ES2169219T5 - Aditivos alimenticios para animales que comprenden xilanasa. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A ADITIVOS PARA ALIMENTOS ANIMALES; DICHOS ADITIVOS INCLUYEN UN MONOCOMPONENTE XILANASA DERIVADO DE UNA CEPA DE HUMICOLA, UNA CEPA DE THERMOASCUS, UNA CEPA DE CHAETOMIUM, UNA CEPA DE MUCOR, UNA CEPA DE TALAROMYCES, UNA CEPA DE MALBRANCHEA, UNA CEPA DE MYCELIOPHTHORA, UNA CEPA DE THIELAVIA, UNA CEPA DE BYSSOCHLAMUS, O UNA CEPA DE PAECILOMYCES. EN OTROS ASPECTOS, LA INVENCION SE REFIERE A PREPARADOS DE MONOCOMPONENTE XILANASA, ESTRUCTURAS DE ADN, VECTORES DE EXPRESION RECOMBINANTE, CELULAS HOSPEDADORAS, Y METODOS PARA PRODUCIR PREPARADOS DE MONOCOMPONENTE XILANASA.
Description
Aditivos alimenticios para animales que
comprenden xilanasa.
La presente invención se refiere a aditivos
alimenticios para animales, dichos aditivos comprendiendo una
xilanasa según la reivindicación 1.
A menudo los tipos y cantidades de materias
primas vegetales que se pueden emplear a modo de componentes en
piensos para animales serán limitados según la capacidad de dichos
animales para digerirlas. Las enzimas mejoradoras para alimentos
son enzimas, normalmente de origen microbiano, que al mejorar la
digestibilidad de los alimentos son capaces de incrementar la
eficiencia de su utilización.
Las enzimas xilanolíticas (EC 3.2.1.8) son bien
conocidas como enzimas mejoradoras para alimentos. Se ha informado
sobre xilanasas obtenidas a partir de cepas de Bacillus,
Aspergillus, Trichoderma y Acreinonium.
Asimismo, se ha comercializado una preparación enzimática obtenida
por fermentación sumergida de Humicola insolens
(Bio-Feed^{TM} Plus, proporcionada por Novo
Nordisk NS, Dinamarca).
Se han descrito preparaciones con xilanasa
obtenidas a partir de cepas del hongo Thermomyces
lanuginosus (sinónimo de Humicola lanuginosa) [ver,
Lischnig T, Purkarthofer H y Steiner W; Biotechnology Letters 1993
15 (4) 411-414; Gomes J, Purkarthofer H, Hayn M,
Kapplmüller J, Sinner M y Steiner W, Appl. Microbiol. Biotechnol.
1993 39 700-707]. Sin embargo, nunca se ha descrito
el uso de una xilanasa Thermomyces lanuginosus como una
enzima mejoradora para alimentos.
Además, todas las preparaciones con xilanasa
descritas en la técnica precedente se refieren a preparaciones
enzimáticas complejas que incluyen componentes enzimáticos
múltiples. No se ha descrito las preparaciones con xilanasa de un
único componente derivadas de Thermomyces a través de la
tecnología del ADN recombinante.
En muchas aplicaciones, el uso de preparaciones
enzimáticas complejas se considera provechoso debido a un efecto
sinergístico que surge de la acción cooperante de los múltiples
componentes. En el caso de algunas aplicaciones, p. ej., la
conversión de la lignocelulosa en combustible o materias primas
líquidas, el procesamiento de alimentos y, en particular, el
incremento de la digestibilidad de alimentos para animales, se
considera que una mezcla de enzimas xilanolíticas y celulíticas
proporcionan un rendimiento óptimo [Alam M, Gomes I, Mohiuddio G,
& Hoq M M; Enzyme Microb. Technol. 1994 16
298-302].
La presente invención provee: un aditivo
alimenticio para animales; una pre-mezcla de pienso
para animales; un proceso para preparar pienso para animales; y
usos de una xilanasa como se define en las reivindicaciones
ane-
xas.
xas.
Según la presente invención, se ha hallado que,
en comparación con las enzimas mejoradoras para alimentos
convencionales, la xilanasa derivada de Thermomyces
lanuginosus es una excelente enzima mejoradora para alimentos
que presenta una mejora significativa en la utilización de los
alimentos cuando se añade a piensos para animales. Asimismo, debido
a su excelente termoestabilidad, la preparación con xilanasa
derivada de Thermomyces lanuginosus resulta particularmente
adecuada para su procesamiento en aditivos alimenticios bajo
condiciones que eviten las infecciones microbianas, en particular
la infección por Salmonella. También se ha hallado que la
xilanasa derivada de Thermomyces lanuginosus ejerce una
reducción significativa en la viscosidad de la digesta, cosa que
implica una mejora significativa en la eficiencia de conversión de
los piensos para pollos.
Finalmente, se ha hallado sorprendentemente que
la xilanasa Thermomyces producida por recombinación es
significativamente más termoestable que la xilanasa nativa, cosa
que hace que la xilanasa producida por recombinación resulte
particularmente adecuada para ser procesada en aditivos
alimenticios bajo condiciones que eviten las infecciones
microbianas, en particular la infección por Salmonella.
El texto de la presente solicitud describe una
preparación con xilanasa de un único componente, cuyo componente
con xilanasa se obtiene mediante técnicas de ADN recombinante a
partir de una cepa de Thermomyces o un género
relacionado.
En consecuencia, en su primer aspecto, el texto
de la presente solicitud describe un aditivo alimenticio para
animales, dicho aditivo comprendiendo una xilanasa de un único
componente derivada de una cepa de Humicola.
En otro aspecto, el texto de la presente
solicitud describe una preparación con xilanasa de un único
componente, en cuya preparación el componente de la xilanasa se
deriva de una cepa de Humicola.
En otro aspecto, el texto de la solicitud
describe un constructo de ADN que incluye una secuencia de ADN que
codifica un componente de xilanasa, cuya secuencia de ADN
comprende:
- a)
- la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o la secuencia de ADN que se puede obtener a partir del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133; o
- b)
- una secuencia de ADN análoga a la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener a partir del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133, cuya secuencia de ADN análoga es o bien
- i)
- homóloga en, como mínimo, un 80% a la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener a partir del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133; o
- ii)
- codifica un polipéptido que es, como mínimo, homólogo en un 80 0/0 al polipéptido codificado mediante la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener a partir del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133.
En otros aspectos, el texto de la solicitud
describe un vector de expresión que alberga un constructo de ADN
según la invención, una célula huésped que incluye dicho constructo
de ADN o vector de expresión y un método para producir una
preparación con xilanasa de un único componente según la invención,
cuyo método comprende cultivar dicha célula huésped bajo
condiciones que permitan la producción de la enzima y la
recuperación de la enzima del cultivo.
La presente invención se ilustra con mayor
detalle al hacer referencia a los dibujos anexos, en los que:
La Figura 1 muestra la actividad xilanolítica
relativa (%) de una xilanasa de un único componente, determinada a
30ºC en un margen de pH de entre 2.5-9. Parece ser
que la enzima presenta un pH óptimo en el margen de
4.5-7.5, más específicamente el margen de entre
5.0-6.5, en torno a un pH de 6;
La Figura 2 muestra la actividad xilanolítica
relativa (%) de una xilanasa de un único componente, determinada a
un pH 5.5 en el margen de entre 30 y 80ºC. Parece ser que la enzima
presenta una temperatura óptima en el margen de entre
50-70ºC, en torno a los 60ºC;
La Figura 3 muestra la actividad residual
relativa (%) de la xilanasa de un único componente (I) en
comparación con aquella de la preparación con la xilanasa
Thermomyces lanuginosus nativa (II). Se ha determinado la
actividad residual a un pH 6.0 tras la incubación durante 60 minutos
a 60, 65, 70 y 75ºC, respectivamente.
La Figura 4 muestra los resultados de una
comparación sobre la eficiencia de la reducción en la viscosidad
del trigo entre una xilanasa Thermomyces lanuginosus nativa
(\bullet) y una preparación enzimática de varios componentes
obtenida al cultivar la Humicola insolens (x) (dosificación
(FXU/g de trigo) en la muestra);
La Figura 5 muestra los resultados de una
comparación sobre la eficiencia de la reducción en la viscosidad
del trigo entre una xilanasa de un único componente Thermomyces
lanuginosus producida por recombinación (I) y una xilanasa
Thermomyces lanuginosus nativa (II) (dosificación (FXU/g de
trigo) en la muestra);
La Figura 6 muestra el valor AMEn del trigo
(MJ/kg) en función de la adición de la xilanasa (FXU/kg de
alimento); (A) preparación de la xilanasa de un único componente
Thermomyces lanuginosus; (B) preparación de la xilanasa
Thermomyces lanuginosus nativa; (C) referencia
(Bio-Feed Plus CT, producto de Novo Nordisk NS,
Dinamarca; una preparación enzimática de varios componentes
obtenida al cultivar Humicola insolens); y
La Figura 7 muestra la digestión de grasa (%) en
la dieta experimental, en función de la adición de la xilanasa
(FXU/kg de alimento); (A) preparación de la xilanasa de un único
componente Thermomyces lanuginosus; (B) preparación de la
xilanasa Thermomyces lanuginosus nativa; (C) referencia
(Bio-Feed Plus CT, producto de Novo Nordisk A/S
Dinamarca; una preparación enzimática de varios componentes
obtenida al cultivar Humicola insolens).
Al añadirse a alimentos para animales, las
enzimas mejoradoras para alimentos mejoran la ruptura in vivo del
material de la pared celular de las plantas en parte debido a una
reducción en la viscosidad intestinal (Bedford et al.,
Proceedings of the 1st Symposium on Enzymes in Animal Nutrition,
1993, págs. 73-77), con lo que se consigue que el
animal obtenga una mejor utilización de los nutrientes vegetales.
De ese modo, se logra mejorar el índice de crecimiento y/o nivel de
conversión de los alimentos (es decir, el peso de alimento ingerido
en relación al aumento de peso) del animal.
En el contexto de la presente invención, un
aditivo alimenticio para animales es una preparación enzimática que
incluye una o más enzima(s) mejoradora(s) para
alimentos, así como soportes adecuados y/o excipientes, y cuya
preparación enzimática se establece en una forma adecuada para ser
añadida al alimento para animales. El aditivo alimenticio para
animales según la invención se puede preparar según los métodos
conocidos en la técnica y puede presentarse en forma de preparación
seca o líquida. La enzima a incluir en la preparación puede
estabilizarse opcionalmente según los métodos conocidos en la
técnica.
En el contexto de la presente invención, un
aditivo alimenticio para animales que comprende una xilanasa de un
único componente es una preparación enzimática establecida en una
forma adecuada para ser añadida al alimento para animales, en cuya
preparación esencialmente toda la actividad xilanolítica (es decir,
la actividad xilanolítica detectable) se debe a un único componente
de xilanasa.
El aditivo alimenticio para animales según la
invención puede ser un producto enzimático granulado que puede
mezclarse fácilmente con otros componentes alimenticios o, más
preferiblemente, a partir de un componente de una mezcla previa. El
producto enzimático granulado puede estar revestido o no revestido.
Se prefiere que el tamaño de partícula de los granulados
enzimáticos sea compatible con el de los componentes alimenticios y
el de la mezcla previa. Esto proporciona un medio seguro y
conveniente para incorporar las enzimas a los alimentos.
Además, el aditivo alimenticio para animales
según la invención puede ser una composición líquida estabilizada,
que puede ser una pasta acuosa o a base de aceite.
El aditivo alimenticio para animales según la
invención puede ejercer su efecto bien in vitro (al
modificar los componentes alimenticios) o bien in vivo. El aditivo
alimenticio según la invención resulta particularmente adecuado para
añadirlo a composiciones de alimentos para animales que contengan
elevadas cantidades de arabinoxilanos y glucuronoxilanos, por ej.,
alimentos que contengan cereales como la cebada, el trigo, el
centeno, la avena o el maíz.
La presente invención proporciona un aditivo
alimenticio para animales como se describe en la reivindicación
1.
En una forma de realización preferida, el
aditivo alimenticio para animales según la invención comprende una
xilanasa de un único componente derivada de una cepa de
Thermomyces, en particular, de una cepa de Thermomyces
lanuginosus, aunque se prefiere que sea una cepa de
Thermomyces lanuginosus, DSM 4109, o su mutante o
variante.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, la xilanasa de un único
componente se deriva de una célula huésped que transporta el gen
que codifica el componente de la xilanasa. En particular la
xilanasa de un único componente puede estar
- a)
- codificada por la secuencia de ADN presentada como ID de SEC N: 1, o por la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa de Sacaromyces cerevisiae DSM 10133; o
- b)
- codificada por una secuencia de ADN análoga a la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133, cuya secuencia de ADN análoga es o bien
- i)
- como mínimo homóloga en un 80% a la xilanasa que codifica que parte de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133; o
- ii)
- codifica un polipéptido que, como mínimo, es homólogo en un 80% al polipéptido codificado por la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133; o
\vskip1.000000\baselineskip
En otras formas de realización preferidas, la
xilanasa de un único componente puede caracterizarse, además, por
el hecho de que
- a)
- presenta una actividad enzimática residual superior a un 96% tras la incubación durante 60 minutos a un pH 6.0 y 60ºC;
- b)
- presenta una actividad enzimática residual superior a un 83% tras la incubación durante 60 minutos a un pH 6.0 y 65ºC;
- c)
- presenta una actividad enzimática residual superior a un 20% tras la incubación durante 60 minutos a un pH 6.0 y 70ºC; y/o
- d)
- presenta una actividad enzimática residual superior a un 10% tras la incubación durante 60 minutos a un pH 6.0 y 75ºC.
Tal y como se define en la presente, se pretende
que una secuencia de ADN análoga a la parte que codifica la
xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1
haga referencia a cualquier secuencia de ADN que codifique una
enzima xilanolítica, dicha enzima presentando una o más de las
propiedades mencionadas en los apartados (i)-(iv), arriba.
La secuencia de ADN análoga se puede aislar
preferiblemente de otros organismos que produzcan el componente de
la xilanasa u organismos relacionados (p. ej., el mismo), basándose
en la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN
mostrada en la ID de SEC Nº: 1, o una subsecuencia adecuada (como,
por ejemplo, de 20-500 bp) derivada, por ej., al
emplear los procedimientos descritos aquí y, de este modo, por ej.,
ser una variante alela o de una especie de la secuencia de ADN que
comprende la secuencia de ADN presentada aquí.
De forma alternativa, la secuencia análoga se
puede construir en base a la parte que codifica la xilanasa de la
secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o cualquier
subsecuencia derivada, por ej., al introducir sustituciones
nucleótidas que no originen otra secuencia de aminoácidos de la
enzima xilanolítica codificada mediante la secuencia de ADN, pero
que se corresponda al uso del codón del organismo huésped destinado
a producir la enzima o al introducir sustituciones nucleótidas que
puedan originar una secuencia de aminoácidos diferente.
Al llevar a cabo las sustituciones nucleótidas,
se prefiere que los cambios aminoácidos sean de naturaleza menor es
decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos que no influyan
significativamente sobre el plegado de proteínas o la actividad
proteínica, pequeñas eliminaciones, normalmente entre uno y
aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones de los
terminales amino o carboxilo, como un residuo de metionina
aminoterminal, un péptido de enlace pequeño de hasta aproximadamente
20-25 residuos o una pequeña extensión que facilite
la purificación, como por ejemplo un tracto de polihistidina, un
epítopo antigénico o un dominio de enlace. Algunos ejemplos de
sustituciones conservadoras se encuentran dentro del grupo de
aminoácidos básicos (como la arginina, la lisina y la histidina),
aminoácidos acídicos (como el ácido glutámico y el ácido aspártico),
aminoácidos polares (como la glutamina y la asparraguina),
aminoácidos hidrofóbicos (como la leucina, la isoleucina y la
valina), aminoácidos aromáticos (como la fenilalanina, el
triptófano y la tirosina) y aminoácidos menores (como la glicina,
la alanina, la serina, la treonina y la metionina). Para una
descripción general de la sustitución nucleótida ver, por ej., Ford
et al., Protein Expression and Purification, 2 1991
95-107.
A los expertos en la materia les resultará
evidente que este tipo de sustituciones se pueden llevar a cabo
fuera de las regiones fundamentales para la función de la molécula
y que, aún así, pueden tener como resultado una enzima xilanolítica
activa. Los aminoácidos esenciales de la actividad de la xilanasa
codificada mediante el constructo de ADN según la invención y, en
consecuencia, preferiblemente sujetas a sustitución, se pueden
identificar según los procedimientos conocidos en la técnica, como
la mutagénesis dirigida o la mutagénesis de escaneado de alanina
(ver, p. ej., Cunningham y Wells, Science 1989 244
1081-1085). En esta última técnica, se introducen
mutaciones en cada residuo de la molécula y se somete a examen las
moléculas mutantes resultantes para detectar la actividad biológica
(es decir, proteolítica) para identificar los residuos aminoácidos
fundamentales para la actividad molecular. Los lugares de
interacción sustrato-enzima también se pueden
determinar mediante un análisis de la estructura cristalina según se
determina mediante este tipo de técnicas como el análisis de
resonancia magnética nuclear, la cristalografía o el marcado por
fotoafinidad (ver, por ej., de Vos et al., Science 1992 255
306-312; Smith et al., J. Mol. Biol. 1992 224
899-904; Wlodaver et al., FEBS Lett. 1992
309 59-64).
Se entenderá que la parte que codifica la
xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o
cualquier subsecuencia derivada, se puede emplear como ensayos para
aislar la secuencia de ADN completa que codifica la enzima
xilanolítica, por ej., la secuencia de ADN presentada como ID de
SEC Nº: 1.
La homología a la que se hace referencia en i)
se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias
que indican una derivación de la primera secuencia con respecto a
la segunda. La homología se puede determinar de forma idónea
mediante programas informáticos conocidos en la materia como GAP
establecidos en el paquete del programa GCG (Needleman S B &
Wunsch C D; J. Mol. Biol. 1970 48 443-453). Uso del
GAP con las siguientes disposiciones para comparar la secuencia de
ADN: penalización de creación GAP de 5.0 y penalización de
extensión GAP de 0.3, la zona de codificación de la secuencia de
ADN muestra un grado de identidad preferiblemente de al menos un
70%, en particular al menos de un 80%, al menos del 85%, al menos
del 90% o incluso al menos del 95% en relación a la zona de
codificación de la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de
ADN mostrada en la ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se
puede obtener del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae
DSM
10133.
10133.
Se pretende que la hibridación a la que se hace
referencia en (ii) indique que la secuencia de ADN análoga hibrida
la misma muestra de oligonucleótido que la secuencia de ADN que
codifica el componente de xilanasa bajo determinadas condiciones
especificadas descritas con detalle en la sección sobre materiales
y métodos, a continuación. La muestra se puede construir de manera
conveniente en base a la parte que codifica la xilanasa de la
secuencia de ADN de la ID de SEC Nº 1, o una subsecuencia derivada
que codifica al menos 6-7 aminoácidos de la enzima,
o en base a la secuencia de aminoácidos deducida que se muestra en
la ID de SEC Nº 2. En este último caso, la muestra se obtiene a
partir de una subsecuencia aminoácida que se corresponde a un alto
número de codones degenerados inferiores.
Normalmente, la secuencia de ADN análoga es
altamente homóloga a la secuencia de ADN en, al menos, un 70% a la
secuencia que se muestra en la ID de SEC Nº: 1 que codifica un
componente de xilanasa según la invención, preferiblemente al menos
en un 80%, en particular al menos en un 85%, aunque se prefiere que
sea al menos en un 90% o incluso como mínimo que sea homóloga en un
95% a la secuencia que se muestra en la ID de SEC Nº: 1.
El grado de homología al que se hace referencia
en (iii) arriba se determina como el grado de identidad entre las
dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia
en relación a la segunda. La homología se puede determinar de forma
idónea mediante programas informáticos conocidos en la materia
como, por ej., el GAP establecido en el paquete del programa GCG
(Needleman S B & Wunsch C D; J. Mol. Biol., 1970 48
443-453). Uso del GAP con las siguientes
disposiciones para comparar la secuencia polipéptida: penalización
de creación GAP de 3.0 y penalización de extensión GAP de 0.1, el
polipéptido codificado mediante una secuencia de ADN análoga muestra
un grado de identidad preferiblemente de, como mínimo, un 70%, en
particular como mínimo de un 80%, aunque se prefiere que sea como
mínimo de un 85%, al menos de un 90% o incluso como mínimo de un
95%, en relación a la enzima codificada mediante un constructo de
ADN que comprende la parte que codifica la xilanasa de la secuencia
de ADN que se muestra en la ID de SEC Nº: 1 o la secuencia de ADN
que se puede obtener del plásmido de la cepa Sacaromyces
cerevisiae DSM 10133.
Según el método descrito anteriormente, la
homología del ADN de la xilanasa según la invención contra la mayor
parte de las xilanasas de la técnica precedente se determinó al
emplear el programa informático GAP. La xilanasa según la invención
mostró sólo una homología del 63% en el ADN en relación con la
xilanasa I de Trichoderma reesei (Torronen A et al.,
Biotechnology 1992 10 111461-1465) y una homología
del 63% en el ADN en relación a una xilanasa I de Cochliobolus
carbonum (Apel P C et al; Mol. Plan Microb. Interact.
1993 6 467-473).
Se pretende que el término "derivado de" en
conexión con la propiedad (iv) anteriormente mencionada no sólo
haga referencia a un componente de xilanasa producida mediante la
cepa Thermomyces lanuginosus, DSM 4109, sino también un
componente de xilanasa codificado mediante una secuencia de ADN
aislada de esta cepa y producida en una célula huésped transformada
con dicha secuencia de ADN. La reactividad inmunológica se puede
determinar a través del método descrito en la sección de materiales
y métodos que sigue a continuación.
En otra forma de realización preferida, el
aditivo alimenticio de la invención puede comprender enzimas
mejoradoras de alimentos adicionales.
En el contexto de la presente invención, las
enzimas mejoradoras de alimentos comprenden, aunque no se limitan
sólo a éstas, las \alpha-galactosidasas,
\beta-galactosidasas, en particular las lactasas,
fitasas, \beta-glucanasas, en particular las
endo-\beta-1,4-glucanasas
y las
endo-\beta-1,3(4)-glucanasas,
las xilanasas, xilosidasas, galactanasas, en particular las
endo-1,4-\beta-galactosidasas
de arabinogalactano y las
endo-1,3-\beta-galactosidasas
de arabinogalactano, las endoglucanasas, en particular la
endo-1,2-\beta-glucanasa,
la
endo-1,3-\alpha-glucanasa
y la
endo-1,3-\beta-glucanasa,
enzimas que degradan la pectina, en particular las pectinasas,
pectinesterasas, pectin liasas, poligalacturonasas, arabinanasas,
ramnogalacturonasas, esterasas acetílicas de ramnogalacturonano,
ramnogalacturonan-\alpha-ramnosidasa,
pectato liasas y \alpha-galacturonisidasas,
mananasas, \beta-manosidasas, esterasas
acetílicas de manano, esterasas acetílicas de xilano, proteasas y
enzimas lipolíticas como, por ejemplo, las lipasas y las
cutinasas.
La presente invención se refiere a un aditivo
alimenticio para animales, dicho aditivo incluyendo una xilanasa
derivada de una cepa que pertenece al grupo de hongos termófilos,
es decir, Thermomyces, o un género relacionado.
El género Thermomyces, que engloba varias
especies [Appinis & Eggins; 1966], más específicamente la
especie Thermomyces lanuginosus (sinónimo de Humicola
lanuginosa), se ha asociado tradicionalmente con el grupo de
hongos termofílicos [Cooney & Emerson; 1964]. Se ha demostrado
que varios de los géneros que pertenecen a este grupo, por ej., la
especie de Humicola, Thermoascus, Chaetomium,
Mucor, Talaromyces, Malbranchea,
Myceliophthora y Thielavia, [Cooney & Emerson;
1964] son productores de enzimas muy potentes. También se han
asociado a este grupo la Byssochlamus y la
Paecilomyces.
La afiliación taxonómica de Thermomyces
generalmente se reconoce como incierta. Sin embargo, la base de
datos Entrez del National Institute of Health (instituto Nacional
de Sanidad) (actualizada en enero de 1996) clasifica la
Thermomyces como una Pyrenomycete mitospórica (es
decir, una Pyrenomycete que sólo se caracteriza de forma
incompleta, sin dar información suficiente como para asociarla ni a
una orden específica ni a una familia específica).
Los estudios moleculares más recientes han
tratado de dilucidar la secuencia 18S-RNA de
Thermomyces con el objetivo de emplear esta información para
seguir clarificando la relación filogenética de este género. La
posible interpretación de los datos disponibles sugiere que la
Thermomyces se afilia más de cerca a los hongos reagrupados
bajo el nombre de Plectomycetes, en particular bajo el de
Erotiales. A través de la búsqueda de homología en la base
de datos, la secuencia 18S-RNA de
Byssochlamus es la secuencia más relacionada con la
secuencia descrita de Thermomyces lanuginosus (Novo Nordisk
1996, datos inéditos). Si los estudios de casos más aislados que
pertenecen al género Thermomyces apoyan las conclusiones
preliminares, también podrían apoyar una transferencia del género
Thermomyces a la orden Plectomycetes. En consecuencia,
la presente invención también se refiere a preparaciones con
xilanasa derivadas de Plectomycetes, más en particular de
Erotiales.
Se llevó a cabo una búsqueda de homología con la
xilanasa según la invención contra las bases de datos de
nucleótidos y proteínicas. La búsqueda de homología mostró que las
xilanasas más relacionadas eran la xilanasa I de Trichoderma
reesei y la xilanasa I de Cochliobolus carbonum. Ambas
xilanasas pertenecen a familia 11 de las glicosil hidrolasas
(Henrissat B; Biochem. J. 1991 280 309-316), cosa
que indica que la xilanasa según la invención también pertenece a
esta familia.
Se han depositado las diferentes muestras de
Thermomyces lanuginosus y se encuentran disponibles al
público en las autoridades depositarias internacionales reconocidas
por el Tratado de Budapest, por ej., la American Type Culture
Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,
EEUU. Se ha depositado una cepa de Thermomyces lanuginosus
según el Tratado de Budapest en el International Recognition of the
Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure de la
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Cellkulturen (DSM),
Mascheroder Weg 1b, DE-3300 Braunschweig, Alemania,
el 4 de mayo de 1987 y se le ha asignado el Nº de registro DSM
4109.
Se depositó una cepa de Sacaromyces
cerevisiae DSM 10133, que contenía el ADN del plásmido que
comprende la secuencia de ADN de longitud completa presentada como
ID de SEC Nº: 1, y que codifica la endoglucanasa según la
invención, en el vector de la levadura pYES 2.0, según el Tratado de
Budapest en el International Recognition of the Deposit of
Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure de la Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen and Cellkulturen (DSM), Mascheroder
Weg lb, DE-3300 Braunschweig, Alemania, el 19 de
julio de 1995 y se le asignó el Nº de registro DSM 10133.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto más, el texto de la solicitud
describe un constructo de ADN que incluye una secuencia de ADN que
codifica un componente de xilanasa, dicha secuencia de ADN
incluyendo:
- a)
- la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133; o
- b)
- una secuencia de ADN análoga a la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener a partir del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133, cuya secuencia de ADN análoga es o bien
- i)
- homóloga en, al menos, un 80% a la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133; o
- ii)
- codifica un polipéptido que es homólogo en, al menos, un 80% al polipéptido codificado por la secuencia de ADN presentada como ID de SEC Nº: 1, o a la secuencia de ADN que se puede obtener a partir del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133.
Tal y como se define aquí, el término
"constructo de ADN" se pretende que haga referencia a
cualquier molécula de ácido nucleico de origen ADNc, ADN genómico,
ADN o ARN sintético. Se pretende que el término "constructo"
haga referencia a un segmento del ácido nucleico que puede ser mono
o bicatenario y que se puede basar en una secuencia nucleótida
completa o parcial que codifique la xilanasa de interés. El
constructo puede contener opcionalmente otros segmentos de ácido
nucleico.
El constructo de ADN que codifica la enzima
xilanolítica puede ser idóneamente de origen genómico o ADNc, por
ejemplo, cuando se obtiene al preparar una biblioteca genómica o de
ADNc y al seleccionar las secuencias de ADN que codifican por
hibridación todas las enzinias xilanolíticas o parte de éstas
usando muestras de oligonucleótido sintético según las técnicas
estándares (ver, por ej., Sambrook et al.,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
NY, 1989).
El constructo de ácido nucleico que codifica el
xilanolítico también se puede preparar de forma sintética a través
de los métodos estandares establecidos, por ej., el método de la
fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters
1981 22 1859-1869, o el método descrito por Matthes
et al., EMBO Journal 1984 3 801-805. Según el
método de la fosfoamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, p.
ej. en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se anelan,
se ligan y se clonan en vectores adecuados.
Además, el constructo de ácido nucleico puede
ser de origen mixto sintético y genómico, sintético y de ADNc o
genómico y de ADNc preparado al ligar los fragmentos de origen
sintético, genómico o de ADNc (según resulte apropiado), los
fragmentos correspondientes a diferentes partes del constructo de
ácido nucleico completo, según las técnicas estandares.
El constructo de ácido nucleico también se puede
preparar mediante reacción en cadena de la polimerasa al emplear
cebadores específicos como, por ejemplo, los descritos en la US
4,683,202 o por Saiki et al., Science 1988 239
487-491.
La secuencia de ADN que codifica un componente
de xilanasa puede derivar de una cepa de Humicola, una cepa
de Thermoascus, una cepa de Chaetomium, una cepa de
Mucor, una cepa de Talromyces, una cepa de
Maibranchea, una cepa de Myceliophthora, una cepa de
Thielavia, una cepa de Byssachlamus o una cepa de
Paecilomyces.
En una forma de realización preferida, la
secuencia de ADN que codifica el componente de xilanasa se deriva
de una cepa de Thermomyces, más en particular una cepa de
Thermomyces lanuginosus. En la forma de realización
preferida, la secuencia de ADN se deriva o se produce de una
biblioteca de ADN de Thermomyces lanuginosus, DSM 4109, o su
mutante o variante.
La secuencia de ADN que codifica la enzima
xilanolítica se puede aislar a través de métodos convencionales;
dichos métodos normalmente implican:
- -
- clonar, en un vector adecuado, una biblioteca de ADNc, p. ej., de la cepa Thermomyces lanuginosus, DSM 4109, o del plásmido de la cepa Sacaromyces cerevisiae DSM 10133,
- -
- transformar una célula huésped adecuada con dicho vector,
- -
- cultivar la célula huésped bajo condiciones adecuadas para expresar la enzima xilanolítica deseada codificada por uno o más clones en la biblioteca de ADNc,
- -
- seleccionar los clones positivos para determinar cualquier actividad xilanolítica de la enzima producida por este tipo de clones, y
- -
- aislar el ADN que codifica la enzima xilanolítica deseada a partir de este tipo de clones.
Se ha descrito un método general en la WO
93/11249, cuyo contenido se incorpora aquí como referencia. En el
Ejemplo 1 a continuación se encuentra una descripción más detallada
del método de selección.
La secuencia de ADN que codifica un componente
de xilanasa se puede aislar, por ejemplo, al seleccionar una
biblioteca de ADNc de una cepa de Thermomyces lanuginosus y
seleccionar los clones que expresan la enzima xilanolítica (por
ej., en el modo definido por la capacidad de la enzima para
hidrolizar los enlaces
1,4-\beta-xilosídicos en
1,4-\beta-xilanos). A
continuación, se puede aislar la secuencia de ADN apropiada del
clon a través de los procedimientos estandares, por ej., como el
descrito en el Ejemplo 1.
En una forma de realización preferida en la
actualidad, el constructo de ácido nucleico comprende la parte que
codifica la xilanasa de la secuencia de ADN que se muestra en la ID
de SEC Nº: 1, en cualquier subsecuencia derivada, pero que difiere
de la secuencia de ADN que se muestra en la ID de SEC Nº: 1 en lo
que se refiere a la degeneración del código genético. La invención
comprende, además, secuencias de ácidos nucleicos que hibridan una
molécula de ácido nucleico (bien genómico, sintético o de ADNc o
ARN) que codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en la
ID de SEC Nº: 2, o cualquier subsecuencia derivada, bajo las
condiciones descritas a continuación.
En otro aspecto, la invención establece un
vector de expresión recombinante que incluye el constructo de ADN
según la invención.
El vector de expresión recombinante según la
invención puede ser cualquier vector que pueda someterse de manera
conveniente a procedimientos de ADN recombinante y la elección de
dicho vector a menudo depende de la célula huésped en la que se
debe introducir. En consecuencia, el vector puede ser un vector de
replicación autónomo, es decir, un vector que existe como entidad
extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej., un plásmido. De forma alternativa,
el vector puede ser un vector que, al introducirlo en una célula
huésped, se integre en el genoma huésped celular y se replique
junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que
se haya
integrado.
integrado.
En el vector de expresión según la invención, se
prefiere que la secuencia de ADN que codifica la enzima
xilanolítica se enlace de forma que se pueda operar con los
segmentos adicionales necesarios para la trascripción del ADN. En
general, el vector de expresión se deriva de ADN plásmido o viral o
bien puede contener elementos de ambos. El término "enlazado de
forma que se pueda operar" indica que los segmentos se disponen
de modo que funcionen de acuerdo con los objetivos pretendidos, por
ej., la trascripción comienza en un promotor y continúa a través de
la secuencia de ADN que codifica la enzima xilanolítica.
En consecuencia, en el vector de expresión según
la invención, la secuencia de ADN que codifica la enzima
xilanolítica se conectaría de forma que se pudiera operar a un
promotor adecuado y a una secuencia de terminación.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN
que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de
elección y pueda derivarse de genes que codifiquen proteínas bien
homólogas o bien heterólogas a la célula huésped.
Algunos ejemplos de promotores adecuados para
dirigir las trascripción del ADN que codifica la enzima
xilanolítica según la invención en células huésped bacterianas
incluyen el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacillus
stearothermophilus, el gen de la alfa-amilasa de
Bacillus licheniformis, el gen de amilasa BAN de Bacillus
amyloliquefaciens, el gen de la proteasa alcalina de
Bacillus subtilis o el gen de la xilosidasa o xilanasa de
Bacillus pumilus, o mediante los promotores P_{R} o
P_{L} del fago Lambda o los promotores lac, trp o
tac de E. Coli.
Algunos ejemplos de promotores adecuados para su
uso en células huésped de levadura incluyen los promotores de genes
glicolíticos de levadura (Hitzeman et al., J. Biol. Chem.
255 (1980), 12073-12080; Alber y Kawasaki, J. Mol.
Appl. Gen. 1 (1982), 419-434) o los genes de la
alcohol dehidrogenasa (Young et al., en Genetic Engineering
of Microorganisms for Chemicals (Hollaender et al, eds.),
Plenum Press, Nueva York 1982) o los promotores TPI1 (US
4,599,311) o ADH2-4c (Russell et al.,
Nature 304 (1983), 652-654).
Algunos ejemplos de promotores adecuados para su
uso en células huésped derivadas de un hongo filamentoso son, por
ejemplo, el promotor ADH3 (McKnight et al., The EMBO
J. 4 (1985), 2093-2099) o el promotor tpiA.
Entre los ejemplos de otros promotores útiles se encuentran los
derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de Aspergillus
oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la
\alpha-amilasa neutral de Aspergillus
niger, la \alpha-amilasa ácida estable de
Aspergillus niger, la glucoamilasa (gluA) de Aspergillus
niger o Aspergillus awamori, la lipasa de Rhizomucor
miehei, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la
isomerasa de fosfato triosa de Aspergillus oryzae o la
acetamidasa de Aspergillus nidulans. Se prefieren los
promotores TAKA-amilasa y
gluA.
gluA.
El vector de expresión también puede comprender
una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la
célula huésped en cuestión. El vector de expresión también puede
comprender un marcador seleccionable, por ej., un gen cuyo producto
complemente un defecto en la célula huésped, como el gen que
codifica la reductasa de dihidrofolato (DHFR) o el gen TPI de
Schizosaccharomyces pombe (descrito por Russell P R, Gene
1985 40 125-130) o un gen que confiera resistencia
a un medicamento, por ej., a la ampicilina, canamicina,
tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato.
En el caso de los hongos filamentosos, entre los marcadores
seleccionables se incluyen amdS, pyrC, argB,
niaD y sC.
Para dirigir la enzima xilanolítica hacia el
vehículo secretor de las células huésped, se puede introducir una
secuencia señal secretora (también conocida como secuencia guía,
preprosecuencia o presecuencia) en el vector de expresión. La
secuencia señal secretora se une a la secuencia de ADN que codifica
la enzima xilanolítica en el marco de lectura correcto. Las
secuencias señal secretoras normalmente se sitúan en la posición 5'
en la secuencia de ADN que codifica la enzima xilanolítica. La
secuencia señal secretora puede asociarse por lo general con la
enzima xilanolítica o puede derivarse de un gen que codifique otra
proteína segregada.
En una forma de realización preferida, el vector
de expresión puede comprender una secuencia señal secretora
sustancialmente idéntica a la señal secretora que codifica la
secuencia del gen de \alpha-amilasa del
Bacillus licheniformis, por ej., como se describe en la WO
86/05812.
Asimismo, se puede tomar las medidas para
amplificar la expresión, por ej., mediante técnicas de
amplificación en serie, que impliquen un entrecruzamiento simple o
doble, o mediante técnicas multicopia, por ej., como se describe en
la US 4,959,316 o en la WO 91/09129. De forma alternativa, el
vector de expresión puede incluir una temperatura origen de
replicación sensible, por ej., como se describe en la EP
283,075.
Los procedimientos para ligar las secuencias de
ADN que codifican la enzima xilanolítica, el promotor y
opcionalmente el terminador y/o secuencia señal secretora,
respectivamente y para insertarlas en vectores adecuados que
contengan la información necesaria para la replicación, son bien
conocidos por los expertos en la materia (ver, por ejemplo,
Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, NY. 1989).
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, el texto de la solicitud
describe una célula huésped que incluye el constructo de ADN según
la invención y/o el vector de expresión recombinante.
El constructo de ADN puede ser bien homólogo o
bien heterólogo en relación al huésped en cuestión. En caso de ser
homólogo a la célula huésped, es decir, producido por la célula
huésped en la naturaleza, éste normalmente se conectará de forma
que se pueda operar con otra secuencia promotora o, en caso de ser
aplicable, otra secuencia señal secretora y/o secuencia de
terminación diferente a la de su ambiente natural. En este contexto,
el término "homólogo" se pretende que incluya una secuencia
ADNc que codifica una enzima xilanolítica nativa en relación al
organismo huésped en cuestión. El término "heterólogo" se
pretende que incluya una secuencia de ADN no expresada por la
célula huésped en la naturaleza. En consecuencia, la secuencia de
ADN puede derivarse de otro organismo o puede ser una secuencia
sintética.
La célula huésped en la que hay que introducir
el constructo de ADN o el vector de expresión recombinante puede
ser cualquier célula que sea capaz de producir la enzima
xilanolítica e incluye bacterias, levadura, hongos y células
eucarióticas superiores.
Algunos ejemplos de células huésped bacterianas
que, tras el cultivo, son capaces de producir la enzima
xilanolítica según la invención son bacterias gram positivas como
las cepas de Bacillus, en particular una cepa de Bacillus
subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus
lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus
circulans, Bacillus lautus, Bacillus megatherium,
Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis o
Bacillus agaradherens, o cepas de Streptomyces, en
particular una cepa de Streptomyces lividans o
Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas como la
Echerichia coli. La transformación de las bacterias se puede
llevar a cabo transformando el protoplasto o empleando células
competentes conocidas en cierto modo per se (ver, Sambrook
et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, NY, 1989).
Cuando se expresa la enzima xilanolitica en
bacterias como la Escherichia coli, se puede retener la
xilanasa en el citoplasma, normalmente a modo de gránulos
insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión) o se puede dirigir
al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción
bacteriana. En el caso anterior, las células se lisifican y los
gránulos se recuperan y desnaturalizan. Tras esto se vuelve a
plegar la enzima xilanolítica diluyendo el agente desnaturalizante.
En el último caso, la enzima xilanolítica se puede recuperar del
espacio periplásmico dividiendo las células, por ej., mediante
sonicación o impacto osmótico, para liberar el contenido del espacio
periplásmico y recuperar la enzima xilanolitica.
Entre los ejemplos de células de levaduras
adecuadas se incluyen las células de Saccharomyces sp., en
particular las cepas de Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces kluyveri y Saccharomyces uvarum, las
células de Saccharomyces sp., como la Schizosaccharomyces
pombe, las células de Kluyveromyces, como la
Kluyveromyces lactis, las células de Hansenula, p.
ej., la Hansenula polymorpha, las células de Pichia,
p. ej., la Pichia pastoris (ver, Gleeson et al., J.
Gen. Microbiol. 132, 1986, págs. 3459-3465; US
4,882,279) y las células de Yarrowia sp. como la Yarrowia
lipolytica. Los métodos para transformar las células de
levadura con ADN heterólogo y para producir polipéptidos
heterólogos derivados aparecen descritos, por ej., en US 4,599,311,
US 4,931,373, US 4,870,008, 5,037,743 y US 4,845,075, todas ellas
incorporadas aquí como referencia. Las células transformadas se
seleccionan mediante un fenotipo determinado por un marcador
seleccionable, la resistencia común al medicamento o la capacidad
de crecer en ausencia de un nutriente particular, p. ej., la
leucina. Un vector preferido para su uso en levadura es el vector
POT1 descrito en US 4,931,373. La secuencia de ADN que codifica la
enzima xilanolítica según la invención puede ir precedida por una
secuencia señal y, opcionalmente, por una secuencia líder, p. ej.,
como la descrita anteriormente.
Algunos ejemplos de otras células micóticas son
células de hongos filamentosos, por ej., Aspergillus sp., en
particular las cepas de Aspergillus japonicus,
Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans o
Aspergillus niger, Neurospora sp., Fusarium
sp., en particular las cepas de Fusarium oxysporum o
Fusarium graminearum, o Trichoderma sp. Las células
micóticas se pueden transformar mediante un proceso que implica la
formación y transformación del protoplasto seguido de la
regeneración de la membrana celular conocida en cierto modo per
se. Se ha descrito el uso de Aspergillus sp. para
expresar proteínas, p. ej., en EP 272,277 y en EP 230,023. La
transformación de F. oxysporum puede, por ejemplo, llevarse
a cabo en el modo descrito por Malardier et al., Gene 1989
78 147-156. El uso de Aspergillus como
microorganismo huésped aparece descrito, p. ej., en EP 238 023, cuyo
contenido se incorpora aquí como referencia.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped es una cepa de Aspergillus oryzae.
En otro aspecto más, el presente texto de la
solicitud describe un método para producir la enzima xilanolítica
según la invención, en el que una célula huésped adecuada,
transformada mediante una secuencia de ADN que codifica la enzima
xilanolítica, se cultiva bajo condiciones que permiten la
producción de la enzima y la enzima resultante se recupera del
cultivo.
En otro aspecto, el presente texto de la
solicitud describe un método para producir una preparación con
xilanasa de un único componente, en el que se cultiva una célula
huésped adecuada transformada con una secuencia de ADN que codifica
la enzima bajo condiciones que permiten la producción del componente
de xilanasa, seguido de la recuperación de dicho componente de
xilanasa del cultivo.
En una forma de realización preferida, la
secuencia de ADN que codifica la enzima es un constructo de ADN
obtenido en el modo descrito anteriormente.
En otra forma de realización preferida, el
constructo de ADN se combina con una señal de expresión apropiada
en un vector de expresión como el descrito anteriormente.
En otra forma de realización preferida, la
célula huésped es una de las células descritas anteriormente.
El medio usado para cultivar las células huésped
transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para
el crecimiento de las células huésped en cuestión. La enzima
xilanolítica expresada puede segregarse de forma conveniente en el
medio de cultivo y se puede recuperar de éste a través de
procedimientos de purificación. Los procedimientos de purificación
bien conocidos incluyen la separación de las células del medio
mediante centrifugado o filtración, la precipitación de los
componentes proteínicos del medio mediante una sal como, por
ejemplo, sulfato amónico y métodos cromatográficos como, p. ej., la
cromatografía de intercambio iónico o la cromatografía de
afinidad.
La invención se ilustra con más detalle haciendo
referencia a los siguientes ejemplos que no se pretende de ningún
modo que limiten el objetivo de la invención según se
reivindica.
Se aisló el ARNm de Thermomyces
lanuginosus, DSM 4109, crecido en un xilano que contenía el
medio de fermentación removido para garantizar una aireación
suficiente. Se recogieron los micelios tras 3-5 días
de crecimiento, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y
se almacenaron a -80ºC.
La cepa de Saccharomyces cerevisiae usada
a continuación es JG169 (MAT\alpha; ura 3-52; leu
2-3, 112; his 3-D200; pep
4-113; prcl::HIS3; prbl:: LEU2; cir+).
Para llevar a cabo la expresión, se empleó el
plásmido pYES 2.0 de levadura comercialmente disponible
(Invitrogen).
El vector de expresión pHD414 de
Aspergillus es un derivado del plásmido p775, descrito en la
EP 238 023. La construcción de pHD414 aparece descrita, además, en
WO 93/11249.
La extracción del ARN total se llevó a cabo con
tiocianato guanidinio seguido de un ultracentrifugado a través de
una almohadilla de 5.7 M de CsCl y del aislamiento del
poli(A)+ANR por cromatografía de afinidad de
oligo(dT)-celulosa usando los procedimientos
descritos en WO 93/11249.
Se sintetizó el ADNc bicatenario a partir de 5
\mug de poli(A)+ARN mediante el método de la flibonucleasa
H (Gubler U, Hoffman B J, Gene 1983 25 263-269;
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 1989) usando la
modificación del tubo refrigerador. El procedimiento aparece
descrito, además, en WO 93/11249.
Tras haberlo tratado con la nucleasa de judía
mung, se hizo el extremo romo del ADNc ds con la ADN polimerasa T4
(Invitrogen) y se ligó el ADNc con los adaptadores BstX I no
palindrómicos (1 \mug/l, Invitrogen) según las instrucciones de
los fabricantes.
Se recuperó el ADNc ds adaptado al
centrifugarlo, lavarlo en un 70% de EtOH y al volverlo a suspender
en 25 ml de H_{2}O. Antes de la ligadura de bibliotecas a gran
escala, se llevó a cabo cuatro ligaduras de ensayo en 10 \mul de
tampón de ligación (el mismo que arriba), cada uno de ellos
conteniendo 1 \mul de ADNc ds (tubos de reacción #1 - #3), 2
unidades de ligasa T4 (Invitrogen) y 50 ng (tubo #1), 100 ng (tubo
#2) y 200 ng (tubos #3 y #4) de vector de expresión de levadura
dividido con Bst XI (o bien el vector pYES 2.0, Invitrogen, o
yHD13).
Usando las condiciones óptimas, se creó una
ligadura a gran escala en 40 \mul de tampón de ligación. Se
transformó una parte alícuota de 1 \mul en 1061 células
electrocompetentes de E. coli, se trituraron las células
transformadas y la biblioteca se colocó en placas de ampicilina LB
+ con 5000-7000 c.f.u./placa. A cada placa se le
añadieron 3 ml de medio. Se extrajeron las bacterias raspándolas,
se añadió 1 ml de glicerol y se almacenó a -80ºC como agregados.
Los 2 ml restantes se emplearon para aislar el ADN. Para obtener
más detalles sobre este método, se hace referencia a la WO
94/14952.
Para asegurar que todos los clones bacterianos
se sometían a examen en levadura, se establecieron varios
transformantes de levadura 5 veces mayores al número de clones
bacterianos de los agregados originales como límite.
Se sometió a electroporación una parte alícuota
de 1 \mul de ADN del plásmido purificado (100 ng/\mul) de
agregados individuales (200 \Omega, 1,5 kV, 25 \muF) en 40
\mul de células JG169 competentes de Saccharomyces
cerevisiae (OD_{600} = 1,5 en 500 ml de YPD), se lavó dos
veces en DIW frío, una vez en 1 M de sorbitol frío, se resuspendió
en 0,5 ml de 1 M de sorbitol (Becker D M Guarante L, Methods
Enzymol. 1991 194 182-187). Tras añadir 1 ml de 1 M
de sorbitol frío, se colocaron partes alícuotas de 80 \mul en
placas en SC + glucosa - uracilo para dar como resultado
250-400 c.f.u./placa y se incubó a 30ºC durante
3-5 días.
Tras 3-5 días de crecimiento,
las placas de agar se replicaron con placas de
SC-Uracil que contenían un 0,2% de xilano de abedul
reticulado con azurina (xilano de abedul AZCL^{TM},
Megazyme^{TM}, Australia) y un 2% de galactosa, seguido de la
incubación durante 2-4 días a 30ºC para detectar la
actividad xilanolítica. Tras la incubación, se identificaron las
colonias de enzimas positivas xilanolíticas como aquellas colonias
con un halo azul a su alrededor.
Las células de colonias de enzimas positivas se
extendieron para aislar una única colonia en agar y se seleccionó
una colonia única productora de enzimas para cada una de las
colonias productoras de enzimas xilanolíticas identificadas.
Se obtuvieron clones positivos como colonias
únicas. El ADN del plásmido se aisló de un cultivo celular obtenido
de dos colonias de levadura positivas. Se introdujo el ADN del
plásmido (transformado) en E. coli, se aisló y se
caracterizó de manera individual secuenciando el extremo 5' de cada
clon de ADNc usando el método de terminación de cadena (Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 1977 74
5463-5467) y el sistema de Sequenase^{TM} (United
States Biochemical).
Se inocularon una o más colonias de levadura
productoras de enzimas xilanolíticas en 20 ml de caldo YNB- 1 en un
tubo de ensayo de cristal de 50 ml. Se removió el tubo durante 2
días a 30ºC. Se recogieron las células centrifugándolas durante 10
minutos a 3000 rpm.
El ADN, aislado según WO 94/14952, se disolvió
en 50 \mul de agua. La parte alícuota del ADN se transformó con
E. coli en el modo descrito en WO 94/14952. Se aisló el ADN
del plásmido de E. coli mediante procedimientos estándares y
se analizó mediante un análisis de enzimas de restricción. Se
escindió el inserto de ADNc mediante enzimas de restricción
apropiadas y se ligó en un vector de expresión de
Aspergillus.
Se inocularon 100 ml de YPD (Sherman et
al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,
1981) con esporas de Aspergillus oryzae o Aspergillus
niger y se incubó mientras se removía a 37ºC durante
aproximadamente 2 días. Se recogió el micelio por filtración y se
lavó con 200 ml de 0,6 M de MgSO_{4}. Se suspendió el micelio en
15 ml de 1,2 M de MgSO_{4} y 10 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH 5.8.
Se dejó que la suspensión se enfriara en hielo y se añadió 1 ml de
tampón que contenía 120 mg de Novozym^{TM} 234, lote 1687. Tras 5
minutos se añadió 1 ml de 12 mg/ml de BSA (Sigma, tipo H25) y se
agitó mientras se removía de forma suave y continuada durante
1,5-2,5 horas a 37ºC hasta que se pudo observar un
gran número de protoplastos en una muestra inspeccionada con
microscopio.
Se filtró la suspensión mediante un miracloth,
se transfirió el filtrado a un tubo estéril y se recubrió con 5 ml
de 0,6 M de sorbitol, 100 mM de Tris-Cl, pH 7.0. El
centrifugado se llevó a cabo durante 15 minutos a 100 g y se
recogieron los protoplastos de la parte superior de la almohadilla
de MgSO_{4}. Se agregaron 2 volúmenes de STC (1,2 M de sorbitol,
10 mM de Tris-Cl, pH 7.5, 10 mM de CaCl_{2}) a la
suspensión del protoplasto y la mezcla se centrifugó durante 5
minutos a 1000 g. El granulado del protoplasto se resuspendió en 3
ml de STC y se volvió a granular. Se repitió este proceso.
Finalmente, se resuspendieron los protopiastos en
0,2-1 ml de STC.
Se mezclaron 100 \mul de suspensión de
protoplastos con 5-25 \mug del ADN apropiado en
10 \mul de STC. Se mezclaron los protoplastos con p3SR2 (un
plásmido que transporta el gen amdS del Aspergillus
nidulans). Se dejó la mezcla a temperatura ambiente durante 25
minutos, Se añadieron 0,2 ml de PEG 4000 al 60% (BDH 29576). Se
añadió 10 mM de CaCl_{2} y 10 mM de Tris-HCl, pH
7.5, se mezcló cuidadosamente (dos veces) y, finalmente, se
añadieron 0,85 ml de la misma solución y se mezcló cuidadosamente.
Se dejó la mezcla a temperatura ambiente durante 25 minutos, se
centrifugó a 2500 g durante 15 minutos y se resuspendió el
granulado en 2 ml de 1,2 M de sorbitol. Tras más de una
sedimentación, los protoplastos se extienden en las placas
adecuadas. Los protoplastos se extienden en placas mínimas (Cove,
Biochem. Biophys. Act 1966 113 51-56) conteniendo
1,0 M de sucrosa, pH 7.0, 10 mM de acetainida como fuente de
nitrógeno y 20 mM de CsCl para inhibir el crecimiento residual.
Tras incubarlo durante 4-7 días a 37ºC se recogieron
las esporas y se extendieron para hallar las colonias únicas. Se
repitió este procedimiento y se almacenaron las esporas de una
única colonia tras el segundo reaislamiento a modo de transformante
definido.
Se inoculó cada uno de los transformantes en 10
ml de YPM (ver abajo) y se propagó. Tras 2-5 días
de incubación a 30ºC, se eliminó el sobrenadante. Se identificó la
actividad xilanolítica aplicando 10 \mul de sobrenadante a
agujeros con un diámetro de 4 mm practicados en placas de agar que
contenían un 0,2% de xilano de abedul AZCL^{TM} (Megazyme^{TM},
Australia). A continuación, se identificó la actividad xilanolítica
como un halo de color azul.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de hibridación adecuadas para
determinar la hibridación entre una muestra oligonucleótida y una
secuencia de ADN "análoga" según la invención se puede definir
en el modo descrito a continuación. Una muestra oligonucleótida
adecuada para ser usada en la hibridación se puede preparar en base
a la parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN que se
muestra en la ID de SEC Nº: 1, o cualquier subsecuencia derivada, o
en base a la secuencia amino deducida que se muestra en la ID de
SEC Nº: 2. Un ejemplo de muestra adecuada es la secuencia de ADN
que se corresponde a la parte que codifica la xilanasa de la ID de
SEC: 1, es decir, nucleótidos en las posiciones
31-705 en la ID de SEC Nº: 1.
Previamente se puso a remojo un filtro
conteniendo los fragmentos de ADN a hibridar en 5x SSC y se
prehibridó durante 1 hora a aproximadamente 50ºC en una solución de
SxSSC, solución Sx Denhardt, 50 mM de fosfato sódico, pH 6.8, y 50
\mug de ADN de timo de ternero sometido a un baño de ultrasonido
desnaturalizado. Tras la hibridación durante 18 horas a \sim45ºC
en la misma solución completada con 50 \mu de la muestra marcada
Ci 32-P-dCTP, se lava el producto
tres veces en 2x SSC, 0,2% de SDS, durante 30 minutos a una
temperatura de preferiblemente como mínimo 55ºC en particular de
como mínimo de 60ºC, al menos de 65ºC, aunque se prefiere que sea
como mínimo de 70ºC, como mínimo de 75ºC, preferiblemente como
mínimo de 80ºC.
Las moléculas a las que bajo estas condiciones
se hibridiza la sonda oligonucleótida pueden detectarse mediante
una película de rayos X.
\vskip1.000000\baselineskip
Medios YPM: 10 g de extracto de levadura, 20 g
de peptona, 810 ml de H_{2}O. Se añaden 90 ml de maltodextrina al
20%, se somete al autoclave y a un filtrado estéril.
Medios YPD: 10 g de extracto de levadura, 20 g
de peptona, 810 ml de H_{2}O. Se añaden 90 ml de glucosa al 20% y
se somete al autoclave y a un filtrado estéril.
10 x Medios de sal basal: 66,8 g de base de
nitrógeno de levadura, 100 g de ácido sucínico, 60 g de NaOH,
H_{2}O hasta 1000 ml, filtrado estéril.
SC-URA: 90 ml de 10 x sal basal,
22,5 ml de ácidos de casamino al 20%, 9 ml de triptófano al 1%,
H_{2}O hasta 806 ml, sometido a autoclave, 3,6 ml de treonina al
5% y 90 ml de glucosa al 20% o galactosa añadida al 20%.
Caldo SC-H; 7,5 g/l de base de
nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 11,3 g/l de ácido sucíuico,
6,8 g/l de NaOH, 5,6 g/l de ácidos de casamino sin vitaminas, 0,1
g/l de triptófano. Sometido a autoclave durante 20 minutos a 121ºC.
Tras el autoclave, se añadieron 10 ml de una solución de galactosa
al 30%, 5 ml de una solución de glucosa al 30%) y 0,4 ml de una
solución de treonina al 5% por 100 ml de medio.
Agar SC-H: 7,5 g/l de base de
nitrógeno de levadura sin aminoácidos, 11,3 g/l de ácido succínico,
6,8 g/l de NaOH, 5,6 g/l de ácidos de casamino sin vitaminas, 0,1
g/l de triptófano y 20 g/l de agar (Bacto^{TM}). Sometido a
autoclave durante 20 minutos a 121ºC. Tras el autoclave, se
añadieron 55 ml de una solución de galactosa al 22% y 1,8 ml de una
solución de treonina al 5% por 450 ml de agar.
Agar YNB-1: 3,3 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 16,7 g/l de agar, pH ajustado a 7 Sometido a
autoclave durante 20 minutos a 121ºC. Tras el autoclave, se
añadieron 25 ml de una base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos
al 13,6%, 25 ml de una solución de glucosa al 40%, 1,5 ml de una
solución de L-leucina al 1% y 1,5 ml de una
solución de histidina al 1% por 450 ml de agar.
Caldo YNB-1: Composición como la
del agar YNB-1 pero sin agar.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad xilanolítica se puede expresar en
unidades FXU, determinadas a un pH 6.0 con remazolxilano
(4-O-metil-D-glucurono-D-xilan
tintado con Azul Brillante de Remazol R, Fluka) como sustrato.
\newpage
Se incuba una muestra de xilanasa con el
sustrato de remazol-xilano. El residuo del sustrato
tintado no degradado se precipita con etanol. El color azul que
permanece en el sobrenadante (en el modo determinado por
espectrofotometría a 585 nm) es proporcional a la actividad de la
xilanasa y, a continuación, se determinan las unidades de xilanasa
en relación a una enzima estándar a condiciones de reacción
estándares es decir, a 50,0ºC, pH 6.0 y un tiempo de reacción de 30
minutos.
Se puede conseguir el expediente AF 293.6/1 que
describe con más detalle este método analítico pidiéndolo a Novo
Nordisk NS, Dinamarca, cuyo expediente se incorpora aquí como
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se construyó una biblioteca de Thermomyces
lanuginosus compuesta aproximadamente por 1,5 x 106 clones
individuales en 150 agregados. Se aisló el ADN de 20 clones
individuales de dicha biblioteca y se sometió a análisis para
insertar el ADNc. Se halló que la frecuencia de inserción era
>90% y que el tamaño medio del inserto era de aproximadamente
1400 bp.
El ADN de algunos agregados se transformó en
levadura y se obtuvo de cada agregado 50-100 placas
que contenían 200-500 colonias de levadura. Tras
3-5 días de crecimiento, las placas de agar se
replicaron con placas en diferentes conjuntos de placas de agar. A
continuación, se incubó un conjunto de placas que contenía xilano
AZCL^{TM} al 0,1% (Megazyme^{TM}, Australia) durante
3-5 días a 30ºC para detectar la actividad de la
xilanasa. Se identificó las colonias positivas como colonias
rodeadas por un halo azul. De forma alternativa, a continuación, se
incubó un conjunto de placas durante 3-5 días a
30ºC antes de cubrir con una capa de xilano un gel que contenía
xilano AZCL^{TM} al 0,1% y un 1% de agarosa en un tampón con un
pH adecuado. Tras la incubación durante 1-2 días a
30ºC, se identificaron las colonias positivas como aquellas
rodeadas por un halo azul.
Las células de colonias positivas de enzimas se
extendieron para conseguir un único aislamiento de la colonia en
agar y se seleccionó la única colonia productora de enzimas para
cada una de las colonias productoras de xilanasa identificadas.
Los clones positivos se obtuvieron como únicas
colonias. Se amplificaron los insertos de ADNc directamente a
partir de la colonia de levadura empleando cebadores del polienlace
marcado con bintina, se purificaron mediante un sistema de bolitas
magnéticas (Dynabead^{TM} M-280, Dynal) y se
caracterizaron individualmente secuenciando el extremo 5' de cada
clon de ADNc mediante el método de terminación de cadena (Sanger F,
Nicklen S & Coulson A R; Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1977 74
5463-5467) y el sistema Sequenase^{TM} (United
States Biochemical).
La secuencia de ADN se muestra como ID de SEC
Nº: 1, que se corresponde con la secuencia de aminoácidos
presentada como ID de SEC Nº: 2.
Con el objetivo de evitar los errores de la RCP
en el gen a donar, se aisló el ADNc de los plásmidos de levadura
mediante procedimientos estandares, por ej., como los descritos en
el ejemplo 1 de la WO 93/11249, cuya publicación se incorpora aquí
como referencia. Se disolvió el ADN de la levadura en 50 \mul de
agua a una concentración final de aproximadamente 100
\mul/ml.
Se transformó el ADN en Escherichia coli
mediante procedimientos estándares. Se aislaron dos colonias de
E. coli de cada una de las transformaciones y se analizaron
con las enzimas de restricción HindIII y XbaI que escindieron el
inserto de ADN. El ADN de uno de estos clones se volvió a
transformar en la cepa de levadura JG169.
Se determino parcialmente las secuencias de ADN
de varios de los clones positivos. Las secuencias de ADN de la
xilanasa según la invención se muestran como ID de SEC Nº: 1, que
se corresponde con la secuencia de aminoácidos presentada como ID
de SEC Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Con el objetivo de expresar el gen en
Aspergillus, se aisló el ADNc de uno de los clones indicados
anteriormente mediante digestión con HindIII/XhaI u otras enzimas
de restricción apropiadas, el fraccionamiento del tamaño sobre un
gel y la purificación y, posteriormente, la ligación en pHD414, cosa
que tiene como resultado el plásmido pA2XITI. Tras la amplificación
en E. coli, el plásmido se transformó en una cepa de
Aspergillus oryzae según el procedimiento general descrito
en la sección de Materiales y Métodos, arriba.
Se inoculó cada uno de los transformantes en 10
ml de medio YPM. Tras 3-5 días de incubación a 30ºC
y 250 rpm, se eliminó el sobrenadante. La actividad xilanolítica se
determinó aplicando 10 \mul de sobrenadante en agujeros de 4 mm
(de diámetro) practicados en una placa de agar que contenía xilano
AZCL^{TM} al 0,2% (Megazyme^{TM}, Australia) en un tampón con un
pH apropiado y se incubó durante toda la noche a 40ºC. La actividad
de la xilanasa se identificó en el modo descrito anteriormente.
Algunos transformantes presentaron halos significativamente más
grandes que los del residuo de Aspergillus oryzae. Esto
demuestra la expresión eficaz de la xilanasa en el Aspergillus
oryzae. Se seleccionaron los 8 transformantes con la máxima
actividad de xilanasa y se inocularon y mantuvieron en agar
YPG.
Se inoculó cada uno de los 8 transformantes
seleccionados desde los sesgos de agar YPC en un frasco de
agitación de 500 ml con medios FG-4 y
MDU-2. Tras 3-5 días de fermentación
mientras se removía lo suficiente como para garantizar una buena
aireación, se centrifugaron los caldos de cultivo durante 10
minutos a 2000 g y se analizaron los sobrenadantes.
Se aplicó un volumen de 15 \mul de cada
sobrenadante a agujeros con un diámetro 4 mm practicados en un 0,1%
de gel de cubierta de xilano AZCL^{TM} (25 ml en una placa petri
de 13 cm de diámetro). Se identificó la actividad de la xilanasa
debido a la formación de un halo azul durante la incubación.
Posteriormente, la xilanasa se fermentó en un
medio que incluía maltodextrina como fuente de carbono, urea como
fuente de nitrógeno y extracto de levadura. La fermentación se
llevó a cabo inoculando un cultivo de un frasco de agitación de las
células huésped de Aspergillus oryzae en un medio que
incluía un 3,5% de la fuente de carbono y un 0,5% de la fuente de
nitrógeno. Tras 24 horas de cultivo a pH 5.0 y 34ºC se inició el
suministro continuo de fuentes de nitrógeno y carbono adicionales.
Se mantuvo la fuente de carbono como factor de limitación y se
garantizó que el oxígeno estuviera presente en exceso. Se continuó
el cultivo durante 4 días, tras lo que se pudo recuperar las
enzimas centrifugándolas, ultrafiltrándolas, filtrándolas en claro y
filtrando el germen.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se centrifugó el sobrenadante del cultivo
derivado de la fermentación del Aspergillus oryzae, descrito
en el ejemplo 2, que expresaba la enzima recombinante y se filtró a
través de un filtro de 0,2 \mum para eliminar los micelios.
Se ultra filtraron 100 ml de sobrenadante
filtrado en un dispositivo de ultrafiltración Filtron^{TM}
ultracette o Amicon^{TM} con una membrana de 3 kDa para dar como
resultado una concentración de 10 veces. Se diluyó este concentrado
100 veces en 20 mM de Tris, pH 8.0, en dos ciclos sucesivos de
ultrafiltración en el mismo dispositivo. Se cargó esta muestra de
ultrafiltración en 2 ml/mm en un intercambiador aniónico de Q
Sefarosa^{TM} de flujo rápido Pharmacia XK 26/20 y se equilibró
en 20 mM de Tris, pH 8.0.
Una vez se aplicó la muestra, se lavó la columna
con dos volúmenes de columna con 25 mM de Tris, pH 8.0, y se
eluyeron las proteínas enlazadas con un gradiente de NaCl en
progresión lineal de O a 0,5 M de NaCl en 25 mM de Tris, pH 8.0. Se
recogieron las fracciones y se midió la actividad de la xilanasa en
las fracciones en el modo descrito anteriormente.
Las fracciones que contenían la xilanasa se
agruparon y se concentraron en UF en 10 mM de citrato sódico, pH
4.0. Se cargó este material en una columna de S Sefarosa^{TM} de
flujo rápido XK 16/20 a 1,5 ml/mm. Se eluyó la enzima con un
gradiente lineal de O a 0,4 M de NaCl y se agrupó, concentró y
empleó las fracciones que contenían la xilanasa para caracterizarla
y seguir experimentando en el modo descrito a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se sometió la xilanasa obtenida según el Ejemplo
3 a la siguiente caracterización de enzimas.
Se llevó a cabo el sistema de dilución simple
por electroforesis en gel de poliacrimida (sulfato de sodio
dodecilo/electroforesis en gel de poliacrilamida) en una unidad de
electroforesis Mini-Leak 4 (Kern-En
-Tec, Copenhage) como versión modificada del procedimiento Laemmli
(Laemmli UK; Nature 1970 227, 680-685; Christgau
et al., 1991, J. Biol. Chem. 1991 266 págs.
21157-212664).
Se determinó un peso molecular (PM) de
aproximadamente 26 kDa.
Se llevó a cabo el isoelectroenfoque en placas
de gel de poliacrimida Ampholine^{TM}, pH 3.5-9.5
(Pharmacia, Suecia) en una unidad de electroforesis
Multiphor^{TM} según las instrucciones de los fabricantes. Tras la
electroforesis, se manchó el gel con commassie según los protocolos
estándares conocidos en la técnica.
Se determinó un punto isoeléctrico (pi) de
aproximadamente 4.5.
\vskip1.000000\baselineskip
Las actividades enzimáticas se midieron según la
liberación de color azul de xilano de abedul AZCL^{TM}
(Megazy-
me^{TM}. Australia).
me^{TM}. Australia).
Se mezclaron 0,5 ml de suspensión de sustrato de
AZCL^{TM} al 0,4% con 0,5 ml de 0,1 M tampón citrato/fosfato con
un pH óptimo y se añadieron 10 \mul de una solución enzimática
diluida de forma idónea. Las incubaciones se llevaron a cabo en
termomezcladores Eppendorph durante 15 minutos a 30ºC, seguido de
la inactivación térmica durante 20 minutos a 95ºC. Las incubaciones
de la enzima se llevaron a cabo por triplicado. Se creó una muestra
para ensayo en blanco en la que se añadió la enzima, aunque se
inactivó inmediatamente. Tras el centrifugado, se midió la
absorbencia del sobrenadante en placas de microtrituración a 620 nm
y se substrajo la mezcla.
Se emplearon 0,1 M de tampones de
citrato/fosfato con un pH variable para determinar el pH óptimo. Se
utilizó un tampón de 0,1 M de citrato/fosfato, pH 5.5, incubándolo
a temperaturas diferentes durante 15 minutos para determinar la
temperatura óptima. Los resultados aparecen presentados en las
Figs. 1-2.
La Figura 1 muestra la actividad xilanolítica
relativa (%) determinada a 30ºC con un margen de pH entre 2.5 y 9.
Parece que la enzima presenta un pH óptimo en el margen de
4.5-7.5, más específicamente el margen de entre
5.0-6.5, en torno a un pH 6.
La Figura 2 muestra la actividad xilanolítica
relativa (%) determinada a un pH 5.5 en un margen de entre 30 y
80ºC. Parece que la enzima presenta una temperatura óptima en el
margen de entre 50-70ºC, en torno a los 60ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
En este ejemplo, se comparó la termoestabilidad
de una preparación con xilanasa de un único componente obtenida
según los ejemplos 1-3 con la preparación con
xilanasa Thermomyces lanuginosus nativa.
La xilanasa nativa Thermomyces
lanuginosus se preparó en el modo descrito a continuación.
Se inoculó la cepa Thermomyces
lanuginosus DSM 4109 durante 24 horas en 200 litros de medio
YPG con la siguiente composición (g/l):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Tras la inoculación, al inoculo se le añadieron
2000 litros del siguiente medio (g/1) y se fermentó durante 3 días
más:
Se eliminaron las células centrifugándolas, se
concentró el sobrenadante por ultrafiltración (usando una membrana
de corte de 10,000 MW) y se convirtió el concentrado UF en un polvo
en bruto mediante liofilización.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las preparaciones se diluyeron con 100 mM de
tampón de citrato-fosfato, pH 6.0 con el objetivo
de trasladar la actividad enzimática dentro de un margen analítico
lineal en aquellos casos en los que se aplica al ensayo sobre
actividad enzimática descrito a continuación. Las muestras diluidas
se colocaron en un baño de agua en partes alícuotas de 2 ml a
temperaturas de 60, 65, 70 y 75ºC. Se mantuvo la muestra de control
en agua helada. Se extrajeron las muestras incubadas después de 60
y se colocaron en agua helada.
Se empleó un sustrato de
remazol-xilano de madera de haya
(4-O-metil-D-glucurono-D-xilano
tintado con Azul R Brillante de Remazol, Fluka). Se disolvió el
sustrato para crear una solución al 0,5% (p/v) con 100 mM de tampón
de citrato-fosfato, pH 6.0.
Para determinar las actividades enzimáticas
residuales se añadieron 0,9 ml de sustrato a cuatro tubos (dos
valores principales y dos muestras para ensayo en blanco) y se
precalentó en un baño de agua a 50ºC durante 5 minutos. A t=0, se
añadieron 0,1 ml de muestra enzimática a todos los tubos que
constituían los valores principales y se mezclaron. Tras 60 minutos,
se terminó la incubación añadiendo 5 ml de reactivo con etanol (una
mezcla de 150 ml de etanol al 99,9% y 1 ml de 2 N de HCl), tras lo
que se removió durante 10 segundos en un Whirlimixer. A todos los
tubos que constituían muestras de ensayos en blanco se les añadió,
en primer lugar, 5 ml de reactivo con etanol, tras lo que se
añadieron 0,1 ml de muestra enzimática y se removió todo durante 10
segundos en un Whirlimixer. Se dejó que todos los tubos
permanecieran durante aproximadamente 15 minutos a temperatura
ambiente antes de centrifugarlos a 4.000 rpm durante 10 minutos.
Finalmente, se midió la densidad óptica a 585 nm, se sacó la media
de las determinaciones dobles y se sustrajeron las muestras para
ensayo en blanco.
Se determinó la actividad enzimática residual
relativa como función de temperatura de incubación y se calculó el
tiempo como porcentaje del valor de control (valor de control
definido como "100%"). Los resultados aparecen presentados en
la Fig. 3.
En dicha figura se representa la actividad
residual de la preparación con xilanasa de un único componente
según la invención (barras blancas) en comparación con la de la
preparación con xilanasa nativa Thermomyces lanuginosus
(barras a rayas). También se muestra la actividad residual
determinada a un pH 6.0 y tras la incubación a 60, 65, 70 y 75ºC
durante 30 y 60 minutos, respectivamente.
A partir de dicha figura se puede observar que
el componente de xilanasa según la invención presenta una actividad
enzimática residual tras la incubación durante 60 minutos con un pH
6.0 y 60ºC superior al 96%, más específicamente superior al 97%,
esencialmente de un 100%.
Tras la incubación durante 60 minutos a un pH
6.0 y 65ºC, el componente de xilanasa según la invención presenta
una actividad enzimática residual superior al 83%, en particular
superior al 85%, con más detalle superior al 90%, esencialmente de
un 100%.
Tras la incubación durante 60 minutos a pH 6.0 y
70ºC, el componente de la xilanasa según la invención presenta una
actividad enzimática residual superior al 20%, en particular
superior al 30%, con más detalle superior al 40%, aún con más
detalle superior al 50%, en torno a un 63%.
Tras la incubación durante 60 minutos a pH 6.0 y
75ºC, el componente de la xilanasa según la invención presenta una
actividad enzimática residual superior al 9%, en particular
superior al 10%, con más detalle superior al 20%, aún con más
detalle superior al 30%, en torno al 48%.
A partir de la figura también se puede observar
que la preparación con xilanasa de un único componente según la
invención muestra una termoestabilidad significativamente
perfeccionada en comparación con la preparación con xilanasa nativa
Thermomyces lanuginosus. Además de ser una enzima mejoradora
de alimentos excelente, esta mejora inesperada en la
termoestabilidad hace posible que la preparación con xilanasa de un
único componente según la invención resulte particularmente muy
adecuada para su incorporación en aditivos alimenticios para
animales. Durante la incorporación en dichos aditivos alimenticios
para animales, la termoestabilidad de la enzima juega un papel
importante a la hora de prevenir las infecciones microbianas en los
piensos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se ha identificado la viscosidad de la digesta
del intestino anterior como constricción nutritiva principal que
influye sobre la digestibilidad de las dietas de engorde basadas en
trigo y cebada. También se ha hallado una correlación más cercana
entre los resultados de la reducción de la viscosidad de la digesta
y las mejoras en la eficacia de la conversión de comida para pollos
[ver, p. ej., Graham H, Bedford M y Choct M; Feedstuffs 1993 65 (5)
14-15].
En este experimento, se somete a examen la
reducción en la viscosidad del trigo obtenida al emplear (i) una
preparación con xilanasa Thermomyces lanuginosus de un único
componente producida por recombinación obtenida según los ejemplos
1-3, (ii) una preparación con xilanasa nativa de
Thermomyces lanuginosus obtenida mediante un cultivo en el
modo descrito en el ejemplo 5, y (iii) una preparación enzimática
de varios componentes comercialmente disponible obtenida mediante
un cultivo de Humicola insolens (Bio-Feed
Plus CT, producto de Novo Nordisk A/S, Dinamarca),
respectivamente.
A t=0, se mezclaron 12 g de trigo seco molido
("Statens Husdyrbrugsforsøg", Foulum, Dinamarca), tamiz de
maya de 1 mm, con 38 ml de tampón de extracción, 0.5 M de
HCl-KCl, pH 1,5, y se mantuvo a 40ºC mientras se
removía de forma constante. Durante la incubación, se cubrieron las
muestras con papel de estaño. A t=89 minutos, se ajustó el pH a 6.0
(\pm 0.15) con 1 M de NaOH. A t=90 minutos, se añadió una solución
enzimática a un total de 40 ml.
Se diluyeron las preparaciones enzimáticas
anteriormente mencionadas (i)-(iii) para dar como resultado una
concentración enzimática final en el margen de entre 0,16 y 5,19
FXU/g de trigo. Todos los experimentos se llevaron a cabo por
duplicado y siempre se incluyeron las muestras, es decir, las
soluciones sin enzima añadida, por duplicado.
Tras 30 minutos de incubación, se extrajeron las
muestras para determinar la viscosidad. Se empleó un viscosímetro
Brookfield LVDV-III con un adaptador de muestras
pequeño y un huso Nº SC4-31, a 250 rpm
correspondientes a una velocidad de cizallamiento de 85 s^{-1}.
Para cada determinación, se vertieron rápidamente aproximadamente
13 ml de suspensión en el adaptador de muestras pequeño, que
posteriormente se situó en la cámara de agua mientras se calentaba
de manera constante a 40ºC. Se llevaron a cabo tres lecturas cP
separadas, cada una por cada 15 segundos, y se empleó el valor
medio.
En cualquier caso, los datos resultantes
obtenidos con la enzima añadida se expresaron como viscosidad
relativa, es decir, relativa a la viscosidad medida en las muestras
de control, definidas como "1".
En la Fig. 4 se muestran los resultados de la
comparación entre la eficiencia de la reducción de la viscosidad
del trigo entre (ii) la xilanasa nativa Thermomyces
lanuginosus, en dosis de 0,16, 0,32, 0,65, 1,29 y 2,58 FXU/g de
trigo (\bullet) y (iii) una preparación enzimática de varios
componentes obtenida al cultivar Humicola insolens, en dosis
de 0,32, 0,65, 1,29, 2,58 y 5,19 FXIJ/g de trigo (X). A partir de
dicha figura se puede observar que en comparación con (iii), una
preparación enzimática de varios componentes obtenida al cultivar
Humicola insolens, la xilanasa nativa Thermomyces
lanuginosus (ii), reduce significativamente la viscosidad de
una suspensión con trigo al calcularla sobre una base FXU.
Además, en la Fig. 5 se muestran los resultados
de una comparación en la eficiencia de la reducción de la
viscosidad del trigo entre (i) la xilanasa Thermomyces
lanuginosus de un único componente producida por recombinación
(I) y (ii) la xilanasa nativa Thermomyces lanuginosus (II).
Los resultados se basan en dos dosificaciones similares de 0,65 y
2,58 FXU/g de trigo. A partir de esta figura se puede observar que
el electo sobre la viscosidad en suspensiones con trigo es bastante
similar.
En resumen, este ejemplo demuestra claramente
que cuando se comparan con un aditivo alimenticio según la técnica
precedente, las xilanasas derivadas de Thermomyces
lanuginosus son superiores a la hora de reducir la viscosidad
de una suspensión con trigo y, en consecuencia, poseen un gran
potencial para su uso como enzimas mejoradoras de alimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
En este ejemplo, se añade una xilanasa de un
único componente Thermomyces lanuginosus al alimento para
animales y se compara con una preparación enzimática que incremente
la digestibilidad convencional.
La preparación con xilanasa de un único
componente se obtuvo según los ejemplos 1-3. La
preparación de referencia es un aditivo alimenticio según la
técnica precedente, una preparación enzimática de varios componentes
obtenida cultivando la Humicola insolens
(Bio-Feed Plus CT, producto de Novo Nordisk NS,
Dinamarca).
Se alimentaron pollos de engorde con una dieta
experimental con y sin enzimas durante tres semanas. La composición
de la dieta se muestra en la Tabla 1, abajo.
Se dividieron los animales en cinco grupos
principales y se los sometió a cinco tratamientos diferentes. Se
dividió cada grupo principal en ocho subgrupos (jaulas) compuestos
por 30 pollos de engorde (15 de cada sexo). Se pesó por separado
cada subgrupo (jaula).
Los cinco tratamientos diferentes incluían un
tratamiento de control sin enzimas, así como los siguientes
tratamientos con aditivos enzimáticos: 400 y 800 FXU/kg de alimento
de preparación de referencia (Ref.) y 200 y 400 FXU/kg de alimento
de preparación con xilanasa de un único componente según la
invención (Inv.).
Se inició el tratamiento en polluelos de varios
días de edad. Tras tres semanas de tratamiento, se midió el aumento
de peso y el consumo de alimentos y se calculó un ratio de
conversión de alimentos (RCA), ver Tabla 2, abajo (en la que se
representa el peso del polluelo y la toma de alimentos a la edad de
tres semanas).
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A partir de la Tabla 2 se puede observar que RCA
es inferior en los grupos receptor de 200 FXLT/kg de alimento de la
preparación enzimática según la invención (Inv.) en comparación con
el grupo de control y el grupo receptor de 400 FXU de la
preparación de referencia (Ref.). Sin embargo, el RCA calculado
tras emplear 200 FXU de la preparación enzimática según la
invención se encuentra al mismo nivel que tras emplear 800 FXU de la
preparación de referencia, cosa que indica que en comparación con
la preparación de referencia, la preparación enzimática según la
invención presenta el mismo efecto que un nivel de dosis de 1/4
FXU.
En consecuencia, se considera que la enzima
según la invención ayuda más a mejorar la digestibilidad de los
piensos que la preparación de referencia. A pesar de que es una
preparación de un único componente, la preparación según la
invención es superior a la hora de incrementar la digestibilidad si
se compara con un aditivo alimenticio del estado de la técnica, que
ofrece la acción de componentes enzimáticos múltiples.
Ejemplo
8
Este ejemplo muestra una comparación de dos
aditivos alimenticios para animales según la invención con un
aditivo alimenticio según el estado de la técnica en el impacto
sobre el valor de la Energía Metabolizable evidente (EME) del
trigo.
Los dos aditivos alimenticios para animales
según la invención son (A) una preparación con la xilanasa de un
único componente Thermomyces lanuginosus obtenida mediante
técnicas de ADN recombinante según los ejemplos 1-3,
y (B) una preparación con la xilanasa nativa Thermomyces
lanuginosus obtenida a través del método descrito en el ejemplo
5. El aditivo alimenticio según el estado de la técnica es una
preparación enzimática de varios componentes (C) obtenida al
cultivar Humicola insolens (Bio-Feed Plus
CT, producto de Novo Nordisk NS, Dinamarca).
Se emplearon polluelos de engorde acelerado Ross
de un día de edad, distribuidos por un criadero comercial. Se les
alimentó con una dieta inicial comercial entre los días 1 a 16. El
día 16 se les pesó individualmente. Se descartaron los pollos con
un peso demasiado elevado o demasiado bajo y al resto se les asignó
una jaula en batería. Entre el día 16 y el 23 se adaptaron a las
jaulas.
Se llevó a cabo un ensayo de equilibrio entre
los días 24 y 28 según el European Reference Method (Método de
referencia europeo) para la determinación in vivo de energía
metabolizable EME [Bourdillon et al.; Br. Pouly. Sci. 1990
31 557-565]. El ensayo incluyó 9 tratamientos con 5
replicados de 4 polluelos de engorde por replicado.
La dieta basal contenía un 56% de sorgo, 32,5%
de harina de soja, 6 de grasa animal, 1% de aceite de soja y un 5%
de minerales, vitaminas, oligoelementos y aminoácidos. En la dieta
experimental, se reemplazó la mitad de la dieta basal por trigo. Se
alimentaron los polluelos con dietas a modo de masa a un nivel de
un 90% de toma ad libitum.
Cada día se recogieron los excrementos de forma
cuantitativa. Se sometieron a análisis muestras de alimento y
excrementos liofilizados para detectar la grasa, la energía bruta
(EB) y el nitrógeno. El contenido en AME de la dieta se calculó a
partir de su respectiva ratio excrementos/alimento así como a
partir de su correspondiente contenido en EB. La corrección para la
retención de N a cero (AMEn) se efectuó usando un equivalente de
energía de 34,36 kJ/g N-retenido. Se determinó la
digestibilidad de las grasas extrayendo las grasas de los
excrementos derivados de las dietas y liofilizados, teniendo en
cuenta el ratio excrementos/alimentos. Los resultados se analizaron
mediante un análisis de un sólo factor de varianza con diferencias
significantes identificadas mediante un test de alcance múltiple
LSD, usando Statgraphics versión 5. Los resultados se muestran en
la tabla 3, abajo, y en las Figs. 6-7.
La Figura 6 muestra el valor AMEn del trigo
(MJ/kg) como función de adición de la xilanasa (FXU/kg de
alimento); (A) preparación con la xilanasa de un único componente
Thermomyces lanuginosus; (B) preparación con la xilanasa
nativa Thermomyces lanuginosus; (C) referencia
(Bio-Feed Plus CT, producto de Novo Nordisk A/S,
Dinamarca; una preparación enzimática de varios componentes
obtenida al cultivar Humicola insolen).
La Figura 7 muestra la digestión de grasa (%) en
la dieta experimental en función de la adición de la xilanasa
(FXU/kg de alimento); (A) preparación con la xilanasa de un único
componente Thermomyces lanuginosus; (B) preparación con la
xilanasa nativa Thermomyces lanuginosus; (C) referencia
(Bio-Feed Plus CT, producto de Novo Nordisk A/S
Dinamarca; una preparación enzimática de varios componentes
obtenida al cultivar Humicola insolens).
La suplementación de la dieta basal con 200
FXU/kg de alimento de bien (A) o (B) tuvo como resultado un aumento
relativamente pequeño y no significativo en el valor AMEn medio así
como de la digestión de grasa (ver, Tabla 3). En consecuencia, no
se llevó a cabo ninguna corrección sobre la actividad de las
xilanasas sobre los componentes basales al calcular los valores
AMEn del trigo.
En la dieta experimental tanto (A) como (B) se
administraron en dosis de 100 y 200 FXU/kg de alimento, mientras
que (C) se administró en dosis de 400 FXU/kg de alimento.
Como se puede observar a partir de la Tabla 3,
ambas dosis de los aditivos alimenticios para animales según la
invención tuvieron como resultado un AMEn significativamente mejor
que la dieta experimental por sí sola. El AMEn del trigo muestra
mejoras de un 4,9-8,6% tras haber añadido las
enzimas. El aditivo de referencia (C) muestra una mejora sobre el
AMEn del trigo de un 4,9%.
Al comparar los aditivos alimenticios para
animales según la invención con un aditivo según el estado de la
técnica, resulta evidente que los aditivos alimenticios para
animales según la invención se comportan mucho mejor que el aditivo
de referencia al administrarse en dosis basadas en FXU. 200 FXU/kg
de (B) es significativamente mejor que las 400 FXU/kg de (C).
La digestión de grasa de la dieta experimental
sigue las mismas pautas que los valores AMEn.
\vskip1.000000\baselineskip
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[0183]
\global\parskip0.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA ID de SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 983 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Thermomyces lanuginosus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: DSM 4109
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 31..705
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA ID de SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 225 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
Claims (6)
1. Aditivo alimenticio para animales que
comprende una xilanasa, dicha xilanasa comprendiendo:
- i)
- una secuencia de aminoácidos con una homología de, como mínimo, un 80% a la ID de SEC Nº 2; o dicha xilanasa siendo codificada por un constructo de ADN que comprende
- ii)
- la secuencia de ADN de la ID de SEC Nº: 1; o
- iii)
- una parte que codifica la xilanasa de la ID de SEC Nº: 1; o
- iv)
- los nucleótidos Nº 31-705 de la ID de SEC Nº: 1; o
- v)
- una parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 10133; o
- vi)
- una secuencia de ADN que difiere de las secuencias de ii)-v) debido a la degeneración del código genético; o
- vii)
- una secuencia de ADN que es homóloga en, como mínimo, un 80% a cualquiera de las secuencias ii)-v) y caracterizado por el hecho de que el aditivo alimenticio para animales es provisto en forma de un granulado revestido o no revestido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Aditivo alimenticio para animales según la
reivindicación 1 en el que la homología mencionada en el párrafo i)
según la reivindicación 1 es de al menos un 85%, o al menos un 90%,
o o al menos un 95%; o en el que la homología mencionada en el
párrafo vii) según la reivindicación 1 es de al menos un 85% o al
menos de un 90% o de al menos el 95%.
3. Mezcla previa para alimentos para animales
que comprende un aditivo alimenticio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 2.
4. Alimento para animales que comprende
componentes alimenticios para animales mezclados con una xilanasa,
dicha xilanasa comprendiendo:
- i)
- una secuencia de aminoácidos con una homología de, como mínimo, un 80% a la ID de SEC Nº 2; o dicha xilanasa siendo codificada por un constructo de ADN que comprende
- ii)
- la secuencia de ADN de la ID de SEC Nº: 1; o
- iii)
- una parte que codifica la xilanasa de la ID de SEC Nº: 1; o
- iv)
- los nucleótidos Nº 31-705 de la ID de SEC Nº: 1; o
- v)
- una parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 10133; o
- vi)
- una secuencia de ADN que difiere de las secuencias de ii)-v) debido a la degeneración del código genético; o vii) una secuencia de ADN que es homóloga en, como mínimo, un 80% a cualquiera de las secuencias ii)-v)
\vskip1.000000\baselineskip
5. Proceso para preparar alimentos para animales
en el que los componentes alimenticios se mezclan con el aditivo
alimenticio para animales, que comprende una xilanasa, dicha
xilanasa comprendiendo:
- i)
- una secuencia de aminoácidos con una homología de, como mínimo, un 80% a la ID de SEC Nº 2;
- \quad
- o dicha xilanasa siendo codificada por un constructo de ADN que comprende
- ii)
- la secuencia de ADN de la ID de SEC Nº: 1; o
- iii)
- una parte que codifica la xilanasa de la ID de SEC Nº: 1; o
- iv)
- los nucleótidos Nº 31-705 de la ID de SEC Nº: 1; o
- v)
- una parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 10133; o
- vi)
- una secuencia de ADN que difiere de las secuencias de ii)-v) debido a la degeneración del código genético; o
- vii)
- una secuencia de ADN que es homóloga en, como mínimo, un 80% a cualquiera de las secuencias ii)-v)
o la mezcla previa según la reivindicación 3
\vskip1.000000\baselineskip
6. Uso de una xilanasa, dicha xilanasa
comprendiendo:
- i)
- una secuencia de aminoácidos con una homología de, como mínimo, un 80% a la ID de SEC Nº 2;
- \quad
- o dicha xilanasa siendo codificada por. un constructo de ADN que comprende
- ii)
- la secuencia de ADN de la ID de SEC Nº: 1; o
- iii)
- una parte que codifica la xilanasa de la ID de SEC Nº: 1; o
- iv)
- los nucleótidos Nº 31-705 de la ID de SEC Nº: 1; o
- v)
- una parte que codifica la xilanasa de la secuencia de ADN que se puede obtener del plásmido de la cepa Saccharomyces cerevisiae DSM 10133; o
- vi)
- una secuencia de ADN que difiere de las secuencias de ii)-v) debido a la degeneración del código genético; o
- vii)
- una secuencia de ADN que es homóloga en, como mínimo, un 80% a cualquiera de las secuencias ii)-v)
en alimentos, aditivos alimenticios o mezclas
previas para animales; o para la modificación in vitro de
componentes alimenticios.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| DK9495 | 1995-01-26 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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