EP0733053A1

EP0733053A1 - Oxathiolanes, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui en renferment

Info

Publication number: EP0733053A1
Application number: EP95920986A
Authority: EP
Inventors: Anne-Sophie Charvet-Faury; Michel Camplo; Jean-Louis Lab. de Chimie Biomoléculaire KRAUS
Original assignee: Laboratoire Laphal
Current assignee: Laboratoire Laphal
Priority date: 1994-05-24
Filing date: 1995-05-24
Publication date: 1996-09-25
Also published as: CA2167930A1; WO1995032200A1; FR2720397B1; HU219299B; AP9600784A0; OA10258A; FI960316A0; NO306299B1; CN1080264C; HUT75112A; KR960703903A; AU2620995A; FR2720397A1; FI960316L; CZ21996A3; US5708000A; KR100242891B1; RU2142462C1; FI960316A7; PL181713B1

Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de la chimie organique et plus précisement à celui de la chimie thérapeutique. Elle a spécifiquement pour objet, les 5-(cytosinyl-1) 1,3-oxathiolanes de configuration cis répondant à la formule générale (I) dans laquelle R est un radical acyle au aralcoyle, dérivés d'un hétérocycle mono- ou bicyclique azoté et le groupe hydroxyméthyle en position 2 est en position cis par rapport au plan déterminé par les positions 2 et 5. Les composés de formule générale (I) servent de principes actifs à des compositions pharmaceutiques, notamment à action antivirale.

Description

0XATHI0LANES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES QUI EN RENFERMENT

La présente invention se rapporte au domaine de la chimie organique et plus précisément à celui de la chimie thérapeutique.

Elle a plus particulièrement pour objet des 2',3'-didesoxynucléosides substitués en position 2 par un cycle 1,3-oxathiolane.

Elle a spécifiquement pour objet les 5-(cytosinyl-1 ) 1 ,3-oxathiolanes de configuration cis (2R-5S ou 2S-5R) répondant à la formule générale

que l'on peut représenter sous l'une des deux représentations spatiales

dans laquelle R est un radical acyle ou aralcoyie, dérivés d'un hétérocycle mono- ou bicyciique azoté et le groupe hydroxyméthyle en position 2 est en position cis par rapport au plan déterminé par les positions 2 et 5. Parmi les différentes définitions prises par le substituant R, on différenciera :

a) les dérivés nicotiniques où l'hétérocycle est une structure pyridique et le groupement acyle est en position 2, 3 ou 4, de formule la

dans laquelle X représente de l'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe nitro, un alcoxy inférieur ou un radical trifluorométhyle et n est un nombre entier variant de 1 à 3

b) les dérivés dihydropyridiques où l'hétérocycle est une 1 ,4-dihydropyridine et le radical acyle est en position 2, 3 ou 4, de formule Ib

R 1

dans laquelle R<| est un radical alcoyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone X et n sont définis comme précédemment

c) les dérivés nicotiniques quaternises où l'atome d'azote porte un substituant alcoyle et le radical acyle est en position 2, 3 ou 4, ayant la formule générale le

dans laquelle A est un anion minéral ou organique R-_| , X et n sont définis comme précédemment d) les dérivés quinoleiques où l'hétérocycle est une structure bicyclique ayant la formule générale Id

O

dans laquelle le radical carbonyle peut être en position 2, 3 ou 4

X représente de l'hydrogène, un halogène, un radical trifluorométhyle, un alcoxy inférieur ou un groupe nitro et n' représente un nombre entier variant de 1 à 6.

e) les dihydroquinoleines de formule générale le

dans laquelle R-j et X sont définis comme précédemment et n' est un nombre entier variant de 1 à 6

f) les quinoléines quaternisées de formule générale If

dans laquelle R-_| , X et n' sont définis comme précédemment le radical acyle se trouve en position 2, 3 ou 4 et A est un anion minéral ou organique

g) les (dihydropyridyl) alcoyles de formule générale Ig dans laquelle R-| , X et n sont définis comme précédemment et m est un nombre variant de 1 à 6 ainsi que leurs sels d'addition avec un acide minéral ou organique.

Les composés de formule I peuvent être dédoublés en leurs isomères optiques. On obtient ainsi l'isomère (+) et l'isomère (-).

Les infections rétrovirales sont la cause de maladies graves, en particulier du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) qui est une affection virale souvent fatale, et à un degré moindre les hépatites. Plusieurs composés de type nucléosidiques ou hétéro-nucléosidiques, sont actuellement cliniquement utilisés pour le traitement de ces affections rétrovirales. Ceux-ci sont les dérivés AZT (3'- azido-2',3'-didesoxythymidine) (Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 7096-7100, 1985), ddC (2',3'-didesoxycytidine) (Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 1911-15, 1986), d4T (2',3'- didéhydro-3'-désoxythymidine) (Biochem. Biophys. Res. Comm. 142, 128--34, 1987), ddl (2',3'-didésoxyinosine) (Antiviral. Chem. Chemother 2, 221 , 1991), BCH-189 ou 3TC (2',3'-dideoxy 3'-thiacytidine) décrit dans la demande de brevet européen 90 301335.7 et suivants. Le nombre restreint de ces composés antiretroviraux à la disposition du praticien, et leur efficacité thérapeutique limitée appelle la recherche de nouveaux composés dont les vertus thérapeutiques seraient accrues et les effets secondaires diminués.

On connaît déjà des dérivés de 2-[(1-hydroxyméthyl) 1 ,3-oxathiolan 5-yl] cytosine et notamment les esters de la fonction hydroxyméthyle (demande de brevet européen 0.382.526) ou les dérivés halogènes en position 5' du noyau pyrimidique (R.F SCHINAZI et al. Antimicrob Agents and Chemotherapy 36 (1992) 2423-2431).

Les composés de l'invention possèdent la propriété d'inhiber la replication de rétrovirus humains, en particulier le VIH et le virus de l'hépatite B (VHB). Ces composés, dérivés du BCH-189 ou 3TC, incluent dans leur structure une entité 1 ,4- dihydro-1-méthyl-3-quinoleylcarbonyl fixée sur le groupement aminé exocyclique de la cytidine. Cette entité structurale particulière confère en pharmacologie expérimentale la propriété d'augmenter et de faciliter le passage de la barrière hémato-encéphalique (Pharmacol. Ther. 19, 337-396, 1983 - Methods Enzymol. 112, 381-396, 1985 - Drug. Des. Del, 51-64, (1986) - J. Med. Chem. 31, 244-249, 1988 - J. Med. Chem. 32, 1782-1788, 1989 - J. Med. Chem. 32, 1774-1781 , 1989).

La synthèse chimique de ces composés a été effectuée à partir de protocoles expérimentaux classiques. La mise au point de ces nouveaux hétéronucléosides nécessite comme composé de départ le dérivé 2',3'-didéoxy-3'-thiacytidine dont plusieurs méthodes de synthèse sont décrites dans la littérature chimique (J. Org. Chem. 56, 6503, 1991 - J. Org. Chem. 57, 2217, 1992 - Tet. Lett. 33, 4625, 1992 - Nucleosides and Nucleotides 12, 225, 1993). A partir de ce dérivé, la synthèse des composés faisant l'objet de la présente invention et celle des intermédiaires qui s'y rapportent, sont décrites dans la présente demande de brevet.

L'invention se rapporte aussi au procédé d'obtention des composés de formule générale I qui consiste à soumettre un 5-(cytosinyl-1 ) 1 ,3-oxathiolane çjs à l'action d'un dérivé fonctionnel d'acide carboxylique de formule ROH où R est un radical acyle dérivé d'un hétérocycle aromatique ou dihydroaromatique, mono- ou bicyclique azoté ou à l'action d'un dérivé actif aralcoyie de formule R'Z où R' est un radical aralcoyie dérivé d'un hétérocycle aromatique ou dihydroaromatique, mono- ou bicyclique, azoté et Z est un radical labile facilement clivable.

D'une manière plus précise, le dérivé fonctionnel d'acide ROH est un halogénure, un anhydride, un anhydride mixte formé avec un carbodiimide ou un ester réactif comme un ester de phénol.

Dans le cas d'un dérivé aralcoyie, Z est un atome d'halogène ou un radical alcoyl-ou aryl sulfonyle.

L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques à action antivirale caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif au moins un composé de formule générale I ou un de ses sels d'addition avec un acide minéral ou organique, en association ou en mélange avec un excipient ou un véhicule inerte, non-toxique, pharmaceutiquement compatible, notamment pour l'usage topique ou général.

Dans ces compositions, la teneur en principe actif de forme générale I s'échelonne de 0,1 mg à 100 mg par prise unitaire en fonction de la voie d'administration. EXEMPLE I

Isomères du Cis 2-(diphénylterbutylsilyloxyméthyl)-5 [N⁴-(3^M- pyridinylcarbonyl) cytosine-1'-yl]-1 ,3-oxathiolane 1

A température ambiante, sous atmosphère d'azote, on additionne dans un mélange de dichlorométhane (7 ml) et de diméthylformamide (2 ml), 1 eq. d'acide nicotinique (27 mg, 0,21 mmol) 1 ,1 eq. de BOP (93 mg, 0,23 mmol), 1 ,1 eq. de HOBT (31 mg, 0,23 mmol), 1 eq. de 5'-terbutyldiphénylsilyl-2',3'didesoxy-3'-thiacytidine (39 mg, 0,23 mmol), 4 eq. de DIEA (146 μl, 0,84 mmol). Le mélange est agité pendant une nuit à température ambiante, lavé par une solution d'acide citrique à 5% (10 ml), puis par une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5% (10 ml). Le mélange résultant est extrait à l'acétate d'éthyle (3x10 ml), séché sur Na2Sθ4, et évaporé. Le résidu est purifié sur plaque de gel de silice. On obtient 48 mg de composé pur.

[1H] RMN : δ (CDCI₃) = 1.1 (s,9H,tBu); 3.1-3.6 (m,2H,CH₂-O); 3.7-4.2 (m,2H,C H₂); 5.25 (t,1 H,C₅-H); 3.1-3.6 (m,2H,CH₂-O); 5.5 (d,1H,C₅-H); 6.35 (q,1H,C₂-H); 7.4-7.8 (m,1 H,aromatique); 8.0 (d.l H.Cβ'-H); 8.3 (d,1 H,nicotinyl); 8.8 (d,1 H,nicotinyl); 8.8 (d,1H,nicotinyl); 9,1 (d,1 H,nicotinyl).

EXEMPLE II

Isomères du Cis 2-(hydroxymethyl)-5 [N⁴-(3"-pyridinylcarbonyl) cytosine-1'-yl] -

1 ,3-oxathiolane 2

Le composé 1 (25 mg, 0,05 mmol) est dissout dans 3 ml de tetrahydrofurane anhydre. A cette solution, on ajoute 3 eq (135 μl, 0,15 mmol) de fluorure de tétrabutylammonium. La solution est agitée à température ambiante pendant 3 h. Après évaporation du solvant, le produit résultant est chromatographié sur plaque de silice préparative (éluant : toluène/CH3θH 15%). On isole 13 mg de composé désiré.

[¹ H] RMN : δ (CDCI3) = 3.1-3.6 (m,2H,CH₂-O); 3.7-4.2 (m,2H,C₄H₂); 5.25 (t,1 H,C₅- H); 5.5 (d,H,C5-H); 6.35 (q,1H,C₂-H); 7.4-7.8 (m,1 H,aromatique); 8.0 (d,1 H,C₆'-H); 8.3 (d,1 H,nicotinyl); 8.8 (d,1 H,nicotinyl); 9.1 (s,1 H,nicotinyl).

EXEMPLE III

Isomères du Cis 2-(terbutyl-diphényl-silyloxyméthyl)-5-[N⁴-(3^,,-tosyl) cytosine-

1^*-yl]-1 ,3-oxathiolane 4 A une solution de dérivé 5 (56 mg, 0,12 mmol) dans la pyridine (3 ml), on additionne à 60°C sous atmosphère d'azote 2 eq. de chlorure d'acide paratoluène sulfonique (46 mg, 0,24 mmol). Après 20 h d'agitation à température ambiante, le mélange est évaporé à sec, lavé par une solution d'acide citrique à 5% (10 ml), puis extrait à l'acétate d'éthyle (3x10 ml). Les phases organiques réunies sont séchées sur Na₂SO₄ et évaporées. On isole 48 mg de produit désiré.

[1 H] RMN : (CDCI3) = 1.1 (s,9H,tbu); 2,45 (s,3H,CH₃ tosyl); 3.15-3.55 (m,2H,C₂- CH₂-O); 3.85-4.2 (m,2H,C₄H₂); 5.25 (t,1 H,C₅-H); 6.3 (t,1 H,C₂-H); 7.3-7.7 (m,14H,ArH); 8.05 (d,1H,C₆'-H);

EXEMPLE IV

Isomères du Cis 2-(diphénylterbutylsilyloxyméthyl)-5-[N⁴(3"-pyridinyl carbonyl) cytosine-1 '-yl]-1 , 3-oxathiolane 3

A une solution de dérivé 4 (47 mg, 0,075 mmol) dans la lutidine (2 ml) sous atmosphère d'azote à 90°C, on ajoute 6 eq. (46 μl, 0,45 mmol) de pyridinylmethylamine. Le chauffage est maintenu pendant 48 h sous agitation. Après refroidissement, le mélange est évaporé, lavé par une solution d'acide citrique à 5% (10 ml), puis extrait à l'acétate d'éthyle (3x10 ml), séché sur Na₂SO₄. Après évaporation, le résidu est purifié par chromatographie sur plaque de gel de silice, (éluant : EtOAC/MeOH, 10/1)

EXEMPLE V

Isomères du Cis 2-(terbutyl-diphényl-silyloxyméthyl)-5-(cytosine-1'-yl)-1 ,3- oxathiolane 5

Une solution de 2',3'-didéoxy-3'-thiacytidine (105 mg, 0,45 mmole) dans la pyridine (6 ml) est traitée sous atmosphère d'azote par du chlorure de diphenylterbutylsilyle (140 μl, 0,5 mmole). Le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures à température ambiante. Après concentration sous vide, on ajoute 30 ml d'eau et on extrait à l'acétate d'éthyl (3x20 ml). Les phases organiques réunies sont alors séchées sur Na₂SO₄ et concentrées à sec pour donner le composé 5 (210 mg, Rdt quantitatif) sous forme d'un solide blanc. Rf (AcOEt/MeOH 2/1) = 0,62

[ H] RMN (CDCI3) δ : 1,1 (s,9H,tbu); 3,1-3,6 (m,2H,C₂-CH₂-0); 3,7-4,2 (m,2H,C₄-

H₂); 5,25 (t,1 H,C₅-H); 5,5 (d,H,C₅-H); 6,35 (q,1 H,C₂-H) 7,4-7,8 (m,10H,2Ph); 8,0

(d,1H,C₆-H)

EXEMPLE VI

Isomères du Cis iodure de 2-(hydroxyméthyl)-5-[N⁴-(1"-méthyl-3"- pyridinylcarbonyl) cytosine-1'-yl]-1,3-oxathiolane 6

Sous atmosphère d'azote à 1 eq (46 mg, 0,14 mmol) de composé 2 dissous dans 4 ml d'acétonitrile anhydre, on ajoute 9 eq. (1,25 mmol, 77 μl) d'iodure de méthyle. La solution résultante est chauffée à 50°C pendant 48 h. Après évaporation des solvants, le résidu est purifié par flash chromatographie, éluant BuOH/H₂O/acide acétique [5:2,5:2,5]. On obtient un solide jaune (55 mg).

[ H] RMN : (DMSO d₆) δ = 3.25 (t,2H,CH₂-4); 3.90 (dd,2H,C₂-CH₂); 4.45 (s,3H,N⁺- CH3); 5.25 (t,1 H,CH-5); 6.30 (t,1 H,CH-2); 6.92 (d,1 H,CH-6'); 7.30 (d,1 H,nicotinyl); 7.85 (d,1 H,nicotinyl); 8.05 (d,1 H,CH-5'); 8.20 (d,1 H,nicotinyl); 7.85 (d,1H,nicotinyl); 9.01 (d,1 H,nicotinyl). Spectre de masse : (FAB⁺) 349 (M-1)⁺

EXEMPLE VII

Isomères du Cis 2-(hydroxyméthyl)-5-[N⁴-(1^,,-méhtyl-1^,,,4^,,-dihydro-3^,,-pyridinyl carbonyl) cytosine-1"-yl]-1 ,3-oxathiolane 7

Dans 3 ml d'une solution dégazée de methanol contenant 10% d'eau, on dissout 30 mg (0,06 mM) de composé 6. A cette solution, on ajoute 15 mg de bicarbonate de sodium et 60 mg de dithionite de sodium. Le mélange réactionnel est agité sous azote pendant 3 h. La solution devient orangée. On évapore le solvant puis on resuspend les sels dans un minimum de methanol; on filtre. Le filtrat est purifié par chromatographie sur couche mince préparative (1 mm). (Eluant : Toluène/méthanol 1:1) pour donner 6 mg d'un solide blanc-jaune SM : (FAB⁺) 349 (M-1)⁺

EXEMPLE VIII Isomères du Cis 2-hydroxyméthyl 5-[N⁴-3"-quinolinylcarbonyl) cytosin-1'-yl] 1 ,3-oxathiolane 8 A 2 ml de diméthylformamide anhydre, on ajoute 74,4 mg (0,43 mmol) d'acide 3- quinoline carboxylique puis 96 mg (0,47 mmol) de 1 ,3-dicyclohexyl carbodiimide et 63,4 mg (0,47 mmol) d'hydrate d'hydroxybenzotriazole. Le mélange est agité pendant 1 h à température ambiante sous azote. Un précipité blanc de dicyclohexylurée apparaît et on ajoute alors 100 mg (0,43 mmol) de 2,3'-dideoxy 3'- thiacytidine. Le mélange est agité pendant une nuit. Ensuite, on évapore le diméthylformamide sous pression réduite, et le résidu est hydrolyse par une solution aqueuse saturée en NaCI (10 ml). On extrait le résidu à deux reprises par de l'acétate d'éthyle (2x10 ml). Les phases organiques sont combinées, séchées sur sulfate de magnésium puis filtrées. Le solvant est évaporé. Le produit est purifié par (flash) chromatographie. (Eluant : acétate d'éthyle/ methanol 98:2) pour donner 78 mg d'un solide blanc (0,2 mmol) soit un rendement de 46,5 % PF = 116-118°C - IR =1656 cm^-1 (carbonyle de la fonction amide)

[¹ H] NMR (DMSO d₆) δ = 11,75 (s,1 H,NH); 9,40 (d,1 H,CH-2"); 9,15 (d,1 H,CH-4"); 8,65 (d,1 H,CH-5'); 8,20 (m,2H,CH-8" et -CH-5"); 8,0 (m,1H,CH-6"); 7,80 (m,1H,CH- 7"); 7,45 (d,1 H,CH-6'); 6,35 (t,1H,CH-2); 5,55 (t,1H,CH-5); 3,98 (t,2H,C₂-CH₂-4) [13C]NMR : (DMSO d₆ ) δ = 37,14 (C-4); 61 ,95 (CH₂0-C2); 87,28 (C-2); 88,29 (C- 5); 95,85 (C-5'); 122,21 (C-3"); 126,28 (C-6"); 127,71 (C-5"); 129,63 (C-10"); 129,87 (C-7"); 132,08 (C-8"); 137,65 (C-4"); 138,89 (C-6'); 148,91 (C-9"); 149,29 (C-2"); 163,16 (C-2'); 164,51 (C-4') Spectre de masse : (Fab⁺) 385 (M+1)⁺. 769 (2M+1)⁺

EXEMPLE IX Isomères du Cis iodure de 2-hydroxyméthyl 5-[N⁴-(1"-méthyl 3"- quinolinylcarbonyl) cytosin-1'y.]-1_.3-oxathiolane 9

On prépare une solution de composé 8 (78 mg soit 0,20 mmol) dans 4 ml d'acétonitrile. On ajoute 112 μl (1 ,8 mmol) d'iodure de méthyle et le mélange est chauffé à 40°C sous azote pendant 24 h. Le solvant est chassé et le résidu brut est alors dissout dans le minimum d'acétonitrile. On le reprécipite par addition d'éther.

On obtient ainsi un solide orangé (60 mg soit un rendement de 55%.

PF = 156-159°C

[¹ H] NMR : (CD₃OD) δ = 3,32 (t,2H,CH₂-4); 3,99 (dd,2H,C₂-CH₂); 4,80 (s,3H,⁺N- CH₃); 5,38 (t,1H,CH-5); 6,0 (d,1 H,CH-6'); 6,33 (t,1 H,CH-2); 8,13 (m,1 H,CH-7"); 8,39

(m,1H,CH-6"); 8,60 (m,2H,CH-8"); 8,72 (d,1 H,CH-5'); 9,79 (d,1 H,CH-4^M); 9,95

(d,1H,CH-2").

Spectre de masse : (Fab+) 399 [M-l]⁺, 799 [2(M-I)]⁺. EXEMPLE X

Isomères du Cis 2-hydroxymethyl 5-[N⁴-(1"-méthyl 1",4"-dihydro 3"- quinolinylcarbonyl) cytosin-1'-yl]-1 ,3-oxathiolane 0

On ajoute à une solution de 30 mg (0,057 mmol) du composé 9 dans 3 ml de methanol aqueux dégazé (3 ml contenant 10% d'eau), 15 mg de bicarbonate de sodium et 60 mg de dithionite de sodium. Le mélange est agité pendant une heure sous azote. Le solvant est évaporé et le résidu brut est purifié par chromatographie preparative. (Eluant : acétate d'éthyle/méthanol 1 :1). On obtient finalement 10 mg d'un solide vitreux jaune soit un rendement de 46%.

[¹H] NMR : (D₂O) δ = 3,24 (m,3+2H,NCH₃+CH₂-4"); 3,48 (m,2H,CH₂-4); 3,93 (m,2H,C₂H₂); 5,29 (t,1 H,CH-5); 6,96 (d,1 H,CH-6'); 7,13 (m,2H,CH-6"+CH-7"); 7,27 (m,2H,CH-5"+CH-8"); 7,45 (d,1 H,CH-2"); 8,23 (d,1 H,CH-5') Spectre de masse : (Fab⁺) 399 (M-1)⁺

EXEMPLE XI

Isomères cis du 2-hydroxyméthyl-5-[N⁴-(2-(a,a,a-trifluoro-m-toluidino) nicotinyl)-cytosine-ryl]-1 ,3-oxathiolane 11

A une solution de 2',3'-didéoxy-3'-thiacytidine (50 mg, 0,2 mmol) dans 5 ml de DMF anhydre, on additionne 1 I eq. de BOP (93 mg, 0,23 mmol), 1 eq. d'acide niflumique (acide 2-(a,a,a-trifloro-m-toluidino) nicotinique) et 4 eq. de DIEA (146 μl, 0.84 mmol). Le mélange est agité une nuit à température ambiante, lavé par une solution d'acide citrique à 5% (10 ml), puis par une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 5% (10 ml). Le mélange résultant est extrait de l'acétate d'éthyle (3 x 10 ml), séché sur sulfate de sodium, puis évaporé. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (eluant : acétate d'éthyle/toluène 1 :9). On obtient un solide blanc (49 mg, rendement 48%).

TEST D'EVALUATION DES PROPRIETES ANTIVIRALËS

TESTS ANTI-HIV - Protocole expérimental a) généralités

Appareillage : l'ultracentπfugeuse utilisée est de type Beckman TL 100. Le comptage des particules radioactives a été effectué sur un appareil Hewlett Packard Tri-Carb Modèle 1600. Les syncitia sont observées d'un microscope inversé Labovert. Composition du tampon de lyse NTE : Tris-hydroxyméthylaminométhane (10 mM); NaCI (100 mM); EDTA (1 mM)

b) tests d'évaluation des propriétés antivirales en culture cellulaire

L'évaluation de l'effet antiviral est basée sur l'étude de l'effet cytopathogène du virus VIH-1 sur la lignée cellulaire MT4. La lignée MT4 a pour origine des cellules T isolées à partir d'un patient, transformées par le virus VTLH-1. L'effet cytopathogène du virus VIH-1 se traduit par la formation de cellules géantes multinuclées appelées

"syncitia", visibles au microscope. Cet effet du VIH-1 est observé 4 à 5 jours après l'infection; il est suivi par la mort des cellules. L'effet cytopathogène est directement correlé à l'infection des cellules par le virus, à sa replication intracellulaire et à l'expression des antigènes viraux par les cellules.

Une inhibition de cet effet correspond donc à une inhibition de la multiplication du virus VIH-1.

Les cellules MT4 sont entretenues à 3.10⁵ cellules/ml dans du milieu RPMI 1640 : 10% de sérum de veau foetal décomplémenté pendant 30 mn à 56°C (hormones, facteurs de croissance sériques ...), 1% glutamine, 1% pénicilline, streptomycine et

2 μg/ml de polyrène qui favorise l'adhésion du virus sur les cellules.

L'action du traitement par l'antiviral est permanent. En effet, celui-ci est présent avant, pendant et après l'infection virale. Des dilutions successives sont effectuées dans le sérum de veau foetal à 10%, afin de pouvoir cultiver les MT4 pendant 8 jours et observer la formation des syncitia.

Test MT4 :

Avant l'infection : 3.10⁶ cellules/1 OOμl sont distribuées dans une microplaque 96 puits et centrifugées 3 mn à 2000 tpm (tours par minutes). Le culot est alors préincubé 1 h à 37°C avec 100 μl de différentes concentrations d'antiviral à tester. Infection : l'infection est réalisée en micropuits en rajoutant 100 TCIU (unités infectieuses) du virus VIH-1 (ce titre du virus VIH-1 est déterminé pour induire la formation de syncitia en 4 ou 5 jours). L'antiviral est toujours présent lors de l'infection et la dilution du virus à 100 TCIU.

Après l'infection : après une incubation de 1 h à 37°C, les MT4 sont lavées 3 fois avec du RPMI 1640 et mises en culture à raison de 3.10^ cellules par millilitre de chacune des concentrations des composés à tester en plaques de 24 puits. Lors du passage effectué au jour J3, les cellules MT4 sont diluées au 1/3. La concentration de l'antiviral est maintenue. Chaque jour, l'apparition de syncitia est observée au microscope afin de détecter un éventuel retard par rapport au témoin VIH-1. A JQ, le dosage de la transcriptase inverse est effectué. Si les cellules ne sont pas infectées, c'est donc qu'il y a protection par l'antiviral testé.

Dosage de la transcriptase inverse :

La transcriptase inverse est une ADN polymérase ARN dépendante. Cet enzyme permet la replication des rétrovirus. Grâce à celui-ci, l'ARN du virus, copié en ADN, s'intègre dans le génome cellulaire. L'ADN proviral est transcrit par les enzymes de la cellule en ARN viral. Pour le dosage de l'activité transcriptase inverse, on concentre 100 fois 1 ml de surnageant de culture par ultracentrifugation pendant 5 mn à 95000 tpm; le culot viral obtenu après ultracentrifugation est remis en suspension dans 10 μl de tampon NTE + TRITON 0.1% (éther de polyoxyéthylène); celui-ci sert à lyser le virus et à libérer la transcriptase inverse. In vitro, c'est l'activité transcriptase inverse qui est mise en évidence. Cet enzyme utilise une matrice synthétique poly A possédant une amorce oligo dT ayant de 12 à 18 résidus. Le substrat radioactif de cette réaction est le [3H]dTTP (thymidine triphosphatée radioactive à 1mCi/ml); les macromolécules tritiées néoformées, sont précipitées par de l'acide trichloroacétique et séparées du [³H]TTP libre par filtration. L'activité enzymatique de la transcriptase inverse est mesurée par la radioactivité incorporée dans les complexes poly-rA/poly-dT. Cette radioactivité est déterminée dans un compteur de particules, après addition du liquide scintillant tenant fonction d'amplificateur.

TEST ANTI-HBV- Protocole expérimental

Parmi les différentes méthodologies employées pour évaluer l'activité de composés sur le virus de l'hépatite B (VHB), le modèle du virus de l'hépatite B du canard (Duck HBV) a été utilisé (J.Med. Virology 1990, 31, 82-89; Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 506-509; Hepatology, 1989, 10, 186-191). Le matériel de culture pour tester "in vitro" l'activité anti-VHB de composés est constitué d'hépatocytes de canard, infectés par le virus de l'hépatite B du canard (DHBV), (Antimicrob. Agents Chemother. 1989, 33, 336-339; J. Med. Virology, 40, 59-64; Antivir. Res. 1993, 21, 155-171; Antimicrob. Agents Chemother. 1993, 37, 1539-1542). En effet, le virus de l'hépatite B du canard est reconnu comme étant très proche du virus de l'hépatite B humain (Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 526-529; Antiviral Research, 1987, 8, 189-199). Dans des conditions standardisées (Virology, 1989, 171, 564-572), la culture d'hépatocytes de canard permet la replication complète du DHBV. L'activité antivirale des composés testés est mesurée en fonction de la quantité d'ADN viral produit pendant 10 jours de culture des hépatocytes infectés.

Protocole expérimental :

Un caneton de 3 semaines, atteint par le DHBV, est utilisé pour la préparation des hépatocytes. Le canard est tué sous anesthésie et l'isolement des hépatocytes est effectué selon la méthodologie de Guillouzou (Research in isolated and cultured hépatocytes, J. Libbey Eurotex Ltd/INSERM, 1986). Les cellules sont mises en suspension dans le milieu de Leibowitz et 5 μg/ml d'insuline bovine, 7.10"^ mole d'hémisuccinate d'hydrocortisone et 1.5% de DMSO sont ajoutés. La densité des cellules est de 8.10^ cellules, étalées dans des boîtes de culture de 100x20 mm. Les composés testés sont ajoutés à la culture après l'étalement des cellules. Le milieu est changé tous les jours, pendant 10 jours. La production d'ADN viral du virus de l'hépatite B de canard dans le surnageant des cellules est estimée par la méthode d'hybridation "Dot Blot", selon Fourel et al. (Viral Hepatitis and Liver Disease, 1988, 506-509; Hepatology, 1989, 10, 186-191). L'inhibition est exprimée en pourcentage de la quantité d'ADN présent dans le surnageant des cellules, par rapport à une culture infectée par le DHBV non traitée avec un dérivé nucléosidique.

RESULTATS VIROLOGIQUES

Tests HIV :

Les composés dont la synthèse est décrite dans la présente demande de brevet, et les structures données dans la description de l'art antérieur, ont un effet sur l'inhibition de la replication du virus HIV-1 BRU (BRU:souche virale expérimentée) dans le cas où les cellules infectées sont du type MT4.

Dans le tableau I ont a décrit les résultats des tests. La colonne 1 donne le nom des composés étudiés les plus représentatifs, et dans la colonne 2 sont reportées les valeurs dites IC50 (concentration de composant donnant 50% d'inhibition de la replication du virus HIV dans des cellules MT4 infectées, mesurée au jour J7 après l'infection). Par observation et comptage du nombre de syncitia formés par rapport à celui compté dans le cas de cellules MT4 infectées mais non traitées par le composé antiviral, la valeur du IC50 est déterminée. Tests DBHV :

Les composés décrits les plus représentatifs, ont été testés pour leur effet sur la replication du virus Duck HBV (DHBV) selon le protocole exposé dans la partie expérimentale de ce document. Dans le tableau 2 sont décrits les résultats des tests.

Abréviations :

AcOEt : acétate d'éthyle

ADN : acide désoxyribonucléique APTS : acide para-toluène sulfonique

ARN : acide ribonucléique

AZT : 3'-azido-2'-3'-didéoxy-thymidine ou Zidovudine

BOP : hexafluorophosphate de benzotriazolyloxytrisdiméthyl-aminophos phonium

CCM : chromatographie sur couche mince DCC : N.N'-dicyclohexylcarbodiimide

DCU : N.N'-dicyclohexylurée

DIEA : N,N-diisopropyl N-éthylamine

DMF : N,N-diméthylformamide

DHBV : Duck hepatitis B Virus FAB⁺ : "Fast positiv Atomic Bombardment"

^HdTTP : Thymidine triphosphatée radioactive à 1 mCi/ml

HOBT : 1-hydroxybenzotriazole

IR : infra-rouge

PF : point de fusion RMN : résonnance magnétique nucléaire

SIDA : syndrome de l'immunodéficience acquise

SM : spectrométrie de masse

TBAF : fluorure de tétrabutylammonium

TBDPSCI : chlorure de tétrabutyldiphénylsilyle 3-TC : (-)-(2R,3S)-2-hydroxyméthyl-5-(cytosine-1'-yl)-1 ,3-oxathiolane ou Lamivudine

TCIU : unités infectieuses

THF : tétrahydrofuranne

TPM : tours par minute

TsCI : chlorure de tosyle UV : ultra-violet

VIH : Virus de l'immunodéficience humaine

VHB : Virus de l'hépatite B

VTLH : Virus des cellules T lymphotropiques humaines Tableau I

Effet des nucieosides selon l'invention sur l'inhibition de la replication du virus HIV-1, exprimés sous la somme de IC50

Composés COMPOSES IC50

9 >100 μM

10 1-10 μM

8 10 μM

6 Composés COMPOSES IC50 N°

7

2 0.1-1 μM

11 <100μM

BCH-189 1 μM (produit de référence) Tableau II Effet des nucieosides selon l'invention sur l'inhibition de la replication du virus DHBV

Composés COMPOSES IC50 N°

BCH-189 1+0.5 μM

(composé de référence)

2 2+0.5 μM

8 2 μM

9 2 μM Composés COMPOSES "CδO N°

10 2μM

6

7

Claims

REVENDICATIONS

1. Les 5-(cytosinyl-1 ) 1,3-oxathiolanes de configuration as (ou 2R5S ou 2S-5R), répondant à la formule générale I

dans laquelle R est un radical acyle ou aralcoyie, dérivés d'un hétérocycle mono- ou bicyclique azoté et le groupe hydroxyméthyle en position 2 est en position çjs par rapport au plan déterminé par les positions 2 et 5.

2. Les 5-(cytosinyl.1) 1,3-oxathiolanes selon la revendication 1°, de configuration 2R-5S, de formule générale :

3. Les 5-(cytosinyl-1 ) 1,3-oxathiolanes, selon la revendication 1 °, de configuration 2S-5R , de formule générale :

(2)

4. Les composés nicotiniques, selon l'une des revendications 1° à 3°, dans laquelle R a la formule I :

dans laquelle X représente de l'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe nitro, un alcoxy inférieur ou un radical trifluorométhyle et n est un nombre entier variant de 1 à 3 et où le reste acyle est en position 2, 3 ou 4

Les composés dihydropyridiniques, selon l'une des revendications 1 ° à 3°, dans laquelle R a la formule

R. dans laquelle R-| est un radical alcoyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone X et n sont définis comme précédemment et le radical acyle est en position 2, 3 ou 4.

Les composés nicotiniques quaternises selon l'une des revendications 1 ° à 3° dans laquelle R a la formule générale le

dans laquelle A est un anion minéral ou organique Ri , X et n sont définis comme précédemment et le radical acyle est en position 2, 3 ou 4.

7. Les composés quinoleiniques selon l'une des revendications 1° à 3°, dans laquelle R a la formule générale Id

dans laquelle le radical carbonyle est en position 2, 3 ou 4

X représente de l'hydrogène, un halogène, un radical trifluorométhyle, un alcoxy inférieur ou un groupe nitro et rî représente un nombre entier variant de 1 à 6.

8. Les composés dihydroquinoleiniques selon l'une des revendications 1 ° à 3°, dans laquelle R a la formule générale le dans laquelle R<_| et X sont définis comme précédemment et n' est un nombre entier variant de 1 à 6

Les composés quinoleiniques quaternisees selon l'une des revendications 1^e à 3°, dans laquelle R à la formule générale If

dans laquelle R^ , X et n' sont définis comme précédemment le radical acyle se trouve en position 2, 3 ou 4 et A est un anion minéral ou organique

10. Les composés (dihydropyridyl alcoyle) selon l'une des revendications 1° à 3°, dans laquelle R a la formule Ig

dans laquelle R<| , X et n sont définis comme précédemment et m est un nombre variant de 1 à 6

11. Les sels d'addition avec un acide minéral ou organique, des composés selon l'une des revendications 1 à 10°.

12. Les isomères optiques des composés selon l'une des revendications 1 à 11 ' 13. Un composé selon la revendication 1 ° ou la revendication 11° ou la revendication 12° à savoir le cis 2-hydroxyméthyl 5-[N⁴-(3"-pyridyl carbonyl) cytosine 1"-yl] 1 ,3-oxathiolane et ses sels d'addition avec un acide minéral ou organique, sous forme racémique ou optiquement active..

14. Un procédé d'obtention des composés selon l'une des revendications 1 à 13° qui consiste à soumettre un 5-(cytosinyl-1 ) 1,3-oxathiolane çjs à l'action d'un dérivé fonctionnel d'acide carboxylique de formule ROH où R est un radical acyle dérivé d'un hétérocycle aromatique ou dihydroaromatique, mono- ou bicyclique, azoté ou à l'action d'un dérivé actif aralcoyie de formule R'Z où R' est un radical aralcoyie dérivé d'un hétérocycle azoté, aromatique ou dihydroaromatique, mono- ou bicyclique, et Z est un radical labile facilement clivable.

15. Les compositions pharmaceutiques à action antivirale, caractérisées en ce qu'elles renferment à titre de principe actif au moins un composé de formule générale I

dans laquelle R est un radical acyle ou aralcoyie, dérivés d'un hétérocycle mono- ou bicyclique azoté, aromatique ou dihydroaromatique et le groupe hydroxyméthyle en position 2 est en position cis par rapport au plan déterminé par les positions 2 et 5 ou un de ses sels d'addition avec un acide sous forme racémique ou optiquement active en mélange ou en association avec un excipient inerte, non toxique, pharmaceutiquement compatible..