DK175764B1 - Transplaceringsvektor omfattende genet for human nervevækstfaktor, insektceller inficeret med vektoren, fremgangsmåde til fremstilling af .......... - Google Patents

Description

DK 175764 B1

Den foreliggende opfindelse angår konstruktionen af rekombinante DNA-molekyler til ekspression af human nervevækstfaktor (hNGF) under anvendelse af et bacuiovirus-ekspressionssystem. Produktion af hNGF opnås under anvendelse af baculovirus-systemet til ekspression af proteinet i S. frugiperda-værtsceller. Den rekombinante 5 hNGF er af potentiel anvendelighed ved behandlingen af Alzheimers sygdom.

Den primære struktur af en pattedyrs-NGF (muse-NGF) blev først opklaret af Angeleti og Bradshaw, Proc. Natl. Acad. Sri. USA 68:2417 (1971). Den primære struktur af dens precursor, præ-pro-NGF, er deduceret fra nukleotidsekvensen af muse-NGF-10 cDNA'et (Scott et al., Nature 302:538 (1983); Ullrich et al., Nature 303:821 (1983)).

Det særdeles homologe humane NGF (hNGF)-gen er også blevet identificeret (Ullrich,

Svmp. on Quan. Btol.. Cold Spring Harbor 48:435 (1983)). Dets homologi med muse-NGF er henholdsvis 90% og 87% på aminosyre- og nukleotidsekvensniveau. På grund 15 af knapheden på hNGF vides der kun lidt om dens biologiske aktivitet.

Baculovirus-ekspressionsvektorer er blevet anvendt til ekspression af mange forskellige fremmede gener i insektceller enten in vitro eller in vivo (se US 4.745.051 j udstedt 17. maj 1988). Disse ekspressionsvektorer omfatter den særdeles effektive og 20 tidsbestemt regulerede Autographa califomica-kemepolyhedrosis-virus (AcNPV)-polyhedrinpromotor med det pågældende gen indsat nedstrøms for promotoren. Det tilsvarende genprodukt opnås fra Spodoptera frugiperda-celler, der er inficeret med de rekombinante baculovirusvektorer.

| 25 Isoleringen af hNGF's β-underenhed og dens ekspression som et heterologt protein i ' E. coli er beskrevet i EP 121 338. Under anvendelse af rekombinante teknikker blev human β-NGF ekspresseret i det væsentlige fri for andre pattedyrproteiner.

Ekspression af hNGF i E. coli under anvendelse af to gener, som indeholder ændrede aminoterminale ender, hvilket resulterede i ekspressionen af et fusionsprotein, er 30 beskrevet af Iwai et al., Chem. Pharm. Bull. 34:4724 (1986).

Anvendelsen af rekombinante teknikker til fremstilling af polypeptider i viralt inficerede insektceller er beskrevet i EP 228 036. Der er anført en fremgangsmåde til fremstilling af proteinet, hepatitis B-overfladeantigen, under anvendelse af baculovirus-35 ekspressionssystemet. Anvendelsen af blandede polyhedrale inklusionslegemer (PIB), som indeholder en blanding af nukleocapsider fra mindst to genetisk forskellige

DK 175764 B1 I

baculovirus, hvoraf den ene indeholder det pågældende heterologe gen, er beskrevet i I

PCT-ansøgning nr. WO 88/02030. Under anvendelse af den beskrevne I

coinfektionsteknik ekspresseres et heterologt protein. H

5 Selv om ekspression af disse store pattedyrsproteiner er mulig, fandtes der op til den H

foreliggende opfindelse kun lidt information om den succesfulde ekspression af små H

molekyler såsom hNGF under anvendelse af.et baculovirus-ekspressionssystem. Det H

har derfor været tvivlsomt, om dette bestemte ekspressionssystem ville være H

anvendeligt til produktion af små proteiner, som kræver posttranslationel proteolytisk I

10 spaltning af proteinprecursoren for at udvise biologisk aktivitet. H

Det har nu overraskende vist sig, at hNGF med held kan ekspresseres med godt H

udbytte under anvendelse af et baculovirus-insektcelleekspressionssystem. I

15 Den foreliggende opfindelse beskriver konstruktionen af ekspressionsvektorer, der er I

anvendelige i et baculovirussystem, som er i stand til at ekspressere hNGF i en I

biologisk aktiv form. Fremstilling af tilstrækkelige mængder hNGF ved rekombinant H

DNA-teknologi ifølge den foreliggende opfindelse gør det muligt at bekræfte den I

potentielle nytte af NGF ved behandlingen af Alzheimers sygdom (AD). I

Én udførelsesform af den foreliggende opfindelse er en baculovirus-

transplaceringsvektor som defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 7, der har H

genet for human nervevækstfaktor (hNGF), der i den rigtige orientering er forbundet H

med regulatoriske elementer, som er funktionelle i insektceller, dvs. ledersekvensen H

25 og promotoren af et baculovirus-polyhydringen. H

I en anden udførelsesform af opfindelsen beskrives insektceller inficeret med H

baculovirus-transplaceringsvektoren. H

30 I en yderligere udførelsesform angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde I

til fremstilling af biologisk aktiv hNGF i insektceller. Fremgangsmåden omfatter I

konstruktion af en transplaceringsvektor som defineret ovenfor, indføring af I

transplaceringsvektor i en baculovirus og infektion af insektceller med den opnåede I

rekombinante baculovirus. De inficerede insektceller dyrkes, fortrinsvis i et lav- eller I

35 serumfrit medium, og den biologisk aktive hNGF høstes fra det brugte I

dyrkningsmedium. H

DK 175764 B1 3 I en yderligere udførelsesform tilvejebringes et hNGF-ekspressionssystem omfattende en DNA-kodningssekvens for hNGF eller derivater deraf og regulatoriske elementer, der er nødvendige for transfektionen af hNGF-kodningssekvensen i et baculovirus-ekspressionssystem, som kan inficere insektceller med den resulterende ekspression 5 af hNGF eller et biologisk aktivt derivat deraf.

I en yderligere udførelsesform af opfindelsen tilvejebringes rekombinant biologisk aktiv hNGF, der kan opnås fra et baculovirus-ekspressionssystem, og som er fri for urenheder, der almindeligvis associeres med hNGF fra naturlige kilder.

10 I endnu en udførelsesform af opfindelsen fremstilles den biologisk aktive hNGF som et farmaceutisk præparat til anvendelse ved behandling af fx neurologiske sygdomme, såsom Alzheimers sygdom.

15 Kort beskrivelse af tegningen

Fig. 1 ser aminosyresekvensen af den modne hNGF-li-underenhed, I

fig. 2 viser konstruktionen af pAc373mhNGF-plasmider, fig. 3 viser konstruktionen af pAcYMhNGF-plasmider, fig. 4 viser sølvfarvning og Western blot-analyse af hNGF, der er oprenset 20 fra virusinficerede cellesupematanter, fig. 5 viser PC12-celler behandlet med dyrkningsvæske ffa pAcY2MhNGF rekombinant baculovirus-inficerede celler, fig. 6 viser starthastigheden som vist ved neurit-udvækst, fig. 7 viser den biologiske aktivitet, der kan tilskrives den baculovirus-25 producerede hNGF og fig. 8 viser reduktionen af hukommelse og kognitiv svækkelse hos rotter ved administrering af hNGF.

Biologisk aktiv hNGF kan ekspresseres i et baculovirussystem ved konstruktion af et 30 kimært gen, der består af genet for præ-pro-hNGF, hvilket gen er bundet til polyhedrinpromotoren og -ledersekvensen fra baculoviralt DNA. Eksempler på plasmider, der bærer promotoren og ledersekvensen fra baculoviralt DNA, omfatter pAcYMI (Bishop, D.H., J. of Gen. Virol. 68:1233 (1987)), pAC101 (US 4.745.501), pAc373 (Smith, G.E., Proc. Natl. Acad. Sri. USA 82:8404 (1985)) og pEV51 (Rice, 35 W.C., J. Virol. 61:1712 (1987)). I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen indsættes hNGF-genet i plasmidet pAcYMI.

______ I DK 175764 B1

I I

Kodningssekvensen for hNGF er tilgængelig fra adskillige kilder, fx ved syntese af I

H genet under anvendelse af den kendte DNA-sekvens eller ved at anvende I

H standardkloningsteknikker, der er kendte for fagmanden. cDNA-kloner, der bærer I

5 hNGF-kodningssekvensen, kan identificeres under anvendelse af oligonukleotid- I

H hybridiseringsprober, der er specifikt konstrueret på basis af den kendte hNGF- I

H sekvens. I

Efter at hNGF-kodningssekvensen er opnået, indsættes den i en baculovirus- I

H 10 kloningsvektor såsom pAcYMI. Kloningsvektoren konstrueres på en sådan måde, at I

! der tilvejebringes de hensigtsmæssige regulatoriske funktioner, der er nødvendige til I

effektiv transkription, translation og processering af kodningssekvensen. I

l ét aspekt af opfindelsen omfatter de rekombinante DNA-molekyler, som producerer I

15 hNGF i S. frugiperda-celler, DNA-kodningssekvensen for hNGF-precursor indsat i en I

baculovirus-transplaceringsvektor. Med transplaceringsvektor menes et plasmid, i I

hvilket det fremmede gen af interesse kan indsættes nedstrøms for I

polyhedrinpromotoren. Derudover indeholder transplaceringsvektoren tilstrækkelige I

, mængder af polyhedringensekvensen til at muliggøre homolog rekombination med I

: 20 vildtype-baculovirusgenomet, således at virusafkommet nu vil indeholde den I

fremmede gensekvens af interesse under kontrol af den virale polyhedrinpromotor. I

I Ved at udnytte den baculovirale promotor ekspresseres den modne hNGF-precursor I

og processeres efterfølgende til moden hNGF. Den modne hNGFudskilles derefter fra I

I 25 celler, der er inficeret med det rekombinante virus. I

I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen er den nyttige baculovirus ved denne I

I 1 homologe rekombination Autographa californica betegnet AcNPV. Andre , I

I baculovirussystemer omfatter fx insektvirus isoleret fra Bombyx mori og Heliothis zea I

I 30 og lignende, mere generelt dem, der er anført i EP 228 036. Det bestemte I

I baculovirussystem, der anvendes, bestemmes af den type genetisk manipulation, der I

I skal udføres. I

Genet for hNGF indsættes i baculovirus-transplaceringsvektoren, således at én af I

I 35 methionin-initieringskodonerne er tilgængelig. hNGF-genet som beskrevet indtil nu I

I (Ullrich et al., Cold Sprinq Harbor Symposia on Quant Biol. XLVII1. s. 435 (1983)) har a 5 DK 175764 B1 methioniner ved position -121 og -119, som sandsynligvis kan anvendes som translationsinitieringskodoner (position 1 henviser til den N-terminale serinrest i moden hNGF, se fig. 1). I modsætning hertil har muse-underkæbekirtel-cDNA'et for NGF, der er den mest grundigt undersøgte af nervevækstfaktorerne, en methionin ved position 5 -187 foruden dem ved position -121 og -119. Det er ikke klart, hvilken af kodonerne der fungerer som translationsinitieringskodon i mennesker eller mus.

Undersøgelser med mRNA, der svarer til muse-cDNA'et, viser, at in vitro translation med en hvedekimsekstrakt kan initiere translation ved methionin -187 (Edwards et al., 10 J. Biol. Chem. 263:6810 (1988)). I overensstemmelse med denne observation er en NGF-precursor blevet isoleret fra muse-underkæbekirtler (Saboori og Young,

Biochemistry 25:5565 (1986)), hvilket antyder, at translationsinitiering kan finde i sted ved methionin -187 i underkæbekirtlen. Det er imidlertid også påvist, at der fremstilles mindst tre forskellige NGF-mRNA-arter i mus (Selby et al., Mol, and Cellular 15 Biol. 7:3057 (1987)). Denne diversitet tilskrives alternativ splejsning og/eller uafhængig initiering fra alternative promotorer. Da nogle af disse alternative muse-NGF-mRNA’er mangler methioninkodonen ved -187, er det blevet sluttet, at translation også kan initieres ved methionin -121 eller -119 (Selby et al., supra).

20 I modsætning til muse-NGF-genet er den humane NGF-genstruktur ikke blevet karakteriseret i samme udstrækning. Således er det ligeledes uklart, hvilken af methionin kodonerne der udnyttes til translationsinitiering. Det har nu vist sig (som illustreret i eksempel 3), at translationsinitiering mest effektivt finder sted ved methionin -121 (betegnet 2-MET-positionen] i baculovirus-ekspressionssystemet, 25 mens initiering ved methionin -119 [betegnet 1-MET-positionen] er blevet påvist at finde sted ineffektivt, hvis overhovedet.

Det er også blevet observeret, at korrekt ekspression og sekretion af biologisk aktiv hNGF under anvendelse af baculovirus-ekspressionssystemet ifølge opfindelsen 30 kræver nærværelse af pro-NGF-sekvensen. Forsøg på at deletere pro-sekvensen, dvs. splejse (præ-)signalsekvensen direkte sammen med den modne hNGF-sekvens, resulterer i manglende hNGF-sekretion.

Ved den foretrukne udførelsesform af opfindelsen indsættes genet for hNGF i en 35 transplaceringsvektor til dannelse af et kimært gen. Ved at cotransficere celler med transplaceringsvektoren, der indeholder det fremmede gen af interesse og vildtype-

DK 175764 B1 I

baculovirusgenomisk DNA, resulterer homolog rekombination mellem virion-DNA'et og H

transplaceringsvektoren i et rekombinant genom, der indeholder det kimære NGF-gen H

indsat i baculovirus-polyhedringenet. Virus, der indeholder det rekombinante genom, I

klones ved plaque-oprensning og udnyttes som ekspressionsvektor. Insektceller, der H

5 er inficeret med ekspressionsvektoren, dyrkes i lav· eller serumfrit medium, og hNGF H

høstes fra det brugte dyrkningsmedium. H

Nærmere bestemt konstrueres de transplaceringsvektorer, der indeholder hNGF- H

I genet, ved modifikation af det plasmid, som bærer hNGF-genet. Plasmidet modificeres I

10 på en sådan måde, at der indsættes et hensigtsmæssigt restriktionssted både I

opstrøms og nedstrøms for den hNGF-kodende sekvens. Modifikationen opnås ved I

anvendelse af syntetiske adaptorer. Fx syntetiseres to oligonukleotid-adaptorer med I

de ønskede restriktionssteder. Den første adaptor: I

5’GGGG AT CCAAATATGT CC AT GTTGTTCTACACT CT3' og 15 5'G AT CAG AGT GTAGAACAACATGGACATATTTGG AT CCCC3', har BamHI-skæringsstedet umiddelbart opstrøms for den første af de to mulige initieringskodoner [2-MET-positionen, position -121, se fig. 1]. I modsætning hertil har

den anden adaptor 5'GGGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTCT3' og I

5’G AT C AG AGT GT AGAACAACAT ATTT G G ATCCCC3', restriktionsstedet anbragt ved

20 siden af den anden methioninkodon [1-MET-positionen, position -119, se fig. 1]. I

Derudover indsættes syntetiske linkere, fx 5’pCAGATCTG, nedstrøms for hNGF-genet I

for at indlemme et hensigtsmæssigt restriktionssted. I

I et andet eksempel kan der indsættes et plasmid, der bærer hNGF-genet, umiddelbart H

25 nedstrøms for baculovirus-polyhedringenpromotoren, hvorved den baculovirale H

polyhedrinpromotor udnyttes til transkriptionsinitiering. I

Ud over de ovennævnte metoder, som tilvejebringer methionin-initieringskodonen, er H

det også muligt at konstruere et hybridt eller kimært gen, hvor præ-pro-delene af NGF- H

30 genet stammer fra muse-underkæbekirtel-cDNA'et, mens den del af NGF'en, der H

koder for moden NGF, er den humane NGF-gensekvens (fig. 1). Et sådant hybridt eller H

kimært gen tillader potentielt translationsinitiering ved methionin -187, der er til stede i I

muse-præ-pro-NGF-delen, mens det resulterer i ekspressionen af moden hNGF. Det H

er påvist, at et sådant kimært gen foldes korrekt eller processeres post-translationelt. I

35 Under anvendelse af baculovirus-ekspressionssystemet har et kimært gen givet biologisk aktiv hNGF.

7 DK 175764 B1

Under anvendelse af de ovennævnte syntetiske adaptorer er de resulterende transplaceringsvektorer konstrueret således, at genet for hNGF er lokaliseret ved siden af én af de to tilgængelige methionin (met)-startkodoner. Den modificerede 5 sekvens for hNGF kombineres med en egnet baculovirus-transplaceringsvektor, fx pAcYMI, for at indsætte hNGF-genet i den rigtige orientering. Det resulterende plasmid indeholder en baculoviral promotor tæt ved én af de mulige NGF-methionin-initieringskodoner.

10 De således konstruerede rekombinante baculovirus-transplaceringsvektorer selekteres fx ved screening for restriktionsenzymskæringssteder eller ved DNA-sekventeringsteknikker, der er velkendte inden for området.

Ud over de bestemte vektorer, der er illustreret i eksemplerne, er derivater af disse 15 bestemte vektorer også specifikt dækkede. Derivater omfatter vektorer, der indeholder modifikationer, som ikke signifikant påvirker deres hovedrolle til tilvejebringelse af hNGF-genet i ekspresserbar form, såsom modifikationer i enzymrestriktionssteder.

Når hNGF-transplaceringspiasmideme er selekterede, kan det plasmid, der indeholder 20 det kimære hNGF-gen, co-transficeres sammen med det baculovirale DNA ind i en egnet insektværtscelle. En sådan værtscelle kan fx være S. frugiperda (hensigtsmæssigt cellinje Sf9, ATCC nr. CRL 1711), A. califomica, Heliothis zea-larver og lignende. Transfektion udføres under anvendelse af standardteknikker. Sådanne teknikker omfatter fx viral transfektion, DEAE-dextraninduceret pinocytose, 25 calciumphosphatudfældning og som det nyeste lipofektion. I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen udføres transfektion under anvendelse af en lipofektionsteknik som beskrevet af Feigner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987).

30 Efter transfektion dyrkes cellerne i dyrkningsmedium. Den brugte supernatant høstes hensigtsmæssigt efter 3 eller 4 dage og udplades på konfluente monolag af værtsceller. Okklusionsnegative plaques, som er en indikation for rekombinante virus, udtages og plaque-oprenses yderligere.

35 Til ekspression inficeres egnede insektværtsceller, fortrinsvis Sf9-celleme, derefter med den rekombinante virus med hensigtsmæssigt 0,01-10 plaquedannende

I DK 175764 B1 I

I I

enheder/celle og dyrkes efterfølgende på fortrinsvis lav· eller serumfrit medium. H

Dyrkningsvæsken høstes hensigtsmæssigt efter 3-7 dage, og der udføres H

I standardidentifikationsassays, fx immunassays såsom ELISA og Western blot- I

analyse, eller biologiske assays såsom PC^-celledifferentiering (L.A. Greene, I

| 5 Trends Neurosci 7:91 (1986)). H

H

I For at øge den proteolytiske processering af præ-pro-NGF-precursoren kan de I ovennævnte metoder fremmes ved coinfektion af værtscellen med andre

rekombinante virus. Fx kan den proteolytiske processering af præ-pro-hNGF i S. I

10 frugiperda øges ved coinfektion af S. frugiperda-cellerne med rekombinante virus, der

indeholder generne for hNGF's β-underenhed og for mNGF's γ-underenhed. Der kan I

I også anvendes coinfektion med rekombinante virus, der indeholder hNGF's β- I underenhed og gær-KEX 2-geneme, eller rekombinante virus, der indeholder generne

for hNGF's β-underenhed og en human kallikreinprotease. I

I 15 I

hNGF'en ifølge opfindelsen kan yderligere oprenses fra det brugte dyrkningsmedium. I

I Standardproteinoprensningsteknikker, fx ionbytterkromatografi, omvendt H

I fasekromatografi, affinitetskromatografi, størrelseseksklusionskromatografi, I

I isoelektrisk fokusering og lignende, kan anvendes. I

1 20 I

I Til anvendelse som et terapeutikum kan hNGF yderligere oprenses til opnåelse af I

I hNGF af farmaceutisk renhed. En farmaceutisk formulering er en sådan, at en H

I dosisenhed hNGF omfatter en effektiv mængde hNGF i en egnet farmaceutisk bærer I

I til at være effektiv ved behandling af Alzheimers sygdom (AD) og andre neurologiske H

I 25 lidelser.

I Patologien af AD, den mest almindelige form for demens, er kompleks og involverer I

I mange neuronale systemer. Det mest konsistente neuropatologiske fund i AD-hjerner

I er et udtalt tab af centrale cholinerge neuroner (Hyman et al., Science 225:1168-1170 H

I 30 (19841: Pearson et al.. Brain Research 289:395 (19831: Whitehouse et al.. Science I

I 215:1234 (1982)). Dette tab er relateret til alvorligheden af demens (Perry et al., British

I Med. Journal 2:1457 (1978)) og kvantitativt korreleret til antallet af neuritiske plaques. I

i Det cholinerge neuronale underskud synes at være begrænset til neuroner, der

I | danner de opadgående reaktionsveje af den basale forhjernekeme (medial septum og I

I ! 35 nucleus basalis), som udstrækker axonale projektioner til hippocampus og cortex. I

I Disse to områder er særlig vigtige for den kognitive funktion (Mann et al., J. Neural. I

9 DK 175764 B1

Neurosurg. Psychiatry 49:310 (1986)). Tabet af disse neuroner resulterer i en markant cerebral atrofi i både cortex og hippocampus og betragtes som et hovedbidrag til de karakteristiske hukommeisesmangler for AD.

i 5 Forskellige metoder til behandling af AD er blevet anvendt på basis af disse neurokemiske mangler, de for tiden mest lovende er oral physostigmin, en acetylcholinesterase-inhibitor. Intravenøs administration af physostigmin har vist sig at forbedre den kognitive funktion hos nogle AD*patienter (Mohs et al., Am. J. Psychiatry 142:28 (1985); Davis et al., New England J. Med. 308:721 (1983); Christie et al., Br. J.

10 Psychiatry 138:46 (1981)). selv om dets kliniske anvendelse er begrænset af dets korte halveringstid. Anvendelsen af neurotrofe faktorer, i særdeleshed nervevækstfaktor (NGF), både for at forhindre cholinerg neuronal degenerering og for at forøge neuronal regenerering (Hefti, Ann. Neurol. 13:109 (1983)), er for nylig blevet foreslået som en ny metode til AD-behandling. Se også Hefti, Ann. Neurol, 20:275 15 (1986).

NGF's rolle blev i begyndelsen tilskrevet regulering af udviklingen og vedligeholdelsen af specifikke funktioner af hvirveldyrs perifere, sympatiske og neurale "cresf-afledte sensoriske neuroner (Lev-Mon-talcini og Angeleti, Phvsiol. Rev. 48:534 (1986)). For 20 nylig er det også blevet fastslået, at NGF har en trofisk rolle for opadgående cholinerge neuroner i den basale forhjerne.

NGF, dens RNA-transkripter og receptorer er til stede i høje niveauer i de hippocampus- og cortex-områder, der er innerveret af disse cholinerge neuroner i 25 forhjernen (Korching et al., EMBO J, 4:1389 (1985); Riopelle et al., Proc. Soc.

Neurosci 11:1056 Π9851: Raivich et al.. Neurosci. 20:23 (1986); Shelton et al.. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 83:2714 (1986)). Stimulering af NGF-receptorer på cholinerge neuroner resulterer i en forøget cholinacetyltransferase (ChAT)-aktivitet i striatum og den basale forhjernekerne (Mobley et al., Mol. Brain Res. 387:53 (1986); Science 30 229:284 (198511.

Måske er de mest overbevisende beviser for, at NGF har en trofisk rolle på de basale forhjemeneuroner, følgende: (a) efter læsioner på den septo-hippocampale reaktionsvej hos rotter er der en dramatisk stigning i endogen NGF (Gasser et al., 35 Brain Res. 376:351 (1986)), og (b) NGF fremmer overlevelse af septale cholinerge neuroner og forhindrer kognitiv svækkelse efter fimbrial transektion (Gage et al., J.

I DK 175764 B1 I

I io I

I Comp. Neurol, 269:147 (1986); Hefti, J. Neurosci. 6:2155 (1986); Williams et al., Proc. I

I Natl. Acad. Sci. USA 83:9231 (1986)). Baseret på disse observationer er det muligt, at I

I tab af cholinerge neuroner, der observeres ved AD, kan være en konsekvens af I

I hjememålvævs manglende evne til at syntetisere tilstrækkelige mængder NGF til I

I 5 bevarelse af disse neuroner. Alternativt kan det reflektere en abnormalitet ved I

I cholinerge neuroners respons over for NGF, dvs. receptorabnormalitet. Selv hvis der I

I ikke er involveret afvigende NGF-responser i AD's patologi, kan NGF stadig være I

anvendelig til at forsinke eller forhindre svækkelse af cholinerge neuroner og/eller I

I forøge ChAT-aktivitet i tilbageværende neuroner. I

I

M Et effektivt farmaceutisk præparat til behandling af AD kan administreres ved en I

I hvilken som helst af mange rutiner, alt afhængigt af den pågældende slutanvendelse. I

Den mest egnede rute vil afhænge af anvendelsen og det involverede individ. I

I 15 Den nøjagtige dosis og det nøjagtige administrationssystem vil afhænge af det I

I behandlede individs behov og lidelsesgraden. Fremgangsmåder til formulering af I

I proteiner til opnåelse af et effektivt farmaceutisk præparat er kendte for fagmanden. I

Præparatet er hensigtsmæssigt en steril opløsning. Det administreres I

20 hensigtsmæssigt ved kontinuerlig intraventrikulær infusion i hjernen ved hjælp af en I

I kanyle. Kanylen kan hensigtsmæssigt være forbundet til en minipumpe. Sådanne I

minipumper kan indsættes under huden og kan indeholde et vidtrækkende I

medikamentreservoir (nok til uger eller endog måneder). Behandlingen finder I

hensigtsmæssigt sted i en længere periode på uger eller måneder. Egnede I

I 25 doseringsgrader forudses at være i området 0,1-100 μg hNGF pr. dag ind i hjernen, I

mere hensigtsmæssigt 2,5-5 pg/dag. Det er tænkeligt, at præparatet alternativt kan I

administreres ind i rygmarven. Det vil sandsynligvis være nødvendigt med større doser I

via denne administrationsvej. I

30 Opfindelsen er særlig fordelagtig til tilvejebringelse af høje mængder hNGF, hvilket I

tillader en grundig undersøgelse af dens egenskaber. Udbytter er hensigtsmæssigt i I

størrelsesordenen op til 5 pg/ml, fortrinsvis op til 10 pg/ml, dyrkningsvæske. I

Følgende eksempler illustrerer, men begrænser ikke opfindelsen. Medmindre andet er I

35 angivet, var alle enzymer, der blev anvendt ved de genetiske manipulationer, opnået I

11 DK 175764 B1 fra kommercielle kilder og blev anvendt i det væsentlige i overensstemmelse med forhandlerens instruktioner. Kloningsprocedurer blev udført i det væsentlige som beskrevet af Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, medmindre andet specifikt er beskrevet.

5 EKSEMPEL 1

Isolering af det humane ft-nervevaekstfaktoraen

Et humant leukocytgenomisk bibliotek (konstrueret under anvendelse af kloningsvektoren A-EMBL-3) blev opnået fra Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, 10 CA). Ca. 1,5 x 106 pfu af de rekombinante fager blev anvendt til at inficere E. coli LE392-celler [Silhavy, T.J. Experiments with Gene Fusion. Cold Spring Harbor Laboratory, s. xi-xii (1984)] ved en infektionsmultiplicitet på 0,01. Efter absorption ved | 37°C i 20 minutter blev de inficerede celler fortyndet med 0,7% blød agar og udpladet på 12 friskfremstillede Luria Broth (LB)-plader (150 mm). Efter 6 timer ved 37°C blev ' 15 pladerne fjernet fra inkubatoren og afkølet natten over. Fagplænerne blev derefter sekventielt dækket med to stykker nitrocellulosefilter (BA85/20 0,45 mm, Schleicher &

Schuell). Nitrocellulosefiltrene blev derefter denatureret med base (15 minutter med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI), neutraliseret (15 minutter med 0,5 M Tris-HCI, pH 8,0 og 1,5 M NaCI), vasket (15 minutter med 6 x SSC (saltvand, natriumcitrat) og bagt ved 20 80eC i 2 timer. Før hybridisering blev filtrene behandlet med præ- hybridiseringsopløsning (6 x SSC, 0,1% SDS, 5 x Denhardts opløsning, 1 mM EDTA, 100 mp/ml laksesperm-DNA, 100 mp/ml gær-tRNA og 0,05% Na-pyrophosphat) i 16 timer ved 65eC. 32P-mærket (ved nick-translation, specifik aktivitet 3 x 108 cpm/pg) muse-B-NGF-cDNA (gave fra dr. W. Rutter, Nature 302:538 (1983)) blev derefter sat til 25 nitrocellulosefiltrene, og hybridisering (6 x SSC, 0,1% SDS, 2% skummetmælk ("skim fat milk"), 1 mM EDTA, 0,05% Na-pyrophosphat, 100 pg/ml dextransulfat) blev udført ved 65“C i 16 timer. Filtrene blev derefter vasket to gange med 2 x SSC, 0,1 % SDS, og én gang med 0,6 x SSC, 0,1 % SDS (10 minutter hver). Filtrene blev lufttørret og eksponeret på røntgenfilm ved -70eC.

30

Fagplaques. som gav positive hybridiseringssignaler, blev udvalgt og underkastet to yderligere runder af subkloning og hybridisering. Under den tredje hybridiseringsrunde blev der også anvendt et ende-mærket syntetisk oligonukleotid (28mer), der var komplementært til det humane NGF-gen 35 (5'GAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCA3'), som hybridiseringsprobe. DNA’er fremstillet fra de positive fager blev karakteriseret ved restriktionsenzymskæringer og

I DK 175764 B1 I

I I

I Southern blot-analyse under anvendelse af enten nick-translateret muse-B-NGF-cDNA I

I eller det ovennævnte syntetiske oligonukleotid som probér. Fager, som gav I

I hybridiseringsfragmenter på de forventede størrelser (dvs. 1,8, 5,7 og 4,4 kb for I

I henholdsvis Bglll-, EcoRI- og Hindlll-fragmenter), blev valgt. Det 1,8 kb lange Bglll- I

I 5 fragment, der indeholder hele kodningssekvensen for præ-pro-human IJ-NGF- I

underenheden, blev skåret ud fra fag-DNA'et og overført til en pUC8-plasmidvektor I

I (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA) (via dets kompatible I

I BamHI-sted). Plasmidafkommet blev betegnet phNGF#5. I

I 10 EKSEMPEL 2 I

I Fremstilling af pAC373mhNGF I

Konstruktionen af pAC373mhNGF var en flertrinsprocedure (fig. 2). I korthed I

involverede konstruktionen den indledende samling af et kimært NGF-gen i vektoren I

I pUC8, hvor 5'-enden af NGF-kimæren bestod af et muse-underkæbekirtel-NGF-cDNA, I

I 15 og 3'-enden af NGF-kimæren bestod af et fragment af humant genomisk DNA, der I

I koder for den modne humane NGF-sekvens. I

I Baculovirus-transfektionsplasmidet pAC373 (Smith, G.E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA I

I 82:8404 (1985)), som har et unikt BamHI-sted umiddelbart nedstrøms for den I

I 20 polyhedrone genpromotor og et unikt Kpnl-sted inden for en del af polyhedrin- I

strukturgenet, blev modificeret til at acceptere NGF-kimæren ved at ligere en adaptor I

ind i BamHI- og Kpnl-restriktionsstedeme; adaptoren indeholdt unikke Smal- og Pstl- I

I restriktionssteder. Det kimære muse/humane NGF-gen blev derefter skåret I

I ud fra pUC8-vektoren som et Smal-Pstl-fragment og indsat i deri modificerede I

25 pAC373-vektor via Smal- og Pstl-restriktionsstedeme. I

Et plasmid betegnet pmNGF blev opnået fra dr. Eric Shooter, Dept, of Neurobiology,

Stanford University, School of Medicine, Stanford, CA 94305. Plasmidet pmNGF I

består af Smal-Pstl-fragmentet på 961 basepar fra det muse-underkæbekirtel-cDNA, I

30 der koder for muse-NGF-precursoren (præpro-muse-NGF) beskrevet af Scott et al., I

I Nature 302:538 (1983), der er subklonet ind i vektoren pGEM1 (Promega, Middleton, I

Wisconsin, USA) via Smal- og Pstl-restriktionsstedeme. I

10 pg pmNGF blev fordøjet med restriktionsendonukleasen EcoRI (Bethesda I

H 35 Research Laboratories) under anvendelse af betingelser, der er anbefalet af I

forhandleren. EcoRI-spaltet DNA blev derefter spaltet med Pstf (Bethesda Research I

13 DK 175764 B1

Laboratories) i overensstemmelse med forhandlerens anbefalinger. De fordøjede DNA-fragmenter blev resolveret ved elektroforese på en 0,7%'s agarosegel, og fragmentet på ca. 1000 basepar blev udvundet fra gelen ved DEAE-nitrocellulosemetoden ifølge Dretzen et al., Anal. Biochem. 112:295 (1981). Ca. 0,5 pg 5 af det udvundne EcoRI-Pstl-fragment blev yderligere fordøjet med restriktions-endonukleasen Xholl (New England Biolabs, Waltham, Mass., USA) under anvendelse af betingelser, der er anbefalet af forhandleren. Det fordøjede DNA blev phenolekstraheret, ethanolfældet, tørret og resuspenderet i sterilt destilleret vand i en koncentration på 50 nanogram pr. mikroliter.

10

Et halvt mikrogram af plasmidet pUC8 blev fordøjet med BamHI (Bethesda Research Laboratories) under anvendelse af betingelser, der er anbefalet af forhandleren. Det BamHI-spaltede DNA blev yderligere spaltet med restriktionsendonukleasen EcoRI. Det spaltede DNA blev phenolekstraheret og 15 ethanolfældet. Det Xholl-spaltede EcoRI-Pstl-fragment fra pmNGF blev ligeret til det BamHI- og EcoRI-spaltede pUC8 i en 25 pi reaktionsblanding indeholdende 125 ng EcoRI- og BamHI-spaltet pUC8, ca. 125 ng Xholl-spaltet EcoRI-Pstl-fragment fra pmNGF, 1,25 pmol Tris-HCI, pH 7,8, 0,25 pmol MgCI2,0,50 pmol reduceret dithiothreitol, 2,5 nmol ATP og 1 enhed T4 DNA-ligase (Bethesda Research 20 Laboratories). Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 15°C i 16 timer.

Ugeringsblandingen blev transformeret ind i kompetente E. coli TG 1-værtsceller (Taylor, J.W., Nucl. Acids Res. 13:8749 (1985)) og udpladet på L-agarplader (10 g trypton, 5 g gærekstrakt, 10 g NaCI, 15 g bactoagar pr. liter) indeholdende 50 pg/ml 25 ampicillin, 50 pg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-B-D-galactopyranosid og 0,05 pmol/ml isopropyl-B-D-thiogalactopyranosid. Efter dyrkning natten over ved 37°C blev 12 farveløse kolonier tilfældigt udvalgt og hver inokuleret i 1,5 ml L-broth indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter 5 timers dyrkning ved 37°C på et rystebord blev minilysat-DNA fremstillet fra hver kultur ved metoden ifølge Birnboim og Doly, Nucleic Acids j 30 Research 7:1513 (1979). Efter spaltning med EcoRI og BamHI gav fire af disse minilysat-plasmid-DNA-præparationer det forventede fragment på ca. 580 basepar (den Xholl-genererede DNA-ende har i dette tilfælde en sådan sekvens, at den, når den ligeres til en BamHI-genereret DNA-ende, regenererer BamHI-stedet). Ét af disse plasmider, betegnet pmNGF#2, blev anvendt til yderligere konstruktion.

35

I DK 175764 B1 I

I I

For at introducere et Xholl-fragment af humant genomisk DNA, som koder for den ; I

I modne del af hNGF, i BamHI-stedet på pmNGF#2 blev vektoren pmNGF#2 spaltet | I

med BamHI og behandlet med alkalisk phosphatase for at forhindre selvligering. 1 pg I

I pmNGF#2 blev fordøjet med restriktionsendonukleasen BamHI. Det spaltede DNA I

I 5 blev phenolekstraheret og ethanoifaeldet. Den tørrede DNA-pellet blev derefter I

I resuspenderet i 10 pi sterilt destilleret vand. Det BamHI-spaltede.pmNGF#2 DNA blev I

I derpå behandlet med alkalisk phosphatase i en 21 μΙ reaktionsblanding indeholdende I

I 1 pg BamHI-spaltet pmNGF#2, 0,315 pmol natriumborat, pH 10,4, og 1 enhed alkalisk I

I kalvetarmsphosphatase (Sigma Chemicals) ved inkubation ved 37°C i 1 time. Efter 1 I

10 time blev der tilsat EDTA, pH 8,0, til en slutkoncentration på 5 mM, og blandingen blev I

! inkuberet ved 68°Ci15 minutter. Blandingen blev dernæst phenolekstraheret, I

I ethanoifaeldet, tørret og resuspenderet i sterilt destilleret vand. I

I I 10 pg phNGF#5 (beskrevet i eksempel 1) blev fordøjet med restriktionsendonukleasen I

15 Xholl (New England Biolabs) ifølge leverandørens anvisninger. Derefter blev det I

Xholl-fordøjede phNGF#5 DNA fordøjet med Pvull (Bethesda Research Laboratories) I

I ifølge leverandørens anvisninger. Det Xholl-fragment, der blev afledt af pUC8- I

' vektordelen af plasmidet, havde omtrent samme størrelse som det ønskede 1004 I

I basepar lange hNGF genomisk DNA-afledte Xholl-fragment. Det pUC8-afledte I

I 20 fragment indeholdt et Pvull-sted og havde derfor en reduceret størrelse i forhold I

I til det hNGF genomisk DNA-afledte fragment som ikke indeholdt et Pvull-sted. De I

I fordøjede DNA-fragmenter blev resolveret ved elektroforese på en 0,7% agarosegel, I

I og det omtrent 1000 basepar lange fragment blev udvundet fra gelen ved DEAE- I

I nitrocellulosemetoden beskrevet af Dretzen et al.. Anal. Biochem. 112:295 Π981). I

I 25 I

H Det udvundne 1000 basepar lange Xholl hNGF-genomiske DNA-fragment blev ligeret I

til det med BamHI og alkalisk phosphatase behandlede pmNGF#2 i en 20 μΙ I

reaktionsblanding indeholdende 120 ng BamHI-spaltet og alkalisk phosphatase- I

I behandlet pmNGF#2, 250 ng 1000 basepar langt Xholl hNGF-genomisk DNA, 1 μΜ I

I 30 Tris-HCI, pH 7,8, 0,20 μΜ MgCI2, 0,40 μΜ reduceret dithiothreitol, 2 nM ATP og 1 I

enhed T4 DNA-ligase. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 15°C i 16 timer. '1

20 μΙ-reaktionsblandingen blev transformeret i kompetente E. coli TG 1-værtsceller og I

udpladet på L-agarplader indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter vækst natten over I

35 ved 37°C blev 170 isolerede, tilfældigt udvalgte kolonier enkeltvis udstrøget på I

nitrocellulosefiltre med en diameter på 82 mm (type BA85, Schleicher & Schuell). I

* 15 DK 175764 B1

Kolonihybridiseringsproceduren ifølge Grunstein og Hogness, som er beskrevet i Maniatis (s. 312-315), blev udført under anvendelse af et 28mer syntetisk oligodeoxynukleotid 5'GAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCA3\ som er homologt 5 med det humane genomiske DNA, der koder for en del af den modne form af NGF, som probe efter 32P 5’-endemærkning. 44 af de 170 testede kolonier hybridiserede med 28mer proben. 24 af de positivt hybridiserende kolonier blev enkeltvis inokuleret til 1,5 ml L-broth indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter 5 timers vækst ved 37°C på et rystebord blev der fremstillet minilysat-DNA fra hver kultur ifølge metoden beskrevet af 10 Bimboim og Doly (supra). Efter spaltning med EcoRI gav tre af disse minilysat-plasmid-DNA-præparationer det forventede fragment på ca. 700 basepar. Disse | plasmider blev betegnet pmhNGF#5, pmhNGF#9 og pmhNGF#21.

! DNA-sekvensanalyse af plasmidet pmhNGF#9 viste, at det havde den ønskede I 15 forbindelse mellem muse-cDNA'et og det humane genomiske DNA. 10 pg plasmid pmhNGF#9-DNA blev spaltet med restriktionsendonukleasen Smal (Bethesda l

Research Laboratories) under de af forhandlerenanbefalede betingelser. Efter ethanolfæidning og tørring i vakuum blev det Smal-spaltede DNA yderligere fordøjet med restriktionsendonukleasen Pstl (Bethesda Research Laboratories) under de af 20 forhandleren anbefalede betingelser. Det ca. 1580 basepar lange fragment blev resolveret ved elektroforese på en 0,7% agarosegel, og DNA'et blev udvundet ved DEAE-nitrocellulosemetoden beskrevet af Dretzen et al., Anal. Biochem. 112:295 (1981).

25 Polyhedrinpromotoren indeholdende baculovirus-kloningsvektorplasmidet pAC373 blev modificeret til at acceptere det 1580 basepar lange Smal-Pstl muse/humane kimære NGF-DNA ved indsætning af en adaptor, som indeholdt Smal- og Pstl-restriktionssteder, mellem de unikke BamHI-og Kpnl-steder på pAC373. Det syntetiske 35mer oligodeoxynukleotid 30 5'GAT CCGAGCT CCCGGGAG AT CTAG ACT GCAGGTAC3’ (som indeholder Smal-,

Pstl- og andre restriktionsenzymsteder) blev resuspenderet i destilleret vand i en koncentration på 100 picomol pr. pi. 200 picomol af 35meren blev phosphoryleret ved inkubation i en 20 μΙ reaktionsblanding, som foruden 35meren indeholdt 1,4 μΜ Tris-HCI, pH 7,6, 0,2 μΜ MgCl2,0,1 μΜ dithiothreitol, 1 nM ATP og 7,5 enheder T4-35 polynukleotidkinase (Pharmacia), i 1 time ved 37°C. Enzymet blev derefter inaktiveret , ved opvarmning til 65°C i 10 minutter. Det komplementære syntetiske 27mer

I DK 175764 B1 I

I 16 I

I oiigodeoxynukleotid 5'CTGCAGTCTAGATCTCCCGGGAGCTGG3’ blev behandlet på I

I lignende måde. I

I En 5 μΙ alikvot af hver phosphoryleringsreaktionsblanding (indeholdende 50 picomol af I

I 5 hvert phosphoryleret oiigodeoxynukleotid) blev samlet, og de selv-komplementære I

I oligodeoxynukleotider blev annealet med hinanden ved inkubation ved 70°C i 4 I

minutter, efterfulgt af inkubation ved 37eC i 30 minutter og endelig 23eC i 60 minutter. I

I 3 pg af plasmidet pAC373 blev spaltet med restriktionsendonukleasen Kpnl (Bethesda I

I 10 Research Laboratories). Det Kpnl-spaltede pAC373 blev yderligere spaltet med I

I restriktionsendonukleasen BamHI. Det Kpnl- og BamHI-spaltede DNA blev I

, phenolekstraheret, ethanolfældet, tørret i vakuum og resuspenderet i sterilt destilleret I

vand i en koncentration på 120 ng/μΙ, Det spaltede pAC373-vektor-DNA blev derefter I

ligeret til de annealede oligodeoxynukleotider i en 20 μΙ reaktionsblanding I

I 15 indeholdende 120 ng Kpnl- og BamHI-spaltet pAC373-DNA, 1,0 picomol annealede I

I oligodeoxynukleotider, 1 μΜ Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 μΜ MgCI2, 0,4 μΜ reduceret I

I dithiothreitol, 2 nM ATP og 1 enhed T4 DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev I

I inkuberet ved 15eC i 16 timer. I

I 20 20 μΙ-reaktionsblandingen blev derefter transformeret i kompetente E. coli HB 101- I

værtsceller (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring I

Harbor Laboratory, New York) og udpladet på LB-agarplader indeholdende 50 pg/ml I

ampicillin. Efter vækst natten over ved 37°C blev 12 kolonier tilfældigt udvalgt, og hver I

blev inokuleret til 1,5 ml L-broth indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter 5 timers vækst I

25 ved 37°C på et rystebord blev der fremstillet minilysat-DNA fra hver kultur ifølge I

metoden beskrevet af Birnboim og Doly (supra). I

1 Efter spaltning med Pstl og Xhol (et unikt restriktionssted i pAC373) blev der opnået I

DNA-fragment med den forventede størrelse på ca. 2000 basepar ud fra alle minilysat- I

30 plasmid-DNA-præparationeme bortset fra én. Alle de plasmider, som havde fået et I

Pstl-restriktionssted, viste sig også at have fået et Smal-restriktionssted, hvilket blev I

bestemt ved spaltning med Xhol og Smal. Ét af disse plasmider, betegnet pAC373 I

SSBXP-8, blev anvendt til den endelige plasmidkonstruktion. I

35 1 pg plasmid pAC373 SSBXP-8 blev fordøjet med restriktionsendonukleasen Smal I

under de af forhandleren anbefalede betingelser. Efter ethanolfældning blev den I

17 DK 175764 B1 tørrede Smal-spaltede DNA-pellet resuspenderet i sterilt destilleret vand og yderligere spaltet med Pstl (Bethesda Research Laboratories) under de af forhandleren anbefalede betingelser. Det Smal- og Pstl-spaltede pAC373 SSBXP-8-DNA blev phenolekstraheret og ethanolfældet, og den tørrede DNA-pellet blev resuspenderet i 5 sterilt destilleret vand i en koncentration på 100 ng/μΙ. Den spaltede pAC373 SSBXP-8-vektor blev derefter ligeret til det tidligere isolerede ca. 1580 basepar lange Smal-Pstl-fragment fra pmhNGF#9, som indeholdt muse/human NGF-kimæren, i en 20 pi reaktionsblanding indeholdende 100 ng Smal- og Pstl-spaltet pAC373 SSBXP-8, 250 ng af det ca. 1580 basepar lange Smal-Pstl-fragment fra pmhNGF#9,1,0 μΜ Tris-10 HCI, pH 7,8, 0,20 μΜ MgCI2, 0,40 μΜ reduceret dithiothreitol, 2,0 nM ATP og 1 enhed T4 DNA-ligase. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 15eC i 16 timer.

Ligeringsblandingen blev transformeret i kompetente E. coli HB 101-værtsceller og udpladet på L-agarplader indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter vækst natten over 15 ved 37°C blev 12 kolonier tilfældigt udvalgt, og hver blev inokuleret i 1,5 ml L-broth indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter 5 timers vækst ved 37°C på et rystebord blev der fremstillet minilysat-DNA fra hver kultur ved metoderne beskrevet af Birnboim og Doly (supra). Efter spaltning med EcoRI gav to af disse minilysat-plasmid-DNA-præparationer det forventede 3400 basepar lange fragment.

20 Ét af disse plasmider, betegnet pAC373mhNGF, blev anvendt til co-transfektion af Spodoptera frugiperda Sf9-celler med baculovirus-genomisk DNA på den beskrevet i eksempel 4 nedenfor beskrevne måde. Den resulterende rekombinante virus blev anvendt til infektion af Sf9-insektceller, og derefter blev der udtrykt hNGF på den i 25 eksempel 5 nedenfor beskrevne måde.

EKSEMPEL 3

Fremstilling af pAcYMhNGF-plasmider

Konstruktionen af pAcYMhNGF-plasmider var en flertrinsprocedure (fig. 3). Plasmidet 30 phNGF#5 (beskrevet i eksempel 1) blev først modificeret til at inkorporere hensigtsmæssige restriktionsenzymsteder både opstrøms og nedstrøms for fi-NGF-kodningssekvensen. For at tilvejebringe et opstrøms BamHI-spaltningsted blev der syntetiseret to oligonukleotid-adaptorer. Den første adaptor: 5OGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT3' og 35 5'GATCAG AGT GTAGAACAACATGG ACATATTT GG AT CCCC3',

I DK 175764 B1 I

I I

I har BamHI-spaltningsstedet umiddelbart opstrøms for den første af de to mulige I

I initieringskodoner [2-MET-positionen, -121], hvorimod den anden adaptor: I

I 5,GGGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTCT3‘ og I

I 5’GATCAGAGTGTAGAACAACATATTTGGATCCCC3\ I

5 har restriktionsstedet ved siden af den anden methioninkodon [1-MET-positionen, I

I -119]. I

I 35mer oligodeoxynukleotidet 5’GGGGAT CCAAATAT GT CCAT GTTGTT CTACACTCT3’ I

I blev resuspenderet i destilleret vand i en koncentration på 100 picomol pr. pi. 100 I

I 10 picomol af 35meren blev phosphoryleret ved inkubation i en 20 μΙ reaktionsblanding I

I indeholdende 1,4 μΜ Tris-HCl, pH 7,6, 0,2 μΜ MgCIZl 0,1 μΜ dithiothreitol, 1 nM ATP I

og 7,5 enheder T4-poly-nukleotidkinase (Pharmacia) i 1 time ved 37eC. Enzymet blev I

I derefter inaktiveret ved opvarmning til 65®C i 10 minutter. 39mer oligodeoxy- I

I nukleotidet 5’G AT C AG AGT GTAG AAC AAC AT G G ACATATTTG G AT CCCC3’ blev I

I 15 behandlet på tilsvarende måde. I

I En 5 μΙ alikvot af hver phosphoryleringsreaktionsblanding (indeholdende 25 picomol af I

I hvert phosphoryleret oligodeoxynukleotid) blev samlet, og de selv-komplementære I

I oligodeoxynukleotider blev annealet med hinanden ved inkubation ved 70°C i 4

20 minutter, efterfulgt af inkubation ved 37“C i 30 minutter og endelig 23°C i 60 I

I minutter. I

I Plasmid-DNA fra phNGF#5 blev fremstillet ud fra dam-E. coli-værten GM 48 (dam3-, I

I dcm6, gal, ara, lac, thr, leu, thi, tonA, tsx), og 5 pg af DNA'et blev spaltet med I

25 restriktionsendonukleasen Bell (Boehringer-Mannheim) ifølge leverandørens I

H anbefalinger. Efter ethanolfældning blev den Bcll-spaltede DNA-pellet tørret i vakuum. I

I Den tørnede DNA-pellet blev resuspenderet i sterilt vand og spaltet med I

I endonukleasen Smal. Det Smal- og Bcll-spaltede phNGF#5-DNA blev I

phenolekstraheret, ethanolfældet, tørret i vakuum og resuspenderet i sterilt destilleret I

I 30 vand. Det spaltede phNGF#5-vektor-DNA blev derefter ligeret til de annealede I

H oligodeoxynukleotider i en 20 μΙ reaktionsblanding indeholdende 100 ng (0,038 I

I picomol) Bell- og Smal-spaltet phNGF#5-DNA, 2,5 picomol annealede I

oligodeoxynukleotider, 1 μΜ Tris-HCl, pH 7,8, 0,2 μΜ MgClz, 0,4 μΜ reduceret I

dithiothreitol, 2 nM ATP og 1 enhed T4 DNA-ligase. Ligéringsblandingen blev I

H 35 inkuberet ved 15eC i 16 timer. I

19 DK 175764 B1 20 μΙ-ligeringsblandingen blev derefter transformeret i kompetente E. coli GM 48-værtsceller og udpladet på LB-agarplader indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter vækst natten over ved 37“C blev 12 kolonier tilfældigt udvalgt, og hver blev inokuleret til 1,5 ml L-broth indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter 5 timers vækst ved 37°C på et 5 rystebord blev der fremstillet minilysat-DNA fra hver kultur ved metoden beskrevet af Birnboim og Doly (supra). Efter spaltning med BamHI og Sall gav hver af disse minilysat-DNA'er det forventede 1500 basepar lange fragment. Ét af disse plasmider, betegnet phNGF2M, blev underkastet DNA-sekventering ved metoden beskrevet af Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)) og viste sig at have den ønskede 10 sekvens.

Plasmid phNGFI M blev konstrueret på analog måde under anvendelse af de syntetiske oligonukleotider 5'GGGGATCCAAATATGTTGTTCTACACTCT3’ og 5'G AT CAG AGT GTAG AACAACAT ATTT GG AT CCCC3'. Efter spaltning med BamHI og 15 Sall gav en minilysat-plasmidpræparation af klonen phNGFI M det forventede 1500 basepar lange fragment.

For at opnå et BamHI-kompatibelt nedstrøms-restriktionssted til kloning i pAcYMI (supra) blev en Bglll-linker indsat mellem de to Apal-steder nedstrøms for hNGF-20 DNA'et. 8mer oligodeoxynukleotidet 5'CAGATCTG3' blev phosphoryleret ved inkubation i en 20 pi reaktionsblanding indeholdende 188 picomol af 8meren, 1,4 pM Tris-HCI, pH 7,6, 0,2 pM MgCI2, 0,1 pM reduceret dithiothreitol, 1 nM ATP og 7,5 enheder T4-po!ynukleotidkinase (Pharmacia) i 1 time ved 37°C. Enzymet blev inaktiveret ved opvarmning til 65°C i 10 minutter. 1,6 pg plasmid phNGF2M blev 25 fordøjet med restriktionsendonukleasen Apal (New England Biolabs) under de af leverandøren foreslåede betingelser. Efter phenolekstraktion, ethanolfældning og tørring blev det Apal-spaltede DNA resuspenderet i sterilt destilleret vand i en koncentration på 200 ng/pl. De 3*-overhængende ender af de Apal-spaltede DNA'er blev derefter fjernet ("blunt-ended") ved inkubation med Klenow-fragmentet af E. coli 30 DNA-polymerase I og alle fire dNTP’er. 1,4 pg Apal-spaltede phNGF2M blev inkuberet i en 25 pi reaktionsblanding bestående af det Apal-spaltede DNA, 1,25 pM NaCI, 0,25 pM Tris-HCI, pH 7,5, 0,25 pM MgCfe, 5 nM af hver af dATP, dGTP, dTTP og dCTP og 1 enhed Klenow-fragment af E. coli DNA-polymerase I (Bethesda Research Laboratories) ved 23°C i 10 minutter.

35

I DK 175764 B1 I

I I

I Efter inkubation tiisattes 0,5 μΜ EDTA, pH 8,0, og den resulterende blanding blev H

I phenolekstraheret, ethanolfældet, tørret og resuspenderet ved en DNA-koncentration I

I på 100 ng/μΙ. Det Apal-spaltede og “blunt-ended" phNGF2M-vektor-DNA blev derefter I

I ligeret til 8mer Bglll-linkeren i en 20 μΙ reaktionsblanding indeholdende 100 ng Apal- I

I 5 spaltet og "blunt-ended" phNGF2M, 28 picomol phosphoryleret 8mer-linker, 1 μΜ

I Tris-HCI, pH 7,8, 0,2 μΜ MgCI2, 0,4 μΜ reduceret dithiothreitol, 2 nM ATP og 1 enhed I

I T4 DNA-ligase (Bethesda Research Laboratories). I

I Ligeringsblandingen blev inkuberet ved 23°C i 16 timer. DNA-ligasen blev dernæst I

I 10 inaktiveret ved inkubation ved 65°C i 10 minutter. Det ligerede DNA blev derefter I

I spaltet med restriktionsendonukleasen Bglll (Bethesda Research Laboratories) under I

I de af leverandøren anbefalede betingelser. Efter phenolekstraktion, ethanolfældning I

I og tørring blev DNA'et resuspenderet i sterilt destilleret vand i en koncentration på 10 I

I ng/μΙ, og DNA'et blev religeret i en 20 μΙ reaktionsblanding indeholdende 100 ng DNA, I

I 15 1 μΜ Tris-HCI, pH 7,8, 0,2 μΜ MgCI* 0,4 μΜ reduceret dithiothreitol, 2 nM ATP og 1 I

I enhed T4 DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev inkuberet ved 23°C i 16 timer. 20 μΙ- I

I ligeringsblandingen blev derefter transformeret i kompetente E. coli HB 101-

I værtsceller og udpladet på LB-agarplader indeholdende 50 pg/ml ampiciflin. I

I , 20 Efter vækst natten over ved 37eC blev 6 kolonier tilfældigt udvalgt, og hver blev I

inokuleret til 1,5 ml L-broth indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter 5 timers vækst ved I

I 37° C på et rystebord blev der fremstillet minilysat-DNA fra hver kultur ved metoden

I beskrevet af Birnboim og Doly (supra). Efter spaltning med BamHI og Bglll gav to af I

I minilysat-plasmid-DNA-præparationerne fra ligering af phNGF2M det forventede ca.

I 25 780 basepar lange fragment. I

I , Plasmid phNGFIM blev konstrueret på analog måde, og det 780 basepar lange I

BamHI-Bglll-fragment blev oprenset. I

I i 30 Ca. 2 pg plasmid phNGF2M-DNA blev spaltet med restriktionsendonukleaseme I

I BamHI og Bglll. De spaltede DNA-fragmenter blev resolveret ved elektroforese på en I

0,7% agarosegel, og det ca. 780 basepar lange fragment blev udvundet fra gelen ved H

DEAE-nitrocellulosemetoden beskrevet af Dretzen et al., Anal. Biochem. 112:295 I

(1981). Det udvundne DNA blev resuspenderet i sterilt destilleret vand i en I

I 35 koncentration på 30 ng/μΙ. I

21 DK 175764 B1 9 pg af polyhedrinpromotoren indeholdende baculovirus-transplaceringsplasmidet - pAcYMI (Y. Matsu ura, J. of Gen. Virol. 68:1233 (1987)) blev spaltet med restriktionsendonukleasen BamHI under betingelser anbefalet af leverandøren. Efter phenolekstraktion, ethanolfældning og tørring blev det BamHI-fordøjede pAcYMI 5 resuspenderet i sterilt destilleret vand og behandlet med alkalisk phosphatase i en 21 pi reaktionsblanding indeholdende 9 pg BamHI-spaltet pAcYMI, 0,315 pM natriumborat, pH 10,4, og 1 enhed alkalisk kalvetarmsphosphatase (Sigma) ved inkubation ved 37°C i 1 time. Efter 1 time tilsattes EDTA, pH 8,0, til en slutkoncentration på 5 mM, og blandingen blev inkuberet ved 68°C i 15 minutter.

10 Blandingen blev derefter phenolekstraheret, ethanolfældet, tørret og resuspenderet i sterilt destilleret vand;

Det tidligere oprensede ca. 780 basepar lange BamHI-Bglll-fragment fra phNGF2M blev derefter ligeret til det BamHI-spaltede og alkalisk phosphatase-behandlede 15 pAcYMI i en 20 pi reaktionsblanding indeholdende 100 ng BamHI-spaltet og phosphatase-behandlet pAcYMI, 225 ng BamHI-Bglll (780 basepar langt fragment) fra phNGF2M, 1 pM Tris-HCI, pH 7,8, 0,2 pM MgCfe, 0,4 pM reduceret dithiothreitol, 2 nM ATP og 1 enhed T4 DNA-ligase. Ligeringsblandingen blev inkuberet ved 15eC i 16 timer.

20 20 pl-ligeringsblandingen blev derefter transformeret i kompetente E. coli HB 101-værtsceller og udpladet på LB-agarplader indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter vækst natten over ved 37°C blev 12 kolonier tilfældigt udvalgt, og hver blev inokuleret til 1,5 ml L-broth indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Efter 5 timers vækst ved 37eC på et 25 rystebord blev der fremstillet minilysat-DNA fra hver kultur ved metoden beskrevet af Bimboim og Doly (supra). Efter spaltning med restriktionsendonukleaserne Pstl og Xhol gav to af disse minilysat-plasmid-DNA-præparationer det forventede antal og størrelser af restriktionsfragmenter. Ét af disse plasmider, betegnet pAcY2MhNGF, blev anvendt til cotransfektion af Spodoptera frugiperda Sf9-celler med baculovirus-30 genomisk DNA.

Plasmid pAcY1 MhNGF blev konstrueret på analog måde ud fra BamHI-Bglll-fragmentet fra phNGFIM og pAcYMI.

35 EKSEMPEL 4

Fremstilling af hNGF-rekombinante baculovirus Η Η

I DK 175764 B1 I

I 22 I

I pAcY1 MhNGF eller pAcY2MhNGF DNA'er blev cotransficeret med baculo-viralt I

I (AcNPV) DNA i Spodoptera frugiperda-celler (Sf9) under anvendelse af en I

I lipofektionsproced ure som beskrevet af Feigner (supra). I

I 5 Forskellige mængder (1 til 10 pg) af de pAcYMI-afledte hNGF-plasmider og 1 pg af I

I AcNPV-DNA’et (1,5 ml) blev blandet med et lige så stort volumen af "DOTMA"- I

I lipidopløsningen (Life Science Technology, MD) (66 pg/ml i HEPES-bufret I

I saltopløsning). De liposomindkapslede DNA'er blev derefter sat til Sf9-celler i T-25- I

I kolber og blev inkuberet i 1,5 time. 3 ml frisk medium blev derefter tilsat. Efter 4 timer I

I 10 blev det oprindelige medium fjernet, og der blev fyldt op med frisk medium. Efter 3-4 I

dages inkubation ved 27°C blev supematantvæskeme høstet og titreret i konfluente I

monolag af Sf9-celler. Plaques, der ikke udviste okklusionslegemer (bestemt ved I

lysmikroskopi), blev udvalgt og genudpladet to gange på Sf9-celler for at få I

I polyhedrin-negative rekombinante virus. Der blev fremstillet højtiter-stamvirus (107 til I

15 108pfu/ml). I

I EKSEMPEL 5 I

Immundetektioner af human β-NGF i den med rekombinant virus inficerede I

cellesupematant I

20 Insektceller [(efterårshærorme-ovarie, Spodoptera frugiperda (Sf9), ATCC nr. I

CRL1711) fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD] i 35 mm I

vævskulturskåle blev inficeret i en mængde på 100 pfu/celle med separat enten den I

f pAcYlMhNGF- eller det pAcY2MhNGF-afledte rekombinante virus. Efter 1 time blev I

de inficerende virus fjernet, og der tilsattes 2 ml frisk Grace-medium (JR Scientific, I

25 Woodland, CA) (uden føtal kalveserum). Efter 72 timer blev kultursupematanten I

isoleret og koncentreret 10 gange. Det koncentrerede materiale blev underkastet I

enten ELISA eller Western blot-analyse under anvendelse af anti-muse-NGF- I

antistoffer. Både resultaterne af Western blot (fig. 4) og ELISA viste, at mens I

H pAcY1 MhNGF ikke producerede detekterbare mængder hNGF, udskilte ' I

30 pAcY2MhNGF-af1edt rekombinant virus ca. 1 pg/ml hNGF i dyrkningsmediet. I

I EKSEMPEL 6 I

Produktion af hNGF i serumfrit medium I

Serumfrit medium (XL-400) blev fremskaffet fra JR Scientific Inc., Woodland, CA. Sf9- I

35 celler, der var propageret i XL-400-medium ved 27°C, blev dyrket i suspension i 100 I

ml rystekolber. Celletætheden blev holdt på 3 x 105 til 1 x 106 celler/ml ved fortynding I

23 DK 175764 B1 med frisk medium. Fordoblingstiden i logaritmisk fase var ca. 24 timer. Sf9-celler med en celletæthed på 5 x 105 til 2,4 x 106 celler/ml blev inficeret med rekombinante virus i forskellige infektionsmultipliciteter (MOI) (fra 0,01 til 10 pfu/celle).

5 Kultursupernatanter blev høstet på dag 3, 5 og 6 efter infektion. Efter filtrering gennem et 0,22 pm membranfiltersystem (Coming Glassware. Coming, NY) blev den mængde hNGF, der fandtes i filtratet, bestemt ved en ELISA-metode. I XL-400-medium blev der optimalt produceret rekombinant hNGF (ca. 6 pg/ml) 3 dage efter infektion, når Sf9-celler blev inficeret med en tæthed på 2,4 x 106 celler/ml og en MOI på 0,01.

10

EKSEMPEL 7 Analyse ved ELISA

lmmulon-2 fladbundede 96-brøndsplader (Dynatech Labs Inc., katalog nr. 011-01 ΟΙ 3450) blev overtrukket med anti-muse-B (2,5S) NGF (Boehringer Mannheim, katalog

! 15 nr. 1008218) i en koncentration på 0,1 pg/ml og 0,15 ml/brønd i mindst 2 timer. (NGF

blev fortyndet med overtrækningsbuffer (Na2C03/NaHC03, 50 mM; Na-azid, 0,1 % vægt/volumen; pH 9,6)). Pladerne blev derefter vasket med vaskebuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,0; 200 mM NaCI, 10 mM CaCI2, 0.1% (vægt/volumen) Triton X-100, 0,05% (vægt/volumen) Na-azid). Pladerne blev dernæst blokeret med BSA (1 % BSA, Sigma, 20 RIA-kvalitet, katalog nr. A-7888 i vaskebuffer) i mindst 30 minutter ved stuetemperatur og igen vasket med vaskebuffer.

En standardkurve er inkluderet i hvert af de kommercielt tilgængelige assays: 2,5 S muse-NGF (Sigma, produkt nr. N6009), der i forvejen var rekonstitueret i destilleret i 25 vand i en koncentration på 100 pg/ml og opbevaret i alikvoter på 5 pl/rør ved -60°C, blev optøet og fortyndet med 495 pi prøvebuffer (blokeringsbuffer tilsat 20 pg/ml aprotinin, United States Biochemical Co., katalog nr. 11388). Denne standard (slutkoncentration af NGF: 1 pg/ml) er stabil i mindst 10 dage ved 4"C.

30 mNGF-standarden blev seriefortyndet to gange med prøvebuffer og sat på ELISA-pladerne (0,1 ml/brønd; i duplikater). Kulturvæske blev også seriefortyndet i prøvebuffer (1/2 til 1/64.000) og sat på pladerne (også med 0,1 ml/brønd). Efter inkubation natten over ved 4°C blev brøndene vasket gentagne gange. NGF (2,5S)-B-gal-konjugat (Boehringer Mannheim, katalog nr. 1008234, 0,0125 enheder/ml i 35 blokeringsbuffer) blev tilsat hver brønd. Efter 4 timers inkubation ved 37eC blev pladerne igen vasket. 0,2 ml af en friskfremstillet substratopløsning (2 mg/ml

I DK 175764 B1 I

chlorphenolrødt-li-D-galactopyranosid i substratbuffer: 100 mM Hepes, pH 7,0; 150 I

mM NaCI, 2 mM MgCI2; 0,1% (vægt/volumen) Na-azid, 1% (vægt/volumen) albumin) I

blev sat til hver af brøndene og lodes inkubere i yderligere 2 timer ved 37eC. ELISA- I

pladerne blev derefter aflæst med en Titertek Multiskan-mikrotiterpladeaflæser I

5 under anvendelse af et Multiskan-interferensfilter ved 570 nm. I

EKSEMPEL 8 I

Biologisk aktivitet af det baculovirusproducerede hNGF H

Den biologiske aktivitet af det materiale, der blev produceret af det rekombinante I

10 pAcYlMhNGF- eller pAcY2MhNGF-virus, blev testet in vitro på PC12- I

pheochromocytom-cellelinjen (Greene L.A., Trends Neurosci. 7:91 (1986)). PC12-ceIler I

blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) tilsat 5% defineret-

supplementeret kalvefosterserum og 5% hesteserum og podet med en tæthed på ca. I

50.000 celler pr. brønd (16 mm). Cellerne blev behandlet ved en enkelt tilsætning af I

15 enten kulturvæsker fra celler inficeret med rekombinant baculovirus eller

muse-NGF (Sigma). Cellerne blev observeret i op til 14 dage efter tilsætningen. I

PC-i2-celler behandlet med kulturvæske (25 μΙ/ml medium) fra celler inficeret med det I

rekombinante pAcY2MhNGF-baculovirus undergik hurtig differentiering (fig. 5). I

20 Hastigheden for igangsætning, hvilket påvistes ved neurit-udvækst, var væsentligt I

hurtigere (i løbet af 12 timer) end muse-NGF ved 25 og 100 ng pr. ml medium (24-36 I

timer) (fig. 6). Evnen til at inducere hurtig differentiering af PC12-celier ser ud til at være I

en iboende evne hos den baculovirusproducerede hNGF. Varigheden af :

differentieringen er på den anden side koncentrationsafhængig. PCirceller behandlet I

25 med en koncentreret præparation af inficeret Sf9-cellevæske forblev differentierede I

under hele forsøgets varighed (14 dage). PCi2-celler behandlet med en mere fortyndet I

præparation (0,1 x) af den baculovirusproducerede hNGF ændrede derimod deres I

differentierede fænotype efter 5 dage. I

30 Det er interessant, at PCi2-celler behandlet med cellesupematant inficeret med

rekombinant pAcY1 MhNGF-virus ikke viste nogen tegn på differentiering. Denne ; I

observation stemmer overens med de negative resultater fra Western blotting og

ELISA (eksempel 5). I

35 Den biologiske aktivitet, der kan tilskrives den baculovirusproducerede hNGF, kan I

neutraliseres med et anti-muse-NGF-antistof (fig. 7). I

25 DK 175764 B1 EKSEMPEL 9

Neutralisering af NGF-induceret differentiering af PC1?-celler PCi2-celler blev udpladet som beskrevet i eksempel 8 med følgende modifikation: før 5 tilsætning af NGF til dyrkningsmediet blev PCi2-cellerne tilsat anti-muse-NGF-antiserum (Collaborative Research Inc., i en 1:500 og 1:1000 fortynding af rent serurri). Muse-NGF (Sigma) eller rekombinant human NGF blev derefter tilsat PC12-cellekultureme, og deres virkning på celledifferentiering blev observeret i en periode på 14 dage.

10 NGF-induceret differentiering af PCirceller af både human NGF (25 pi kulturvæske) og muse-NGF (100 ng) blev neutraliseret af anti-NGF-antiserum i en fortynding på 1:50Q og 1:1000 rent serum.

15 EKSEMPEL 10

Biologisk aktivitet af hNGF på humane neuroblastom-SH-SY5Y-celler Kulturer af SH-SY5Y-celler [Biedler et al., Cancer Res. 33:2643 (1973); ibid. 38:3751 (1978)] blev holdt i 75 cm2 Corning T-75-kolber i en 1:1-blanding af Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og Hams F-12 (JR Scientific, Woodland, CA) 20 tilsat 10% kalvefosterserum (JR Scientific) ved 37°C. Cellerne blev frigjort til passage og høst ved tilsætning af 4 ml 0,02% EDTA i DMEM pr. kolbe, efterfulgt af kraftig omrystning. Cellerne blev passeret ved et delt forhold på 1:5. Ingen antibiotika blev anvendt i kulturerne på noget som helst tidspunkt. Efter at cellerne var udsat for negativ kontrolsupernatant, NGF (2,5 S muse-NGF, Sigma) i en koncentration på 100 25 ng/ml eller human NGF (25 μΙ/ml), blev cellerne observeret hver 24. time med henblik på tegn på differentiering. Mediet blev udskiftet hver 2. dag under dyrkningens varighed, og der blev igen fyldt op med NGF. 10 pg/ml aphidicolin blev sat til mediet under den anden uges behandling.

30 Tilsætning af hNGF (25 μΙ/ml) til den humane neuroblastom-cellelinje SH-SY5Y

inducerede hurtig differentiering (udstrækning af neuriter fra cellerne), selv om der ikke blev observeret nogen virkning efter administration af negativ kontrolkulturvæskesupernatant til SH-SY5Y-celler (25 μΙ/ml). Den hurtige indtræden af ' differentiering på grund af NGF, der begyndte så tidligt som 24 timer, stod i 35 modsætning til den meget langsommere indtræden af differentiering, der blev observe-

I DK 175764 B1 I

I 26 I

I ret efter tilsætning af muse-NGF (Sigma) til den samme cellelinje (5 dage) (Jensen, I

I Dev. Biol. 120:56 (1987)). I

I Aphidicolin har ingen virkning på differentierede celler, men er en reversibel inhibitor af I

I 5 ct-DNA-polymerase og vil derfor dræbe mitotisk delende celler. Det er nødvendigt at I

I behandle cellerne med aphidicolin i løbet af den anden uge, da de få mitotisk aktive I

celler, som ikke blev induceret til at differentiere på grund af NGF, vil overvokse de - I

I latente, dvs. differentierede, celler. I

I 10 EKSEMPEL 11 I

I Infektion med rekombinante virus indeholdende hNGF-oehet oo et andet gen, som I

I koder for et processerende enzym, i det samme baculovirus I

Udviklingen af transplaceringsvektorer, der er specifikt udformede til at tillade et højt I

niveau af coekspression af hNGF-genet og et andet gen, der koder for et I

I ! 15 processerende enzym såsom γ-underenheden af NGF eller gær-KEX2- I

I endopeptidasen, er en alternativ fremgangsmåde til fremstilling af store mængder I

I moden NGF. Dette kan opnås ved indsætning af β-NGF-genet nedstrøms for I

I polyhedrinpromotoren og enten γ-NGF- eller KEX2-genet under kontrol af en anden I

kopi af polyhedrinpromotoren, en anden baculoviruspromotor såsom den sene I

20 p1 O-promotor eller en designet syntetisk promotor. Der dannes derefter rekombinant I

virus som beskrevet i eksempel 4, hvilken virus anvendes til infektion af Sf9-celler som I

beskrevet i eksempel 5. I

I EKSEMPEL 12 I

25 hNGF i svækket hukommelsestest I

Generelt I

Ved denne test forsøger læsionerne at efterligne cholinerg dysfunktion med hensyn til I

den svækkelse af hukommelse og kognitiv evne, der findes hos AD-patienter. hNGF- I

30 behandling reducerede graden af svækkelse i betydeligt omfang. I

H Metoder I

Charles River Wistar-hanrotter (280-300 g) blev anbragt enkeltvis i rum, der var I

H kontrollerede med hensyn til lyd, temperatur og fugtighed, og de blev holdt i en cyklus I

35 med 12 timers lys/mørke. I de første ti dage af undersøgelsen havde dyrene fri adgang I

til foder. Fra den 11. dag og fremefter blev dyrenes foderforsyning reduceret, indtil alle I

27 DK 175764 B1 dyrene nåede 80% af deres indledende legemsvægt. Denne vægt blev holdt under resten af forsøget.

Apparat - En Y-labyrint blev anvendt til at foroptræne dyrene, idet hver målarm målte 5 13 cm i højden x 13 cm i bredden x 47 cm i længden. Disse arme var skilt fra adgangsvejen (13 cm i højden x 13 cm i bredden x 40 cm i længden) ved hjælp af en falddør.

Optræningsprocedure - Optrænings- og testproceduren var i det væsentlige som 10 beskrevet af Ramirez og Stein (Behav. Brain Res. 13:53-61 (1982)). Kort beskrevet blev dyrene tilfældigt fordelt i forskellige forsøgsgrupper (n = 5-9) og fik en 3-dages foroptræningsperiode for at vænne sig til den person, der udførte forsøget, samt Y-labyrinten. Dyrene fik derefter fem dages tilfældig skiftende optræning. Efter at rotten var anbragt i adgangsvejens ende, blev dyret sluppet fri og fik lov at gå ind i én 15 af armene. Når dyret var i målarmen, modtog det en foderbelønning (45 mg Noyes foderpellet). Når dyret havde ædt pelleten, blev det returneret til adgangsvejen, sluppet fri og fik lov at gå ind i den næste, tilfældigt valgte målarm, hvor rotten igen modtog en foderbelønning. Dyrene blev underkastet en serie på ti venstre/højre tilfældige skift i alt. Efter denne tvungne optræningsperiode blev dyrene optrænet til frit 20 at skifte i labyrinten, indtil alle havde nået et vist kriterieniveau: tre på hinanden følgende dage med 80% korrekt skiftende adfærd.

Kirurgi - Rotterne blev bedøvet med xylazin (Haver)/ketamin (Parke-Davis) 200:20 mg/kg intramuskulært og anbragt i en stereotaktisk ramme (Kopf Instruments). Kraniet 25 blev blotlagt og renset, og der blev boret to huller over hver af nucleus basalis af Meynert (NBM) (koordinaterne blev målt fra Bregma i overensstemmelse med Paxino og Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 2. udgave, 1986, Academic Press, New York; rostral/caudal -0,4 mm. lateral ±2,6 mm). Dura under hullerne blev gennemboret, og spidsen af en Hamilton-sprøjte, der i forvejen var fyldt med 30 ibotensyre (5 mg/ml), blev stukket ned -6,5 mm og -7,5 mm ventralt til dura. 1,0 pi ibotensyre blev infunderet i NBM i løbet af 1 minut.

Desuden blev der boret et tredje hul i kraniet over de laterale ventrikler (rostral/caudal -0,8 mm, lateral 1,4 mm), og en kanyle af rustfrit stål blev implanteret 4 mm ned fra 35 dura ind i ventriklerne. Kanylerne var fremstillet af 23 g nåle af rustfrit stål og var forbundet til en i forvejen fyldt, steril Alzet (Alza, Palo Alto, Californien, USA) model 2

I DK 175764 B1 I

I I

I ml mini-osmotisk pumpe (gennemstrømningshastighed 2,4 μΙ/time) via polyethylenrør, I

I Pumperne var anbragt subdermalt mellem skulderbladene. Såret blev derefter syet, og I

I dyrene fik lov at komme sig. Minipumper blev afhængigt af forskellige I

I behandlingsgrupper fyldt med: I

I 5 a) hNGF opløst til en slutkoncentration på 0,1,1,0 eller 10,0 pg/ml i steril I

I saltopløsning indeholdende 0,1 pg/ml rotteserum, dvs. rotterne modtog 0,2, 2,0 I

I eller 20,0 pg hNGF pr. 4 ugers behandlingsperiode; eller I

I b) saltopløsning indeholdende 0,1 mg/ml rotteserum. I

I 10 Procedure I

I Forsøgsgrupperne omfattede kontroldyr (n = 6), udelukkende læsion (n = 9), læsion I

I med 0,1 pg/ml hNGF (n = 9), læsion med 1,0 pg/ml hNGF (n = 9) og læsion med 10,0 I

pg/ml hNGF (n = 9). Dyrene blev optrænet ved den rumlige skifteudfordring og blev I

I kirurgisk behandlet og fik derefter en 3 ugers behandlingsperiode. Efter denne I

15 behandlingsperiode blev rotterne på ny testet i Y-labyrinten, og deres I

I adfærdsmæssige indsats blev bedømt i løbet af en periode på 20 dage. I

I Statistisk analyse - Der blev benyttet en Cochran-Mantel-Haenszel-test for at opnå I

tests af signifikans for samlede virkninger af behandlingen samt parvise forskelle I

20 mellem behandlingerne. I

Resultater I

I Mortalitetsgraden efter læsioner i forsøgsgrupperne var 40%, og de endelige gruppetal I

I var kontrol (6), udelukkende læsion (6), læsion med 0,1 pg/ml hNGF (5), læsion med I

li 25 1,0 pg/ml hNGF (6) og læsion med 10,0 pg/ml hNGF (6). I

I For at bestemme virkningerne af ibotensyre-læsioner og hNGF på rumlig skifteadfærd I

I blev der undersøgt tre adfærdsmæssige kriterier: (i) antal dage for at nå kriteriet efter I

I læsion, (ii) gennemsnitligt antal skiftefejl pr. dag og (iii) gennemsnitligt antal I

I 30 vedvarende fejl pr. dag. I

I Det fremgår af fig. 8, at det for dyr med bilateral ibotensyre-læsion tog væsentligt I

I længere tid (p<0,01) at nå det fastslåede kriterieniveau i sammenligning med I

Η kontroldyr. Denne virkning blev delvis forbedret af hNGF-behandiing i doser på 1,0 og I

35 10,0 pg/ml. Der var en signifikant forskel mellem dyr med udelukkende læsion og dyr I

med læsion, men behandlet med 1,0 pg/ml hNGF (p<0,01) og 10,0 pg/ml hNGF I

29 DK 175764 B1 (p<0,01). Der var ingen signifikant forskel mellem rotter med udelukkende læsion og | dem med læsion, men som modtog 0,1 pg/ml hNGF.

i

Bilaterale læsioner fik også rotterne til at udvise signifikant flere daglige skiftefejl 5 (p<0,01) (se fig. 8) i sammenligning med kontrolrotter og udvise signifikant flere i vedvarende fejl (p<0,01) end kontroldyrene.

hNGF-behandling begrænsede graden af de svækkelser, der blev observeret efter bilateral ibotensyre-læsion på NBM. Der var en signifikant forskel i de gennemsnitlige 10 antal skiftefejl (se fig. 8) og gennemsnitligt antal vedvarende fejl mellem de læsionsbehandlede og læsions-hNGF-behandlede dyr i doserne på 1,0 pg/ml (p<0,01) og 10,0 pg/ml (p<0,01). Der var ingen signifikant forskel i det gennemsnitlige antal skiftefejl (se fig. 8) og vedvarende fejl mellem læsionsbehandlede og læsion - 0,1 pg/ml hNGF-behandlede dyr op til dag 9; imidlertid var der på dag 10 og fremefter en 15 signifikant forskel (p<0,01) mellem disse grupper.

Kortfattet svækker bilaterale ibotensyre-læsioner af nucleus basalis af Meynert i rotter signifikant tillært rumlig skifteadfærd. Denne svækkelse forbedres signifikant ved hjælp af rekombinant hNGF, hvilket tyder på, at rhNGF forbedrer central cholinerg 20 dysfunktion.

EKSEMPEL 13

Der blev ikke observeret toksiske virkninger ved den test, der er beskrevet i eksempel 12. 1

Claims (23)

1. Baculovirus-transplaceringsvektor, der en funktionel i insektceller med en mRNA- I I 5 ledersekvens og en promotor af et baculovirus-polyhydringen, som er operativt bundet I til en DNA-kodningssekvens, hvilken DNA-kodningssekvens består af: I en DNA-kodningssekvens for præ-pro-delen af human eller musenervevækstfaktor; og I en DNA-sekvens for den modne humane β-nervevækstfaktor. I I 10

2. Transplaceringsvektor ifølge krav 1 konstrueret under anvendelse af en syntetisk I I adaptor med et BamHI-restriktionssted indsat opstrøms for den første methionin- I I initieringskodon i position -187. I

3. Transplaceringsvektor ifølge krav 2, hvor den syntetiske adaptor har I 15 kodningssekvensen: I 35mer: 5'GATCCGAGCTCCCGGGAGATCTAGACTGCAGGTAC3' I I 27men 5'CTGCAGT CT AGAT CT CCCGGGAGCT GG3' I

4. Transplaceringsvektor ifølge krav 2, som er pAC373mhNGF (fig. 2). I I I

5. Transplaceringsvektor ifølge krav 1 konstrueret under anvendelse af en syntetisk I I adaptor med et BamHI-restriktionssted anbragt stødende op til initieringskodonen i I I position-121 af hNGF. I

6. Transplaceringsvektor ifølge krav 5, hvor den syntetiske adaptor har I I kodningssekvensen: I I 35mer: 5'GGGGATCCAAATATGTCCATGTTGTTCTACACTCT3' I I 39mer: 5'G AT CAG AGT GTAG AACAAC AT G G ACAT ATTT GG ATCCCC3'. I

7. Transplaceringsvektor ifølge krav 5, som er pAcY2MhNGF (fig. 3). 1 I H

8. Insektcelle inficeret med transplaceringsvektoren ifølge krav 1-7. I

9. Insektcelle ifølge krav 8, som er Spodoptera frugiperda (Sf9). I I 35 I DK 175764 B1 31

10. Fremgangsmåde til produktion af biologisk aktiv, moden, human β-nervevækstfaktor i insektceller, hvilken fremgangsmåde omfatter (a) konstruktion af en'transplaceringsvektor med en mRNA-ledersekvens og promotor af et baculovirus-polyhydringen, der er operativt bundet til en DNA-kodningssekvens, 5 hvilken DNA-kodningssekvens består af: - en DNA-kodningssekvens for præ-pro-delen af human eller muse-nervevækstfaktor; og - en DNA-kodningssekvens for moden human β-nervevækstfaktor; (b) inkorporering af transplaceringsvektoren i (a) i en baculovirus til dannelse af en 10 rekombinant baculovirus; (c) inficering af insektceller med den rekombinante baculovirus i (b); (d) dyrkning af de inficerede insektceller i (c); og (e) høst af den humane β-nervevækstfaktor fra det brugte dyrkningsmedium.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor transplaceringsvektoren er pAcY2mhNGF (fig. 2) eller pAC373mhNGF (fig. 3).

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor insektcelleme dyrkes i lav- eller serumfrit medium. 20

13. Fremgangsmåde ifølge krav 10, hvor de Inficerede insektceller udskiller biologisk aktiv β-NGF i dyrkningsmediet.

14. hNGF-ekspressionssystem omfattende en DNA-kodningssekvens for hNGF eller 25 derivater deraf ifølge krav 1 og regulatoriske elementer, der er nødvendige for transfektionen af hNGF-kodningssekvensen i et baculovirus-ekspressionssystem, som kan inficere insektceller med den resulterende ekspression af hNGF eller et biologisk aktivt derivat deraf.

15. Rekombinant biologisk aktiv human β-nervevækstfaktor med aminosyresekvensen 1 til 118 som vist i fig. 1, kendetegnet ved, at den kan opnås med et baculovirus-ekspressionssystem og er fri for urenheder, der almindeligvis forbindes med hNGF opnået fra naturlige kilder.

16. Farmaceutisk præparat omfattende biologisk aktiv hNGF ifølge krav 15 i en farmaceutisk acceptabel bærer. I I I DK 175764 B1 I Η I I I I

17. Farmaceutisk præparat ifølge krav 16 indeholdende tilstrækkelig biologisk aktiv I I hNGF til tilvejebringelse af 0,1-100 pg/dag til patienten. I

18. Anvendelse af biologisk aktiv hNGF ifølge krav 15 ved fremstilling af et lægemiddel I I 5 til behandling af neurologiske sygdomme hos mennesker. I

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvor den neurologiske sygdom er Alzheimers sygdom. I

20. Biologisk aktiv hNGF ifølge krav 15 til anvendelse ved behandling af en I I 10 neurologisk sygdom. I

21. Biologisk aktiv hNGF ifølge krav 20, hvor den neurologiske sygdom er Alzheimers I H sygdom. I

22. Biologisk aktiv hNGF ifølge krav 15 fremstillet ud fra den inficerede insektceller I ifølge krav 8 eller 9. I

23. Biologisk aktiv hNGF ifølge krav 15, der kan opnås ved fremgangsmåden ifølge I H krav 10. I I 20 I