ES2219678T3

ES2219678T3 - Composiciones que contienen derivados de amida del acido crotonico y lipoproteina.

Info

Publication number: ES2219678T3
Application number: ES96119699T
Authority: ES
Inventors: Stefan Dr. Mullner; Axel Dr. Hofmann; Karin Saar; Hans-Ulrich Dr. Schorlemmer; Robert Dr. Bartlett
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2016-12-09
Also published as: DE59611022D1; US5780592A; EP0780128A3; DE19547648A1; DK0780128T3; EP0780128A2; ATE268603T1; PT780128E; EP0780128B1; JPH09188658A

Abstract

UNA PREPARACION CONTENIENDO LIPOPROTEINAS Y UN COMPUESTO DE FORMULA I QUE ESTA INDICADA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INMUNOLOGICAS, CANCER Y EN TRANSPLANTES.

Description

Composiciones que contienen derivados de amida del ácido crotónico y lipoproteína.

Se designa como lipoproteínas a ciertos complejos de alto peso molecular, solubles en agua, que constan de lípidos (colesterol, triglicéridos, fosfolípidos) y de una o varias proteínas enteramente determinadas, que pueden formar complejos con los lípidos, y que se designan como apolipoproteínas. Las lipoproteínas constituyen la unidad funcional para el transporte en la sangre de los lípidos insolubles en agua. Es común a la estructura de las lipoproteínas el hecho de que las porciones hidrófilas de los fosfolípidos y las porciones hidrófilas de las apolipoproteínas se disponen junto a la superficie, mientras que los triglicéridos y ésteres de colesterol, hidrófobos, se disponen, por el contrario, en el interior de las partículas esféricas (partículas pseudomicelares).

Las lipoproteínas se clasifican en diferentes clases de densidades. Los lípidos poseen una densidad esencialmente menor que las proteínas. Para los primeros, el peso específico está situado por debajo de 0,9 g / ml de KBr y para las proteínas dicho peso específico está situado por encima de 1,28 g / ml de KBr. Los complejos de lípidos y proteínas están situados, en cuanto a su densidad, por consiguiente, entre los valores extremos mencionados. En una ultracentrífuga las lipoproteínas se pueden separar en 4 clases de densidades.

Los quilomicrones (densidad d < 0,95 g/ml) se forman en los intestinos y transportan triglicéridos exógenos, su proporción de lípidos es de 98 - 99,5%, la proporción de proteínas es de 0,5 - 2%; ellos forman una nata en el suero.

Las VLDL (de Very Low Density Lipoproteine = lipoproteínas de muy baja densidad; d < 1,006 g/ml) se forman en el hígado y transportan la parte principal de los triglicéridos endógenos, y constan en un 85 - 90% de lípidos y en un 10 - 15% de proteínas.

Las IDL (de Intermediate Density Lipoproteine = lipoproteínas de densidad intermedia; d = 1,006 - 1,019 g/ml) son detectables en personas, que están sanas en cuanto al metabolismo, solamente en una concentración muy baja, y se entienden como productos del metabolismo de las VLDL o como moléculas precursoras de las LDL.

Las LDL (de Low Density Lipoproteine = lipoproteínas de baja densidad; d = 1,019 - 1,063 g/ml) transportan la parte principal del colesterol en la sangre. Las LDL se forman como un producto del metabolismo a partir de las VLDL, y contienen aproximadamente 75% de lípidos y 25% de proteínas.

Las HDL (de High Density Lipoproteine = lipoproteínas de alta densidad; d = 1,063 - 1,21 g/ml) contienen aproximadamente 50% de proteínas y 50% de lípidos y se forman como moléculas precursoras de los intestinos y del hígado y se conforman en el plasma; pueden recoger colesterol a partir de las células y transportarlo de retorno al hígado. A causa de las diferentes composiciones y morfologías, así como las diferentes propiedades funcionales, se establece diferencia entre las subfracciones de HDL siguientes: HDL_{1}(1,055 - 1,085 g/ml), HDL_{2} (1,063 - 1,12 g/ml) y HDL_{3} (1,12 - 1,21 g/ml).

Las HDL no constituyen ninguna sustancia uniforme, sino una mezcla heterogénea de macromoléculas, que se diferencian por el tamaño de las partículas, la composición química y las propiedades físico-químicas. Un método de referencia para la preparación de las HDL es la flotación en una ultracentrífuga preparativa (d = 1,063 - 1,21 g/ml). La parte predominante de las partículas encontradas en esta clase de densidades tiene las siguientes propiedades:

a): Electroforesis: Desplazamiento a la posición \alpha,

b): Microscopia electrónica, partículas esféricas con un diámetro de 80 - 120 x 10^{-10} m,

c): Composición química: Proporción de Apo A-I (30-35%), proporción de Apo A-II (10-15%), proporción de Apo C (3-5%), proporción de fosfolípidos (26-30%), proporción de colesterol y ésteres de colesterol (15-20%), proporción de triglicéridos (3-5%).

Dependiendo de la técnica de aislamiento y del contenido de lipoproteína (a) en diferentes sueros se pueden encontrar en la clase de densidad HDL unas cantidades variables de lipoproteínas que contienen Apo \beta (lipoproteína (a), LDL); por otro lado, se pueden consignar pequeñas pérdidas de HDL en la clase de densidades d > 1,21 g/ml al realizar una ultracentrifugación preparativa.

La fracción de HDL se puede separar, mediante técnicas especiales de aislamiento, en diferentes subfracciones. Las subfracciones más importantes para cuestiones clínicas se designan como HDL_{1} (1,055 - 1,085 g/ml), HDL_{2} (1,063 - 1,125 g/ml) y HDL_{3} (1,125 - 1,210 g/ml). Éstas se distinguen por diferentes composiciones de lípidos y proteínas, propiedades físico-químicas y funcionales.

La subfracción HDL_{1} se puede aislar mediante técnicas especiales de separación (p.ej. separación zonal, cromatografía de afinidad con heparina). Ésta contiene Apo E como componente proteínico dominante. Mediando alimentación con piensos que contienen colesterol aumenta grandemente la concentración de esta fracción, en diferentes especies de animales; esta fracción de HDL reducida en cuanto a la cantidad de colesterol se designa como HDL_{C}. La HDL_{C} es también detectable en seres humanos después de una nutrición rica en colesterol durante varias semanas.

Aproximadamente un 50% de la masa de las HDL son proteínas, un 30% de ella son fosfolípidos, de un 10 a un 20% de ella son colesterol y ésteres de colesterol, y un 5 % de ella son triglicéridos. La relación de lecitina a esfingomielina es de 5:1, y la relación de colesterol esterificado a colesterol libre es de aproximadamente 3:1. La HDL_{2} contiene aproximadamente 60% de lípidos y 40% de proteínas, mientras que la HDL_{3} consta en aproximadamente un 45% de lípidos y en aproximadamente un 55% de proteínas. La relación de fosfatidilcolina a esfingomielina y la de colesterol libre a colesterol esterificado son en la HDL_{2} mayores que en la HDL_{3}. La HDL_{3} contiene una proporción especialmente alta de Apo E y de ésteres de colesterol. La porción proteínica de las HDL se compone de varias apolipoproteínas. Aproximadamente un 90% de la porción proteínica de las HDL consta de Apo-I y Apo A-II. La relación cuantitativa de ambas apolipoproteínas manifiesta ser diversa en las subpoblaciones de las HDL y, en una parte de la respectiva formulación se encontró con el rotor zonal en la fracción HDL_{2} un cociente molar de Apo A-I a Apo A-II de 9:1 y en la fracción HDL_{3} un cociente de 2:1.

Los derivados de amidas de ácido crotónico, su preparación y su utilización como medicamentos se conocen a partir de los documentos de patentes europeas EP 484.223, EP 529.500, EP 538.783, de patente de los EE.UU. 4.061.767 y de patente europea 551.230.

Se encontró, por fin, que los compuestos de la fórmula I se enriquecen en la fracción HDL de la sangre y las formulaciones que contienen lipoproteínas de alta densidad y un compuesto de la fórmula I, conducen a una disminución de las dosis del compuesto de la fórmula I a igualdad de actividad. La reducción de las dosis conduce, sin actividad disminuida, a una seguridad aumentada en el caso de la aplicación terapéutica. Al mismo tiempo, se pueden disminuir los costos de una terapia. Además, las formulaciones, que contienen lipoproteínas y compuestos de la fórmula I, tienen una actividad prolongada en el caso de trasplantes.

El invento concierne por lo tanto a una formulación que contiene por lo menos

1) una lipoproteína,

2) un compuesto de la fórmula I

1

y/o una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la fórmula I, y

3) un vehículo farmacéutico, representando

R^{1}
	a)	alquilo (C_{1}-C_{4}),
	b)	cicloalquilo (C_{3}-C_{5}),
	c)	alquenilo (C_{2}-C_{6}) o
	d)	alquinilo (C_{2}-C_{6}),
R^{2}
	a)	-CF_{3},
	b)	-O-CF_{3},
	c)	-S-CF_{3},
	d)	-OH,
	e)	-NO_{2},
	f)	halógeno,
	g)	bencilo,
	h)	fenilo,
	i)	-O-fenilo,
	k)	-CN,
	l)	-O-fenilo, sustituido una vez o múltiples veces con

	1)	alquilo (C_{1}-C_{4}),
	2)	halógeno,
	3)	-O-CF_{3} o
	4)	-O-CH_{3},

R^{3}
	a)	alquilo (C_{1}-C_{4}),
	b)	halógeno, o
	c)	un átomo de hidrógeno, y
X
	a)	un grupo -CH, o
	b)	un átomo de nitrógeno.

Se prefiere el empleo de un compuesto de la fórmula I y/o de una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I y/o de una sal del compuesto de la fórmula I, representando

R^{1}
	a)	metilo,
	b)	ciclopropilo o
	c)	alquinilo (C_{3}-C_{5}),

representando

R^{2}

CF_{3} ó CN,

representando

R^{3}

un átomo de hidrógeno o metilo, y

representando

X	un grupo -CH.

Se prefiere en particular la utilización de N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-crotónico, (4-ciano-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico o N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-4-hidroxi-hept-2-en-6-ino-carboxílico.

La preparación de los compuestos de la fórmula I se efectúa de acuerdo con procedimientos conocidos, tal como se describen en los documentos EP 484.223; EP 538.783 ó EP 551.230.

Por el concepto de alquilo, alquenilo o alquinilo se entienden radicales cuya cadena de carbonos puede ser lineal o ramificada. Además, los radicales alquenilo o alquinilo pueden contener también varios dobles enlaces o varios triples enlaces. Los radicales alquilo cíclicos son, por ejemplo, radicales monocíclicos de 3 a 5 miembros, tales como ciclopropilo, ciclobutilo o ciclopentilo. Las sustancias de partida para las reacciones químicas son conocidas o se pueden preparar con facilidad con acuerdo con métodos conocidos en la bibliografía.

Las lipoproteínas, que se utilizan en el presente invento, contienen lípidos y proteínas. Los lípidos preferidos son lípidos que se presentan de modo natural en la sangre o en el suero, tales como colesterol, ésteres de colesterol, triglicéridos o fosfolípidos. Las proteínas preferidas son proteínas lipófilas, de modo preferido proteínas lipófilas procedentes de la sangre o del suero. Las proteínas pueden también haber sido modificadas químicamente, por ejemplo proteínas modificadas con poli(etilen-glicoles).

La relación preferida de proteínas a lípidos es de aproximadamente 20% de proteínas a 80% de lípidos, de manera especialmente preferida de aproximadamente 30% de proteínas a aproximadamente 70% de lípidos, de manera particularmente preferida de aproximadamente 40% de proteínas a aproximadamente 60% de lípidos, y de manera muy especialmente preferida de aproximadamente 50% de proteínas a 50% de lípidos. La concentración de los componentes lipídicos varía de una manera correspondiente a las lipoproteínas utilizadas.

El componente lipídico de las lipoproteínas contiene, por ejemplo, de aproximadamente 5% a 40% de fosfolípidos, de aproximadamente 1% a 20% de triglicéridos, de aproximadamente 5% a 30% de ésteres de colesterol, o de 1% a 5% de colesterol o mezclas de los componentes lipídicos mencionados.

Las formulaciones conformes al invento contienen de aproximadamente 1% a aproximadamente 20% de peso en seco de un compuesto de la fórmula I o de una sal del compuesto de la fórmula I.

Las lipoproteínas, que se pueden utilizar en el presente invento, son lipoproteínas como tales, que se presentan de modo natural en animales o seres humanos, lipoproteínas que proceden de fuentes no naturales, o lipoproteínas modificadas químicamente. Se prefieren las lipoproteínas procedentes de animales mamíferos y en particular de seres humanos. Lipoproteínas apropiadas se pueden obtener a partir de animales mamíferos, tales como reses de bovino, caballos o conejos. Son especialmente apropiadas las lipoproteínas procedentes de los pacientes que se han de tratar, puesto que las lipoproteínas autólogas poseen unas toxicidades e inmunogeneidades desde pequeñas hasta nulas.

De modo preferido, son apropiadas las lipoproteínas HDL, y se pueden obtener a partir de animales mamíferos tales como reses de bovino, caballos o conejos. Es especialmente apropiada una HDL procedente del paciente que se ha de tratar, puesto que una HDL autóloga presenta una toxicidad y una inmunogeneidad desde más pequeñas que una HDL procedente de animales mamíferos, hasta nula. Sin embargo, se pueden emplear también fracciones de HDL, subfracciones o constituyentes de HDL en la formulación conforme al invento. Además, la HDL puede ser modificada enzimática o químicamente.

La formulación conforme al invento es apropiada por ejemplo para el tratamiento de

-: enfermedades inmunológicas

-: enfermedades de cáncer, tales como cáncer de pulmón, leucemia, cáncer de ovario, sarcomas, sarcoma de Kaposi, meningioma, cáncer de intestinos, cáncer de ganglios linfáticos, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer de piel

-: enfermedades autoinmunitarias tales como lupus eritematoso sistémico o esclerosis múltiple,

-: enfermedades reumáticas,

-: trasplantes o reacciones del injerto frente al anfitrión (graft versus host) o bien reacciones del anfitrión frente al injerto (host versus graft),

-: reacciones de rechazo agudas, crónicas o hiperagudas después de un trasplante de órganos tales como riñón, piel, hígado, hueso, sangre o pelos,

-: enfermedades, que son causadas por células que proliferan en alto grado,

-: psoriasis o dermatitis atópica,

-: alergia, asma, urticaria, rinitis o uveítis,

-: diabetes del tipo II,

-: fibrosis cística, colitis, fibrosis hepática o sepsis.

El invento se refiere también a un procedimiento para la preparación de la formulación, que está caracterizado porque el compuesto de la fórmula I y/o una sal fisiológicamente del compuesto de la fórmula I y las HDL se llevan, junto con un vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente aceptable y eventualmente otras apropiadas sustancias activas, aditivas o coadyuvantes, a un forma apropiada de presentación.

La formulación conforme al invento se puede aplicar por vía intravenosa o parenteral. Apropiadas formas de presentación galénicas líquidas son, por ejemplo, soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables.

De modo preferido, la formulación se prepara y administra en unidades de dosificación, conteniendo cada una de las unidades, como ingrediente activo, una determinada dosis del compuesto de la fórmula I y/o sales fisiológicamente compatibles del compuesto de la fórmula I. Para el tratamiento de un paciente (con un peso de 70 kg) son indicados en fases tempranas un tratamiento intravenoso por infusión de como máximo 1.200 mg por día, y en la fase de rehabilitación posterior, por infusión de como máximo 3 veces 300 mg por día del compuesto de la fórmula I y/o de las correspondientes sales del compuesto de la fórmula I.

La cantidad de las lipoproteínas, en particular de las HDL en la formulación, es de 0,1 ml a 100 ml por día. El dato cuantitativo de ml de HDL se refiere a la formulación de acuerdo con el Ejemplo 1a, no conteniendo ni el suero ni las HDL ningún compuesto de la fórmula I:

La dosificación que se ha de aplicar es evidentemente dependiente de diferentes factores, tales como el ser vivo que se ha de tratar (es decir, un ser humano o animal), la edad, el peso, el estado general de salud, el grado de gravedad de los síntomas, de la enfermedad que se ha de tratar, de los fenómenos concomitantes eventuales (caso de que existan), del tipo de tratamiento concomitante con otros medicamentos, o de la frecuencia del tratamiento. Las dosificaciones se administran por lo general varias veces por día y, de modo preferido, de una vez a tres veces por día. La cantidad utilizada del compuesto de la fórmula I se orienta en este caso a la dosis diaria recomendada del respectivo compuesto de la fórmula I y a la solubilidad del compuesto I en las HDL. Por lo general, la concentración del compuesto I en la formulación está situada entre 10% y 100% de la dosis diaria recomendada, de modo preferido entre 20% y 80%, y en particular está situada en 50%. La terapia apropiada con las combinaciones conformes al invento consiste, por consiguiente, p.ej. en la administración de una, dos o tres dosificaciones individuales de la formulación conforme al invento, que consta:

1): de 5 mg a 50 mg, de modo preferido de 10 mg a 20 mg de N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-crotónico, y

2): de 0,1 a 10 ml, de modo preferido de 1 ml a 3 ml de las HDL,

dependiendo la cantidad, naturalmente, del número de las dosificaciones individuales y también de la enfermedad que se ha de tratar. Una dosificación individual puede constar también de varias unidades de dosificación, administradas al mismo tiempo. La relación del compuesto de la fórmula I a la cantidad de HDL en las unidades de dosificación depende de la solubilidad del compuesto I en las HDL. Por regla general, por cada mg del compuesto de la fórmula se emplean de 0,01 a 10 ml de HDL, de modo preferido de 0,1 ml a 5 ml de las HDL.

Además, las formulaciones conformes al invento se pueden emplear también en común con otras sustancias activas apropiadas, agentes anti-uricopáticos, agentes inhibidores de la agregación de trombocitos, analgésicos, antiflogísticos esteroidales o no esteroidales, o compuestos supresores de inmunidad, tales como ciclosporina A, FK 506 o rapamicina.

Ejemplo 1 N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-crotónico (Compuesto 1) en fracciones de lipoproteínas procedentes de un suero humano

Tres personas masculinas experimentales voluntarias reciben en tres días consecutivos por vía oral cada vez 100 mg de N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-crotónico en forma de polvo. Aproximadamente a las cuatro horas después de la última medicación, se extraen cada vez 100 ml de sangre. A partir de esta sangre se obtiene por centrifugación un suero.

a) Preparación de las fracciones de lipoproteínas.

El suero de cada persona experimental se lleva a una densidad de 1,020 g/ml mediante incorporación por agitación de KBr sólido, empleándose 0,0199 g de KBr por cada ml del suero. Después de una centrifugación durante 20 horas a 4ºC y 140.000 x g se deposita sobre el suero una capa lipoproteínica de color blanco que contiene "lipoproteínas de muy baja densidad" (VLDL).

Después de separar por pipeteo cuidadosamente esta capa, el suero remanente se mezcla con 0,0628 g de KBr / ml de suero, alcanzándose una densidad de 1,063 g/ml. Después una centrifugación durante 20 horas a 4ºC y 140.000 x g se retira del suero la capa de "lipoproteínas de baja densidad" LDL de color parduzco. El suero remanente se mezcla con 0,234 g de KBr / ml, alcanzándose una densidad de 1,21 g/ml. Después de una centrifugación durante 20 horas a 4ºC y 140 x g se retira la capa de "lipoproteínas de alta densidad" HDL. Las fracciones de HDL obtenidas se introducen en una manguera para diálisis con un límite de exclusión de 6.000-8.000 kD y se dializan durante 72 horas frente a un tampón de pH 7,4. Cada 24 horas se cambia el tampón de 2 a 3 veces. Las fracciones de HDL dializadas se pueden utilizar inmediatamente o se almacenan a -80ºC. Después de la diálisis se lleva a cabo una determinación de las proteínas de las fracciones de HDL dializadas. Se establece un valor de aproximadamente 20 g de proteína por cada ml de fracción de HDL dializada.

b) Extracción del Compuesto 1 a partir de las muestras

Para esto, se sacan cada vez 500 \mul de todas las fracciones lipoproteínicas y adicionalmente del plasma de partida y se añaden gota a gota lentamente en cada caso a 1.200 \mul de acetonitrilo. Las muestras se tratan durante 10 min en un baño de ultrasonidos y se separan por centrifugación durante 10 min a 14.000 x g.

En el caso de las muestras de HDL se forman dos fases, de las que la superior es tratada ulteriormente. De todas las muestras se saca el material sobrenadante y se concentra por evaporación a 60ºC durante una noche en una estufa de desecación. Al día siguiente, las muestras se recogen cada vez en 100 \mul de metanol y se analizan.

c) Método de análisis

Las muestras se analizan con una cromatografía en fase líquida a alta presión (HPLC)

Agente eluyente:	mezcla 0,1 M de H_{3}PO_{4} y acetonitrilo 1:1
Columna :	LiChrospher 100 RP 18, 250 x 4 mm, 5 \mu, entidad Merck AG
Caudal:	1,5 ml/min.
Inyección:	50 \mul por cada muestra

Detección:

con un detector de conjunto de diodos

d) Resultado

Se registra en cada caso una curva patrón con el Compuesto 1. Mediante comparación de los espectros de UV con la sustancia encontrada en las muestras, se pone de manifiesto que en el plasma está presente exclusivamente el Compuesto 1. La cantidad total de la sustancia detectada en el plasma es, en las tres personas voluntarias, como sigue: en la persona experimental 1 (VP1) de 32,0 \mug/ml, en la VP2 de 9,61 \mug/ml y en la VP3 de 36,27 \mug/ml.

Aparte de en el plasma entero, el Compuesto 1 se puede encontrar solamente en las fracciones de HDL. Aquí se comprueban en el caso de la VP1 1,55 \mug/ml, en el caso de la VP2 2,39 \mug/ml, y en el caso de la VP3 1,03 \mug/ml del Compuesto 1.

Ejemplo 2 Influencia de las HDL sobre el efecto del Compuesto 1 en el modelo de ensayo de una encefalomielitis alérgica experimental (EAE) aguda

La realización del experimento se efectúa tal como se ha descrito en la cita de H.W. Schorlemmer y R. R. Bartlett (Agents Actions, 41, Special Conference Issue: C271-C273, 1994)). 10 mg del Compuesto 1 se disuelven en 1 ml de la fracción dializada de HDL. Las HDL se preparan a partir de un suero de rata, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Para esto, 100 mg del Compuesto 1 se añaden a 10 ml de una fracción de HDL dializada, y se agita durante una noche en un agitador magnético a una velocidad intermedia de agitación y a 4ºC. Luego se suspende 3 veces durante 30 s (segundos) con ultrasonidos y se agita durante 4 horas adicionales. Al final, la formulación se trata durante 15 min en un baño de ultrasonidos. La formulación se administra por vía intravenosa a las ratas.

El Compuesto 1 sin HDL se administra a las ratas por vía intravenosa en una concentración de 10 mg/ml de un disolvente (carboximetil-celulosa al 1% en agua). Los datos de concentraciones se refieren en la tabla en cada caso a 1 kg de peso en vivo de una rata. El grupo testigo contiene solamente el disolvente (1% de carboximetil-celulosa en agua) administrado por vía intravenosa. Se emplean en cada caso 5 ratas Lewis por experimento. La Tabla 1 muestra los resultados.

TABLA 1

2

Los resultados muestran que todos los animales en el grupo testigo y 0,2 ml en el grupo de las HDL mueren el transcurso de 17 días. En los grupos de tratamiento con 10 mg del Compuesto 1 y 20 mg del Compuesto 1 se efectúan un comienzo retrasado de la enfermedad y la desaparición de los síntomas después de aproximadamente 26 días. En el grupo de tratamiento con 2 mg del Compuesto 1 aparecen unos síntomas manifiestamente más intensos, y la disminución de los síntomas se efectúa más lentamente. En el grupo de tratamiento con 0,2 ml de HDL y 2 mg del Compuesto 1 - formulación conforme al invento - se efectúan un comienzo retrasado de la enfermedad y la desaparición de los síntomas después de 25 días. El retraso de la enfermedad en el grupo de tratamiento con 0,2 ml de HDL y 2 mg del Compuesto 1 corresponde aproximadamente al del grupo de tratamiento con 10 mg del Compuesto 1, y la gravedad de los síntomas que han aparecido corresponde aproximadamente a la del grupo de tratamiento con 20 mg del Compuesto 1. Por lo tanto, la formulación conforme al invento conduce a una disminución de la dosis del Compuesto 1 con una actividad igual de buena.

Ejemplo 3 Sal de sodio de N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-hept-2-en-6-ino-carboxílico (Compuesto 2)

50 g (0,15 moles) de N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-hept-2-en-6-ino-carboxílico se disuelven en un sistema de dos fases a base de 50 ml de una solución 5 N de hidróxido de sodio y de 500 ml de acetato de etilo, la fase orgánica se separa, se lava dos veces con un poco de agua, se seca sobre sulfato de sodio y se concentra por evaporación. El residuo oleoso se recoge con 500 ml de (butil terciario)-metil-éter y para la cristalización total se agita durante 4 horas (h) a la temperatura ambiente, se filtra y se seca bajo una presión reducida. Para la eliminación total de los restos del disolvente, el producto cristalino se suspende en 500 ml de tolueno durante 10 min a reflujo, se enfría mediando agitación, se filtra de nuevo con succión y se seca bajo presión reducida. Rendimiento: 41,1 g (77%) con el punto de fusión \geq 244ºC con descomposición (desc.).

C_{15}H_{10}F_{3}N_{2}O_{2}Na (330,24 g/mol):

Calculado:	C: 54,0 H: 3,5 N: 8,4 Na: 6,88	(calc. para 1,1% de agua)
Encontrado:	C: 54,4 H: 3,4 N: 8,4 Na: 6,5	agua: 1,1%

Ejemplo 4 Sal de sodio de (4-ciano-fenil)amida de ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico (Compuesto 3)

15 g (0,059 mol) de (4-ciano-fenil)amida de ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico se suspenden en 120 ml de agua y 100 ml de acetona, y se llevan a disolución por adición de 60 ml de NaOH 1 N. Después de haber filtrado con respecto de los vestigios de material sin disolver, se concentra hasta aproximadamente 200 ml en un evaporador rotatorio bajo presión reducida, y se cristaliza durante una noche a 0ºC, se filtra con succión y se seca bajo presión reducida.

Rendimiento: 13 g, p. f. > 280ºC.

C_{14}H_{10}N_{3}Na (275,24

Calculado:	C: 60,7 H: 3,7 N: 15,2	(calc. para 0,7% de agua)
Encontrado:	C: 60,8 H: 3,6 N:15,3	agua: 0,7%

Ejemplo 5 Influencia de las HDL en el modelo de ensayo de un rechazo de trasplante agudo

La realización de los experimentos se efectúa tal como se describe en la cita de H.U. Schorlemmer y colaboradores (Transplant. Proceeding, tomo 25, nº 1 (1993), páginas 763 - 767). Como donantes para los trasplantes sirven ratas hembras Dark Agouti (RTI*avl); las ratas receptoras son ratas Lewis (RTI*I) con un peso corporal de aproximadamente 170 g. Las ratas son puestas a disposición por Charles River-Wega, Sulzfeld, Alemania.

Trozos de piel de la cola, con un tamaño de aproximadamente 0,5 x1,0 cm, se transfieren desde las ratas Dark Agouti (DA) a la cola de las ratas Lewis (LEW). Por cada grupo de tratamiento se emplean 8 animales. El rechazo es definido como una piel trasplantada con consistencia dura y color pardo rojizo. Los Compuestos 2 y 3 así como las fracciones HDL se preparan previamente tal como en el Ejemplo 2 y se administran a los animales por vía intravenosa (i.v.). El tratamiento se efectúa con las formulaciones en el día del trasplante y en los nueve (9) días siguientes una vez por día.

La Tabla 2 muestra los resultados

TABLA 2

3

\hskip0,3cm

DT = desviación típica

La Tabla 2 muestra que las formulaciones que contienen las HDL y un compuesto de la fórmula I, prolongan manifiestamente el momento del rechazo.

Ejemplo 6 Influencia de las LDL en el modelo de ensayo de un rechazo agudo de trasplante

Las LDL se obtienen a partir de un suero de rata, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1a. La realización de los experimentos se efectúa tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. El tratamiento se efectúa con las formulaciones en el día del trasplante y en los siguientes 14 días, en cada caso una vez por día.

La Tabla 3 muestra los resultados

5

6

La Tabla 3 muestra que las formulaciones, que contienen las LDL y un compuesto de la fórmula I, prolongan manifiestamente el momento del rechazo.

Claims

1. Formulación, que contiene por lo menos

1) una lipoproteína,

2) un compuesto de la fórmula I

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3) un vehículo farmacéuticamente compatible, representando

R^{1} a) alquilo (C_{1}-C_{4}), b) cicloalquilo (C_{3}-C_{5}), c) alquenilo (C_{2}-C_{6}) o d) alquinilo (C_{2}-C_{6}),

representando

R^{2} a) -CF_{3}, b) -O-CF_{3}, c) -S-CF_{3}, d) -OH, e) -NO_{2}, f) halógeno, g) bencilo, h) fenilo, i) -O-fenilo, k) -CN, o l) -O-fenilo, sustituido una vez o múltiples veces con

1) alquilo (C_{1}-C_{4}), 2) halógeno, 3) -O-CF_{3} o 4) -O-CH_{3},

representando

R^{3} a) alquilo (C_{1}-C_{4}), b) halógeno, o c) un átomo de hidrógeno, y

representando

X a) un grupo -CH, o b) un átomo de nitrógeno.

2. Formulación de acuerdo con la reivindicación 1, empleándose un compuesto de la fórmula I y/o una forma eventualmente estereoisómera del compuesto de la fórmula I y/o una sal del compuesto de la fórmula I,

representando

R^{1} a) metilo, b) ciclopropilo, o c) alquinilo (C_{3}-C_{5}),

representando

R^{2} CF_{3} ó CN,

representando

R^{3} un átomo de hidrógeno o metilo, y

representando

X un grupo -CH.

3. Formulación de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, empleándose N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-crotónico, (4-ciano-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-ciclopropil-3-hidroxi-acrílico o N-(4-trifluorometil-fenil)-amida de ácido 2-ciano-3-hidroxi-hept-2-en-6-ino-carboxílico.

4. Formulación de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque como lipoproteína se emplean lipoproteínas de baja densidad, una fracción de lipoproteínas de alta densidad, una subfracción de lipoproteínas de alta densidad o un componente de lipoproteínas de alta densidad.

5. Formulación de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque como lipoproteína se emplean HDL_{1}, HDL_{2}, HDL_{3}, HDL_{C}, Apo E, Apo A-I, Apo A-II o mezclas de las mismas.

6. Formulación de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque están contenidas sustancias activas adicionales seleccionadas del grupo de los agentes anti-uricopáticos, agentes inhibidores de la agregación de trombocitos, analgésicos, antiflogísticos esteroidales, antiflogísticos no esteroidales y compuestos supresores de inmunidad.

7. Formulación de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque están contenidas ciclosporina a, FK 506 o rapamicina.

8. Utilización de la formulación de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades inmunológicas.

9. Utilización de acuerdo con la reivindicación 8, para el tratamiento de enfermedades inmunológicas agudas tales como sepsis o alergia, reacciones de injerto frente a anfitrión, reacciones de anfitrión frente a injerto, de reacciones de rechazo agudas, crónicas o hiperagudas después de un trasplante de órganos, tales como riñón, corazón, piel, hígado, hueso, sangre o pelos, de enfermedades autoinmunitarias tales artritis reumatoide, lupus eritematoso sintético, o esclerosis múltiple, psoriasis, dermatitis atópica, urticaria, rinitis, uveítis, diabetes del tipo II, fibrosis cística, colitis, fibrosis hepática, enfermedades de cáncer, tales como cáncer de pulmón, leucemia, cáncer de ovario, sarcomas, sarcoma de Kaposi, meningioma, cáncer de intestinos, cáncer de ganglios linfáticos, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer de piel.

10. Procedimiento para la preparación de la formulación de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se elaboran lipoproteínas de alta densidad y un compuesto de la fórmula I así como un vehículo farmacéutico para dar una forma de presentación farmacéutica.