM), CuSO4·5H2O (0,2 mM), L-Tyrosin (0,3 mg/ml, Y) und Isopropyl-B-D-Galactosid (1mM)] (Della-Cioppa, G. et al., Biotechnology 8:634, 1990).
  • Ergebnisse
  • Design der Genkonstrukte
  • Die Gene, die Ssp IC und IN codierten, wurden aus genomischer Ssp Gen DNA durch molekularbiologische Standardverfahren amplifiziert (Sambrook et al, siehe oben) und in pDIMC7 seriell ligiert. Das sich ergebende Zyklisierungsvorläufer(CP)-Fragment wurde aus pDIMC7 ausgeschnitten und dem AraB Promotor von pAR3 benachtbart kloniert, um die pARCP Vektorreihe (3) zu erzeugen. Diese Vektoren aktivieren die Expression von zyklischen Vorläufern in Gegenwart von Arabinose. Das E. coli DHFR-Gen wurde zwischen den NdeI und NsiI Stellen von pARCP kloniert, um eine In-Frame-Fusion mit jedem der Splitinteingene (b und c in 3) zu erzeugen. Der PCR-Primer, der zum Amplifizieren von DHFR verwendet wurde, brachte ebenfalls eine Sequenz ein, die einen Sechs-Histidin-Marker am 5'-Ende des DHFR Gens codierte, um eine Immundetektion der zu zyklisierenden Region zu ermöglichen. Zwei DHFR Konstrukte wurden assembliert, um die Rolle des vorletzten Restes von IC in der Säure/Base-Katalyse einer Asparaginseitenkettenzyklisierung zu untersuchen. Das Plasmid pARCP-DHFR (b in 3) codiert Wildtyp IC, das einen Alaninrest benachbart dem terminalen Asparagin aufweist. Plasmid pARCPAH-DHFR (c in 3) incorporiert eine Alanin-an-Histidin-Mutation an der vorletzten Position im IC-Gen. Um Pseudostellarin-F (Cyclo-[SGGYLPPL]) zu erzeugen, wurde der Vektor durch stille Mutation modifiziert, um eine AfIII Stelle am 5'-Ende des IN-Gens (d in 3) zu erzeugen. Eine MfeI Stelle trat natürlicherweise am 3'-Ende des Wildtyp-IC-Gens auf. Die Ligation eines synthetisch hergestellten, doppelsträngigen Insertes, dass Pseudostellarin F codierte, in dem modifizierten Vektor, erzeugte das Plasmid pARCP-p (e in 3). Eine KpnI Stelle wurde am 3'-Ende des IN- Gens eingebracht, um das Gen für die Chitingbindungsdomäne an das Pseudostellarin erzeugende Konstrukt (f in 3) zu fusionieren.
  • Herstellung und Charakterisierung von zyklischem DHFR)
  • Die DHFR Zyklisierung war leicht durch SDS-PAGE nach Arabinoseinduktion von pARCP-DHFR, wie in 4 dargestellt, erkennbar (F: IC-DHFR-IN Fusionsprotein. T: IC-DHFR-IN Fusionsthioesterzwischenprodukt. R: IC-DHFR Lariatzwischenprodukt. L: lineares DHFR. O: zyklischesDHFR. IN: N-Intein. IC: C-Intein. Bahn 1: nicht induziertes XL1-Blue/pARCP-DHFR. Bahn 2: arabinoseinduziertes XLI-Blue/pARCP-DHFR. Bahn 3: arabinoseinduziertes XLIBlue/pARCPAH-DHFR. Bahn 4: Bahn 3-Rohlysat nach Methotrexatagarose. Bahn 5: Bahn 4-Material nach FPLC. Bahn 6: Wildtyp DHFR).
  • Banden mit Apparentmolekulargewichten bzw. Molekülmassen entsprechend den linearen (L, 23 kDa) und zyklischen (0,21 kDA) DHFR Produkten, entsprechend den Fusionsproteinen (F, 37 kDa), IN (14 kDa) und IC (4 kDa) waren klar sichtbar, genauso wie Banden die provisorisch als Thioester (T, 36 kDa) und Lariatzwischenprodukte (R, 26 kDa) bezeichnet wurden (4, Bahn 2). Die Mutation des vorletzten Restes von IC (A35) von Alanin zu Histidin (c in 3) verbesserte die Ausbeute von zyklischem DHFR ( 4, Bahn 3). Eine Methotrexat-Agarose-Affinitätschromatographie des Rohlysates (4, Bahn 4) bestätigte, dass die Mehrzahl der induzierten Banden korrekt gefaltetes DHFR enthielt. Obwohl IN nicht kovalent an DHFR gebunden ist, wurde es auf der Methotexatsäule vermutlich aufgrund einer nicht-kovalenten Komplexbildung mit dem IC-DHFR Lariatzwischenprodukt (R) zurückgehalten. Der Methotrexat-Agaroseeluant wurde durch FPLC fraktioniert und ermöglichte die Aufreinigung von 5 mg des zyklischen Produktes pro Liter Kultur (4, Bahn 5). Ein Westernblotting (nicht dargestellt) mit einem Anti-His-Antikörper demonstriert das Vorhandensein der Polyhistidinlinkersequenz (d in 3) im FPLC aufgereinigten Protein. Das Protein migrierte rascher in STS/PAGE Analysen als rekombinantes DHFR (4, Bahn 6) trotz der zusätzlichen 11-Aminosäurelinkersequenz (b in 3), was eine zusätzliche topologische Beschränkung bedeutet. Darüber hinaus wurde keine Reaktion nachgewiesen, wenn das FPLC-aufgereinigte Protein mit Phenylisothiocyanat umgesetzt wurde (Edman, P., Acta Chem. Scand., 4:283, 1950), was nahe legt, dass der Aminoterminus nicht verfügbar war.
  • Zyklisches DHFR wies Steady-State kinetische Parameter und Substrat, Cofaktor- und Methotrexatdissoziationskonstanten auf, die vom Wildtypenzym bei 25°C nicht unterscheidbar waren. Die Aktivitätsassays, die nach 65°C Präinkubation von Wildtyp und zyklischem DHFR durchgeführt wurden, zeigten, dass die Zyklisierung die Thermostabilität des Enzyms verbesserte (5). Die Endoproteinase Lys-C-Digestion wurde dazu verwendet, unzweifelhaft zu demonstrieren, dass das FPLC aufgereinigte Protein zyklisches DHFR war. Die Digestion des Wildtypenzyms erzeugte aminoterminale (4,4 kDa) und carboxyterminale (6,3 kDa) Fragmente; in einem zyklischen Protein wären diese beiden Fragmente verbunden, was ein 10,7 kDa Digestionsprodukt zur Folge hätte (7). Das FPLC aufgereinigte Material war gegenüber einer Proteolyse im Vergleich zu dem Wildtypenzym resistent und Massenspektralanalysen der Digestionsgemische identifizierten eine 10,7 kDa Peak im Produkt, das sich aus dem zyklischen Protein ergab, das im Wildtypenzym (Daten nicht dargestellt) abwesend war.
  • Produktion und Charakterisierung von Pseudostellarin F
  • Die Pseudostellarin F Produktion wurde leicht in vivo durch Hemmung der rekombinanten Streptomyces antibioticus Tyrosinase (7) nachgewiesen. In dem in 7 dargestellten Experiment waren XLI-Blue-Zellen mit pDIM-NY und entweder pARCP2-6H (a & b) oder pARCP-p (c & d) co-transformiert. Die Zellen wurden auf FeCuY Platten mit Chlroamphenicol (50 μg/ml) entweder ohne (a & c) oder mit (b & d) L-(+)Arabinose (0,5%) ausplatiert.
  • Eine Co-Expression von Pseudostellarin F in Tyrosinase exprimierenden Zellen reduziert die Pigmentbildung (d in 7) dramatisch. Die Expression eines unverwandten zyklischen Peptides aus pARCP2-6H hemmte Tyrosinase nicht (a und b in 7) und die Hemmung erforderte die Arabinoseinduktion absolut (vgl. c und d in 7). Eine SDS/PAGE-Analyse von Arabinose-induziertem pARCP-p in mehreren bakteriellen Stämmen (BL21-DE3, DH5a, und XLI-Blue) ermöglichten die Visualisierung von Banden, die dem Fusionsprotein (F), dem Thioesterzwischenprodukt (T) und IN entsprachen. Eine intensive niedermolekulare Gewichtsbande war ebenfalls sichtbar, jedoch war die Auflösung nicht ausreichend, um das Lariatzwischenprodukt (R) und IC (Daten nicht dargestellt) aufzutrennen. Obwohl Pseudostellarin F zu klein war, um durch SDS/PAGE visualisiert zu werden, zeigte die Massenspektralanalyse sein Vorhandensein sowohl im Rohzelllysat als auch Medien. Ungefähr 30 μg des rekombinanten zyklischen Peptides wurden aus dem Zelllysatprogramm feuchter Zellmasse isoliert. Pseudostellarin F wurde ebenfalls aus den Medien durch 1-Butanolextraktion gefolgt von HPLC isoliert, mit einer Ausbeute, die zwischen 2 mg/Liter (XL I Blue) und 20 mg/Liter (BL21-DE3) variierte, abhängig vom Expressionsstamm. Das NMR-Spektrum des rekombinanten Materials war mit demjenigen konsistent, das für das Naturprodukt berichtet wurde (Morita et al., siehe oben) und die Retentionszeit des bakteriell expremierten zyklischen Peptides war mit einem synthetisch hergestellten Standard identisch. Das rekombinante Material versagte dabei mit Ninhydrin zu reagieren (siehe Gordon, A.J., und R.A. Ford, The Chemist's Companion: A Handbook of Practical Data, Techniques, and References, Wiley Interscience, New York, 1972), was auf ein zyklisches Peptidgrundgerüst (Lactam) eher als auf ein Lactonprodukt hinweist. Weder HPLC noch Massenspektralanalyse ergab irgendeinen Hinweis auf die Produktion des linearen Stammpeptides.
  • Eine Chitinbindungsdomäne wurde an den Carboxy-Terminus von IN fusioniert, um die Zwischenprodukte der Intein-vermittelten Ligationsreaktionsaffinität aufzureinigen und um diese durch MALDI Massenspektometrie (Tabelle 1) zu charakterisieren
    Figure 00470001
    Tabelle 1: Massenspektrencharakterisierung von Pseudostellarin F Zyklisierungs-Zwischenprodukten
  • Alle Zwischenprodukte der Spleißreaktion, einschließlich IC, wurden zurückgehalten, wenn das Rohzelllysat aus Arabinose-induzierten pARCBD-p in XL1-Blue über eine Chitinaffinitätssäule passiert wurde. Pseudostellarin F wurde aus dem nicht zurückgehaltenen Material durch 1-Butanolextraktion wiedergewonnen. Die beobachteten Molekularmassen für das Fusionsprotein (F), das Thioesterzwischenprodukt (T) und IN wiesen eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit den Werten auf, die aus der Gensequenz vorhergesagt wurden. Die Masse von IC war mit der Asparagin-zyklisierten Form konsistent, wie es aus dem vorgeschlagenen Mechanismus der Produktfreisetzung vorhergesagt wurde. Die Molekularmasse des Lariatzwischenproduktes (R) war mit dem linearen IC-Pseudostellarin F-Fusionsprodukt konsistenter als das verzweigte Lactonprodukt, das aus der Trans-Veresterungsreaktion erwartet wurde.
  • Weitere Ausführungsformen
  • Während die obige Beschreibung viele spezielle Beispiele enthält, sollten diese nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung angesehen werden, sondern eher als Beispiele bevorzugter Ausführungsformen. Viele andere Variationen sind möglich. Demgemäß sollte der Umfang der Erfindung nicht durch die dargestellten Ausführungsformen, sondern durch die beigefügten Ansprüche und ihren Äquivalenzbereich bestimmt werden. SEQUENCE LISTING
    Figure 00490001
    Figure 00500001
    Figure 00510001
    Figure 00520001

Claims (127)

  1. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das einen ersten, carboxyterminalen Anteil eines getrennten (split) Inteins (C-Intein), einen zweiten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein) und ein Zielpeptid, flankiert am einen Ende mit dem carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein) und an seinem anderen Ende mit dem aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein), umfaßt, wobei die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem das Polypeptid in einer Form erzeugt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht: (a) einem Polypeptid, das im Wirtssystem spontan spleißt und so eine zyklisierte Form des Zielpeptids ergibt und (b) einem Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptids.
  2. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, das im Wirtssystem spontan spleißt und so eine zyklisierte Form des Zielpeptides ergibt.
  3. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid ein Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptids ist.
  4. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei sowohl der erste Anteil eines getrennten Inteins und auch der zweite Anteil eines getrennten Inteins von einem natürlich vorkommenden, getrennten Intein abgeleitet sind.
  5. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei sowohl der erste Teil eines getrennten Inteins als auch der zweite Anteil eines getrennten Inteins von Ssp DnaE abgeleitet sind.
  6. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei zumindest einer des ersten Anteils eines getrennten Inteins oder des zweiten Anteils eines getrennten Inteins von einem nicht natürlich vorkommenden getrennten Intein abgleitet sind.
  7. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei das nicht natürlich vorkommende getrennte Intein von der Gruppe abgeleitet ist, die aus RecA, DnaB, Psp Pol-I und Pfu Inteinen besteht.
  8. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei sowohl der erste Anteil eines getrennten Inteins als auch der zweite Anteil eines getrennten Inteins von einem nicht natürlich vorkommenden getrennten Intein abgeleitet sind.
  9. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei das Spleißzwischenprodukt ein aktives Intein-Zwischenprodukt ist.
  10. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei das Spleißzwischenprodukt ein Thioester-Zwischenprodukt ist.
  11. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei das Spleißzwischenprodukt ein Lariat-Zwischenprodukt ist.
  12. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid codiert, das einen ersten, carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein), einen zweiten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein), einen dritten, carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein), und einen vierten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein) umfaßt, wobei ein erstes Zielpeptid sich zwischen dem ersten Anteil eines getrennten Inteins und dem zweiten Anteil eines getrennten Inteins befindet und ein zweites Zielpeptid sich zwischen dem dritten Anteil eines getrennten Inteins und dem vierten Anteil eines getrennten Inteins befindet.
  13. Nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12, wobei der erste Anteil eines getrennten Inteins zum dritten Anteil eines getrennten Inteins komplementär ist, jedoch nicht zum zweiten Anteil eines getrennten Inteins komplementär ist und der zweite Anteil eines getrennten Inteins zum vierten Anteil eines getrennten Inteins komplementär ist, jedoch nicht zum dritten Anteil eines getrennten Inteins komplementär ist.
  14. Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül umfaßt, das ein Polypeptid codiert, das einen ersten, carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein), einen zweiten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein) und ein Zielpeptid umfaßt, flankiert am einen Ende mit dem carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein) und an seinem anderen Ende mit dem aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein), wobei die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem das Polypeptid in einer Form erzeugt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht: (a) einem Polypeptid, das spontan im Wirtssystem spleißt, um eine zyklisierte Form des Zielpeptides zu bilden und (b) einem Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptids.
  15. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, das spontan im Wirtssystem spleißt, so daß sich eine zyklisierte Form des Zielpeptides ergibt.
  16. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid ein Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptides ist.
  17. Expressionsvektor nach Anspruch 15, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin eine regulatorische Sequenz umfaßt, die die Expression des Polypeptids im Wirtssystem erleichtert.
  18. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Peptid codiert, das das Screening der zyklisierten Form des Zielpeptides nach einer speziellen Eigenschaft erleichtert.
  19. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für ein Peptid codiert, das die Aufreinigung der zyklisierten Form des Zielpeptides aus dem Wirtssystem erleichtert.
  20. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Zielpeptid ein erstes Ende fusioniert an den ersten Anteil eines getrennten Inteins und ein zweites Ende, fusioniert an den zweiten Anteil eines getrennten Inteins aufweist.
  21. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei sowohl der erste Anteil eines getrennten Inteins als auch der zweite Anteil eines getrennten Inteins von einem natürlich vorkommenden getrennten Intein abgeleitet sind.
  22. Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei sowohl der erste Anteil eines getrennten Inteins als auch der zweite Anteil eines getrennten Inteins von Ssp DnaE abgeleitet sind.
  23. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei zumindest der erste Anteil eines getrennten Inteins oder der zweite Anteil eines getrennten Inteins von einem nicht natürlich vorkommenden getrennten Intein abgeleitet sind.
  24. Expressionsvektor nach Anspruch 23, wobei das nicht natürlich vorkommende getrennte Intein von der Gruppe abgeleitet ist, die aus RecA, DnaB, Psp Pol-I und Pfu Inteinen besteht.
  25. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei sowohl der erste Anteil eines getrennten Inteins als auch der zweite Anteil eines getrennten Inteins von einem nicht natürlich vorkommenden getrennten Intein abgeleitet sind.
  26. Expressionsvektor nach Anspruch 16, wobei das Spleißzwischenprodukt ein aktives Intein-Zwischenprodukt ist.
  27. Expressionsvektor nach Anspruch 16, wobei das Spleißzwischenprodukt ein Thioesterzwischenprodukt ist.
  28. Expressionsvektor nach Anspruch 16, wobei das Spleißzwischenprodukt ein Lariat-Zwischenprodukt ist.
  29. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Wirtssystem eine prokaryontische Zelle umfaßt.
  30. Expressionsvektor nach Anspruch 29, wobei die prokaryontische Zelle ein Bakterium ist.
  31. Expressionsvektor nach Anspruch 30, wobei das Bakterium Escherichia coli ist.
  32. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Wirtssystem eine eukaryontische Zelle umfaßt.
  33. Expressionsvektor nach Anspruch 32, wobei die eukaryontische Zelle eine Hefe ist.
  34. Expressionsvektor nach Anspruch 33, wobei die eukaryontische Zelle eine Säugetierzelle ist.
  35. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Wirtssystem ein Archaebakterium umfaßt.
  36. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei das Wirtssystem eine Pflanzenzelle umfaßt.
  37. Expressionsvektor nach Anspruch l 4, wobei der Vektor ein Plasmid ist.
  38. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei der Vektor eine Bakteriophage ist.
  39. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei der Vektor ein Virus ist.
  40. Expressionsvektor nach Anspruch 14, wobei der Vektor ein lineares Nukleinsäuremolekül ist.
  41. Ein im wesentlichen reines Polypeptid, das einen ersten carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein), einen zweiten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein) und ein Zielpeptid umfaßt, flankiert am einen Ende mit dem carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein) und an seinem anderen Ende mit dem aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein), wobei das Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: (a) einem Polypeptid, das spontan im Wirtssystem spleißt, um eine zyklisierte Form des Zielpeptides zu ergeben und (b) einem Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptides.
  42. Polypeptid nach Anspruch 41, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, das spontan im Wirtssystem spleißt, um eine zyklisierte Form des Zielpeptides zu ergeben.
  43. Polypeptid nach Anspruch 41, wobei das Polypeptid ein Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptides ist.
  44. Polypeptid nach Anspruch 41, wobei das Zielpeptid ein erstes Ende fusioniert an den ersten Anteil eines getrennten Inteins und ein zweites Ende, fusioniert an den zweiten Anteil eines getrennten Inteins, aufweist.
  45. Polypeptid nach Anspruch 41, wobei sowohl der erste Anteil eines getrennten Inteins als auch der zweite Anteil eines getrennten Inteins von einem natürlich vorkommenden getrennten Intein abgeleitet sind.
  46. Polypeptid nach Anspruch 45, wobei sowohl der erste Anteil eines getrennten Inteins als auch der zweite Anteil eines getrennten Inteins von Ssp DnaE abgeleitet sind.
  47. Polypeptid nach Anspruch 41, wobei zumindest einer des ersten Anteils eines getrennten Inteins und des zweiten Anteils eines getrennten Inteins von einem nicht natürlich vorkommenden getrennten Intein abgeleitet sind.
  48. Polypeptid nach Anspruch 47, wobei das nicht natürlich vorkommende getrennte Intein von der Gruppe abgeleitet ist, die aus RecA, DnaB, Psp Pol-I und Pfu Inteinen besteht.
  49. Polypeptid nach Anspruch 41, wobei der erste Anteil eines getrennten Inteins und der zweite Anteil eines getrennten Inteins von einem nicht natürlich vorkommenden getrennten Intein abgeleitet sind.
  50. Polypeptid nach Anspruch 43, wobei das Spleißzwischenprodukt ein aktives Intein-Zwischenprodukt ist.
  51. Polypeptid nach Anspruch 43, wobei das Spleißzwischenprodukt ein Thioester-Zwischenprodukt ist.
  52. Polypeptid nach Anspruch 43, wobei das Spleißzwischenprodukt ein Lariat-Zwischenprodukt ist.
  53. Ein Wirtssystem, das ein nicht natürlich vorkommendes Nukleinsäuremolekül umfaßt, das ein Polypeptid codiert, das einen ersten, carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein), einen zweiten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein) und ein Zielpeptid umfaßt, flankiert am einen Ende mit dem carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein) und auf seinem anderen Ende mit dem aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein); wobei die Expression des Nukleinsäuremoleküls im Wirtssystem das Polypeptid in einer Form erzeugt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht: (a) einem Polypeptid, das spontan im Wirtssystem spleißt, so daß sich die zyklisierte Form des Zielpeptides ergibt und (b) einem Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptides.
  54. Wirtssystem nach Anspruch 53, wobei das Polypeptid ein Polypeptid ist, das spontan im Wirtssystem spleißt, so daß sich eine zyklisierte Form des Zielpeptids ergibt.
  55. Wirtssystem nach Anspruch 53, wobei das Polypeptid ein Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptides ist.
  56. Wirtssystem nach Anspruch 53, wobei das Wirtssystem einen Prokaryonten umfaßt.
  57. Wirtssystem nach Anspruch 56, wobei der Prokaryont ein Bakterium ist.
  58. Wirtssystem nach Anspruch 53, wobei das Wirtssystem ein Archaebakterium umfaßt.
  59. Wirtssystem nach Anspruch 53, wobei das Wirtssystem einen Eukaryonten umfaßt.
  60. Wirtssystem nach Anspruch 59, wobei der Eukaryont eine Hefe ist.
  61. Wirtssystem nach Anspruch 59, wobei der Eukaryont eine Säugetierzelle ist.
  62. Wirtssystem nach Anspruch 53, wobei das Wirtssystem eine Pflanzenzelle umfaßt.
  63. Verfahren zur Herstellung eines Peptidmoleküls, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Bereitstellung eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, das ein Polypeptid codiert, das einen ersten, carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein), einen zweiten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein) und ein Zielpeptid umfaßt, flankiert am einen Ende mit dem carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein) und an seinem anderen Ende mit dem aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein), wobei die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem das Peptidmolekül in einer Form erzeugt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht: (a) einer zyklisierten Form des Zielpeptides, die sich aus einem spontanen Spleißen des Polypeptids im Wirtssystem ergibt und (b) einem Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptides; Bereitstellen eines Wirtssystems; Einbringen des isolierten Nukleinsäuremoleküls in das Wirtssystem; und Exprimieren des isolierten Nukleinsäuremoleküls.
  64. Verfahren nach Anspruch 63, wobei der Schritt des Exprimierens des isolierten Nukleinsäuremoleküls die Produktion eines Polypeptids zur Folge hat, das spontan im Wirtssystem spleißt, so dass sich die zyklisierte Form des Zielpeptides ergibt.
  65. Verfahren nach Anspruch 64, das weiterhin den Schritt umfasst, die zyklisierte Form des Zielpeptides aus dem Wirtssystem aufzureinigen.
  66. Verfahren nach Anspruch 63, wobei der Schritt des Exprimierens des isolierten Nukleinsäuremoleküls die Erzeugung eines Spleißzwischenproduktes einer zyklisierten Form des Zielpeptides zur Folge hat.
  67. Verfahren nach Anspruch 66, das weiterhin den Schritt umfasst, das Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptides aus dem Wirtssystem aufzureinigen.
  68. Verfahren nach Anspruch 66, wobei das Spleißzwischenprodukt ein aktives Intein-Zwischenprodukt ist.
  69. Verfahren nach Anspruch 66, wobei das Spleißzwischenprodukt ein Thioester-Zwischenprodukt ist.
  70. Verfahren nach Anspruch 66, wobei das Spleißzwischenprodukt ein Lariat-Zwischenprodukt ist.
  71. Verfahren nach Anspruch 66, das weiterhin den Schritt umfasst, das zyklische Peptid aus dem Spleißzwischenprodukt zu bilden.
  72. Verfahren nach Anspruch 63, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor eingebaut ist, der die Expression des isolierten Nukleinsäuremoleküls im Wirtssystem erleichtert.
  73. Verfahren nach Anspruch 72, wobei der Expressionsvektor ein Plasmid ist.
  74. Verfahren nach Anspruch 72, wobei der Expressionsvektor ein Bakteriophage ist.
  75. Verfahren nach Anspruch 72, wobei der Expressionsvektor ein Virus ist.
  76. Verfahren nach Anspruch 63, wobei das Wirtssystemn eine prokaryontische Zelle umfasst.
  77. Verfahren nach Anspruch 76, wobei die prokaryontische Zelle ein Bakterium ist.
  78. Verfahren nach Anspruch 77, wobei das Bakterium Escherichia coli ist.
  79. Wirtssystem nach Anspruch 63, wobei das Wirtssystem ein Archaebakterium umfasst.
  80. Verfahren nach Anspruch 63, wobei das Wirtssystem eine eukaryontische Zelle umfasst.
  81. Verfahren nach Anspruch 80, wobei die eukaryontische Zelle eine Hefe ist.
  82. Verfahren nach Anspruch 80, wobei die eukaryontische Zelle eine Säugetierzelle ist.
  83. Verfahren nach Anspruch 63, wobei das Wirtssystem eine Pflanzenzelle umfasst.
  84. Verfahren nach Anspruch 63, wobei das Wirtssystem ein in vitro Transskriptions/Translations-System umfasst.
  85. Verfahren nach Anspruch 84, wobei das in vitro Transskriptions/Translations-System ein Zelllysat umfasst.
  86. Verfahren nach Anspruch 64, wobei die Erzeugung des Zielpeptides in zyklisierter Form im Wirtssystem in Abwesenheit eines exogen zugesetzten Mittels eintritt.
  87. Verfahren nach Anspruch 86, wobei das exogen zugesetzte Mittel eine Protease ist.
  88. Verfahren nach Anspruch 86, wobei das exogen zugesetzte Mittel ein Thiol ist.
  89. Verfahren nach Anspruch 72, wobei der Expressionsvektor induzierbar ist.
  90. Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von Peptidmolekülen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen einer Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von Zielpeptiden mit heterogenen Aminosäuresequenzen kodieren; Einbauen jede der Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen in einen Expressionsvektor zur Bildung einer Vielzahl von Expressionsvektoren, wobei jede der Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen sich zwischen einem Nukleinsäuremolekül, das einen ersten, carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein) und einem Nukleinsäuremolekül, das einen zweiten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein) in jedem der gebildeten Expressionsvektoren befindet, wobei die Expression der Expressionsvektoren in einem Wirtssystem die Erzeugung einer Vielzahl von Peptidmolekülen in einer Form zur Folge hat, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht: (a) Polypeptide, die spontan im Wirtssystem spleißen so dass sich zyklisierte Formen der Zielpeptide ergeben, und (b) Spleißzwischenprodukte zyklisierter Formen der Zielpeptide; und Exprimieren der Expressionsvektoren im Wirtssystem.
  91. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Vielzahl von Polypeptiden Polypeptide sind, die spontan im Wirtssystem spleißen, so dass sich zyklisierte Formen der Zielpeptide ergeben.
  92. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Vielzahl von Polypeptiden Spleißzwischenprodukte zyklisierter Formen der Zielpeptide sind.
  93. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von Zielpeptiden kodieren, durch Festphasensynthese erzeugt werden.
  94. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von Zielpeptiden kodieren, unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion erzeugt werden.
  95. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von Zielpeptiden kodiert, durch enzymatisches Verdauen eines größeren Nukleinsäuremoleküls erzeugt werden.
  96. Verfahren nach Anspruch 95, wobei das größere Nukleinsäuremolekül von einem Organismus abgeleitet ist.
  97. Verfahren nach Anspruch 90, wobei die Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, die eine Vielzahl von Zielpeptiden kodieren von einem Vorläufernukleinsäuremolekül erzeugt werden, das unter Bedingungen amplifiziert wurde, die Mutationen in die Nukleotidsequenz des Vorläufernukleinsäuremoleküls einbringen.
  98. Verfahren zum Screenen eines Peptidmoleküls nach einer vorherbestimmten Eigenschaft, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Bereitstellen eines Nukleinsäuremoleküls, das ein Polypeptid kodiert, das einen ersten, carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein), einen zweiten, aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein) und ein Zielpeptid umfasst, flankiert am einen Ende von carboxyterminalen Anteil eines getrennten Inteins (C-Intein) und an seinem anderen Ende von dem aminoterminalen Anteil eines getrennten Inteins (N-Intein), wobei die Expression des Nukleinsäuremoleküls in einem Wirtssystem das Peptidmolekül in einer Form erzeugt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus folgendem besteht: (a) einer zyklisierten Form des Zielpeptids, die sich aus einem spontanen Spleißen des Polypeptids im Wirtssystem ergibt und (b) einem Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptids; Bereitstellen des Wirtssystems; Einbringen des isolierten Nukleinsäuremoleküls in das Wirtssystem; Anordnen des Wirtssystems unter Bedingungen, die eine Erzeugung des Peptidmoleküls verursachen; und Testen des Peptidmoleküls nach vorherbestimmten Eigenschaften.
  99. Verfahren nach Anspruch 98, wobei das Peptidmolekül eine zyklisierte Form des Zielpeptids ist.
  100. Verfahren nach Anspruch 98, wobei das Peptidmolekül ein Spleißzwischenprodukt einer zyklisierten Form des Zielpeptids ist.
  101. Verfahren nach Anspruch 98, wobei die vorherbestimmte Eigenschaft die Fähigkeit umfasst, ein Zielmolekül spezifisch zu binden und den Schritt, das Peptidmolekül bezüglich der vorherbestimmten Eigenschaft zu testen die Schritte umfasst: (a) das Peptidmolekül mit dem Zielmolekül in Berührung zu bringen und (b) zu bestimmen, ob das Peptidmolekül an das Zielmolekül bindet.
  102. Verfahren nach Anspruch 101, wobei der Schritt des Bestimmens, ob das Peptidmolekül an das Zielmolekül bindet durch Beobachten einer Farbveränderung gemessen wird.
  103. Verfahren nach Anspruch 101, wobei der Schritt der Bestimmung, ob das Peptidmolekül an ein Zielmolekül bindet durch Beobachten eines fluoreszierenden Signals gemessen wird.
  104. Verfahren nach Anspruch 101, wobei der Schritt der Bestimmung, ob das Peptidmolekül an das Zielmolekül bindet durch Analysieren des Zellzyklus eines Organismus gemessen wird.
  105. Verfahren nach Anspruch 101, wobei der Schritt der Bestimmung, ob das Peptidmolekül an ein Zielmolekül bindet durch Untersuchen der Reproduktion eines Organismus gemessen wird.
  106. Verfahren nach Anspruch 101, wobei das Zielmolekül ein zellassoziiertes Molekül ist.
  107. Verfahren nach Anspruch 106, wobei das zellassoziierte Molekül ein membranassoziiertes Molekül ist.
  108. Verfahren nach Anspruch 106, wobei das zellassoziierte Molekül ein intrazelluläres Molekül ist.
  109. Verfahren nach Anspruch 108, wobei das intrazelluläre Molekül ein Kernmolekül ist.
  110. Verfahren nach Anspruch 108, wobei das intrazelluläre Molekül eine Organelle ist.
  111. Verfahren nach Anspruch 110, wobei die Organelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: Mitochondrien, Lysosomen, endoplasmatische Reticula, Chloroplasten, Golgi, und Periplasma.
  112. Verfahren nach Anspruch 101, wobei das Zielmolekül ein extrazelluläres Molekül ist.
  113. Verfahren nach Anspruch 98, wobei die vorherbestimmte Eigenschaft die Fähigkeit ist, eine biochemische Reaktion zu modulieren und der Schritt des Testens des Peptidmoleküls auf eine vorherbestimmte Eigenschaft den Schritt umfasst: (a) das Peptidmolekül mit einem System in Berührung zu bringen, das die biochemische Reaktion enthält und (b) zu bestimmen, ob das Peptidmolekül die biochemische Reaktion moduliert.
  114. Verfahren nach Anspruch 113, wobei der Schritt der Bestimmung, ob das Peptidmolekül die biochemische Reaktion moduliert durch Beobachten einer Farbveränderung gemessen wird.
  115. Verfahren nach Anspruch 113, wobei der Schritt der Bestimmung, ob das Peptidmolekül die biochemische Reaktion moduliert durch Beobachten eines fluoreszierenden Signals gemessen wird.
  116. Verfahren nach Anspruch 113, wobei der Schritt der Bestimmung, ob das Peptidmolekül die biochemische Reaktion moduliert durch Analysieren des Zellzyklus eines Organismus gemessen wird.
  117. Verfahren nach Anspruch 113, wobei der Schritt der Bestimmung, ob das Peptidmolekül die biochemische Reaktion moduliert durch Analysieren der Reproduktion eines Organismus gemessen wird.
  118. Verfahren nach Anspruch 113, wobei die biochemische Reaktion ein zellassoziierter Prozess ist.
  119. Verfahren nach Anspruch 118, wobei die biochemische Reaktion ein intrazelluläres metabolisches Ereignis ist.
  120. Verfahren nach Anspruch 118, wobei die biochemische Reaktion ein membranassoziiertes Ereignis ist.
  121. Verfahren nach Anspruch 118, wobei die biochemische Reaktion ein nukleäres Ereignis ist.
  122. Verfahren nach Anspruch 113, wobei die biochemische Reaktion eine extrazelluläre Reaktion ist.
  123. Verfahren nach Anspruch 98, wobei der Schritt des Testens des Peptidmoleküls nach der vorherbestimmten Eigenschaft unter Verwendung eines Hybridsystems durchgeführt wird.
  124. Verfahren nach Anspruch 98, das weiterhin den Schritt umfasst, das Peptidmolekül auf einem Festphasenträger zu immobilisieren.
  125. Verfahren zur Aufreinigung eines zyklischen Peptides aus einem Gemisch, wobei das Verfahren die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 63 und das Bereitstellen eines Gemisches umfasst, das ein Spleißzwischenprodukt enthält, konjugiert mit einem Affinitäts-Marker; Mischen des konjugierten Spleißzwischenproduktes mit einem Festphasenträger mit einem daran befindlichen Liganden, der spezifisch den Affinitäts-Marker bindet, wobei der Träger spezifisch mit dem Spleißzwischenprodukt gebunden ist; Waschen des Trägers zur Entfernung nicht spezifisch gebundenen Materials vom Träger; Zusetzen eines Reagenzes zum Träger, der ein zyklisches Peptid aus dem Spleißzwischenprodukt macht; und Eluieren des zyklischen Peptides vom Träger.
  126. Verfahren zum Aufreinigen eines zyklischen Peptides aus einem Gemisch, wobei das Verfahren die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 63 und das Bereitstellen eines Gemisches, das ein Spleißzwischenprodukt konjugiert mit einem Affinitäts-Marker enthält; das Mischen des konjugierten Spleißzwischenpruktes mit einem Festphasenträger, der einen Liganden daran umfasst, der spezifisch den Affinitäts-Marker bindet, wobei der Träger spezifisch mit dem Spleißzwischenprodukt gebunden wird; das Waschen des Trägers zur Entfernung von nicht spezifisch gebundenem Material vom Träger; das Eluieren des Spleißzwischenproduktes vom Träger; und das Zusetzen eines Reagenzes zum eluierten Spleißzwischenprodukt umfasst, das ein zyklisches Peptid aus dem Spleißzwischenprodukt macht.
  127. Verfahren zur Aufreinigung eines Zielmoleküls, das ein Spleißzwischenprodukt aus einem Gemisch bindet, wobei das Verfahren die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 63 und die Bereitstellung eines Festphasenträgers, an den das Spleißzwischenprodukt spezifisch gebunden ist; das In Berührung bringen des Trägers mit dem Zielmolekül im Gemisch; das Waschen des Trägers und Entfernung von nicht spezifisch gebundenem Material vom Träger; und das Eluieren des Zielmoleküls von dem Träger umfasst.
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