ES2221357T3 - Agente biologico para la proteccion de las plantas con efecto favorecedor de la resistencia y procedimiento para su obtencion. - Google Patents
Agente biologico para la proteccion de las plantas con efecto favorecedor de la resistencia y procedimiento para su obtencion.Info
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Abstract
Preparación a base de plantas, de partes de plantas o de semillas de: (a) la familia de las cariofiláceas, elegidas entre el grupo de las variedades licnis viscaria (Viscaria vulgaris), flor del cuclillo (Lychnis flos-cuculi), borbonesa (Silene dioica), melandrium (Silene noctiflora), clavelito (Dianthus superbus), clavellina de los cartujos (Dianthus carthusianorum) o conejera (Silene alba) y (b) variedades de alfalfa (Medicago), en forma de una mezcla pulverulenta, encontrándose la proporción en peso el polvo, que procede de las cariofiláceas, por encima del 80 % pero por debajo del 99 %: (i) molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas, (ii) recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar, (iii) realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de éste modo, (iv) evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble, (v) secado del residuo, y (vi) mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada variedad de planta, en la proporción deseada.
Description
Agente biológico para la protección de las
plantas con efecto favorecedor de la resistencia y procedimiento
para su obtención.
La invención se refiere a un agente biológico
para la protección de las plantas, nuevo y de nuevo tipo. El agente
protector de las plantas propiamente dicho está basado en una
preparación específica de plantas y provoca, además de efectos
vigorizantes de las plantas, ante todo una inducción de resistencia
general, marcada de una manera sorprendentemente intensa en las
plantas útiles y de cultivo frente a los efectos patógenos de
muchos tipos, especialmente frente al ataque producido por
bacterias, hongos e incluso virus. El agente según la invención es
altamente eficaz pero no es tóxico bajo ninguna circunstancia y por
lo tanto se diferencia de los agentes protectores de las plantas
clásicos, basados en su mayoría en compuestos sintetizados
químicamente, tales como pesticidas o fungicidas, que
frecuentemente están sometidos a ordenanzas legales en muchos
países debido a su toxicidad. La invención se refiere también a la
preparación vegetal en la que está basado el agente para la
protección de las plantas y a un procedimiento para su obtención así
como a un procedimiento para la determinación rápida de la
actividad biológica de las preparaciones vegetales correspondientes,
o bien extractos in vitro. La invención se refiere, además,
al empleo de la citada preparación para mejorar suelos dañados
mediante vigorizado de los cultivos microbianos del terreno
autóctonos. La invención se refiere, finalmente, también a productos
que han sido encontrados en la preparación según la invención, y
que pueden asociarse con los efectos descritos o que contribuyen a
los mismos.
Las enfermedades de las plantas en el caso de las
plantas de cultivo o bien de las plantas útiles, o bien la lucha
contra las mismas, representan un reto cada vez mayor. Debido a
tales enfermedades, así como debido a factores de estrés
condicionados por el medio ambiente y/o por el clima, tales como por
ejemplo períodos marcados de falta de lluvia o bien de sequía o
terrenos ácidos, sobreabonados o cargados con materiales
perjudiciales de otro tipo, tienen que aceptarse cada año,
mundialmente, considerables pérdidas de cosecha o, bajo ciertas
condiciones, se pierde por completo terrenos de cultivo.
Frecuentemente los efectos dañinos del medio ambiente y
climatológicos condicionan y refuerzan la propagación de
enfermedades correspondientes, puesto que las plantas se encuentran
bajo un estrés permanente y, de éste modo, quedan debilitadas con
respecto a sus fuerzas de defensa naturales.
Las enfermedades de las plantas se combaten en la
actualidad, preponderantemente con agentes protectores de las
plantas químicos, tradicionales, tales como por ejemplo pesticidas
o fungicidas. De éste modo pueden conseguirse, en primer lugar,
éxitos rápidos y buenos puesto que tales agentes son en su mayoría
muy eficaces y, además, son económicos y pueden prepararse con
medios técnicos sencillos, de manera que, especialmente para el
tercer mundo son interesantes. Sin embargo los agentes protectores
de las plantas químicos, tradicionales, presentan también amplios
inconvenientes notables de manera que su empleo es considerado cada
vez de una manera más crítica por el público al menos en los países
industrializados. De éste modo un inconveniente de la protección
química de las plantas consiste en la selección de cepas de
patógenos resistentes que se han formado y que se forman en la lucha
contra los hongos con la introducción de fungicidas sistémicos.
Tales cepas pueden combatirse frecuentemente sólo con agentes
todavía más tóxicos. Los fungicidas para las plantas se comportan
por lo tanto de manera análoga a la de los antibióticos en
medicina, en donde ya son muy virulentos los problemas de
resistencia. Además no todas las enfermedades de las plantas, tales
como por ejemplo micosis de los vasos, virosis o bacteriosis,
pueden ser combatidas con éxito con los agentes conocidos hasta
ahora. Otro inconveniente de los agentes químicos para la
protección de las plantas se produce debido a su toxicidad, ya
citada, frecuentemente considerable, que no solamente se refiere a
su manipulabilidad sino también a su efecto sobre el medio ambiente
(terrenos, agua potable, etc.). A través de la cadena alimenticia
pueden ser absorbidos o sus metabolitos igualmente tóxicos en
parte, por los seres humanos y conducir a daños o a enfermedades
corporales en parte irreversibles. Por lo tanto los agentes para la
protección de las plantas están sometidos en muchos países a la
necesidad de su autorización y se tratan cada vez de una manera más
restrictiva por parte de las autoridades.
Como una verdadera alternativa a los agentes
químicos para la protección de las plantas son considerados los
agentes biológicos a base de microorganismos, plantas, extractos de
plantas o productos activos individuales aislados de mezclas de
productos activos, aún cuando no jueguen todavía un gran papel en
la práctica debido a diversos motivos. Ejemplos a éste respecto son
el tratamiento de pepinos y de melones contra la antracnosis con
extractos de Colletotrichum lagenarium (Caruso, Kuc, 1977,
Phytopathology 67, 1285), que es el propio patógeno de la
antracnosis. El tabaco ha podido ser protegido, ampliamente, en
ensayos en campo abierto contra el hongo azul mediante el
tratamiento con suspensiones de esporas de P. tabacina
(Tuzun, Kuc, 1989, en: McKeen (Ed.), Blue mold of tobacco, 177, APS
Press, St. Paul Minnesota). Además, se conocen extractos de hojas
de mata de polígono (Reynoutria sachalinenis) contra los
hongos de las plantas (Herger et al., 1989, Nachr. Blatt.
Dt. Pflanzenschutzdienst 40, 56). También se ha dado ya información
sobre el efecto protector de determinados substratos bacterianos y
fúngicos sobre plantas útiles superiores (Schönbeck et al.,
1980, Z. PflKrankheiten, PflSchutz 87, 654). Además, se conocen
también compuestos individuales definidos, que se presenta en la
naturaleza, tales como el ácido salicílico o el ácido
acetilsalicílico (por ejemplo Mills, Wood, 1984, Phythopathol.,
111, 209) o ácido isonicotínico o bien derivados del ácido
isonicotínico (Kunz et al., 1988, EP 0026875), para los
cuáles ha podido demostrarse un efecto protector con respecto a las
plantas. Se conoce por los autores Neronha et al. (1995,
L'Arboriculture Fruitière 482, páginas 17-20), que
extractos de determinadas plantas o de determinados puntos de las
plantas de la familia cariofiláceas presentan una actividad
inductora de cierta resistencia; sin embargo no se ha observado un
efecto sinérgico de una combinación correspondiente con otras
plantas.
En algunos de los ejemplos conocidos para la
protección de las plantas por medio de agentes biológicos se ha
dado preferencia o bien se ha provocado la protección mediante
resistencia inducida. Se entiende por la expresión resistencia
inducida de una planta o también de un microorganismo, en general,
la capacidad del organismo correspondiente para inhibir el
desarrollo del efecto de factores dañinos mediante determinados
tratamientos térmicos o productos, sin que se modifique la
constitución genética del organismo. La resistencia del organismo
aumenta en general y de manera persistente, lo cuál conduce a una
disminución de la intensidad del ataque así como del efecto dañino
del ataque aún persistente. La resistencia inducida se caracteriza,
entre otras cosas, ante todo por la ausencia de toxicidad de los
productos inductores de la resistencia frente a los productos
dañinos o bien frente a los organismos dañinos (patógenos), así
como por la ausencia de una relación lineal, estricta,
dosis-efecto. Otra consecuencia de la resistencia
inducida en el caso de las plantas puede observarse a nivel
molecular y se refiere a la expresión de diversas proteínas, que se
forman tras el ataque patógeno o bien tras el contacto patógeno o
bien tras el contacto con el producto inductor de la resistencia,
que en sí mismo no es patógeno, y que se denominan proteínas PR
("pathogenesis related proteins"). A las mismas pertenecen,
entre otras, las proteínas PR-1, las
b-1,3-glucanasas
(PR-2), las quitanasas (PR-3), las
proteínas similares a la heveína (PR-4) y similares
a la taumatina/osmotina (PR-5) (Schneider et
al., 1996, Intern. Review of Cytology 168, 303). En muchos
casos de resistencia inducida o bien adquirida puede observarse que
el efecto no solamente permanece localizado en el punto que ha
entrado directamente en contacto con el producto o bien con el
patógeno inductores de la resistencia, sino que se extiende de
manera sistémica también hasta las partes de la planta no atacadas,
todavía sanas. Mediante la inducción de la resistencia se activa de
manera duradera por lo tanto un potencial de diversos mecanismos de
defensa existentes ya de manera latente en la planta, que dependen,
a su vez, del tipo de planta y del patógeno atacante, o bien del
producto inductor de la resistencia. Finalmente ésta posibilidad de
las plantas para defenderse es comparable, en cierto sentido, con
el inmunizado medicinal en el caso de los seres humanos mediante una
vacunación activa. Para la protección de las plantas tiene un
considerable significado la resistencia inducida puesto que puede
ampliar la paleta de sus posibilidades y abarcar enfermedades, que
no eran accesibles a un combate por medio de los agentes químicos
tradicionales, anteriormente citados. Deben distinguirse de éstos
los que presentan un efecto puramente vigorizador de la planta. Los
agentes vigorizadores de las plantas se caracterizan por un
vigorizado temporal del organismo correspondiente sin que presenten
el efecto inmunizante mediante resistencia adquirida o inducida.
Los agentes biológicos para la protección de las plantas son, por lo
tanto, una alternativa real a los pesticidas, fungicidas y agentes
de acción similar, tradicionales, químicos, en su mayoría
fuertemente tóxicos, puesto que éstos últimos, como ya se ha
indicado, tienen que tratarse cada vez de una manera más
restrictiva en lo que se refiere a la autorización administrativa y
se enfrentan al rechazo de un amplio público, sensibilizado desde
el punto de vista ecológico.
Los agentes biológicos, conocidos hasta el
presente, son, sin embargo, difícilmente manipulables (cuando están
basados por ejemplo en el propio patógeno de la enfermedad, tales
como por ejemplo las suspensiones de hongos o de bacterias),
frecuentemente no pueden prepararse de manera sencilla en
cantidades suficientes para el amplio empleo en la agricultura o en
la economía ecológicas, en parte no son suficientemente específicos
o presentan muy frecuentemente una intensidad insuficiente en cuánto
a su actividad en comparación con los agentes protectores de las
plantas tradicionales. Especialmente en el caso de las plantas que
ya han sido atacadas o dañadas, casi no se emplean los agentes
biológicos poco conocidos puesto que, en tales casos presentan poca
actividad y, frecuentemente, sólo presentan una actividad tardía.
El empleo de tales agentes biológicos, protectores contra las
plantas, conocidos, o agentes para vigorizar las plantas se limita,
por lo tanto, en la práctica la mayoría de las veces, en todo caso,
sólo al tratamiento profiláctico, o cuando son reconocibles los
primeros signos de un ataque y entonces, por regla general, sólo
sobre una pequeña población de plantas.
Así pues, existía la tarea de poner a disposición
un agente biológico para la protección de las plantas que no
presentase los inconvenientes anteriormente indicados de los
agentes conocidos químicos o biológicos para la protección de las
plantas y que, además, no solamente fuese un puro agente para el
vigorizado de las plantas. Especialmente tenía que ponerse a
disposición un agente que pudiese fabricarse de manera
relativamente sencilla y altamente eficaz a concentraciones tan
pequeñas como fuera posible así como que pudiese ser aplicado para
un amplio espectro de plantas y de enfermedades de plantas incluso
en el caso de grandes poblaciones de plantas.
Según la invención puede ponerse a disposición un
agente de éste tipo. Éste está basado en una preparación vegetal
que puede fabricarse fácilmente.
El objeto de la invención consiste, por lo tanto,
en una preparación a base de plantas, de partes de plantas o de
semillas de (a) la familia de las cariofiláceas, elegidas entre el
grupo de las variedades licnis viscaria (Viscaria vulgaris),
flor del cuclillo (Lychnis flos-cuculi),
borbonesa (Silene dioica), melandrium (Silene
noctiflora), clavelito (Dianthus superbus), clavellina de
los cartujos (Dianthus carthusianorum) o conejera (Silene
alba) y (b) variedades de alfalfa (Medicago), en forma de
una mezcla pulverulenta, encontrándose la proporción en peso el
polvo, que procede de las cariofiláceas, por encima del 80% pero
por debajo del 99%, obtenibles mediante las etapas siguientes:
(i)-(vi), llevándose a cabo las etapas (i) hasta (v)
independientemente para cada una de las variedades de plantas (a) y
(b):
- (i)
- molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas,
- (ii)
- recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar,
- (iii)
- realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de éste modo,
- (iv)
- evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble,
- (v)
- secado del residuo, y
- (vi)
- mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada variedad de planta, en la proporción deseada.
El objeto de la invención es también una
preparación en forma de una suspensión acuosa a base de la
preparación pulverulenta anteriormente citada.
El objeto de la invención es además un
procedimiento para la obtención de una preparación correspondiente
pulverulenta o acuosa, adecuada para la protección biológica de las
plantas, que se caracteriza porque se llevan a cabo las etapas
siguientes, llevándose a cabo las etapas (i) hasta (v) separadamente
para cada una de las variedades de plantas (a) y (b):
- (i)
- molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas,
- (ii)
- recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar,
- (iii)
- realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de éste modo,
- (iv)
- evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble,
- (v)
- secado del residuo, y
- (vi)
- mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada variedad de planta (a) y (b), en la proporción deseada, para dar un polvo mixto y en el caso en que se fabrique una preparación acuosa,
- (vii)
- suspensión del polvo mixto obtenido procedente de (vi) en agua en la concentración prevista.
Lo decisivo para la actividad de la preparación
vegetal según la invención consiste en la proporción del material
vegetal cariofiláceas con respecto a las variedades de Medicago. La
proporción de las cariofiláceas tiene que ser, al menos, del 80% en
peso referido a la mezcla pulverulenta, sin embargo no debe
sobrepasar el 99%. La actividad para una proporción de cariofiláceas
entre el 90 y el 98% es mayor que la de las mezclas con una
composición del 80 al 90%. Una mezcla con aproximadamente una
proporción del 95% en cariofiláceas y con una proporción del 5% en
variedades de Medicago es especialmente preferente según la
invención puesto que la actividad como agente biológico protector de
las plantas con efecto inductor de la resistencia muestra aquí un
máximo relativamente estrecho pero pronunciado. Las preparaciones,
que están constituidas únicamente por uno de los dos componentes
vegetales citados, son inactivas, sorprendentemente, igual que las
preparaciones que presentan una proporción de cariofiláceas
claramente por debajo del 80%. La actividad sorprendentemente
elevada, acrecentada de una manera súbita, de la preparación según
la invención con una proporción en cariofiláceas de aproximadamente
el 95% permite suponer que en éste caso se produce un efecto
sinérgico de los productos activos formados por las cariofiláceas y
las variedades de Medicago.
El objeto de la invención es, por lo tanto, una
preparación preferente a base de plantas o de partes de plantas de
cariofiláceas y de variedades de Medicago, siendo la proporción en
peso del polvo, que procede de la familia de las plantas de las
cariofiláceas, mayor que el 90 y hasta el 98%, de forma
especialmente preferente del 95% aproximadamente (5% de variedades
de Medicago).
Las cariofiláceas representan una familia propia
de plantas. Éstas están ampliamente extendidas especialmente en
Europa central y se han adaptado, dentro de ciertos límites, a las
diversas condiciones del terreno y climatológicas. Las
cariofiláceas se encuentran en terrenos ácidos así como también de
tipo calcáreo, sin embargo prefieren, por regla general, terrenos
pobres en nutrientes. Ejemplos de cariofiláceas, que son adecuadas
para la realización de la invención, son clavellina de los prados
(Dianthus deltoides), clavellina de penachos (Dianthus
armeria), clavellina de los cartujos (Dianthus
carthusuanorum), clavelito (Dianthus superbus), conejera
(Silene alba), flor del cuclillo (Lychnis
flos-cuculi), Licnis viscaria (Viscaria
vulgaris), melandrium (Silene noctiflora), borbonesa
(Silene dioica), jabonera real y roja (Saponia
officinalis), perpétua (Helichrysum bellum), alsine del
bosque (Stellaria hoostea campestri), alsine nervada
(Stellaria alsine). Son especialmente preferentes la flor del
cuclillo (Lychnis flos-cuculi) y la viscaria
común (Lychnis viscaria). Según la invención pueden mezclarse
también diversas variedades. Preferentemente sin embargo es el
empleo de respectivamente sólo una variedad.
También las leguminosas (papilonáceas)
representan una familia de plantas; entre éstas existe un gran
número de subfamilias (por ejemplo fabáceas), tipos y variedades,
que se cultivan mundialmente como plantas útiles y forrajeras. Sus
representantes presentan una elevada proporción en proteínas y
almidones y no plantean exigencias especiales en cuánto al suelo,
puesto que las bacterias enlazantes del nitrógeno, que viven de
manera simbiótica en las raíces, contribuyen a mejorar los terrenos.
Como ejemplos de representantes de leguminosas puede citarse muchas
variedades de trébol, tales como melolito común real (Milolotus
officinalis), vulneraria común (Anthyllis), trebol
dorado (Trifolium aureum), fenarda (Trifolium
camprestre), cuernecillo común (Lotus corniculatus),
cuernecillo de los pantanos (Lotus corniculatus), hierba de
la herradura (Hippocrepis comosa). Del mismo modo son
adecuadas variedades de Medicago,
regaliz-tragacanto, cuernecillo de mar (Lotus
maritimus), cicércula trepadora (Lathyrus cirru),
cicércula pratense (Lathyrus prantensis). Son especialmente
adecuadas las variedades de alfalfa tales como por ejemplo alfalfa
borde (Medicago falcata) o mielga negra (Medicago
lupulina).
Para la preparación de las plantas para la
realización de la invención éstas también pueden cultivarse
sistemáticamente mediante siembra. Según la invención es preferente
en éste caso el empleo de formas silvestres, que no hayan sido
influenciadas por medidas de cultivo. El objeto de la invención es,
por lo tanto, una preparación correspondiente, que se caracteriza
porque el material vegetal empleado procede de formas silvestres no
influenciadas mediante reproducción, que crecen, preferentemente,
sin tratamiento con abonos minerales y/o pesticidas. Sin embargo
esto no significa que el material vegetal necesario pueda obtenerse
únicamente a partir de plantas que crezcan de manera silvestre. Por
el contrario pueden prepararse también bajo las condiciones citadas
mediante plantación específica. Preferentemente es recomendable
elegir para cada estación del año un lugar diferente para la
plantación, cuyo terreno pueda caracterizarse previamente mediante
análisis correspondientes. En principio son suficientes las medidas
indicadas en el Reglamento de la Comunidad Europea EG 2092/91 para
la producción agrícola ecológica, para conseguir resultados
satisfactorios. Las cantidades de semillas, que se requieren por
cada hectárea, dependen de la especie a ser sembrada así como de la
composición especial del terreno. Por regla general son suficientes
de 20 hasta 30 kg de semillas/hectárea. Además es ventajoso para la
actividad de la preparación según la invención una siembra de un
cultivo precedente, especialmente de maíz o de trigo. En general
habrá que tomar en cuenta que antes y durante el período vegetal de
las cariofiláceas/leguminosas no se produzcan factores de estrés
adicionales tales como por ejemplo ataque por pestes o contaminación
con venenos ambientales. Cuando se utilicen para la obtención de la
preparación según la invención semillas, pueden conseguirse
resultados todavía mejores mediante la eliminación por medio de un
tamiz de las semillas débiles o enfermas. Las preparaciones según
la invención, que pueden prepararse a partir de dicho material
vegetal, muestran una actividad especialmente elevada. En algunos
casos puede observarse un efecto protector de las plantas digno de
consideración sólo en las plantas iniciales tratadas de éste modo.
Probablemente se han atrofiado ya en gran medida las fuerzas de
defensa latentes originales en las formas cultivadas según los
métodos usuales corrientemente o bien modificadas por su
reproducción de tal manera, que ya no son adecuadas para la
finalidad de la invención.
En principio pueden emplearse todas las partes de
las plantas de las variedades de las cariofiláceas o bien de
Medicago para la obtención de la preparación según la invención, es
decir, por ejemplo, tallos, hojas, raíces, flores o semillas.
Preferentemente se emplearán, sin embargo, las semillas de las
variedades correspondientes.
Así pues el objeto de la invención es una
preparación correspondiente caracterizada porque las partes
vegetales que se emplean son semillas. El polvo, preparado de
acuerdo con el procedimiento de la invención, constituido por ambas
familias de plantas, citadas, es almacenable sin problemas durante
un período de tiempo prolongado y puede ponerse a disposición
directamente para el empleo para el tratamiento de las plantas
amenazadas o enfermas en el mejor de los casos en forma de
suspensiones acuosas. Cuando se utilizan grandes cantidades sobre
grandes superficies, especialmente en las explotaciones agrícolas y
en la industria agrícola es ventajoso combinar en polvo, en primer
lugar, con un soporte o carga. En éste caso, son adecuados todos los
materiales conocidos para éstas finalidades, así por ejemplo
harinas minerales, polvo de silicato de magnesio o harina de algas.
Según la invención se mezclarán, según la variedad de planta a ser
tratada, desde 2 hasta 8 g de polvo mixto vegetal con 98 hasta 92 g
de la carga correspondiente. El objeto de la invención, por lo
tanto, una preparación correspondiente que contiene,
adicionalmente, cargas o materiales de soporte, siendo
preferentemente la proporción en peso del polvo mixto, procedente
de las plantas, del 2 al 8% referido a la carga/material de
soporte. Ésta mezcla lista para su aplicación puede recogerse ahora
a su vez en agua y emplearse en forma de suspensión acuosa para el
tratamiento. Según la invención se emplean de 50 hasta 400 g,
preferentemente de 100 hasta 200 g de una mezcla total de éste tipo
(polvo vegetal más carga/material de soporte) por cada hectárea. En
último lugar la cantidad depende de diversos factores, tales como
la variedad de la planta, el tipo del ataque, el desarrollo del
ataque, los daños ya existentes, las características del terreno,
etc. Tal como ya se ha indicado se recoge o bien se suspende la
preparación pulverulenta, según la invención, con o sin cargas,
preferentemente en agua y la suspensión obtenida se utiliza para la
aplicación directa mediante pulverización, regado, impregnación o
de una manera similar. En éste caso tiene un significado decisivo
tanto para la actividad como también para la economía de la
preparación según la invención, la concentración en la que pueda o
deba encontrarse el polvo mixto vegetal citado en ésta solución
acuosa. Así pues el objeto de la invención es una preparación
correspondiente, caracterizada porque se presentan en forma de
suspensión acuosa mediante la adición de agua, siendo la
concentración del polvo mixto, procedente de las plantas, desde 0,1
mg hasta 2 mg/litro, preferentemente desde 0,5 hasta 1,0 mg/litro,
de forma especialmente preferente desde 0,5 hasta 0,6 mg/litro
(referido únicamente al polvo vegetal). Una gran parte de la idea
inventiva de la presente solicitud está basada en éste valor
sorprendentemente bajo. Además debe considerarse sorprendente que
concentraciones mayores, por ejemplo de 5 mg/litro, muestran un
menor efecto inductor de la resistencia en la mayoría de los
casos.
Así pues, el objeto de la invención es, también,
el empleo de la preparación citada como agente biológico para la
protección de las plantas, especialmente como agente con efecto
inductor de la resistencia. La expresión de la resistencia inducida
se ha definido según la invención de acuerdo con las indicaciones
dadas en la introducción. La preparación según la invención
presenta en éste caso, en tanto en cuánto han sido medidas, todas
las características correspondientes que entran en consideración
para el efecto de la resistencia inducida. La preparación es
altamente eficaz a las concentraciones indicadas en una amplia
paleta de plantas diferentes tales como cereales u hortalizas así
como también en planas ornamentales, árboles ornamentales o plantas
para la industria forestal y, concretamente, contra una pluralidad
de tipos de hongos patógenos, entre los cuáles se encuentra el
mildíu real, así como frente al ataque por parte de bacterias e
incluso por parte de virus. Se ha podido observar, por ejemplo, que
el tabaco no solamente puede protegerse, después del tratamiento,
contra el ataque del virus del mosaico del tabaco (TMV), sino que
se observa en las plantas de tabaco, atacadas ya con el TMV una
fuerte disminución el deterioro de las hojas. Así pues el objeto de
la invención es el empleo de la preparación citada para conseguir y
favorecer la resistencia inducida en plantas útiles y de cultivo
frente a efectos patógenos y factores condicionados por el estrés,
especialmente en el caso de infecciones bacterianas, fungicidas o
víricas. Según la invención se entenderán por la expresión
"influjos patógenos o factores condicionados por el estrés"
también todas las solicitaciones y deterioros de las plantas
provocados por venenos ambientales, carga del terreno, estrés
climatológico, tales como períodos de sequía y de frío, fuerte y
radiación solar o bien UV, o incluso una aplicación de abono
excesiva y/o parcial. Frecuentemente son precisamente tales factores
o influjos los que debilitan las fuerzas de defensa de las plantas
y, de éste modo, posibilitan un ataque por hongos, por bacterias o
por virus.
Además del efecto o bien del empleo como agentes
protectores de las plantas biológicos, no tóxicos, inductores de la
resistencia, que, por lo tanto, no quedan sometidos a los
procedimientos administrativos de autorización, la preparación
según la invención presenta también efectos vigorizantes de las
plantas, que pueden hacerse notar, por ejemplo, en una mayor
producción de clorofila, en un crecimiento más vivo, en un
crecimiento vigorizado de las raíces y de manera similar. La cuantía
de éste efecto depende, desde luego, fuertemente de la variedad de
la planta y de otros factores externos. Es perfectamente posible
que en algunos casos el efecto de la resistencia inducida no vaya
acompañado de un efecto vigorizante o vaya acompañado por un efecto
vigorizante inapreciable. Para poner especialmente de manifiesto el
efecto vigorizante no es suficiente, por regla general, un solo
tratamiento, en contra de lo que ocurre para la inducción de la
resistencia.
La preparación según la invención puede
aplicarse, entre otras, a las plantas en crecimiento,
preferentemente puede ser aplicada por pulverización. En éste caso,
para el tratamiento profiláctico, se tratarán con la suspensión
acuosa las plantas recién germinadas o las plantas jóvenes, que
acaben de hayan desarrollado precisamente la primera, la segunda o
la tercera hoja. En el caso de plantas ya atacadas se verifica el
tratamiento inmediatamente después que se haya detectado el
deterioro. Alternativamente pueden tratarse también las semillas
mediante pulverización o mediante impregnación como paso previo a la
siembra. Éste método se ha mostrado como especialmente eficaz para
impedir el ataque o los deterioros. Otro método según la invención
consiste preferentemente en la pulverización o en la aplicación
mediante riego de las superficies de los terrenos, sobre las cuáles
deban crecer las plantas a ser protegidas. De éste modo la planta
en germinación puede absorber los productos de la preparación según
la invención, responsables del efecto, con lo cuál se refuerza en
el sentido citado la fuerza de defensa de las plantas en
desarrollo.
El tratamiento del terreno con la preparación
según la invención tiene, sin embargo, además otro efecto positivo
e inventivo. Se ha podido observar, concretamente, que la
preparación según la invención vigoriza o bien regenera,
sorprendentemente, los cultivos microbianos del terreno, que se
encuentran en el terreno y que son responsables de un crecimiento
sano de las plantas que crecen en el mismo. El empleo de la
preparación según la invención puede extenderse, por lo tanto,
también al saneado de terrenos cargados o bien para la mejora de
terrenos agotados. La preparación según la invención se incorpora
en éste caso en el terreno, pudiéndose conseguir una mejor
distribución del material hasta una profundidad deseada,
determinada, con la aireación simultánea del terreno, por medio de
un o varios removidos del terreno. La actividad de los cultivos
útiles en el terreno puede seguirse en éste caso según los métodos
normalizados durante el proceso de saneado. Mediante la combinación
del tratamiento del terreno y del tratamiento de las plantas o bien
de las semillas pueden conseguirse, por lo tanto, resultados
especialmente ventajosos. El efecto sorprendente, adicional,
positivo sobre los microorganismos hace que la preparación según la
invención sea adecuada también para su empleo a modo de estiércol,
o bien como acelerador para la formación del estiércol. En éste caso
pueden reprimirse en gran medida, como se ha observado,
especialmente también las bacterias dañinas de la podredumbre. En
éste sentido puede emplearse con éxito la preparación según la
invención también para la conservación y el mantenimiento
prolongados por ejemplo de plantas cortadas, especialmente de
flores cortadas. El objeto de la invención es, por lo tanto,
también el empleo de la preparación según la invención para el
vigorizado y la regeneración de microorganismos útiles que se
presentan especialmente en los terrenos. Las preparaciones según la
invención abarcan también aquellas preparaciones a base de plantas
o de partes de plantas de la familia de las cariofiláceas y de las
leguminosas que pueden contener adicionalmente otros componentes.
Tales componentes pueden ser, en principio, aditivos para los
abonos, especialmente de base orgánica, aditivos para mejorar los
terrenos, con inclusión de microorganismos útiles, o aditivos que
sean capaces de vigorizar o de regular el efecto de la preparación
según la invención.
Los aditivos vigorizantes en el sentido de la
invención pueden ser los agentes protectores de las plantas
tradicionales, cuando el ataque o bien el deterioro de las plantas
correspondientes sea ya tan intenso que tenga que apoyarse, al
menos temporalmente, el efecto según la invención, por medio de
tales aditivos, para poder salvar todavía la planta. En éstos casos
la cantidad necesaria de agentes tradicionales protectores de las
plantas es, en general, sensiblemente menor que sin el empleo de la
preparación según la invención de manera que la carga del medio
ambiente es claramente menor con tales aditivos con empleo de la
preparación según la invención.
Los aditivos reguladores en el sentido de la
invención son, preferentemente, preparaciones vegetales, que sean
capaces de regular, especialmente, el efecto vigorizante de las
plantas de la preparación según la invención en el caso en que esto
sea deseable. Puesto que pueden reproducirse en las plantas
tratadas, muy frecuentemente, determinados componentes debido a la
aplicación de la preparación según la invención, puede ser deseable
reducir de nuevo éste efecto o incluso reducirlo por debajo de la
medida normal. Ejemplos a éste respecto son el contenido en nicotina
de las plantas de tabaco o el contenido en proteínas de cereales
necesarios para determinadas aplicaciones (por ejemplo cebada
cervecera). Un ejemplo de un aditivo regulador, de éste tipo, está
constituido por los polvos, obtenidos de acuerdo con el
procedimiento según la invención, a partir de plantas de mostaza o
de cerezas silvestres. La proporción de tales aditivos reguladores
en el conjunto de la mezcla puede estar comprendida, según la
invención, entre el 0,5 y el 10%. Los aditivos se añaden
ventajosamente en forma pulverizada a los polvos vegetales según la
invención y se mezclan con éste. La preparación según la invención
presenta, en resumen, las siguientes ventajas importantes: provoca
resistencia inducida en las plantas tratadas, de las variedades más
diversas. Ésta puede observarse tanto en el caso de las plantas no
atacadas (como profilaxis) así como también en el caso de las
plantas tratadas. El grado de actividad de las plantas atacadas se
encuentra, en promedio, entre 30 y 75%, preferentemente entre 50 y
70%, es decir que, por ejemplo, el deterioro de las hojas después de
un solo tratamiento, es únicamente del 25 al 70% (30 a 50%) del
ataque original. En determinados casos pueden conseguirse también
grados de actividad por encima del 90%. El material vegetal o los
terrenos tratados de manera profiláctica no presentan, en la
mayoría de los casos, ataque o únicamente presentan un ligero
ataque cuando las plantas quedan sometidas al patógeno después del
tratamiento con la preparación según la invención. Mediante la
preparación según la invención pueden tratarse con éxito
enfermedades fúngicas tales como mildíu, mildíu real, moho azul y
moho gris en un gran número de plantas de cultivo, tales como
tomates, pepinos, trigo, etc. Debe señalarse especialmente la
actividad de la preparación frente al virus del mosaico del tabaco
en plantas de tabaco. Éste es el primer caso en el que es activo en
gran medida un agente biológico, basado en plantas, frente al ataque
vírico en plantas. La preparación según la invención no tiene
efecto tóxico frente al patógeno generador de la enfermedad de las
plantas, por ejemplo frente al bacterium, frente al hongo o
frente al virus y, de éste modo, cumple una condición previa
importante para la presencia de la resistencia inducida. Se ha
podido observar, en concreto, que la preparación según la invención
no perjudica en modo alguno el crecimiento micelar de los hongos,
en función de la concentración, es decir que no tiene efecto
fungicida y, de éste modo, se encuentra en oposición a los agentes
clásicos protectores de las plantas. Además pudo observarse que se
forman proteínas PR importantes, responsables de la inducción de la
resistencia, tales como, entre otras, quitinasas y
b-1,3-glucanasas cuando se aplica la
preparación según la invención sobre las plantas, de una manera
fuertemente vigorizada (aumento del 30 hasta el 50%). Es
especialmente digno de consideración, también, la concentración
mínima de producto activo según la invención, que presenta un
máximo relativamente estrecho entre 0,5 mg y 1 mg/litro. Los
extractos naturales, protectores de las plantas, que actúan a
concentraciones comparativamente pequeñas, no son conocidos hasta
el presente. La preparación según la invención hace que las plantas
tratadas sanen o que permanezcan sanas. Al mismo tiempo se activan
también efectos vigorizantes de las plantas. En resumen pueden
conseguirse de éste modo, en muchos casos, aumentos de las cosechas
de un 20 hasta un 50%, incluso a escala de campo abierto (en
función de las otras condiciones especiales). Éstos aumentos pueden
conseguirse incluso en comparación con las plantas de control sanas
(sin tratamiento con la preparación según la invención). Esto
significa que el empleo de la preparación según la invención
conduce, por ejemplo, por medio del tratamiento profiláctico del
terreno y/o de las semillas/plantas a un aumento de la cosecha de
las plantas sanas y con defensas fuertes.
La preparación según la invención puede
prepararse de la manera siguiente quedando incluidas variantes y
modificaciones obvias en tanto en cuánto no se diga otra cosa al
respecto. El tratamiento o bien el cultivo de las plantas ha sido
ya descrito anteriormente. En éste caso se señalará de nuevo que
para cada representante de ambas familias de plantas según la
invención (cariofiláceas y leguminosas) debe llevarse a cabo,
preferentemente, una vía propia de preparación hasta la formación
de la mezcla correspondiente para conseguir el efecto completo
según la invención. Si se parte de plantas o bien de partes de
plantas, éstas se secarán cuidadosamente en primer lugar según los
métodos usuales. En éste caso deben evitarse temperaturas por encima
de 40ºC, así como también para todas las etapas del procedimiento.
El material vegetal, secado, quedando incluidas también las
semillas, se muele finamente en un molino usual en el comercio. El
tamaño de grano no debe ser menor que 0,05 mm y no debe ser mayor
que 0,5 mm para conseguir efectos óptimos en la extracción.
Preferentemente el material molido presenta un tamaño medio de grano
desde 0,1 hasta 0,2 mm. El material molido se combina ahora con un
disolvente orgánico, polar y la suspensión obtenida se agita
intensamente, preferentemente a temperatura ambiente. En general
las temperaturas claramente por debajo de 15ºC están relacionadas
con una pérdida de actividad y, por lo tanto, deben ser evitadas.
Como disolventes orgánicos, polares, son adecuados, especialmente,
alcoholes inferiores, por ejemplo etanol,
n-propanol, iso-propanol o
n-butanol. También son posibles mezclas de diversos
alcoholes. El etanol es especialmente preferido. El metanol puede
emplearse sólo de manera condicional. Para todos los disolventes
empleados se cumple que deben ser de alta pureza, es decir que no
deben contener por ejemplo productos desnaturalizados u otras
impurezas. El disolvente puede contener de 0 hasta 30% de agua. Una
proporción mayor de agua dificulta, desde luego, muy frecuentemente
la eliminación necesaria, ulterior, del disolvente. Según la
invención se emplearán de una hasta cuatro partes en volumen de
disolvente, preferentemente 1,5 hasta dos partes en volumen de
disolvente por cada parte de volumen del material vegetal molido.
Se lleva a cabo una extracción bajo agitación durante tres hasta
seis, preferentemente cuatro hasta cinco días, preferentemente a
temperatura ambiente. En caso dado se añade un poco de disolvente a
la carga para compensar el efecto de dilución. A continuación se
elimina cuidadosamente el disolvente, en el caso más favorable por
medio de un evaporador rotativo bajo ligero vacío, no debiéndose
sobrepasar temperaturas de 40ºC. También es adecuado dejar que se
produzca una evaporación entre 30 y 40ºC. Por lo tanto es esencial
según la invención que durante la extracción no se separen los
productos disueltos sino que, por el contrario, sean alimentados de
nuevo al residuo sólido, "desprendido". El residuo obtenido de
éste modo, en caso dado todavía húmedo, se seca con un aparato usual
en el comercio para el secado, debiéndose conseguir un contenido en
humedad menor que el 10%. De éste modo se obtiene un producto
pulverulento, exento de residuos y de disolventes, que puede ser
considerado como inocuo desde el punto de vista de la salud de
acuerdo con las normas para los productos peligrosos.
Los polvos obtenidos, que proceden de plantas de
las cariofiláceas y de las variedades de Medicago se mezclan a
continuación, de acuerdo con las proporciones anteriormente
indicadas y que se han indicado en las reivindicaciones, en caso
dado con aporte de calor con las cargas/materiales de soporte
citados y se disuelven o bien se suspenden en agua directamente
antes de la aplicación, ajustándose las concentraciones
indicadas.
En el ensayo de las preparaciones según la
invención con respecto a las substancias que contienen productos
activos se ha encontrado que, además de una serie de fitoesteroles,
están presentes también al menos tres compuestos brasinoesteroides,
no habiéndose podido identificar todavía un compuesto, habiéndose
identificado uno de ellos como
24-epi-castasterona
((22R,23R,24R)-2,3,22,23-tetrahidroxi-24-metil-5a-colestan-6-ona),
siendo el otro la 24-epi-secasterona
((22R,23R,24R)-22,23-dihidroxi-2b,3b-epoxi-24-metil-5a-colestan-6-ona).
Ésta última no era conocida todavía como producto natural. Así pues
la invención se refiere también al empleo de la
24-epi-secasterona y de la
24-epi-castasterona como agentes
favorecedores de la resistencia para plantas. En el día de la
solicitud no se conocía todavía si éstos compuestos eran los únicos
responsables del efecto favorecedor de la resistencia o si
participan en ello además otras substancias, o si juega un papel un
efecto sinérgico de diversos componentes de la composición según la
invención. Los brasinoesteroides pertenecen a las fitohormonas y
son conocidos como reguladores del crecimiento de las plantas con
actividad favorecedora del crecimiento. En general se presentan en
cantidades de
ng - mg/ kg de material vegetal (por ejemplo Clouse y Sasse, 1998, Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 427). La 24-epi-castasterona puede aislarse, por ejemplo, a partir del alga verde Hydrodicton reticulatum (Yokata et al., 1987, Phytochemestry, 26, 503 o partir de Beta vulgaris (Schmidt, J. Et al., 1994, Phytochemestry, 36, 175). La 24-epi-secasterona era conocida hasta ahora únicamente como producto sintético (Voigt et al., 1995, J. Chem, Soc. Perkin Trans 1, 1495). Además se ha identificado en el composición según la invención una serie de fitoesteroles, tales como espinasterol, colesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, estigmast-22-en-3b-ol, 24-metilcolest-7-en-3b-ol, espinasterol, sitosterol, sitostanol, dihidroespinasterol, 24-metilcolesta-5,22-dien-3b-ol y 24-metilcolesta-7,22-dien-3b-ol. La cantidad principal de ésta fracción corresponde al espinasterol (85-90%).
ng - mg/ kg de material vegetal (por ejemplo Clouse y Sasse, 1998, Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49, 427). La 24-epi-castasterona puede aislarse, por ejemplo, a partir del alga verde Hydrodicton reticulatum (Yokata et al., 1987, Phytochemestry, 26, 503 o partir de Beta vulgaris (Schmidt, J. Et al., 1994, Phytochemestry, 36, 175). La 24-epi-secasterona era conocida hasta ahora únicamente como producto sintético (Voigt et al., 1995, J. Chem, Soc. Perkin Trans 1, 1495). Además se ha identificado en el composición según la invención una serie de fitoesteroles, tales como espinasterol, colesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, estigmast-22-en-3b-ol, 24-metilcolest-7-en-3b-ol, espinasterol, sitosterol, sitostanol, dihidroespinasterol, 24-metilcolesta-5,22-dien-3b-ol y 24-metilcolesta-7,22-dien-3b-ol. La cantidad principal de ésta fracción corresponde al espinasterol (85-90%).
Los ejemplos siguientes explican mejor la
invención sin limitarla:
Se muelen 1,2 g de semillas de flor del cuclillo
(Lychnis flos-cucculi) en un molino para
especias (tamaño medio de las partículas 0,12 mm). El polvo se seca
de tal manera, que presente un contenido en humedad residual del 7
al 8%. El polvo se recoge con 20-30 ml de etanol
puro (al 99%) y se agita por medio de un agitador eléctrico de
laboratorio aproximadamente durante 100 h a 20 hasta 25ºC. En caso
en que la mezcla se vuelva demasiado espesa, se añadirá etanol en
la cantidad correspondiente. Una vez verificada la extracción se
elimina cuidadosamente el disolvente a temperatura ambiente en el
evaporador rotativo. El residuo se continúa secando en caso dado
hasta que se presente un polvo fino.
De manera análoga a la del ejemplo 1 se muelen
semillas de alfalfa borde (Medicago falcata) (1,2 g) y se
somete a la extracción por agitación. Se obtiene igualmente un
polvo seco.
Se mezclan íntimamente entre sí 950 mg de polvo,
preparado según el ejemplo 1, y 50 mg del polvo, preparado según el
ejemplo 2. Se añaden 50 mg de ésta mezcla a 100 litros de agua y se
mezclan perfectamente. La disolución puede emplearse directamente
para la pulverización de aproximadamente 100 m^{2} de superficie
de campo.
Se preparan, como se ha descrito, 6 g de una
mezcla obtenida a partir de hojas de borbonesa (Silene
dioica) y de hojas de alfalfa (5,7 g de polvo de clavel, 0,3 g
de polvo de alfalfa). Ésta mezcla se añade a 96 g de harina
mineral, o bien se mezcla íntimamente con la misma. Se añaden a ésta
mezcla 10.000 litros de agua en un tanque con agitador con una
capacidad aproximada de 15.000 litros La cantidad es suficiente
para tratar una hectárea de superficie de cultivo.
Se cultivan en un invernadero plantas de tabaco
de la variedad con reacción hipersensible "Xanthi NN". Una
parte de las plantas se pulveriza con agua, a la que se ha añadido
0,125% de Tween 20 a modo de humectante. Éstas plantas representan
los controles. La otra parte de las plantas se pulverizan con una
disolución, que contiene 1 mg/litro de harina vegetal (mezcla 95/5
formada por clavel/alfalfa) e igualmente Tween 20 como agente
humectante (0,125%). Al cabo de 5 días de incubación se inoculan
las plantas con el virus del mosaico del tabaco. Para ello se molió
en el mortero previamente material vegetal atacado por TMV en
tampón de fosfato de sodio 0,1 M (pH = 6,8) y se combinó con un
poco de carborundum a modo de abrasivo. Ésta suspensión se unta a
continuación con un pincel sobre la segunda y la tercera hoja
vegetativa (contado desde abajo) de las plantas tratadas y también
de las plantas de control. Al cabo de 6 semanas se evaluó el cuadro
de deterioros o bien el ataque ( % de la superficie de la hoja,
diámetro de las lesiones en mm).
De manera análoga a la del ejemplo 5 se infectan
con mildíu real plantas de trigo tras el tratamiento con la
preparación según la invención (plantas de control: únicamente con
agua) y se determinaron los deterioros en las hojas. Los resultados
pueden verse en la tabla 2.
De manera análoga a la del ejemplo 5 se
infectaron con mildíu real pepinos tras el tratamiento con la
preparación según la invención (plantas de control: únicamente con
agua) y se determinaron los daños en las hojas. Los resultados
pueden verse en la tabla 3.
De manera análoga a la del ejemplo 5 se
infectaron con el hongo gris (Botrytis cinerea) plantas de
tomate tras el tratamiento con la preparación según la invención
(plantas de control: únicamente con agua) y se determinaron los
daños en las hojas. Un tratamiento con la preparación según la
invención en una concentración de 0,6 mg/litro provoca una
reducción de los daños en las hojas, en comparación con los
controles no tratados pero infectados también con el moho gris, en
un 55-65%. Un tratamiento con una solución con una
concentración diez veces mayor de la preparación según la invención
provocó una disminución de los deterioros únicamente entre el 48 y
56%.
De acuerdo con el ejemplo 5 se cultivan en el
invernadero trigo, tomates, plantas de pepino y de judías y se
tratan con la preparación según la invención, tal como se ha
descrito. Una parte de las plantas se emplea modo de control. A
continuación no se llevó a cabo una infección con los patógenos de
las enfermedades en éstos ensayos. Al cabo de seis semanas se
determinan diversos parámetros tales como peso fresco, superficie
de las hojas, longitud de los tallos y contenido en clorofila según
los métodos normalizados usuales y se comparan con los de las
plantas de control. En todos los casos, con una sola excepción,
puede observarse un aumento de los parámetros citados:
- Peso fresco:
- aumento del 21 (trigo) hasta el 57% (tomate);
- Longitud de los tallos:
- aumento del 15 (judías) hasta el 34% (tomates);
- Contenido en clorofila:
- aumento del 8 (trigo) y 76% (pepino), o bien 90% (judías), únicamente en el caso de los tomates no pudo detectarse un aumento significativo del contenido en clorofila.
Se pulverizan superficialmente 10 litros de una
disolución de la preparación según la invención con una
concentración de 0,6 mg/litro sobre un terreno de cultivo
(superficie: aproximadamente 10 m^{2}) en el invernadero. Sobre
éste terreno se plantan trigo, tomates y plantas de judía. Una parte
de las plantas se cultiva, a modo de control, sobre terreno no
tratado pero con todas las demás condiciones idénticas. Al cabo de
seis semanas se determinan diversos parámetros tales como peso
fresco, superficie de las hojas, longitud de los tallos y contenido
en clorofila y se comparan con los de las plantas de control.
Mientras que en el caso del trigo y del tomate, bajo éstas
condiciones, no se observa un aumento significativo de los
parámetros citados, en el caso de las plantas de judías aumenta el
peso fresco en un promedio del 21%, la superficie de las hojas en
un 18%, la longitud de los tallos en un 25% y el contenido en
clorofila en un 5% frente a las plantas de control
correspondientes.
Se mide el crecimiento micelar del patógeno del
tizón tardío de la patata, Phytophtora infestans, en
presencia de diversas concentraciones de la preparación según la
invención sobre V8-Agar. Pudo observarse que el
crecimiento micelar en todo el intervalo medido de concentraciones,
entre 0,5 y 100 mg/litro de la preparación según la invención, no
queda influenciado de manera significativa. Esto significa que el
agente según la invención no ejerce efecto tóxico sobre el hongo.
Por lo tanto no puede explicarse el efecto según la invención por un
efecto fungicida, como ocurre en el caso de los agentes
tradicionales protectores de las plantas.
Se extrajo polvo, preparado según el ejemplo 1
(25 g), tres veces con 200 ml de metanol en el transcurso de una
semana y, a continuación, tres veces con 200 ml de una mezcla
constituida por metanol/acetato de etilo (1:1 v/v) igualmente
durante una semana. Los extractos reunidos se concentraron en vacío.
El residuo se sacudió con agua/acetato de etilo(1:1 v/v).
Las fases reunidas de acetato de etilo se concentraron en vacío y
el residuo se sacudió tres veces con una mezcla de metanol (al
90%)/n-hexano. Las fases acuosas de metanol
reunidas se concentraron y se sacudieron con una mezcla formada por
acetato de etilo/disolución saturada de bicarbonato de sodio (1:1
v/v). El residuo de las fases de acetato de etilo se cromatografió
sobre una columna de gel de sílice (20 cm x 1 cm, gel de sílice de
35-70 mallas, Merck, Alemania). La columna se
eluyó, sucesivamente, con cloroformo (50 ml) y, a continuación, con
metanol en cloroformo (2, 5, 10, 15, 20, 100 v/v %,
respectivamente 50 ml). El eluato se acumuló en fracciones de 25
ml. La actividad biológica se midió con el ensayo de inclinación
Reis-Lamina. Éste ensayo se desarrolló
especialmente para el grupo de fitohormonas de los
brasinoesteroides (Arima et al., 1984, Phytochemestry 23,
1587). La fracción con actividad biológica (fracción 5) se purificó
adicionalmente mediante cromatografía preparativa HPLC (4,6 x 250
mm, columna Ultrasphere ODS RP-18). La fase móvil
estaba constituida por A (agua, 0,1% TFA v/v) y B (metanol) con una
velocidad de flujo de 1 ml/min. El perfil del gradiente fue:
0-1 min.: 100% A, 1-10 min.:
0-40% B (lineal),
10-15 min.: 40 B, 15-27 min.: 40-100% B (lineal), 27-35 min.: 100% B, 35-37 min.: 0-100% A (lineal). Las fracciones activas tenían un tiempo de retención de 25,5-29,5 min. y se concentraron y se derivatizaron con objeto de realizar análisis GC-MS. Se emplearon las siguientes condiciones: El (70 eV), fuente de temperatura 200ºC, columna:
DB-5MS (J&W, 15 m x 0,32mm, espesor de la película 0,25 mm), temperatura de inyección: 260ºC, temperatura de la interfase: 300ºC, gas portador: helio, velocidad de flujo: 1 ml/min.; programa de temperatura de la columna: 170ºC durante 1 min., calentamiento hasta 290ºC con una velocidad de 30ºC/min., 20 min. a 290ºC. La derivatización se llevó a cabo según los métodos normales. Para la identificación de la 24-epi-castasterona y de la 24-epi-secasterona se ensayaron también muestras auténticas procedentes del sistema GC-MS.
10-15 min.: 40 B, 15-27 min.: 40-100% B (lineal), 27-35 min.: 100% B, 35-37 min.: 0-100% A (lineal). Las fracciones activas tenían un tiempo de retención de 25,5-29,5 min. y se concentraron y se derivatizaron con objeto de realizar análisis GC-MS. Se emplearon las siguientes condiciones: El (70 eV), fuente de temperatura 200ºC, columna:
DB-5MS (J&W, 15 m x 0,32mm, espesor de la película 0,25 mm), temperatura de inyección: 260ºC, temperatura de la interfase: 300ºC, gas portador: helio, velocidad de flujo: 1 ml/min.; programa de temperatura de la columna: 170ºC durante 1 min., calentamiento hasta 290ºC con una velocidad de 30ºC/min., 20 min. a 290ºC. La derivatización se llevó a cabo según los métodos normales. Para la identificación de la 24-epi-castasterona y de la 24-epi-secasterona se ensayaron también muestras auténticas procedentes del sistema GC-MS.
La fracción de n-hexano,
anteriormente obtenida, se concentró, se dividió en dos porciones y
se cromatografió en dos columnas de gel de sílice idénticas (20 cm
x 1 cm, 35-70 mallas, Merck). Las columnas se
eluyeron, escalonadamente, con n-hexano (50 ml) y,
a continuación, con acetato de etilo en n-hexano
(10, 30, 50, 70, 90 v/v %, respectivamente 50 ml). El eluato se
acumuló en fracciones de 6 ml y se separó por medio de DC
(eluyente: cloroformo/metanol, 95:5 v/v). Los fitoesteroles se
hicieron visibles mediante sobrepulverización con ácido sulfúrico al
5% en anhídrido acético y calentamiento de las placas DC a 150ºC.
Las fracciones, que contenían los fitoesteroles, se purificaron
adicionalmente mediante columnas de gel de sílice, empleándose como
agente eluyente diclorometano/heptano (1:1 v/v). La fracción que
contenía el esterol se acetalizó y se analizó por medio de
GC-MS de acuerdo con los métodos usuales.
Claims (25)
1. Preparación a base de plantas, de partes de
plantas o de semillas de (a) la familia de las cariofiláceas,
elegidas entre el grupo de las variedades licnis viscaria
(Viscaria vulgaris), flor del cuclillo (Lychnis
flos-cuculi), borbonesa (Silene dioica),
melandrium (Silene noctiflora), clavelito (Dianthus
superbus), clavellina de los cartujos (Dianthus
carthusianorum) o conejera (Silene alba)y (b) variedades
de alfalfa (Medicago), en forma de una mezcla pulverulenta,
encontrándose la proporción en peso el polvo, que procede de las
cariofiláceas, por encima del 80% pero por debajo del 99%,
obtenibles mediante las etapas siguientes: (i)-(vi), llevándose a
cabo las etapas (i) hasta (v) independientemente para cada una de
las variedades de plantas (a) y (b):
- (i)
- molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas,
- (ii)
- recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar,
- (iii)
- realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de éste modo,
- (iv)
- evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble,
- (v)
- secado del residuo, y
- (vi)
- mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada variedad de planta, en la proporción deseada.
2. Preparación según la reivindicación 1,
caracterizada porque la proporción en peso del polvo, que
procede de las cariofiláceas es del 90 al 98%.
3. Preparación según la reivindicación 2,
caracterizada porque la proporción en peso entre el polvo de
las cariofiláceas y el polvo de las variedades de Medicago es de 95
a 5.
4. Preparación según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el material
vegetal empleado procede de formas silvestres no influenciadas por
reproducción, que han crecido preferentemente sin tratamiento con
abonos minerales y/o pesticidas.
5. Preparación según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque se emplean
semillas de las plantas correspondientes.
6. Preparación según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque contienen
compuestos del grupo de los brasinoesteroides.
7. Preparación según la reivindicación 6,
caracterizada porque contiene
24-epi-secasterona y /o
24-epi-castasterona.
8. Preparación según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque adicionalmente
contiene materiales de soporte o bien cargas sólidas,
pulverulentas.
9. Preparación según la reivindicación 8,
caracterizada porque la proporción en peso del polvo mixto
procedente de las plantas supone, con relación a las
cargas/materiales de soporte, del 2 al 8%.
10. Preparación según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque adicionalmente
contiene aditivos vigorizantes o reguladores del efecto.
11. Preparación según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 10, obtenibles según un procedimiento de
acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 15 a 24.
12. Preparación en forma de una suspensión acuosa
a base de la preparación pulverulenta según las reivindicaciones 1 a
11.
13. Preparación según la reivindicación 12, en la
que la concentración del polvo mixto, procedente de las plantas,
supone desde 0,1 mg hasta 2 mg/litro.
14. Preparación según la reivindicación 13, en la
que la concentración del polvo mixto, procedente de las plantas,
supones desde 0,5 mg hasta 1,0 mg/litro.
15. Procedimiento para la obtención de una
preparación pulverulenta o acuosa, adecuada para la protección
biológica de las plantas, según las reivindicaciones 1 a 14,
caracterizado porque se llevan a cabo las etapas siguientes,
verificándose individualmente las etapas (i) hasta (v) para cada una
de las variedades de plantas (a) y (b):
- (i)
- molienda de las plantas, partes de plantas o semillas, secas,
- (ii)
- recogida del producto molido en un disolvente orgánico, polar,
- (iii)
- realización de una extracción bajo agitación de la suspensión obtenida de este modo,
- (iv)
- evaporación del disolvente, sin llevar a cabo una separación previa de la fase sólida y de la fase soluble,
- (v)
- secado del residuo, y
- (vi)
- mezclado de ambos productos pulverulentos, obtenidos según las etapas (i) hasta (v) para cada una de las variedades de las plantas (a) y (b), en la proporción deseada, para dar un polvo mixto y en el caso en que se fabrique una preparación acuosa, de las reivindicaciones 12 a 14,
- (vii)
- suspensión del polvo mixto obtenido procedente de (vi) en agua en la concentración prevista.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque se emplea material vegetal molido con un
tamaño de grano medio comprendido entre 0,1 y 0,2 mm para la
elaboración ulterior.
17. Procedimiento según las reivindicaciones 15 ó
16, caracterizado porque se emplea para la extracción con
agitación desde 1,5 a 2 partes en volumen de disolvente por 1 parte
en volumen de polvo molido.
18. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque como
disolvente se emplea etanol no desnaturalizado del 98 al 100%.
19. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque la extracción
con agitación se lleva a cabo durante un período de tiempo de
aproximadamente 96 hasta 120 horas.
20. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque cada etapa
del procedimiento se lleva a cabo a una temperatura comprendida
entre 15 y 40ºC.
21. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 15 a 20, caracterizado porque se emplea
polvo seco con un contenido en agua menor que el 10% para la
elaboración ulterior según la etapa (vi).
22. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque en el polvo
mixto obtenido, la proporción en peso entre polvo de las
cariofiláceas y el polvo de las variedades de Medicago es de 95 a
5.
23. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque como material
vegetal se emplea aquél que procede de formas silvestres no
influenciadas por la reproducción y, preferentemente, sin
tratamiento con abonos minerales y/o con pesticidas.
24. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 15 a 23, caracterizado porque el polvo
mixto, obtenido según la etapa (vi) se mezcla, adicionalmente, con
un material de soporte o carga sólida, pulverulenta.
25. Empleo de una preparación según una o varias
de las reivindicaciones 1 a 14 como agente biológico para la
protección de las plantas.
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