ES2242227T3 - Nuevo factor de tipo vegf. - Google Patents

Nuevo factor de tipo vegf.

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ES2242227T3 ES97930804T ES97930804T ES2242227T3 ES 2242227 T3 ES2242227 T3 ES 2242227T3 ES 97930804 T ES97930804 T ES 97930804T ES 97930804 T ES97930804 T ES 97930804T ES 2242227 T3 ES2242227 T3 ES 2242227T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO GEN HUMANO QUE TIENE UNA HOMOLOGIA SIGNIFICATIVA CON UN GEN VEGF-C, MIEMBRO DE LA FAMILIA VEGF, QUE HA SIDO AISLADO MEDIANTE EL PROCEDIMIENTO PCR UTILIZANDO CEBADORES DISEÑADOS BASANDOSE EN LA SECUENCIA DE EST, LA CUAL SE ASUME QUE ES HOMOLOGA CON LA REGION C-TERMINAL DEL GEN VEGF-C. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A GENES DE RATA Y RATON QUE HAN SIDO AISLADOS BASANDOSE EN DICHO GEN HUMANO, AISLADO SEGUN EL PROCEDIMIENTO MENCIONADO ANTERIORMENTE, Y TAMBIEN A UNA PROTEINA CODIFICADA POR DICHO GEN HUMANO QUE HA SIDO AISLADA MEDIANTE LA INTRODUCCION DE DICHO GEN HUMANO EN ESCHERICHIA COLI Y LA EXPRESION DEL MISMO. DICHOS GENES Y PROTEINAS AISLADOS PUEDEN APLICARSE, POR EJEMPLO, EN TERAPIA GENICA PARA LA DEFICIENCIA DE VEGF-D, CICATRIZACION DE HERIDAS, Y PROMOCION DE LA FORMACION DE VASOS COLATERALES. ADEMAS, LOS INHIBIDORES DE LA PROTEINA VEGF-D PUEDEN UTILIZARSE COMO NUEVOS FARMACOS ANTICANCERIGENOS, ETC.

Description

Nuevo factor de tipo VEGF.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un factor proteínico implicado en la angiogénesis en humanos y entra en el campo de la ingeniería genética.
Antecedentes del campo
El proceso de la angiogénesis, en el que las células endoteliales existentes en la pared interior de los vasos sanguíneos de los animales generan nuevos vasos sanguíneos, se desencadena por la transducción de una señal específica. Según se ha descrito, una variedad de sustancias están implicadas en la transducción de esta señal. La sustancia más notable entre éstas es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El VEGF es un factor proteínico que se aisló y purificó, y que puede aumentar la proliferación de las células endoteliales y la permeabilidad de los vasos sanguíneos (Senger, D. R. Et al., Science 219: 983-985 (1983); Ferrara, N. and Henzel, W. J., Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 951-858 (1989)). Se ha referido que el gen humano VEGF contiene ocho exones y produce cuatro subtipos consistentes en 121, 165, 189, o 206 residuos de aminoácidos, dependiendo de la diferencia en el splicing, que causa patrones de secreción diferentes (Houck, K. A. et al., Mol. Endocrinol. 5: 1806-1814 (1991)). También se ha referido que hay un receptor VEGF específico, flt-1, y que la unión del VEGF a flt-1 es importante para la transducción de la señal (Vries, C. D. et al., Science 255: 989-991 (1992)).
La expresión del VEGF durante la angiogénesis embrionaria y la diferenciación celular endotelial han sido referidas por Breier, G. et al., Development, (1992), p. 521-532. WO 97/12972 (1996) describe una molécula FIGF relacionada con el crecimiento del factor VEGF.
El factor de crecimiento placentario (PIGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) han sido de este modo aislados y son factores relacionados con VEGF. Se ha encontrado que estos factores promueven las actividades de proliferación de la células endoteliales vasculares (Maglione, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9267-9271 (1991); Betsholtz, C. et al., Nature 320: 695-699 (1986)). Además, VEGF-B (Olofsson, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2576-2581 (1996)) y VEGF-C (Lee, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1988-1992 (1996); Joukov, V. et al., EMBO J. 15, 290-299 (1996) han sido recientemente aislados.
Estos factores parecen constituir una familia, y ésta puede contener factores adicionales desconocidos.
Se ha sugerido que el VEGF está implicado en no sólo la formación vascular en el estado de desarrollo, sino que también en la neovascularización patológica asociada con la diabetes, artritis reumatoide, retinopatía, y el crecimiento de tumores sólidos. Además, sumado a sus efectos de promoción del crecimiento celular endotelial vascular listados anteriormente, la capacidad del VEGF de incrementar la permeablilidad vascular sugirió estar implicada en la formación del edema resultante de varias causas. También, esta familia de factores VEGF puede actuar no sólo en los vasos sanguíneos sino que también en las células sanguíneas y los vasos linfáticos. Pueden de esta manera jugar un papel en la diferenciación y proliferación de células sanguíneas y la formación de vasos linfáticos. Consecuentemente, los factores de la familia VEGF actualmente están captando una atención extraordinaria para desarrollar fármacos nuevos y útiles.
Revelación de la invención
Un objetivo de la presente invención es aislar una proteína nueva perteneciente a la familia VEGF y un gen que codifica la proteína. Buscamos genes que presenten homología a VEGF-C, que es un gen de la familia VEGF recientemente clonado, contra Etiquetas de Secuencia Expresada (EST) y Sitios de Secuencia Etiquetados (STS) en la base de datos GenBank. Como resultado, encontramos un EST que se asumió que presentaba homología con la porción C-terminal de VEGF-C. Entonces diseñamos cebadores basados en la secuencia, y amplificamos y aislamos el correspondiente cDNA utilizando el método 5' RACE y el método 3' RACE. La secuencia de nucleótidos del cDNA aislado se determinó, y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma reveló que la secuencia de aminoácidos presentaba una homología significativa a aquella de VEGF-C. Basándonos en la homología, hemos asumido que el clon humano aislado es un cuarto miembro de la familia VEGF (denominado a partir de aquí como VEGF-D). También hemos tenido éxito en la expresión de la proteína codificada por el gen VEGF-D humano aislado en las células E. coli, y también lo hemos purificado y aislado. Además, hemos tenido éxito en el aislamiento de los genes VEGF-D de ratón y rata utilizando el gen VEGF-D humano aislado.
En particular, la presente invención se refiere a una proteína nueva preteneciente a la familia VEGF y un gen que codifica la proteína. Más específicamente se refiere a:
(1) Una proteína mostrada por la ID de SEC. Nº 1;
(2) Una proteína codificada por un DNA que se hibrida con el DNA mostrado por la ID de SEC. Nº 2;
(3) Un DNA que codifica la proteína de (1);
(4) Un DNA que se hibrida con el DNA mostrado por la ID de SEC. Nº 2;
(5) Un vector que contiene el DNA de (3) ó (4);
(6) Un transformante llevando el vector de (5);
(7) Un método de producción de la proteína de (1) ó (2), que comprende el cultivo del transformante de (6);
(8) Un anticuerpo que se une a la proteína de (1) ó (2);
(9) Un método de cribaje de un compuesto que se une a la proteína de (1) ó (2), que comprende un paso de detección de la actividad de la proteína de (1) ó (2) para unirse a la muestra del test; y
La proteína de la presente invención (VEGF-D) tiene una homología significativa con VEGF-C y puede ser considerada como un cuarto factor de la familia VEGF. Debido a que la función principal de VEGF es la formación vascular en el estadio de desarrollo y se considera que VEGF está implicado en la neovascularización patológica asociada con diabetes, artritis reumatoide, retinopatía, y el crecimiento de tumores sólidos, se cree que la proteína de la presente invención tiene funciones similares.
Una persona experimentada en el campo podría preparar proteínas equivalentes funcionalmente a través de la modificación de VEGF-D de la presente invención mediante la adición, eliminación, o sustitución de uno o más de los aminoácidos de VEGF-D mostrados por la ID de SEC. Nº 1 utilizando métodos conocidos. Las modificaciones de la proteína también pueden ocurrir naturalmente además de las modificaciones artificiales descritas anteriormente. Métodos conocidos para la adición, eliminación, o sustitución de aminoácidos incluyen el método de la extensión solapada de la reacción en cadena de la polimerasa (OE-PCR) (Gene, 1989, 77 (1): 51).
El DNA que codifica el VEGF-D de la presente invención, mostrado por ID de SEC. Nº 2, es útil para aislar los DNAs que codifican las proteínas que tienen funciones similares a VEGF-D humano en otros organismos. Por ejemplo, una persona experimentada en el campo podría aislar rutinariamente homólogos del VEGF-D humano de la presente invención de otros organismos permitiendo al DNA mostrado por la ID de SEC. Nº 2, o una parte de la misma, como una sonda, hibridarse con el DNA derivado de otros organismos. El DNA que se hibrida con el DNA mostrado por la ID de SEC. Nº 2 está también incluido en la presente invención. Los otros organismos incluyen ratones, ratas, y conejos.
El DNA que codifica una proteína que es funcionalmente equivalente a VEGF-D normalmente tiene una homología elevada al DNA mostrado por la ID de SEC. Nº 2. La elevada homología aquí utilizada significa al menos el 70% o más, más preferiblemente el 80% o más, y todavía más preferiblemente el 90% o más de homología de secuencia.
Un ejemplo de las condiciones de hibridación para aislar el DNA que tiene elevada homología se dará a continuación. La prehibridación se realiza en una Solución ExpressHyb a 68ºC durante 30 minutos. La sonda marcada con un radioisótopo se desnaturaliza de 95ºC a 100ºC durante 2 a 5 minutos y rápidamente se enfría en hielo. La sonda se añade a una nueva Solución ExpressHyb. El blot se transfiere a la solución que contiene la sonda y se deja hibridar bajo un gradiente de temperatura de 68ºC a 55ºC durante 2 horas. El blot se lavó cuatro veces, durante 10 minutos cada una, con una solución SSC x 2 que contiene SDS 0,05% a temperatura ambiente. El blot se lava entonces con una solución SSC x 0,1 que contiene un 0,1% SDS a 45ºC durante 3 minutos. El blot se somete a autoradiografía.
Un ejemplo de las condiciones de hibridación para aislar el DNA que tiene una homología muy elevada se da a continuación. La prehibridación se realiza en la Solución ExpressHyb a 68ºC durante 30 minutos. La sonda marcada con un radioisótopo se desnaturaliza de 95ºC a 100ºC durante 2 a 5 minutos y se enfría rápidamente en hielo. La sonda se añade a una nueva Solución ExpressHyb. El blot se transfiere a la solución que contiene la sonda, y se deja hibridar a 68ºC durante 1 hora. El blot se lavó cuatro veces, durante 10 minutos cada vez, con una solución SSC x 2 que contiene un 0,05% de SDS a temperatura ambiente. El blot se lavó entonces con una solución SSC x 0,1 que contiene 0,1% de SDS a 50ºC durante 40 minutos, durante los que la solución se sustituyó una vez. El blot se sometió a autoradiografía.
Nótese que las condiciones de hibridación pueden variar dependiendo de la longitud de la sonda (tanto si es un oligómero o una sonda con más de unos cuantos cientos de bases), el método de marcaje (tanto si la sonda está marcada radioisotópicamente o marcada no radioisotópicamente), y el tipo de gen diana a ser clonado. Una persona experimentada en el campo puede seleccionar apropiadamente las condiciones adecuadas de hibridación. En la presente invención, se desea especialmente que las condiciones no permitan a la sonda hibridarse con el DNA que codifica VEGF-C.
El DNA de la presente invención también se utiliza para producir VEGF-D de la presente invención como una proteína recombinante. Específicamente, la proteína recombinante puede ser producida en grandes cantidades mediante la incorporación de DNA que codifica VEGF-D (por ejemplo, el DNA mostrado por ID de SEC. Nº 2) en un vector de expresión adecuado, introduciendo el vector resultante en un huésped, y cultivando el transformante para permitir que la proteína recombinante sea expresada.
El vector que va a ser utilizado para producir la proteína recombinante no está particularmente restringido. Sin embargo, los vectores tales como pGEMEX-1 (Promega) o pEF-BOS (Nucleic Acids Res. 1990, 18(17): p. 5322) son preferibles. Ejemplos adecuados del huésped en el que el vector es introducido incluyen las células E. coli, células CHO, y células COS.
La proteína VEGF-D expresada por el transformante puede ser purificada mediante la combinación de tratamientos de purificación adecuados tales como la solubilización con un homogenizador o un aparato de ultrasonidos, la extracción con varios tampones, solubilización o precipitación por ácidos o bases, extracción o precipitación con disolventes orgánicos, haciendo precipitar mediante la adición de sulfato de amonio y otros agentes, diálisis, ultrafiltración utilizando filtros de membrana, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase reversa, cromatografía de distribución contra-corriente, cromatografía líquida de alta resolución, isoelectroenfoque, electroforesis en gel, o cromatografía de afinidad en la que los anticuerpos o receptores están inmovilizados.
Una vez que se obtiene la proteína recombinante, se pueden preparar anticuerpos en contra de ésta utilizando métodos conocidos. Los métodos conocidos incluyen la preparación de anticuerpos policlonales mediante la inmunización de conejos, ovejas, u otros animales con la proteína purificada, y preparando los anticuerpos monoclonales a partir de las células productoras de anticuerpos de ratas o ratones inmunizados. Estos anticuerpos harán posible la cuantificación de VEGF. Aunque los anticuerpos obtenidos de esta manera pueden ser utilizados como tales, será más efectivo utilizar los anticuerpos humanos para reducir la inmunogenicidad. Los métodos de humanización de los anticuerpos incluyen el método de injerto de CDR y el método de producción directa del anticuerpo humano. En el método de injerto CDR, el gen del anticuerpo es clonado a partir de las células productoras de anticuerpos monoclonales y su porción antigénica determinante es transplantada a un anticuerpo humano existente. En el método de producción directa de un anticuerpo humano, se inmuniza un ratón cuyo sistema inmunitario ha sido reemplazado por el sistema inmunitario humano, similar a otros anticuerpos monoclonales. La proteína VEGF-D o sus anticuerpos así obtenidos pueden ser administrados al cuerpo mediante inyección subcutánea o un método similar.
Una persona experimentada en el campo puede cribar compuestos que se unen a la proteína de la presente invención mediante métodos conocidos.
Por ejemplo, tales compuestos pueden ser obtenidos haciendo una librería de cDNA en un vector fágico (tal como \lambdagtll y ZAP) de las células que se espera que expresen la proteína que se une a la proteína de la presente invención (tal como células de pulmón, intestino delgado, y del corazón de mamíferos), expresando los cDNAs en agarosa-LB, fijando las proteínas expresadas en un filtro, preparando la proteína purificada de la presente invención como una proteína de fusión o marcada con biotina con la proteína GST, y reaccionando esta proteína con el filtro anterior. Los compuestos deseados pueden entonces detectarse mediante west western blotting utilizando estreptavidina o un anticuerpo anti-GST (Skolnik, E. Y., Margolis, B., Mohammadi, M., Lowenstein, E., Fischer, R., Drepps, A., Ullrich, A., y Schlessinger, J. (1991) Cloning of P13 kinase-associated p85 utlilizing a novel method for expression/cloning of target proteins for receptor tyrosine kinases, Cell 65: 83-90). Otro método comprende los siguientes pasos. Primero, expresar la proteína de la presente invención fusionada con el dominio de unión SRF o el dominio de unión GAL4 en células de levaduras. Segundo, preparar una librería de cDNA que expresa los cDNAs fusionados con el dominio de activación de transcripción de VP16 o GAL4 de las células que se espera que expresen una proteína que se une a la proteína de la presente invención. Tercero, introducir el cDNA en las células de levadura anteriores. Cuarto, aislar el cDNA derivado de la librería de los clones positivos. Finalmente, introducir el cDNA aislado en E. coli para permitir su expresión. (Cuando una proteína que se une a la proteína de la presente invención se expresa en células de levadura, el gen marcador se activa y el clon positivo puede ser detectado). Este método puede ser realizado utilizando el sistema dos híbridos (Sistema Dos híbridos MATCHMAKER, Equipo de Ensayo Dos-Híbridos MATCHMAKER de Mamíferos, o Sistema Un Híbrido MATCHMAKER (todo por Clontech) o el Sistema Vector Dos-Híbridos HybriZAP (Stratagene) (Dalton, S. and Treisman, R. (1992)) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response to the c-fos serum response element, Cell 68: 597-612). Alternativamente, las proteínas de unión pueden ser cribadas mediante la preparación de una librería de cDNA a partir de las células que se espera que expresen una sustancia, tal como un receptor, que se une a la proteína de la presente invención (por ejemplo, células vasculares endoteliales, células de médula ósea, o células de los conductos ductales linfáticos), introduciéndolo en células tales como COS, detectando la unión de la proteína de la presente invención por ella misma o marcada con un radioisótopo o fluorescencia, y clonando las proteínas que se unen a la proteína de la presente invención (Yamasaki, K., Taga, T., Hirata, Y., Yawata, H., Kawanishi, Y., Seed, B., Taniguchi, T., Hirano, T., y Kishimoto, T., (1988) Cloning and expression of human interleukin-6 (BSF-2/IFN beta2) receptor, Science 241: 825-828, Fukunaga, R., Ishizaka-Ikeda, E., Seto, Y., y Nagata, S. (1990) Expression cloning of a receptor for murine granulocyte colony-stimulating factor, Cell 61: 341-350). Aún así otro método comprende la aplicación del sobrenadante del cultivo o el extracto celular de las células que se espera que expresen una proteína que se une a la proteína de la presente invención en una columna de afinidad a la que la proteína de la presente invención ha sido inmovilizada, y purificando las proteínas específicamente unidas a la columna. Además, un DNA que codifica la proteína que se une a la proteína de la presente invención puede ser obtenida mediante la determinación de la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión, sintetizando oligonucleótidos basados en la secuencia, y cribando una librería de cDNA con los oligonucleótidos como sondas.
Además, los compuestos que se unen a la proteína de la presente invención pueden ser cribados por compuestos de contacto, un banco de sustancias naturales, o una librería de exhibición de péptidos de fagos aleatoria con la proteína inmovilizada de la presente invención y detectando las moléculas unidas a la proteína. Estos compuestos pueden también ser cribados mediante un cribado de elevado rendimiento utilizando tecnología de química combinatoria (Wrighton, N. C., Farrell, F. X., Chang, R., Kashyap, A. K., Barbone, F. P., Mulcahy, L. S., Johnson, D. L., Barrett, R. W., Jolliffe, L. K., y Dower, W. J., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (Estados Unidos) Jul 26 1996, 273: 458-464, Verdine, G. L., The combinatorial chemistry of nature, Nature (Inglaterra) Nov 7 1996, 384: 11-13, Hogan, J. C. Jr. Directed combinatorial chemistry, Nature (England) Nov 7 1996, 384: 17-19).
El VEGF-D de la presente invención puede ser utilizado para la terapia génica mediante la introducción del gen VEGF-D en el cuerpo del paciente con la deficiencia VEGF-D, o expresando el gen en el organismo. Un DNA antisentido del gen VEGF-D puede también ser utilizado para inhibir la expresión del gen mismo, suprimiendo por lo tanto la neovascularización patológica.
Entre los varios métodos disponibles para introducir el gen VEGF-D o su cadena DNA antisentido en el organismo son preferibles el método del retrovirus, el método del liposoma, el método del liposoma catiónico, y el método del adenovirus.
Para expresar estos genes en el organismo, los genes pueden ser incorporados en un vector adecuado e introducidos en el cuerpo mediante el método del retrovirus, el método del liposoma, el método del liposoma catiónico, o el método del adenovirus. Aunque los vectores que se van a utilizar no están particularmente limitados, son preferibles tales vectores como pAdexlcw y pZIPneo.
La presente invención también puede ser aplicada para diagnosticar trastornos causados por anomalías del gen VEGF-D, por ejemplo, mediante PCR para detectar una anomalía de la secuencia de nucleótidos del gen VEGF-D.
Además, de acuerdo con la presente invención, la proteína VEGF-D o sus agonistas pueden ser utilizados para curar heridas, promover la formación colateral de vasos, y ayudar a la hematopoyesis por las células madre hematopoyéticas, aprovechándose del efecto angiogénico de la proteína VEGF-D. Los anticuerpos en contra de la proteína VEGF-D o sus antagonistas pueden ser utilizados como agentes terapéuticos para la neovascularización patológica, displasia linfática, dishematopoyesis, o edemas surgidos por diversas causas. Los anticuerpos anti-VEGF-D pueden ser utilizados para el diagnóstico de enfermedades que resultan de la producción anómala de VEGF-D mediante la cuantificación de VEGF-D.
Breve descripción de las ilustraciones
La figura 1 muestra la relación entre el gen VEGF-D, las secuencias EST, y los cebadores utilizados para clonar.
La figura 2 compara las secuencias de aminoácidos de EST (H24828) y VEGF-C.
La figura 3 compara las secuencias de aminoácidos deducidas a partir del gen VEGF-D y a partir de los genes conocidos de la familia de proteínas VEGF.
La figura 4a muestra el esquema de hidrofobicidad de VEGF-D. La figura 4b muestra la predicción del sitio de escisión del péptido señal VEGF-D.
Mejor método para implementar la invención
Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención en detalle, pero no están construidos para limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Búsqueda de homología mediante el método TFASTA
La secuencia CGPNKELDENTCQCVC (ID de SEC. Nº 3) se diseñó basándose en la secuencia consenso encontrada en el BR3P (proteína 3 del anillo de Balbiani) que se repite en el extremo C-terminal de VEGF-C. Las secuencias completas de ESTs y STS en la base de datos Genbank (en el 29 de Febrero de 1996) fueron entonces buscadas por el método TFASTA (Person and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988)). Las condiciones de búsqueda utilizadas se muestran posteriormente (Tabla 1).
TABLA 1
Secuencias \hskip2,5cm 392.210
Símbolos 135.585.305
Tamaño de palabra 2
Penalización de creación de huecos 12,0
Penalización de extensión de huecos 4,0
Como resultado, se descubrió un EST (Número de acceso H24828) que se considera que codifica la secuencia de consenso. La secuencia es uno de los ESTs registrados por The WashU-Merck EST Project, y nueve de cada 16 aminoácidos eran idénticos. La posterior búsqueda por el UniGene de NCBI basado en su secuencia reveló que cinco secuencias registradas (T64149, H24780, H24633, H24828, y T64277 (a 1 de Marzo de 1996)), incluyendo el EST anterior, fueron consideradas derivadas del mismo gen. T64277 y T64149, así como H24828 y H24780, son la combinación de la secuencia 5' y la secuencia 3' de los mismos clones, y la longitud del inserto en ambos de estos clones fue 0,9 kb (Fig. 1).
Traduciendo la secuencia H24828 en una secuencia de proteínas en un marco donde la homología sugiere que esta secuencia codifica 104 residuos de aminoácidos C-terminales. Comparando esta secuencia de aminoácidos con el extremo C-terminal de VEGF-C, 28 de cada 104 aminoácidos (27%) eran idénticos. Además, los aminoácidos que son importantes para el mantenimiento de la estructura proteínica, tales como cisteína y prolina, estaban bien conservados (Fig. 2). Las secuencias conservadas se muestran en un recuadro negro.
Ejemplo 2 Clonación de cDNA a partir de una librería
Los cebadores para 5' RACE y 3' RACE (cebador 5' RACE: 5'-AGGGATGGGGAACTTGGAACGCTGAAT-3' (ID de SEC. Nº 4) cebador 3' RACE: 5'-GATCTAATCCAGCACCCCAAAAACTGC-3' (ID de SEC. Nº 5)). Un cDNA de doble cadena fue sintetizado a partir de un RNA poliA derivado de pulmón utilizando la transcriptasa reversa. Entonces se realizó el PCR utilizando el cDNA Marathon-Ready, Pulmón (Chlontech), teniendo un adaptador de cDNA ligado a ambos finales como un cDNA molde, y utilizando el cebador anterior y el cebador adaptador (cebador AP-1: 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (ID de SEC Nº 6), Fig. 1) como cebadores. El cDNA adaptador anterior contiene las regiones a las que los cebadores adaptadores AP-1 y AP-2 se hibridan. La PCR se realizó de manera que el sistema se expuso a tratamiento a 94ºC durante 1 minuto; cinco ciclos de tratamiento a 94ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 4 minutos; cinco ciclos de tratamiento a 94ºC durante 30 segundos y a 70ºC durante 4 minutos; entonces 25 ciclos de tratamiento a 94ºC durante 20 segundos y a 68ºC durante 4 minutos. (TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) y el tampón adjunto se utilizaron como polimerasa Taq en vez de la mezcla de polimerasas Advantage KenTaq). Como resultado, fueron amplificados fragmentos de 1,5 Kb en la región 5' y fragmentos de 0,9 kb en la región 3'. Estos fragmentos fueron clonados con el Sistema de Clonación Directo-pCR (Clontech), Sistema de Clonación CR-TRAP (GenHunter), y vector PT7Blue-T (Novagen). Cuando el fragmento 5'-RACE se clonó en el vector pCR-Directo, el fragmento se amplificó otra vez utilizando 5'-CTGGTTCGGCCCAGAACTTGGAACGCT
GAATCA-3' (ID de SEC. Nº 7) y 5'-CTCGCTCGCCCACTAATACGACTCACTATAGG-3' (ID de SEC Nº 8) como cebadores.
Ejemplo 3 Análisis de la secuencia de nucleótidos
Se utilizaron el Equipo de Reacción Preparada de Secuenciación de Ciclo Terminal de Tinción ABI PRISM con Polimerasa DNA Amplitaq FS y Secuenciador DNA A 377 (ABI) para la secuenciación del DNA: los cebadores utilizados son los cebadores de los vectores (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (ID de SEC. Nº 9), 5'-CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (ID de SEC. Nº 10.)), cebador AP-2 (5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGG
C-3' (ID de SEC. Nº 11)) y 10 cebadores en la secuencia abajo mostrada. (Tabla 2).
TABLA 2
SC1 (ID de SEC. Nº 12) \hskip1,5cm 5'-AAGTCTGGAGACCTGCT-3'
SC2 (ID de SEC. Nº 13) 5'-CAGCAGGTCTCCAGACT-3'
SC3 (ID de SEC. Nº 14) 5'-CGCACCCAAGGAATGGA-3'
SC4 (ID de SEC. Nº 15) 5'-TGACACCTGGCCATTCCA-3'
SC5 (ID de SEC. Nº 16) 5'-CATCAGATGGTAGTTCAT-3'
SC6 (ID de SEC. Nº 17) 5'-ATGCTGAGCGAGAGTCCATA-3'
SC7 (ID de SEC. Nº 18) 5'-CACTAGGTTTGCGGCAACTT-3'
SC8 (ID de SEC. Nº 19) 5'-GCTGTTGGCAAGCACTTACA-3'
SC9 (ID de SEC. Nº 20) 5'-GATCCATCCAGATCCCTGAA-3'
SC10 (ID de SEC. Nº 21) 5'-CAGATCAGGGCTGCTTCTA-3'
La determinación de la secuencia de nucleótidos del fragmento de 1,5 kb en el extremo 5' y el fragmento de 0,9 kb en el extremo 3' reveló que la secuencia de la región solapada era idéntica, confirmando que se habían obtenido los cDNAs de los extremos 5' y 3' del gen deseado. La determinación de la secuencia de nucleótidos completa del cDNA reveló que este nuevo gen tiene la longitud completa de 2 kb y que puede codificar una proteína que consiste de 354 residuos de aminoácidos (ID de SEC. Nº 1 e ID de SEC. Nº 2). La figura 1 muestra la relación entre este gen y las secuencias EST registradas en la base de datos Genbank. Comparando la secuencia de aminoácidos con otras proteínas de la familia VEGF reveló que los aminoácidos que están bien conservados entre las proteínas de familia están también conservados en este nuevo gen, y por lo tanto este gen es obviamente un nuevo miembro de la familia VEGF (Fig. 3). En la Fig. 3, el HSVEGF indica VEGF humano; HSVEGF-D, HSVEGF-C y HSVEGF-B indican homólogos humanos de VEGF (VEGF-D humano, VEGF-C humano, y VEGF-B humano, respectivamente); HSPDGF-A indica PDGF-A humano; HSPDGF-B indica PDGF-B humano; y HSP1GF2 indica P1GF2 humano. Las secuencias conservadas se muestran en un recuadro negro. Ya que VEGF-D es elevadamente homóloga a VEGF-C que se clonó como el ligando Flt4, se supuso que era un ligando al receptor tipo Flt-4.
Deduciendo el sitio de escisión del péptido señal (Fig. 4b) mediante un plot de hidrofobicidad (fig. 4a) y el método de von Heijne (von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683-4690 (1986)), residuos de 21 aminoácidos N-terminales pueden ser escindidos como péptidos señal, y éstos pueden también experimentar procesamiento adicional de tipo VEGF-C.
Ejemplo 4 Análisis Northern blot
Un fragmento de 1 kb, que ha sido cortado mediante digestión con EcoRI a partir del fragmento 5'- subclonado en el vector pCR-Directo, se marcó con [\alpha-^{32}P]dCTP y se utilizó como sonda. Se realizó el marcaje cebando aleatoriamente utilizando perlitas marcadoras de DNA listas para utilizar (Pharmacia). La hibridación se realizó en la Solución de Hibridación ExpressHyb (Clontech) mediante el método usual utilizando Northern Blot Humano de Múltiples Tejidos (MTN), Humano II, Fetal Humano, y líneas Celulares Humanas (Clontech). Una expresión significativa se observó en pulmón, corazón, e intestino. Se observó una débil expresión en el músculo esquelético, ovario, colon, y páncreas. El peso molecular aparente del mRNA era de 2,2 kb, y el fragmento clonado pareció tener casi la longitud completa del gen.
Ejemplo 5 Expresión de la proteína VEGF-D en E. coli
Dos cebadores, 5'-TCCAGATCTTTTGCGGCAACTTTCTATGACAT-3' (ID de SEC. Nº 22) y 5'-CAGGTC
GACTCAAACAGGCACTAATTCAGGTAC-3' (ID de SEC. Nº 23), fueron sintetizados para amplificar la región correspondiente a los residuos de aminoácidos del 89º al 181º del cDNA del VEGF humano. El fragmento de DNA de esta manera obtenido se digirió con los enzimas de restricción BglII y SalI, y se ligó utilizando el equipo de ligación II (Takara Shuzo Co., Ltd) al plásmido pQE42 (QIAGEN), que había sido digerido con enzimas de restricción BamHI y SalI. El plásmido resultante se introdujo en E. coli SG19003[pREP4] (QIAGEN), y un plásmido, que fue obtenido tal como se diseñó sin ninguna mutación, fue seleccionado (pQE42-BS3). El plásmido pQE42-BS3 se introdujo en E. coli BL21 (Invitorogen) y se cultivó en 10 mL de Caldo L que contiene 100 mg/l de bicucilina (ampicilina sódica para inyección, Meiji Seika Kaisha, Ltd.). Entonces se inocularon 200 mL de Caldo L fresco en el cultivo. Después de incubar a 37ºC durante 1,5 horas, se añadió IPTG a 3mM, y el cultivo se incubó a 37ºC durante 5 horas. Después de que las células se cultivaran, una proteína se purificó con una columna de Ni-NTA siguiendo el protocolo del equipo de tipo II de QIAexpress.
Ejemplo 6 Expresión de la proteína de fusión DHFR-VEGF-D en E. coli
La región correspondiente a los residuos de aminoácidos del 89º al 181º del cDNA de VEGF humano se amplificó con los mismos cebadores utilizados en el Ejemplo 5. El fragmento de DNA obtenido de esta manera se digirió con enzimas de restricción BglI y SalI. El fragmento entonces se ligó utilizando el equipo de ligación II (Takara Shuzo Co., Ltd.) al plásmido pQE40 (QIAGEN), que había sido digerido con enzimas de restricción BamHI y SalI. El plásmido resultante se introdujo en E. coli SG19003[pREP4] (QIAGEN), y un plásmido, que fue obtenido tal como se diseñó sin ninguna mutación, fue seleccionado (pQE40-BS3). El plásmido pQE40-BS3 se introdujo en E. coli BL21 (Invitrogen) y se cultivó en 10 mL de Caldo L que contiene 100 mg/l de bicucilina (ampicilina sódica para inyección, Meiji Seika Kaisha, Ltd.). Entonces se inocularon 200 mL de Caldo L fresco en el cultivo. Después de incubar a 37ºC durante 1,5 horas, se añadió IPTG a 3mM, y el cultivo se incubó a 37ºC durante 5 horas. Después de cultivar las células, se purificó una proteína de fusión DHFR-VEGF-D con una columna de Ni-NTA siguiendo el protocolo del equipo de tipo II de QIAexpress.
Ejemplo 7 Clonación del cDNA de VEGF-D de ratón
Se prepararon dos filtros (Amersham) Hybond-N+ (20 cm x 22 cm) en los que 1,5 x 10^{5} pfu de la librería de cDNA de tramos 5' de pulmón de ratón que se transfirieron. El gradiente de hibridación de 68ºC a 55ºC se realizó durante dos horas en Solución de Hibridación ExpressHyb (Clontech) utilizando como sonda un fragmento Pvu II de aproximadamente 5ª ng de VEGF-D humano, que había sido marcado con \alpha-^{32}P-dCTP (Amersham) utilizando perlitas marcadoras de DNA listas para utilizar (-dCTP) (Pharmacia). Los filtros se lavaron cuatro veces en SSC x 2, 0,05% SDS a temperatura ambiente durante 10 minutos, entonces se lavaron en SSC x 0,1, 0,1% SDS a 45ºC durante 3 minutos. Los filtros lavados se expusieron durante toda la noche a -80ºC utilizando HyperFilm MP (Amersham) y papel intensificador. Los clones positivos se sometieron al segundo cribado de la misma manera que anteriormente para aislar un único clon. Los DNAs lambda aislados se purificaron a partir del lisado de la placa utilizando un Equipo MAX I Lambda QIAGEN (Qiagen). Los DNAs insertados se cortaron con EcoRI y se subclonaron en pUC118 EcoRI/BAP (Takara Shuzo Co., Ltd.). Entonces se determinó su secuencia de nucleótidos con el secuenciador ABI377 (Perkin Elmer). El cDNA que codifica la longitud completa del VRGF-D del ratón se reconstruyó con dos de los clones obtenidos que se solapaban uno al otro. ID de SEC. Nº 24 muestra la secuencia de nucleótidos del cDNA del VEGF-D del ratón y la secuencia de aminoácidos deducida del mismo.
Ejemplo 8 Clonación del cDNA de VEGF-D de rata
Se prepararon dos filtros (Amersham) Hybond-N+ (20 cm x 22 cm), en los que 1,5 x 10^{5} pfu de la librería de cDNA de tramos 5' de pulmón de rata había sido transferida. Se realizó un gradiente de hibridación de 68ºC a 55ºC durante 2 horas en una Solución de Hibridación Fyb.ExpressH (Clontech) utilizando como sonda un fragmento de aproximadamente 1 \mug conteniendo 1-782 bp del cDNA de VEGF-D del ratón que había sido marcado con \alpha-^{32}P-dCTP (Amersham) utilizando perlitas marcadoras de DNA listas para utilizar (-dCTP) (Pharmacia). Los filtros se lavaron cuatro veces en SSC x 2, SDS 0,05% a temperatura ambiente durante 10 minutos, entonces se lavó en SSC x 0,1, SDS 0,1% a 45ºC durante 3 minutos. Los filtros lavados se expusieron durante toda la noche a -80ºC utilizando HyperFilmMP (Amersham) y papel intensificador. Los clones positivos se sometieron al segundo cribado de la misma manera que antes para aislar un único clon. El clon positivo aislado se cortó en pBluescript utilizando E. coli SOLAR (Stratagene) y un fago ayudante ExAssist (Stratagene), entonces la secuencia se determinó con el secuenciador ABI377 (Perkin Elmer). La secuencia pareció ser el cDNA VEGF-D de rata pero no contenía el codón de terminación.
Para obtener el cDNA C-terminal que no había sido obtenido, se realizó la PCR utilizando el cDNA de riñón de rata Marathon-Ready (Clontech) como molde y 5' cebador GCTGCGAGTGTGTCTGTAAA (ID de SEC. Nº 26) y 3' cebador GGGTAGTGGGCAACAGTGACAGCAA (ID de SEC. Nº 27) con 40 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 2 minutos. Después el fragmento de esta manera obtenido se subclonó en el vector pGEM-T (promega), la secuencia de nucleótidos se determinó con el secuenciador ABI377 (Perkin Elmer). El clon resultante contenía el extremo C-terminal del VEGF-D de la rata. Basándonos en los resultados de la secuenciación del clon obtenido mediante la hibridación en placa y el clon obtenido por PCR, se determinó la longitud completa de la secuencia de VEGF-D de la rata. La ID de SEC Nº 25 muestra la secuencia de nucleótidos determinada y la secuencia de aminoácidos deducida a partir de la misma.
Aplicabilidad industrial
En la presente invención, una nueva proteína (VEGF-D) que tiene una homología significativa con VEGF-C y su gen han sido aislados. Parece ser que el VEGF-D está implicado en la neovascularización patológica asociada con la diabetes, artritis reumatoide, el crecimiento de tumores sólidos, diferenciación y proliferación de células sanguíneas, formación de vasos linfáticos, y formación de edema resultante de varias causas así como la neovascularización normal en el estadio de desarrollo. El gen de la presente invención puede ser utilizado para diagnosticar trastornos causados por anormalidades del gen VEGF-D y la terapia génica para la deficiencia de VEGF-D. La proteína VEGF-D, que se obtiene mediante la expresión del gen de la presente invención, puede ser utilizada para curar heridas, promover la formación de vasos colateral, y ayudar a la proliferación de células madre hematopoyéticas. Los anticuerpos o inhibidores contra la proteína VEGF-D pueden ser utilizados para tratar la angiodisplasia y linfangiodisplasia asociada a inflamación, edemas producidos por diversas causas, dishematopoyesis, y, como un nuevo agente anticáncer, para tratar la neovascularización patológica. La proteína VEGF-D y sus anticuerpos pueden se útiles para diagnosticar enfermedades que resultan de una producción anormal de VEGF-D.
(1)
Nombre del solicitante: Chugai Research Institute for Molecular Medicine, Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
(2)
(2) Titulo del invento: Nuevo factor a modo de VEGF
\vskip0.800000\baselineskip
(3)
(3) Número de referencia: CI-802PCT
\vskip0.800000\baselineskip
(4)
Número de solicitud:
\vskip0.800000\baselineskip
(5)
Fecha de presentación:
\vskip0.800000\baselineskip
(6)
País en donde se ha depositado la solicitud prioritaria y el número de solicitud de la patente: Japón Nº Hei 8-185216
\vskip0.800000\baselineskip
(7)
Fecha de prioridad: 15 julio l996
\vskip0.800000\baselineskip
(8)
Número de secuencias: 27
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 354
TIPO SE SECUENCIA: aminoácido
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: proteína
FUENTE ORIGINAL:
\hskip0,7cm ORGANISMO: Homo sapiens
\hskip0,7cm TIPO DE TEJIDO: pulmón
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2004
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: doble
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: cDNA a mRNA
FUENTE ORIGINAL:
\hskip0,7cm ORGANISMO: Homo sapiens
\hskip0,7cm TIPO DE TEJIDO: pulmón
CARACTERISTICA:
\hskip0,7cm NOMBRE/CLAVE: CDS
\hskip0,7cm POSICION: 403..1464
\hskip0,7cm METODO DE IDENTIFICACION: E
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 16
TIPO DE SECUENCIA: aminoácido
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: péptido
FUENTE ORIGINAL:
\hskip0,7cm ORGANISMO: Homo sapiens
\hskip0,7cm TIPO DE TEJIDO: pulmón
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 4
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 27
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGGGATGGGG AACTTGGAAC GCTGAAT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 27
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCTAATCC AGCACCCCAA AAACTGC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 27
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGTTCGGC CCAGAACTTG GAACGCTGAA TCA 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 32
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGCTCGCC CACTAATACG ACTCACTATA GG 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTAACCCT CACTAAAGGG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 22
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGGGTTTT CCCAGTCACG AC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 23
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTCTGGAG ACCTGCT 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCAGGTCT CCAGACT 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 17
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCACCCAAG GAATGGA 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGACACCTGC CCATTCCA 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATCAGATGG TAGTTCAT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 17
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGCTGAGCG AGAGTCCATA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 18
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACTAGGTTT GCGGCAACTT 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 19
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGTTGGCA AGCACTTACA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 20
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCATCCA GATCCCTGAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 21
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 19
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGATCAGGG CTGCTTCTA 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 22
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 32
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCAGATCTT TTGCGGCAAC TTTCTATGAC AT 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 23
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 33
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGGTCGACT CAAACAGGCA CTAATTCAGG TAC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 24
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1581
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: doble
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: cDNA a mRNA
FUENTE ORIGINAL:
\hskip0,7cm ORGANISMO: ratón
\hskip0,7cm TIPO DE TEJIDO: pulmón
CARACTERISTICA:
\hskip0,7cm NOMBRE/CLAVE: CDS
\hskip0,7cm POSICION: 96..1169
\hskip0,7cm METODO DE IDENTIFICACION: E 
\newpage
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
6
7 
\newpage
SEC. ID Nº: 25
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 1491
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: doble
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: cDNA a mRNA
FUENTE ORIGINAL:
\hskip0,7cm ORGANISMO: rata
\hskip0,7cm TIPO DE TEJIDO: pulmón
CARACTERISTICA:
\hskip0,7cm NOMBRE/CLAVE: CDS
\hskip0,7cm POSICION: 270..1247
\hskip0,7cm METODO DE IDENTIFICACION: E
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
8
9
10
SEC. ID Nº: 26
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 20
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGCGAGTG TGTCTGTAAA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID Nº: 27
\vskip1.000000\baselineskip
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 25
TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico
TIPO DE CADENA: simple
TOPOLOGIA: lineal
TIPO DE MOLECULA: otro ácido nucleico, DNA sintético
DESCRIPCION DE LA SECUENCIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTAGTGGG CAACAGTGAC AGCAA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (18)

1. Una molécula de DNA seleccionada a partir del grupo que consiste de
(a)
una molécula de DNA que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en ID de SEC. Nº 1;
(b)
una molécula de DNA que tiene la secuencia de codificación que se muestra en la ID de SEC. Nº 2;
(c)
una molécula de DNA, la hebra complementaria de la que se hibrida con una molécula de DNA tal como se define en (a) ó (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad VEGF-D; o
(d)
una molécula de DNA, la hebra complementaria de la cual se hibrida y que es al menos el 70% idéntica a la molécula de DNA tal como se define en (a) ó (b) y que codifica un polipéptido que tiene actividad VEGF-D;
o la hebra complementaria de tal molécula de DNA.
2. Un vector que contiene una molécula de DNA de la reivindicación 1.
3. El vector de la reivindicación 2 siendo un vector de expresión que permite la expresión de dicha molécula de DNA en células huésped eucariotas o procariotas.
4. Una célula transformante que lleva el vector de la reivindicación 2 ó 3.
5. Un método para producir un polipéptido codificado por la molécula de DNA de la reivindicación 1, que comprende el cultivo de la célula transformante de la reivindicación 4.
6. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de DNA de la reivindicación 1 u obtenible mediante el proceso de la reivindicación 5, en donde el polipéptido obtenible por el procedimiento de la reivindicación 5 está codificado por la molécula de DNA de la reivindicación 1 contenida en la célula transformante de la reivindicación 4.
7. Un anticuerpo en contra del polipéptido de la reivindicación 6.
8. Un inhibidor de la expresión de la molécula de DNA de la reivindicación 1, que es una molécula de DNA antisentido específicamente hibridando una molécula de DNA de la reivindicación 1.
9. Una composición que comprende una molécula de DNA de la reivindicación 1, o un vector de la reivindicación 2 ó 3.
10. Una composición que comprende un polipéptido de la reivindicación 6.
11. Una composición que comprende un anticuerpo de la reivindicación 7.
12. Una composición que comprende una molécula de DNA antisentido de la reivindicación 8.
13. La composición de la reivindicación 9 para utilizar en terapia génica.
14. la composición de la reivindicación 10 para curar las heridas, promover la formación de vasos colaterales, o ayudar a la hematopoyesis o a las células madre hematopoyéticas.
15. La composición de la reivindicación 11 para el tratamiento de la neovascularización patológica, displasia linfática, dishematopoyesis, o edemas.
16. La composición de la reivindicación 12 para la inhibición de la expresión del gen VEGF-D de este modo suprimiendo la neovascularización patológica.
17. La composición de la reivindicación 11 para diagnosticar la producción anormal de VEGF-D.
18. Un método de cribado para un compuesto que se une a un polipéptido de la reivindicación 6, que comprende el paso de unión a un polipéptido de la reivindicación 6 a una muestra del ensayo.
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