EP1817053A1 - Nouvelle composition pharmaceutique utilisable dans le domaine des vaccins - Google Patents

Nouvelle composition pharmaceutique utilisable dans le domaine des vaccins

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EP1817053A1
EP1817053A1 EP05824496A EP05824496A EP1817053A1 EP 1817053 A1 EP1817053 A1 EP 1817053A1 EP 05824496 A EP05824496 A EP 05824496A EP 05824496 A EP05824496 A EP 05824496A EP 1817053 A1 EP1817053 A1 EP 1817053A1
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EP
European Patent Office
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oil
composition according
antigen
composition
surfactant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05824496A
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German (de)
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Inventor
Marinette Moreau
Nicolas Osty
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Vetoquinol SA
Original Assignee
Vetoquinol SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Vetoquinol SA filed Critical Vetoquinol SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Definitions

  • the present invention is in the field of pharmaceutical compositions, particularly in the field of vaccines. More specifically, the subject of the invention is a novel pharmaceutical composition that can be used as a vaccine (or vaccine composition).
  • the invention also relates to a process for preparing said vaccine composition according to the invention.
  • Vaccine adjuvants have been known for a long time and are defined as compositions which, when combined with an antigen, produce an immune response superior to that of the antigen alone.
  • the immunogenicity of a non-adjuvanted vaccine is generally low, especially if it is an inactivated vaccine or if the antigen is simply a peptide or protein, and does not in itself allow induce a protective response.
  • Alum phosphate and aluminum hydroxide
  • Alum is an adjuvant that is widely used in human and veterinary vaccines.
  • adjuvants are known and used for research such as Freund's adjuvant consisting of a mixture of mineral oil and killed mycobacteria. This adjuvant is extremely effective and produces marked immune responses. Its poor tolerance, however, limits its use to research on laboratory animals.
  • U.S. Patent No. 4,788,056 discloses a combination vaccine against herpes and E. coli for vaccination of livestock.
  • This patent mentions various possible adjuvants, among which emulsions of oil in water or water in oil based on certain oils such as Miglyol® (medium chain triglycerides) or surfactants such as polysorbate, without, however, indicating a precise formulation of the adjuvant.
  • these are conventional emulsions in which the dispersed phase exists in the form of droplets.
  • none indication is not given as to the effect of the adjuvant on the immunogenicity of the vaccine.
  • U.S. Patent No. 5,688,761 discloses a water-in-oil microemulsion formulation that converts to an oil-in-water system by adding an aqueous fluid which results in the release of the protein contained in the aqueous phase.
  • the advantage of microemulsions is their spontaneous formation and their physical stability.
  • the oils used by these authors are well-tolerated oils for injection such as medium-chain mono and triglycerides. They are emulsified in the aqueous phase by the use of conventional surfactants and known to those skilled in the art such as sorbitan esters or polysorbates. Their dilution by the biological fluids during their injection causes the inversion of the phases and thus the release of the biological agent incorporated in the aqueous phase.
  • Some formulation examples demonstrate an increase in the activity of biological agents incorporated in the described formulation. However, the examples provided do not relate to the field of vaccines.
  • US Pat. No. 5,744,137 describes the use of non-mineral oils in vaccines as well as vaccines in the form of water-in-oil emulsions containing a mixture of at least two surfactants chosen from ethoxylated castor oil, laurate propylene glycol, propylene glycol caprylate and isosteryl diglyceryl succinate.
  • the oils chosen are of animal or vegetable origin in order to limit as much as possible the tissue reaction linked to the administration of poorly tolerated mineral oils.
  • U.S. Patent No. 5,961,970 discloses a vaccine adjuvant in the form of an oil-in-water submicroemulsion comprising an emulsifier (it is a phospholipid), a nonionic surfactant, and an oil. The high cost of phospholipids limits however the applications of this invention.
  • U.S. Patent Application No. 2003011977 discloses a biphasic lipid vesicle composition for enhancing the immune response induced by an antigen.
  • U.S. Patent Application No. 20030175309 discloses an adjuvant containing lecithin, an oil and an amphiphilic surfactant capable of forming a vaccine in the form of a stable oil-in-water emulsion which minimizes local reactions in the injected animal.
  • European Patent Application No. 0 398 287 discloses a pharmaceutical composition in the form of an isotropic solution consisting of one or more active substances and a support which solidifies at between 20 ° C. and 80 ° C. (particularly at room temperature) and being soluble in water. Nevertheless, there is a continuing need in the vaccine industry for new adjuvants having the properties set forth above. In particular, the need remains to provide adjuvants allowing a strong increase of immunogenicity of the antigen. An advantage of such adjuvants lies in the fact that they allow to administer reduced doses of antigen while maintaining a satisfactory immune response. It is particularly desirable to have such compositions when the antigen is expensive or difficult to produce in sufficient amount or when it is a simple peptide or antigens obtained by synthesis or recombination.
  • a pharmaceutical composition in the form of an oily isotropic at least composed of a ternary mixture oil / surfactant (s) / aqueous phase, said aqueous phase comprising the antigenic substance , could have a much higher immunogenicity than a ternary composition of the prior art in the form of an emulsion, in a non-isotropic form.
  • a composition in an isotropic form may have a viscosity compatible with injection use.
  • isotropic will be used hereinafter to designate the oily isotropic according to the invention, that is to say the ternary isotropic mixture oil / surfactant (s) / aqueous phase according to the invention.
  • isotropic comprising an antigenic substance will denote a composition according to the invention in which the antigenic substance is included in the aqueous phase of the isotropic oily according to the invention.
  • oily isotropic is meant a mixture of oil, water and surfactants whose proportions are adjusted so that the preparation obtained is clear, clear and has a low viscosity.
  • Such a composition corresponds to a solubilization of water in an oil, or more precisely water in a micelle, itself in an oil (isotropic oily).
  • micelles molecular aggregates of surfactants
  • Isotropes are well known and all necessary information can be found among others in Galenica, 1983, Vol. 5, Chapter 5, page 195-219.
  • this work presents ternary water / oil / surfactant diagrams, for example on page 203 a water / oil paraffin / Brij 96 diagram, making it possible to determine the respective concentrations of these compounds for which an isotropic system is obtained.
  • a composition in isotropic form has a continuous three-dimensional structure, also called monophasic structure.
  • the emulsions for their part are formed by a system of two immiscible liquids, one of which is finely divided into droplets, or vesicles, in the other.
  • the dispersed phase is called internal phase or discontinuous, the dispersant phase is called external phase or continuous.
  • An emulsion is therefore a liquid-liquid dispersion, which has a biphasic structure.
  • a composition in isotropic form is distinguished from an emulsion by the absence of vesicle type organization and the presence of micelles.
  • vesicle-type organization is intended to mean a structure having a wall comprising, or consisting of, surfactant-type components, said wall including a volume comprising, or constituted by, a hydrophilic internal phase when the outer phase is hydrophobic and vice versa.
  • the invention therefore firstly relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one mixture of at least one oil, at least one surfactant and an aqueous phase comprising itself at least one active substance, said pharmaceutical composition being under the oily isotropic form.
  • This composition is in isotropic form, it is therefore not in the form of an emulsion.
  • the composition has a viscosity compatible with injection use.
  • the active substance may be any type of biological active agent such as, for example, a live, attenuated or inactivated antigen.
  • living antigen is meant a bacterium or a virus attenuated empirically or genetically, a protein antigen (or glycoprotein). lipoprotein) expressed in vivo by a vector (bacterium or recombinant virus).
  • inactivated antigen an inactivated bacterium or virus either by physical methods or by chemical methods or a bacterial or viral extract, or a protein, a polypeptide or a peptide obtained by genetic recombination or by chemical synthesis, or at least one in vivo generator of a compound comprising an amino acid sequence.
  • Especially the biological asset can be inert.
  • the pharmaceutical composition is a vaccine.
  • the active substance is then an antigen.
  • Said antigen may be of any origin and in any form commonly used in the field of vaccination.
  • the antigen may be, for example, of viral, bacterial, parasitic or even tumor origin.
  • the antigen can be natural or recombinant. It may be composed of a microorganism (virus, bacteria or parasites), possibly attenuated or inactivated, or fractions, particularly acellular, of said microorganism (purified antigens, proteins or glyco-proteins or native peptides, polynucleotides, whether they are synthesis or produced by genetic engineering in particular), or based on hydro-soluble or water-dispersible antigens.
  • a microorganism virus, bacteria or parasites
  • fractions, particularly acellular, of said microorganism purified antigens, proteins or glyco-proteins or native peptides, polynucleotides, whether they are synthesis or produced by genetic engineering in particular
  • hydro-soluble or water-dispersible antigens based on hydro-soluble or water-dispersible antigens.
  • an antigenic phase composed of molecules excreted by said microorganism will be used, whether they be components of the bacterial wall or components of the cytoplasm.
  • the amount of active substance and / or antigen in the composition according to the invention is a function of the desired effect and of the very nature of the active substance or antigen used. The skilled person knows depending on the active substance or the antigen used to dose it.
  • the concentration of surfactant may be greater than the critical micelle concentration (CMC).
  • CMC critical micelle concentration
  • the value of the CMC can be determined by various methods, for example conductimetry or spectrophotometry, especially as described in the article by Dominguez et al., Journal of Chemical Education, 1997, 1227-1231.
  • the CMC corresponds to a sudden change in the law of variation of the measured parameter, for example, conductance or absorbance.
  • the compositions according to the invention may comprise a surfactant content greater than or equal to the critical micelle concentration. This critical micellar concentration depends on several parameters, including the nature of the components present in the composition and their content.
  • composition according to the invention will comprise at least a high concentration of surfactant and a small amount of water.
  • the composition may comprise from 10% to 90% of an oil, preferably from 40% to 75% by weight, relative to the weight of the total composition.
  • the amount of water in the composition will be between 0.5% and 20%, preferably between 3% and 9% by weight, relative to the weight of the total composition.
  • the amount of surfactant in the composition may be between 1% to 60%, preferably between 16% and 45% by weight, relative to the weight of the total composition.
  • the ratio of the amount of oil to the amount of water must not be less than 1 (amount of oil equal to the amount of water), preferably not less than 5 (amount of oil). oil at least 5 times larger than the amount of water).
  • Many oils can be used in the composition according to the invention. However, said oil must be compatible with a pharmaceutical use, particularly for use by parenteral injection.
  • the oil may be chosen from: mineral oils, such as and not limited to paraffin oil, liquid petroleum jelly, non-mineral oils, such as cod liver oil, synthetic lipids, oils (such as without limitation soybean oil, olive oil, corn oil, peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, oil sesame, castor oil, almond oil), medium and long chain triglycerides (such as triglycerides of caprylic / capric acids such as those sold by Stearineries Dubois or those sold under the names Miglyol 810® 812® and 818® by Dynamit Nobel), terpene oils such as squalane and squalene, and mixtures thereof.
  • mineral oils such as and not limited to paraffin oil, liquid petroleum jelly, non-mineral oils, such as cod liver oil, synthetic lipids, oils (such as without limitation soybean oil, olive oil, corn oil, peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, oil sesame, castor oil, almond oil), medium and long chain triglycerides (such
  • an oil such as squalene or, preferably, an oil of the triglyceride family and very preferably medium chain triglycerides of the Mygliol 810 type.
  • an oil mixture can be used.
  • the surfactants that can be used according to the invention can be anionic, cationic, nonionic or amphoteric.
  • the preferred class because of its good tolerance, particularly during an injection, is that of the nonionic surfactants.
  • all those that can be used by the injectable route can be used alone or as a mixture.
  • polysorbates sorbitan esters, particularly sorbitan esters of fatty acids, polyoxyethylenated derivatives of castor oil, polyoxyethylenated derivatives of the acid, stearic acids, copolymers of ethylene oxide and 1 propylene oxide or poloxamers, sucrose esters of fatty acids, glycol esters of fatty acids, mono-, di- and tri- esters fatty acid and glycerol, esters of polyethylene glycols and fatty acids, esters of sucrose and fatty acids.
  • the polysorbates, the sorbitan esters, in particular the sorbitan and fatty acid esters are used.
  • These surfactants may have identical or different HLBs (hydrophilic-lipophilic balance which is a characteristic of surfactants, linked to the structure of their molecule).
  • the surfactants will have different HLBs so as to approach the critical HLB of the oily phase used.
  • Critical HLB is a function of the concentration of emulsifiers and the chemical nature of the surfactants.
  • HLB surfactants can therefore, depending of the composition of the mixture that it wishes to achieve, choose the appropriate surfactant (s).
  • the aqueous phase may contain, besides the water-soluble or water-dispersible antigen and water, other substances such as salts intended to complex The antigen so as to delay its release and thus to prolong its action.
  • salts include alumina silicate or calcium phosphate.
  • the aqueous phase may also optionally contain non-specific immunogenic substances known to those skilled in the art, such as lipopolysaccharide or chitosan. Similarly, it may contain polymers, nonionic copolymers (such as, for example, poloxamer), synthetic clay (for example Laponite®, Chimilab Essor), cytokines, or antioxidants such as vitamin E, which are recognized for their immunostimulant power.
  • the composition has a viscosity of between 5 and 150 mPa.s, preferably between 5 and 100 mPa.s.
  • the viscosity of the composition is measured at ambient temperature, preferably at 25 ° C., using a rotor-stator type viscometer, such as, for example, an apparatus of the Rhéo brand called HAAK-VT500, according to the manufacturer's instructions.
  • a rotor-stator type viscometer such as, for example, an apparatus of the Rhéo brand called HAAK-VT500, according to the manufacturer's instructions.
  • composition according to the invention may be prepared according to any procedure known to those skilled in the art.
  • a composition according to the invention may be prepared according to the following procedure:
  • the antigen in a first step, is dissolved or dispersed in the aqueous phase in which the additional substances described above are also optionally incorporated and the mixture is heated, for example in a water bath, at a temperature of between 30 and 60 0 C, preferably between 35 and 45 ° C;
  • the surfactant or surfactants are mixed with the oil and the mixture is heated, for example in a water bath, at a temperature of between 30 and 60 ° C., preferably between 35 and 45 ° C .;
  • the aqueous phase is incorporated into the oily phase by using a homogenizer (such as, for example, a Rayneri® 33300 homogenizer).
  • a homogenizer such as, for example, a Rayneri® 33300 homogenizer.
  • these devices are widely used, particularly in the preparation of emulsions, and the skilled person will have no difficulty in carrying out the mixture according to the invention; and in a final step, the oily isotropic product obtained is cooled to room temperature and sterilized.
  • Various methods described in the literature can be used for this operation such as, for example, sterilization by heat, ionizing radiation or by filtration. The preferred mode of doing is that of sterilizing filtration.
  • the same aqueous phase containing the antigen is used. It is an acellular antigenic phase composed of antigens excreted during the cultivation of a bacterial strain of Streptococcus suis. This bacterium is responsible for a severe and widespread pathology in piglets. The infection is characterized by nervous disorders (motor incoordination, tremors, convulsions) and articular disorders. Septicemia has also been reported, as well as pulmonary lesions. A transmission to humans is possible (slaughterhouse staff, veterinarians).
  • the MRP protein Muramidase Released Protein
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • the aliquot of stock solution containing the desired amount of antigens is diluted to the necessary and sufficient amount of a buffer usually used in the field of vaccines, such as for example phosphate buffer.
  • a buffer usually used in the field of vaccines such as for example phosphate buffer.
  • Example 2 Composition 1 The following table shows the composition according to the invention which is produced. Quantities are given in grams.
  • Miglyol 810®, Tween 80 and Span 80 are mixed.
  • the oily phase obtained is heated in a water bath at 40 ° C.
  • the aqueous phase is also heated at 40 ° C. in a water bath
  • the aqueous phase is added dropwise to the oily phase by homogenizing with a turbine mixer (Rayneri 33300) rotating at 500 rpm.
  • the two beakers are maintained at 40 ° C.
  • the mixture is made, it is removed from the water bath and allowed to cool to room temperature.
  • the target MRP protein title of the finished product is
  • the target title is a title to a reference antigen with a theoretical and arbitrary titer of 1. (1.6 means that the vaccine has a titre 1.6 times higher than the reference used).
  • the target MRP protein titre of the finished product is 1.6.
  • Miglyol 810® Tween 80® and Span 80® are mixed. This mixture is sterilized by heating at 120 ° C. for 30 minutes and then allowed to cool to room temperature.
  • the aqueous phase containing the antigen is sterilized by filtration on a synthetic membrane of 0.22 ⁇ m porosity.
  • the oily phase obtained above and the aqueous phase prepared in Example 1 are heated in parallel and separately in a water bath at 40 ° C.
  • the aqueous phase is added dropwise to the phase oily by homogenizing with a turbine mixer (Rayneri 33300) rotating at 500 rpm.
  • both beakers are kept at temperature. Once the mixture is made, it is removed from the water bath and allowed to cool to room temperature.
  • the target MRP protein titre of the finished product is 1.6.
  • composition 1 of Example 2 The activity of the composition 1 of Example 2 is compared with that of other compositions of the prior art comprising one or more adjuvants described in the literature and known to those skilled in the art.
  • Formulation Control 1 oil-in-water type emulsion:
  • Example 2 For this emulsion, the same excipients described for the oily isotropic of Example 2 were used in different proportions to obtain a very fine emulsion, for a critical HLB of 11. The amounts are given in grams.
  • the antigenic phase obtained in Example 1 is sterilized by filtration on a synthetic membrane with a porosity of 0.22 ⁇ m.
  • Miglyol®, Tween 80® and Span 80® are mixed and the mixture is sterilized by heating at 120 ° C. for 30 minutes and allowed to cool to room temperature.
  • aqueous phase (antigen phase) and the oily phase are then heated separately at 40 ° C. in a water bath.
  • the aqueous phase is added to the oily phase with stirring at 3000 rpm.
  • Formulation Control 2 adjuvant oil-in-water (Montanide IMS, SEPPIC)
  • Example 1 The aqueous phase obtained in Example 1 and the adjuvant are mixed with stirring using the Rayneri T33300 homogenizer rotating at 150 rpm for 20 seconds.
  • Formulation Control 3 adjuvant of water / oil trade (Montanide ISA 763 VG, SEPPIC)
  • the aqueous phase, obtained in Example 1, is filtered through a 0.22 ⁇ m nylon filter, the PTFE filter adjuvant of 0.22 ⁇ m porosity, the assembly being aseptically assembled.
  • the adjuvant is placed in a beaker with stirring at 800 rpm using a Rayneri T33300 homogenizer.
  • the antigenic aqueous phase is incorporated all at once, with stirring at 1200 rpm, maintained for 30 minutes.
  • Formulation Control 4 adjuvant water in oil (Montanide ISA 563 VG, SEPPIC)
  • the aqueous part of the formulation is filtered on 0.22 ⁇ m nylon filter, adjuvant on PTFE filters of 0.22 ⁇ m porosity, the assembly being assembled aseptically.
  • the adjuvant is placed in a beaker and stirred at 800 rpm using a Rayneri T33300 homogenizer.
  • the antigenic aqueous phase is incorporated all at once, with stirring at 1200 rpm, maintained for 15 minutes.
  • Control formulation 5 LH adjuvant according to patent application WO 01/40240
  • aqueous adjuvant LH is sterilized by the supplier and received as is. Aseptically, the aqueous antigenic phase and the salt buffer are mixed by magnetic stirring for 5 to 10 min., Then the LH adjuvant is added very slowly ("meshed") to the antigenic-salt buffer mixture. Stirring is maintained for 10 minutes.
  • the MRP protein titers, measured as previously described, control formulations are about 4 (in RP units, (Relative Potency: Unit of Measure by Relative Potency Calculation Software, version 3.0, US Department of Agriculture). That of the composition according to the invention is 1.01.
  • the comparison of the tolerance and the immunogenic activity is carried out on the mouse.
  • mice BALB / C mice (supplier: Charles River) of 18-22 grams at the reception received, 2 weeks apart, 2 injections of 250 ⁇ l intraperitoneally. Blood was collected one week after the booster at autopsy of the mice. From a serological point of view, the level of anti-Streptococcus suis antibodies was evaluated by an ELISA method.
  • the wells of a micro-plate are lined with the antigen (acellular supernatant of the culture) and then saturated.
  • the sera of the mice which received the vaccine are diluted and deposited in the plate.
  • a labeled anti-mouse antibody (enzyme conjugated) is added.
  • the substrate / chromogen of the enzyme is deposited and the reaction colored is measured.
  • the immunogenic activity of each composition is then defined by an average titre (in RP) corresponding to the mean of the titers of the mice making up the group.
  • Tolerance is assessed according to three criteria: the mortality rate, the activity of the animal and the appearance of the coat. The presence of a residue at the injection point is also verified.
  • the values indicated are relative: the value indicated represents the immunogenic capacity of a composition according to the invention relative to the immunogenic capacity of the control No. 5 which was used as a reference for the evaluation of the immunogenic power of each tested control.
  • composition 1 which contains 4 and 6 times less antigen than the controls 1 to 4, induces an immunological response between 2 and 80 times higher than that induced by these same controls. • tolerance in animals
  • composition 5 is perfectly tolerated both locally and systemically, and much better tolerated than the 4 control formulas.

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Abstract

La présente invention se place dans le domaine des compositions pharmaceutiques, particulièrement dans le domaine des vaccins. Plus précisément, l'invention a pour objet une nouvelle composition pharmaceutique utilisable comme vaccin (ou composition vaccinale). L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de ladite composition vaccinale selon l'invention.

Description

NOUVELLE COMPOSITION PHiMlMACEUTIQUE UTILISABLE DANS LE
DOMAINE DES VACCINS
La présente invention se place dans le domaine des compositions pharmaceutiques, particulièrement dans le domaine des vaccins. Plus précisément, l'invention a pour objet une nouvelle composition pharmaceutique utilisable comme vaccin (ou composition vaccinale).
L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation de ladite composition vaccinale selon l' invention.
Dans le domaine des vaccins, il est bien connu que l'efficacité de la composition vaccinale est essentiellement due au mélange de l'antigène utilisé avec un adjuvant. Les adjuvants pour vaccins sont connus depuis fort longtemps et sont définis comme des compositions qui, lorsqu'elles sont combinées à un antigène, produisent une réponse immunitaire supérieure à celle de l'antigène seul.
Le pouvoir άmmunogène d'un vaccin sans adjuvant est en règle générale faible, en particulier s'il s'agit d'un vaccin inactivé ou si l'antigène est simplement un peptide ou une protéine, et ne permet en lui-même d'induire une réponse protectrice.
De nombreuses recherches sont conduites afin d'obtenir des adjuvants satisfaisants, lesquels, de manière idéale devraient présenter les propriétés suivantes:
• induire une réponse immunitaire importante, particulièrement avec une dose d'antigène minimale ;
• induire une réponse immunitaire mixte (humorale et cellulaire) afin de favoriser et d'établir une réponse mémoire ;
• être parfaitement toléré et dénué de toxicité ;
• être constitué si possible d'excipients couramment utilisés dans le domaine pharmaceutique, plus particulièrement celui des médicaments injectables ;
• être facile à administrer, par exemple à l'aide d'une seringue et, si possible, à conditionner directement en seringue prête à l'emploi ;
• être facile à associer à des antigènes variés, de manière à permettre de standardiser la production de vaccins divers ;
• être de production aisée à l'échelle industrielle avec un procédé d'obtention facile à maîtriser ;
II est connu dans l'art antérieur, une multitude d'adjuvants de nature et d'origine diverses.
L'alun (phosphate et hydroxyde d'aluminium) est un adjuvant dont l'utilisation est répandue dans les vaccins humains et vétérinaires.
D'autres adjuvants sont connus et utilisés pour la recherche tel l'adjuvant de Freund constitué d'un mélange d'huile minérale et de mycobactéries tuées. Cet adjuvant est extrêmement efficace et produit des réponses immunitaires marquées. Sa mauvaise tolérance limite toutefois son emploi à la recherche sur l' animal de laboratoire.
Divers brevets décrivent des compositions d'adjuvants pour vaccins. Le brevet américain n° 4,788,056 décrit un vaccin combiné contre 1 'herpès et E. coli destiné à la vaccination du bétail. Ce brevet cite différents adjuvants possibles, parmi lesquels des émulsions d'huile dans l'eau ou d'eau dans l'huile à base de certaines huiles telles que le Miglyol® (triglycérides à chaîne moyenne) ou de tensioactifs tels que le polysorbate, sans toutefois indiquer de formulation précise de l'adjuvant. Il s'agit toutefois d'émulsions classiques, où la phase dispersée existe sous forme de gouttelettes. D'autre part, aucune indication n'est donnée quant à l'effet de l'adjuvant sur le pouvoir immunogène du vaccin.
Le brevet américain n° 5,688,761 décrit une formulation de microémulsion eau dans huile qui se convertit en système huile dans eau par addition d'un fluide aqueux ce qui conduit à la libération de la protéine contenue dans la phase aqueuse. L'avantage des microémulsions est leur formation spontanée et leur stabilité physique. Les huiles utilisées par ces auteurs sont des huiles bien tolérées par voie injectable telles que les mono et triglycérides à chaîne moyenne. Elles sont émulsionnées à la phase aqueuse grâce à l'emploi de tensioactifs classiques et connus de l'homme du métier tels que les esters de sorbitane ou les polysorbates. Leur dilution par les fluides biologiques lors de leur injection provoque l'inversion des phases et donc la libération de 1 'agent biologique incorporé dans la phase aqueuse. Certains exemples de formulation démontrent une augmentation de l'activité d'agents biologiques incorporés dans la formulation décrite. Toutefois, les exemples fournis ne concernent pas le domaine des vaccins.
Le brevet américain n° 5,744,137 décrit l'utilisation d'huiles non minérales dans des vaccins ainsi que des vaccins sous forme d'émulsions eau dans huile contenant un mélange d'au moins deux tensioactifs choisis parmi l'huile de ricin éthoxylée, le laurate de propylène glycol, le caprylate de propylène glycol et le succinate d'isostéryle diglycéryle. Les huiles choisies sont d'origine animale ou végétale afin de limiter au maximum la réaction des tissus liée à l'administration d'huiles minérales mal tolérées. Le brevet américain n° 5,961,970 décrit un adjuvant pour vaccin se présentant sous la forme d'une submicroémulsion huile dans eau comprenant un émulsifiant (il s'agit d'un phospholipide) , un tensioactif non ionique et une huile. Le coût élevé des phospholipides limite cependant les applications de cette invention.
La demande de brevet américain n° 2003011977, décrit une composition constituée de vésicules lipidiques biphasiques permettant d'améliorer la réponse immunitaire induite par un antigène.
La demande de brevet américain n° 20030175309 décrit un adjuvant contenant de la lécithine, une huile et un tensioactif amphiphile capable de former un vaccin sous forme d'une émulsion stable huile dans eau qui permet de minimiser les réactions locales chez l'animal injecté.
La demande Internationale WO 99/61003 décrit un système de délivrance d'actifs comprenant une réserve de médicament sous forme solide étroitement compactée, ayant une structure isotrope a l'état solide. Ce système est adéquat pour délivrer des actifs par inhalation. L'actif se présente sous la forme de liposomes, les liposomes étant ensuite compactés afin de former le système de délivrance solide décrit.
La demande de brevet européen n° 0 398 287, décrit une composition pharmaceutique sous forme d'une solution isotrope consistant en une ou plusieurs substances actives et un support se solidifiant entre 200C et 800C (particulièrement à température ambiante) et étant soluble dans l'eau. II n'en demeure pas moins qu'il existe un besoin toujours renouvelé dans l'industrie des vaccins pour des adjuvants nouveaux présentant les propriétés énoncées précédemment. Particulièrement, le besoin demeure de fournir des adjuvants permettant une forte augmentation du pouvoir immunogène de l'antigène. Un avantage de tels adjuvants réside dans le fait qu'ils permettent d'administrer des doses réduites d'antigène tout en conservant une réponse immunitaire satisfaisante. II est particulièrement souhaitable de disposer des telles compositions lorsque l'antigène est coûteux ou difficile à produire en quantité suffisante ou lorsqu'il s'agit de simple peptide ou d'antigènes obtenus par synthèse ou recombinaison.
De manière surprenante et inattendue, les inventeurs ont maintenant découvert qu'une composition pharmaceutique sous la forme d'un isotrope huileux, au moins composée d'un mélange ternaire huile /tensioactif(s)/phase aqueuse, ladite phase aqueuse comprenant la substance antigénique, pouvait présenter un pouvoir immunogène nettement plus élevé qu'une composition ternaire de l'art antérieur sous la forme d'une émulsion, sous une forme non isotrope. De plus, une composition sous une forme isotrope peut présenter une viscosité compatible avec une utilisation par injection.
Le terme "isotrope" sera utilisé ci-après pour désigner l'isotrope huileux selon l'invention, c'est-à-dire le mélange ternaire isotrope huile/tensioactif(s)/phase aqueuse selon l'invention. De même "isotrope comprenant une substance antigénique" désignera une composition selon 1' invention dans laquelle la substance antigénique est incluse dans la phase aqueuse de l'isotrope huileux selon l'invention. Par isotrope huileux, on entend un mélange d'huile, d'eau et de tensioactifs dont les proportions sont ajustées de telle sorte que la préparation obtenue soit limpide, claire et présente une faible viscosité. Ainsi une telle composition peut être administrée par injection. Une telle composition correspond à une solubilisation d'eau dans une huile, ou plus précisément d'eau dans un micelle, lui-même dans une huile (isotrope huileux).
En effet, lors de la constitution de l'isotrope, il se forme des agrégats moléculaires de tensioactifs appelés micelles, au sein desquels l'actif est inséré plus ou moins profondément.
Les isotropes sont bien connus et l'on trouvera tous les renseignements nécessaires entre autres dans Galenica, 1983, Vol. 5, Chapitre 5, page 195-219. En particulier, cet ouvrage présente des diagrammes ternaires eau/huile/tensioactif, par exemple en page 203 un diagramme eau/huile de paraffine/Brij 96, permettant de déterminer les concentrations respectives de ces composés pour lesquels un système isotrope est obtenu.
Plus précisément, une composition sous forme isotrope présente une structure tridimensionnelle continue, également appelée structure monophasique. Les émulsions pour leur part sont formées par un système de deux liquides non miscibles, dont l'un est finement divisé en gouttelettes, ou vésicules, dans l'autre. La phase dispersée est appelée phase interne ou discontinue, la phase dispersante est appelée phase externe ou continue. Une émulsion est donc une dispersion liquide- liquide, qui présente une structure biphasique.
Une composition sous forme isotrope se distingue d'une émulsion par l'absence d'organisation de type vésicules et la présence de micelles. Par «organisation de type vésicule », on entend au sens de la présente invention, une structure présentant une paroi comprenant, ou constitué par, des composants de type tensioactifs, ladite paroi englobant un volume comprenant, ou constitué par, une phase interne hydrophile lorsque la phase externe est hydrophobe et vice-versa.
Les résultats, présentés ci-après et obtenus sur des animaux de laboratoire lors d'essais avec un isotrope comprenant une substance antigénique selon l'invention, ont démontré qu'il était possible d'obtenir avec un tel isotrope, une augmentation très significative de l'activité immunogène de l' antigène comparée à l'activité immunogène obtenue avec l'antigène en combinaison avec un adjuvant classique.
De plus, ces essais ont montré que l'isotrope surclassait les préparations constituées d'émulsions eau dans huile classiques. L'invention découle donc de cette découverte.
L'invention a donc pour premier objet une composition pharmaceutique comprenant au moins un mélange d'au moins une huile, d'au moins un tensioactif et d'une phase aqueuse comprenant elle-même au moins une substance active, ladite composition pharmaceutique étant sous la forme d'isotrope huileux. Cette composition est sous forme isotrope, elle n'est donc pas sous forme d'émulsion.
En particulier, la composition présente une viscosité compatible avec une utilisation par injection. Selon l'invention, la substance active peut être tout type d'actif biologique comme par exemple un antigène vivant, atténué ou inactivé.On entend par antigène vivant : une bactérie ou un virus atténué empiriquement ou génétiquement, un antigène protéique (ou glyco- lipoprotéique) exprimé in vivo par un vecteur (bactérie ou virus recombinant) . On entend par antigène inactivé une bactérie ou un virus inactivé soit par des méthodes physiques soit par des méthodes chimiques ou un extrait bactérien ou viral, ou une protéine, un polypeptide ou un peptide obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, ou au moins un générateur in vivo d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés.
Tout particulièrement l'actif biologique peut être inerte.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition pharmaceutique est un vaccin. Sous cette forme, la substance active est alors un antigène. Ledit antigène peut être de toute origine et sous toute forme communément utilisée dans le domaine de la vaccination. L'antigène peut être par exemple, d'origine virale, bactérienne, parasitaire ou encore tumorale.
L'antigène peut être naturel ou recombinant. II peut être composé d'un microorganisme (virus, bactéries ou parasites), éventuellement atténué ou inactivé, ou de fractions, particulièrement acellulaires, dudit microorganisme (antigènes purifiés, protéines ou glyco-protéines ou peptides natifs, polynucléotides, qu'ils soient de synthèse ou produits par génie génétique notamment), ou encore à base d'antigènes hydro-solubles ou hydro-dispersibles.
Préférentiellement, on utilisera selon l'invention une phase antigénique composée des molécules excrétées par ledit microorganisme que ce soient des composants de la paroi bactérienne ou des composants du cytoplasme.
La quantité de substance active et/ou d'antigène dans la composition selon l'invention est fonction de l'effet recherché et de la nature même de la substance active ou de l'antigène utilisé. L'Homme du Métier sait en fonction de la substance active ou de l'antigène utilisé doser celui- ci.
Les proportions de chacun de ces constituants de l'isotrope sont ajustées de manière à ce que l'ensemble forme un isotrope huileux.
Plus précisément, la concentration en tensioactif peut être supérieure à la concentration micellaire critique (CMC). Pour une concentration inférieure à la CMC, l'essentiel du tensioactif est sous forme de monomère, en revanche pour une concentration supérieure à la CMC, il y a une présence appréciable de micelles.
La valeur de la CMC peut être déterminée par diverses méthodes, par exemple la conductimétrie ou la spectrophotométrie, notamment comme décrit dans l'article de Dominguez et al., « Journal of Chemical Education », 1997, 1227-1231. En général, la CMC correspond un changement brusque de la loi de variation du paramètre mesuré, par exemple la conductance ou l'absorbance. Ainsi, les compositions selon l'invention peuvent comprendre une teneur en tensioactif supérieure ou égale à la concentration micellaire critique. Cette concentration micellaire critique dépend de plusieurs paramètres, dont la nature des composants présents dans la composition et leur teneur.
Ainsi, la composition selon l'invention comprendra au moins une forte concentration en tensioactif et une faible quantité d'eau.
Selon l'invention, la composition peut comprendre de 10% à 90% d'une huile, préférentiellement de 40% à 75% en poids, par rapport au poids de la composition totale.
Selon l'invention encore, la quantité d'eau dans la composition sera comprise entre 0,5% et 20%, préférentiellement entre 3% et 9 % en poids, par rapport au poids de la composition totale
Selon l'invention enfin, la quantité de tensioactif dans la composition peut être comprise entre 1% à 60%, préférentiellement entre 16% et 45% en poids, par rapport au poids de la composition totale. Selon l'invention, le rapport de la quantité d'huile à la quantité d'eau ne doit pas être inférieur à 1 (quantité d'huile égale à la quantité d'eau), préférentiellement ne doit pas inférieur à 5 (quantité d'huile au moins 5 fois plus grande que la quantité d'eau). De nombreuses huiles peuvent être utilisées dans la composition selon l'invention. Cependant ladite huile doit être compatible avec un usage pharmaceutique, particulièrement pour un usage par injection par voie parentérale.
L'huile peut être choisie parmi : les huiles minérales, comme et sans limitation, l'huile de paraffine, l'huile de vaseline, les huiles non-minérales, comme l'huile de foie de morue, les lipides synthétiques, les huiles végétales, (telles que sans limitation l'huile de soja, l'huile d'olive, l'huile de maïs, l'huile d'arachide, l'huile de graines de coton, l'huile de tournesol, l'huile de sésame, l'huile de ricin, l'huile d'amande), des triglycérides à chaînes moyennes et longues (comme les triglycérides des acides caprylique/caprique comme ceux vendus par la société Stearineries Dubois ou ceux vendus sous les dénominations Miglyol 810®, 812® et 818® par la société Dynamit Nobel), les huiles terpéniques telles que le squalane et le squalène, et leurs mélanges.
Selon l'invention, on préfère utiliser une huile telle que le squalène ou de préférence une huile de la famille des triglycérides et très préférentiellement des triglycérides à chaînes moyennes du type Mygliol 810.
Selon l'invention, on peut utiliser un mélange d'huile. Les tensioactifs utilisables selon l'invention peuvent être anioniques, cationiques, non ioniques ou amphotères. La classe préférée en raison de sa bonne tolérance, particulièrement lors d'une injection est celle des tensioactifs non ioniques.- Préférentiellement parmi ceux- ci, tous ceux utilisables par voie injectable peuvent être utilisés seuls ou en mélange. On citera à titre d'exemple et sans que cette liste ne puisse être considérée comme limitative, les polysorbates, les esters de sorbitane, particulièrement les esters de sorbitane et d'acide gras, les dérivés polyoxy-éthylênés de l'huile de ricin, les dérivés polyoxyéthylénés de l'acide stéarique, les copolymères d'oxyde d'éthylène et d1 oxyde de propylène ou poloxamères, les esters de saccharose et d'acide gras, les esters de glycol et d'acides gras, les mono-, di- et tri- esters d'acide gras et de glycérol, les esters de polyéthylèneglycols et d'acides gras, les esters de saccharose et d'acides gras.
Préférentiellement selon l'invention, on utilise les polysorbates, les esters de sorbitane, particulièrement les esters de sorbitane et d'acide gras. Selon l'invention, il est possible d'utiliser un mélange de deux ou de plusieurs tensioactifs. Ces tensioactifs pourront avoir des HLB identiques ou différents (balance hydrophile-lipophile qui est une caractéristique des tensioactifs, liée à la structure de leur molécule).
Préférentiellement, les tensioactifs auront des HLB différents de manière à s ' approcher de la HLB critique de la phase huileuse utilisée. La HLB critique est fonction de la concentration des émulsionnants et de la nature chimique des tensioactifs.
L'Homme du Métier trouvera sans difficulté dans "Handbook of excipients" , (Raymond C. Rowe, Paul J.Sheskey, Paul J. Weller- 4ême Edition, 2003) par exemple, les HLB des tensioactifs et pourra donc, en fonction de la composition du mélange qu'il désire réaliser, choisir le ou les tensioactifs adéquats.
Selon l'invention, la phase aqueuse peut contenir outre l'antigène hydrosoluble ou hydrodispersible et l'eau, d'autres substances comme des sels destinés à complexer 1' antigène de manière à retarder sa libération et donc à prolonger son action. Comme exemple de sels de ce type, on peut citer le silicate d'alumine ou le phosphate de calcium. La phase aqueuse peut également contenir de manière optionnelle, des substances immunogènes non spécifiques connues de l'Homme du Métier telles que le lipopoly- saccharide, ou le chitosan. De même, elle peut contenir des polymères, des copolymères non ioniques (comme par exemple le Poloxamère), de l'argile synthétique (comme par exemple la Laponite®, Chimilab Essor), des cytokines, ou des antioxydants tels la vitamine E, reconnus pour leur pouvoir immunostimulant.
Selon l'invention, la composition présente une viscosité comprise entre 5 et 150 mPa.s de préférence entre 5 et 100 mPa.s.
La viscosité de la composition est mesurée à température ambiante, préférentiellement à 25°C, en utilisant un viscosimètre du type rotor-stator, comme par exemple un appareil de la marque Rhéo dénommé HAAK-VT500, selon les prescriptions du fabricant.
La composition selon l' invention peut être préparée selon tout mode opératoire connu de l'Homme du Métier. Par exemple une composition selon l'invention peut être préparée selon le mode opératoire suivant :
-dans une première étape, l'antigène est dissous ou dispersé dans la phase aqueuse dans laquelle sont également éventuellement incorporées les substances additionnelles ci-dessus décrites et le mélange est chauffé, par exemple au bain-marie, à une température comprise entre 30 et 600C, préférentiellement entre 35 et 45°C ;
-dans une seconde étape, qui peut être concomitante, le ou les tensioactifs sont mélangés à l'huile et le mélange est chauffé, par exemple au bain-marie, à une température comprise entre 30 et 6O0C, préférentiellement entre 35 et 45°C ;
-dans une troisième étape, la phase aqueuse est incorporée à la phase huileuse en employant un homogénéiseur (tel que par exemple un homogénéiseur Rayneri® 33300). Ces appareils sont largement employés, particulièrement dans la préparation des émulsions, et l'Homme du Métier n'aura donc aucune difficulté pour réaliser le mélange selon l' invention ; et -dans une dernière étape l'isotrope huileux obtenu est refroidi à température ambiante et stérilisé. Divers procédés décrits dans la littérature sont utilisables pour cette opération tels que par exemple la stérilisation par la chaleur, par rayonnements ionisants ou par filtration. Le mode de faire préféré est celui de la filtration stérilisante.
Selon un autre mode de réalisation, il est également possible d'employer des matières premières elles-mêmes stériles et d'opérer l'ensemble de la fabrication en salle blanche, de manière à ne pas être obligé de recourir à une opération finale de stérilisation.
Les exemples suivants • sont donnés à titre d'illustration de l'invention et ne la limite aucunement. D'autres réalisations sont possibles selon un mode de réalisation identique.
Exemple 1 : Composition de la phase antigénique
Dans les trois exemples qui suivent, une même phase aqueuse contenant l'antigène est utilisée. Il s'agit d'une phase antigénique acellulaire composée d'antigènes excrétés lors de la culture d'une souche bactérienne de Streptococcus suis. Cette bactérie est responsable d'une pathologie sévère et très répandue chez le porcelet. L'infection est caractérisée par des troubles nerveux (incoordination motrice, tremblements, convulsions) et articulaires. Des septicémies ont également été rapportées, ainsi que des lésions pulmonaires. Une transmission à l'Homme est possible (personnel des abattoirs, vétérinaires) .
Seul le surnageant acellulaire de la culture est utilisé. Il s'agit d'un mélange de protéines dont l'une est utilisée comme marqueur d'activité : la protéine MRP (Muramidase Released Protein), dont le titre peut être déterminé par test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) . Un anticorps monoclonal anti-MRP est fixé dans les puits d'une plaque de micro-titration. Après une phase de saturation permettant d'éviter une adsorption non spécifique, le vaccin (contenant l'antigène à doser) est dilué et déposé dans chaque puits. Après lavage, un anticorps monoclonal dirigé contre la protéine MRP et couplé à une enzyme est ajouté. La réaction avec le substrat/chromogène de l'enzyme permet d'obtenir une réaction colorée mesurée par un lecteur de plaques. L'intensité de coloration est directement proportionnelle à la quantité d'antigène dans le vaccin.
Une fois le titre de cette solution mère obtenue, l'Homme du Métier sait sans difficulté ajuster par dilution (exceptionnellement par concentration) le titre de la solution qu' il va utiliser dans la préparation des vaccins.
Selon l'invention, l'aliquot de solution mère contenant la quantité désirée d'antigènes est dilué à la quantité nécessaire et suffisante d'un tampon habituellement utilisé dans le domaine des vaccins, comme par exemple du tampon phosphate.
Exemple 2 : Composition 1 Le tableau suivant présente la composition selon l'invention qui est réalisée. Les quantités sont données en grammes.
Dans un bêcher, on mélange le Miglyol 810®, le Tween 80 et le span 80. On chauffe la phase huileuse obtenue au bain—marie à 400C.
Parallèlement et séparément, on chauffe la phase aqueuse également à 400C au bain-marie
On ajoute goutte-à-goutte la phase aqueuse dans la phase huileuse en homogénéisant avec un mélangeur à turbine (Rayneri 33300) tournant à 500 tours/minute.
Durant le mélange, les deux béchers sont maintenus a 4O0C.
Une fois le mélange réalisé, on le retire du bain-marie et le laisse refroidir jusqu'à température ambiante.
Le titre cible en protéine MRP du produit fini est de
1,6. Le titre cible est un titre relatif à un antigène de référence ayant un titre théorique et arbitraire de 1. (1,6 signifie que le vaccin a un titre 1,6 fois plus élevé que la référence utilisée) .
Exemple 3 : Composition 2
La composition suivante est réalisée. Les quantités sont données en grammes :
Le procédé de préparation du mélange est identique à celui décrit à 1 'exemple 2.
Le titre cible en protéine MRP du produit fini est de 1,6.
Exemple 4 : Composition 3
La composition suivante est réalisée. Les quantités sont données en grammes :
Dans un bêcher on mélange le Miglyol 810®, le Tween 80® et le Span 80®. Ce mélange est stérilisé par chauffage à 1200C pendant 30 minutes puis il est laissé refroidir à température ambiante.
La phase aqueuse contenant l'antigène est stérilisée par filtration sur membrane synthétique de 0,22 μm de porosité. On chauffe parallèlement et séparément la phase huileuse obtenue ci-dessus et la phase aqueuse préparée à l'exemple 1 au bain—marie à 4O0C.
Une fois que les 2 phases sont à la même température, on ajoute goutte-à-goutte la phase aqueuse dans la phase huileuse en homogénéisant avec un mélangeur à turbine (Rayneri 33300) tournant à 500 tours/minute.
Durant le mélange, les deux béchers sont maintenus à température. Une fois le mélange réalisé, on le retire du bain-marie et on le laisse refroidir à température ambiante.
Le titre cible en protéine MRP du produit fini est de 1,6.
Exemple 5 : Comparaison de l'activité immunogène d'une composition selon l'invention avec l'activité immunogène de formulations selon l'art antérieur :
L'activité de la composition 1 de l'exemple 2 est comparée à celle d'autres compositions de 1 'art antérieur comprenant un ou des adjuvants décrits dans la littérature et connus de l'Homme du Métier.
Ainsi, 4 autres formulations (Témoins) sont réalisées, selon les compositions et modes opératoires suivants :
Formulation Témoin 1 : émulsion de type huile dans eau classique :
Pour cette émulsion, les mêmes excipients décrits pour l' isotrope huileux de l'exemple 2 ont été utilisés dans des proportions différentes afin d'obtenir une émulsion très fine, pour un HLB critique de 11. Les quantités sont données en gramme.
Le procédé employé est le suivant :
La phase antigénique obtenue à l'exemple 1 est stérilisée par filtration sur membrane synthétique de 0.22 μm de porosité. Dans un bêcher, on mélange le Miglyol®, le Tween 80® et le Span 80® et on stérilise le mélange par chauffage à 1200C pendant 30 minutes et on le laisse refroidir à température ambiante.
On chauffe alors la phase aqueuse (phase antigénique) et la phase huileuse séparément à 400C dans un bain marie.
Quand les 2 phases sont à la même température, on ajoute la phase aqueuse à la phase huileuse sous une agitation à 3000 tours/minutes.
Après l'ajout de la phase aqueuse, l'agitation est maintenue pendant 30 minutes.
Formulation Témoin 2 : adjuvant du commerce huile dans eau (Montanide IMS, SEPPIC)
Un adjuvant, le Montanide IMS, vendu par la société SEPPIC, (PARIS, France), prêt à l'emploi a été employé dans cette seconde préparation témoin. Les quantités sont données en gramme.
Phase aqueuse contenant l'antigène (exemple 1 ) 50 ,00 lMontanide IMS : 50 ,00
La phase aqueuse obtenue à l'exemple 1 et l'adjuvant sont mélangés sous agitation à l'aide du homogénéiseur Rayneri T33300 tournant à 150 tours par minute durant 20 secondes.
L'ensemble est stérilisé par filtration sur membrane synthétique de 0.22 μm de porosité. Formulation Témoin 3 : adjuvant du commerce eau/huile (Montanide ISA 763 VG, SEPPIC)
Un autre adjuvant, le Montanide ISA 763 VG, vendu par la société SEPPIC (PARIS, FRANCE), prêt à l'emploi, a été utilisé dans cette troisième formulation témoin. Les quantités sont données en gramme.
Phase aqueuse contenant l' antigène (exemple 1) | 30,00
Montanide ISA 763 VG 70,00
La phase aqueuse, obtenue à l'exemple 1, est filtrée sur filtre nylon 0.22μm, l'adjuvant sur filtre PTFE de 0.22 μm de porosité, l'ensemble étant assemblé de manière aseptique
L'adjuvant est placé dans un bêcher sous agitation à 800 tours/minute à l'aide d'un homogénéiseur Rayneri T33300.
La phase aqueuse antigénique est incorporée en une seule fois, sous agitation à 1200 tours/minute, maintenue durant 30 minutes.
Formulation Témoin 4 : adjuvant du commerce eau dans huile (Montanide ISA 563 VG, SEPPIC)
Un autre adjuvant, le Montanide ISA 563 VG, vendu par la société SEPPIC, (PARIS, FRANCE), prêt à l'emploi, a été utilisé dans cette quatrième formulation témoin. Les quantités sont données en gramme.
La partie aqueuse de la formulation est filtrée sur filtre nylon 0.22μm, l'adjuvant sur filtres PTFE de 0.22 μm de porosité, l'ensemble étant assemblé de manière aseptique.
L'adjuvant est placé dans un bêcher et agité à 800 tours/minute à l'aide d'un homogénéiseur Rayneri T33300. La phase aqueuse antigénique est incorporée en une seule fois, sous agitation à 1200 tours/minute, maintenue durant 15 minutes.
Formulation témoin 5 : adjuvant LH selon la demande de brevet WO 01/40240
Un autre adjuvant, le LH, adjuvant expérimental de la société COVACClNE (Lelystadt, PAYS BAS), prêt à l'emploi, a été utilisé dans cette dernière formulation témoin. Les quantités sont données en millilitres.
L'adjuvant aqueux LH est stérilisé par le fournisseur et reçu en l'état. De manière aseptique, la phase antigénique aqueuse et le tampon salin sont mélangés par agitation magnétique pendant 5 à 10 min., puis l'adjuvant LH est ajouté très lentement (« en filet ») au mélange phase antigénique- tampon salin. L'agitation est maintenue pendant 10 min. Comparaison des titres MRP :
Les titres en protéine MRP, mesurés comme décrit précédemment, des formulations témoin sont de 4 environ (en unités RP, (Relative Potency : Unité de mesure par Relative Potency Calculation Software, version 3.0, US Department of Agriculture). Celui de la composition selon l'invention est de 1.01.
En effet, compte tenu de la faible quantité d'eau présente dans la composition selon l'invention, il n'est pas possible d'incorporer autant d'antigène que dans les formulations témoin, sauf à augmenter sa concentration dans la phase aqueuse, ce qui pouvait biaiser la mesure de la réponse immunitaire.
Or, malgré cette concentration largement inférieure, et ce de manière surprenante, les résultats décrits ci-après démontrent une activité immunogène largement supérieure de 1' adjuvant selon l' invention.
Protocole des études comparatives de l'activité immunogène et de la tolérance des compositions Témoin et de la composition selon 1 ' invention :
La comparaison de la tolérance et de l' activité immunogène est réalisée sur la souris.
L'activité immunogène de la composition 1 selon 1' invention de l'exemple 2 a été comparée à celles des compositions Témoins en suivant le protocole expérimental suivant :
Des souris BALB/C (Fournisseur : Charles River) de 18- 22 grammes à la réception ont reçu, à 2 semaines d'intervalle, 2 injections de 250μl par voie intrapéritonéale. Le sang a été prélevé une semaine après le rappel, lors de l'autopsie des souris. D'un point de vue sérologique, le taux d'anticorps anti-Streptococcus suis a été évalué par une méthode ELISA.
Les puits d'une micro-plaque sont tapissés avec l'antigène (surnageant acellulaire de la culture) puis saturés. Les sérums de souris ayant reçu le vaccin sont dilués et déposés dans la plaque. Un anticorps anti-souris marqué (conjugué à une enzyme) est ajouté. Le substrat/chromogène de l'enzyme est déposé et la réaction colorée est mesurée. L'activité immunogène de chaque composition est alors définie par un titre moyen (en RP) correspondant à la moyenne des titres des souris composant le groupe.
La tolérance est appréciée selon trois critères : le taux de mortalité, l'activité de l'animal et l'aspect du pelage. La présence d'un résidu au point d'injection est également vérifiée.
Résultats
• pouvoir immunogène
Les valeurs indiquées sont relatives : la valeur indiquée représente le pouvoir immunogène d'une composition selon l' invention rapporté au pouvoir immunogène du témoin n° 5 qui a servi de référence pour l'évaluation du pouvoir immunogène de chaque témoin testé.
A Composition 1 selon l'invention B Témoin 1 C Témoin 2 D Témoin 3
E Témoin 4 F Témoin 5
Ces résultats montrent que la composition 1 (formule A) qui contient 4 et 6 fois moins d'antigène que les témoins 1 à 4, induit une réponse immunologique entre 2 et 80 fois plus élevée que celle induite par ces mêmes témoins. • tolérance chez l' animal
++ : Excellent (aucun signe)
+ : bonne (pas de tuméfaction, pas de résidus, éventuellement le poil ébouriffé)
+/-: mauvaise (tuméfaction, présence de résidus de produits, poil ébouriffé)
Ces résultats montrent que la formule A (composition
1), tout comme la formule F de référence (composition 5), est parfaitement tolérée tant au niveau local que systëmique, et beaucoup mieux tolérée que les 4 formules témoins.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique comprenant au moins le mélange d'au moins une huile, d'au moins un tensioactif et d'une phase aqueuse comprenant elle-même au moins une substance active, ladite composition pharmaceutique n'étant pas sous la forme d'une émulsion mais sous la forme d'un isotrope huileux.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle présente une viscosité compatible avec une utilisation par injection
3. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la substance active est un actif biologique, notamment un antigène vivant, atténué ou inactivé.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un vaccin.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la substance active est un antigène.
6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'antigène est d'origine virale, bactérienne, parasitaire ou tumorale.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 ou 6, caractérisée en ce que l'antigène est naturel ou recombinant.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que l' antigène est composé d'un microorganisme, éventuellement inactivé, ou de fractions dudit microorganisme.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une forte concentration en tensioactif et une faible concentration en eau.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend de 10% à 90% d'une huile, préférentiellement de 40% à 75% en poids, par rapport au poids de la composition totale.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,5% et 20% pour cent, préférentiellement de 3% et 9%, d'eau, en poids, par rapport au poids de la composition totale.
12. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle comprend de 1% à 60%, préférentiellement de 16% et 45% de tensioactif, en poids, par rapport au poids de la composition totale.
13. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le rapport de la quantité d'huile à la quantité d'eau ne doit pas être inférieur à 1, préférentiellement pas inférieur à 5.
14. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que l'huile est choisie parmi les huiles minérales, les huiles non- minérales, comme l'huile de foie de morue, les lipides synthétiques, les huiles végétales, les triglycérides à chaînes moyennes et longues, ou encore les huiles terpéniques, et leurs mélanges.
15. Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que l'huile minérale est choisie parmi l'huile de paraffine, l'huile de vaseline.
16. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'huile non-minérale est une huile végétale choisie parmi l'huile de soja, l'huile d'olive, l'huile de maïs, l'huile d'arachide, l'huile de graines de coton, l'huile de tournesol, l'huile de sésame, l'huile de ricin, l'huile d'amande.
17. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que les triglycérides à chaînes moyennes et longues sont choisis parmi les triglycérides des acides caprylique/caprique.
18. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que les huiles terpéniques sont choisies parmi le squalane et le squalène.
19. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que l'on utilise un mélange d'huile.
20. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisée en ce que le tensioactif est choisi parmi les tensioactifs anioniques, cationiques, non ioniques ou amphotères.
21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que le tensioactif est un tensioactif non ionique.
22. Composition selon la revendication 21, caractérisée en ce que le tensioactif est choisi parmi les polysorbates, les esters de sorbitane, particulièrement les esters de sorbitane et d'acide gras, les dérivés polyoxy- éthylénés de l'huile de ricin, les dérivés polyoxyéthylénés de l'acide stéarique, les copolymères d'oxyde d'éthylène et d' oxyde de propylène ou poloxamères, les esters de sacharose et d'acide gras, les esters de glycol et d'acides gras, les mono-, di- et tri-esters d'acide gras et de glycérol, les esters de polyéthylèneglycols et d'acides gras, les esters de saccharose et d'acides gras.
23. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, caractérisée en ce que l'on utilise un mélange de tensioactifs.
24. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, caractérisée en ce que sa viscosité à température ambiante est comprise entre 5 et 150 mPa.s, de préférence entre 5 et 100 mPa.s
25. Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que : - dans une première étape, l'antigène est dissous ou dispersé dans la phase aqueuse dans laquelle sont également éventuellement incorporées les substances additionnelles ci-dessus décrites et le mélange est chauffé, par exemple au bain-marie, à une température comprise entre 30 et 600C, préférentiellement entre 35 et 45°C ; dans une seconde étape, qui peut être concomitante à la première, le ou les tensioactifs sont mélangés à l'huile et le mélange est chauffé, par exemple au bain- marie, à une température comprise entre 30 et 600C, préférentiellement entre 35 et 450C ; dans une troisième étape, la phase aqueuse est incorporée à la phase huileuse en employant un homogénéiseur ; et dans une dernière étape, l'isotrope huileux obtenu est refroidi à température ambiante et stérilisé.
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