EP2198964B1 - Verfahren zum Bereitstellen eines getrockneten Reagenz in einem mikrofluidischen System - Google Patents

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EP2198964B1
EP2198964B1 EP08019462A EP08019462A EP2198964B1 EP 2198964 B1 EP2198964 B1 EP 2198964B1 EP 08019462 A EP08019462 A EP 08019462A EP 08019462 A EP08019462 A EP 08019462A EP 2198964 B1 EP2198964 B1 EP 2198964B1
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Manfred Augstein
Romi Roedl
Susanne Wuerl
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Roche Diagnostics GmbH
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F Hoffmann La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
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    • F26B5/06—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat by evaporation or sublimation of moisture under reduced pressure, e.g. in a vacuum the process involving freezing
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Definitions

  • the invention relates to a method for providing a dried reagent in a microfluidic system.
  • Microfluidic systems have, at least in sections, a microfluidic structure in which one or more microcompartments and / or microchannels are formed.
  • microfluidic systems are provided as microfluidic test elements or test systems with which one or more analytes can be analyzed, for example in a sample of a body fluid.
  • one or more reagents are then provided in the microfluidic structure, in particular for a detection reaction with the analyte to be analyzed.
  • the one or more reagents are arranged in the microchannels and / or the microcompartments of the microfluidic structure, so that they come into contact with the sample liquid when the sample to be examined is placed on the microfluidic test element, whereupon a detection reaction usually takes place.
  • Lyophilization is a freeze-drying process that results in the removal of liquid from the frozen material in vacuo. In this freezing of the solvent, which is usually water, the solvent evaporates in the frozen state (sublimation drying). In this way, a gentle drying and preservation of one or more reagents is possible.
  • the end product of lyophilization is a frozen mass (lyophilisate), which may also be referred to as a porous, stable and dry "lyo cake”.
  • lyophilized pellets suitable for use in a microfluidic system.
  • the lyophilized pellets may contain various biological reagents or microparticles.
  • the pellets are prepared by placing drops of a reagent solution on a cooled plate and frozen there, followed by vacuum treatment.
  • the document WO 03/035909 A2 relates to diagnostic methods in a device in which a plurality of so-called assay stations are formed in a substrate. Reagents are introduced into the assay stations, which then participate in a reaction. In one embodiment, it is provided to introduce DNA / RNA sample material into at least one assay station and to lyophilize there. Subsequently, the reagents participate in a PCR or RT-PCR reaction.
  • the object of the invention is to provide a method for providing a dried reagent in a microfluidic system as well as a microfluidic system in which at least one dried reagent can be introduced into the microfluidic system for retention herein in a flexible and adaptable manner to a particular application ,
  • One aspect of the invention is a method of providing a dried reagent in a microfluidic system, the method comprising the steps of: providing a microfluidic system having a microfluidic structure, introducing a reagent-containing flowable carrier medium into the microfluidic structure, and drying of the reagent in the microfluidic structure by lyophilization. Before introducing the flowable carrier medium, the microfluidic structure is thermally treated. In this way, the incorporation of the reagent (s) in the microfluidic structure is specifically influenced.
  • the possibility is created to first introduce the reagent to be stored in the microfluidic structure in dissolved or suspended form into the microfluidic structure, in order then to carry out a drying by means of lyophilization.
  • the reagent can be more easily introduced into the sections of the microfluidic structure by means of the flowable carrier medium, for example in the form of a solution or a suspension. It is not necessary to optimize the sections of the microfluidic structure geometrically for the introduction of pellets or particles. Rather, the carrier medium, which may be, for example, water, flows with the reagent into the sections of the microfluidic structure in the microfluidic system.
  • the microfluidic structure may be formed in sections in the microfluidic system or in a substantially completely encompassing manner.
  • the advantage is that the dried reagent dissolves rapidly and completely in a liquid. For example, in an aqueous solution which is introduced into the microfluidic structure when using the microfluidic system. This is particularly advantageous for kinetic measurements, for example.
  • one or more reagents can be incorporated into the microfluidic structure.
  • the incorporation of several reagents can also be carried out, for example, by multiple application of the steps for introducing the carrier medium and subsequent lyophilization. However, such a multiple application can also be provided in connection with the introduction of only one reagent in the microfluidic structure.
  • the microfluidic structure is thermally treated when the flowable carrier medium is introduced.
  • An advantageous embodiment of the invention provides that the microfluidic structure is cooled during the thermal treatment.
  • the cooling of the microfluidic structure is a form of thermal treatment in which, for example, the microfluidic structure or parts thereof or the entire microfluidic system are cooled.
  • the cooling can be done so far that the flowable carrier medium freezes after application on contact with the surface of the microfluidic structure equal or in temporal proximity thereto. In this way, a targeted influencing of the distribution of the flowable carrier medium within the microfluidic structure is made possible. Cooling is advantageous, for example, if the flowable carrier medium contains a surfactant whose distribution in the microfluidic structure can be influenced in a targeted manner.
  • a development of the invention provides that the microfluidic structure is heated during the thermal treatment.
  • the heating is another form of thermal treatment of the microfluidic system or parts thereof, in particular the micro fluidic structure.
  • This type of thermal treatment can also be used to control and regulate the spatial distribution of the reagent suspension or solution within the microfluidic structure.
  • heating is advantageous when the flowable carrier medium contains surfactants whose distribution is otherwise difficult to control in microfluidic structures.
  • An expedient embodiment of the invention may provide that the reagent is incorporated in the microfluidic structure with a substantially homogeneous distribution.
  • the flowable carrier medium contains one or more surfactants and / or one or more fillers. These form after drying a kind of chemical lattice for the one or more reagents in the microfluidic structure, whereby, for example, a homogeneous and rapid dissolution of the reagents is supported.
  • microfluidic test element selected from the following group of systems: microfluidic test element and microfluidic chip.
  • test elements are preferably used, as they are as such in the document EP 1 916 524 A1 are described.
  • analysis systems that are loaded with dry reagents and are substantially disk-shaped.
  • a reagent solution or suspension is initially prepared in which one or more reagents are present in dissolved or suspended form.
  • the microfluidic system is then provided, for example in the form of a microfluidic test element or a microfluidic chip.
  • the reagent solution or suspension is applied, for example, about 10 microliters are applied. This again takes place at atmospheric pressure.
  • the applied liquid penetrates at least partially into the microfluidic structure of the microfluidic system.
  • the microfluidic system can be pre-cooled, for example by placing it on a cooled storage surface, which in turn was pre-cooled, for example, at about -50 ° C.
  • the described method can be carried out, for example, with a cholesterol reagent which contains a surface-active substance.
  • reagents in dried form within the microfluidic structure of the microfluidic system with a desired distribution, for example a substantially homogeneous distribution.
  • the application of the reagent solution or suspension allows easy penetration of the reagent (s) into the microstructure. Subsequently, the drying is then carried out by lyophilization.

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Bereitstellen eines getrockneten Reagenz in einem mikrofluidischen System.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Mikrofluidische Systeme weisen wenigstens abschnittsweise eine mikrofluidische Struktur auf, in der ein oder mehrere Mikrokammern und / oder Mikrokanäle gebildet sind. Beispielsweise werden solche mikrofluidischen Systeme als mikrofluidische Testelemente oder Testsysteme zur Verfügung gestellt, mit denen ein oder mehrere Analyte analysiert werden können, zum Beispiel in einer Probe einer Körperflüssigkeit. Für diesen Anwendungszweck werden dann in der mikrofluidischen Struktur ein oder mehrere Reagenzien bereitgestellt, insbesondere für eine Nachweisreaktion mit dem zu analysierenden Analyten. Das eine oder die mehreren Reagenzien sind in den Mikrokanälen und / oder den Mikrokammern der mikrofluidischen Struktur angeordnet, so dass sie beim Auftragen der zu untersuchenden Probe auf das mikrofluidische Testelement mit der Probenflüssigkeit in Kontakt kommen, worauf üblicherweise eine Nachweisreaktion stattfindet.
  • In dem Dokument WO 93/04195 wurde vorgeschlagen, Kugeln mit einem Reagenz für eine Analyse einer biologischen Probe herzustellen, indem eine wässrige Lösung des Reagenz hergestellt, Tropfen der wässrigen Lösung zum Gefrieren in eine Kälteflüssigkeit gegeben und die gefrorenen Tropfen lyophilisiert werden.
  • Beim Lyophilisieren handelt es sich um eine Gefriertrocknung, die zu einem Flüssigkeitsentzug aus dem tiefgefrorenen Material im Vakuum führt. Bei diesem Ausfrieren des Lösungsmittels, bei dem es sich meistens um Wasser handelt, verdampft das Lösungsmittel im gefrorenen Zustand (Sublimationstrocknung). Auf diese Weise ist eine schonende Trocknung und Konservierung eines oder mehrerer Reagenzien möglich. Das Endprodukt einer Lyophilisierung ist eine gefrorene Masse (Lyophilisat), die auch als ein poröser, stabiler und trockner "Lyo-Kuchen" bezeichnet werden kann.
  • In dem Dokument US 2007/0259348 A1 wurde vorgeschlagen, lyophilisierte Pellets herzustellen, die für eine Nutzung in einem mikrofluidischen System geeignet sind. Die lyophilisierten Pellets können verschiedene biologische Reagenzien oder Mikropartikel enthalten. Die Pellets werden hergestellt, indem Tropfen einer Reagenzlösung auf eine gekühlte Platte gegeben und dort gefroren werden, woraufhin eine Vakuumbehandlung erfolgt.
  • Das Dokument WO 03/035909 A2 betrifft diagnostische Verfahren in einer Vorrichtung, bei der in einem Substrat mehrere so genannte Assaystationen gebildet sind. In die Assaystationen werden Reagenzien eingebracht, die anschließend an einer Reaktion teilnehmen. In einer Ausführungsform ist vorgesehen, DNA / RNA-Probenmaterial in wenigstens eine Assaystation einzubringen und dort zu lyophilisieren. Anschließend nehmen die Reagenzien an einer PCR- oder einer RT-PCR-Reaktion teil.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Bereitstellen eines getrockneten Reagenz in einem mikrofluidischen System sowie ein mikrofluidisches System bereitzustellen, bei dem auf flexible und an eine jeweilige Anwendung anpassbare Art und Weise wenigstens ein getrocknetes Reagenz in das mikrofluidische System zum Verbleib hierin eingebracht werden kann.
  • Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach dem unabhängigen Anspruch 1 gelöst.
  • Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Bereitstellen eines getrockneten Reagenz in einem mikrofluidischen System, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen eines mikrofluidischen Systems, welches eine mikrofluidische Struktur aufweist, Einbringen eines ein Reagenz enthaltenden, fließfähigen Trägermediums in der mikrofluidischen Struktur und Trocknen des Reagenz in der mikrofluidischen Struktur mittels Lyophilisieren. Vor dem Einbringen des fließfähigen Trägermediums wird die mikrofluidische Struktur thermisch behandelt. Auf diese Weise wird die Einlagerung des oder der Reagenzien in der mikrofluidischen Struktur gezielt beeinflusst.
  • Mit der Erfindung wird die Möglichkeit geschaffen, zunächst das in der mikrofluidischen Struktur einzulagernde Reagenz in gelöster oder suspendierter Form in die mikrofluidische Struktur einzubringen, um anschließend eine Trocknung mittels Lyophilisierung durchzuftren. Im Gegensatz zu den im Stand der Technik vorgesehenen Pellets lässt sich das Reagenz mittels des fließfähigen Trägermediums, beispielsweise in Form einer Lösung oder einer Suspension, einfacher in die Abschnitte der mikrofluidischen Struktur einbringen. Es ist nicht notwendig, die Abschnitte der mikrofluidischen Struktur in geometrischer Hinsicht für das Einbringen von Pellets oder Partikeln zu optimieren. Vielmehr fließt das Trägermedium, bei dem es sich zum Beispiel um Wasser handeln kann, mit dem Reagenz in die Abschnitte der mikrofluidischen Struktur in dem mikrofluidischen System. Darüber hinaus wird eine möglichst homogene Verteilung des Reagenz in der mikrofluidischen Struktur oder in Abschnitten hiervon erleichtert, soweit eine solche homogene Verteilung im konkreten Anwendungsfall gewünscht ist. Die mikrofluidische Struktur kann hierbei abschnittsweise in dem mikrofluidischen System oder dieses im Wesentlichen ganz erfassend gebildet sein. Unabhängig von der konkreten Verteilung des getrockneten Reagenz in der mikrofluidischen Struktur besteht der Vorteil darin, dass sich das getrocknete Reagenz schnell und vollständig löst in einer Flüssigkeit. Zum Beispiel in einer wässrigen Lösung, die bei der Nutzung des mikrofluidischen Systems in die mikrofluidische Struktur eingebracht wird. Dies ist zum Beispiel bei kinetischen Messungen von besonderem Vorteil.
  • Mit Hilfe des Verfahrens können ein oder mehrere Reagenzien in die mikrofluidische Struktur eingelagert werden. Die Einlagerung mehrerer Reagenzien kann beispielsweise auch mittels mehrfacher Anwendung der Schritte zum Einbringen des Trägermediums und anschließender Lyophilisierung erfolgen. Eine solche Mehrfachanwendung kann aber auch im Zusammenhang mit dem Einbringen nur eines Reagenz in der mikrofluidischen Struktur vorgesehen sein.
  • Bei einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass beim Einbringen des fließfähigen Trägermediums die mikrofluidische Struktur thermisch behandelt wird.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung sieht vor, dass die mikrofluidische Struktur bei der thermischen Behandlung gekühlt wird. Das Kühlen der mikrofluidischen Struktur ist eine Form der thermischen Behandlung, bei der zum Beispiel die mikrofluidische Struktur oder Teile hiervon oder das gesamte mikrofluidische System gekühlt werden. Die Kühlung kann soweit erfolgen, dass das fließfähige Trägermedium nach dem Auftragen beim Kontakt mit der Oberfläche der mikrofluidischen Struktur gleich oder in zeitlicher Nähe hierzu gefriert. Auf diese Weise ist eine gezielte Beeinflussung der Verteilung des fließfähigen Trägermediums innerhalb der mikrofluidischen Struktur ermöglicht. Eine Kühlung ist zum Beispiel dann von Vorteil, wenn das fließfähige Trägermedium ein Tensid enthält, dessen Verteilung in der mikrofluidischen Struktur so gezielt beeinflussbar ist.
  • Bevorzugt sieht eine Fortbildung der Erfindung vor, dass die mikrofluidische Struktur bei der thermischen Behandlung beheizt wird. Das Beheizen ist eine weitere Form der thermischen Behandlung des mikrofluidischen Systems oder von Teilen hiervon, insbesondere der mikro-, fluidischen Struktur. Diese Art der thermischen Behandlung kann ebenfalls dazu genutzt werden, die räumliche Verteilung der Reagenzsuspension oder -lösung innerhalb der mikrofluidischen Struktur zu kontrollieren und zu regeln. Beispielsweise ist ein Beheizen von Vorteil, wenn das fließfähige Trägermedium Tenside enthält, deren Verteilung in mikrofluidischen Strukturen sonst schwierig zu steuern ist.
  • Eine zweckmäßige Ausführung der Erfindung kann vorsehen, dass das Reagenz in der mikrofluidischen Struktur mit einer im Wesentlichen homogenen Verteilung eingelagert wird.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass das fließfähige Trägermedium ein oder mehrere Tenside und / oder einen oder mehrere Füllstoffe enthält. Diese bilden nach dem Trocknen eine Art chemisches Gitter für das oder die Reagenzien in der mikrofluidischen Struktur, wodurch zum Beispiel eine homogene und schnelle Auflösung der Reagenzien unterstützt wird.
  • Bei einer vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen sein, dass ein mikrofluidisches System, ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Systemen, bereitgestellt wird: mikrofluidisches Testelement und mikrofluidischer Chip. Bevorzugt werden in einer Ausführung Testelemente eingesetzt, wie sie als solche in dem Dokument EP 1 916 524 A1 beschrieben sind. Es sind dort Analysesysteme offenbart, die mit Trockenreagenzien beladen sind und im Wesentlichen scheibenförmig sind.
    • Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung
  • Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
  • Um ein mikrofluidischen System, welches wenigstens abschnittsweise mit einer mikrofluidischen Struktur in Form von Mikrokanälen und / oder Mikroräumen versehen ist, bereitzustellen, wird zunächst eine Reagenzlösung oder -suspension hergestellt, in welcher ein oder mehrere Reagenzien in gelöster oder suspendierter Form vorliegen. Sodann wird das mikrofluidische System bereitgestellt, beispielsweise in Form eines mikrofluidischen Testelementes oder eines mikrofluidischen Chips. Anschließend wird die Reagenzlösung oder -suspension aufgetragen, zum Beispiel werden etwa 10 Mikroliter aufgegeben. Dieses erfolgt wiederum bei Atmosphärendruck. Die aufgetragene Flüssigkeit dringt wenigstens teilweise in die mikrofluidische Struktur des mikrofluidischen Systems ein. Hierbei kann das mikrofluidische System vorgekühlt werden, zum Beispiel mittels Auflegen auf eine gekühlte Ablagefläche, die ihrerseits beispielsweise bei etwa -50°C vorgekühlt wurde.
  • Es schließt sich ein Einfrieren bei etwa -70°C und Atmosphärendruck an, zum Beispiel für eine Dauer von drei bis vier Stunden. Bei einer anschließenden Trocknung im Vakuum über mehrere Stunden, beispielsweise etwa 14 Stunden, wird die Umgebungstemperatur erhöht, vorzugsweise in Schritte von etwa 0,1°C / Minute, bis eine Temperatur von etwa 25°C erreicht wird, die dann konstant gehalten wird. Dieser Verfahrensschritt wird bei einem Umgebungsdruck von etwa 0,4mbar ausgeführt. Das beschriebene Verfahren kann beispielsweise mit einem Cholesterol-Reagenz durchgeführt werden, welches eine oberflächenaktive Substanz enthält.
  • Mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens ist es möglich, ein oder mehrere Reagenzien in getrockneter Form innerhalb der mikrofluidischen Struktur des mikrofluidischen Systems mit einer gewünschten Verteilung bereitzustellen, zum Beispiel einer im Wesentlichen homogenen Verteilung. Das Aufgeben der Reagenzlösung oder -suspension ermöglicht ein leichtes Eindringen des oder der Reagenzien in die Mikrostruktur. Anschließend wird dann die Trocknung mittels Lyophilisierung durchgeführt.

Claims (7)

  1. Verfahren zum Bereitstellen eines getrockneten Reagenz in einem mikrofluidischen System, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
    - Bereitstellen eines mikrofluidischen Systems, welches eine mikrofluidische Struktur aufweist,
    - Einbringen eines ein Reagenz enthaltenen, fließfähigen Trägermediums in der mikrofluidischen Struktur und
    - Trocknen des Reagenz in der mikrofluidischen Struktur mittels Lyophilisieren,
    dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Einbringen des fließfähigen Trägermediums die mikrofluidische Struktur thermisch behandelt wird, derart, dass die thermische Behandlung die Einlagerung des Reagenz in der mikrofluidischen Struktur gezielt beeinflusst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass beim Einbringen des fließfähigen Trägermediums die mikrofluidische Struktur thermisch behandelt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Struktur bei der thermischen Behandlung gekühlt wird.
  4. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidische Struktur bei der thermischen Behandlung beheizt wird.
  5. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz in der mikrofluidischen Struktur mit einer im Wesentlichen homogenen Verteilung eingelagert wird.
  6. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das fließfähige Trägermedium ein oder mehrere Tenside und / oder einen oder mehrere Füllstoffe enthält.
  7. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein mikrofluidisches System ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Systemen bereitgestellt wird: mikrofluidisches Testelement und mikrofluidischer Chip.
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