ES2221357T3 - Agente biologico para la proteccion de las plantas con efecto favorecedor de la resistencia y procedimiento para su obtencion. - Google Patents

Agente biologico para la proteccion de las plantas con efecto favorecedor de la resistencia y procedimiento para su obtencion.

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ES2221357T3 ES99904810T ES99904810T ES2221357T3 ES 2221357 T3 ES2221357 T3 ES 2221357T3 ES 99904810 T ES99904810 T ES 99904810T ES 99904810 T ES99904810 T ES 99904810T ES 2221357 T3 ES2221357 T3 ES 2221357T3
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    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
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Abstract

Preparación a base de plantas, de partes de plantas o de semillas de: (a) la familia de las cariofiláceas, elegidas entre el grupo de las variedades licnis viscaria (Viscaria vulgaris), flor del cuclillo (Lychnis flos-cuculi), borbonesa (Silene dioica), melandrium (Silene noctiflora), clavelito (Dianthus superbus), clavellina de los cartujos (Dianthus carthusianorum) o conejera (Silene alba) y (b) variedades de alfalfa (Medicago), en forma de una mezcla pulverulenta, encontrándose la proporción en peso el polvo, que procede de las cariofiláceas, por encima del 80 % pero por debajo del 99 %: (i) molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas, (ii) recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar, (iii) realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de éste modo, (iv) evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble, (v) secado del residuo, y (vi) mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada variedad de planta, en la proporción deseada.

Description

Agente biológico para la protección de las plantas con efecto favorecedor de la resistencia y procedimiento para su obtención.
La invención se refiere a un agente biológico para la protección de las plantas, nuevo y de nuevo tipo. El agente protector de las plantas propiamente dicho está basado en una preparación específica de plantas y provoca, además de efectos vigorizantes de las plantas, ante todo una inducción de resistencia general, marcada de una manera sorprendentemente intensa en las plantas útiles y de cultivo frente a los efectos patógenos de muchos tipos, especialmente frente al ataque producido por bacterias, hongos e incluso virus. El agente según la invención es altamente eficaz pero no es tóxico bajo ninguna circunstancia y por lo tanto se diferencia de los agentes protectores de las plantas clásicos, basados en su mayoría en compuestos sintetizados químicamente, tales como pesticidas o fungicidas, que frecuentemente están sometidos a ordenanzas legales en muchos países debido a su toxicidad. La invención se refiere también a la preparación vegetal en la que está basado el agente para la protección de las plantas y a un procedimiento para su obtención así como a un procedimiento para la determinación rápida de la actividad biológica de las preparaciones vegetales correspondientes, o bien extractos in vitro. La invención se refiere, además, al empleo de la citada preparación para mejorar suelos dañados mediante vigorizado de los cultivos microbianos del terreno autóctonos. La invención se refiere, finalmente, también a productos que han sido encontrados en la preparación según la invención, y que pueden asociarse con los efectos descritos o que contribuyen a los mismos.
Las enfermedades de las plantas en el caso de las plantas de cultivo o bien de las plantas útiles, o bien la lucha contra las mismas, representan un reto cada vez mayor. Debido a tales enfermedades, así como debido a factores de estrés condicionados por el medio ambiente y/o por el clima, tales como por ejemplo períodos marcados de falta de lluvia o bien de sequía o terrenos ácidos, sobreabonados o cargados con materiales perjudiciales de otro tipo, tienen que aceptarse cada año, mundialmente, considerables pérdidas de cosecha o, bajo ciertas condiciones, se pierde por completo terrenos de cultivo. Frecuentemente los efectos dañinos del medio ambiente y climatológicos condicionan y refuerzan la propagación de enfermedades correspondientes, puesto que las plantas se encuentran bajo un estrés permanente y, de éste modo, quedan debilitadas con respecto a sus fuerzas de defensa naturales.
Las enfermedades de las plantas se combaten en la actualidad, preponderantemente con agentes protectores de las plantas químicos, tradicionales, tales como por ejemplo pesticidas o fungicidas. De éste modo pueden conseguirse, en primer lugar, éxitos rápidos y buenos puesto que tales agentes son en su mayoría muy eficaces y, además, son económicos y pueden prepararse con medios técnicos sencillos, de manera que, especialmente para el tercer mundo son interesantes. Sin embargo los agentes protectores de las plantas químicos, tradicionales, presentan también amplios inconvenientes notables de manera que su empleo es considerado cada vez de una manera más crítica por el público al menos en los países industrializados. De éste modo un inconveniente de la protección química de las plantas consiste en la selección de cepas de patógenos resistentes que se han formado y que se forman en la lucha contra los hongos con la introducción de fungicidas sistémicos. Tales cepas pueden combatirse frecuentemente sólo con agentes todavía más tóxicos. Los fungicidas para las plantas se comportan por lo tanto de manera análoga a la de los antibióticos en medicina, en donde ya son muy virulentos los problemas de resistencia. Además no todas las enfermedades de las plantas, tales como por ejemplo micosis de los vasos, virosis o bacteriosis, pueden ser combatidas con éxito con los agentes conocidos hasta ahora. Otro inconveniente de los agentes químicos para la protección de las plantas se produce debido a su toxicidad, ya citada, frecuentemente considerable, que no solamente se refiere a su manipulabilidad sino también a su efecto sobre el medio ambiente (terrenos, agua potable, etc.). A través de la cadena alimenticia pueden ser absorbidos o sus metabolitos igualmente tóxicos en parte, por los seres humanos y conducir a daños o a enfermedades corporales en parte irreversibles. Por lo tanto los agentes para la protección de las plantas están sometidos en muchos países a la necesidad de su autorización y se tratan cada vez de una manera más restrictiva por parte de las autoridades.
Como una verdadera alternativa a los agentes químicos para la protección de las plantas son considerados los agentes biológicos a base de microorganismos, plantas, extractos de plantas o productos activos individuales aislados de mezclas de productos activos, aún cuando no jueguen todavía un gran papel en la práctica debido a diversos motivos. Ejemplos a éste respecto son el tratamiento de pepinos y de melones contra la antracnosis con extractos de Colletotrichum lagenarium (Caruso, Kuc, 1977, Phytopathology 67, 1285), que es el propio patógeno de la antracnosis. El tabaco ha podido ser protegido, ampliamente, en ensayos en campo abierto contra el hongo azul mediante el tratamiento con suspensiones de esporas de P. tabacina (Tuzun, Kuc, 1989, en: McKeen (Ed.), Blue mold of tobacco, 177, APS Press, St. Paul Minnesota). Además, se conocen extractos de hojas de mata de polígono (Reynoutria sachalinenis) contra los hongos de las plantas (Herger et al., 1989, Nachr. Blatt. Dt. Pflanzenschutzdienst 40, 56). También se ha dado ya información sobre el efecto protector de determinados substratos bacterianos y fúngicos sobre plantas útiles superiores (Schönbeck et al., 1980, Z. PflKrankheiten, PflSchutz 87, 654). Además, se conocen también compuestos individuales definidos, que se presenta en la naturaleza, tales como el ácido salicílico o el ácido acetilsalicílico (por ejemplo Mills, Wood, 1984, Phythopathol., 111, 209) o ácido isonicotínico o bien derivados del ácido isonicotínico (Kunz et al., 1988, EP 0026875), para los cuáles ha podido demostrarse un efecto protector con respecto a las plantas. Se conoce por los autores Neronha et al. (1995, L'Arboriculture Fruitière 482, páginas 17-20), que extractos de determinadas plantas o de determinados puntos de las plantas de la familia cariofiláceas presentan una actividad inductora de cierta resistencia; sin embargo no se ha observado un efecto sinérgico de una combinación correspondiente con otras plantas.
En algunos de los ejemplos conocidos para la protección de las plantas por medio de agentes biológicos se ha dado preferencia o bien se ha provocado la protección mediante resistencia inducida. Se entiende por la expresión resistencia inducida de una planta o también de un microorganismo, en general, la capacidad del organismo correspondiente para inhibir el desarrollo del efecto de factores dañinos mediante determinados tratamientos térmicos o productos, sin que se modifique la constitución genética del organismo. La resistencia del organismo aumenta en general y de manera persistente, lo cuál conduce a una disminución de la intensidad del ataque así como del efecto dañino del ataque aún persistente. La resistencia inducida se caracteriza, entre otras cosas, ante todo por la ausencia de toxicidad de los productos inductores de la resistencia frente a los productos dañinos o bien frente a los organismos dañinos (patógenos), así como por la ausencia de una relación lineal, estricta, dosis-efecto. Otra consecuencia de la resistencia inducida en el caso de las plantas puede observarse a nivel molecular y se refiere a la expresión de diversas proteínas, que se forman tras el ataque patógeno o bien tras el contacto patógeno o bien tras el contacto con el producto inductor de la resistencia, que en sí mismo no es patógeno, y que se denominan proteínas PR ("pathogenesis related proteins"). A las mismas pertenecen, entre otras, las proteínas PR-1, las b-1,3-glucanasas (PR-2), las quitanasas (PR-3), las proteínas similares a la heveína (PR-4) y similares a la taumatina/osmotina (PR-5) (Schneider et al., 1996, Intern. Review of Cytology 168, 303). En muchos casos de resistencia inducida o bien adquirida puede observarse que el efecto no solamente permanece localizado en el punto que ha entrado directamente en contacto con el producto o bien con el patógeno inductores de la resistencia, sino que se extiende de manera sistémica también hasta las partes de la planta no atacadas, todavía sanas. Mediante la inducción de la resistencia se activa de manera duradera por lo tanto un potencial de diversos mecanismos de defensa existentes ya de manera latente en la planta, que dependen, a su vez, del tipo de planta y del patógeno atacante, o bien del producto inductor de la resistencia. Finalmente ésta posibilidad de las plantas para defenderse es comparable, en cierto sentido, con el inmunizado medicinal en el caso de los seres humanos mediante una vacunación activa. Para la protección de las plantas tiene un considerable significado la resistencia inducida puesto que puede ampliar la paleta de sus posibilidades y abarcar enfermedades, que no eran accesibles a un combate por medio de los agentes químicos tradicionales, anteriormente citados. Deben distinguirse de éstos los que presentan un efecto puramente vigorizador de la planta. Los agentes vigorizadores de las plantas se caracterizan por un vigorizado temporal del organismo correspondiente sin que presenten el efecto inmunizante mediante resistencia adquirida o inducida. Los agentes biológicos para la protección de las plantas son, por lo tanto, una alternativa real a los pesticidas, fungicidas y agentes de acción similar, tradicionales, químicos, en su mayoría fuertemente tóxicos, puesto que éstos últimos, como ya se ha indicado, tienen que tratarse cada vez de una manera más restrictiva en lo que se refiere a la autorización administrativa y se enfrentan al rechazo de un amplio público, sensibilizado desde el punto de vista ecológico.
Los agentes biológicos, conocidos hasta el presente, son, sin embargo, difícilmente manipulables (cuando están basados por ejemplo en el propio patógeno de la enfermedad, tales como por ejemplo las suspensiones de hongos o de bacterias), frecuentemente no pueden prepararse de manera sencilla en cantidades suficientes para el amplio empleo en la agricultura o en la economía ecológicas, en parte no son suficientemente específicos o presentan muy frecuentemente una intensidad insuficiente en cuánto a su actividad en comparación con los agentes protectores de las plantas tradicionales. Especialmente en el caso de las plantas que ya han sido atacadas o dañadas, casi no se emplean los agentes biológicos poco conocidos puesto que, en tales casos presentan poca actividad y, frecuentemente, sólo presentan una actividad tardía. El empleo de tales agentes biológicos, protectores contra las plantas, conocidos, o agentes para vigorizar las plantas se limita, por lo tanto, en la práctica la mayoría de las veces, en todo caso, sólo al tratamiento profiláctico, o cuando son reconocibles los primeros signos de un ataque y entonces, por regla general, sólo sobre una pequeña población de plantas.
Así pues, existía la tarea de poner a disposición un agente biológico para la protección de las plantas que no presentase los inconvenientes anteriormente indicados de los agentes conocidos químicos o biológicos para la protección de las plantas y que, además, no solamente fuese un puro agente para el vigorizado de las plantas. Especialmente tenía que ponerse a disposición un agente que pudiese fabricarse de manera relativamente sencilla y altamente eficaz a concentraciones tan pequeñas como fuera posible así como que pudiese ser aplicado para un amplio espectro de plantas y de enfermedades de plantas incluso en el caso de grandes poblaciones de plantas.
Según la invención puede ponerse a disposición un agente de éste tipo. Éste está basado en una preparación vegetal que puede fabricarse fácilmente.
El objeto de la invención consiste, por lo tanto, en una preparación a base de plantas, de partes de plantas o de semillas de (a) la familia de las cariofiláceas, elegidas entre el grupo de las variedades licnis viscaria (Viscaria vulgaris), flor del cuclillo (Lychnis flos-cuculi), borbonesa (Silene dioica), melandrium (Silene noctiflora), clavelito (Dianthus superbus), clavellina de los cartujos (Dianthus carthusianorum) o conejera (Silene alba) y (b) variedades de alfalfa (Medicago), en forma de una mezcla pulverulenta, encontrándose la proporción en peso el polvo, que procede de las cariofiláceas, por encima del 80% pero por debajo del 99%, obtenibles mediante las etapas siguientes: (i)-(vi), llevándose a cabo las etapas (i) hasta (v) independientemente para cada una de las variedades de plantas (a) y (b):
(i)
molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas,
(ii)
recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar,
(iii)
realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de éste modo,
(iv)
evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble,
(v)
secado del residuo, y
(vi)
mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada variedad de planta, en la proporción deseada.
El objeto de la invención es también una preparación en forma de una suspensión acuosa a base de la preparación pulverulenta anteriormente citada.
El objeto de la invención es además un procedimiento para la obtención de una preparación correspondiente pulverulenta o acuosa, adecuada para la protección biológica de las plantas, que se caracteriza porque se llevan a cabo las etapas siguientes, llevándose a cabo las etapas (i) hasta (v) separadamente para cada una de las variedades de plantas (a) y (b):
(i)
molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas,
(ii)
recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar,
(iii)
realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de éste modo,
(iv)
evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble,
(v)
secado del residuo, y
(vi)
mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada variedad de planta (a) y (b), en la proporción deseada, para dar un polvo mixto y en el caso en que se fabrique una preparación acuosa,
(vii)
suspensión del polvo mixto obtenido procedente de (vi) en agua en la concentración prevista.
Lo decisivo para la actividad de la preparación vegetal según la invención consiste en la proporción del material vegetal cariofiláceas con respecto a las variedades de Medicago. La proporción de las cariofiláceas tiene que ser, al menos, del 80% en peso referido a la mezcla pulverulenta, sin embargo no debe sobrepasar el 99%. La actividad para una proporción de cariofiláceas entre el 90 y el 98% es mayor que la de las mezclas con una composición del 80 al 90%. Una mezcla con aproximadamente una proporción del 95% en cariofiláceas y con una proporción del 5% en variedades de Medicago es especialmente preferente según la invención puesto que la actividad como agente biológico protector de las plantas con efecto inductor de la resistencia muestra aquí un máximo relativamente estrecho pero pronunciado. Las preparaciones, que están constituidas únicamente por uno de los dos componentes vegetales citados, son inactivas, sorprendentemente, igual que las preparaciones que presentan una proporción de cariofiláceas claramente por debajo del 80%. La actividad sorprendentemente elevada, acrecentada de una manera súbita, de la preparación según la invención con una proporción en cariofiláceas de aproximadamente el 95% permite suponer que en éste caso se produce un efecto sinérgico de los productos activos formados por las cariofiláceas y las variedades de Medicago.
El objeto de la invención es, por lo tanto, una preparación preferente a base de plantas o de partes de plantas de cariofiláceas y de variedades de Medicago, siendo la proporción en peso del polvo, que procede de la familia de las plantas de las cariofiláceas, mayor que el 90 y hasta el 98%, de forma especialmente preferente del 95% aproximadamente (5% de variedades de Medicago).
Las cariofiláceas representan una familia propia de plantas. Éstas están ampliamente extendidas especialmente en Europa central y se han adaptado, dentro de ciertos límites, a las diversas condiciones del terreno y climatológicas. Las cariofiláceas se encuentran en terrenos ácidos así como también de tipo calcáreo, sin embargo prefieren, por regla general, terrenos pobres en nutrientes. Ejemplos de cariofiláceas, que son adecuadas para la realización de la invención, son clavellina de los prados (Dianthus deltoides), clavellina de penachos (Dianthus armeria), clavellina de los cartujos (Dianthus carthusuanorum), clavelito (Dianthus superbus), conejera (Silene alba), flor del cuclillo (Lychnis flos-cuculi), Licnis viscaria (Viscaria vulgaris), melandrium (Silene noctiflora), borbonesa (Silene dioica), jabonera real y roja (Saponia officinalis), perpétua (Helichrysum bellum), alsine del bosque (Stellaria hoostea campestri), alsine nervada (Stellaria alsine). Son especialmente preferentes la flor del cuclillo (Lychnis flos-cuculi) y la viscaria común (Lychnis viscaria). Según la invención pueden mezclarse también diversas variedades. Preferentemente sin embargo es el empleo de respectivamente sólo una variedad.
También las leguminosas (papilonáceas) representan una familia de plantas; entre éstas existe un gran número de subfamilias (por ejemplo fabáceas), tipos y variedades, que se cultivan mundialmente como plantas útiles y forrajeras. Sus representantes presentan una elevada proporción en proteínas y almidones y no plantean exigencias especiales en cuánto al suelo, puesto que las bacterias enlazantes del nitrógeno, que viven de manera simbiótica en las raíces, contribuyen a mejorar los terrenos. Como ejemplos de representantes de leguminosas puede citarse muchas variedades de trébol, tales como melolito común real (Milolotus officinalis), vulneraria común (Anthyllis), trebol dorado (Trifolium aureum), fenarda (Trifolium camprestre), cuernecillo común (Lotus corniculatus), cuernecillo de los pantanos (Lotus corniculatus), hierba de la herradura (Hippocrepis comosa). Del mismo modo son adecuadas variedades de Medicago, regaliz-tragacanto, cuernecillo de mar (Lotus maritimus), cicércula trepadora (Lathyrus cirru), cicércula pratense (Lathyrus prantensis). Son especialmente adecuadas las variedades de alfalfa tales como por ejemplo alfalfa borde (Medicago falcata) o mielga negra (Medicago lupulina).
Para la preparación de las plantas para la realización de la invención éstas también pueden cultivarse sistemáticamente mediante siembra. Según la invención es preferente en éste caso el empleo de formas silvestres, que no hayan sido influenciadas por medidas de cultivo. El objeto de la invención es, por lo tanto, una preparación correspondiente, que se caracteriza porque el material vegetal empleado procede de formas silvestres no influenciadas mediante reproducción, que crecen, preferentemente, sin tratamiento con abonos minerales y/o pesticidas. Sin embargo esto no significa que el material vegetal necesario pueda obtenerse únicamente a partir de plantas que crezcan de manera silvestre. Por el contrario pueden prepararse también bajo las condiciones citadas mediante plantación específica. Preferentemente es recomendable elegir para cada estación del año un lugar diferente para la plantación, cuyo terreno pueda caracterizarse previamente mediante análisis correspondientes. En principio son suficientes las medidas indicadas en el Reglamento de la Comunidad Europea EG 2092/91 para la producción agrícola ecológica, para conseguir resultados satisfactorios. Las cantidades de semillas, que se requieren por cada hectárea, dependen de la especie a ser sembrada así como de la composición especial del terreno. Por regla general son suficientes de 20 hasta 30 kg de semillas/hectárea. Además es ventajoso para la actividad de la preparación según la invención una siembra de un cultivo precedente, especialmente de maíz o de trigo. En general habrá que tomar en cuenta que antes y durante el período vegetal de las cariofiláceas/leguminosas no se produzcan factores de estrés adicionales tales como por ejemplo ataque por pestes o contaminación con venenos ambientales. Cuando se utilicen para la obtención de la preparación según la invención semillas, pueden conseguirse resultados todavía mejores mediante la eliminación por medio de un tamiz de las semillas débiles o enfermas. Las preparaciones según la invención, que pueden prepararse a partir de dicho material vegetal, muestran una actividad especialmente elevada. En algunos casos puede observarse un efecto protector de las plantas digno de consideración sólo en las plantas iniciales tratadas de éste modo. Probablemente se han atrofiado ya en gran medida las fuerzas de defensa latentes originales en las formas cultivadas según los métodos usuales corrientemente o bien modificadas por su reproducción de tal manera, que ya no son adecuadas para la finalidad de la invención.
En principio pueden emplearse todas las partes de las plantas de las variedades de las cariofiláceas o bien de Medicago para la obtención de la preparación según la invención, es decir, por ejemplo, tallos, hojas, raíces, flores o semillas. Preferentemente se emplearán, sin embargo, las semillas de las variedades correspondientes.
Así pues el objeto de la invención es una preparación correspondiente caracterizada porque las partes vegetales que se emplean son semillas. El polvo, preparado de acuerdo con el procedimiento de la invención, constituido por ambas familias de plantas, citadas, es almacenable sin problemas durante un período de tiempo prolongado y puede ponerse a disposición directamente para el empleo para el tratamiento de las plantas amenazadas o enfermas en el mejor de los casos en forma de suspensiones acuosas. Cuando se utilizan grandes cantidades sobre grandes superficies, especialmente en las explotaciones agrícolas y en la industria agrícola es ventajoso combinar en polvo, en primer lugar, con un soporte o carga. En éste caso, son adecuados todos los materiales conocidos para éstas finalidades, así por ejemplo harinas minerales, polvo de silicato de magnesio o harina de algas. Según la invención se mezclarán, según la variedad de planta a ser tratada, desde 2 hasta 8 g de polvo mixto vegetal con 98 hasta 92 g de la carga correspondiente. El objeto de la invención, por lo tanto, una preparación correspondiente que contiene, adicionalmente, cargas o materiales de soporte, siendo preferentemente la proporción en peso del polvo mixto, procedente de las plantas, del 2 al 8% referido a la carga/material de soporte. Ésta mezcla lista para su aplicación puede recogerse ahora a su vez en agua y emplearse en forma de suspensión acuosa para el tratamiento. Según la invención se emplean de 50 hasta 400 g, preferentemente de 100 hasta 200 g de una mezcla total de éste tipo (polvo vegetal más carga/material de soporte) por cada hectárea. En último lugar la cantidad depende de diversos factores, tales como la variedad de la planta, el tipo del ataque, el desarrollo del ataque, los daños ya existentes, las características del terreno, etc. Tal como ya se ha indicado se recoge o bien se suspende la preparación pulverulenta, según la invención, con o sin cargas, preferentemente en agua y la suspensión obtenida se utiliza para la aplicación directa mediante pulverización, regado, impregnación o de una manera similar. En éste caso tiene un significado decisivo tanto para la actividad como también para la economía de la preparación según la invención, la concentración en la que pueda o deba encontrarse el polvo mixto vegetal citado en ésta solución acuosa. Así pues el objeto de la invención es una preparación correspondiente, caracterizada porque se presentan en forma de suspensión acuosa mediante la adición de agua, siendo la concentración del polvo mixto, procedente de las plantas, desde 0,1 mg hasta 2 mg/litro, preferentemente desde 0,5 hasta 1,0 mg/litro, de forma especialmente preferente desde 0,5 hasta 0,6 mg/litro (referido únicamente al polvo vegetal). Una gran parte de la idea inventiva de la presente solicitud está basada en éste valor sorprendentemente bajo. Además debe considerarse sorprendente que concentraciones mayores, por ejemplo de 5 mg/litro, muestran un menor efecto inductor de la resistencia en la mayoría de los casos.
Así pues, el objeto de la invención es, también, el empleo de la preparación citada como agente biológico para la protección de las plantas, especialmente como agente con efecto inductor de la resistencia. La expresión de la resistencia inducida se ha definido según la invención de acuerdo con las indicaciones dadas en la introducción. La preparación según la invención presenta en éste caso, en tanto en cuánto han sido medidas, todas las características correspondientes que entran en consideración para el efecto de la resistencia inducida. La preparación es altamente eficaz a las concentraciones indicadas en una amplia paleta de plantas diferentes tales como cereales u hortalizas así como también en planas ornamentales, árboles ornamentales o plantas para la industria forestal y, concretamente, contra una pluralidad de tipos de hongos patógenos, entre los cuáles se encuentra el mildíu real, así como frente al ataque por parte de bacterias e incluso por parte de virus. Se ha podido observar, por ejemplo, que el tabaco no solamente puede protegerse, después del tratamiento, contra el ataque del virus del mosaico del tabaco (TMV), sino que se observa en las plantas de tabaco, atacadas ya con el TMV una fuerte disminución el deterioro de las hojas. Así pues el objeto de la invención es el empleo de la preparación citada para conseguir y favorecer la resistencia inducida en plantas útiles y de cultivo frente a efectos patógenos y factores condicionados por el estrés, especialmente en el caso de infecciones bacterianas, fungicidas o víricas. Según la invención se entenderán por la expresión "influjos patógenos o factores condicionados por el estrés" también todas las solicitaciones y deterioros de las plantas provocados por venenos ambientales, carga del terreno, estrés climatológico, tales como períodos de sequía y de frío, fuerte y radiación solar o bien UV, o incluso una aplicación de abono excesiva y/o parcial. Frecuentemente son precisamente tales factores o influjos los que debilitan las fuerzas de defensa de las plantas y, de éste modo, posibilitan un ataque por hongos, por bacterias o por virus.
Además del efecto o bien del empleo como agentes protectores de las plantas biológicos, no tóxicos, inductores de la resistencia, que, por lo tanto, no quedan sometidos a los procedimientos administrativos de autorización, la preparación según la invención presenta también efectos vigorizantes de las plantas, que pueden hacerse notar, por ejemplo, en una mayor producción de clorofila, en un crecimiento más vivo, en un crecimiento vigorizado de las raíces y de manera similar. La cuantía de éste efecto depende, desde luego, fuertemente de la variedad de la planta y de otros factores externos. Es perfectamente posible que en algunos casos el efecto de la resistencia inducida no vaya acompañado de un efecto vigorizante o vaya acompañado por un efecto vigorizante inapreciable. Para poner especialmente de manifiesto el efecto vigorizante no es suficiente, por regla general, un solo tratamiento, en contra de lo que ocurre para la inducción de la resistencia.
La preparación según la invención puede aplicarse, entre otras, a las plantas en crecimiento, preferentemente puede ser aplicada por pulverización. En éste caso, para el tratamiento profiláctico, se tratarán con la suspensión acuosa las plantas recién germinadas o las plantas jóvenes, que acaben de hayan desarrollado precisamente la primera, la segunda o la tercera hoja. En el caso de plantas ya atacadas se verifica el tratamiento inmediatamente después que se haya detectado el deterioro. Alternativamente pueden tratarse también las semillas mediante pulverización o mediante impregnación como paso previo a la siembra. Éste método se ha mostrado como especialmente eficaz para impedir el ataque o los deterioros. Otro método según la invención consiste preferentemente en la pulverización o en la aplicación mediante riego de las superficies de los terrenos, sobre las cuáles deban crecer las plantas a ser protegidas. De éste modo la planta en germinación puede absorber los productos de la preparación según la invención, responsables del efecto, con lo cuál se refuerza en el sentido citado la fuerza de defensa de las plantas en desarrollo.
El tratamiento del terreno con la preparación según la invención tiene, sin embargo, además otro efecto positivo e inventivo. Se ha podido observar, concretamente, que la preparación según la invención vigoriza o bien regenera, sorprendentemente, los cultivos microbianos del terreno, que se encuentran en el terreno y que son responsables de un crecimiento sano de las plantas que crecen en el mismo. El empleo de la preparación según la invención puede extenderse, por lo tanto, también al saneado de terrenos cargados o bien para la mejora de terrenos agotados. La preparación según la invención se incorpora en éste caso en el terreno, pudiéndose conseguir una mejor distribución del material hasta una profundidad deseada, determinada, con la aireación simultánea del terreno, por medio de un o varios removidos del terreno. La actividad de los cultivos útiles en el terreno puede seguirse en éste caso según los métodos normalizados durante el proceso de saneado. Mediante la combinación del tratamiento del terreno y del tratamiento de las plantas o bien de las semillas pueden conseguirse, por lo tanto, resultados especialmente ventajosos. El efecto sorprendente, adicional, positivo sobre los microorganismos hace que la preparación según la invención sea adecuada también para su empleo a modo de estiércol, o bien como acelerador para la formación del estiércol. En éste caso pueden reprimirse en gran medida, como se ha observado, especialmente también las bacterias dañinas de la podredumbre. En éste sentido puede emplearse con éxito la preparación según la invención también para la conservación y el mantenimiento prolongados por ejemplo de plantas cortadas, especialmente de flores cortadas. El objeto de la invención es, por lo tanto, también el empleo de la preparación según la invención para el vigorizado y la regeneración de microorganismos útiles que se presentan especialmente en los terrenos. Las preparaciones según la invención abarcan también aquellas preparaciones a base de plantas o de partes de plantas de la familia de las cariofiláceas y de las leguminosas que pueden contener adicionalmente otros componentes. Tales componentes pueden ser, en principio, aditivos para los abonos, especialmente de base orgánica, aditivos para mejorar los terrenos, con inclusión de microorganismos útiles, o aditivos que sean capaces de vigorizar o de regular el efecto de la preparación según la invención.
Los aditivos vigorizantes en el sentido de la invención pueden ser los agentes protectores de las plantas tradicionales, cuando el ataque o bien el deterioro de las plantas correspondientes sea ya tan intenso que tenga que apoyarse, al menos temporalmente, el efecto según la invención, por medio de tales aditivos, para poder salvar todavía la planta. En éstos casos la cantidad necesaria de agentes tradicionales protectores de las plantas es, en general, sensiblemente menor que sin el empleo de la preparación según la invención de manera que la carga del medio ambiente es claramente menor con tales aditivos con empleo de la preparación según la invención.
Los aditivos reguladores en el sentido de la invención son, preferentemente, preparaciones vegetales, que sean capaces de regular, especialmente, el efecto vigorizante de las plantas de la preparación según la invención en el caso en que esto sea deseable. Puesto que pueden reproducirse en las plantas tratadas, muy frecuentemente, determinados componentes debido a la aplicación de la preparación según la invención, puede ser deseable reducir de nuevo éste efecto o incluso reducirlo por debajo de la medida normal. Ejemplos a éste respecto son el contenido en nicotina de las plantas de tabaco o el contenido en proteínas de cereales necesarios para determinadas aplicaciones (por ejemplo cebada cervecera). Un ejemplo de un aditivo regulador, de éste tipo, está constituido por los polvos, obtenidos de acuerdo con el procedimiento según la invención, a partir de plantas de mostaza o de cerezas silvestres. La proporción de tales aditivos reguladores en el conjunto de la mezcla puede estar comprendida, según la invención, entre el 0,5 y el 10%. Los aditivos se añaden ventajosamente en forma pulverizada a los polvos vegetales según la invención y se mezclan con éste. La preparación según la invención presenta, en resumen, las siguientes ventajas importantes: provoca resistencia inducida en las plantas tratadas, de las variedades más diversas. Ésta puede observarse tanto en el caso de las plantas no atacadas (como profilaxis) así como también en el caso de las plantas tratadas. El grado de actividad de las plantas atacadas se encuentra, en promedio, entre 30 y 75%, preferentemente entre 50 y 70%, es decir que, por ejemplo, el deterioro de las hojas después de un solo tratamiento, es únicamente del 25 al 70% (30 a 50%) del ataque original. En determinados casos pueden conseguirse también grados de actividad por encima del 90%. El material vegetal o los terrenos tratados de manera profiláctica no presentan, en la mayoría de los casos, ataque o únicamente presentan un ligero ataque cuando las plantas quedan sometidas al patógeno después del tratamiento con la preparación según la invención. Mediante la preparación según la invención pueden tratarse con éxito enfermedades fúngicas tales como mildíu, mildíu real, moho azul y moho gris en un gran número de plantas de cultivo, tales como tomates, pepinos, trigo, etc. Debe señalarse especialmente la actividad de la preparación frente al virus del mosaico del tabaco en plantas de tabaco. Éste es el primer caso en el que es activo en gran medida un agente biológico, basado en plantas, frente al ataque vírico en plantas. La preparación según la invención no tiene efecto tóxico frente al patógeno generador de la enfermedad de las plantas, por ejemplo frente al bacterium, frente al hongo o frente al virus y, de éste modo, cumple una condición previa importante para la presencia de la resistencia inducida. Se ha podido observar, en concreto, que la preparación según la invención no perjudica en modo alguno el crecimiento micelar de los hongos, en función de la concentración, es decir que no tiene efecto fungicida y, de éste modo, se encuentra en oposición a los agentes clásicos protectores de las plantas. Además pudo observarse que se forman proteínas PR importantes, responsables de la inducción de la resistencia, tales como, entre otras, quitinasas y b-1,3-glucanasas cuando se aplica la preparación según la invención sobre las plantas, de una manera fuertemente vigorizada (aumento del 30 hasta el 50%). Es especialmente digno de consideración, también, la concentración mínima de producto activo según la invención, que presenta un máximo relativamente estrecho entre 0,5 mg y 1 mg/litro. Los extractos naturales, protectores de las plantas, que actúan a concentraciones comparativamente pequeñas, no son conocidos hasta el presente. La preparación según la invención hace que las plantas tratadas sanen o que permanezcan sanas. Al mismo tiempo se activan también efectos vigorizantes de las plantas. En resumen pueden conseguirse de éste modo, en muchos casos, aumentos de las cosechas de un 20 hasta un 50%, incluso a escala de campo abierto (en función de las otras condiciones especiales). Éstos aumentos pueden conseguirse incluso en comparación con las plantas de control sanas (sin tratamiento con la preparación según la invención). Esto significa que el empleo de la preparación según la invención conduce, por ejemplo, por medio del tratamiento profiláctico del terreno y/o de las semillas/plantas a un aumento de la cosecha de las plantas sanas y con defensas fuertes.
La preparación según la invención puede prepararse de la manera siguiente quedando incluidas variantes y modificaciones obvias en tanto en cuánto no se diga otra cosa al respecto. El tratamiento o bien el cultivo de las plantas ha sido ya descrito anteriormente. En éste caso se señalará de nuevo que para cada representante de ambas familias de plantas según la invención (cariofiláceas y leguminosas) debe llevarse a cabo, preferentemente, una vía propia de preparación hasta la formación de la mezcla correspondiente para conseguir el efecto completo según la invención. Si se parte de plantas o bien de partes de plantas, éstas se secarán cuidadosamente en primer lugar según los métodos usuales. En éste caso deben evitarse temperaturas por encima de 40ºC, así como también para todas las etapas del procedimiento. El material vegetal, secado, quedando incluidas también las semillas, se muele finamente en un molino usual en el comercio. El tamaño de grano no debe ser menor que 0,05 mm y no debe ser mayor que 0,5 mm para conseguir efectos óptimos en la extracción. Preferentemente el material molido presenta un tamaño medio de grano desde 0,1 hasta 0,2 mm. El material molido se combina ahora con un disolvente orgánico, polar y la suspensión obtenida se agita intensamente, preferentemente a temperatura ambiente. En general las temperaturas claramente por debajo de 15ºC están relacionadas con una pérdida de actividad y, por lo tanto, deben ser evitadas. Como disolventes orgánicos, polares, son adecuados, especialmente, alcoholes inferiores, por ejemplo etanol, n-propanol, iso-propanol o n-butanol. También son posibles mezclas de diversos alcoholes. El etanol es especialmente preferido. El metanol puede emplearse sólo de manera condicional. Para todos los disolventes empleados se cumple que deben ser de alta pureza, es decir que no deben contener por ejemplo productos desnaturalizados u otras impurezas. El disolvente puede contener de 0 hasta 30% de agua. Una proporción mayor de agua dificulta, desde luego, muy frecuentemente la eliminación necesaria, ulterior, del disolvente. Según la invención se emplearán de una hasta cuatro partes en volumen de disolvente, preferentemente 1,5 hasta dos partes en volumen de disolvente por cada parte de volumen del material vegetal molido. Se lleva a cabo una extracción bajo agitación durante tres hasta seis, preferentemente cuatro hasta cinco días, preferentemente a temperatura ambiente. En caso dado se añade un poco de disolvente a la carga para compensar el efecto de dilución. A continuación se elimina cuidadosamente el disolvente, en el caso más favorable por medio de un evaporador rotativo bajo ligero vacío, no debiéndose sobrepasar temperaturas de 40ºC. También es adecuado dejar que se produzca una evaporación entre 30 y 40ºC. Por lo tanto es esencial según la invención que durante la extracción no se separen los productos disueltos sino que, por el contrario, sean alimentados de nuevo al residuo sólido, "desprendido". El residuo obtenido de éste modo, en caso dado todavía húmedo, se seca con un aparato usual en el comercio para el secado, debiéndose conseguir un contenido en humedad menor que el 10%. De éste modo se obtiene un producto pulverulento, exento de residuos y de disolventes, que puede ser considerado como inocuo desde el punto de vista de la salud de acuerdo con las normas para los productos peligrosos.
Los polvos obtenidos, que proceden de plantas de las cariofiláceas y de las variedades de Medicago se mezclan a continuación, de acuerdo con las proporciones anteriormente indicadas y que se han indicado en las reivindicaciones, en caso dado con aporte de calor con las cargas/materiales de soporte citados y se disuelven o bien se suspenden en agua directamente antes de la aplicación, ajustándose las concentraciones indicadas.
En el ensayo de las preparaciones según la invención con respecto a las substancias que contienen productos activos se ha encontrado que, además de una serie de fitoesteroles, están presentes también al menos tres compuestos brasinoesteroides, no habiéndose podido identificar todavía un compuesto, habiéndose identificado uno de ellos como 24-epi-castasterona ((22R,23R,24R)-2,3,22,23-tetrahidroxi-24-metil-5a-colestan-6-ona), siendo el otro la 24-epi-secasterona ((22R,23R,24R)-22,23-dihidroxi-2b,3b-epoxi-24-metil-5a-colestan-6-ona). Ésta última no era conocida todavía como producto natural. Así pues la invención se refiere también al empleo de la 24-epi-secasterona y de la 24-epi-castasterona como agentes favorecedores de la resistencia para plantas. En el día de la solicitud no se conocía todavía si éstos compuestos eran los únicos responsables del efecto favorecedor de la resistencia o si participan en ello además otras substancias, o si juega un papel un efecto sinérgico de diversos componentes de la composición según la invención. Los brasinoesteroides pertenecen a las fitohormonas y son conocidos como reguladores del crecimiento de las plantas con actividad favorecedora del crecimiento. En general se presentan en cantidades de
ng - mg/ kg de material vegetal (por ejemplo Clouse y Sasse, 1998, Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 427). La 24-epi-castasterona puede aislarse, por ejemplo, a partir del alga verde Hydrodicton reticulatum (Yokata et al., 1987, Phytochemestry, 26, 503 o partir de Beta vulgaris (Schmidt, J. Et al., 1994, Phytochemestry, 36, 175). La 24-epi-secasterona era conocida hasta ahora únicamente como producto sintético (Voigt et al., 1995, J. Chem, Soc. Perkin Trans 1, 1495). Además se ha identificado en el composición según la invención una serie de fitoesteroles, tales como espinasterol, colesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, estigmast-22-en-3b-ol, 24-metilcolest-7-en-3b-ol, espinasterol, sitosterol, sitostanol, dihidroespinasterol, 24-metilcolesta-5,22-dien-3b-ol y 24-metilcolesta-7,22-dien-3b-ol. La cantidad principal de ésta fracción corresponde al espinasterol (85-90%).
Los ejemplos siguientes explican mejor la invención sin limitarla:
Ejemplo 1
Se muelen 1,2 g de semillas de flor del cuclillo (Lychnis flos-cucculi) en un molino para especias (tamaño medio de las partículas 0,12 mm). El polvo se seca de tal manera, que presente un contenido en humedad residual del 7 al 8%. El polvo se recoge con 20-30 ml de etanol puro (al 99%) y se agita por medio de un agitador eléctrico de laboratorio aproximadamente durante 100 h a 20 hasta 25ºC. En caso en que la mezcla se vuelva demasiado espesa, se añadirá etanol en la cantidad correspondiente. Una vez verificada la extracción se elimina cuidadosamente el disolvente a temperatura ambiente en el evaporador rotativo. El residuo se continúa secando en caso dado hasta que se presente un polvo fino.
Ejemplo 2
De manera análoga a la del ejemplo 1 se muelen semillas de alfalfa borde (Medicago falcata) (1,2 g) y se somete a la extracción por agitación. Se obtiene igualmente un polvo seco.
Ejemplo 3
Se mezclan íntimamente entre sí 950 mg de polvo, preparado según el ejemplo 1, y 50 mg del polvo, preparado según el ejemplo 2. Se añaden 50 mg de ésta mezcla a 100 litros de agua y se mezclan perfectamente. La disolución puede emplearse directamente para la pulverización de aproximadamente 100 m^{2} de superficie de campo.
Ejemplo 4
Se preparan, como se ha descrito, 6 g de una mezcla obtenida a partir de hojas de borbonesa (Silene dioica) y de hojas de alfalfa (5,7 g de polvo de clavel, 0,3 g de polvo de alfalfa). Ésta mezcla se añade a 96 g de harina mineral, o bien se mezcla íntimamente con la misma. Se añaden a ésta mezcla 10.000 litros de agua en un tanque con agitador con una capacidad aproximada de 15.000 litros La cantidad es suficiente para tratar una hectárea de superficie de cultivo.
Ejemplo 5
Se cultivan en un invernadero plantas de tabaco de la variedad con reacción hipersensible "Xanthi NN". Una parte de las plantas se pulveriza con agua, a la que se ha añadido 0,125% de Tween 20 a modo de humectante. Éstas plantas representan los controles. La otra parte de las plantas se pulverizan con una disolución, que contiene 1 mg/litro de harina vegetal (mezcla 95/5 formada por clavel/alfalfa) e igualmente Tween 20 como agente humectante (0,125%). Al cabo de 5 días de incubación se inoculan las plantas con el virus del mosaico del tabaco. Para ello se molió en el mortero previamente material vegetal atacado por TMV en tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH = 6,8) y se combinó con un poco de carborundum a modo de abrasivo. Ésta suspensión se unta a continuación con un pincel sobre la segunda y la tercera hoja vegetativa (contado desde abajo) de las plantas tratadas y también de las plantas de control. Al cabo de 6 semanas se evaluó el cuadro de deterioros o bien el ataque ( % de la superficie de la hoja, diámetro de las lesiones en mm).
TABLA 1
1
Ejemplo 6
De manera análoga a la del ejemplo 5 se infectan con mildíu real plantas de trigo tras el tratamiento con la preparación según la invención (plantas de control: únicamente con agua) y se determinaron los deterioros en las hojas. Los resultados pueden verse en la tabla 2.
TABLA 2
2
Ejemplo 7
De manera análoga a la del ejemplo 5 se infectaron con mildíu real pepinos tras el tratamiento con la preparación según la invención (plantas de control: únicamente con agua) y se determinaron los daños en las hojas. Los resultados pueden verse en la tabla 3.
TABLA 3
3
Ejemplo 8
De manera análoga a la del ejemplo 5 se infectaron con el hongo gris (Botrytis cinerea) plantas de tomate tras el tratamiento con la preparación según la invención (plantas de control: únicamente con agua) y se determinaron los daños en las hojas. Un tratamiento con la preparación según la invención en una concentración de 0,6 mg/litro provoca una reducción de los daños en las hojas, en comparación con los controles no tratados pero infectados también con el moho gris, en un 55-65%. Un tratamiento con una solución con una concentración diez veces mayor de la preparación según la invención provocó una disminución de los deterioros únicamente entre el 48 y 56%.
Ejemplo 9
De acuerdo con el ejemplo 5 se cultivan en el invernadero trigo, tomates, plantas de pepino y de judías y se tratan con la preparación según la invención, tal como se ha descrito. Una parte de las plantas se emplea modo de control. A continuación no se llevó a cabo una infección con los patógenos de las enfermedades en éstos ensayos. Al cabo de seis semanas se determinan diversos parámetros tales como peso fresco, superficie de las hojas, longitud de los tallos y contenido en clorofila según los métodos normalizados usuales y se comparan con los de las plantas de control. En todos los casos, con una sola excepción, puede observarse un aumento de los parámetros citados:
Peso fresco:
aumento del 21 (trigo) hasta el 57% (tomate);
Longitud de los tallos:
aumento del 15 (judías) hasta el 34% (tomates);
Contenido en clorofila:
aumento del 8 (trigo) y 76% (pepino), o bien 90% (judías), únicamente en el caso de los tomates no pudo detectarse un aumento significativo del contenido en clorofila.
Ejemplo 10
Se pulverizan superficialmente 10 litros de una disolución de la preparación según la invención con una concentración de 0,6 mg/litro sobre un terreno de cultivo (superficie: aproximadamente 10 m^{2}) en el invernadero. Sobre éste terreno se plantan trigo, tomates y plantas de judía. Una parte de las plantas se cultiva, a modo de control, sobre terreno no tratado pero con todas las demás condiciones idénticas. Al cabo de seis semanas se determinan diversos parámetros tales como peso fresco, superficie de las hojas, longitud de los tallos y contenido en clorofila y se comparan con los de las plantas de control. Mientras que en el caso del trigo y del tomate, bajo éstas condiciones, no se observa un aumento significativo de los parámetros citados, en el caso de las plantas de judías aumenta el peso fresco en un promedio del 21%, la superficie de las hojas en un 18%, la longitud de los tallos en un 25% y el contenido en clorofila en un 5% frente a las plantas de control correspondientes.
Ejemplo 11
Se mide el crecimiento micelar del patógeno del tizón tardío de la patata, Phytophtora infestans, en presencia de diversas concentraciones de la preparación según la invención sobre V8-Agar. Pudo observarse que el crecimiento micelar en todo el intervalo medido de concentraciones, entre 0,5 y 100 mg/litro de la preparación según la invención, no queda influenciado de manera significativa. Esto significa que el agente según la invención no ejerce efecto tóxico sobre el hongo. Por lo tanto no puede explicarse el efecto según la invención por un efecto fungicida, como ocurre en el caso de los agentes tradicionales protectores de las plantas.
Ejemplo 12 Purificación e identificación de brasinoesteroides
Se extrajo polvo, preparado según el ejemplo 1 (25 g), tres veces con 200 ml de metanol en el transcurso de una semana y, a continuación, tres veces con 200 ml de una mezcla constituida por metanol/acetato de etilo (1:1 v/v) igualmente durante una semana. Los extractos reunidos se concentraron en vacío. El residuo se sacudió con agua/acetato de etilo(1:1 v/v). Las fases reunidas de acetato de etilo se concentraron en vacío y el residuo se sacudió tres veces con una mezcla de metanol (al 90%)/n-hexano. Las fases acuosas de metanol reunidas se concentraron y se sacudieron con una mezcla formada por acetato de etilo/disolución saturada de bicarbonato de sodio (1:1 v/v). El residuo de las fases de acetato de etilo se cromatografió sobre una columna de gel de sílice (20 cm x 1 cm, gel de sílice de 35-70 mallas, Merck, Alemania). La columna se eluyó, sucesivamente, con cloroformo (50 ml) y, a continuación, con metanol en cloroformo (2, 5, 10, 15, 20, 100 v/v %, respectivamente 50 ml). El eluato se acumuló en fracciones de 25 ml. La actividad biológica se midió con el ensayo de inclinación Reis-Lamina. Éste ensayo se desarrolló especialmente para el grupo de fitohormonas de los brasinoesteroides (Arima et al., 1984, Phytochemestry 23, 1587). La fracción con actividad biológica (fracción 5) se purificó adicionalmente mediante cromatografía preparativa HPLC (4,6 x 250 mm, columna Ultrasphere ODS RP-18). La fase móvil estaba constituida por A (agua, 0,1% TFA v/v) y B (metanol) con una velocidad de flujo de 1 ml/min. El perfil del gradiente fue: 0-1 min.: 100% A, 1-10 min.: 0-40% B (lineal),
10-15 min.: 40 B, 15-27 min.: 40-100% B (lineal), 27-35 min.: 100% B, 35-37 min.: 0-100% A (lineal). Las fracciones activas tenían un tiempo de retención de 25,5-29,5 min. y se concentraron y se derivatizaron con objeto de realizar análisis GC-MS. Se emplearon las siguientes condiciones: El (70 eV), fuente de temperatura 200ºC, columna:
DB-5MS (J&W, 15 m x 0,32mm, espesor de la película 0,25 mm), temperatura de inyección: 260ºC, temperatura de la interfase: 300ºC, gas portador: helio, velocidad de flujo: 1 ml/min.; programa de temperatura de la columna: 170ºC durante 1 min., calentamiento hasta 290ºC con una velocidad de 30ºC/min., 20 min. a 290ºC. La derivatización se llevó a cabo según los métodos normales. Para la identificación de la 24-epi-castasterona y de la 24-epi-secasterona se ensayaron también muestras auténticas procedentes del sistema GC-MS.
Purificación e identificación de fitosteroles
La fracción de n-hexano, anteriormente obtenida, se concentró, se dividió en dos porciones y se cromatografió en dos columnas de gel de sílice idénticas (20 cm x 1 cm, 35-70 mallas, Merck). Las columnas se eluyeron, escalonadamente, con n-hexano (50 ml) y, a continuación, con acetato de etilo en n-hexano (10, 30, 50, 70, 90 v/v %, respectivamente 50 ml). El eluato se acumuló en fracciones de 6 ml y se separó por medio de DC (eluyente: cloroformo/metanol, 95:5 v/v). Los fitoesteroles se hicieron visibles mediante sobrepulverización con ácido sulfúrico al 5% en anhídrido acético y calentamiento de las placas DC a 150ºC. Las fracciones, que contenían los fitoesteroles, se purificaron adicionalmente mediante columnas de gel de sílice, empleándose como agente eluyente diclorometano/heptano (1:1 v/v). La fracción que contenía el esterol se acetalizó y se analizó por medio de GC-MS de acuerdo con los métodos usuales.

Claims (25)

1. Preparación a base de plantas, de partes de plantas o de semillas de (a) la familia de las cariofiláceas, elegidas entre el grupo de las variedades licnis viscaria (Viscaria vulgaris), flor del cuclillo (Lychnis flos-cuculi), borbonesa (Silene dioica), melandrium (Silene noctiflora), clavelito (Dianthus superbus), clavellina de los cartujos (Dianthus carthusianorum) o conejera (Silene alba)y (b) variedades de alfalfa (Medicago), en forma de una mezcla pulverulenta, encontrándose la proporción en peso el polvo, que procede de las cariofiláceas, por encima del 80% pero por debajo del 99%, obtenibles mediante las etapas siguientes: (i)-(vi), llevándose a cabo las etapas (i) hasta (v) independientemente para cada una de las variedades de plantas (a) y (b):
(i)
molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas,
(ii)
recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar,
(iii)
realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de éste modo,
(iv)
evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble,
(v)
secado del residuo, y
(vi)
mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada variedad de planta, en la proporción deseada.
2. Preparación según la reivindicación 1, caracterizada porque la proporción en peso del polvo, que procede de las cariofiláceas es del 90 al 98%.
3. Preparación según la reivindicación 2, caracterizada porque la proporción en peso entre el polvo de las cariofiláceas y el polvo de las variedades de Medicago es de 95 a 5.
4. Preparación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el material vegetal empleado procede de formas silvestres no influenciadas por reproducción, que han crecido preferentemente sin tratamiento con abonos minerales y/o pesticidas.
5. Preparación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque se emplean semillas de las plantas correspondientes.
6. Preparación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque contienen compuestos del grupo de los brasinoesteroides.
7. Preparación según la reivindicación 6, caracterizada porque contiene 24-epi-secasterona y /o 24-epi-castasterona.
8. Preparación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque adicionalmente contiene materiales de soporte o bien cargas sólidas, pulverulentas.
9. Preparación según la reivindicación 8, caracterizada porque la proporción en peso del polvo mixto procedente de las plantas supone, con relación a las cargas/materiales de soporte, del 2 al 8%.
10. Preparación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque adicionalmente contiene aditivos vigorizantes o reguladores del efecto.
11. Preparación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 10, obtenibles según un procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 15 a 24.
12. Preparación en forma de una suspensión acuosa a base de la preparación pulverulenta según las reivindicaciones 1 a 11.
13. Preparación según la reivindicación 12, en la que la concentración del polvo mixto, procedente de las plantas, supone desde 0,1 mg hasta 2 mg/litro.
14. Preparación según la reivindicación 13, en la que la concentración del polvo mixto, procedente de las plantas, supones desde 0,5 mg hasta 1,0 mg/litro.
15. Procedimiento para la obtención de una preparación pulverulenta o acuosa, adecuada para la protección biológica de las plantas, según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque se llevan a cabo las etapas siguientes, verificándose individualmente las etapas (i) hasta (v) para cada una de las variedades de plantas (a) y (b):
(i)
molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas,
(ii)
recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar,
(iii)
realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de este modo,
(iv)
evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble,
(v)
secado del residuo, y
(vi)
mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada una de las variedades de las plantas (a) y (b), en la proporción deseada, para dar un polvo mixto y en el caso en que se fabrique una preparación acuosa, de las reivindicaciones 12 a 14,
(vii)
suspensión del polvo mixto obtenido procedente de (vi) en agua en la concentración prevista.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque se emplea material vegetal molido con un tamaño de grano medio comprendido entre 0,1 y 0,2 mm para la elaboración ulterior.
17. Procedimiento según las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque se emplea para la extracción con agitación desde 1,5 a 2 partes en volumen de disolvente por 1 parte en volumen de polvo molido.
18. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque como disolvente se emplea etanol no desnaturalizado del 98 al 100%.
19. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque la extracción con agitación se lleva a cabo durante un período de tiempo de aproximadamente 96 hasta 120 horas.
20. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque cada etapa del procedimiento se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 15 y 40ºC.
21. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizado porque se emplea polvo seco con un contenido en agua menor que el 10% para la elaboración ulterior según la etapa (vi).
22. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque en el polvo mixto obtenido, la proporción en peso entre polvo de las cariofiláceas y el polvo de las variedades de Medicago es de 95 a 5.
23. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque como material vegetal se emplea aquél que procede de formas silvestres no influenciadas por la reproducción y, preferentemente, sin tratamiento con abonos minerales y/o con pesticidas.
24. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 15 a 23, caracterizado porque el polvo mixto, obtenido según la etapa (vi) se mezcla, adicionalmente, con un material de soporte o carga sólida, pulverulenta.
25. Empleo de una preparación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 14 como agente biológico para la protección de las plantas.
ES99904810T 1998-02-01 1999-01-25 Agente biologico para la proteccion de las plantas con efecto favorecedor de la resistencia y procedimiento para su obtencion. Expired - Lifetime ES2221357T3 (es)

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