EP2097537A1 - Massenspektrometrisches verfahren an proben enthaltend nukleinsäuren - Google Patents

Massenspektrometrisches verfahren an proben enthaltend nukleinsäuren

Info

Publication number
EP2097537A1
EP2097537A1 EP07856466A EP07856466A EP2097537A1 EP 2097537 A1 EP2097537 A1 EP 2097537A1 EP 07856466 A EP07856466 A EP 07856466A EP 07856466 A EP07856466 A EP 07856466A EP 2097537 A1 EP2097537 A1 EP 2097537A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
strand
double
strands
mass
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07856466A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hüseyin Aygün
Michael Karas
Ute Bahr
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Goethe Universitaet Frankfurt am Main
BioSpring Gesellschaft fur Biotechnologie mbH
Original Assignee
Goethe Universitaet Frankfurt am Main
BioSpring Gesellschaft fur Biotechnologie mbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Goethe Universitaet Frankfurt am Main, BioSpring Gesellschaft fur Biotechnologie mbH filed Critical Goethe Universitaet Frankfurt am Main
Priority to EP07856466A priority Critical patent/EP2097537A1/de
Publication of EP2097537A1 publication Critical patent/EP2097537A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials

Definitions

  • Nucleic acids are composed of individual building blocks, the nucleotides, constructed macromolecules. Alternating monosaccharides and phosphoric acid residues form the backbone of the nucleic acids, with a nucleobase attached to each monosaccharide.
  • Important representatives of the nucleic acids are the deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), but also derivatives and modifications thereof, such as the "locked nucleic acid” (LNA), which is a modified RNA.
  • DNA and RNA-like organic polymers, such as e.g. Peptide nucleic acid (PNA) from the preamble of the nucleic acid comprises.
  • nucleic acids An essential property of the nucleic acids is that not only can they be present as single strands of the polymer of nucleotides or derivatives thereof, but also in the form of duplexes or more complex forms (e.g., as a triple helix).
  • a special feature here is that double-stranded or more complex structures are not formed from any individual strands of the nucleic acids, but the formation proceeds depending on the base sequence. Thus, a certain amount of complementarity in the base sequence of two individual nucleic acid strands is necessary in order to form a double-stranded structure.
  • such structures form spontaneously after the nucleic acid single strands have been brought together under physiological conditions (salt concentration, pH and temperature). Double strands are stabilized by hydrophobic interactions within the stacking (stacking interactions) and by intermolecular hydrogen bonding of the respective complementary strands of the single strands.
  • double-stranded nucleic acids are obtained by either separately synthesizing the complementary single strands and then combining under double-stranded conditions under physiological conditions, or synthesizing the double strand in a so-called "tandem" synthesis of the single strand.
  • a linker introduced in the synthesis is hydrolyzed and the resulting single strands, which have complementary base sequences are then hybridized under physiological conditions.
  • RNAi RNA interference or RNA interference
  • siRNAs short double-stranded RNA sequences
  • Elbashir and Tuschl succeeded for the first time in 2001 in proving that such a process can also be induced by means of short double-stranded RNA molecules (siRNAs) (Elbashir SM, Lendeckel W, and Tuschl T, Genes Dev, 2001, 15 (2), 188 Elbashir SM, Harborth J, Lendckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T, Nature, 2001, 411, 494-498; Caplen NJ, Parrish S, Imani F, Fire A, and Morgan RA, Proc. Natl Acad., USA, 2001, 98, 9746-9747).
  • siRNAs short double-stranded RNA molecules
  • RNA single strands it is above all the receptors TLR 7 and TLR 8 that are able to trigger such an immune response (Heil F, Hemmi H, Hochrein H, Ampenberger F, Kirschning C, Akira S, Lipford G, Wagner H , Bauer S, Science, 2004, 303, 1526-1529). Therefore, applications in which double-stranded nucleic acids act as an active substance should be well characterized in view of the presence of excess single strands.
  • the same proportions of the two complementary single strands are required for the preparation of a double strand.
  • Nucleic acids eg synthetic oligonucleotides, quantified in the prior art by UV-VIS spectroscopy.
  • the extinction coefficients of a solution containing the nucleic acid are measured and the nucleotide content calculated using the Lambert-Beer law.
  • the extinction coefficient of a nucleic acid is approximately additive composed of the extinction coefficients of the individual bases of a strand.
  • the samples obtained which in addition to the proportion of double strand can have a further proportion of single strand, must be characterized in particular by two measured values.
  • the single strand excess (single strand A or complementary single strand B), on the other hand the ratio of single strand to double strand in the sample.
  • the single strand fraction is determined in the prior art by ion exchange or reverse phase HPLC.
  • this method is complicated, time-consuming and also requires a constant optimization of the running conditions.
  • pure samples of each single strand are needed as calibration standards.
  • the detection limit for the single-stranded part is around 5%. This can be explained inter alia by the fact that the constituents (strand A, B, or double strand) often have similar retention times in chromatography. An evaluation is thus by the "running together" Both components much more difficult and inaccurate.
  • no direct statements can be made on the single strand in excess (strand A or strand B) via HPLC. If both strands have no or too little retention difference in the HPLC method used, the determination of the single strand excess must be carried out using a further method.
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • MS mass spectrometry
  • mass spectrometry is often used to check the quality of synthetically produced nucleic acids after preparation.
  • a method known as LC-MS is known.
  • the liquid chromatography is coupled with mass spectrometry.
  • the liquid chromatography is used for separation and the mass spectrometry for the identification and / or quantification of the substances.
  • other detectors are switched on, such as UV-ELS or conductivity detectors.
  • MALDI-MS matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry
  • the invention relates to a method for determining at least one property parameter of a sample which contains at least one biomolecule, the method comprising the following steps:
  • step (c) preparing a mass spectrum of the sample containing the standard under denaturing conditions; (d) comparing the peak height or peak area of at least one biomolecule-allocatable peak in the mass spectrum of step (b) with the peak height of the corresponding peak in the mass spectrum of step (c).
  • a biomolecule is understood to mean a chemical compound which occurs naturally in living organisms or is or can be prepared by them.
  • Biomolecules consist mainly of carbon and hydrogen, along with nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur and other rarer elements.
  • the biomolecules consist of two non-covalently bound units, e.g. homo- or heterodimeric protein complexes or double-stranded DNA, the latter being preferred.
  • the biomolecule comprises at least one nucleic acid, in particular one or more oligomolecules, e.g. a mixture of single-stranded and / or double-stranded nucleic acids.
  • double-stranded part in the sample means the ratio of the amounts (molar amounts) of the part of a nucleic acid which is present as a double strand to that part of a nucleic acid which is present as a single strand.
  • the parts, which are present as double strand or single strand are each two complementary single strands, which together can form a double strand. It is thus possible for each of the complementary single strands, which are preferably not identical, to determine a double-stranded part or a ratio of the respective single strand to the double-stranded part in the sample.
  • nucleic acids contained in the sample DNA, RNA, non-natural derivatives thereof, such as LNA, and preferably natural or synthetically produced nucleic acids, so-called oligonucleotides, can be used.
  • the ratio of single strands to double strands in the sample, the excess of single strand in the sample, the interaction forces between different nucleic acids of the sample or the interaction of the in the Sample present nucleic acid with other non-nucleic acid-containing ingredients of the sample can be determined.
  • the method according to the invention is described by way of example for the measurement of nucleic acids, in particular double-stranded and single-stranded nucleic acids.
  • it may be suitably extended to other biomolecules, e.g. Proteins which are correspondingly transferred in complexes consisting of two non-covalently bound units, which would correspond to the double strand, and in corresponding monomers, which would correspond to the single strand.
  • corresponding refers to peaks which occur in several measurements and originate from the same substance.
  • corresponding peaks which are derived from a particular single strand, which under native conditions in the spectrum can only be seen at height, in which it is not bound in the double strand, and gives a stronger signal under denaturing conditions, since there is virtually no double strand is present.
  • the corresponding peaks are understood as meaning the respective peak pairs to be assigned to a particular single strand of two measurements, one of which is recorded under native and one under denaturing conditions.
  • normalization or “normalizing” is understood as meaning the multiplication of the peak heights / areas of one spectrum with respect to another by a factor which is determined so that a substance, preferably the standard, is kept constant in both measurements then having the same peak height or area in both spectra.
  • all measurements are normalized with respect to one measurement, in particular with respect to the standard held constant in the samples of all measurements.
  • the mass spectrum of a sample is obtained by measuring the sample in a mass spectrometer.
  • a mass spectrometer usable in the method of the present invention a MALDI-based mass spectrometer is preferred.
  • the sample is introduced into the instrument in the form of a so-called matrix.
  • the MALDI mass spectrometry is based primarily on the cocrystallization of matrix and analyte with a 100 to 100,000-fold molecular excess of matrix.
  • matrix substances small organic molecules are normally chosen which strongly absorb at the laser wavelength used (eg nitrogen lasers at a wavelength of 337 nm). With short high-energy laser pulses of a few nanoseconds pulse duration follows the excitation, which leads after relaxation in the crystal lattice to explosive particle separations on the surface of the matrix crystal. The combination with the matrix prevents fragmentation of mass-rich molecules.
  • the ionization mechanism in MALDI mass spectrometry is not fully understood.
  • the present invention is based, inter alia, on the problem that to quantify the content of double strand of a sample, e.g. consisting of two oligonucleotides, the signal intensities of the double and single strands in the MALDI mass spectrum can not be compared directly with one another, since the intensities obtained depend both on the mass of the detected nucleic acid and on the base composition itself.
  • a problem in the quantitative determination of the ratio of single strand to double strand and determination of the excess content on a single strand compared to the complementary single strand lies in the variation of the absolute values of the peak heights / peak areas of a mass spectrometric measurement to the next.
  • At least two measurements are carried out, one under native conditions in which the double strand is stabilized, and one under denaturing, the double strand destabilizing conditions.
  • An intensity comparison of the peaks of the corresponding single strands taking into account the internal standard provides a reliable statement about the single-stranded part of the sample.
  • an internal standard is each at two measurements are added and the single stranded intensity (Iss) relative to the intensity of internal standard (l S s) is determined. From the single-strand intensities single-strand and double-stranded parts can be calculated. Furthermore, it can be determined simultaneously which single strand is in excess, provided that the masses of the two strands differ (M Stran g A ⁇
  • an aqueous solution is first prepared consisting of the oligonucleotide probe and an added standard.
  • the standard e.g. comprises another oligonucleotide, must not interact with the sample under the experimental conditions, especially not under "native” and “denaturing” conditions.
  • the added standard acts as an internal standard.
  • a denaturing agent for example formic acid
  • the denaturing agent is weighted and added in such amounts (preferably 10-30% by weight, in particular 15-25% by weight, for example 20% by weight of the sample) that the double strand completely decomposes into single strands.
  • the measurement previously performed under "native" conditions is thus repeated under identical conditions with the mere addition of denaturing agent.
  • the intensity of the single strand that is not bound in the double strand is known (IssN at iv) - From the measurement under "denaturing” conditions is the intensity and thus the amount of the single strand contained in the sample known (Iss D e n a ⁇ - Taking into account the ratio factor y between the two different measurements of the proportion of the single strand can be determined therefrom at which it is present at “native” conditions (ISSN at iv (%)) • As this share with it If the proportion of single strand bound in double strand is 100% supplemented, this can be used to determine the proportion of single strand bound in double strand (I DS (%)).
  • the peak heights can be used in addition to the peak areas, provided that the standard and single strands are in a similar mass range, so that the resolution (peak width) is the same for both.
  • Suitable standard substances are all single-stranded oligonucleotides which show no interaction with the analyte substances under the experimental conditions and do not change under the influence of the denaturing agent.
  • the use of oligonucleotides also makes it easy to tune the mass range of the standard to the single strands, which, as explained above, leads to a comparable resolution.
  • a difference of 1 to 2 nucleotide units between the length of the oligonucleotides and the length of the individual strands to be examined is advantageous.
  • Such an analysis of the spectra obtained requires a linearity of the mass spectrometric measurement over two orders of magnitude of concentration, ie the concentrations of the single strands are between 1 and 100 percent of the measuring range of the mass spectrometer. It should also be noted that when measuring under "denaturing" conditions, the ratio of ion intensity of standard and analyte should not be affected compared to the measurement in "native" conditions to avoid falsification of the results of the
  • any excess of one of the two single strands (strand 1 or 2), the to form the double strand can be determined from the two measurements at "native" and “denaturing” conditions, any excess of one of the two single strands (strand 1 or 2), the to form the double strand.
  • the direct difference of the signal intensities of the two strands within a spectrum can not be used directly for this, since due to different ionization and detection probabilities of the two molecules, the excess is not directly, e.g. by subtracting the intensities.
  • the different ionization and detection probability of a molecule is taken into account by means of an unknown response factor z. Since the response factor z of one strand with respect to the other is between two measurements, e.g. under "native" and "denaturing" conditions, this unknown factor z can be eliminated by the ratio of the intensities between the measurements. In this way, the excess of one single strand over the other can be quantified.
  • the proposed double-strand quantification method according to the invention has the particular advantage that the peak ratios are determined in a single solution. By setting the intensities of the peaks of two measurements, fluctuations of the measurement parameters are eliminated and thus a high accuracy of the values to be determined is ensured.
  • the inventive method also has the advantages that the measurement is very fast due to the use of a MALDI mass spectrometer, since the method can be automated and the sample throughput is very high. Thus, typically only a few minutes are required to record the two measurements at "native” and “denaturing” conditions. The evaluation of the spectra and the corresponding calculations of the intensities and the excess ratio can easily be carried out with computer assistance. The use of calibration substances is not necessary, except for an internal standard, which can be the same every time. Thus, due to the above advantages, the error in determining the double strand portion can be suppressed to below 2 percent.
  • the inventive method can be carried out with any MALDI mass spectrometer, as long as it is a linear MALDI mass spectrometer.
  • the MALDI sample matrices useful in the method of the present invention are neutral matrices that do not result in denaturation of the duplexes. Particularly advantageous are saturated solutions of 6-aza-2-thiothymine (ATT, available from Fluka, Germany) (about 6-7 mg / ml) in 100-200 mM, particularly advantageously 120-150 mM, aqueous diammonium hydrogen citrate. Solution (DAHC, available from Fluka, Germany). With the concentration of DAHC increasing from 0 mM, the concentration of detectable duplex increases and approaches saturation at 150-200 mM (see Example 2).
  • ATT 6-aza-2-thiothymine
  • DAHC available from Fluka, Germany
  • the method according to the invention is particularly advantageous given a length of the nucleic acids of 10 to 60 bp, in particular of 18 to 23 bp, e.g. of siRNA.
  • a lower limit for sufficient stability of the duplex should be around 10 bp.
  • the invention further relates to the use of an acid for denaturing nucleic acids in sample preparation for mass spectrometry.
  • the invention relates to the use of a mixture of 6-aza-2-thiothymine (ATT) and diammonium hydrogen citrate (DAHC) in a sample matrix for MALDI mass spectrometry.
  • ATT 6-aza-2-thiothymine
  • DAHC diammonium hydrogen citrate
  • the method according to the invention is also suitable for the detection of other, non-covalent interactions between nucleic acid single strands which have complementary base sequences.
  • the relationship between the species present as a single strand and as a double strand on the binding energy for the formation of the double strand from the respective strands can be deduced.
  • Appropriate method for Determination of the binding energies from the binding ratios are known in the art.
  • the method according to the invention can be used to determine protein interactions since, in accordance with the above statements, the ratio between dissociated proteins and protein complexes can be determined in an identical manner. From the ratio determined by means of the method according to the invention, conclusions can be drawn about corresponding interaction energies.
  • the method of the invention can be used to control the quality of synthetically produced, double-stranded oligonucleotides, as described, for example, in US Pat. used in gene expression studies (siRNA or RNAi).
  • the process according to the invention can be advantageously used for the preparation of mixtures with a defined ratio between double strand and single strand. This is e.g. possible via mixture titration with subsequent MALDI mass spectrometry according to the invention.
  • a simple method is thus provided to obtain compounds containing a defined amount of duplex, preferably mainly duplex, e.g. > 98%, exist. Such compounds are particularly important for pharmaceutical applications of great importance.
  • FIG. 1 shows a graph with two offset mass spectra of a sample in native and denaturing conditions.
  • FIG. 2 shows a diagram in which the double-strand / single-strand intensity of a nucleic acid-containing sample is plotted against the DAHC concentration of the sample solution.
  • example 1 The invention is further illustrated by the following examples: example 1
  • Figure 1 shows two staggered MALDI-MS spectra, where lane 1 was recorded under "native" conditions and lane 2 under “denaturing” conditions. Only the mass range of the standard and the single strands are shown since the peaks of the double strand are not needed for the evaluation.
  • the standard used was an oligonucleotide strand which does not interact with the complementary single strands 1 and 2 (SS 1 and SS 2 ) to be investigated. Since the standard in the samples of the two measurements is identical, the intensities of the two spectra can be normalized via the correction factor y, which is determined according to formula (1) above, so that subsequently the intensity of the standard is the same in both spectra and respective single-strand intensities are thus directly comparable. For the spectrum shown in FIG.
  • a possible excess of a single strand can be determined.
  • the values of single strand 2 (SS 2 ) of the peaks at "native" conditions (1347 counts) and at "denaturing" conditions (16749 counts) are required. Used in the above formula (4b) thus results in a relative excess for single strand 2 of 2.5%. That is, single strand 1 is a total of 5.7% in the form of single strand and single strand 2 8.2% in the form of single strand, with single strand 2 has a relative excess of 2.5%.
  • RNA 6-aza-2-thiothymine
  • DAHC aqueous diammonium hydrogen citrate solution
  • RNA oligonucleotide was 17-base-pair RNA oligonucleotide that did not interact with the sample under the experimental conditions.
  • Mass spectrometric analysis was performed on a linear time MALDI time-of-flight mass spectrometer (Voyager De-Pro, Applied Biosystems, Framingham, USA). Spectra of the positive ions as well as the negative ions can be used for analysis since both show comparable intensities and resolutions.
  • the operating parameters chosen were an acceleration voltage of 20 kV, a grid voltage of 95% of the acceleration voltage and a delay time of 600 ns. In order to obtain a sufficient signal-to-noise ratio, 50-100 individual spectra were accumulated for each spectrum. To calculate the peak areas and heights, the spectra were smoothed 19 pt and the baseline corrected.
  • the concentration of double strand was found to increase with increasing DAHC concentration, approaching saturation at 150-200 mM.
  • the samples were prepared and measured according to Example 1.
  • the ratios of double strand to single strand were calculated according to the above-mentioned method of the measured according to Example 1 spectra.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein massenspektrometrisches Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von doppelsträngigen Nukleinsäuren, welche nicht kovalent miteinander assoziiert sind.

Description

Massenspektrometrisches Verfahren an Proben enthaltend Nukleinsäuren
Nukleinsäuren sind aus einzelnen Bausteinen, den Nukleotiden, aufgebaute Makromoleküle. Alternierende Monosaccharide und Phosphorsäurereste bilden hierbei das Grundgerüst der Nukleinsäuren, wobei an jedem Monosaccharid eine Nukleinbase hängt. Wichtige Vertreter der Nukleinsäuren sind die Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA), aber auch Derivate und Modifikationen dieser, wie die "locked nucleic acid" (LNA), die eine modifizierte RNA darstellt. Des Weiteren werden oft auch DNA- und RNA-ähnliche organische Polymere, wie z.B. Peptid-Nukleinsäure (PNA) vom Oberbegriff der Nukleinsäure umfasst.
Eine wesentliche Eigenschaft der Nukleinsäuren liegt darin, dass sie nicht nur als Einzelstränge des Polymers aus Nukleotiden oder Derivaten dieser vorliegen kann, sondern auch in Form von Doppelsträngen oder komplexeren Formen (z.B. als Tripelhelix) vorliegt. Eine Besonderheit hierbei ist, dass doppelsträngige bzw. komplexere Strukturen nicht aus beliebigen Einzelsträngen der Nukleinsäuren gebildet werden, sondern die Bildung in Abhängigkeit der Basensequenz abläuft. So ist ein bestimmter Anteil an Komplementarität in der Basenabfolge zweier einzelner Nukleinsäurestränge nötig, um eine doppelsträngige Struktur bilden zu können. Liegt ausreichende Komplementarität vor, bilden sich solche Strukturen, wie eine Doppelstrangstruktur, spontan nach Zusammenbringen der Nukleinsäure-Einzelstränge unter physiologischen Bedingungen (Salzkonzentration, pH und Temperatur). Stabilisiert werden Doppelstränge durch hydrophobe Wechselwirkungen innerhalb der Basenstapelung (stacking interactions) und durch intermolekulare Wasserstoffbrücken der jeweils komplementären Basen der Einzelstränge.
Im Stand der Technik werden doppelsträngige Nukleinsäuren gewonnen, indem man entweder die komplementären Einzelstränge getrennt synthetisiert und anschließend unter physiologischen Bedingungen zum Doppelstrang kombiniert, oder den Doppelstrang hintereinander in einer sog. "Tandem-"Synthese des Einzelstranges synthetisiert. Hierbei wird nach der Einzelstrangsynthese nach chemischer Aufarbeitung ein bei der Synthese eingebrachter Linker hydrolysiert und die entstehenden Einzelstränge, welche komplementäre Basenabfolgen aufweisen, werden anschließend unter physiologischen Bedingungen hybridisiert.
In neuester Zeit stoßen gerade doppelsträngige RNA-Moleküle auf sehr großes Interesse. Die als RNAi (RNA-I nterferenz oder RNA interference) bezeichnete Technologie, bei welcher kurze doppelsträngige RNA-Sequenzen zum Einsatz kommen (sog. siRNA's), nutzt eine spezielle Eigenschaft höherer Zellen aus, um die intrazelluläre Proteinexpression auf mRNA- Ebene mittels solcher Doppelstränge und weiterer zelleigener Komponenten zu regulieren. Elbashir und Tuschl gelang 2001 erstmals der Nachweis, dass sich ein solcher Prozess auch mit Hilfe von kurzen doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA's) induzieren lässt (Elbashir SM, Lendeckel W, and Tuschl T, Genes Dev, 2001 , 15(2), 188 - 200; Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T, Nature, 2001 , 411 , 494 - 498; Caplen NJ, Parrish S, Imani F, Fire A, and Morgan RA, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2001 , 98, 9746 - 9747). In der Regel handelt es sich hierbei um chemisch hergestellte Doppelstränge, mit einer Länge von 19 - 21 Basenpaaren und einem Dinukleotid als 3'-Überhang (zumeist dTdT).
Für die erfolgreiche Anwendung doppelsträngiger Strukturen in Forschung und Medizin ist es besonders wichtig, neben der Reinheit der Einzelstränge auch die Vollständigkeit der Hybridisierung als Doppelstrang zu gewährleisten. Ein Überschuss an Einzelsträngen kann in der Anwendung zu zahlreichen Nebenwirkungen führen und sollte daher möglichst vermieden werden. Wichtig ist dabei die Fähigkeit von Zellen, über sog. TLR-Rezeptoren an Membranoberflächen solche einzelsträngigen Nukleinsäuren zu erkennen und darauf mittels einer Immunantwort (z.B. durch Ausschüttung von Interferonen) zu reagieren. Diese Immunantwort ist jedoch insbesondere bei medizinischen Verfahren unerwünscht und sollte vermieden werden. Für RNA-Einzelstränge sind es vor allem die Rezeptoren TLR 7 und TLR 8, die in der Lage sind, eine solche Immunantwort auszulösen (Heil F, Hemmi H, Hochrein H, Ampenberger F, Kirschning C, Akira S, Lipford G, Wagner H, Bauer S, Science, 2004, 303, 1526 - 1529). Daher sollten Anwendungen, in welcher doppelsträngige Nukleinsäuren als aktive Substanz wirken, im Hinblick auf das Vorhandensein von überschüssigen Einzelsträngen gut charakterisiert werden.
In der Regel werden für die Herstellung eines Doppelstranges gleiche Anteile der beiden komplementären Einzelstränge benötigt. Um dies quantitativ erreichen zu können werden Nukleinsäuren, z.B. synthetische Oligonukleotide, im Stand der Technik mittels UV-VIS Spektroskopie quantifiziert. Hierbei werden die Extinktionskoeffizienten einer Lösung, die die Nukleinsäure enthält, gemessen und der Nukleotidgehalt über das Lambert-Beersche Gesetz berechnet. Der Extinktionskoeffizient einer Nukleinsäure setzt sich näherungsweise additiv aus den Extinktionskoeffizienten der Einzelbasen eines Stranges zusammen. Ein Fehler dieser additiven Abschätzung des Extinktionskoeffizienten der Nukleinsäure aus den Einzelbasen entsteht jedoch durch nachbarschaftliche Wechselwirkungen der Einzelbasen, die die effektive Absorption der Einzelbasen verändert, wodurch sich der Extinktionskoeffizient des Gesamtstrangs nicht mehr exakt berechnen lässt. Hinzu kommt, dass die Nukleinsäuren selbst unter den Messbedingungen intramolekulare Strukturen bilden können, was die Extinktionskoeffizienten der Einzelbasen über den sog. hyperchromen Effekt weiter verändert, und somit den berechneten Wert des Oligonukleotidgehalts weiter verfälscht. Dies hat zur Folge, dass es zu Fehlern bei der Bestimmung der Einzelstrangkonzentration kommt. Durch die Fehler bei der Bestimmung der Einzelstrangkonzentration einer Probe wird folglich bei der Herstellung eines Doppelstrangs ein Produkt erhalten, das neben den gewünschten Doppelsträngen einen Überschuss an einem Einzelstrang enthält. Solche Proben sind jedoch unvorteilhaft, da sie wie oben ausgeführt insbesondere bei medizinischen Verfahren unerwünschte Nebenwirkungen auslösen.
Die erhaltenen Proben, die neben dem Anteil an Doppelstrang einen weiteren Anteil an Einzelstrang aufweisen können, müssen insbesondere durch zwei Messwerte charakterisiert werden. Zum einen handelt es sich um die qualitative Erfassung des Einzelstrangüberschusses (Einzelstrang A oder komplementärer Einzelstrang B), zum anderen um das Verhältnis von Einzel- zu Doppelstrang in der Probe.
Der Einzelstranganteil wird im Stand der Technik über lonentauscher- oder Umkehrphasen- HPLC bestimmt. Dieses Verfahren ist jedoch aufwendig, zeitintensiv und setzt zudem eine ständige Optimierung der Laufbedingungen voraus. Um dieses Verfahren außerdem quantitativ anwenden zu können, werden von jedem Einzelstrang reine Proben als Kalibrierungsstandards benötigt. Die Detektionsgrenze liegt hierbei für den Einzelstranganteil im Bereich um 5%. Dies lässt sich u.a. damit erklären, dass die Bestandteile (Strang A, B, oder Doppelstrang) häufig ähnliche Retentionszeiten in der Chromatographie aufweisen. Eine Auswertung wird somit durch das "Ineinanderlaufen" beider Komponenten wesentlich erschwert und ungenau. Zudem lassen sich über HPLC keine direkten Aussagen über den im Überschuss befindlichen Einzelstrang machen (Strang A oder Strang B). Weisen beide Stränge keinen oder einen zu geringen Retensionsunterschied in der verwendeten HPLC-Methode auf, muss die Bestimmung des Einzelstrangüberschusses über eine weitere Methode erfolgen.
Ein weiteres Verfahren, das Verhältnis an Einzelstrang zu Doppelstrang zu bestimmen, ist die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE). Hierbei wird der Umstand ausgenutzt, dass im elektrischen Feld die Wanderungseigenschaften von Doppelsträngen und Einzelsträngen, durch die Ladungsverhältnisse bedingt, deutlich unterschiedlich sind. Auch bei dieser Methode dominieren zahlreiche Einschränkungen. Die genaue Quantifizierung des Überschussanteils, auch hierfür werden Eichsubstanzen benötigt, sowie die Charakterisierung des im Überschuss vorliegenden Einzelstranges erweisen sich als fehlerbehaftet und wenig vorteilhaft, insbesondere wenn beide Stränge die gleiche Länge aufweisen und somit ähnliches Laufverhalten im Gel aufweisen.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Untersuchung von Biomolekülen ist die Massenspektrometrie (MS). Sie stellt unter anderem ein einfaches und sehr effizientes Messverfahren zur Bestimmung der molekularen Masse von Biomolekülen dar (W. D. Lehmann: Massenspektrometrie in der Biochemie, Spektrum Akad. Verlag, Heidelberg 1996) und wird hauptsächlich zur Analyse von Proteinen, aber auch Nukleinsäuren eingesetzt.
Als analytisches Verfahren kommt die Massenspektrometrie häufig zum Einsatz, um die Qualität synthetisch hergestellter Nukleinsäuren nach der Herstellung zu überprüfen. Bekannt ist z.B. ein Verfahren, dass als LC-MS bezeichnet wird. Hierbei wird die Flüssigchromatographie mit der Massenspektrometrie gekoppelt. Die Flüssigchromatographie dient zur Auftrennung und die Massenspektrometrie zur Identifikation und/oder Quantifizierung der Substanzen. In der Regel werden noch weitere Detektoren zugeschaltet, wie z.B. UV-ELS- oder Leitfähigkeitsdetektoren. Hierdurch können z.B. qualitative und quantitative Aussagen über Verunreinigungen in der zu untersuchenden Oligonukleotidprobe festgestellt werden. Am häufigsten findet jedoch eine als MALDI-MS (matrix assisted laser desorption ionisation mass spectrometry) Verfahren bezeichnete Technik Anwendung (M. Karas, F. Hillenkamp, Anal. Chem. 1988, 60, 2299; M. Karas, U. Bahr, F. Hillenkamp, Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1989, 92, 231 ; M. Karas, U. Bahr, A. Ingendoh, F. Hillenkamp, Angew. Chemie 1989, 101 , 805; F. Hillenkamp, M. Karas, Methods Enzymol. 1990, 193, 280). Diese Technik eignet sich besonders zur schnellen und qualitativen Untersuchung von Oligonukleotiden (Bonk T, Humeny A, The Neuroscientist, 2001 , 7 (1), 6 - 12; Distler AM, Allison J, Anal Chem., 2001 , 73 (20), 5000 - 5003). Im Stand der Technik sind jedoch nur wenige erfolgreiche Anwendungen dieser Methode übermittelt, bei denen es gelungen ist, intakte Biomoleküle zu detektieren, die nicht über kovalente Wechselwirkungen stabilisiert werden, wie beispielsweise Nukleinsäuredoppelstränge.
Ursachen für die Schwierigkeiten, nicht-kovalent miteinander assoziierte Doppelstränge mit MALDI-MS nachzuweisen, sind die im Stand der Technik verwendete Probenmatrix, die einen sauren pH-Wert von ca. 3 aufweist, sowie die Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Beides führt zur Destabilisierung von Nukleinsäuredoppelsträngen. Inwieweit die zur Desorption nötige Laserintensität (UV-Laser) zur Destabilisierung beiträgt, ist bisher nicht bekannt.
Zahlreiche Variationen wurden entwickelt, um den Nachweis von nicht-kovalent assoziierten Einzelsträngen in der MALDI-Massenspektrometrie zu ermöglichen.
Lecci und Pannell (J. Am. Soc. Mass Spectrom., 1995, 6, 972 - 975) beschreiben die Verwendung von 6-Aza-2-thiothymin anstelle von 3-Hydroxypicolinsäure als Probenmatrix, um doppelsträngige DNA über MALDI-MS nachzuweisen. Jedoch konnte auch durch die Veränderung der Probenmatrix nicht verhindert werden, dass signifikante Mengen von Einzelsträngen, verursacht durch die Dissoziation des Doppelstranges, während der Desorption gemessen wurden. Eine Aussage über das Verhältnis von überschüssigem Einzelstrang zum Doppelstrang der Probe kann somit nicht vorgenommen werden.
Little et al. (Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes, 169/170, 1997, 323 - 330) beschreibt die Untersuchung von DNA mittels MALDI-MS, bei der die Probenmatrix zusätzlich abgekühlt wurde, um die Dissoziation der Doppelstränge zu verhindern. Die Abkühlung stellt jedoch einen weiteren aufwendigen Prozessschritt dar, der unvorteilhaft ist, und ebenfalls nicht verhindern konnte, dass signifikante Mengen an Einzelsträngen bei der Messung nachgewiesen wurden. Somit ist auch durch dieses Verfahren keine Möglichkeit gegeben, das Verhältnis von überschüssigem Einzelstrang zum Doppelstrang der Probe zu bestimmen.
Eine weitere Methode, mittels Massenspektrometrie doppelsträngige Nukleinsäureproben zu untersuchen, wurde von Kirpekar et al. beschrieben (Kirpekar F, Berkenkamp S, Hillenkamp F, Anal. Chem., 1999, 71 (13), 2334 - 2339). Neben UV-Lasern und 6-Aza-2-thiothymin als Probenmatrix wurde hier statt eines handelsüblichen Stickstofflasers ein IR-Laser zur Probendesorption verwendet. Das Probenmaterial bestand aus sehr langen Oligonukleotid- Doppelsträngen (70mer und 80mer), von denen Doppelstränge nachgewiesen, aber nicht quantifiziert wurden. Auch diese Methode kann somit keine Aussage über das Verhältnis von überschüssigem Einzelstrang zum Doppelstrang liefern.
Es besteht somit Bedarf an einem schnellen, unkomplizierten Verfahren zur Bestimmung von Eigenschaftsparametern einer Probe enthaltend mindestens ein Biomolekül, vorzugsweise mindestens eine Nukleinsäure, wodurch die Eigenschaftsparameter, bei nukleinsäurehaltigen Proben insbesondere das Verhältnis von Einzelstrang zu Doppelstrang der Nukleinsäure der Probe und/oder der Überschuss an einem Einzelstrang an Nukleinsäure in der Probe, bestimmt werden können.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass bestimmte Eigenschaftsparameter einer Probe, die mindestens ein Biomolekül, vorzugsweise mindestens eine Nukleinsäure enthält, durch Ausführung des nachfolgend beschriebenen Verfahrens quantitativ bestimmt werden können.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung wenigstens eines Eigenschaftsparameters einer Probe, die wenigstens ein Biomolekül enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Zugabe eines Standards zu der Probe;
(b) Erstellen eines Massenspektrums der den Standard enthaltenden Probe unter nativen Bedingungen;
(c) Erstellen eines Massenspektrums der den Standard enthaltenden Probe unter denaturierenden Bedingungen; (d) Vergleichen der Peakhöhe oder Peakfläche von wenigstens einem dem Biomolekül zuzuordnenden Peak in dem Massenspektrum aus Schritt (b) mit der Peakhöhe bzw. Peakfläche des korrespondierenden Peaks in dem Massenspektrum aus Schritt (c).
Als Biomolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine chemische Verbindung verstanden, die in der Natur in lebenden Organismen auftritt oder von diesen hergestellt wird oder werden kann. Biomoleküle bestehen hauptsächlich aus Kohlenstoff und Wasserstoff, zusammen mit Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel und weiteren selteneren Elementen. Gegebenenfalls bestehen die Biomoleküle im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus zwei nicht kovalent gebundenen Einheiten, wie z.B. homo- oder heterodimere Proteinkomplexe oder doppelsträngige DNA, wobei letztere bevorzugt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Biomolekül mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere ein oder mehrere Oligomoleküle, z.B. ein Gemisch aus einzelsträngigen und/oder doppelsträngigen Nukleinsäuren.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Doppelstranganteil" in der Probe das Verhältnis der Mengen (Stoffmengen) des Teils einer Nukleinsäure, die als Doppelstrang vorliegt zu dem Teil einer Nukleinsäure, der als Einzelstrang vorliegt, verstanden. Bei den Teilen, die als Doppelstrang bzw. Einzelstrang vorliegen, handelt es sich jeweils um zwei komplementäre Einzelstränge, die zusammen einen Doppelstrang bilden können. Es kann somit für jeden der komplementären Einzelstränge, die vorzugsweise nicht identisch sind, ein Doppelstranganteil bzw. ein Verhältnis des jeweiligen Einzelstrangs zu dem im Doppelstrang vorliegenden Teil in der Probe bestimmt werden.
Als die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren können DNA, RNA, nicht natürliche Derivate hieraus wie LNA und vorzugsweise natürliche oder synthetisch hergestellte Nukleinsäuren, sog. Oligonukleotide, verwendet werden.
Als Eigenschaftsparameter können durch das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere der Doppelstranganteil der Probe, das Verhältnis von Einzelsträngen zu Doppelsträngen in der Probe, der Überschuss an Einzelstrang in der Probe, die Wechselwirkungskräfte zwischen verschiedenen Nukleinsäuren der Probe oder die Wechselwirkung der in der Probe vorhandenen Nukleinsäure mit anderen nicht-Nukleinsäure-haltigen Inhaltsstoffen der Probe bestimmt werden.
Im Weiteren wird das erfindungsgemäße Verfahren beispielhaft für die Messung von Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngige und einzelsträngige Nukleinsäuren beschrieben. Es kann jedoch entsprechend auf weitere Biomoleküle, wie z.B. Proteine, die entsprechend in Komplexen bestehend aus zwei nicht kovalent gebundenen Einheiten, was dem Doppelstrang entsprechen würde, und in entsprechenden Monomeren, was dem Einzelstrang entsprechen würde, übertragen werden.
Unter "Vergleichen" der Peakhöhen oder Peakflächen einzelner Peaks wird das ins Verhältnissetzen bzw. das Umrechnen nach algebraischen Vorschriften, wie z.B. im Rahmen dieser Anmeldung beschrieben, der numerischen Werte, die für die entsprechenden Peaks aus den Spektren bestimmt werden können, z.B. count, area, usw. verstanden. Das Quantifizieren von Peaks aus Spektren ist im Stand der Technik bekannt.
Als "korrespondierend" werden im Rahmen der vorliegenden Anmeldung Peaks bezeichnet, die in mehreren Messungen auftreten und von der gleichen Substanz stammen. Hierbei werden z.B. als korrespondierende Peaks diese bezeichnet, welche von einem bestimmten Einzelstrang stammen, der unter nativen Bedingungen im Spektrum nur in der Höhe zu sehen ist, in der er nicht im Doppelstrang gebunden ist, und unter denaturierenden Bedingungen ein stärkeres Signal gibt, da praktisch kein Doppelstrang mehr vorliegt. Vorzugsweise werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung als korrespondierende Peaks die jeweils einem bestimmten Einzelstrang zuzuordnenden Peakpaare von zwei Messungen, von denen eine unter nativen und eine unter denaturierenden Bedingungen aufgenommen ist, verstanden.
Unter "Normalisierung" oder "Normalisieren" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das Multiplizieren der Peakhöhen/-flächen eines Spektrums bezüglich eines anderen mit einem Faktor verstanden, der so bestimmt wird, dass eine Substanz, vorzugsweise der Standard, die bei beiden Messungen konstant gehalten wurde, anschließend in beiden Spektren die selbe Peakhöhe oder -fläche aufweist. Vorzugsweise werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren alle Messungen bezüglich einer Messung, insbesondere bezüglich des in den Proben aller Messungen konstant gehaltenen Standards, normalisiert. Das Massenspektrum einer Probe wird durch Messung der Probe in einem Massenspektrometer erhalten. Als im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbarer Massenspektrometer ist ein MALDI-basiertes Massenspektrometer bevorzugt. Im MALDI- Massenspektrometer wird die Probe in Form einer sog. Matrix in das Gerät eingebracht. Die MALDI-Massenspektrometrie beruht vor allem auf der Kokristallisation von Matrix und Analyt mit einem 100 bis 100.000-fachen molekularen Überschuss an Matrix. Als Matrixsubstanzen werden normalerweise kleine organische Moleküle gewählt, die bei der verwendeten Laserwellenlänge (z.B. Stickstoff-Laser bei einer Wellenlänge von 337nm) stark absorbieren. Mit kurzen hochenergetischen Laserimpulsen von einigen Nanosekunden Pulsdauer folgt die Anregung, die nach Relaxation im Kristallgitter zu explosionsartigen Teilchenablösungen an der Oberfläche des Matrixkristalls führt. Durch die Verbindung mit der Matrix wird eine Fragmentierung von massenreichen Molekülen verhindert. Der lonisierungsmechanismus bei der MALDI-Massenspektrometrie ist noch nicht vollständig verstanden.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass bei besonders hohen Konzentrationen an Matrixpuffer (Diammoniumhydrogencitrat, DAHC) und bei optimaler Probenkonzentration, sowie Vermeidung von organischen Lösungsmitteln der Doppelstranganteil einer Nukleinsäure enthaltenden Probe, selbst in einer handelsüblichen Probenmatrix wie 6-Aza- 2-Thiotymin (ATT) während der Desorption mittels UV-Laser stabil erhalten bleibt. Somit wird eine quantitative Bestimmung des Doppelstranganteils in der Probe möglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt unter anderem das Problem zugrunde, dass zur Quantifizierung des Gehalts an Doppelstrang einer Probe, z.B. bestehend aus zwei Oligonukleotiden, die Signalintensitäten der Doppel- und der Einzelstränge im MALDI- Massenspektrum nicht direkt miteinander verglichen werden können, da die erhaltenen Intensitäten sowohl von der Masse der detektierten Nukleinsäure als auch von der Basenzusammensetzung selbst abhängen.
Ein Problem bei der quantitativen Bestimmung des Verhältnisses von Einzelstrang zu Doppelstrang und Bestimmung des Überschussanteils an einem Einzelstrang gegenüber dem komplementären Einzelstrang liegt in der Variation der absoluten Werte der Peakhöhen/Peakflächen einer massenspektrometrischen Messung zur nächsten. Diese Probleme wurden durch das Einführen einer Referenzsubstanz, welche sich in der Probe als interner Standard befindet, gelöst. Somit war eine Quantifizierung des Verhältnisses von Einzelstrang zu Doppelstrang und des Überschussanteils an einem Einzelstrang erstmals mit Hilfe der MALDI-MS-Technik möglich.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden mindestens zwei Messungen durchgeführt, eine unter nativen Bedingungen, bei denen der Doppelstrang stabilisiert ist, und eine unter denaturierenden, den Doppelstrang destabilisierenden, Bedingungen. Ein Intensitätsvergleich der Peaks der korrespondierenden Einzelstränge unter Berücksichtigung des internen Standards liefert hierbei eine verlässliche Aussage über den Einzelstranganteil der Probe. Insbesondere wird jeweils bei zwei Messungen, unter nativen und unter denaturierenden Bedingungen, der gelösten Probe ein interner Standard zugesetzt und die Einzelstrangintensität (Iss) relativ zur Intensität des internen Standards (lSs) bestimmt. Aus den Einzelstrangintensitäten lassen sich Einzelstrang- und Doppelstranganteil berechnen. Des Weiteren lässt sich simultan bestimmen, um welchen Einzelstrang es sich im Überschuss handelt, sofern sich die Massen der beiden Stränge unterscheiden (MStrang A ≠
Mstrang ß)-
Zur Messung unter "nativen" Bedingungen, d.h. unter optimierten MALDI- Massenspektrometriebedingungen, bei denen insbesondere auch die Doppelstränge erhalten bleiben und als solche quantitativ bestimmt werden können, wird zunächst eine wässrige Lösung hergestellt, die aus der Oligonukleotidprobe sowie einem zugesetzten Standard besteht. Der Standard, der z.B. ein weiteres Oligonukleotid umfasst, darf nicht unter den experimentellen Bedingungen, insbesondere nicht unter "nativen" und "denaturierenden" Bedingungen, mit der Probe wechselwirken. Der zugesetzte Standard fungiert hierbei als interner Standard.
Eine weitere Messung erfolgt anschließend unter "denaturierenden" Bedingungen. Hierfür wird der wässrigen Lösung der Probe, die aus der Nukleinsäure besteht, neben dem zugesetzten Standard ein denaturierendes Agens, z.B. Ameisensäure hinzugesetzt. Das denaturierende Agens wird so gewichtet und in solchen Mengen zugesetzt (vorzugsweise 10 - 30 Gew.-%, insbesondere 15 - 25 Gew.-%, z.B. 20 Gew.-% der Probe), dass der Doppelstrang vollständig in Einzelstränge zerfällt. Die zuvor unter "nativen" Bedingungen durchgeführte Messung wird somit unter identischen Bedingungen unter lediglicher Zugabe von denaturierendem Agens wiederholt. Da die Konzentration des Standards in beiden Messungen identisch ist, wird ein Vergleich der einen Messung unter "nativen" Bedingungen und der anderen Messung unter "denaturierenden" Bedingungen unter Berücksichtigung des Verhältnisses der Intensitäten der Signale für den Standard ermöglicht. Hierfür wird ein Korrekturfaktor y eingeführt, der dem Verhältnis der Intensitäten des Standards beider Messungen wiedergibt.
_ Istandard 1 ,,. >
I
'Standard 2
Aus der Messung unter "nativen" Bedingungen ist die Intensität des Einzelstrangs, der nicht im Doppelstrang gebunden ist, bekannt (IssNativ)- Aus der Messung unter "denaturierenden" Bedingungen ist die Intensität und damit die Menge des insgesamt in der Probe enthaltenen Einzelstranges bekannt (IssDenaύ- Unter Berücksichtigung des Verhältnisfaktors y zwischen den beiden unterschiedlichen Messungen kann hieraus der Anteil des Einzelstrangs bestimmt werden, zu dem er unter "nativen" Bedingungen vorliegt (IssNativ (%))• Da dieser Anteil sich mit dem Anteil an Einzelstrang, der im Doppelstrang gebunden vorliegt, zu 100% ergänzt, kann hieraus der Anteil an Einzelstrang bestimmt werden, der im Doppelstrang gebunden vorliegt (IDS (%)).
lssNat (%) = y 100 (2)
lDS (%) = 100 - lssNa. (%) (3)
Zur Quantifizierung können neben den Peakflächen auch die Peakhöhen verwendet werden, vorausgesetzt Standard und Einzelstränge liegen in einem ähnlichen Massenbereich, sodass die Auflösung (Peakbreite) für beide gleich ist.
Als Standardsubstanz eignen sich alle einzelsträngigen Oligonukleotide, die unter den experimentellen Bedingungen keine Wechselwirkung mit den Analytensubstanzen zeigen und sich nicht unter Einfluss des denaturierenden Agens verändern. Durch den Einsatz von Oligonukleotiden kann auch leicht der Massenbereich des Standards auf die Einzelstränge abgestimmt werden, was wie oben ausgeführt zu einer vergleichbaren Auflösung führt. Vorteilhaft ist eine Differenz von 1 - 2 Nukleotidbausteinen zwischen der Länge der Oligonukleotide und der Länge der zu untersuchenden Einzelstränge. Eine derartige Analyse der erhaltenen Spektren setzt eine Linearität der massenspektrometrischen Messung über zwei Größenordnungen an Konzentration voraus, d.h. die Konzentrationen der Einzelstränge liegen zwischen 1 bis 100 Prozent des Messbereichs des Massenspektrometers. Des Weiteren muss beachtet werden, dass bei der Messung unter "denaturierenden" Bedingungen im Vergleich zur Messung bei "nativen" Bedingungen das Verhältnis der lonenintensität von Standard und Analyt nicht beeinflusst werden darf, um eine Verfälschung der Ergebnisse der beiden Messungen zu vermeiden.
Neben der oben angegebenen Bestimmung des Anteils, in dem ein Einzelstrang im Doppelstrang gebunden ist, kann aus den beiden Messungen bei "nativen" und "denaturierenden" Bedingungen ein eventuell vorhandener Überschuss des einen der beiden Einzelstränge (Strang 1 oder 2) bestimmt werden, die den Doppelstrang bilden. Der direkte Unterschied der Signalintensitäten der beiden Stränge innerhalb eines Spektrums kann hierfür nicht direkt herangezogen werden, da aufgrund unterschiedlicher lonisierungs- und Nachweiswahrscheinlichkeiten der beiden Moleküle der Überschuss nicht direkt, z.B. durch Subtraktion der Intensitäten, erhalten werden kann. Die unterschiedliche lonisierungs- und Nachweiswahrscheinlichkeit eines Moleküls wird mittels eines unbekannten Response- faktors z berücksichtigt. Da der Responsefaktor z eines Strangs bezüglich des anderen zwischen zwei Messungen, z.B. unter "nativen" und "denaturierenden" Bedingungen, gleich bleibt, kann dieser unbekannte Faktor z über das Verhältnis der Intensitäten zwischen den Messungen eliminiert werden. Auf dieses Weise kann der Überschuss eines Einzelstrangs gegenüber dem anderen quantitativ bestimmt werden.
'2D + IY I2N + IY
• IN - ~~ l MiD wobei lγ den Überschuss eines Einzelstrangs, z den unbekannten Response-Faktor, I10 und I2D die normierten Intensitäten der Einzelstränge 1 und 2 unter "denaturierenden" und liN und I2N die Intensitäten der Einzelstränge 1 und 2 unter "nativen" Bedingungen darstellt.
Im Falle eines Überschusses an Einzelstrang 1 ist lγ positiv, im Falle eines Überschusses von Einzelstrang 2 ist lγ negativ, liegt kein Überschuss eines Einzelstrangs vor ist lγ = 0.
Für Überschuss an Einzelstrang 1 kann anschließend gemäß Gleichung (4a) der relative Überschuss an Einzelstrang 1 (lYi (%)) bzw. für Überschuss an Einzelstrang 2 der relative Überschuss an Einzelstrang 2 (IY2 (%)) gemäß Gleichung (4b) berechnet werden.
IY1 (%) = • 100 (4b) |
Das vorgestellte erfindungsgemäße Verfahren der Doppelstrangquantifizierung hat insbesondere den Vorteil, dass die Peakverhältnisse in einer einzigen Lösung bestimmt werden. Durch das Ins-Verhältnis-setzen der Intensitäten der Peaks zweier Messungen werden Schwankungen der Messparameter eliminiert und somit eine hohe Genauigkeit der zu bestimmenden Werte gewährleistet.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat weiterhin die Vorteile, dass die Messung aufgrund der Verwendung eines MALDI-Massenspektrometers sehr schnell ist, da die Methode automatisierbar und der Probendurchsatz sehr hoch ist. So werden typischerweise zur Aufnahme der beiden Messungen bei "nativen" und "denaturierenden" Bedingungen lediglich wenige Minuten benötigt. Die Auswertung der Spektren und die entsprechenden Berechnungen der Intensitäten sowie des Überschussverhältnisses kann leicht computerunterstützt vollzogen werden. Der Einsatz von Eichsubstanzen ist, bis auf einen internen Standard, der jedes Mal der gleiche sein kann, nicht notwendig. Somit kann, aufgrund der vorstehenden Vorteile, der Fehler bei der Bestimmung des Doppelstranganteils auf unter 2 Prozent gedrückt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit jedem MALDI-Massenspektrometer durchführbar, solange es sich um ein lineares MALDI-Massenspektrometer handelt. Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren MALDI-Probenmatrizes sind neutrale Matrizes, die nicht zu einer Denaturierung der Doppelstränge führen. Als besonders vorteilhaft haben sich gesättigte Lösungen von 6-Aza-2-thiothymin (ATT, erhältlich von Fluka, Deutschland) (ca. 6 - 7 mg/ml) in 100 - 200 mM, besonders vorteilhaft 120 - 150 mM, wässriger Diammoniumhydrogencitrat-Lösung (DAHC, erhältlich von Fluka, Deutschland), herausgestellt. Mit von 0 mM ansteigender Konzentration des DAHC nimmt die Konzentration des detektierbaren Doppelstrangs zu, und nähert sich bei 150 - 200 mM einer Sättigung (vgl. Bsp. 2). Ab 200 mM DAHC kann es zu Ausfällung gelöster Stoffe kommen. Typischerweise werden 2 μL dieser Matrixlösung mit 0,5 μl_ einer Oligonukleotid- Lösung von ca. 20 μM direkt auf dem Probenteller gemischt und im kalten Luftstrom getrocknet. Erfindungsgemäß besonders wichtig ist der Verzicht auf organische Lösungsmittel, wie z.B. Acetonitril, bei der MALDI-Probenbereitung, welche sonst im Stand der Technik zur Verbesserung der Löslichkeit der Proben eingesetzt werden. Die effektive Probenkonzentration von ca. 20 μM liegt im Bereich der üblicherweise verwendeten, wobei eine Verringerung der Probenkonzentration eine abnehmende Stabilität des Doppelstrangs bewirken würde. Zur Erreichung eines ausreichenden Signal-Rausch-Verhältnisses werden typischerweise 50 - 100 Einzelspektren akkumuliert.
Besonders vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Länge der Nukleinsäuren von 10 bis 60 bp, insbesondere von 18 - 23 bp, z.B. von siRNA. Eine untere Grenze für eine ausreichende Stabilität des Doppelstrangs dürfte bei ca. 10 bp liegen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Säure zur Denaturierung von Nukleinsäuren in der Probenbereitung für die Massenspektrometrie.
Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung eines Gemisches von 6-Aza-2-thiothymin (ATT) und Diammoniumhydrogencitrat (DAHC) in einer Probenmatrix für die MALDI- Massenspektrometrie.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zum Nachweis von anderen, nicht kovalenten Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäureeinzelsträngen, die komplementäre Basenfolgen aufweisen. So kann über das Verhältnis zwischen als Einzelstrang und als Doppelstrang vorliegenden Spezies auf die Bindungsenergie zur Bildung des Doppelstrangs aus den jeweiligen Strängen rückgeschlossen werden. Entsprechende Verfahren zur Bestimmung der Bindungsenergien aus den Bindungsverhältnissen sind im Stand der Technik bekannt.
Des Weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Proteinwechselwirkungen verwendet werden, da entsprechend obiger Ausführungen auf identische Weise das Verhältnis zwischen dissoziierten Proteinen und Proteinkomplexen bestimmt werden kann. Aus dem mittels erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Verhältnis kann auf entsprechende Wechselwirkungsenergien rückgeschlossen werden.
Des Weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Qualitätskontrolle synthetisch hergestellter, doppelsträngiger Oligonukleotide, wie sie z.B. in Genexpressionsstudien vorkommen, verwendet werden (siRNA bzw. RNAi).
Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft zur Herstellung von Mischungen mit definiertem Verhältnis zwischen Doppelstrang und Einzelstrang verwendet werden. Dies ist z.B. über Mischungstitration mit anschließender erfindungsgemäßer MALDI- Massenspektrometrie möglich. Da für jedes Titrationsstadium schnell und einfach der Einzelstrangüberschuss bestimmt werden kann, wird somit ein einfaches Verfahren zur Verfügung gestellt, um Verbindungen zu erhalten, die einen definierten Anteil von Doppelstrang, vorzugsweise hauptsächlich aus Doppelstrang, z.B. > 98%, bestehen. Derartige Verbindungen sind gerade für pharmazeutische Applikationen von großer Bedeutung.
Figur 1 zeigt eine Grafik mit zwei versetzt dargestellten Massenspektren einer Probe bei nativen und denaturierenden Bedingungen.
Figur 2 zeigt ein Diagramm, in dem die Doppelstrang/Einzelstrang-Intensität einer nukleinsäurehaltigen Probe gegen die DAHC-Konzentration der Probenlösung aufgetragen ist.
Die Erfindung wird anhand folgender Beispiele weiter veranschaulicht: Beispiel 1
Quantifizierung des Doppelstranganteils
Figur 1 zeigt zwei versetzt dargestellte MALDI-MS-Spektren, wobei Spur 1 unter "nativen" Bedingungen und Spur 2 unter "denaturierenden" Bedingungen aufgenommen wurde. Es ist nur der Massenbereich des Standards und der Einzelstränge gezeigt, da die Peaks des Doppelstrangs für die Auswertung nicht benötigt werden. Als Standard wurde ein Oligonukleotidstrang eingesetzt, der mit den zu untersuchenden komplementären Einzelsträngen 1 und 2 (SS1 und SS2) nicht interagiert. Da der Standard in den Proben der beiden Messungen identisch ist, können über den Korrekturfaktor y, der gemäß obiger Formel (1) bestimmt wird, die Intensitäten der beiden Spektren normalisiert werden, so dass anschließend die Intensität des Standards in beiden Spektren gleich ist und die jeweiligen Einzelstrangintensitäten somit direkt vergleichbar werden. Für das in Figur 1 gezeigte Spektrum wurde nach der Normalisierung auf den Standard für Einzelstrang 1 (SSi) eine Intensität von 756 counts unter nativen und 13227 counts unter denaturierten Bedingungen gemessen. Es ergibt sich nach obiger Formel (3) ein Doppelstranganteil bezogen auf den Einzelstrang 1 von 100 - 756/13227 x 100 = 94,3%.
Des Weiteren kann ein eventueller Überschuss eines Einzelstrangs bestimmt werden. Neben den bekannten Werten für Einzelstrang 1 (SS1) werden noch die Werte des Einzelstrangs 2 (SS2) der Peaks bei "nativen" Bedingungen (1347 counts) und bei "denaturierenden" Bedingungen (16749 counts) benötigt. In die oben angegebene Formel (4b) eingesetzt ergibt sich somit ein relativer Überschuss für Einzelstrang 2 von 2,5 %. Das heißt, Einzelstrang 1 liegt insgesamt 5,7% in Form des Einzelstrangs und Einzelstrang 2 8,2% in Form des Einzelstrangs vor, wobei Einzelstrang 2 einen relativen Überschuss von 2,5 % aufweist.
Bei den Untersuchungen wurde als Probenmatrix eine gesättigte Lösung von 6-Aza-2- thiothymin (ATT) in 100 - 200 mM wässriger Diammoniumhydrogencitrat-Lösung (DAHC) verwendet. 2 μL dieser Matrixlösung wurden mit 0,5 μl_ Oligonukleotidlösung (ca. 20 μM) direkt auf dem Probenteller gemischt und in einem kalten Luftstrom getrocknet. Probensequenz (RNA): 51 G*GC*GA*UA*UU*CU*GC*UA*CA*GU* x ACUGUAGCAGAAUAUCGCC 31
(* = 21 Omethyl)
Als Standard wurde ein RNA-Oligonukleotid mit der Länge von 17 Basenpaaren eingesetzt, der unter den experimentellen Bedingungen nicht mit der Probe interagierte. Die massenspektrometrische Analyse wurde mit einem MALDI-Flugzeitmassenspektrometer (Voyager De-Pro, Applied Biosystems, Framingham, USA) im Linearbetrieb durchgeführt. Es können Spektren der positiven Ionen als auch der negativen Ionen zur Analyse verwendet werden, da beide vergleichbare Intensitäten und Auflösungen zeigen. Als Betriebsparameter wurden eine Beschleunigungsspannung von 20 kV, eine Grid-Spannung von 95% der Beschleunigungsspannung und eine Delay-Zeit von 600 ns gewählt. Um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, wurden für jedes Spektrum 50 - 100 Einzelspektren akkumuliert. Zur Berechnung der Peakflächen bzw. -höhen wurden die Spektren 19 pt geglättet und die Basislinie korrigiert.
Beispiel 2
Einzelstrang/Doppelstrangverhältnis bei verschiedenen DAHC-Konzentrationen
In Figur 2 wurde das Verhältnis von Einzelstrang zu Doppelstrang für verschiedene Konzentrationen von DAHC untersucht. Die angegebenen Werte für die Doppelstrangintensität sind willkürliche Einheiten und entsprechen nicht den wirklichen Verhältnissen.
Es wurde gefunden, dass die Konzentration an Doppelstrang mit zunehmender DAHC- Konzentration zunimmt, sie nähert sich bei 150 - 200 mM einer Sättigung.
Die Proben wurden gemäß Beispiel 1 bereitet und vermessen. Die Verhältnisse von Doppelstrang zu Einzelstrang wurden gemäß dem oben angegebenen Verfahren der gemäß Beispiel 1 gemessenen Spektren berechnet.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung wenigstens eines Eigenschaftsparameters einer Probe, die wenigstens eine Nukleinsäure enthält, wobei der Eigenschaftsparameter ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Doppelstranganteil der Probe, Verhältnis von Einzelsträngen zu Doppelsträngen in der Probe, Überschuss an einem Einzelstrang bezüglich eines zweiten Einzelstrangs in der Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Zugabe eines Standards zu der Probe;
(b) Erstellen eines Massenspektrums der den Standard enthaltenden Probe unter nativen Bedingungen;
(c) Erstellen eines Massenspektrums der den Standard enthaltenden Probe unter denaturierenden Bedingungen;
(d) Vergleichen der Peakhöhe oder Peakfläche von wenigstens einem der Nukleinsäure zuzuordnenden Peak in dem Massenspektrum aus Schritt (b) mit der Peakhöhe bzw. Peakfläche des korrespondierenden Peaks in dem Massenspektrum aus Schritt (c).
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis der dem Standard entsprechenden Peaksignale in den Massenspektren aus den Schritten (b) bzw. (c) zueinander berücksichtigt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Eigenschaftsparameter der Doppelstranganteil der Probe ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Eigenschaftsparameter das Verhältnis von Einzelsträngen zu Doppelsträngen in der Probe ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Eigenschaftsparameter der Überschuss an einem Einzelstrang bezüglich eines zweiten Einzelstrangs in der Probe ist.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die denaturierenden Bedingungen durch Zugabe eines denaturierenden Agens, vorzugsweise durch Zugabe einer Säure hergestellt werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure DNA ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure RNA ist.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Massenspektrometer auf MALDI basiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die MALDI-Probenmatrix eine Doppelstrang-stabilisierende Zusammensetzung umfasst.
11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die MALDI- Probenmatrix 6-Aza-2-thiothymin (ATT) und Diammoniumhydrogencitrat (DAHC) umfasst.
12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Standard eine einzelsträngige Nukleinsäure ist.
13. Verwendung von Säure zur Denaturierung von Nukleinsäuren in der Probenbereitung für die Massenspektrometrie, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure Ameisensäure ist, die in einer Menge zugesetzt wird, dass sie in einer Konzentration von 10 - 30 Gew.-% in der Probe vorliegt.
14. Verwendung eines Gemisches von 6-Aza-2-thiothymin (ATT) und Diammoniumhydrogencitrat (DAHC) in einer Probenmatrix für die MALDI- Massenspektrometrie, wobei DAHC in einer Konzentration von 50 - 250 mM eingesetzt wird.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass DAHC in einer Konzentration von 100 - 200 mM eingesetzt wird.
16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Probenmatrix eine gegebenenfalls gesättigte Lösung von ATT in wässriger DAHC-Lösung bereitgestellt wird.
17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe mit der Probenmatrix gemischt wird und das Gemisch vor Durchführung der Massenspektrometrie in einem Luftstrom getrocknet wird.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass bei der MALDI-Probenbereitung keine organischen Lösungsmittel eingesetzt werden.
EP07856466A 2006-12-08 2007-12-07 Massenspektrometrisches verfahren an proben enthaltend nukleinsäuren Withdrawn EP2097537A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07856466A EP2097537A1 (de) 2006-12-08 2007-12-07 Massenspektrometrisches verfahren an proben enthaltend nukleinsäuren

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06025448A EP1930444A1 (de) 2006-12-08 2006-12-08 Massenspektrometrisches Verfahren an Proben enthaltend Nukleinsäuren
PCT/EP2007/010663 WO2008068034A1 (de) 2006-12-08 2007-12-07 Massenspektrometrisches verfahren an proben enthaltend nukleinsäuren
EP07856466A EP2097537A1 (de) 2006-12-08 2007-12-07 Massenspektrometrisches verfahren an proben enthaltend nukleinsäuren

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2097537A1 true EP2097537A1 (de) 2009-09-09

Family

ID=38024305

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP06025448A Withdrawn EP1930444A1 (de) 2006-12-08 2006-12-08 Massenspektrometrisches Verfahren an Proben enthaltend Nukleinsäuren
EP07856466A Withdrawn EP2097537A1 (de) 2006-12-08 2007-12-07 Massenspektrometrisches verfahren an proben enthaltend nukleinsäuren

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP06025448A Withdrawn EP1930444A1 (de) 2006-12-08 2006-12-08 Massenspektrometrisches Verfahren an Proben enthaltend Nukleinsäuren

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20100167410A1 (de)
EP (2) EP1930444A1 (de)
WO (1) WO2008068034A1 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5072682B2 (ja) * 2008-03-28 2012-11-14 富士フイルム株式会社 質量分析用デバイス、これを用いる質量分析装置および質量分析方法
AU2014223472B2 (en) 2013-02-28 2018-03-08 Nuvera Fuel Cells, LLC Electrochemical cell having a cascade seal configuration and hydrogen reclamation
CN119757444B (zh) * 2024-12-19 2025-09-23 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种基于核磁共振磷谱鉴别游离核酸与被载体包裹的核酸的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6723564B2 (en) * 1998-05-07 2004-04-20 Sequenom, Inc. IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices
EP2186879B1 (de) * 2002-10-03 2016-11-23 Norman Leigh Anderson Hochempfindliche Quantifizierung von Peptiden mittels Massenspektrometrie
WO2006015797A2 (en) * 2004-08-09 2006-02-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for high-throughput screening of test molecules binding to target molecules

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE MEDLINE [online] US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US; December 2004 (2004-12-01), SAKAI H ET AL: "Simultaneous detection of Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci in positive blood cultures by real-time PCR with two fluorescence resonance energy transfer probe sets.", Database accession no. NLM15583307 *
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY DEC 2004 LNKD- PUBMED:15583307, vol. 42, no. 12, December 2004 (2004-12-01), pages 5739 - 5744, ISSN: 0095-1137 *
KURIHARA K ET AL: "The hyperchromic effect of organic denaturing reagents on deoxyribonucleic acid", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, ELSEVIER, NL LNKD- DOI:10.1016/0006-3002(63)90165-3, vol. 68, 1 January 1963 (1963-01-01), pages 434 - 445, XP023380476, ISSN: 0006-3002, [retrieved on 19630101] *
See also references of WO2008068034A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008068034A1 (de) 2008-06-12
US20100167410A1 (en) 2010-07-01
EP1930444A1 (de) 2008-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0925373B1 (de) Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren unter ermittlung der masse
DE69330834T2 (de) Quantitative detektierung von makromolekülen mit hilfe von fluoreszierenden oligonukleotiden
DE19802905C2 (de) Verfahren zur bevorzugten Herstellung nur eines Stranges selektierten Genmaterials für massenspektrometrische Messungen
DE69607749T2 (de) Analoge des calcitonin aus lachs, ihre herstellung und ihre verwendung als medizin und als analytische reagentien
DE202013012535U1 (de) Blutsammelvorrichtung für verbesserte Nukleinsäureregulierung
EP2806275B1 (de) Massenspektrometrische Resistenzbestimmung durch Wachstums-Messung
DE102009033368A1 (de) Massenspektrometrische Sepsisdiagnose
DE10392707T5 (de) Verfahren zur Verwendung von Datenbinning bei der Analyse von Chromatographie-/Spektrometriedaten
DE602004009824T2 (de) Analyse von massenspektraldaten in den ruhigen gebieten
EP2801825B1 (de) Massenspektrometrische Bestimmung der Resistenzen von Mikroben
EP1846757A2 (de) Verfahren und system zur massenspektrenanalyse
EP2097537A1 (de) Massenspektrometrisches verfahren an proben enthaltend nukleinsäuren
DE112018007805B4 (de) Biopolymer-Analyseverfahren und Biopolymer-Analysevorrichtung
US20110137022A1 (en) Method for the analysis of oligonucleotides
DE102004010969B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Isotopenverhältnisanalyse und Verwendung des Verfahrens
DE10292304B4 (de) Separation von Komponenten einer Analysenprobe in einem Ionenmobilitätsspektrometer durch Zuführung selektiv wechselwirkender gasförmiger Partikel
EP2224018B1 (de) Hybridisierungs- und Detektionspuffer
DE69528533T2 (de) Verfahren und vorrichtung zur messung von analyten mittels ionenmobilitätsspektrometrie
EP2433651B1 (de) Bestimmungsmethode für Aldehyde und Ketone in Glycerin
Cui et al. Dispersive liquid-liquid microextraction with high-performance liquid chromatography for the analysis of 1, 4-benzodioxane-6-aldehyde in eliglustat tartrate active pharmaceutical ingredient
DE102012024203A1 (de) Verfahren zur Ermittlung der Sequenz von Biopolymeren
DE102005059227A1 (de) Verfahren zur Bestimmung des Genotyps aus einer biologischen Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen
CN117368300B (zh) 核酸质谱基质的试剂组合及其制备方法和应用
DE102006003415A1 (de) Verfahren zur Analyse einer Probe
DE10001881C2 (de) Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Nukleinsäuren mittels competitiver PCR

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20090528

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL PL PT RO SE SI SK TR

17Q First examination report despatched

Effective date: 20091124

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20130525