ES2217339T3

ES2217339T3 - Enzimas insecticidas.

Info

Publication number: ES2217339T3
Application number: ES96943766T
Authority: ES
Inventors: George E. Schwab
Original assignee: Mycogen Corp
Current assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2016-12-09
Also published as: WO1997020469A1; US6214364B1; NZ325096A; JP2000502074A; CA2238493A1; DE69631978T2; EP1018885B1; US5753249A; ATE262279T1; AU731609B2; EP1018885A1; KR19990071962A; DE69631978D1; AU1292197A

Abstract

Procedimiento de control de un organismo nocivo que no forma parte de la clase de los mamíferos, elegido entre los insectos, los nematodos y los ácaros, y que consume tejidos vegetales, que comprende la administración al vegetal o al suelo que lo rodea, o el aporte sobre o en el tejido del vegetal, de una enzima que cataliza una reducción del grupo 3-ceto de 3-deshidroecdisona o de 3-deshidro-20-deshidroecdisona en un grupo 3a-hidroxi.

Description

Enzimas insecticidas.

Antecedentes de la invención

Los insectos cuestan a los granjeros miles de millones de dólares anualmente, en pérdidas en los cultivos y en gastos para mantener estos parásitos bajo control. Las pérdidas causadas por los insectos parásitos en los sectores de la producción agrícola comprenden una reducción del rendimiento del cultivo, una menor calidad del cultivo y mayores costes de recogida.

Los pesticidas químicos han proporcionado un procedimiento eficaz de control de los parásitos; sin embargo, la opinión publica se interesa por la cantidad de residuos químicos que se encuentra en la comida, el agua subterránea y el medioambiente. Por esta razón, hay cada vez más interés por los pesticidas químicos sintéticos, y por consiguiente, por sus potenciales consecuencias tóxicas sobre el medioambiente. Los pesticidas químicos sintéticos pueden envenenar el suelo y las capas acuíferas, contaminar las aguas superficiales como consecuencia del riego, y destruir formas de vida contra las que no se apunta. Los agentes químicos sintéticos de control tienen la desventaja adicional de presentar peligros para la seguridad pública cuando se aplican en zonas en las que los animales domésticos, los animales de la granja o los niños pueden entrar en contacto con éstos. También pueden presentar peligros para la salud del personal que los aplica, en particular si no se siguen las técnicas apropiadas de aplicación. Las agencias de regulación por el mundo restringen y/o prohíben el uso de numerosos pesticidas y, en particular, de los pesticidas químicos sintéticos orgánicos, que persisten en el medioambiente y entran en la cadena alimentaria. Ejemplos de pesticidas químicos sintéticos ampliamente utilizados comprenden organoclorados, por ejemplo el DDT, el mirex la kepona, el lindano, la aldrina, el clordano, el aldicarbo y la dieldrina; organofosfatos, por ejemplo el clorpirifos, el paratión, el malatión y el diazinón, y carbamatos. Nuevas y severas restricciones acerca del uso de los pesticidas y la eliminación de ciertos pesticidas eficaces del mercado pueden limitar las opciones económicas y eficaces de control de los parásitos costosos de eliminar.

A causa de los problemas asociados a la utilización de pesticidas químicos sintéticos orgánicos, existe una clara necesidad de limitar el uso de estos agentes, y una necesidad de identificar agentes alternativos de control. La sustitución de los pesticidas químicos sintéticos, o la combinación de estos agentes con pesticidas biológicos, puede reducir la proporción de los productos químicos tóxicos en el medioambiente. Un agente pesticida biológico que goza de una creciente popularidad, es el microbio de los suelos Bacillus thuringiensis (B.t.). Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva, esporulante, caracterizada por inclusiones cristalinas, proteicas parasporales. Estas inclusiones aparecen frecuentemente al microscopio, como cristales de formas distintivas. Las proteínas pueden ser muy tóxicas para los parásitos, y específicas en lo que respecta a su actividad tóxica. Se han aislado y sequenciado ciertos genes de toxina de B.t, y se han producido y aprobado productos de B.t. basados en el ADN recombinado para un uso. Además mediante el uso de técnicas de ingeniería genética, se están desarrollando nuevos estudios de administración de estas endotoxinas de B.t. en los entornos agrícolas, incluido el uso de plantas genéticamente tratadas con genes de endotoxina para la resistencia a los parásitos, y el uso de células microbianas intactas estabilizadas como vehículos de administración de endotoxina de B.t.. Hasta estos últimos diez años, el uso comercial de pesticidas de B.t. se ha limitado en gran medida a una estrecha gama de lepidópteros parásitos (orugas). Sin embargo, estos últimos años, unos investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con especificidades para una gama más amplia de parásitos.

Desgraciadamente, ciertos insectos son refractarios a los efectos del B.t. y/o los insectos pueden desarrollar una resistencia al B.t.. Los primeros comprenden insectos tales como el picudo del algodonero y del noctuido ypsilon, así como los insectos adultos de la mayoría de las especies que no han demostrado hasta la fecha ninguna sensibilidad significativa aparente a las \delta-endotoxinas de B.t. En lo que respecta a estas últimas, las estrategias de gestión de las resistencias en la tecnología de las plantas transgénicas a B.t. se alcanza una posición importante. Sin embargo, sigue habiendo una gran necesidad de identificación de nuevos procedimientos de control de los insectos, que son eficaces, y también seguros para un uso en el medio ambiente.

Un posible enfoque del control de los insectos implica la ruptura de las funciones metabólicas vitales del insecto. Los compuestos esteroides desempeñan una función importante en el crecimiento y el desarrollo de los insectos. Los insectos son incapaces de formar la estructura cíclica de ciclopentaperhidrofenanterno de los esteroides. Por esto, son dependientes de fuentes de esteroides alimentarios colesterol y/o \beta-sitosterol) para la posterior elaboración de los esteroides del desarrollo, incluida la ecdisona y la 20-hidroxiecdisona. La ecdisona y la 20-hidroxiecdisona son hormonas pivote en la metamorfosis de los insectos. La ecdisona oxidasa interviene en la oxidación de la ecdisona y de la 20-hidroxiecdisona en la 3-deshidroecdisona y en la 3-deshidro-20-hidroxiecdisona, respectivamente, además de H_{2}O_{2}. Los insectos parecen ser únicos en lo que respecta a esta reacción de oxidación. Los productos de reacción tienen una actividad marginal de muda, y ninguna otra actividad hormonal conocida, de este modo se supone que la ecdisona oxidasa participa en las vías de inactivación del catabolismo de los esteroides. La ecdisona oxidasa se localiza en el cuerpo graso y el citosol del intestino de los insectos. Unos estudios han demostrado que la ecdisona y la 20-hidroxiecdisona administradas de manera exógena pueden tener un profundo efecto sobre el desarrollo del insecto, pudiendo incluso ocasionar la muerte (Tananka, 1993).

El gen que codifica la colesterol oxidasa se ha clonado en plantas (Purcell, 1994; Corbin, 1994). Sin embargo, los mamíferos son dependientes del colesterol como precursor de la elaboración de las hormonas esteroideas (corticosterona, hormonas sexuales, etc.). Dicha presentación de una enzima activa en las plantas puede plantear cuestiones de seguridad a causa de la potencial interferencia con la elaboración de los esteroides de mamífero.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de control de los parásitos que no forman parte de la clase de los mamíferos. Según la invención, un procedimiento de control de un organismo nocivo que no forma parte de la clase de los mamíferos, elegido entre los insectos, los nematodos y los ácaros, y que consume tejidos vegetales, comprende la administración al vegetal o al suelo que lo rodea, o el aporte sobre o en el tejido del vegetal, de una enzima que cataliza una reducción del grupo 3-ceto de la 3-deshidroecdisona o de la -deshidro-20-hidroxiecdisona en un grupo 3\alpha-hidroxi.

El procedimiento de la invención es particularmente ventajoso puesto que la vía que se perturba no existe en los mamíferos y, por consiguiente, los materiales y los procedimientos de la invención son muy selectivos y no se le conoce que plantee ningún riesgo de seguridad para el hombre.

En una realización preferida de la invención, el procedimiento comprende además la administración a dicho organismo nocivo, de una -endotoxina de Bacillus thuringiensis. La administración puede ser la de un huésped transformado para expresar la \delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis y dicha enzima.

El huésped puede ser por ejemplo, una planta sobre la cual el parásito se va a alimentar. En una variante, el huésped puede ser un microorganismo como un hongo o una bacteria, que se puede aplicar entonces en el lugar en el que el parásito deber ser controlado. Los microbios transformados pueden estar vivos, y elegidos de manera que colonicen las zonas en las que los parásitos deben ser controlados. Igualmente, el microbio puede haber sido matado después de la producción de la proteína, en cuyo caso el microbio se utiliza simplemente para administrar el compuesto pesticida.

El uso de un pesticida con base proteica como la ecdisona oxidasa, cuyo modo de acción y cuya composición molecular son distintos de los del B.t., proporciona una excelente alternativa al B.t. en los esquemas de gestión de las resistencias.

Descripción detallada de la invención

Además de la ecdisona oxidasa, también se puede utiliza la enzima 3-oxoecdisteroide 3\beta-reductasa como agente de control, sola o expresada con la ecdisona oxidasa. Esta enzima proporciona también un control selectivo de los parásitos sin afectar ninguna vía biológica conocida de los mamíferos. La 3-oxoecdisteroide 3\beta-reductasa cataliza la reducción del grupo 3-ceto de la 3-deshidroecdisona o de la 3-deshidro-20-hidroxiecdisona en un grupo 3\alpha-hidroxilo. Estos productos de reducción están desprovistos de actividad, y la reacción es irreversible.

La invención es particularmente ventajosa para el control de los parásitos que son refractarios los efectos de Bacillus thuringiensis (B.t.) y/o a lo parásitos que desarrollan una resistencia al B.t. El uso de un pesticida con base proteica como la ecdisona oxidasa, cuyo modo de acción y la estructura molecular son distintos de los del B.t., proporciona una excelente alternativa al B.t. en los esquemas de gestión de las resistencias.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión "control de los parásitos" significa la reducción del número de parásitos que pueden provocar daños. Esta reducción se puede hacer mediante la mortalidad, el retraso del desarrollo (ralentización) o una eficacia reproductora reducida. La referencia a los "parásitos" indica los parásitos que no forman parte de la clase de los mamíferos, y comprende por ejemplo los insectos, los nematodos y los ácaros. Los insectos comprenderán, por ejemplo, todos los tipos de insectos chupadores y picadores, por ejemplo, los dípteros, los coleópteros y los lepidópteros. Los compuestos de ecdisteroide son bien conocidos en la técnica, como lo son los precursores y los derivados de estos compuestos. Véase por ejemplo, Gilbert y Goodman, 1981.

Los compuestos útiles, según la invención, para controlar los parásitos, se pueden purificar a partir de fuentes naturales. Una vez purificados, los compuestos se pueden formular y aplicar directamente sobre los parásitos, o aplicarse de tal manera que los parásitos entren en contacto con los compuestos. De este modo, los compuestos se pueden aplicar de manera general, sobre superficies, como las superficies de los vegetales o el suelo que los rodea, ahí donde se deben controlar los parásitos. En una variante, los compuestos se pueden formular como cebo para ser ingeridos por los parásitos. Estas composiciones formuladas se pueden preparar y aplicar fácilmente por el experto en la técnica con conocimientos de la presente descripción.

La administración de los compuestos de control de los parásitos de la invención también puede realizarse transformando un huésped apropiado con una construcción genética que induce al huésped recombinado a producir el compuesto pesticida. La identificación, la producción y el uso de tales construcciones genéticas también se pueden realizar por el experto en la técnica con conocimientos de la presente descripción. Por ejemplo, para una proteína aislada aquí descrita, la secuenciación parcial de los aminoácidos se puede utilizar para el desarrollo de sondas de oligonucleótido. Se puede construir u obtener un banco de ADNc. Las sondas se pueden utilizar entonces para identificar el gen deseado en el banco de ADNc. Después de la secuenciación, el p gen se puede reconstruir para un uso en una expresión en los vegetales, bajo el control de un promotor apropiado.

Los genes interesantes se pueden insertar en un casete de un vector de transformación, que se utiliza para transformar un huésped apropiado. En una realización, el huésped puede ser un microorganismo que coloniza los vegetales que, cuando se aplica sobre las plantas o su entorno, expresa los genes que producen el compuesto de control, como la ecdisona oxidasa, para así provocar el control de los parásitos. En una variante, los genes que funcionan en las plantas, y que codifican los compuestos en cuestión, se pueden insertar en casetes de vector de transformación que pueden incorporarse en el genoma de la planta, que se protege ella misma del ataque del parásito expresando el gen y produciendo el compuesto de control de los parásitos. Además, la planta también se puede transformar para coexpresar genes de B.t, que expresan proteínas para el control de los parásitos.

De este modo, un aspecto de la presente invención consiste en un procedimiento de producción de plantas genéticamente transformadas, que expresan una cantidad eficaz de un compuesto de control de los parásitos como la ecdisona oxidasa. El procedimiento puede comprender las etapas que consisten en:

(a): insertar en el genoma de una célula vegetal, una molécula de ADN recombinado que comprende:

(i): un promotor que funciona en las células vegetales, para inducir la producción de una secuencia de ARN;

(ii): una secuencia codificante de estructura, que codifica la ecdisona oxidasa, y

(iii): una región 3' no traducida, que funciona en dichas células vegetales para inducir la adición de nucleótidos poliadenilato en el extremo 3' de la secuencia de ARN,

: donde el promotor es heterólogo respecto de la secuencia codificante de estructura, y donde el promotor está unido de manera funcional a la secuencia codificante de estructura, que está a su vez unida de manera funcional a la región no traducida;

(b): obtener células vegetales transformadas, y

(c): regenerar, a partir de las células vegetales transformadas, de plantas genéticamente transformadas que expresan una cantidad eficaz como pesticida, el compuesto de control del parásito.

Un cierto número de promotores, que están activos en las células vegetales, se han descrito en la literatura. Dichos promotores se pueden obtener a partir de plantas o de virus de plantas y comprenden, pero no se limitan a, los promotores de la nopalina sintetasa (NOS) y de la octopina sintetasa (OCS) (que son llevados por plásmidos que inducen tumores de Agrobacterium tumefaciens), los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor inducible por la luz para la pequeña subunidad de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido vegetal muy abundante) y el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV). Todos estos promotores se han utilizado para crear diferentes tipos de construcciones de ADN, que se han expresado en las plantas.

Además, los materiales y procedimientos para introducir genes en las plantas para conferir a estas plantas la capacidad de producir las proteínas pesticidas, se conocen bien en la técnica. En una realización preferida, los genes se modifican para facilitar la estabilidad óptima y la expresión en el huésped vegetal elegido. A este respecto, la patente de los Estados Unidos Nº 5 380 831 se refiere específicamente a la optimización de genes de B.t. para la expresión en las plantas.

Genes y proteínas

En una realización de la invención, un gen que codifica un compuesto de control de los parásitos se puede transformar en un huésped apropiado. Los genes útiles según la invención comprenden no sólo las secuencias de longitud completa, sino también los fragmentos de esta secuencia, las variantes y los mutantes, que codifican compuestos pesticidas. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, los términos "variantes" o "variaciones" de los genes se refieren a las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas proteínas o que codifican proteínas equivalentes. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión "proteínas equivalentes" se refiere a compuestos que tienen la misma actividad biológica o una actividad esencialmente idéntica respecto de los parásitos dianas, respecto de los compuestos que se describen específicamente.

Es evidente para el experto en la técnica, que los genes que codifican los compuestos útiles según la invención se pueden obtener por diversos medios. Estos genes, o partes o variantes de éstos, se pueden construir de manera sintética, por ejemplo utilizando un sintetizador de genes. Las variaciones de los genes se pueden construir fácilmente mediante técnicas estándar para realizar mutaciones puntuales. Igualmente, se pueden preparar fragmentos de estos genes utilizando las exonucleasas o endonucleasas comerciales, o por mutagénesis dirigida, según los procesos estándar. Por ejemplo, se pueden utilizar enzimas como Ba131 para cortar sistemáticamente el nucleótido desde los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos también se pueden obtener utilizando una serie de enzimas de restricción. Las proteasas se pueden utilizar para obtener directamente los fragmentos activos de estos compuestos. Los genes que codifican estos compuestos equivalentes se pueden sacar de bancos de ADN utilizando las descripciones dadas en la presente memoria descriptiva.

Existe un cierto número de procedimientos para obtener los compuestos útiles según la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos de las enzimas descritas en la presente memoria descriptiva para identificar y aislar otras enzimas. Estos anticuerpos e pueden entonces utilizar para identificar específicamente enzimas equivalentes con la actividad característica por inmunoprecipitación inmunodosificación enzimática (ELISA) o transferencia de Western. Los anticuerpos de las enzimas descritas en la presente memoria descriptiva, o de las enzimas equivalentes, o de los fragmentos de estas enzimas, se pueden preparar fácilmente utilizando los procesos estándar de la técnica. Entonces se pueden obtener los genes que codifican estas enzimas.

Los fragmentos y equivalentes que conservan la actividad enzimática de las enzimas ilustradas entran en el marco de la invención. Igualmente a causa de la redundancia del código genético, una serie de diferentes secuencias de ADN puede codificar estas enzimas. Forma parte de la pericia de una persona preparada, el crear estas secuencias alternativas de ADN, que codifican las mismas, o esencialmente las mismas, enzimas. Las secuencias de ADN variantes entran en el marco de la invención. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la referencia a una secuencia "esencialmente la misma" indica secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos, que no afectan materialmente a la actividad enzimática.

Huéspedes recombinados

Los genes útiles según la invención se pueden introducir en una gran variedad de huéspedes microbianos o vegetales. La expresión del gen da como resultado, directa o indirectamente, la producción del compuesto de control de los parásitos. Con los huéspedes microbianos apropiados por ejemplo Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar en el biotopo de los parásitos, donde van a proliferar y ser ingeridos por el parásito, lo que da como resultado el control del parásito. En una variante, el microbio que presenta el gen deseado se puede tratar en condiciones que prolongan la actividad del compuesto activo y que estabilizan la célula. La célula tratada, que conserva la actividad pesticida, se puede aplicar entonces en el entorno del parásito diana. Cuando el gen se introduce por medio de un vector apropiado en un huésped microbiano, y que dicho huésped se aplica al medioambiente en estado vivo, es ventajoso utilizar ciertos huéspedes microbianos. Por ejemplo, se pueden elegir los microorganismos huéspedes conocidos por ocupar el hábitat del parásito. Los microorganismos huéspedes también pueden vivir de manera simbiótica con una especie específica de los parásitos. Estos microorganismos se eligen de manera a poder entrar en competición en el medioambiente particular con los microorganismos de tipo salvaje, lo que conduce al mantenimiento estable y a la expresión del gen que expresa el compuesto deseado y de manera deseable, a una protección mejorada del pesticida de la degradación y de la inactivación por el medioambiente.

Una gran variedad de vías están disponibles para introducir el gen interesante en un microorganismo huésped en condiciones que permiten el mantenimiento estable y la expresión del gen. Estos procedimientos son bien conocidos por el experto en la materia.

Tratamiento de las células

Como se ha indicado anteriormente, las células recombinadas que expresan un compuesto pesticida se pueden tratar para prolongar la actividad pesticida y estabilizar la célula por formación de una microcápsula celular. La microcápsula pesticida que se forma, comprende el compuesto activo en una estructura celular, que se ha estabilizado y que va a proteger el compuesto cuando la microcápsula se aplica al entorno del parásito diana. Las células huéspedes apropiadas pueden comprender procariotas o eucariotas, limitándose normalmente a las células que no producen sustancia tóxica para los organismos superiores, como los mamíferos. La célula usualmente va a estar intacta, y estar sensiblemente bajo una forma proliferativa, en vez de estar bajo una forma de espora, aunque se pueden utilizar esporas en ciertos casos. Se describen procedimientos de tratamiento de las células microbianas en las patentes de los Estados Unidos Nº 4 695 455 y 4 695 462.

Crecimiento de las células

El huésped celular que contiene el gen interesante puede cultivarse en cualquier medio nutritivo apropiado, donde la construcción de ADN proporciona una ventaja selectiva, proporcionando un medio selectivo de manera que todas o sensiblemente todas las células conserven el gen. Estas células pueden entonces ser recogidas según las vías clásicas. Los microbios recuperados se pueden formular en un polvo mojable, un concentrado líquido, gránulos u otras formulaciones por adición de tensioactivos, dispersantes, soportes inertes y otros componentes para facilitar la manipulación y la aplicación sobre parásitos dianas particulares. Estas formulaciones y procedimientos de aplicación son bien conocidos en la técnica.

Formulaciones

Unos gránulos de cebo formulados que contienen un atractivo y el compuesto y el compuesto de control de los parásitos o microbios recombinados que comprenden los genes que codifican el compuesto, se pueden aplicar al medioambiente del parásito. El cebo se puede aplicar sin límite ya que los compuestos de control no afectan a las vías biológicas conocidas de los animales o de los seres humanos. El producto también se puede formular como un espay o un polvo. Un huésped recombinado que expresa el gen del compuesto de control también se puede incorporar a un cebo o una fuente alimentaria para el parásito.

Como se apreciará por parte del experto en la técnica, la concentración pesticida va a variar en gran medida en función de la naturaleza de la formulación particular, en particular si se trata de un concentrado o si se utiliza directamente. El pesticida estará presente en al menos un 1% en peso y puede estarlo en un 100% en peso. Las formulaciones secas tendrán aproximadamente entre el 1% y el 95% en peso del pesticida, mientras que las formulaciones líquidas serán en general, de aproximadamente entre el 1% y el 60% en peso de las materias sólidas. Las formulaciones que contienen células tendrán en general, entre aproximadamente 10^{2} y aproximadamente 10^{4} células/mg. Estas formulaciones se administrarán aproximadamente entre 50 mg (líquido o seco) a 1 kg o más por hectárea.

Las formulaciones se pueden aplicar en el medioambiente del parásito, por ejemplo sobre las hojas de las plantas.

Los siguientes ejemplos ilustran características relativas a la invención. Estos ejemplos no serán considerados como limitativos. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de solvente son en volumen, salvo que se indique lo contrario.

Ejemplo 1 Purificación de la ecdisona oxidasa

Se pueden cultivar larvas de Manduca sexta (gusano del Cuerno) de los dos sexos a temperatura ambiente (20-25ºC) y humedad relativa (50-60%) sobre comida artificial. Una o dos semanas después de la ecdisis en el quinto nivel, las larvas se congelan en hielo y se disecan. Salvo que se indique lo contrario, todos los siguientes procedimientos se realizan a 4ºC. Se recoge el hilo de 30-50 larvas, se coloca en tres volúmenes de tampón de homogeneización (Tris-Hcl 50 mM, pH 7,0, Na_{2}-ácido etilenodiaminotetracético (Na_{2}-EDTA) 1mM, leupeptina 10 \muM y ditiotreitol (DTT) 0,1 mM) y se homogeneiza mediante un homogeneizador Teflón-vidrio de Potter-Elvejum. El homogeneizado se puede centrifugar (10 k X g X 30 minutos) y se puede separar el residuo. El sobrenadante se puede someter a sonicación durante 20 segundos a 80% (Branson Sonifier 450, CT) y el material sobrenadante se puede centrifugar (105 k X g X 90 minutos). El residuo microsómico se puede separar, el sobrenadante se conserva y el volumen se registra.

Se añade sulfato de amonio saturado gota a gota al sobrenadante con agitación. Se recoge el material precipitando entre el 35% y el 60% de sulfato de amonio saturado, por centrifugación (10 k X g X 30 minutos). El residuo resultante se vuelve a suspender en un tampón que contiene fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0, Na_{2}-EDTA 1 mM, DDT 0,1 mM, leupeptina 10 \muM y glicerol al 20% (tampón de equilibrado) y se registra el volumen.

El material resuspendido se puede aplicar sobre una columna (1 \times 15 cm que contiene DEAE-Sefarosa (Sigman Chem. Co., St Louis, Mo), y se recoge n fracciones de 1,0 ml. Se pasan sobre la columna dos volúmenes de columna suplementarios de equilibrado. Se aplica sobre la columna un gradiente lineal de NaCl (0-0,3 M, \Sigma ml) en el tampón de equilibrado. Se controlan las fracciones para la absorbencia a 280 nm y las fracciones de pico se analizan por SDS PAGE y dosificación enzimática. Las fracciones enriquecidas con actividad ecdisona oxidasa y con proteína se unen y se dializan respecto del tampón de equilibrado.

El material dializado se aplica sobre una columna (1 x 15 cm) que contiene CM-Sefarosa (Sigma Chem. Co, St Louis, MO), previamente equilibrada con el tampón de equilibrado y se recogen fracciones de 1,0 ml. Se pasan dos volúmenes de columna suplementarios de equilibrados sobre la columna. Se aplica sobre la columna un gradiente lineal de NaCl ((0-0,3 M, Ó ml) en el tampón de equilibrado. Se pueden controlar de nuevo las fracciones por su absorbencia a 280 nm y las fracciones de pico se analizan por SDS PAGE y dosificación enzimática. Las fracciones enriquecidas con actividad ecdisona oxidasa y con proteína se unen y se dializan respecto del tampón de equilibrado.

Ejemplo 2 Determinación de las proteínas y electroforesis sobre gel de poliacrilamida

Las concentraciones proteicas se pueden determinar según el procedimiento de Bensadoun y Weinstein (Bensadoun et col, 1976) utilizando serumalbumina bovina como estándar proteico. La electroforesis sobre gel de poliacrilamida se realiza en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE) esencialmente como se ha descrito (Laemmlli, 1979).

Ejemplo 3 Dosificaciones enzimáticas

Una mezcla de reacción típica contiene entre 0,05 y 2 mg de la enzima y del tampón fosfato de potasio 50 mM, pH 7,0 en un volumen final de 1,0 ml. Después de una preincubación de 3 minutos a 30ºC, la reacción se inicia por adición de \alpha-[23,24-^{3}H(N)]-ecdisona o de [24,24,26,27-^{3}H(N)]-ponasterona A 10-50 \muM (Dupont NEN®, Boston, MA). Las incubaciones se llevan a cabo durante 5-60 minutos a 30ºC con agitación a 60 oscilaciones por minuto en un baño de agua girorrotativo modelo 976 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ). La reacción se detiene por extracción de la ecdisona o de la ponasterona A y de sus respectivos metabolitos en 9,0 ml de cloroformo. Después de la centrifugación a 2.500 X g X 5 minutos, se elimina la fase acuosa por aspiración y se seca una fracción alícuota de fase orgánica que contiene la ecdisona y sus metabolitos bajo una corriente de nitrógeno. Se vuelve a disolver el residuo en 25 \mul de acetato de etilo y se aplica sobre una hoja de gel de sílice IB2-F (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ). Las hojas de capa fina se pueden desarrollar por cromatografía secuencial con cloroformo: etanol (9:1) y acetato de etilo:ciclohexano (1:1). El sustrato promotor y sus metabolitos se pueden visualizar por autorradiografía y las zonas del gel de sílice que contienen los compuestos interesantes se eliminan y cuantifican mediante un analizador por centelleo líquido (Packard Instruments Co., Laguna Hills, Ca). La identificación de la 3-deshidroecdisona y de la 3-deshidro-20-hidroxiecdisona se realiza por comparación directa de la movilidad relativa con las de 3-deshidroecdiesteroides auténticos.

Ejemplo 4 Biodosificación de la ecdisona oxidasa como agente pesticida

Se recogen larvas recién nacidas de la polilla de la col (Plutella xylostella) después de su eclosión y se mantienen en ayuna durante 18 horas. Se colocan unas gotas de una solución de agua que contienen un colorante y la ecdisona oxidasa purificada (0-0,1 mg/ml) en una zona sobre una caja de Petri. Las larvas se colocan en el disco y pueden acceder a la solución. Después de aproximadamente 30 minutos, se examinan las larvas de manera microscópica para la presencia de colorante en el hilo, y estas larvas se colocan sobre una comida artificial, en la que la ecdisona oxidasa se incorpora (0-0,1 mg/ml). Cada día después de la ingestión de la comida por las polillas, se cuentan las larvas para la detención del crecimiento. Tres a cinco días después de la infestación inicial, se pesan las larvas y se las compara con el grupo testigo.

Ejemplo 5 Inserción de genes de toxina en las plantas

Un aspecto de la invención es la transformación de plantas con genes que codifican una proteína que perturba el metabolismo del ecdisteroide en los parásitos que ingieren partes de la planta. Las plantas transformadas son resistentes al ataque de los parásitos.

Un gen que codifica la proteína de control de los parásitos se puede insertar en las células vegetales mediante una serie de técnicas, que son bien conocidas en la especialidad. Estas técnicas comprenden la transformación con un ADN T, mediante Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, la fusión, la microinyección, el bombardeo de partículas (biolística), la inserción de ADN asistida por un agente químico (PEG) o la electroporación así como otros posibles procedimientos. Si se utilizan Agrobacteria para la transformación, el ADN a insertar se debe clonar en plásmidos especiales, a saber en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plásmido Ti o Ri por recombinación homóloga a causa de las secuencias que son homólogas a las secuencias en el ADN T. El plásmido Ti o Ri comprende también la región vir necesaria para la transferencia del ADN T. Los vectores intermedios no se pueden replicar a si mismos en Agrobacteria. El vector intermedio se transfiere Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido helper (conjugación). Los vectores binarios se pueden replicar a sí mismos en E. Coli y en Agrobacteria. Comprenden un gen de marcador de selección y un atador atador multisitio, que están enmarcados por las regiones límites derecha e izquierda del ADN T. Se pueden transformar directamente en Agrobacteria (Holsters et coll., 1978). La Agrobacterium utilizado como célula huésped debe comprender un plásmido que lleva una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN T en la célula vegetal.

La utilización del ADN T para la transformación de las células vegetales se ha estudiado de manera importante y se ha descrito suficientemente en el documento EP 120 516; Hoekema (1985) en el Binary Plant Vector system, Offsetdrukkertij Kanters B.V., Albasserdam, capítulo 5; Fraley et col., Crit. Rev. Plant. Sci. 4:1-46, y An et col., (1985) EMBO J. 4:277-287.

Una vez que el ADN insertado se ha integrado en el genoma, es relativamente estable y en general no se sale de éste. Contiene normalmente un marcador de selección, que confiere a las células vegetales transformadas, la resistencia a un biocida o a un antibiótico, como la kanamicina, el G418, la bleomicina, la hidromicina o el cloranfenicol, entre otros. El marcador utilizado individualmente puede permitir de este modo la selección de las células transformadas respecto de las células que no contienen el ADN insertado.

La bacteria así transformada se utiliza para la transformación en las células vegetales. Se cultivan ventajosamente explantes vegetales con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN en la célula vegetal. Toda la planta se puede regenerar a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, un trozo de hoja, un segmento de tallo, la raíz, pero también protoplastos, células de callo o células cultivadas en suspensión) en un medio apropiado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas así obtenidas se pueden testar entonces para la presencia del ADN insertado. No se ha tenido en cuenta ninguna exigencia especial sobre los plásmidos en el caso de la microinyección y de la electroporación. Es posible utilizar plásmidos ordinarios, como por ejemplo derivados pUC.

Las células transformadas crecen en las plantas de manera usual. Pueden formar células germinales y transmitir los caracteres transformados a las plantas hijas. Tales plantas se cultivan de la manera normal, y se cruzan con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados, u otros factores hereditarios. La progenitura resultante presenta las propiedades fenotípicas correspondientes.

Se ha de entender que los ejemplos y las realizaciones descritos en la presente memoria descriptiva lo son únicamente a título ilustrativo, y que se le aparecerán diferentes modificaciones o cambios al experto en la técnica, y deben considerarse como integrantes de marco de las reivindicaciones anexas.

Referencias Patentes de los Estados Unidos

Patente U.S. Nº 4 695 455

Patente U.S. Nº 4 695 462

Patente U.S. Nº 5 380 831

Patentes y solicitudes internacionales y extranjeras

EP 120 516

Otras publicaciones

An et col. (1985) EMBO J. 4:277-287)

Bensadoun A., D. Weinstein (1976) Anal. Biochem. /0:241-250.

Carnin D.R. et col. (1994) "Cloning of Insectidal Cholesterol Oxidase Gene and Its Expresion in Bacteria and in Plant Protoplasts". Appl. Environn. Microbiol. 60:4239-4244.

Fraley et col., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-16

Gilbert y Goodamn (1981) capítulo 5: Chemistry, "Metabolism and Transport of Hormones Controlling Insect Metamorphosis" (subcapítulo: "Molting Hormone") en Metamorphosis: A problem in Developmental Biology, Gilbert L.I y E. Frieden, editores, Plenum Press, NY, páginas 139-173

Holsters et col; (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187

Hoekema (1985) en: The binary Plant Vector system, Offsertdrukkerij Kanters B.V., Albasserdam, capítulo 5.

Humason, Gretchen L. (1967) Animal Tissue Techniques, W.H, Freeman y Company

Laemmli UK. (1970) Nature 227:680-685.

Purcell J.P. et col. (1994) "Colesterol Oxidase : A Potent Insecticidal Protein Against Boll Weevil Larvae" Biochem. Biophys. Res. Comm. 196:1406-1412.

Tanaka Y., Takeda S. (1993) "Ecdysome and 20-hydroxyecdysome Suplements to the diet Affect Laval Development in the Silkworm Bombix mori, Differencially" J. Insect. Pathol. 39:805-809.

Claims

1. Procedimiento de control de un organismo nocivo que no forma parte de la clase de los mamíferos, elegido entre los insectos, los nematodos y los ácaros, y que consume tejidos vegetales, que comprende la administración al vegetal o al suelo que lo rodea, o el aporte sobre o en el tejido del vegetal, de una enzima que cataliza una reducción del grupo 3-ceto de 3-deshidroecdisona o de 3-deshidro-20-deshidroecdisona en un grupo 3\alpha-hidroxi.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la administración a dicho organismo nocivo de una \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende la administración de un huésped transformado para expresar la \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis y dicha enzima.

4. Composición para el control de un organismo nocivo que no forma parte de la clase de los mamíferos, que comprende una enzima tal como la definida en la reivindicación 1, y una \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis.