DK173633B1 - Fremgangsmåde og kanyle til pipetteringsrobot til fuldautomatisk simultan syntese af flere polypeptider - Google Patents

Description

i DK 173633 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fuldautomatisk simultan syntese af flere polypeptider ifølge faststofsyntesemetoden samt en kanyle til pipetteringsrobot.

5 Til hurtig bedømmelse af struktur-virkningsfor- hold af biologisk aktive peptider ved receptor-bindingsundersøgelser og hurtig epitop-undersøgelse for immunologien ved peptider og proteiner anvendes relativt små mængder (mindre end 20 mg af hver) af mange 10 forskellige peptider. Fremstillingen af disse peptider sker hensigtsmæssigt ifølge fastfasepeptidsyntesen.

Denne syntese er baseret på den af R.B. Merrifield udviklede metode (G. Barany, R.B. Merrifield i The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, vol. 2, 3-284 15 (1980), udgivet af Gross, Meienhofer Academic Press,

New York), hvorved peptidkæden opbygges trinvis. Syntesetrinene kan sammenfattes som følger: a) Binding af den første aminosyre i peptidkæden 20 til et polymert bæremateriale via en ankergruppe, b) trinvis tilkondensering af peptidkædens øvrige aminosyrer, 25 c) mellemliggende trin mellem de enkelte kondensationer bestående af vask, fraspaltning af beskyttelsesgrupper og neutralisering, 30d) eventuelt acylering af endestillede aminogrup- per, og e) fraspaltning af peptidet fra bæreren.

2 DK 173633 B1

Ved denne peptidsyntese skal man regne med en syntesetid på op til 18 timer,, for det meste op til 4 timer pr. aminosyre. (De enkelte kondensationer behøver for det meste 1 til 2 timers reaktionstid; mellem 5 kondensationerne kræves som regel ca. 10 mellemliggende trin, hvortil man skal påregne ca. 2 til 15 minutter pr. trin). Fremstillingen af peptider med et større antal aminosyrer er således meget tidsrøvende, arbejdskrævende og dyr.

10 Til fastfasesyntesen af analoge peptider har R.A. Houghten (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 82, side 5131-5135, august 1985, Immunology) beskrevet en metode. Ifølge denne fyldes polymert bæremateriale til syntesen i små porøse polypropylenposer i portioner på 15 50-100 mg, poserne smeltes sammen, de fælles mellemtrin ved synteserne (vask, neutralisering og fraspaltning af beskyttelsesgrupper) udføres samtidig på alle poser i en samlet reaktionsbeholder, og de enkelte kondensationer udføres adskilt. Metoden kan udføres manuelt eller 20 delvis automatisk ved anvendelse af et peptidsynteseap-parat.

Ulempen ved den beskrevne metode ligger i, at håndteringen af poserne er en smule omstændig, at poserne ikke kan genanvendes, at poserne skal sorteres 25 til kondensation af de forskellige peptider, og at der ikke kan tages kontrolprøver under syntesen.

Opfindelsens formål er at tilvejebringe en fremgangsmåde og en kanyle, der muliggør automatisk simultan syntese af flere polypeptider og undgår de oven-30 nævnte ulemper.

Opgaven løses ved, at den i forvejen nævnte fastfasesyntesemetode varieres således, at den kan udføres ved hjælp af en tilsvarende tilpasset pipette- DK 173633 B1 3 ringsrobot. Pipetteringsrobotter er hidtil anvende til serieanalyser. Eksempelvis kan pipetteringsrobotten, RSP 5052 fra firmaet TECAN, anvendes.

En pipetteringsrobot har følgende ydre bestand-5 dele: Mindst én arm med doseringspipette, én holder med lagerbeholdere samt én mikrotiterplade, der kan indeholde op til 96 brønde. Robotarmen bringer reagenserne fra beholderne ud i mikrotiterpladens enkelte brønde og suger, når det er nødvendigt, væsker ud af 10 brøndene. Doseringspipettens kanyle kan også være fremstillet således, at den er adskilt i to dele af en fra oven og nedefter løbende skillevæg. (Ved denne delte kanyle er det muligt at udføre to forskellige doseringer eller en dosering og en frasugning med en 15 arm). Apparatets arbejdsforløb styres af et computerprogram.

Fastfasepeptidsyntesen ifølge opfindelsen foregår i en sådan pipetteringsrobot som følger: I mikrotiterpladens brønde anbringes bæremateri-20 ale (fortrinsvis granuleret bæremateriale). Bærematerialet kan være påhæftet med begyndelsesdelen af de enkelte ønskede peptider. De til reaktionerne og vasketrinene nødvendige væsker hældes på lagerbeholderne.

Hvis peptidet skal skilles fra bærematerialet efter 25 endt syntese, og/eller hvis frie aminogrupper skal acy-leres, skal de til disse reaktioner krævede reagenser også forberedes i lagerbeholderne. Ud fra de krævede reaktionstider ses det, at det er hensigtsmæssigt at anvende en mikrotiterplade, der ikke indeholder mere 30 end 96 brønde. Således kan der i et programforløb maksimalt syntetiseres 96 forskellige polypeptider. Ifølge programmet, der er tilpasset disse peptiders syntese, bringer robotten reagenserne og vaskevæskerne til 4 DK 173633 B1 de enkelte brønde og frasuger efter passende opholdstider den over bærematerialet stående væske.

Fremgangsmåden og den nødvendige tilpasning af apparatet til fremgangsmåden forklares nærmere på bag-5 grund af den toarmede pipetteringsrobot RSP 5052 fra firmaet Tecan. Anvendelsen af fremgangsmåden er dog ikke begrænset til dette apparat. .Andre typer pipetteringsrobotter, især også en- eller flerarmede robotter, kan tilpasses fremgangsmåden ifølge nærværende opfin-10 dele.

Der vælges en mikrotiterplade med 96 brønde. En brønd rummer f.eks. 10 mg harpiks, der kan være påført med en aminosyre, og lidt mere end 300 μΐ væske. Harpiksmængden svarer ca. til 5 ymol aminosyre eller er 15 egnet til fremstillingen af ca. 5 ymol peptid. Sædvanlige bærematerialer på polystyren- eller polyacrylamid-basis er anvendelige. Det er hensigtsmæssigt at opbygge peptider, der maksimalt indeholder 20 aminosyrer.

De dertil anvendte reagensopløsninger og vaskevæsker 20 tilberedes i de dertil indrettede lagerbeholdere. Ap-paratets arm 1 er udstyret med en doseringspipette, arm 2 med en sugekanyle med skylleanordning. Denne skylleanordning er fortrinsvis forbundet med en separat stående lagerbeholder til det anvendte opløsningsmid-25 del. Syntesen sker efter det i den tilsluttede PC programmerede program.

Tildoseringen af samtlige reagensopløsninger, der tages fra åbne lagerbeholdere, sker med arm 1.

Før doseringspipetten skifter fra en reagensopløsning 30 til en anden, skylles doseringspipetten med opløsningsmiddel i en speciel skylleposition. Frasugning af reagenser og vaskevæsker sker med arm 2 gennem en med et filter udstyret kanyle. For at forhindre harpikstab og DK 173633 B1 5 kontaminering af nabobrøndene skylles kanylens yderside med opløsningsmiddel af en på kanylens yderside anbragt tilledning efter hver frasugningsprocedure. Næste vaskeprocedure startes samtidig med dette opløsningsmid-5 del. Herefter skylles kanylen i en kanyleskylleposi-tion.

Til adskillelse af peptidet fra harpiksen tilføres brøndene f.eks. trifluoreddikesyre igennem arm 1.

Efter fraspaltning frasuges opløsningen med su-10 gekanylen og overføres til en anden mikrotiterplade, hvorfra oparbejdningen sker.

Som nævnt ovenfor, kan sugekanylen udstyres med et filter. Dette filter er anbragt i kanylens nedre ende og forhindrer frasugning og medrivning af harpiks.

15 Piltret kan hensigtsmæssigt bestå af et net af rustfrit stål, der f.eks. fastgøres med en påloddet ring. En anden mulighed består i at tilpasse en metalsinterpla-de eller keramiksinterplade i kanylens åbning. Anvendes en kanyle uden filter, kan medrivningen og opsugningen 20 af harpiks undgås i stor udstrækning ved langsom opsugning. Derved forlænges tiden for opsugningen dog væsentligt.

Sugekanylens yderside skylles med opløsningsmiddel efter hver sugeprocedure. Det sker hensigtsmæssigt 25 ved tilledning af opløsningsmidlet i en ledning (slange eller rør), der løber langs kanylen og er således anbragt, at åbningen ligger knapt ovenfor kanylens neder-ste ende. Det er vigtigt, at opløsningsmidlet skyller hele omkredsen af kanylens nederste ende.

30 Apparatets arm 2 kan være udstyret med en kam i stedet for sugekanylen. En sådan kam omfatter flere sugekanyler (for det meste 4-12 kanyler) af den ovenfor beskrevne udførelsesform. Ved hjælp af en sådan kam DK 173633 B1 6 kan flere brønde betjenes samtidigt, hvilket fører til en væsentlig tidsbesparelse.

Sædvanligvis anvendes DMF eller N-methylpyrroli-don som opløsningsmiddel. Brøndene og den eventuelt 5 dertil indrettede skylleanordning skal ligeledes være fremstillet af opløsningsmiddelbestandigt materiale, såsom polypropylen eller teflon. I de i handlen tilgængelige apparater er doseringspipetterne og sugekanylerne fremstillet af rustfrit stål. Dette materialer 10 er egnet til fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Hvis man ved denne syntese vil anvende en større mængde harpiks pr. peptid (f.eks. 50 mg harpiks), skal der anvendes mikrotiterplader med større brønde. Disse mikrotiterplader er standardiserede og tilgængelige i 15 handlen. De indeholder så et tilsvarende lavere antal brønde.

I stedet for en pipetteringsrobot med to arme kan der også anvendes et étarms-apparat. I dette tilfælde skal sugekanylen have en opdeling i frie volumi-20 ner. Med den ene del sker frasugning af vaske- og reagensopløsninger, den anden del opfylder arm l's funktion fra toarms-apparatet, dvs. udfører tildosering af reagensopløsningerne. Beskyttelsen mod opsugning af harpiks sker som beskrevet ved toarm-apparatet. Også 25 denne kanyle skylles som beskrevet ovenfor.

Fremgangsmåden udføres eksempelvis med de følgende stoffer (mængdeangivelse pr. brønd): Udgangsmateriale er 10 mg med Fmoc-aminosyrer påhæftet harpiks (kornstørrelse 200-400 mesh); Fmoc-beskyttede aminosy-30 rer anvendes i op til ti gange af overskud for hver enkelt koblingstrin, dvs. der tilsættes 200 \il af en DMF-opløsning af 50 ymol Fmoc-aminosyre og 50 ymol 1-hydroxybenzotriazol og 100 yl af en DMF-opløsning af DK 173633 B1 7 75 ymol Ν,Ν-dicyclohexylcarbodiimid; koblingstiden er ca. en time. Fraspaltning af Fmoc-beskyttelsesgruppen sker ved hjælp af 300 μΐ af en 40%'s opløsning af pipe-ridin i DMF. Fraspaltningstiden er ca. 20 minutter.

5 Vasketrinene udføres med 300 yl DMF.

Fraspaltningen af det færdige peptid fra bærematerialet kan ske i brøndene ved manuel eller automatisk tilsætning af 300 yl trifluoreddikesyre (20 minutters reaktionstid). Acyleringen af frie grupper (NH2,OH) 10 kan ske analogt ved tilsætning af egnede syreanhydri-der, f.eks. eddikesyreanhydrid og pyridin. Efter endt omsætning frasuges opløsningen og ledes til oparbejdning.

Som det ses i ovennævnte forklaring, udføres al-15 le trin i peptidsyntesen i åbne beholdere. Ved udførelsen af syntesen ifølge opfindelsen opnås peptiderne alligevel i meget høj renhed.

Fig. 1 viser et eksempel på en kanyle til en pipetteringsrobot med en arm: (1) kanyle; (2) og (3) 20 kanylens tildoseringsside og sugeside; (4) slange til tilledning af opløsningsmiddel til skylning; (5) filter.

Det følgende eksempel viser fremgangsmådens forløb, idet der beskrives opbygning af et peptid i en 25 brønd. Der lægges mærke til produktets renhed.

Eksempel

Der syntetiseredes 44 forskellige undecapeptider 30 ved hjælp af Tecan-pipetteringsrobotten RSP 5052. Udgangsmateriale var i alle tilfælde et over en linker til polystyren bundet tetrapeptid Fmoc-Arg(Mtr)-Gin-Arg- (Mtr) -Tyr (tBu)-linker-polystyrol (påhæftet ca. 0,5 DK 173633 B1 8 mmol/g harpiks). 44 gange indførtes 10 mg af denne harpiks i brøndene på en mikrotiterplade (5 ymol peptid), og syntesen startedes. Som eksempel beskrives syntesen af: 5

Ac-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-NH2

Syntesen af de øvrige 4 peptider forløb analogt .

10 Syntesecyklus: 300 yl piperidin (40%) i DMF (5 minutter) 300 yl piperidin (40%) i DMF (20 minutter) 15 10 gange vask hver gang med 300 yl DMF (2 minutter) 200 yl af en DMF-opløsning, der er 50 ymolær med hensyn til Fmoc-Thr (tBu)-OH og 5 0 ymolær med hensyn til HOBt 20 og 100 yl af en DMF-opløsning, der er 75 ymolær med hensyn til DCC (1 time) 25 10 gange vask med 300 yl DMF (2 minutter).

DK 173633 B1 9 I identiske syntesecykler anvendtes tilsvarende opløsninger af:

Fmoc-Ile-OH

5

Fmoc-Leu-OH

Fmoc-Asn-OH

10 Fmoc-Ile-OH

Fmoc-Tyr(tBU)-OH

Fmoc-His(Trt)-OH.

15 med samme koncentrationer. Den afsluttende acetylering gennemførtes som sædvanlig med 300 μΐ af en DMF-opløs-ning, der er 40 ymolær med hensyn til eddikesyreanhy-drid og pyridin, efter Fmoc-spaltning.

20 Fraspaltningen fra harpiks skete med 300 yl trifluoreddikesyre/1% anisol i 30 minutter, vask 5 gange med 300 yl trifluoreddikesyre. De samlede trifluor-eddikesyreopløsninger opbevaredes under fugtig-hedsudelukkelse i en 1 time ved 50°C, og trifluoreddi-25 kesyren afdestilleredes under vakuum. Resten behandledes med ether i ultralydsbad, etheren dekanteredes, resten opløstes i vand og frysetørredes. HPLC-chromato-gram (RPl8-søjle) (fig. 2).

10 DK 173633 B1 Løbemiddel A Vand/acetonitril/trifluoreddikesyre 95/5/0,2 Løbemiddel B Vand/acetonitril/trifluoreddikesyre 5 20/80/0,2 FAB-massespektrogram: M+H: 1518.

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fuldautomatisk simultan syntese af flere polypeptider ifølge fastfasesynteseme-toden, kendetegnet ved, at man anvender en pipetteringsrobot, hvorved polymert bæremateriale, der 5 kan være påhæftet med de ønskede peptiders begyndelsesdele, anbringes i brønde på mikrotiterplader, hvorefter peptiderne opbygges i brøndene efter den i og for sig kendte fastfasesyntesemetode, og peptidernes eventuelle frie aminogrupper og/eller hydroxygrupper acyleres, 10 og/eller peptiderne derefter adskilles fra bærematerialet, idet de til de enkelte trin krævede reagenser eller vaskevæsker tilføres brøndene fra de tilsvarende lagerbeholdere via en eller flere robotarme med kanyler, og idet de over bærematerialet stående reagenser 15 eller vaskevæsker, der er til stede i brøndene, frasu-ges med en robotarm med kanyle efter den tilstrækkelige opholdstid, idet de enkelte trin i fremgangsmåden styres af det i computeren, der er tilsluttet til robotten, programmerede program.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende tegnet ved, at kanylen skylles på ydersiden hver gang mellem opsugning af væsken og tilsætning af reagenser.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, k e n -25detegnet ved, at reagenserne anvendes i op til 20 ganges overskud af de støkiometrisk nødvendige mængder.

4. Kanyle til pipetteringsrobot, kendetegnet ved, at dens øvre ende er sluttet til ro- 30 botarmens doseringsanordning, og hvis nedre ende er udstyret med et filter og/eller en skylleanordning, hvis DK 173633 B1 øvre ende er tilsluttet robotarmen.., og hvis nedre ende når ned til knapt over den nedre ende af kanylen, og hvis åbning er udført således, at den nedre ende af kanylen kan skylles.

5. Kanyle ifølge krav 4, kendetegnet ved, at hulrummet er delt i to dele af en fra oven og nedefter løbende skillevæg.

6. Kanylekam, kendetegnet ved, at den består af flere kanyler ifølge krav 4 eller 5.