DED0016646MA - - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 23. Dezember 1953 Bekanntgemacht am 6. Oktober 1955

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Antibiotika, welche unter dem Namen Polymyxin bekannt sind.

Die Polymyxine sind in Kulturflüssigkeiten, in welchen Stämme von Bacillus polymyxa und Bacillus aerosporus gezüchtetlworden sind, erzeugte Stoffwechselprodukte. Es wurde nachgewiesen, daß sie aus eine Ammogruppe aber keine sauren Gruppen enthaltenden Polypeptiden bestehen und daß sie unterschiedlich in ihrem Aminosäuregehalt und ihren spezifischen physiologischen Auswirkungen sind. Die hier benutzte Bezeichnung wird auf alle Mitglieder dieser Gruppe von Antibiotika angewendet.

Es ist bereits vorgeschlagen worden, Polymyxin aus Kulturflüssigkeiten durch Adsorption an Aktivkohle und nachfolgendes Auslaugen mit Hilfe eines wäßrigen oder organischen, als Auslaugemittel dienenden Lösungsmittels zu gewinnen. Das anfallende Polymyxin besitzt jedoch einen niedrigen Reinheitsgrad, und der Wirkungsfaktor des Verfahrens ist gering. Ein weiterer Vorschlag ging dahin, das Polymyxin aus seinen Lösungen mittels komplexer organischer Reagenzien

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oder Farbstoffen niederzuschlagen. Diese Reagenzien sind aber kostspielig, und ihre Wiedergewinnung ist nicht leicht.

Es wurde nun festgestellt, daß Polymyxin aus

S Kulturilüssigkeiten, in welchen Stämme von Bacillus polymyxa oder Bacillus aerosporus gezüchtet worden sind, durch Adsorption an Ionenaustauscher mit nachfolgendem Auslaugen gewonnen werden kann.

Dementsprechend ist das eri'indungsgemäße Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Polymyxin dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von Polymyxin mit einem Ionenaustauscher in Berührung bringt, welches seine Austauscheigenschaft von der Anwesenheit von Carboxylgruppen herleitet, wobei das Polymyxin an das Material adsorbiert wird, und hernach das Material mit der Lösung eines Elektrolyts auslaugt, wodurch das adsorbierte Polymyxin daraus entfernt wird.

Die Verwendung von Ionenaustauschern bei der C.ewinnung von Antibiotika ist grundsätzlich bekannt. So hat man schon Calciumpenicilün in Natriumpcnicillin durch Behandlung mit kationenaustauschenden Harzen umgewandelt. Auch die Reinigung von Penicillin mittels anionenaustauschender Harze ist

s5 bekannt. Auch die Reinigung von Streptomycin mittels ionciiaustauscheiider Harze mit Carboxylgruppen ist schon durchgeführt worden. Streptomycin und Polymyxin unterscheiden sich aber voneinander in grundsätzlicher Weise. Streptomycin enthält zwei Ciuanidingiuppen und ist daher eine sehr starke Base. Polymyxin andererseits ist eine Polypeptidverbindung und wegen seiner schwachen Aminogruppen nur ein schwach basischer Körper.Währcnd daher die Adsorption des stark basischen Streptomycins von einem schwach sauren ionenaustauschenden Harz ohne weiteres vorausgesagt werden konnte, ist es völlig unerwartet, daß das schwach basische Polymyxin von der gleichen Harzart in merklicher Weise adsorbiert wird. Viel eher hätte angenommen werden können, daß wegen der schwachen Basizität des Polymyxins die Verwendung eines stark sauren Harzes, z. B. eines sulfonsäuren Harzes, notwendig gewesen wäre. Tatsächlich haben aber Versuche mit solchen Harzen gezeigt, daß sie beträchtlich weniger wirksam als die schwachen carbonsauren Harze sind.

Das Verhalten der zwei Antibiotika hinsichtlich der Adsorption durch Harze von carbonsaurem Typ ist völlig verschieden. Mit Streptomycin werden die besten Ergebnisse erhalten, wenn das Streptomycin von dem Harz bei einem neutralen oder alkalischen Pii-Weit adsorbiert und bei einem mäßig sauren Pu-Wcrt, z. H. 2 bis 3, ausgelaugt wird, während mit Polymyxin die besten Ergebnisse, durch Adsorbieren bei einem sauren p_M-Wert und Auslaugen unter stärker sauren Bedingungen, z. B. 1 bis 2, erhalten werden.

Zweifelsohne mußte im Hinblick auf den verschiedenen chemischen Charakter der beiden Antibiotika die Anwendung des für Streptomycin bekannten Verfahrens auf Polymyxin völlig zwecklos erscheinen. Dieses berechtigte Vorurteil mußte überwunden und das Wagnis der Übertragung unternommen werden, um zu dem völlig überraschenden Ergebnis zu gelangen, daß eine schwach basische Verbindung von einem schwach sauren ionenaustauschenden Harz adsorbiert wird.

Ionenaustauschmittel, welche polare Carboxylgruppen enthalten, sind in der Technik bekannt. Verschiedene Arten derselben sind in den USA.-Patentschriften 2 319 359, 2 333 754, 2 340 no, 2 340 in und anderen beschrieben worden und sind dadurch charakterisiert, daß ihre lonenaustauscheigenschaften sich von der Anwesenheit von Carboxylgruppen im Molekül herleiten. Im allgemeinen werden diese Stoffe entweder durch Mischpolymerisation einer polymcrisierbaren Säure mit einer Divinylverbindung, d. h. einer zwei CH₂ = CH-Gruppen besitzenden Verbindung, beispielsweise durch Mischpolymerisation von Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Divinylbenzol oder durch Kondensation eines Aldehyds mit einem Phenol, erzeugt, von welchen eine dieser Verbindungen eine Carboxylgruppe enthält, insbesondere Formaldehyd und Resorcylsäure.

Durch die Anwendung von diesen Stoffen wird sowohl eine erhebliche Reinigung wie auch eine Konzentration des Polymyxins bewirkt, da nur wenige oder gar keine nicht basische, in der Kulturflüssigkeit anwesende Verunreinigungen zugleich mit dem Polymyxin adsorbiert werden. Es lassen sich hohe Gewinnungswirkungsgrade erzielen und, da es möglich ist, die Ionenaustauscher viele Male wieder zu gebrauchen, weist das Verfahren große wirtschaftliche Vorteile auf.

Als Ausgangsmaterial für das erfmdungsgemäßc Verfahren ist irgendeine wäßrige Lösung von Polymyxin anwendbar. Geeignet ist die Kulturflüssigkeit, in welcher der Bazillus gezüchtet worden ist, nachdem diese zweckmäßig zur Entfernung von Feststoffen filtriert worden ist. Gegebenenfalls kann man die Flüssigkeit einer Vorreinigungsbehandlung unterziehen, z. B. einer Hydrolyse, Klärung, Erhitzung und chromatographischen Adsorption.

Die Adsorption an die Ionenaustauscher kann entweder in Absätzen oder mittels einer Kolonne geschehen. Im ersten Falle bringt man die Masse in einem Mischgefäß, z. B. einem mit Rührvorrichtung versehenen Tank, mit der Flüssigkeit in Berührung, trennt sie hernach von der ausgezogenen Flüssigkeit, beispielsweise durch Filtrieren, und gewinnt das Polymyxin durch Auslaugen. Die für eine maximale Adsorption des Polymyxins aus einer bestimmten Konzentration desselben erforderliche Menge Austauscher und die hierfür benötigte Zeit lassen sich leicht durch Versuche feststellen, wobei man Standardmethoden für die Gehaltsbestimmung der Flüssigkeit zur Anwendung bringt.

Bei der Benutzung der Ionenaustauscher in Kolonnen werden vorzugsweise zwei oder mehr Kolonnen, welche mit dem Ionenaustauscher gefüllt sind, vorgesehen, so daß die Flüssigkeit die Kolonnen nacheinander durchfließt. Die erste Kolonne wird dann ausgesondert und ausgelaugt, wenn durch eine Gehaltsbestimmung gefunden wird, daß die Masse gesättigt ist und kein Polymyxin mehr aus der Flüssigkeit adsorbiert. Zusätzliche Kolonnen lassen sich am entgegengesetzten Ende des Systems nacheinander anfügen in dem Maße, wie eine jede gesättigte

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Kolonne zum Zweck des Auslaugens ausgeschieden wird. Ein derartiges System ist in der Abb. ι bildlich dargestellt. Diese zeigt vier hintereinander angeordnete, mit Ionenaustauscher gefüllte Kolonnen. Die PoIymyxin enthaltende Flüssigkeit wird nach der Darstellung durch das Ventil 5 in die Kolonne 2 eingeführt und strömt durch die Kolonne und Ventil 6 in die Kolonne 3. Die erschöpfte Flüssigkeit verläßt die Kolonne durch Ventil 7. Die Ventile 8, 9, 13 und 14 sind geschlossen. Kolonne 1 stellt eine mit Polymyxin gesättigte Kolonne dar, welche von der übrigen Reihe abgesondert ist und dadurch ausgelaugt wird, daß man ein Auslaugemittel durch Ventil 11 einlaufen läßt und die Polymyxin enthaltende Auslaugeflüssigkeit durch Ventil 12 abzieht. Ventil 10 ist geschlossen. Kolonne 4 stellt eine wieder aufgefrischte Kolonne dar, welche dem System wieder angeschlossen wird, sobald Kolonne 2 gesättigt ist, indem man die Ventile 9 und 17 öffnet, während Ventile iä und 16 geschlossen bleiben. Obgleich das in Abb. 1 dargestellte System nur aus vier hintereinander angeordneten Kolonnen besteht, ist die Anzahl nicht beschränkt. Diese Durchführungsart hat die Wirkung, das Auslaugeprodukt zu reinigen und macht das Verfahren wirtschaftlicher. Bei der Verwendung von einer einzigen Kolonne neigen die ausgelaugten Flüssigkeiten zur Zurückhaltung eines höheren Prozentgehaltes Polymyxin. Der Durchfluß durch die Kolonnen kann entweder von unten nach oben oder in umgekehrter Richtung vor sich gehen.

Die Adsorption kann innerhalb einer p_H-Spanne von 3,5 bis 9 vorgenommen werden, wobei die Ionenaustauscher entweder als freie Säure oder in Gestalt ihrer teilweise umgewandelten, leicht ersetzbaren Salze angewendet werden. Vorzugsweise bewirkt man die Adsorption bei einem p_H von ungefähr 4,5 bei Anwendung der Masse als freie Säure. In diesem Falle läßt sich die Masse vor dem Gebrauch durch absatzweise oder gegebenenfalls in Kolonnenbehandlung mit verdünnter Mineralsäure, bis der p_H-Wert der Suspension oder der austretenden Flüssigkeit ungefähr ι oder 2 beträgt, und nachfolgendes Auswaschen des Kunstharzes mit Wasser, bis der p_H-Wert auf zwischen 3,5 bis 5 zurückgegangen ist, regenerieren. Wenn man die Masse in Gestalt des teilweise umgewandelten, leicht ersetzbaren Salzes zur Anwendung zu bringen wünscht, kann man sie vor dem Gebrauch dadurch auf die erforderliche p_H regenerieren, daß man sie mit einer angepaßten Pufferlösung, z. B. von Natriumacetat/Essigsäure, behandelt.

Vor dem Auslaugen des Polymyxins wäscht man die Masse vorteilhafterweise mit geringen Mengen Wasser.

Zum Auslaugen des adsorbierten Polymyxins aus den Ionenaustauschern kann man sich im allgemeinen irgendeines Elektrolyts als Auslaugemittel bedienen. Besonders geeignet hierfür haben sich verdünnte, wäßrige Lösungen von Mineralsäuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, in einer Konzentration von etwa 1,5 normal erwiesen. Gute Ergebnisse lassen sich auch durch Anwendung einer wäßrigen Lösung von Calciumchlorid, z. B. ioprozentig, erzielen. Es soll jedoch bemerkt werden, daß die Aufgabe der Auslaugung des Polymyxins aus den Ionenaustauschern keine besondere Schwierigkeiten darbietet und daß die Auslaugung mit Hilfe irgendeines gewöhnlichen Auslaugemittels, einschließlich z. B. von wäßrigen organischen Lösungen von Elektrolyten, vorgenommen werden kann.

Ebenso wie das Adsorptionsverfahren kann das Auslaugen des Polymyxins aus den Ionenaustauschern absatzweise oder durch Kolonnen geschehen. Die bevorzugte Methode des Auslaugens besteht in der Anwendung von Kolonnen, indem man verdünnte, wäßrige Lösungen einer Mineralsäure durch die Kolonne im Kreislauf zirkulieren läßt, wobei man weitere Mengen Mineralsäure zufügt, bis ein gleichmäßiger p_H-Wert von weniger als 3 und zweckmäßig von etwa 1,5 in dem ganzen System, erreicht ist. Die saure Auslaugeflüssigkeit, welche das Polymyxin in praktisch stöchiometrischen Verhältnissen enthält, wird sodann schleunigst durch die Zugabe von verdünntem Alkali oder eines basischen Ionenaustauschers auf ein pjj zwischen 4,5 und 7 gebracht.

Die Auslaugung kann auch dadurch vorgenommen werden, daß man Mengen des Auslaugemittels bei einer festgesetzten Konzentration durch die Kolonne laufen läßt, oder durch ein absatzweises Verfahren. Im letzteren Falle besteht die bevorzugte Methode darin, daß man die Masse in Wasser suspendiert und Mineralsäure zufügt, bis das p_H der Suspension während etwa 20 Minuten bei einem Werte zwischen ungefähr 1 und 3 konstant bleibt. Die Suspension wird sodann filtriert und das saure FiItrat wie oben beschrieben neutralisiert.

Nach dem Auslaugen kann man das Polymyxinkonzentrat für die Gewinnung der reinen Substanz nach den in der Technik bekannten Methoden behandeln.

Die folgenden Beispiele sollen die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutern. Für die Bestimmung des Polymyxins wurde der willkürlich gewählte Wellcome-standard benutzt, welcher dem reinen Material eine Wirkungskraft von 10 000 Einheiten per mg gibt.

Beispiel 1

Eine Charge Ionenaustauscher obiger Bedingungen wurde mit Schwefelsäure auf ein p_H 0,8 regeneriert und mit Wasser gewaschen, bis das p_H der Aufschlemmung 3,5 betrug. 50 ecm dieses Materials wurden in Absätzen mit 200 ecm einer filtrierten Kulturflüssigkeit, in welcher Bacillus polymyxa gezüchtet worden war und welche nach der Analyse 770 Einheiten je ecm enthielt, gemischt. Die Aufschlemmung des Ionenaustauschers und der filtrierten Flüssigkeit wurde 20 Minuten gerührt und das p_H der Mischung durch Zusatz von wäßriger Natriumbicarbonatlösung auf 4,6 gehalten. Die Aufschlemmung wurde dann filtriert. Das anfallende Filtrat (255 ecm) analysierte 55 Einheiten je ecm, was ungefähr 8°/₀ Polymyxin in der Flüssigkeit darstellt.

Das Ionenaustauschkunstharz wurde darauf mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen, ehe man es in Wasser suspendiert. Sodann wurde Schwefelsäure zugesetzt, bis das p_H der Suspension 20 Minuten

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konstant auf 1,2 stehenblieb. Die Suspension wurde darauf filtriert und das Filtrat nach Einstellung des P₁₁ auf 4,5 mittels wäßrigen Natriumbicarbonats analysiert. ICs wurde ein Gehalt von 152 720 Einheiten Polymyxin gefunden. Innerhalb der Fehlergrenze der Analyse wurde sonnt, das Polymyxin in theoretischer Menge aus dem Ionenaustauscher ausgelaugt.

Beispiel 2

Der im Heispiel 1 in Umrissen geschilderte Vorgang wurde bei einein p_n-Wert während der Adsorption von 5,5 wiederholt. Von den 154 000 Einheiten Polymyxin, welche ursprünglich in dem Filtrat enthalten waren, verblieben weniger als 8800 Einheilen in dem ausgelaugten Filtrat. Nach dem Auslaugen auf ein p,, 1,2, wie oben beschrieben, analysierte die Auslaugeflussigke.it 134680 Einheiten Polymyxin. Die Auslaugewirksanikeit betrug daher 93%.

_ao Beispiel 3

Kine. 1,35 hohe und 15 cm weite Kolonne wurde mit 4,5 kg eines Ionenaustauschkunstharzes obiger Bedingungen gefüllt. Das Kunstharz wurde durch Umlaufenlassen von wäßriger Schwefelsäure, bis ein konstantes p_H 2 in der ausfließenden Flüssigkeit erreicht war, vorbereitet. Die Kolonne wurde dann mit: Wasser gewaschen, bis das abfließende Wasser auf ρ,, 4,5 zurückgekehrt war.

318 1 einer hydrolysieren Kulturflüssigkeit, in welcher Bacillus polymyxa gezüchtet worden war, welche ein \t_n 4,5 besaß und ungefähr 500 Einheiten je ecm analysierte, wurden von unten nach oben mit einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 4,5 1 in der Minute durch die Kolonne fließen gelassen. Die Ablauge von der Kolonne analysierte 220 Einheiten je ecm. Unter gewöhnlichen Umständen würde mau diese weiteren Kolonnen zuführen.

Somit waren 120 000 000 Einheiten an den Ionenaustauscher adsorbiert, mit dem sodann zwei Auslaugcoperationen vorgenommen wurden. Jede Auslaugung bestand darin, daß man 45,5 1 Wasser durch die Kolonne umlaufen ließ und dauernd konzentrierte Schwefelsäure zugab, bis ein unveränderliches p_H erreicht wurde. Die erste Auslaugung wurde bis zu einem unveränderlichen Pn 2 ausgeführt. Nach Einstellung.des p,, auf 4,5 mit Alkali analysierte das Elual 83 000 000 Einheiten Polymyxin. Die zweite Auslaugung geschah bis zu einem unveränderlichen Pu ι, und nach Einstellung des pn-Wertes auf 4,5 mit Alkali analysierte die Lösung 29 000 000 Einheiten Polymyxin. Somit waren 112 000 000 Einheiten Polymyxin insgesamt ausgelaugt worden, was eine Wirksamkeit von 03,7% ausmacht. Die Reinheit des gewonnenen Materials, bezogen auf die Bestimmung der gesamten festen Stoffe, ließ eine zehnfache Zunahme der Reinheit von derjenigen in der hydrolysieren Flüssigkeit zu der in dem Eluat mit p,₍ 4,5 erkennen.

Obwohl diese Beispiele nur die Benutzung von Schwefelsäure als Auslaugemittel schildern, werden im wesentlichen ähnliche Ergebnisse mit anderen Auslaugemitteln, beispielsweise wäßriger, verdünnter Salzsäure, zehnprozentiger wäßriger Calciumchloridlösung und im allgemeinen Lösungen von Elektrolyten, einschließlich wäßriger organischer Lösungen von solchen Elektrolyten erhalten.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Polymyxin unter Verwendung von bei der Herstellung von Antibiotika bekannten Ionenaustauschern, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von Polymyxin mit einem Ionenaustauscher, deren Austauscheigenschaft durch Anwesenheit von Carboxylgruppen bedingt ist, in Berührung bringt und dann das adsorbierte Polymyxin mit der Lösung eines Elektrolyts auslaugt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption mittels eines bekannten Ionenaustauschers vorgenommen wird, welcher durch Mischpolymerisation von Divinylbenzol mit einer polymerisierbaren Carboxylsäure, z. B. Acrylsäure oder Methacrylsäure, oder durch Kondensation eines Aldehyds und eines Phenols, von denen eine der beiden Verbindungen eine Carboxylgruppe besitzt, z. B. durch die Kondensation von Formaldehyd mit Resorcylsäure, hergestellt wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Adsorption bei einem Pn zwischen 3,5 und 9, z. B. bei p_u von etwa 4,5, wobei der Ionenaustauscher als freie Säure vorliegt, vornimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den gesättigten Ionenaustauscher vor dem Auslaugen mit geringen Mengen Wasser wäscht.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Auslaugemittel eine verdünnte, wäßrige Mineralsäure, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, oder eine wäßrige Lösung von Calciumchlorid verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Auslaugung kolonnenweise dadurch vornimmt, daß man die verdünnte, wäßrige Mineralsäure in einem Kreislaufsystem durch die Kolonne umlaufen läßt, weitere Mengen Mineralsäure zugibt, bis ein unveränderliches Pi₁ von weniger als 3 in dem System erreicht ist, das saure Eluat abtrennt und durch Zugabe von verdünntem Alkali oder einem basischen Ionenaustauscher das p_H im Eluat auf zwischen 4,5 und 7 bringt.

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Angezogene Druckschriften:
USA.-Patentschriften Nr. 2 479 832, 2 541 420;
britische Patentschrift Nr. 687 476;
französische Patentschrift Nr. 952 376.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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