EP2162527A1 - Verfahren zur fermentation von zellkulturen - Google Patents

Verfahren zur fermentation von zellkulturen

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Publication number
EP2162527A1
EP2162527A1 EP08760919A EP08760919A EP2162527A1 EP 2162527 A1 EP2162527 A1 EP 2162527A1 EP 08760919 A EP08760919 A EP 08760919A EP 08760919 A EP08760919 A EP 08760919A EP 2162527 A1 EP2162527 A1 EP 2162527A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
metabolic
determined
cell
target
fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08760919A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Werner Zang
Michelangelo Canzoneri
Rolf KRÜGER
Manfred Biselli
Rainer Fischer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitec Zang GmbH
Original Assignee
Hitec Zang GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitec Zang GmbH filed Critical Hitec Zang GmbH
Publication of EP2162527A1 publication Critical patent/EP2162527A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the invention relates to a method and / or a device for an RQ-regulated feed process in cell cultures.
  • Biopharmaceutical drugs are rapidly gaining in importance.
  • Biopharmaceuticals are understood to be (recombinant) therapeutic proteins obtained by genetic engineering methods, monoclonal antibodies or nucleic acid-based drugs.
  • the volume of biopharmaceuticals produced by cell cultures has more than doubled.
  • the development has reached such a dynamic that the cell culture fermentation capacities worldwide become the limiting factor.
  • the optimization of these large-scale production processes is therefore becoming increasingly important.
  • the challenge will be to cost-effectively produce the corresponding products in competition.
  • fed-batch fermentation is currently the most widely used process control strategy.
  • other process parameters such as: As the pH, kept constant. The acidified by metabolic end product is thus neutralized and allows the culture to grow unhindered. The culture time can be extended by the fed-batch method to up to two weeks and increase the product titre in some cases up to 10-fold.
  • the maintenance of constant culture parameters is of particular importance for cell cultures. Not optimal culture parameters not only lower the productivity of the cells.
  • the aerobic degradation of nutrients leads to a decrease in the concentration of the substrate to be metabolized and to a depletion of oxygen (respiratory chain).
  • the latter can be determined by accounting for the exhaust air as the Oxygen Transfer Rate (OTR) and is a measure of the current oxygen consumption of the cell.
  • OTR Oxygen Transfer Rate
  • the direct relationship between substrate and oxygen consumption rates has been demonstrated by several groups of work (T. Anderlei, Online Respiration Activity Measurement (OTR, CTR, RQ) in shake flasks, Biochemical Engineering, 2004, 17, 187-194, Q. Feng, On -Im monitoring of oxygen uptake rate and its application in hybridoma culture, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao., 2003, 19 (5), 593-607; M. Canzoneri, Respiratory activity of mammalian cells, BioForum, 2006, 2).
  • the feed process or the fed-batch strategy is used as standard in various production processes (recombinant proteins, baker's yeast, antibiotics, etc.) in industry.
  • the limiting substrates are supplied after the deceleration phase.
  • the substrate is supplied to the extent that it is metabolized (quasi steady state), d. H. with the adjusted substrate concentration, a certain growth rate can be set (monodic kinetics).
  • Essential for the fed-batch technique are the instructions for the specific culture / production processes. They are based on intensive research into the course of culture and the derivation of corresponding, specific procedures / instructions.
  • a major disadvantage of conventional process control is the offline determination of the substrate consumption rates, substrate concentrations and the current cell density. As a rule, samples must be taken at regular intervals in the running process and then analyzed with external devices or with rapid tests. Based on these results, the feed rate is recalculated and then the feed rate is adjusted. The lack of online measurement of substrate concentrations makes control of the process expensive and difficult. Variations in product yield and quality are possible consequences of this type of process control.
  • the time interval between the offline analysis of the samples and the adjustment of the new process values can lead to incorrect settings of the inflow rate and thus to an unwanted nutrient limitation.
  • the aerobic metabolism of the substrates consumes oxygen and produces carbon dioxide.
  • the ratio of the amount of CO 2 released in a certain period of time to the amount of O 2 taken up in the same time unit is defined as the respiratory quotient (RQ).
  • RQ respiratory quotient
  • the measured CTR is a sum signal of cell-specific and buffer-induced carbon dioxide formation. The latter results from the effect of the buffer in acidification of the cells. In this case, the acidification causes additional CO2 to be generated chemically.
  • the determined RQ values lead to inflated values because only a part of the CO2 was produced by the metabolism of the cells and do not represent the metabolic RQ of the cells. Since the term RQ is misleading here, the term TQ (Transfer Quotient) was introduced. This represents the ratio of the total CO 2 formation to the total O 2 consumption.
  • the measured TQ does not say anything about the metabolic RQ and thus does not give any indication of the metabolic activity of the cell.
  • CER cell-specific carbon dioxide formation rate
  • Object of the present invention is to provide a method and a corresponding device for RQ-regulated supply of culture medium and / or nutrients available, which overcomes the described problems of the prior art. It is to be achieved according to the invention by determining the metabolic RQ value that the supply of culture medium and / or nutrients to a sensitive on-line control is made accessible by means of online control. At the same time an effective increase in productivity in cell culture processes should be achieved. This was not possible with the previous methods of fermentation technology. Because the methods known from culturing with microorganisms can not be transferred to the much more sensitive cell cultures. This is especially true when using animal cell cultures.
  • This object is achieved by a method for the fermentation of cell cultures in which
  • the metabolic RQ is determined online, - the metabolic RQ serves as an actual value for a regulation, - the target RQ for the desired productivity or product characteristic is determined as a setpoint for a control, and
  • the supply of culture medium and / or nutrients is regulated so that sets an optimal cell or product yield and / or a desired product quality or product property.
  • the process according to the invention can be carried out for the production of proteins, for example pharmaceutical proteins.
  • the process can be carried out with animal or plant cells. Both continuous cell lines and genetically engineered cells can be used in the method.
  • the target RQ can be determined in a preliminary test (eg batch operation, continuous operation or chemostat operation, continuous operation corresponds to continuous process control) or in the ongoing process. Furthermore, the target RQ can be calculated from the stoichiometry of the metabolic pathway. Online, the metabolic RQ is determined by the appropriate combination of gas analysis values and in situ measurements such as pH and temperature. The gas analysis is carried out by means of partial pressure measurement, mass and volume flow determination or any combination of two or more of said parameters.
  • the measurement of the metabolic RQ value is based on the measurement and calculation methods described in the prior art.
  • a use of the RQ value to control a fermentation of cell cultures has not yet been shown.
  • the present invention shows for the first time that it is possible in a method for fermentation of cell cultures from the measured RQ course reproducibly to close various metabolic states and that set during the fermentation various discrete RQ conditions based on the cell-specific productivity.
  • the optimal RQ value can be determined by recording a complete RQ progression of continuous cell lines and identifying and biochemically interpreting the individual RQ phases.
  • the target RQ in the course of an upstream fermentation, calculated from the stoichiometry of the metabolic pathway, but also in the ongoing process can be determined.
  • the online control and regulation of the desired RQ value thus enables an exact supply of the required culture medium and / or nutrients to achieve either a high cell yield, a high product yield, a certain product quality or product property.
  • Saccharomyces cerevisiae can produce alcohol under anaerobic conditions.
  • Crabtree effect refers to and describes aerobic alcohol formation above a critical glucose concentration of 100 mg / l, whereas below 100 mg / l, biomass production preferably proceeds.
  • the measured RQ is well over one in ethanol production. In contrast, complete oxidation of the sugar to CO2 and water has an RQ of one.
  • the process control according to the invention is completely independent of substrate offline measurements and is preferably based on the measurement of the gas exchange. Due to the exact adherence to a specific substrate concentration, the yield of biomass or ethanol can be increased many times over.
  • the respiration quotient is preferably measured by determining the appropriate combination of the gas analysis values and the measurements made in situ.
  • the gas analysis can be carried out by means of all methods available to the person skilled in the art.
  • the prerequisite is that the methods are suitable for online determination.
  • Examples of gas analysis are partial pressure measurements as well as the determination of the mass and volume flow.
  • the in situ measurement can also be measured by the usual methods known to those skilled in the art.
  • the carbon dioxide content preferably the carbon dioxide content
  • Oxygen content, the pH and the temperature determined. O 2 and CO 2 content can, for. B. be determined by means of partial pressure measurement. Possibly. can also more
  • Oxygen content and the pH, for example, conventional electrodes are considered.
  • the determination of the desired value can, according to the invention, preferably be carried out before the start of production. However, the setpoint determination can also take place at any other time points and, depending on the requirements of the operation, also be repeated as often as desired. It can be done in a separate fermenter or in the production fermenter. Preferably, the measurement is in batch mode in a separate vessel.
  • the method according to the invention can be used for plant or animal cells.
  • continuous cell lines or genetically modified cells can also be used.
  • the process according to the invention is particularly preferred for the use of animal cell cultures.
  • a particularly preferred range is the production of proteins, in particular of pharmaceutically applicable proteins.
  • the process according to the invention can be carried out in the fermenters which are known from the prior art and are suitable for preferably submersed processes. Accordingly, for example bubble columns, injector operated systems, loop reactors and stirred reactors in the form of single and multi-stage systems come into consideration. Particularly preferred are stirred reactors.
  • the reactors are regularly equipped with the state-of-the-art measuring, control and regulating systems. These include devices for online and offline measurement. Examples include pH, pÜ2-pCÜ2 measuring devices, in particular the use of appropriate sensors. Likewise, z. As the use of measurements of the supply and removal of substrate and the supply and exhaust according to the invention advantageous.
  • a device which is suitable for carrying out the method described enables the online determination of the metabolic RQ with the aid of the supply and exhaust air, as well as the pH value and the temperature.
  • the control of media and nutrient supply is automatic based on the RQ.
  • dosing devices gaseous, liquid or solid media
  • a regulation of the oxygen or. NaOH / CO 2 supply to maintain a desired oxygen concentration or pH in the fermenter are performed.
  • the apparatus for carrying out the method may include a) a fermenter; b) a gas mixing system; c) supply air ducts for gas; d) exhaust ducts; e) measuring devices for determining the oxygen and CO 2 concentration and the mass flow in the supply air and in the exhaust air for determining the oxygen consumption rate OTR and the carbon dioxide formation rate CTR; f) device for measuring the pH and the temperature; g) Apparatus for determining CER and metabolic RQ from the temperature, pH, oxygen concentration and carbon dioxide concentration values; h) contain an RQ regulator for RQ-based control of the supply of culture medium and / or nutrients.
  • P1 corresponds to phase 1; P2 of phase 2; Phase 3 P3; Phase 4 P4; Phase 5 P5 and Phase 6 P6.
  • FIG. 1 Course of the RQ in a batch fermentation of the hybridoma cell line CF-10H5. Continuous line: glutamine; dashed line: glucose; continuous line in gray: RQ.
  • Fig. 2 Course of the cell-specific productivity. Dashed line: cell-specific productivity; continuous line in gray: RQ.
  • FIG. 4 Dependence of the RQ on the glutamine concentration in the chemostatic mode of operation. Continuous line: glutamine; continuous line in gray: RQ.
  • Fig. 5 Glutamine course in the RQ-regulated fed-batch (nominal value RQ 0.66). Continuous line: glutamine; continuous line in gray: RQ. The arrow marks the start of the RQ-controlled Fed-Batch process.
  • Fig. 6 Productivity course in the RQ-regulated Fed-Batch. Dashed line: cell-specific productivity; continuous line in gray: RQ.
  • FIG. 7 Process flow diagram of the RQ-controlled fed-batch process.
  • FIG. 1 fermenter; 2: stirrer; 3: supply air; 4: exhaust air; 5 and 22: pH and p ⁇ 2 electrodes; 7: device for the exhaust gas analysis; 8: device for determining the metabolic RQ; 9: nutrient container; 10: nutrient pump; 11: supply line.
  • FIG. 8 shows an apparatus for carrying out the RQ-controlled fed-batch process.
  • 1 fermenter; 2: stirrer; 3: supply air for gas; 4: exhaust ducts; 5: pH electrode; 6-7: Measuring devices for determining the oxygen and CO 2 concentration and the mass flow in the incoming air; 8: device for determining the metabolic RQ; 9: nutrient container; 10: nutrient pump; 11: supply line; 12: device for measuring the pH value; 13: device for measuring the temperature; 14-15: measuring devices for determining the oxygen and CO 2 concentration and the mass flow in the exhaust air; 16: Device for determining the oxygen consumption rate OTR; 17: device for determining the carbon dioxide formation rate CTR; 18: device for determining the CER; 19: predetermined target RQ; 20: RQ controller; 21: gas mixing system;
  • FIG. 1 shows the course of the RQ in a batch fermentation of the hybridoma cell line CF-10H5.
  • FIG. 1 shows the RQ curve and the decrease in the glucose and glutamine concentration during the batch cultivation of the hybridoma cell line CF-10H5 in the fermenter.
  • the glutamine concentration decreases continuously over the course of the culture until it is completely exhausted after about 60 hours.
  • Glucose concentration decreases throughout the culture but never limits culture until the end of fermentation.
  • various discrete RQ states (phases 1 to 6) occur during the fermentation.
  • FIG. 2 shows the course of the cell-specific productivity in the batch.
  • FIG. 4 shows the dependence of the RQ on the glutamine concentration in the chemostatic mode of operation.
  • This type of process control reflects the continuous operation of a fermentation without cell retention.
  • This system is characterized by the continuous feed of fresh culture medium and the effluent of spent culture medium including cells.
  • the flow equilibrium taking into account the flow rate (D ⁇ ma ⁇ ) allows the setting of defined growth rates, substrate, product and cell concentrations in the fermenter.
  • FIG. 5 shows the glutamine profile in the RQ-regulated fed-batch (nominal value RQ 0.66).
  • FIG. 6 shows the productivity profile in the RQ-regulated fed batch (nominal value RQ 0.66).
  • the RQ is regulated by the controlled addition of culture medium and / or nutrients (here: fed-batch medium, quadruple-concentrate of nutrients).
  • Factor four be increased. From an initial productivity of approximately 1 E-7 ⁇ g / N / h, productivity was increased to approximately 4E-7 ⁇ g / N / h.
  • FIG. 7 shows a process flow diagram with an example of the application of the RQ control according to the invention.
  • the production takes place in a fermenter 1 with a stirrer 2.
  • the fermenter is equipped with a supply air 3 and an exhaust air 4.
  • the electrodes 5 and 22 are provided for the measurement of the pH and the pÜ2.
  • the exhaust 4 a device for the exhaust gas analysis 7 is still arranged.
  • the RQ can be determined as a function of the OTR, CTR, pH and the temperature.
  • the regulation of the inflow of culture media and / or nutrients 9 then takes place.
  • the RQ regulator actuates the valve of the nutrient pump 10 for the supply line 11. 7.
  • FIG. 8 shows a process flow diagram of the device for carrying out the method.
  • the gas composition and the gas flow is determined.
  • the composite through the gas mixing system 21 supply air 3 is first passed through the device to determine the oxygen and carbon dioxide content 6-7 of the supply air.
  • OTR oxygen consumption rate
  • the measurement pH 5 and the temperature 13 in the fermenter in combination with the calculation of the CTR allows the determination of the CER 18 and thus of the metabolic RQ 8.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine entsprechende Vorrichtung zur Fermentation von Zellkulturen, bei welchem -der metabolische Respirationsquotient (RQ) als Ist-Wert für eine Regelung online bestimmt wird, -der für die Erzielung einer angestrebten Produktivität oder Produkteigenschaft geeigneter Ziel-RQ als Sollwert für eine Regelung durch Versuch oder Berechnung ermittelt wird und -auf Basis dieser Soll-und Ist-Werte durch Ansteuerung von einer oder mehreren Dosiervorrichtungen eine hohe Zellausbeute, eine optimale Produktausbeute und/oder Produktqualität bzw. eine gewünschte Produkteigenschaft, z. B. Reduzierung von Nebenprodukten erzielt wird.

Description

Verfahren zur Fermentation von Zellkulturen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und/oder eine Vorrichtung für ein RQ-geregeltes Zulaufverfahren in Zellkulturen.
Bei der Entwicklung neuer Medikamente nehmen biopharmazeutische Wirkstoffe rasant an Bedeutung zu. Unter Biopharmazeutika versteht man mit gentechnischen Methoden gewonnene (sog. rekombinante) therapeutische Proteine, monoklonale Antikörper oder nukleinsäurebasierte Medikamente. Innerhalb von nur drei Jahren hat sich die produzierte Menge an Biopharmazeutika mit Zellkulturen mehr als verdoppelt. Die Entwicklung hat mittlerweile eine solche Dynamik erreicht, dass die Zellkultur- Fermentationskapazitäten weltweit zum limitierenden Faktor werden. Die Optimierung dieser großtechnischen Produktionsprozesse wird daher zunehmend bedeutsam. Die Herausforderung wird insbesondere darin bestehen, die entsprechenden Produkte im Wettbewerb kosteneffizient herzustellen.
Bei großtechnischen Anlagen stellt die Fed-Batch Fermentation die zurzeit am weitesten verbreitete Strategie der Prozessführung dar. Neben der Nachfütterung essentieller Medienkomponenten (Fed-Batch) werden gleichzeitig andere Prozessparameter, wie z. B. der pH-Wert, konstant gehalten. Das durch Stoffwechselendprodukte angesäuerte Medium wird somit neutralisiert und ermöglicht der Kultur ein ungehindertes Wachstum. Die Kulturdauer lässt sich durch die Fed-Batch-Methode auf bis zu zwei Wochen verlängern und der Produkttiter teilweise bis auf das 10-fache erhöhen. Die Einhaltung konstanter Kulturparameter ist für Zellkulturen von besonderer Bedeutung. Bei nicht optimalen Kulturparametern wird nicht nur die Produktivität der Zellen gesenkt. Durch wechselnde Kulturparameter wird auch die chemische Struktur (von z. B. Seitenketten) des sekretierten Proteins (insbesondere die Glykosylierung) verändert und so eine unerwünschte Heterogenität des Wirkstoffs hervorgerufen, was einen erheblichen Einfluss auf die pharmakologische Wirkung hat. Die fortlaufende Ermittlung prozessrelevanter Parameter während einer Fermentation ist daher für eine kontrollierte Kultivierung von Zellkulturen unverzichtbar. Diese liefern Informationen, die für das Verständnis des Stoffwechsels sowie für die Optimierung des Prozesses von großem Interesse sind. Weiterhin wird auch immer mehr die Dokumentation der Reproduzierbarkeit des Prozessverlaufs gegenüber den Behörden, z. B. der FDA bedeutend. Durch den tieferen Einblick in die Zelle eröffnen sich vielseitige Möglichkeiten, die Konzentration und die Qualität des Biopharmazeutikums zu steigern. Der aerobe Abbau von Nährstoffen führt zu einer Konzentrationsabnahme des zu verstoffwechselnden Substrates und zu einer Abreicherung von Sauerstoff (Atmungskette). Letzteres kann durch Bilanzierung der Abluft als Oxygen Transfer Rate (OTR) erfasst werden und ist ein Maß für den momentanen Sauerstoffverbrauch der Zelle. Der direkte Zusammenhang zwischen Substrat- und Sauerstoffverbrauchsrate konnte durch verschiedene Arbeitsgruppen nachgewiesen werden (T. Anderlei, Online respiration activity measurement (OTR, CTR, RQ) in shake flasks, Biochemical Engineering, 2004, 17, 187-194; Q. Feng, On-Iine monitoring of oxygen uptake rate and its application in hybridoma culture, Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao., 2003, 19(5), 593- 607; M. Canzoneri, Atmungsaktivität von Säugerzellen, BioForum, 2006, 2).
Die vollständige Erschöpfung der Nährsubstanzen führt zum Absterben der Zellen. Daher ist die Zuführung von Kulturmedium und/oder Nährstoffen unabdingbar. Das Zulaufverfahren bzw. die Fed-Batch-Strategie wird bei verschiedenen Produktionsprozessen (rekombinante Proteine, Backhefe, Antibiotika etc.) in der Industrie standardmäßig angewendet. Ausgehend von einer Batch-Kultur werden nach der Verzögerungsphase die limitierenden Substrate zugeführt. Das Substrat wird dabei in dem Maße zugeführt, wie es metabolisiert wird (quasi steady State), d. h. mit der eingestellten Substratkonzentration kann eine bestimmte Wachstumsrate eingestellt werden (Monod-Kinetik).
Wesentlich bei der Fed-Batch-Technik sind die Handlungsanweisungen für die konkreten Kultur-/Produktionsverfahren. Sie basieren auf einer intensiven Erforschung des Kulturverlaufs und der Ableitung entsprechender, spezifischer Vorgehensweisen/Handlungsanweisungen. Einen großen Nachteil der konventionellen Prozessführung stellt die Offline-Ermittlung der Substratverbrauchsraten, Substratkonzentrationen und der aktuellen Zelldichte dar. In der Regel müssen in regelmäßigen Abständen Proben im laufenden Prozess genommen und anschließend mit externen Geräten bzw. mit Schnelltests analysiert werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wird die Zulaufrate neu berechnet und anschließend die Zulaufgeschwindigkeit angepasst. Die fehlende Möglichkeit einer Onlinemessung von Substratkonzentrationen macht eine Regelung des Prozesses aufwändig und schwierig. Schwankungen in der Produktausbeute und -qualität sind mögliche Folgen dieser Art der Prozesskontrolle. Der Zeitabstand, der zwischen der Offline-Analyse der Proben und der Einstellung der neuen Prozesswerte entsteht, kann zu falschen Einstellungen der Zulaufrate und damit zu einer ungewollten Nährstofflimitierung führen. Durch die aerobe Verstoffwechselung der Substrate wird Sauerstoff verbraucht und Kohlendioxid produziert. Das Verhältnis der in einer bestimmten Zeitspanne abgegebenen Cθ2-Menge zu der in der gleichen Zeiteinheit aufgenommenen O2-Menge ist definiert als der Respirationsquotient (RQ). Dieser Parameter spiegelt den Stoffwechselzustand der Zelle wieder und erlaubt einen detaillierten Rückschluss auf den aktuellen Stoffwechselprozess der Zelle. So kann z. B. festgestellt werden welche Substratgruppen (z. B. Kohlenhydrate oder Fette) aktuell überwiegend verwertet werden.
In Zellkulturen werden Bikarbonat gepufferte Medien verwendet. Dadurch wird die Bestimmung des RQ kompliziert. Die gemessene CTR ist ein Summensignal aus zellspezifischer und pufferbedingter Kohlendioxidbildung. Letzteres resultiert aus der Wirkung des Puffers bei Säurebildung der Zellen. Hierbei wird durch die Ansäuerung zusätzliches CO2 chemisch erzeugt. Die ermittelten RQ-Werte führen zu überhöhten Werten da nur ein Teil des CO2 dem Stoffwechsel der Zellen entstand und stellen nicht den metabolischen RQ der Zellen dar. Da hier die Bezeichnung RQ irreführend ist, wurde der Begriff TQ (Transfer Quotient) eingeführt. Dieser stellt das Verhältnis der gesamten Cθ2-Bildung zum gesamten 02-Verbrauch dar. Der gemessene TQ sagt nichts über den metabolischen RQ aus und lässt damit keinen Rückschluss auf die Stoffwechselaktivität der Zelle zu.
Verschiedene Forschergruppen konnten jedoch durch Flüssig-Gas-Bilanzierungen des CO2 unter Einbeziehung des pH-Wertes die tatsächliche zellspezifische Kohlendioxidbildungsrate (CER, Carbondioxide Evolution Rate) bestimmen. (Hendrik P. Bonarius, Determination of the Respiration Quotient in Mammalian Cell Culture in Bicarbonate Buffered Media, Biotechnology and Bioengineering, 1995, 45, 524-534; Björn Frahm, Determination of dissolved CO2 concentration and CO2 production rate of mammalian cell Suspension culture based on off-gas measurement, Journal of Biotechnology, 2002, 99, 133-148).
Damit war zwar die Grundvoraussetzung für die korrekte Bestimmung des metabolischen RQ gegeben, aber aufgrund der aufwändigen apparativen und rechnerischen Randbedingungen hat die online Messung keine weitere Verbreitung in der industriellen Zellkulturfermentation gefunden. Die Steigerung der Produktivität kontinuierlicher Zelllinien ist auf Grund ihres komplexen Stoffwechsels und des Zusammenspiels der Einflüsse verschiedener Substrate auf das Wachstum eine große Herausforderung.
In verschiedenen Experimenten (Carl Johan Franzen, Metabolie flux analysis of RQ- controlled microaerobic ethanol produetion by Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 2003, 20, 1 17-132; Hendrik P. Bonarius, Determination of the Respiration Quotient in Mammalian Cell Culture in Bicarbonate Buffered Media, Biotechnology and Bioengineering, 1995, 45, 524-534) konnte gezeigt werden, dass die Kultivierung von kontinuierlichen Zelllinien bei niedrigen Glutamin- und Glukosekonzentrationen einen positiven Einfluss auf die zellspezifische Produktivität hat. Gleichzeitig wird die Bildung von Stoffwechselendprodukten auf ein Minimum reduziert, so dass deren Einfluss auf das Wachstum und die Produktbildung erheblich reduziert wird. Die Steigerung der Produktivität bei niedrigen Substratkonzentrationen beruht auf der effektiveren Verstoffwechselung von Glukose und Glutamin zu CO2 und Wasser. Bei höheren Konzentrationen hingegen überwiegt die ineffektive Verstoffwechselung von Glukose zu Laktat (95%) bzw. von Glutamin zu Alanin (Overflow-Metabolismus) (Jan Ljunggren, Catabolic Control of Hybridoma CeIIs by Glucose and Glutamine Limited Fed Batch Cultures, Biotechnology and Bioengineering, 1994, 44, 808-818; Hideo Kurokawa, Growth Characteristics in Fed-Batch Culture of Hybridoma CeIIs with Control of Glucose and Glutamine Concentrations, Biotechnology and Bioengineering, 1994, 44, 95-103).
Kontinuierliche Zelllinien durchlaufen bei hohen Substratkonzentrationen den Zitratzyklus nur vom α-Ketoglutarat bis zum Zitrat. Niedrige Aktivitäten von wichtigen Schlüsselenzymen verhindern eine weitere Umsetzung des Substrates und führen somit zu einem unvollständigen und energetisch ineffektiven Abbau. Stoffwechselphysiologisch gesehen basiert die effektivere Verwertung der Substrate bei niedrigen Konzentrationen auf einem vollständigen Durchlaufen des Zitratzyklus. Die Aktivitätszunahme verschiedener Schlüsselenzyme im Laufe einer Batch-Fermentation konnte von verschiedenen Forschergruppen belegt werden (L. Fitzpatrick, Glucose and glutamine metabolism of a murine B-lymphocyte hybridoma grown in batch culture, Appl Biochem Biotechnol, 1993, 43(2), 93-1 16).
Die Folge sind ein erhöhter Sauerstoffverbrauch und eine erhöhte Kohlendioxidbildung pro umgesetztem Substratmolekül. Die Änderung der Stoffwechselaktivität muss sich demzufolge im metabolischen RQ widerspiegeln und damit kann der RQ in Abhängigkeit von der Glutaminkonzentration verschiedene Werte annehmen. Eine Aufzeichnung des vollständigen RQ-Verlaufs während einer Batch-Fermentation von kontinuierlichen Zelllinien sowie die Identifizierung und biochemische Interpretation einzelner RQ-Phasen ist bisher nicht erfolgreich gelungen. Eine Aussage zur Korrelation zwischen Nährstoffkonzentration und Stoffwechselzustand war bisher nur durch retrospektive Offline-Messungen möglich. Obwohl seit mehr als 10 Jahren Möglichkeiten zur Bestimmung des RQ bei Mikroorganismen bekannt sind, war es bisher nicht möglich bei Zellkulturen, eine Online-Regelung auf Basis der RQ-Werte zu erstellen. Dies lag vor allen Dingen daran, dass bisher nur der TQ bestimmt werden konnte.
Verschiedene Kontrollmethoden sind beispielsweise aus der US 4,891 ,310, US 6,284,453 B1 , US 6,150,133 und US 6,955,892 B2 bekannt. Aber auch hier wird kein Kontroll- und Messverfahren vorgestellt, mit welchem sich letzten Endes online über die Messung des Respirationsquotienten der Zulauf von Kulturmedium und/oder Nährstoffen regeln lässt. Gleichwohl besteht ein Bedarf, hier Abhilfe zu schaffen; denn allen bisherigen Messverfahren für die Parameter von Fermentationen in Zellkulturverfahren haften Nachteile an. So ist z. B. die Elektrodenmessung zur Bestimmung des CÜ2fürdie Regelung nicht stabil genug.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren sowie eine entsprechende Vorrichtung zur RQ-geregelten Zufuhr von Kulturmedium und/oder Nährstoffen zur Verfügung zu stellen, welches die geschilderten Probleme des Standes der Technik überwindet. Es soll erfindungsgemäß durch Bestimmung des metabolischen RQ-Wertes erreicht werden, dass mittels Online-Regelung die Zufuhr von Kulturmedium und/oder Nährstoffen einer empfindlichen Online-Regelung zugänglich gemacht wird. Hierdurch soll zugleich eine effektive Produktivitätssteigerung in Zellkulturverfahren erreicht werden. Dies war mit den bisherigen Verfahren der Fermentationstechnik nicht möglich. Denn die von der Kultivierung mit Mikroorganismen bekannten Verfahren lassen sich nicht auf die wesentlich empfindlicheren Zellkulturen übertragen. Dies gilt insbesondere bei Einsatz von tierischen Zellkulturen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Fermentation von Zellkulturen, bei welchen
- der metabolische RQ online bestimmt wird, - der metabolische RQ als Istwert für eine Regelung dient, - der Ziel-RQ für die gewünschte Produktivität oder Produkteigenschaft als Sollwert für eine Regelung ermittelt wird und
- auf Basis der Soll- und Ist-Werte die Zufuhr von Kulturmedium und/oder Nährstoffen so geregelt wird, dass sich eine optimale Zell- oder Produktausbeute und/oder eine gewünschte Produktqualität bzw. Produkteigenschaft einstellt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung von Proteinen, beispielsweise Pharmaproteinen, durchgeführt werden. Dabei kann das Verfahren mit tierischen- oder pflanzlichen Zellen durchgeführt werden. In dem Verfahren können sowohl kontinuierliche Zelllinien als auch gentechnisch veränderte Zellen eingesetzt werden.
Dabei kann der Ziel-RQ in einem Vorversuch (z. B. Batch-Betrieb, Konti-Betrieb oder Chemostat-Betrieb; Konti-Betrieb entspricht einer kontinuierlichen Prozeßführung) oder im laufenden Prozess bestimmt werden. Ferner kann der Ziel- RQ rechnerisch aus der Stöchiometrie des Stoffwechselweges bestimmt werden. Online wird der metabolische RQ durch die geeignete Kombination der Gasanalysewerte und in situ Messwerte wie pH und Temperatur bestimmt. Die Gasanalyse wird mittels Partialdruckmessung, Massen- und Volumenstrombestimmung oder einer beliebigen Kombination von zwei oder mehr der genannten Parameter durchgeführt.
Die Messung des metabolischen RQ-Wertes basiert auf den im Stand der Technik beschriebenen Meß- und Berechnungsmethoden. Eine Verwendung des RQ-Wertes zur Regelung einer Fermentation von Zellkulturen wurde bisher noch nicht gezeigt. Die vorliegende Erfindung zeigt erstmals, dass es möglich ist in einem Verfahren zur Fermentation von Zellkulturen aus dem gemessenen RQ-Verlauf reproduzierbar auf verschiedene Stoffwechselzustände zu schließen und dass sich während der Fermentation verschiedene diskrete RQ-Zustände bezogen auf die zellspezifische Produktivität einstellen. Der optimale RQ-Wert kann anhand einer Aufzeichnung eines vollständigen RQ-Verlaufs von kontinuierlichen Zelllinien sowie der Identifizierung und biochemischen Interpretation der einzelnen RQ-Phasen ermittelt werden. Dabei kann der Ziel-RQ im Verlauf einer vorgeschalteten Fermentation, rechnerisch aus der Stöchiometrie des Stoffwechselweges, aber auch im laufenden Prozess bestimmt werden. Mit Hilfe dieser Information, der Verknüpfung von diskreten RQ-Werten mit Stoffwechselzuständen und/oder zellspezifischen Produktivitäten, ist es möglich, bestimmte Produktivitäten einem bestimmten RQ-Wert zuzuweisen. Dadurch kann man z. B. eine bestimmte Produktmenge verbunden mit einer geringen Nebenproduktbildung über den RQ-Wert einregeln. Folglich kann während der Fermentation ohne aufwändige Kontrolle verschiedenster Parameter, lediglich durch eine Online-Bestimmung und Online-Regelung des RQ-Werts, die gewünschte Produktivität eingestellt werden. Die Regelung erfolgt durch die Zufuhr von Kulturmedium und/oder Nährstoffen, so dass sich eine optimale Zell- oder Produktausbeute und/oder eine gewünschte Produktqualität bzw. Produkteigenschaft einstellt.
Die Online-Kontrolle und -Regelung des gewünschten RQ-Wertes ermöglicht somit eine exakte Zuführung des benötigten Kulturmediums und/oder der Nährstoffe um entweder eine hohe Zellausbeute, eine hohe Produktausbeute, eine bestimmte Produktqualität oder Produkteigenschaft zu erzielen.
Die Begriffe „gewünschte Produktqualität", „gewünschte Produkteigenschaft", „optimaler RQ-Wert" oder „gewünschter RQ-Wert" im Sinne der Erfindung variieren je nach Verfahren und Produkt. So kann es bedeuten nicht auf einen RQ-Wert zu regeln bei dem die maximale zellspezifische Produktivität vorhanden ist, sondern auf einen RQ-Wert mit niedrigerer zellspezifischer Produktivität, wobei dieser dafür mit einer niedrigeren Nebenproduktbildung verbunden ist.
Die Verstoffwechselung von z. B. Fetten führt zu RQ-Werten < 1 (ca. 0,7), da diese Stoffklasse zu den wenig oxidierten Substanzen zählt. Kohlenhydrate sind im Vergleich hoch oxidiert und führen zu einem RQ-Wert von 1. Anwendung findet diese Methode z.B. bei der Fermentation von Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) (Carl Johan Franzen, Metabolie flux analysis of RQ-controlled microaerobic ethanol produetion by Saccharomyces cerevisiae, Yeast, 2003, 20, 117-132).
Saccharomyces cerevisiae kann unter anaeroben Bedingungen Alkohol produzieren.
Jedoch gibt es außerdem die Möglichkeit, unter aeroben Bedingungen entweder Alkohol oder ausschließlich Biomasse zu gewinnen. Das zu Grunde liegende Phänomen wird als
Crabtree-Effekt bezeichnet und beschreibt die aerobe Alkoholbildung oberhalb einer kritischen Glukosekonzentration von 100 mg/l, wohingegen unterhalb von 100 mg/l bevorzugt die Biomasseproduktion abläuft.
Der gemessene RQ liegt bei der Ethanolproduktion weit über eins. Im Gegensatz dazu hat die vollständige Oxidation des Zuckers zu CO2 und Wasser einen RQ von eins. Die erfindungsgemäße Prozessführung ist völlig unabhängig von Substrat- Offlinemessungen und basiert vorzugsweise auf der Messung des Gaswechsels. Durch die exakte Einhaltung einer bestimmten Substratkonzentration kann die Ausbeute an Biomasse oder Ethanol um ein vielfaches gesteigert werden.
Die Messung des Respirationsquotienten erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise durch die Bestimmung der geeigneten Kombination der Gasanalysewerte und der in situ vorgenommenen Messungen.
Die Gasanalyse kann mittels aller dem Fachmann zur Verfügung stehenden Methoden erfolgen. Voraussetzung ist, dass die Verfahren für die Online-Bestimmung brauchbar sind. Beispiele für Gasanalyse sind Partialdruckmessungen sowie die Bestimmung des Masse- und Volumenstroms.
Die in situ-Messung kann ebenfalls mit den üblichen dem Fachmann bekannten Methoden gemessen werden. Hier werden vorzugsweise der Kohlendioxidgehalt, der
Sauerstoffgehalt, der pH-Wert und die Temperatur bestimmt. O2- und Cθ2-Gehalt können z. B. mittels Partialdruckmessung ermittelt werden. Ggf. können auch weitere
Parameter gemessen werden. Für die Bestimmung des Kohlendioxidgehalts, des
Sauerstoffgehalts und des pH-Werts kommen beispielsweise übliche Elektroden in Betracht.
Die Bestimmung des Soll-Wertes kann erfindungsgemäß vorzugsweise vor Beginn der Produktion durchgeführt werden. Die Sollwertbestimmung kann jedoch auch an beliebigen anderen Zeitpunkten erfolgen und je nach Erfordernissen des Betriebs auch beliebig oft wiederholt werden. Sie kann in einem gesonderten Fermenter oder auch in dem Produktionsfermenter erfolgen. Bevorzugt ist die Messung im Batch-Betrieb in einem gesonderten Gefäß.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für pflanzliche oder tierische Zellen Verwendung finden. Erfindungsgemäß können auch kontinuierliche Zelllinien oder gentechnisch veränderte Zellen zum Einsatz kommen. Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren für den Einsatz von tierischen Zellkulturen. Hier ist ein besonders bevorzugter Bereich wiederum die Produktion von Proteinen, insbesondere von pharmazeutisch anwendbaren Proteinen. Besonders vorteilhaft ist es erfindungsgemäß, dass nunmehr im kontinuierlichen Verfahren über die Regelung des metabolischen RQ der Zulauf von Kulturmedium und/oder Nährstoffen gesteuert werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in den nach dem Stand der Technik bekannten für vorzugsweise Submersversverfahren geeigneten Fermentern durchgeführt werden. Demgemäß kommen z.B. Blasensäulen, Injektor betriebene Systeme, Schlaufenreaktoren sowie Rührreaktoren in Form von Ein- und Mehrstufensystemen in Betracht. Besonders bevorzugt sind Rührreaktoren.
Die Reaktoren sind regelmäßig mit den nach dem Stand der Technik an sich bekannten Mess-, Steuer- und Regelsystemen ausgestattet. Hierzu zählen Geräte zur Online- und Offline-Messung. Als Beispiele zu nennen sind pH-, pÜ2- pCÜ2 Messgeräte, insbesondere der Einsatz entsprechender Sensoren. Ebenso ist z. B. der Einsatz von Messungen der Zu- und Abfuhr von Substrat sowie der Zu- und Abluft erfindungsgemäß vorteilhaft.
Eine Vorrichtung die zur Durchführung des beschriebenen Verfahrens geeignet ist, ermöglicht die Online-Ermittlung des metabolischen RQ mit Hilfe der Zu- und Abluft, sowie des pH-Wertes und der Temperatur. Die Steuerung der Medien- und Nährstoffzufuhr erfolgt automatisch basierend auf dem RQ. Dabei werden Dosiervorrichtungen (gasförmige, flüssige oder feste Medien) angesteuert um einen für die Erzielung einer angestrebten Produktivität oder Produkteigenschaft geeigneten RQ (Ziel-RQ) einzuregeln und zu halten. Darüber hinaus können durch die Messung der Sauerstoffkonzentration und des pH-Wertes im Fermentereine Regelung der Sauerstoffbzw. NaOH/Cθ2-Zufuhr zur Aufrechterhaltung einer gewünschten Sauerstoffkonzentration bzw. pH-Wertes im Fermenter durchgeführt werden.
Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens kann dabei a) einen Fermenter; b) ein Gasmischsystem; c) Zuluftleitungen für Gas; d) Abluftleitungen; e) Messvorrichtungen zur Bestimmung der Sauerstoff und Cθ2-Konzentration und des Massenflusses in der Zuluft und in der Abluft zur Ermittlung der Sauerstoffverbrauchsrate OTR und der Kohlendioxidbildungsrate CTR; f) Vorrichtung zur Messung des pH-Werts und der Temperatur ; g) Vorrichtung zur Ermittlung des CER und des metabolischen RQ aus den Temperatur-, pH-, Sauerstoffkonzentrations- und Kohlendioxidkonzentrations-Werten; h) ein RQ-Regler zur RQ-basierten Regelung der Zufuhr von Kulturmedium und/oder Nährstoffen enthalten.
Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf diese Beispiele und Figuren näher erläutert. Im einzelnen haben die Figuren folgende Bedeutung:
In allen Figuren entspricht P1 der Phase 1 ; P2 der Phase 2; P3 der Phase 3; P4 der Phase 4; P5 der Phase 5 und P6 der Phase 6.
Fig. 1 : Verlauf des RQ bei einer Batch-Fermentation der Hybridomazelllinie CF-10H5. Durchgängige Linie: Glutamin; gestrichelte Linie: Glucose; durchgängige Linie in grau: RQ.
Fig. 2: Verlauf der zellspezifischen Produktivität. Gestrichelte Linie: zellspezifische Produktivität; durchgängige Linie in grau: RQ.
Fig. 3: Verlauf der Laktatbildungsrate. Durchgängige Linie: Zellspezifische Laktatbildungsrate; durchgängige Linie in grau: RQ.
Fig. 4: Abhängigkeit des RQ von der Glutaminkonzentration in der chemostatischen Betriebsweise. Durchgängige Linie: Glutamin; durchgängige Linie in grau: RQ.
Fig. 5: Glutaminverlauf im RQ-geregelten Fed-Batch (Sollwert RQ 0,66). Durchgängige Linie: Glutamin; durchgängige Linie in grau: RQ. Der Pfeil markiert den Start des RQ- geregelten Fed-Batch-Verfahrens.
Fig. 6: Produktivitätsverlauf im RQ-geregelten Fed-Batch. Gestrichelte Linie: zellspezifische Produktivität; durchgängige Linie in grau: RQ.
Fig. 7: Verfahrensfließbild des RQ-geregelten Fed-Batch Verfahrens. 1 : Fermenter; 2: Rührer; 3: Zuluft; 4: Abluft; 5 und 22: pH und pθ2-Elektroden; 7: Vorrichtung für die Abgasanalytik; 8: Vorrichtung zur Ermittlung des metabolischen RQ; 9: Nährstoffbehälter; 10: Nährstoffpumpe; 11 : Zufuhrleitung.
Fig. 8: Vorrichtung zur Durchführung des RQ-geregelten Fed-Batch Verfahrens. 1 : Fermenter; 2: Rührer; 3: Zuluft für Gas; 4: Abluftleitungen; 5: pH-Elektrode; 6-7: Messvorrichtungen zur Bestimmung der Sauerstoff und Cθ2-Konzentration und des Massenflusses in der Zuluft; 8: Vorrichtung zur Ermittlung des metabolischen RQ; 9: Nährstoffbehälter; 10: Nährstoffpumpe; 11 : Zufuhrleitung; 12: Vorrichtung zur Messung des pH-Werts; 13: Vorrichtung zur Messung der Temperatur; 14-15: Messvorrichtungen zur Bestimmung der Sauerstoff und Cθ2-Konzentration und des Massenflusses in der Abluft; 16: Vorrichtung zur Ermittlung der Sauerstoffverbrauchsrate OTR; 17: Vorrichtung zur Ermittlung der Kohlendioxidbildungsrate CTR; 18: Vorrichtung zur Ermittlung der CER; 19: Vorgegebener Ziel-RQ; 20: RQ-Regler; 21 : Gasmischsystem;
1. RQ-Verlauf während einer Fermentation von Hybridomazellen
Figur 1 zeigt den Verlauf des RQ bei einer Batch-Fermentation der Hybridomazelllinie CF-10H5.
In Batch-Experimenten mit Hybridomazellen (ACC 477, CF-10H5) ist es gelungen aus dem gemessenen RQ-Verlauf reproduzierbar auf verschiedene Stoffwechselzustände zu schließen und eine biochemische Interpretation zu ermöglichen. Insbesondere konnte im RQ-Verlauf eine Phase identifiziert werden, in der die zellspezifische Produktivität am höchsten ist. Daraus ergibt sich eine konkrete Handlungsanweisung bzw. ein Verfahren für die Führung der Kultur mit erhöhter Produktivität für Fed-Batch und kontinuierliche Fermentationsverfahren.
Figur 1 zeigt den RQ-Verlauf sowie die Abnahme der Glukose- und Glutaminkonzentration während der Batch-Kultivierung der Hybridomazelllinie CF-10H5 im Fermenter. Die Glutaminkonzentration nimmt im Laufe der Kulturdauer kontinuierlich ab, bis sie nach ca. 60 Stunden vollständig erschöpft ist. Die Glukosekonzentration nimmt während der gesamten Kulturdauer ab, wird aber bis zum Ende der Fermentation nie limitierend für die Kultur. Überraschenderweise stellen sich verschiedene diskrete RQ-Zustände (Phasen 1 bis 6) während der Fermentation ein.
2. Verlauf der zellspezifischen Produktivität während dieser Batch-Fermentation
Figur 2 zeigt den Verlauf der zellspezifischen Produktivität im Batch.
Aus Figur 2 wird ersichtlich, dass die zellspezifische Produktivität von den genannten RQ-Werten abhängig ist. Bei hohen Glutaminkonzentrationen (Phase 1 ) wird ein niedriger RQ-Wert von 0,55 und bei niedrigen Glutaminkonzentrationen höhere RQ-Werte zwischen 0,66 und 1 ,1 1 gemessen. Die zellspezifischen Produktivitäten liegen bei den niedrigen RQ-Werten bei ca. 1 E-7 μg/N/h und erreichen ihr Maximum (ca. 4E-7 μg/N/h) bei einem RQ von 1 ,1 1. Ab einem RQ von ca. 1 ,3 fällt die Produktivität erneut auf den Ursprungswert zurück. Die Erhöhung der Produktivität liegt ca. bei einem Faktor 4.
Darüber hinaus wird bei einem RQ von 1 ,1 1 die Bildungsrate von Nebenprodukten deutlich erniedrigt. Aus Figur 3 wird ersichtlich, dass in der RQ-Phase von 1 ,1 1 die Laktatbildungsrate im Vergleich zu den anderen RQ-Phasen deutlich niedriger ist.
Das Ziel ist es daher, die 3. Stoffwechselphase (RQ = 1 ,1 1 ) und damit eine hohe Produktivität und gleichzeitig eine niedrige Bildungsrate von zum Teil toxischen Nebenprodukten aufrecht zu halten.
3. RQ-Ve rl auf während einer chemostatischen Betriebsweise
Aus Figur 4 ist die Abhängigkeit des RQ von der Glutaminkonzentration in der chemostatischen Betriebsweise sichtbar.
Die Korrelation des RQ mit dem jeweiligen Glutaminkonzentrationsbereich, im speziellen der Phasen 1 , 2 und 3 konnte durch die chemostatische Fermentationsbetriebsweise bestätigt werden.
Diese Art der Prozessführung spiegelt die kontinuierliche Betriebsweise einer Fermentation ohne Zellrückhaltung. Dieses System ist charakterisiert durch den kontinuierlichen Zulauf von frischem Kulturmedium und dem Ablauf von verbrauchtem Kulturmedium inklusive Zellen. Das Fließgleichgewicht ermöglicht unter Berücksichtigung der Durchflussrate (D < μmaχ) das Einstellen von definierten Wachstumsraten, Substrat-, Produkt- und Zellkonzentrationen im Fermenter.
Aus Figur 4 wird ersichtlich, dass erst das Überschreiten von gewissen Glutaminkonzentrationen der RQ seinen Wert ändert.
4. RQ-geregelter Fed-Batch
Fed-Batch-Fermentationen mit der Hybridomazelllinie CF-10H5 konnten die Effektivität dieser Methode bestätigen (Figuren 5 bis 8). Figur 5 zeigt den Glutaminverlauf im RQ-geregelten Fed-Batch (Sollwert RQ 0,66).
Figur 6 zeigt den Produktivitätsverlauf im RQ-geregelten Fed-Batch (Sollwert RQ 0,66).
Der anfängliche Batch-Betrieb bis 50 Stunden Fermentationszeit zeigt 2 der 6 Stoffwechselphasen und die damit verbundenen zellspezifischen Produktivitäten. Es konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit des eingeregelten RQ-Wertes eine niedrige (RQ = 0,66) bzw. eine hohe (RQ = 1 ,1 1 ) zellspezifische Produktivität eingestellt wurde (Figur 6).
Das Einregeln des RQ erfolgt durch die geregelte Zugabe von Kulturmedium und/oder Nährstoffen (hier: Fed-Batch Medium, vierfach-Konzentrat der Nährstoffe).
5. Erhöhung der zellspezifischen Produktivität
Durch das Aufrechterhalten des RQ-Wertes von 1 ,11 konnte die Produktivität um den
Faktor vier erhöht werden. Von einer anfänglichen Produktivität von ca. 1 E-7 μg/N/h wurde die Produktivität auf ca. 4E-7 μg/N/h gesteigert.
Somit konnte im RQ-geregelten Fed-Batch gezeigt werden, dass das zuvor im Batch festgestellte Phänomen reproduzierbar ist und für eine RQ-basierte Prozessregelung genutzt werden kann.
Eine Onlineüberwachung sowie -regelung des Prozesses konnte ohne Laboranalytik erfolgreich umgesetzt und die Produktivität um 300 % gesteigert werden.
6. Anwendung der Methode
Figur 7 zeigt ein Verfahrensfließbild mit einem als Beispiel für die erfindungsgemäße Anwendung der RQ-Regelung. In diesem Beispiel erfolgt die Produktion in einem Fermenter 1 mit einem Rührer 2. Der Fermenter ist mit einer Zuluft 3 und einer Abluft 4 ausgerüstet. Ferner sind für die Messung des pH und des pÜ2 die Elektroden 5 und 22 vorgesehen. In der Abluft 4 ist noch eine Vorrichtung für die Abgasanalytik 7 angeordnet. Anhand des pH-Wertes, der Temperatur und der Ergebnisse der Abgasanalytik 8 lässt sich der RQ als Funktion des OTR, CTR, pH und der Temperatur bestimmen. Mit Hilfe des zuvor in einem Batch-Verfahren bestimmten verfahrensspezifischen RQ erfolgt sodann die Regelung des Zulaufs an Kulturmedien und/oder Nährstoffen 9. Hierbei betätigt der RQ-Regler das Ventil der Nährstoffpumpe 10 für die Zufuhrleitung 11. 7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
Figur 8 zeigt ein Verfahrensfließbild der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Hierbei wird die Gaszusammensetzung und der Gasfluss (Massenfluss) ermittelt. Die durch das Gasmischsystem 21 zusammengesetzte Zuluft 3 wird zunächst durch die Vorrichtung geleitet um den Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalt 6-7 der Zuluft zu bestimmen.
Anschließend wird das Gas in den Fermenter 1 geleitet.
Durch die Bestimmung der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentration 14-15 in der Abluft 4 ist die Ermittlung der Sauerstoffverbrauchsrate (OTR) 16 sowie der Kohlendioxidbildungsrate
(CTR) 17 möglich.
Die Messung pH-Wertes 5 und der Temperatur 13 im Fermenter ermöglicht in Kombination mit der Berechnung der CTR die Ermittlung der CER 18 und damit des metabolischen RQ 8.
Unter Berücksichtigung des RQ-Reglers 20 und einem vorgegebenen Ziel-RQ 19 ist die Zufuhr der Kulturmedien und/oder Nährstoffen aus dem Nährstoffbehälter 9 über die
Ansteuerung der Nährstoffpumpe 10 möglich.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Fermentation von Zellkulturen, bei welchem
- der metabolische RQ online bestimmt wird, - der metabolische RQ als Istwert für eine Regelung dient,
- ein Ziel-RQ für die gewünschte Produktivität oder Produkteigenschaft als Sollwert für eine Regelung ermittelt wird und
- auf Basis der Soll- und Ist-Werte die Zufuhr von Kulturmedium und/oder Nährstoffen so geregelt wird, dass sich eine optimale Zell- oder Produktausbeute und/oder eine gewünschte Produktqualität bzw. Produkteigenschaft einstellt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Ziel-RQ in einem Vorversuch bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Ziel-RQ in einem Vorversuch im Batch-Betrieb, Konti-Betrieb oder Chemostat-Betrieb bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Ziel-RQ im laufenden Prozess bestimmt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Ziel-RQ rechnerisch aus der Stöchiometrie des Stoffwechselweges bestimmt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der metabolische RQ online durch die geeignete Kombination der Gasanalysewerte und in situ Messwerte wie pH und Temperatur bestimmt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Gasanalyse mittels Partialdruckmessung, Massen- und Volumenstrombestimmung oder einer beliebigen Kombination von zwei oder mehr der genannten Parameter durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass kontinuierliche Zelllinien oder gentechnisch veränderte Zellen eingesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es mit tierischen- oder pflanzlichen Zellen durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es zur Herstellung von Proteinen durchgeführt wird.
1 1. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation zur Herstellung von Pharmaproteinen durchgeführt wird.
12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 umfassend a) einen Fermenter (1); b) ein Gasmischsystem (21); c) Zuluftleitungen für Gas (3); d) Abluftleitungen (4); e) Messvorrichtungen zur Bestimmung der Sauerstoff und Cθ2-Konzentration und des Massenflusses in der Zuluft (6-7) und in der Abluft (14-15) zur Ermittlung der Sauerstoffverbrauchsrate OTR (16) und der Kohlendioxidbildungsrate CTR (17); f) Vorrichtung zur Messung des pH-Werts (12) und der Temperatur (13); g) Vorrichtung zur Ermittlung des CER (18) und des metabolischen RQ (8) aus den Temperatur-, pH-, Sauerstoffkonzentrations- und Kohlendioxidkonzentrations-Werten; h) ein RQ-Regler (20) zur RQ-basierten Regelung der Zufuhr von Kulturmedium und/oder Nährstoffen (9).
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