ES2242234T3 - Plantas transgenicas que expresan enzimas celuloliticas. - Google Patents

Plantas transgenicas que expresan enzimas celuloliticas.

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Eric Russell Ward
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS PROCEDIMIENTOS DE REGULACION DE LA EXPRESION GENICA EN LAS PLASTAS, UN SISTEMA INDUCTIBLE CON MEDIACION POR TRANSACTIVADOR, Y PLANTAS QUE ENCIERRAN LOS NUEVOS SISTEMAS DE EXPRESION. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA PRODUCCION DE ENZIMAS QUE DEGRADAN LA CELULASA EN LAS PLANTAS, MEDIANTE TECNICAS DE INGENIERIA GENETICA. SECUENCIAS QUE CODIFICAN LA CELULASA, SE FUSIONAN CON PROMOTORES ACTIVOS EN LAS PLANTAS Y SE TRANSFORMAN EN GENOMA NUCLEAR Y GENOMA CLOROPLASTICO. PUESTO QUE LAS CELULASAS PUEDEN SER TOXICAS PARA LAS PLANTAS, SE UTILIZAN, PREFERENTEMENTE, LOS PROMOTORES CON INDUCCION QUIMICA, DE MANERA QUE LA EXPRESION EN LAS PLANTAS DE LOS GENES DE CELULASA TRANSFORMADOS, PUEDA INDUCIRSE QUIMICAMENTE. ADEMAS, SE PUEDEN UTILIZAR LAS CELULASAS EXPRESADAS PARA APUNTAR VACUOLAS U OTRAS ORGANELLAS, CON EL FIN DE REDUCIR LA TOXICIDAD. EL CAMPO DE APLICACION SE EXTIENDE A CUALQUIER PROCESO INDUSTRIAL QUE REQUIERA UNA ABUNDANTE CANTIDAD DE CELULASAS, PERO EN PARTICULAR A LA CONVERSION DE BIOMASA CELULOSICA EN ETANOL.

Description

Plantas transgénicas que expresan enzimas celulolíticas.
Campo de la invención
La invención se refiere al control de la expresión génica en plástidos transgénicos y a plantas transgénicas capaces de expresar enzimas de degradación de celulosa.
Antecedentes de la invención Usos Industriales de Enzimas de Degradación de la Celulosa 1. Transformación de Biomasa en Etanol
La producción de etanol ha recibido una considerable atención a lo largo de los años para su uso como potenciador del índice de octano, como extensor de combustible o como combustible líquido directamente. Por ejemplo, en Brasil, hasta el 90% de los coches nuevos funcionan con etanol, mientras que el resto funcionan con una mezcla etanol/gasolina. En los Estados Unidos, aproximadamente el 7% de toda la gasolina vendida actualmente contiene etanol, normalmente en la forma de una mezcla gasolina:etanol 90%:10%. Actualmente en Brasil el combustible de etanol se produce principalmente a partir de caña de azúcar; sin embargo, en los Estados Unidos, los precios del azúcar normalmente son demasiado elevados para hacer que la caña de azúcar sea una fuente atractiva para la producción de etanol. En los Estados Unidos, actualmente el combustible de etanol se produce principalmente a partir del maíz y de otros cereales ricos en almidón. Sin embargo, la producción de mil millones de galones de etanol al año se traduce en 14000 millones de litros de maíz al año, lo que significa que la industria de etanol a partir de maíz existente es insuficiente para dar suministro al actual mercado de combustibles. Adicionalmente, en la actualidad el etanol de maíz es demasiado caro para competir de un modo eficaz económicamente con la gasolina. Para introducir un impacto significativo en el mercado de combustibles para el transporte, el etanol necesita una fuente más amplia y barata que la que la industria tiene a su disposición actualmente. La tecnología para utilizar biomasa celulósica, por ejemplo madera, hierba, y residuos de biomasa procedentes de distintos procesos comerciales, como fuente podría expandir la fuente base para ajustarse a la mayor parte de las necesidades del mercado de combustible en los Estados Unidos, ya que la biomasa celulósica es barata y abundante.
Los principales componentes de las plantas terrestres son dos familias de polímeros de azúcares, la celulosa y la hemicelulosa. Las fibras de celulosa comprenden del 4% al 50% del peso total seco de los tallos, raíces y hojas. Estas fibras se encuentran embebidas en una matriz de hemicelulosa y de polímeros fenólicos. La celulosa es un polímero compuesto de azúcares de seis carbonos, principalmente glucosa, unidos mediante enlaces \beta-1,4. La hemicelulosa es un polímero de azúcares, pero los tipos de azúcares varían en función del origen de la biomasa. Con la excepción de las maderas de coníferas, el azúcar de cinco carbonos, xilosa, es el componente predominante en la hemicelulosa.
Aunque la producción de etanol incluye necesariamente procesos de fermentación a partir de azúcares, la tecnología de producción de etanol a partir de biomasa celulósica difiere fundamentalmente de la producción de etanol a partir de cultivos de alimentos almidonados. Aunque ambos requieren la hidrólisis de la fuente (almidón o celulosa) para dar lugar a azúcares fermentables, el almidón es más fácil de hidrolizar y las enzimas que degradan almidón, las amilasas, son relativamente baratas. Por el contrario, las enzimas de degradación de la celulosa o "celulasas" actualmente son menos eficaces y más caras. La hidrólisis de biomasa celulósica para dar lugar a azúcares fermentables también se puede producir a través de procesos de hidrólisis ácida, que no serán descritos en detalle. Las celulasas son una familia de enzimas de trabajan en concierto para degradar la celulosa hasta sus componentes de azúcares más sencillos y en condiciones mucho más suaves que las de la hidrólisis ácida. Adicionalmente, estas enzimas catalizan reacciones altamente específicas y son necesarias en cantidades mucho menores en comparación con las reacciones de hidrólisis ácida.
La hidrólisis de la celulosa y del almidón produce glucosa a través de la siguiente reacción:
n \ C_{6}H_{10}O_{5} + n \ H_{2}O \rightarrow n \ C_{6}H_{12}O_{6}
Después de que se forme la glucosa, se produce su fermentación a etanol mediante la siguiente reacción:
C_{6}H_{12}O_{6} \rightarrow \ 2 \ CO_{2} + 2 \ C_{2}H_{5}OH
Para la biomasa lignocelulósica como la de maderas duras, la fracción hemicelulósica también debe ser considerada. Para biomasa que contiene predominantemente el azúcar de cinco carbonos, xilosa, en la hemicelulosa la reacción de hidrólisis transcurre como se indica a continuación:
n \ C_{5}H_{8}O_{4} + n \ H_{2}O \rightarrow n \ C_{5}H_{10}O_{5}
mientras que la xilosa producida es fermentada a etanol con la siguiente estequiometría:
3 \ C_{5}H_{10}O_{5} \rightarrow 5 \ CO_{2} + 5 \ C_{2}H_{5}OH
2. Otros Usos Potenciales para las Enzimas de Degradación de Celulosa
Además del uso de transformación de biomasa en etanol, las celulasas presentan una potencial utilidad en otros procesos industriales, tales como cualquier proceso industrial que dependa de un suministro de azúcares fermentables. Las celulosas también presentan una potencial utilidad en la industria de pasta y papel y en la industria textil para reducir la actual dependencia de la hidrólisis ácida, que es la principal causa de contaminación del agua.
En la industria de piensos para animales, las celulasas presentan utilidad como aditivo de los piensos para ayudar a la digestión del material celulósico. Por ejemplo, el ensilaje puede hacerse más digerible mediante la adición de celulasas o de plantas que expresen celulasas.
Características de las Enzimas de Degradación de Celulosa
Como se ha indicado anteriormente, la celulosa y la hemicelulosa son el principal origen de azúcares fermentables en las fuentes lignocelulósicas; sin embargo, la naturaleza ha diseñado el tejido de la madera para resistir eficazmente al ataque microbiano. Una amplia variedad de organismos, incluyendo las bacterias y los hongos, poseen actividad celulolítica. Para ser eficaces, los microorganismos degradadores de celulosa producen normalmente sistemas enzimáticos que se caracterizan por múltiples actividades enzimáticas que trabajan sinérgicamente para reducir la celulosa a celobiosa, y a continuación a glucosa. Se requieren al menos tres actividades enzimáticas diferentes para llevar a cabo esta tarea. Las \beta-1,4-endoglucanasas (EC 3.2.1.4, también denominadas endocelulasas) rompen los enlaces \beta-1,4-glicosídicos de forma aleatoria a lo largo de la cadena de celulosa. Las \beta-1,4-exoglucanasas (EC 3.2.1.91, también denominadas celobiohidrolasas, CBH) rompen la celobiosa tanto del extremo reductor como del extremo no reductor de una cadena de celulosa. Las 1,4-\beta-D-glucosidasas (EC 3.2.1.21, también denominadas celobiosas) hidrolizan aril- y alquil-\beta-D-glucósidos.
Los hongos filamentosos son bien conocidos como fuente para celulasas industriales. Sin embargo, esta fuente generalmente es considerada demasiado cara para la producción de etanol a gran escala industrial. Algunos de los productores más prolíficos de celulasas extracelulares son varias cepas de Trichoderma reesei. Por el contrario, normalmente bacterias celulolíticas tales como la Thermomonospora fusca producen celulasas en un nivel muy inferior al de los hongos filamentosos. Sin embargo, las celulasas procedentes de T. fusca y de otras bacterias han demostrado presentar actividades altamente específicas en un amplio intervalo de valores de pH y también han demostrado presentar la deseable propiedad de estabilidad térmica. Los genes de T. fusca que codifican enzimas de degradación de celulosa han sido clonados y caracterizados intensivamente. (Véase, por ejemplo, Collmer y col. (1983) Bio/Technology 1:594-601, incorporado aquí a modo de referencia; Ghangas y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 2521-2526, incorporado aquí a modo de referencia; y Wilson (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12: 45-63, incorporado aquí a modo de referencia). Adicionalmente, se han determinado las secuencias de ADN de un gen de celobiohidrolasa y de un gen de endoglucanasa procedente de T. fusca (Jung y col. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032-3043, incorporado aquí a modo de referencia); y también se han determinado las secuencias de ADN de tres genes de endoglucanasa procedentes de T. fusca (Lao y col. (1991) J. Bacterial. 173: 3397-3407, incorporado aquí a modo de referencia).
Actualmente se están llevando a cabo esfuerzos para utilizar hospedantes bacterianos o fúngicos recombinantes productores de celulasas para producir diversas celulasas para su uso en procesos de transformación de biomasa en etanol. Las celulasas candidatas para su utilización en dichos sistemas recombinantes son seleccionadas en base a factores tales como la cinética, la temperatura y la tolerancia al pH, la resistencia a la inhibición de producto final, y sus efectos sinérgicos. (Véase, por ejemplo, Thomas y col., "Initial Approaches to Artificial Cellulase Systems for Conversion of Biomass to Ethanol"; Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, J. N. Saddler y M. H. Penner, eds., ACS Symposium Series 618: 208-36, 1995, American Chemical Society, Washington, D. C., incorporado aquí por complete a modo de referencia). Se han presentado ejemplos de expresión heteróloga de endoglucanasas, exoglucanasas y \beta-D-glucosidasas en E. coli, Bacillus sutilis y Streptomyces lividans (Lejeune y col., Biosynthesis and Biodegradation of Cellulose; Haigler, C. H.; Weimer, P. J., Eds.; Marcel Dekker: Nueva Cork, NY, 1990; páginas 623-671). Además, se ha demostrado la expresión de una endoglucanasa de B. subtilis y una \beta-D-glucosidasa de C. fimi en E. coli (Yoo y col. (1992) Biotechnol. Lett. 14: 77-82).
Aunque existe una investigación continua por desarrollar un sistema de expresión génica múltiple en un hospedante adecuado que produzca elevados niveles de actividad de endoglucanasas, exoglucanasas y \beta-D-glucosidasa en proporciones óptimas para la degradación de biomasa celulósica, el resultado final de esta investigación será simplemente un birreactor mejorado para la producción de grandes cantidades de celulasas altamente activas para su uso en procesos convencionales de transformación de biomasa en etanol así como en otras aplicaciones industriales. Por tanto, esta investigación está limitada por los problemas convencionales inherentes a dichos procesos de fermentación, incluyendo el hecho de que la biomasa es resistente de forma natural a un ataque enzimático externo.
Las estrategias actuales para solucionar este problema se limitan a usar hospedantes recombinantes que no sean dañados a sí mismos por su producción modificada genéticamente de enzimas de degradación de celulosa. Por ejemplo, sería de esperar que sólo los hospedantes que no incluyen celulosa en sí mismos fueran adecuados para su uso en dichos birreactores. Por lo tanto, no se esperaría que las plantas fueran hospedantes adecuados para genes recombinantes de celulasa. La transformación de una planta para producir elevados niveles de celulasa va contra la lógica y presenta dificultades técnicas especiales. Para superar estas dificultades, fue necesario desarrollar nuevos sistemas de expresión, que permitan niveles de expresión muy elevados, preferiblemente bajo una regulación restrictiva para evitar daños en la planta durante su desarrollo. Estos nuevos sistemas de expresión también tendrían aplicaciones a parte de la producción de celulasa.
Resumen de la invención
La presente invención aborda la necesidad de una fuente abundante y económica de enzimas de degradación de celulosa para industrias tales como la industria de producción de etanol, la industria de alimentación de ganado, y las industrias papelera y textil. Del mismo modo, la presente invención se refiere a la producción de enzimas de degradación de celulosa en plantas a través de la aplicación de técnicas de modificación genética. Las plantas superiores son candidatos prometedores para su uso en birreactores in vivo para la producción de celulasa. Presentan elevados rendimientos de biomasa, la producción se puede llevar fácilmente a escalas mayores y no requieren condiciones asépticas, y la modificación post-translacional compleja de las proteínas sintetizadas por la planta es corriente. Además, los niveles de proteínas codificadas por transgenes en las plantas pueden superar el 1% del contenido total de proteínas. Sin embargo, ya que las plantas dependen de la celulosa para su integridad estructural, es de esperar que las enzimas de degradación de la celulosa sean tóxicas para las plantas. Del mismo modo, los genes de celulasa representan un objetivo ideal para la tecnología relacionada con la inducción química de la expresión génica y con la fijación de productos génicos a estructuras de almacenamiento.
En la presente invención, las secuencias de codificación de celulasa son fusionadas con promotores activos de las plantas y son transformadas en el genoma nuclear o en el genoma de plástidos. Las celulasas que pueden ser expresadas en plantas de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, endoglucanasas, exoglucanasas y \beta-D-glucosidasas, preferiblemente derivadas de fuentes no vegetales tales como microorganismos (por ejemplo, bacterias u hongos). Un promotor preferido es el promotor PR-1a del tabaco inducible químicamente; sin embargo, en determinadas situaciones, también pueden utilizarse promotores constitutivos tales como el promotor CaMV 35S. Con un promotor inducible químicamente, la expresión de los genes de celulasa transformados en plantas puede ser activada en el momento apropiado mediante la aplicación foliar de un inductor químico.
Cuando se usa la transformación de plástido, los vectores son construidos de forma adecuada usando un promotor fago, tal como el promotor fago T7 gen 10, cuya activación transcripcional es dependiente de una polimerasa de ARN tal como la polimerasa de ARN de fago T7. En un caso concreto, los vectores de transformación de plástido que contienen un promotor fago fusionado con un gen de celulasa son transformados en el genoma de cloroplastos. La línea resultante es cruzada con una línea transgénica que contiene una región de codificación nuclear para una polimerasa de ARN de fago complementada con una secuencia dirigida a cloroplastos y unida operativamente a un promotor constitutivo tal como el promotor CaMV 35S, dando como resultado la expresión de celulasa constitutiva en los cloroplastos de las plantas resultantes de dicho cruce. La expresión de cloroplastos presenta la ventaja de que la celulasa es menos dañina para el plástido, ya que contiene poco o nada de celulosa.
Además de usar promotores inducibles químicamente, las celulasas expresadas pueden ser dirigidas a determinados orgánulos tales como las vacuolas para reducir los problemas de toxicidad. Para la expresión de celulasas dirigida a vacuolas, las plantas son transformadas con vectores que incluyen una secuencia de direccionamiento vacuolar tal como la procedente de un gen de quitinasa de tabaco. En este caso, las celulasas expresadas serán almacenadas en las vacuolas desde donde no podrán degradar la celulosa y provocar daños en la planta.
Por lo tanto, la invención está relacionada con:
Un planta que expresa una enzima de degradación de celulosa, por ejemplo una enzima de degradación de celulosa que no está expresada de forma natural en las plantas, por ejemplo una planta que comprende una secuencia de ADN heteróloga que codifica una enzima de degradación de celulosa integrada de forma estable en su ADN nuclear o de plástido, preferiblemente bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo un promotor inducible por herida o químicamente, por ejemplo ligado operativamente al promotor inducible o bajo el control de un promotor regulado por transactivador en el que el correspondiente transactivador está bajo el control de un promotor inducible.
Por tanto, la invención proporciona:
Un método para producir etanol que comprende la fermentación de una planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una celulasa en el que dicha planta es capaz de sobreexpresar dicha celulasa.
Este método puede comprender además una degradación de celulosa potenciada obtenida mediante la combinación de dos o más enzimas de degradación de celulosa diferentes, por ejemplo, enzimas que actúan en diferentes etapas del mecanismo de biodegradación de la celulosa, por ejemplo, en combinación sinérgicamente activa a través de la expresión de dichas enzimas en una única planta o a través de la combinación de dos o más plantas, expresando cada una de ellas una enzima de degradación de celulosa diferente.
La invención puede utilizar:
Una casete de expresión expresable de planta que comprende una región de codificación de una enzima de degradación de celulosa, preferiblemente bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo, un promotor inducible por herida o químicamente; por ejemplo una casete de expresión expresable de plástido que comprende un promotor, por ejemplo un promotor mediado por transactivador regulado por un transactivador nuclear (por ejemplo, el promotor T7 cuando el transactivador es polimerasa de ARN de T7, cuya expresión se encuentra opcionalmente bajo el control de un promotor inducible), y ligado operativamente a una región de codificación de una enzima de degradación de celulosa;
un vector que comprende dicha casete de expresión expresable de planta; y
una planta transformada con dicho vector, o una planta transgénica que comprende en su genoma, por ejemplo, en su genoma de plástido, dicha casete de expresión expresable de planta.
La presente invención también puede utilizar un nuevo sistema de expresión de plástidos, en el que el gen expresado en el plástido está bajo el control de un promotor regulado por transactivador, y el gen del transactivador está en el ADN nuclear, bajo el control de un promotor inducible. Por ejemplo, los vectores de transformación de plástidos normalmente son construidos usando un promotor fago, tal como el promotor fago T7 gen 10, cuya activación transcripcional depende de una polimerasa de ARN tal como la polimerasa de ARN del fago T7. La línea resultante es cruzada con una línea transgénica que contiene una región codificadora nuclear de una polimerasa de ARN de fago complementada con una secuencia dirigida a cloroplastos y unida operativamente a un promotor inducible químicamente tal como el promotor de tabaco PR-1a. La expresión del gen de interés en los cloroplastos de las plantas resultantes de este cruce es activada a continuación mediante una aplicación foliar de un inductor químico. Se demuestra que el nuevo sistema de expresión de plástidos inducible mediado por transactivadores descrito aquí es ajustable con precisión, sin que se detecte ninguna expresión antes de la inducción y con una expresión excepcionalmente elevada y una acumulación de proteínas posterior a la inducción.
Adicionalmente, la invención utiliza:
Una casete vegetal expresable de expresión que comprende un promotor inducible, por ejemplo, un promotor inducible por herida o químicamente, por ejemplo el promotor PR-1a del tabaco, unido operativamente a una secuencia de ADN que codifica un transactivador (preferiblemente un transactivador que no existe de forma natural en las plantas, preferiblemente una polimerasa de ARN o una proteína de unión de ADN, por ejemplo, polimerasa de ARN T7), estando fusionado dicho transactivador con una secuencia directora de plástido, por ejemplo, una secuencia directora de cloroplasto;
un vector que comprende dicha casete vegetal expresable; y
una planta transformada con dicho vector o una planta transgénica cuyo genoma comprende dicha casete vegetal expresable de expresión.
Además, la invención puede utilizar:
Una planta que comprende
una casete de expresión nuclear heterólogo que comprende un promotor inducible, por ejemplo, un promotor inducible mediante herida o químicamente, por ejemplo el promotor PR-1a del tabaco, unido operativamente a una secuencia de ADN que codifica un transactivador (preferiblemente un transactivador que no existe de forma natural en las plantas, preferiblemente una polimerasa de ARN o una proteína de unión de ADN, por ejemplo, polimerasa de ARN T7), estando dicho transactivador opcionalmente fusionado con una secuencia directora de plástido, por ejemplo una secuencia directora de cloroplasto (por ejemplo, una casete vegetal expresable de expresión como se ha descrito anteriormente); y
una casete de expresión de plástido heteróloga que comprende un promotor mediado por transactivador regulado por el transactivador (por ejemplo, el promotor T7 si el transactivador es polimerasa de ARN T7) y unido operativamente a una secuencia de ADN de interés, por ejemplo, que codifique una proteína de interés (por ejemplo, una enzima, una enzima de degradación de carbohidratos, por ejemplo GUS o una enzima de degradación de celulosa) o un ARN funcional de interés (por ejemplo, ARN antisentido);
incluyendo también la semilla de dicha planta, cuya semilla de forma opcional es tratada (por ejemplo es imprimada o recubierta) y/o almacenada, por ejemplo, es colocada en una bolsa o en otro contenedor con instrucciones de uso.
Las plantas para su uso en el método de la presente invención pueden ser producidas mediante:
la polinización de una planta que comprende una casete de expresión de plástido heteróloga que comprende un promotor mediado por transactivador regulado y ligado operativamente a una secuencia de ADN que codifica una proteína de interés;
con polen procedente de una planta que comprende una casete de expresión nuclear heteróloga que comprende un promotor inducible ligado operativamente a una secuencia de ADN que codifica un transactivador capaz de regular dicho promotor mediado por transactivador;
recuperar la semilla de la planta que ha sido polinizada de este modo; y
cultivar una planta como se ha descrito anteriormente a partir de dicha semilla.
Definiciones
Aquí se describen las "enzimas de degradación de celulosa" e incluyen celulasas, celobiohidrolasas, celobiosas y otras enzimas involucradas en la ruptura de la celulosa y de la hemicelulosa para dar sus azúcares básicos tales como la glucosa y la xilosa. Preferiblemente, la enzima de degradación de celulosa usada en la presente invención es de origen no vegetal, por ejemplo, de origen microbiano, preferiblemente de origen bacteriano, por ejemplo de una bacteria del género Thermomonospora, por ejemplo, de T. fusca.
"Casete de expresión" tal como se usa aquí significa una secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de un gen en células vegetales, que comprende un promotor ligado operativamente a una región de codificación de interés que está ligada operativamente a una región de terminación. La región de codificación normalmente codifica una proteína de interés pero también puede codificar un ARN funcional de interés, por ejemplo ARN antisentido o un ARN no traducido que, en la dirección sentido o en la antisentido, inhibe la expresión de un gen concreto, por ejemplo, ARN antisentido. El gen puede ser quimérico, lo que significa que al menos un componente del gen es heterólogo con respecto a al menos otro componente del gen. El gen también puede ser uno que exista de forma natural pero que haya sido obtenido en una forma recombinante útil para la transformación genética de una planta. Sin embargo, normalmente la casete de expresión es heteróloga con respecto al hospedante, es decir, la secuencia de ADN concreta de la casete de expresión no existe de forma natural en la célula hospedante y debe ser introducida en la célula hospedante o en un antecesor de la célula hospedante mediante un evento de transformación. Una "casete de expresión nuclear" es una casete de expresión que está integrada en el ADN nuclear del hospedante. Una "casete de expresión de plástido" es una casete de expresión que está integrada en el ADN de plástido del hospedante. Una casete de expresión de plástido, tal como se describe aquí, puede comprender opcionalmente un operón policistrónico que contiene dos o más secuencias de codificación cistrónicas de interés bajo el control de un único promotor, por ejemplo, un promotor mediado por transactivador, por ejemplo, en el que una de las secuencias de codificación de interés codifica un mARN antisentido que inhibe la expresión de clpP o de otra proteasa de plástido, potenciando con ello la acumulación de proteína expresada por la otra secuencia o secuencias de codificación de interés.
"Heterólogo" tal como se usa aquí significa "de diferente origen natural". Por ejemplo, si una planta es transformada con un gen derivado de otro organismo, en particular de otra especie, dicho gen es heterólogo con respecto a dicha planta y también con respecto a los descendientes de dicha planta que porten dicho gen.
"Homoplastídico" se refiere a una planta, a un tejido de planta o a una célula de planta en la que todos los plástidos son genéticamente idénticos. Este es el estado normal en una planta cuando los plástidos no han sido transformados, mutados, o alterados genéticamente de algún otro modo. En distintos tejidos o etapas de desarrollo, los plástidos pueden adoptar diferentes formas, por ejemplo, cloroplastos, proplástidos, etioplastos, amiloplastos, cromoplastos y otros.
Un "promotor inducible" es un promotor que inicia la transcripción sólo cuando la planta es expuesta a un estímulo externo determinado, y se distingue de los promotores constitutivos o de los promotores específicos de un tejido, órgano o etapa de desarrollo específicos. Para la presente invención son particularmente preferidos los promotores inducibles químicamente y los promotores inducibles por heridas. Los promotores inducibles químicamente incluyen promotores derivados de plantas, tales como los promotores del mecanismo de resistencia adquirida sistémica, por ejemplo los promotores PR, por ejemplo, los promotores PR-1, PR-2, PR-3, PR-4 y PR-5, especialmente el promotor PR-1a del tabaco y el promotor PR-1 de Arabidopsis, que inician la transcripción cuando la planta es expuesta a BTH y a otros agentes químicos relacionados. Véase la solicitud de Patente de EE.UU. 5.614.395, incorporada aquí a modo de referencia, y la Solicitud Provisional de EE.UU. No. 60/027.228, incorporada aquí a modo de referencia. Los promotores inducibles químicamente también incluyen sistemas mediados por receptor, por ejemplo, aquellos derivados de otros organismos, tales como la expresión génica dependiente de esteroides, la expresión génica dependiente de cobre, la expresión génica dependiente de tetraciclina, y particularmente el sistema de expresión que utiliza el receptor USP procedente de Drosophila mediado por la hormona de crecimiento juvenil y sus agonistas, descrito en el documento PCT/EP96/04224, incorporado aquí a modo de referencia, así como los sistemas que utilizan combinaciones de receptores, por ejemplo, como se describe en el documento PCT/EP 96/00686, incorporado aquí a modo de referencia. Los promotores inducibles por herida incluyen los promotores de inhibidores de proteinasa, por ejemplo, el promotor II de inhibidor de proteinasa de la patata, y otros promotores derivados de plantas involucrados en el mecanismo de respuesta a heridas, tales como los promotores de las oxidasas de polifenilo, LAP y TD. Véase de forma general, C. Gatz, "Chemical Control of Gene Expression", Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. (1997) 48: 89-108, cuyos contenidos son incorporados aquí a modo de referencia.
Una "planta" se refiere a cualquier planta o parte de una planta en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones de la invención, las plantas pueden ser dañadas de forma letal para inducir la expresión o pueden ser inducidas a expresar niveles letales de una proteína deseada, y por tanto el término "planta" tal como se usa aquí pretende abarcar específicamente plantas y material vegetal que ha sido seriamente dañado, así como plantas viables, cortes, cultivos de células o tejidos, y semillas.
Un "transactivador" es una proteína que, por sí misma o en combinación con una o más proteínas adicionales, es capaz de causar la transcripción de una región de codificación bajo el control del correspondiente promotor mediado por transactivador. Ejemplos de sistemas de transactivador incluyen el promotor fago T7 gen 10, cuya activación transcripcional depende de una polimerasa de ARN específica tal como la polimerasa de ARN T7. Normalmente, el transactivador es una polimerasa de ARN o una proteína de unión de ADN capaz de interactuar con un promotor concreto para iniciar la transcripción, mediante la activación directa del promotor o mediante la desactivación de un gen represor, por ejemplo, mediante la supresión de la expresión o de la acumulación de una proteína represora. La proteína de unión de ADN puede ser una proteína quimérica que comprende una región de unión (por ejemplo, la región de unión GAL4) unida a un dominio activador transcripcional apropiado. Algunos sistemas transactivadores pueden presentar múltiples transactivadores, por ejemplo promotores que requieren no sólo una polimerasa sino también una subunidad específica (factor sigma) para el reconocimiento del promotor, para la unión de ADN o para la activación transcripcional. Preferiblemente, el transactivador es heterólogo con respecto a la planta.
Descripción de las figuras
La Figura 1 es una descripción esquemática de los constructos de gen quimérico descritos en los Ejemplos para la expresión de celulasa en plantas. Los recuadros abiertos representan la secuencia de la señal del gen E5 y los recuadros cerrados representan la secuencia dirigida vacuolar procedente de un gen de quitinasa de tabaco. T_{n} significa secuencias de terminación nos y Ttml significa secuencias de terminación tml.
La Figura 2 muestra los vectores de transformación plástidos descritos en la Sección C de los Ejemplos.
Descripción detallada de la invención
La presente invención aborda la necesidad de una fuente abundante y económica de enzimas de degradación de la celulosa para industrias tales como la industria de producción de combustible de etanol, la industria de piensos para el ganado y las industrias papelera y textil, reemplazando las celulasas industriales convencionales producidas por hongos con celulasas producidas en plantas. Si se modifican genéticamente las plantas para producir sus propias celulasas, la aplicación externa de celulasas para la degradación de celulosa será innecesaria. Por ejemplo, la biomasa lignocelulósica destina convertirse en etanol podría servir como su propia fuente de celulasa mediante la utilización de la presente invención. De hecho, las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención no tendrían que constituir necesariamente toda la corriente de alimentación de un biorreactor; sino que podrían ser usadas en combinación con alimento celulósico no transformado, ya que las celulasas producidas por las plantas transgénicas degradarían la celulosa de toda la corriente de alimento, incluyendo el alimento no transgénico. Los procesos de degradación de celulosa que usan biomasa transgénica producida de acuerdo con la presente invención pueden ser llevados a cabo de forma más económica, sencilla y medioambientalmente segura que los métodos convencionales.
El alimento podría ser cualquier tipo de material lignocelulósico tal como plantas ricas en biomasa cultivadas específicamente para su uso como fuente de biomasa o partes residuales de plantas cultivadas principalmente para otros propósitos, tales como tallos y hojas de plantas de cultivo. Las plantas transformadas con genes de celulasa pueden ser transformadas con constructos que proporcionan expresión constitutiva de celulasas si las plantas particulares pueden sobrevivir a su propia producción de celulasas. Si un tipo particular de planta experimenta problemas indebidos de toxicidad procedentes de la expresión constitutiva de celulasas, entonces la planta es transformada preferiblemente con constructos que permitan la producción de celulasa sólo cuando se desee. Por ejemplo, con constructos de celulasa inducibles químicamente, uno induce químicamente la expresión de celulasa justo antes de recolectar las plantas de tal modo que justo cuando las plantas están siendo eliminadas por su propia producción de celulasas son recolectadas. A continuación, el tejido vegetal es aplastado, molido, o cortado para liberar las celulasas, y entonces es añadido a un biorreactor en el que la biomasa lignocelulósica sería degradada en azúcares sencillos por la acción de las celulasas expresadas en las plantas transgénicas.
Los genes quiméricos construidos de acuerdo con la presente invención pueden ser transformados en cualquier tejido vegetal adecuado. Usado en combinación con la presente invención, el término "tejido vegetal" incluye, pero no se limita a, plantas completas, células de plantas, órganos de plantas, semillas de plantas, protoplastos, callos, cultivos de células y cualquier grupo de células de planta organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. Las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero no se limitan a, maíz, trigo, cebada, centeno, patata dulce, alubia, guisante, escarola, lechuga, berza, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimiento, apio, zumo de naranja, calabaza, lino, calabacín, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, zarzamora, piña, aguacate, papaya, mango, banana, semilla de soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha, girasol, semilla de colza, trébol, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, arroz, patata, alcachofa, pepino, Arabidopsis, y plantas superiores tales como árboles coníferos y de hoja caduca.
Una vez que un gen deseado ha sido transformado en el interior de una especie vegetal concreta, puede ser propagado en dicha especie o puede ser trasladado a otras variedades de la misma especie, incluyendo de forma particular las variedades comerciales, usando técnicas de sembrado tradicionales. De forma alternativa, la secuencia codificadora de una proteína deseada, por ejemplo, una enzima de degradación de la celulosa, puede ser aislada, modificada genéticamente para alcanzar una expresión óptima y, a continuación, puede ser transformada en la variedad deseada.
Los genes de celulasa preferidos para su transformación en plantas de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el gen E1 de T. fusca (GenBank número de acceso L20094) (Jung y col. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032-3043); el gen E2 de T. fusca (GenBank número de acceso M73321) (Ghangas y col. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 54, 2521-2526; Lao y col. (1991) J. Bacterial. 173, 3397-3407); y el gen E5 de T. fusca (GenBank número de acceso L01577) (Collmer y Wilson (1983) Biotechnology 1, 594-601; Lao y col. (1991) J. Bacterial. 173, 3397-3407). Sin embargo, también otros genes de celulasa pueden ser transformados en plantas de acuerdo con la presente invención, incluyendo todos los genes de celulasa descritos en las siguientes referencias:
Collmer y col. (1983) Bio/Technology 1: 594-601; Ghangas y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 2521-2526; Wilson (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12: 45-63; Jung y col. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59: 3032-3043; Lao y col. (1991) J. Bacteriol. 173: 3397-3407; y Thomas y col., "Initial Approaches to Artificial Cellulase Systems for Conversion of Biomass to Ethanol"; Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates, J. N. Saddler y M. H. Penner, eds., ACS Symposium Series 618: 208-36, 1995, American Chemical Society, Washington, D. C. Estos incluyen, pero no se limitan a, endoglucanasas, exoglucanasas, y \beta-D-glucosidasas derivadas de microorganismos tales como las bacterias y los hongos.
Modificación de Genes Microbianos para Optimizar la Expresión Nuclear en Plantas
Si se desea, los genes de celulasa clonados descritos en esta aplicación pueden ser modificados para expresión en plantas transgénicas hospedantes. Por ejemplo, la expresión transgénica en plantas de genes derivados de fuentes microbianas puede requerir la modificación de dichos genes para alcanzar y optimizar su expresión en plantas. En particular, los ORFs bacterianos que codifican enzimas separadas pero que están codificados por el mismo tránscrito en el microbio nativo son expresados mejor en plantas sobre tránscritos separados. Para lograr esto, cada ORF microbiano es aislado de forma individual y es clonado dentro de una casete que proporciona una secuencia promotora vegetal en el extremo 5' del ORF y un terminador transcripcional vegetal en el extremo 3' del ORF. La secuencia de ORF aislada incluye preferiblemente el codón ATG de iniciación y el codón de finalización STOP, pero puede incluir secuencia adicional más allá del codón de iniciación ATG y del codón STOP. Además, el ORF puede estar truncado, pero manteniendo aún la actividad requerida; para ORFs particularmente largos, las versiones truncadas que mantienen la actividad pueden ser preferibles para la expresión en organismos transgénicos. Por "promotor vegetal" y "terminador transcripcional vegetal" se pretende decir promotores y terminadores transcripcionales que operan dentro de células vegetales. Esto incluye promotores y terminadores transcripcionales que pueden derivar de fuentes no vegetales tales como los virus (un ejemplo es el Virus Mosaico de la Coliflor).
En algunos casos, no será precisa la modificación de las secuencias codificadoras ORF y de la secuencia adyacente, en cuyo caso es suficiente con aislar un fragmento que contenga el ORF de interés y con insertarlo por debajo de un promotor vegetal. Preferiblemente, sin embargo, ya que debería quedar poca secuencia microbiana adyacente unida por encima del ATG y por debajo del codón STOP. En la práctica, dicha construcción puede depender de la disponibilidad de las posiciones de restricción.
En otros casos, la expresión de genes derivados de fuentes microbianas puede proporcionar problemas en la expresión. Estos problemas han sido bien caracterizados en la técnica y son particularmente comunes con genes derivados de determinadas fuentes tales como los Bacillus. La modificación de dichos genes puede ser realizada usando técnicas bien conocidas hoy día en la técnica. Los siguientes problemas son típicos entre los que pueden encontrarse:
1. Utilización del Codón
La utilización del codón preferida en plantas difiere de la utilización del codón preferida en determinados microorganismos. La comparación de la utilización de codones dentro de un ORF microbiano clonado para su utilización en genes vegetales (y en genes concretos de la planta objetivo) permitirá una identificación de los codones dentro del ORF que preferiblemente debería ser cambiada. Normalmente, la evolución de las plantas se ha dirigido hacia una fuerte preferencia por los nucleótidos C y G en la tercera posición de bases en las monocotiledóneas, mientras que las dicotiledóneas usan a menudo los nucleótidos A ó T en dicha posición. Modificando un gen para incorporar la utilización de codón preferida para una especie transgénica objetivo concreta, se solucionarán muchos de los problemas descritos a continuación para el contenido GC/AT y de división ilegítima.
2. Contenido GC/AT
Los genes vegetales presentan normalmente un contenido de GC superior al 35%. Las secuencias de ORF que son ricas en los nucleótidos A y T pueden ocasionar diversos problemas en las plantas. En primer lugar, se cree que las estructuras de ATTTA provocan la desestabilización de los mensajes y se encuentran en el extremo 3' de muchos mARNs de vida corta. En segundo lugar, se cree que la existencia de señales de poliadenilación tales como AATAAA en posiciones inapropiadas dentro del mensaje causa un truncado prematuro de la transcripción. Además, las monocotiledóneas pueden reconocer secuencias ricas en AT como posiciones de división (ver más adelante).
3. Secuencias Adyacentes a la Metionina de Iniciación
Las plantas difieren de los microorganismos en que sus mensajes no poseen una posición de unión de ribosomas definida. Más bien, se cree que los ribosomas se unen al extremo 5' del mensaje y buscan el primer ATG disponible en el que comience la traducción. Sin embargo, se cree que existe una preferencia por determinados nucleótidos adyacentes al ATG y que la expresión de genes microbianos puede potenciarse mediante la inclusión de un iniciador de la traducción eucarionte de consenso en el ATG. Clontech (catálogo 1993/1994, página 210) ha propuesto la secuencia GTCGACCATGGTC como iniciador de la traducción de consenso para la expresión del gen de E. coli uidA en plantas. Aún más, Joshi (NAR 15: 6643-6653 (1987)) ha comparado muchas secuencias de plantas adyacentes al ATG y propone el TAAACAATGGCT como consenso. En situaciones en las que se encuentran dificultades para la expresión de ORFs microbianos en plantas, la inclusión de uno de estas secuencias en el ATG de iniciación puede mejorar la traducción. En dichos casos los últimos tres nucleótidos del consenso pueden no ser apropiados para la inclusión en la secuencia modificada debido a su modificación en el segundo residuo AA. Las secuencias adyacentes a la metionina de iniciación preferidas pueden diferir entre diferentes especies de plantas. Un estudio con 14 genes de maíz localizados en la base de datos GenBank proporcionó los siguientes resultados:
Posición Antes del ATG de Iniciación en 14 Genes de Maíz
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1
C 3 8 4 6 2 5 6 0 10 7
T 3 0 3 4 3 2 1 1 1 0
A 2 3 1 4 3 2 3 7 2 3
G 6 3 6 0 6 5 4 6 1 5
Este análisis puede ser realizado para la especie de planta deseada en la que se van a incorporar los genes de celulasa, y la secuencia adyacente al ATG puede ser modificada para incorporar los nucleótidos preferidos.
4. Eliminación de Posición de División Ilegítimas
Los genes clonados a partir de fuentes no vegetales y que no han sido optimizados para la expresión en plantas también pueden contener estructuras que pueden ser reconocidas en plantas como posiciones de división 5' ó 3', y ser rotas, generando con ello mensajes truncados o borrados. Estas posiciones pueden ser eliminadas usando las técnicas descritas en la solicitud 07/961.944, incorporada aquí a modo de referencia.
Las técnicas para la modificación de secuencias de codificación y de secuencias adyacentes son bien conocidas en la técnica. En los casos en los que la expresión inicial de un ORF microbiano es baja y es juzgado apropiado para realizar alteraciones en la secuencia tal como ha descrito anteriormente, la construcción de genes sintéticos puede ser llevada a cabo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Éstos son descritos, por ejemplo, en las descripciones de las patentes publicadas EP 0 385 962 (de Monsanto), EP 0 359 472 (de Lubrizol) y WO 93/07278 (de Ciba-Geigy). En la mayoría de los casos es preferible evaluar la expresión de construcciones de genes usando protocolos de ensayo transitorios (que son bien conocidos en la técnica) antes de ser transferidos a plantas transgénicas.
Una importante ventaja de la transformación de plástidos es que los plástidos generalmente son capaces de expresar genes bacterianos sin ninguna modificación sustancial. No se requiere la adaptación de codón, etc., tal como se ha descrito anteriormente, y los plástidos son capaces de expresar múltiples marcos abiertos de lectura bajo el control de un único promotor.
Construcción de Vectores de Transformación Vegetales
Existen numerosos vectores de transformación disponibles para la transformación de plantas, y los genes de esta invención pueden ser usados en combinación con cualquiera de estos vectores. La selección del vector para su uso dependerá de la técnica de transformación preferida y de las especies objetivo para la transformación. Para determinadas especies objetivo, pueden preferirse diferentes marcadores de selección antibióticos o herbicidas. Los marcadores de selección usados rutinariamente en la transformación incluyen el gen nptII que confiere resistencia a la canamicina y a antibióticos relacionados (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan y col., Nature 304: 184-187 (1983)), el gen bar que confiere resistencia al herbicida foSphInotricina (White y col., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990), Spencer y col. Theor Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)), el gen hpt que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), y el gen dhfr, que confiere resistencia al metatrexato (Bourouis y col., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)).
1. Construcción de Vectores Adecuados para la Transformación de Agrobacterium
Para la transformación usando Agrobacterium tumefaciens existen muchos vectores disponibles. Normalmente, estos portan al menos una secuencia de borde T-ADN e incluyen vectores tales como el pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)) y el pXYZ. A continuación se describe la construcción de dos vectores típicos.
Construcción de pCIB200 y de pCIB2001: Los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001 se usan para la construcción de vectores recombinantes para su uso con Agrobacterium y fueron construidos de la siguiente manera. Se creó el pTJS75kan mediante digestión con NarI del pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacterial. 164: 446-455 (1985)) permitiendo la escisión del gen de resistencia a la tetraciclina, seguido de la inserción de un fragmento AccI procedente de pUC4K que lleva un NPTII (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan y col., Nature 304: 184-187 (1983); McBride y col., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Se unieron los ligandos XhoI con el fragmento EcoRV de pCIB7 que contiene las fronteras de T-ADN izquierda y derecha, un gen quimérico vegetal seleccionable nos/nptII y el poliligando pUC (Rothstein y col., Gene 53: 153-161 (1987)), y el fragmento digerido con XhoI fue clonado en pTJS75kan digerido con SalI para crear pCIB200 (véase también el documento EP 0 332 104, ejemplo 19). El pCIB200 contiene las siguientes posiciones de restricción de poliligando únicas: EcoRI, Sstl, Kpnl, BglII, Xbal y SalI. El pCIB2001 es un derivado del pCIB200 que fue creado mediante la inserción en el poliligando de posiciones de restricción adicionales. Las posiciones de restricción únicas en el poliligando de pCIB2001 son EcoRI, SstI, CPU, BglII, XbaI, SalI, MluI, ACLI, AvrII, ApaI, HpaI y StuI. El pCIB2001, además de contener estas posiciones de restricción únicas también presenta selección de canamicina vegetal y bacteriana, fronteras de T-ADN izquierda y derecha para la transformación mediada por Agrobacterium, la función trfA derivada de RK2 para la movilización entre E. coli y otros hospedantes, y las funciones OriT y OriV también de RK2. El poliligando pCIB2001 es adecuado para la clonación de casetes de expresión vegetales que contienen sus propias señales regula-
doras.
Construcción de pCIB10 y de sus Derivados de Selección de Higromicina: El vector binario pCIB10 contiene un gen que codifica la resistencia a la canamicina para la selección en plantas, las secuencias de frontera de T-ADN izquierda y derecha e incorpora las secuencias procedentes del plásmido pRK252 de amplio intervalo de hospedantes, lo que le permite replicarse en E. coli y en Agrobacterium. Su construcción es descrita por Rothstein y col. (Gene 53: 153-161 (1987)). Se han construido varios derivados de pCIB10 que incorporan el gen para la higromicina B fosfotransferasa descrito por Gritz y col. (Gene 25: 179-188 (1983)). Estos derivados permiten la selección de células de plantas transgénicas sobre higromicina sola (pCIB743), o sobre higromicina y canamicina (pCIB715, pCIB717).
2. Construcción de Vectores Adecuados para la Transformación sin Agrobacterium
La transformación sin el uso de Agrobacterium tumefaciens evita el requerimiento de secuencias de T-ADN en el vector de transformación elegido y, por consiguiente, se pueden utilizar vectores que carecen de estas secuencias además de los vectores tales como los descritos anteriormente que contienen secuencias de T-ADN. Las técnicas de transformación que no se basan en Agrobacterium incluyen la transformación vía bombardeo de partículas, recaptación de protoplastos (por ejemplo, PEG y electroporación) y microinyección. La elección del vector depende ampliamente de la selección preferida para la especie que está siendo transformada. A continuación se describe la construcción de algunos vectores típicos.
Construcción de pCIB3064: el pCIB3064 es un vector derivado de pUC adecuado para técnicas de transferencia directa de genes en combinación con la selección mediante el basta herbicida (o fosfinotricina). El plásmido pCIB246 comprende el promotor CaMV 35S en fusión operacional con el gen GUS de E. coli y el terminador transcripcional CaMV 35S y está descrito en la solicitud PCT publicada WO 93/07278. El promotor 35S de este vector contiene dos secuencias ATG 5' de la posición de inicio. Estas posiciones fueron mutadas usando técnicas PCR estándar de tal modo que se eliminaran los ATGs y se generaran las posiciones de restricción Sspl y Pvull. Las nuevas posiciones de restricción estaban a 96 y 37 pb de la única posición SalI y a 101 y 42 pb de distancia de la posición de inicio real. El derivado resultante de pCIB246 fue denominado pCIB3025. El gen GUS fue escindido a continuación del pCIB3025 mediante digestión con SalI y SacI, el extremo fue redondeado y religado para generar el plásmido pCIB3060. El plásmido pJIT82 fue obtenido del Centro John Innes, Norwich, y el fragmento SmaI de 400 pb que contiene el gen bar de Streptomyces viridochromogenes fue escindido e insertado en la posición HPaI de pCIB3064 (Thompson y col., EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Este pCIB3064 generado que comprende el gen bar bajo el control del promotor CaMV 35S y el terminador para la selección del herbicida, un gen para la resistencia a la ampicilina (para la selección en E. coli) y un poliligando con las posiciones únicas SphI, PstI, HindIII y BamHI. Este vector es adecuado para la clonación de casetes de expresión vegetales que contienen sus propias señales reguladoras.
Construcción de pSOG19 y pSOG35: el pSOG35 es un vector de transformación que utiliza la reductasa de dihidrofolato de gen de E. coli (DHFR) como marcador seleccionable que confiere resistencia al metotrexato. El PCR fue usado para amplificar el promotor 35S (\sim 800 pb), el intrón 6 del gen Adh1 del maíz (\sim 550 pb) y 18 pb de la secuencia directora no traducida GUS procedente de pSOG10. Un fragmento de 250 pb que codifica el gen tipo II de reductasa de dihidrofolato de E. coli también fue amplificada mediante PCR y estos dos fragmentos de PCR fueron ensamblados con un fragmento SacI-PstI de pBI221 (Clontech) que comprendía la cadena principal del vector pUC19 y el terminador de sintasa de nopalina. La unión de estos fragmentos generó pSOG19 que contiene el promotor 35S en fusión con la secuencia del intrón 6, el director GUS, el gen DHFR y el terminador de sintasa de nopalina. La sustitución del director GUS en pSOG19 con la secuencia líder procedente del Virus del Moteado Clorótico de Maíz (MCMV, del inglés "Maize Chlorotic Mottle Virus") generó el vector pSOG35. El pSOG19 y el pSOG35 portan el gen pUC para la resistencia a la ampicilina y presentan posiciones HindIII, SphI, PstI y EcoRI disponibles para la clonación de secuencias externas.
Requerimientos para la Construcción de Casetes de Expresión Vegetales
Las secuencias de genes destinadas a la expresión en plantas transgénicas son ensambladas en primer lugar en casetes de expresión detrás de un promotor adecuado y por encima de una terminador de la transcripción adecuado. A continuación, estas casetes de expresión pueden ser transferidas fácilmente a los vectores de transformación descritos anteriormente.
1. Selección del Promotor
La selección del promotor usado en las casetes de expresión determinará el modelo de expresión espacial y temporal del transgen en la planta transgénica. Los promotores seleccionados expresarán transgenes en tipos de células específicos (tales como las células epidermales de hojas, las células de meosfilo, las células de córtex de raíz) o en tejidos u órganos específicos (raíces, hojas o flores, por ejemplo) y esta selección reflejará la posición deseada para la biosíntesis de la celulasa. De forma alternativa, el promotor seleccionado puede dirigir la expresión del gen controlada por un promotor inducido por luz o por otro promotor regulado temporalmente. Una alternativa adicional (y preferida) es que el promotor seleccionado sea inducible mediante un estímulo externo, por ejemplo, la aplicación de un inductor químico específico o de una herida. Esto proporcionaría la posibilidad de inducir la transcripción de celulasa sólo cuando se desee.
2. Terminadores transcripcionales
Existe una variedad de terminadores transcripcionales para el uso en casetes de expresión. Estos son responsables de la terminación de la transcripción más allá del transgen y de su correcta poliadenilación. Los terminadores transcripcionales apropiados y aquellos conocidos por funcionar en plantas y que incluyen al terminador CaMV 35S, el terminador tml, el terminador de nopalina sintasa, el terminador rbcS E9 de guisante. Estos pueden ser usados tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas.
3. Secuencias para la Potenciación o para la Regulación de la Expresión
Se ha descubierto que numerosas secuencias potencian la expresión génica del interior de la unidad transcripcional y dichas secuencias pueden ser usadas junto con los genes de esta invención para aumentar su expresión en plantas transgénicas.
Se ha demostrado que varias secuencias de intrones potencian la expresión, particularmente en células monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha descubierto que los intrones del gen de maíz Adhl potencian significativamente la expresión del gen natural bajo su promotor relacionado cuando son introducidos en células de maíz. Se descubrió que el Intrón I es particularmente eficaz y que potenció la expresión en los constructos de fusión con el gen de acetiltransferasa de cloramfenicol (Callis y col., Genes Develep 1: 1183-1200 (1987)). En el mismo sistema experimental, el intrón del gen de maíz bronze1 presentó un efecto similar sobre el potenciamiento de la expresión. Las secuencias de intrones han sido incorporadas de forma rutinaria en los vectores de transformación vegetales, típicamente dentro del director no traducido.
También se conoce un número de secuencias directoras no traducidas derivadas de virus para potenciar la expresión, siendo éstas particularmente eficaces en células dicotiledóneas. Específicamente, se ha demostrado que las secuencias directoras procedentes del Virus de Mosaico del Tabaco (TMV, del inglés "Tobacco Mosaic Virus", la "secuencia \Omega"), el Virus de Moteado Clorótico del Maíz (MCMV, del inglés "Maize Chlorotic Mottle Virus"), y el Virus de Mosaico de la Alfalfa (AMV, del inglés "Alfalfa Mosaic Virus") son eficaces en la potenciación de la expresión (por ejemplo, Gallie y col. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski y col. Plant Molec. Biol. 15; 65-79 (1990)).
4. Direccionamiento del Producto de Gen dentro de la Célula
Se conocen varios mecanismos para dirigir los productos de gen en plantas y las secuencias que controlan el funcionamiento de estos mecanismos han sido caracterizadas con cierto detalle. Por ejemplo, el direccionamiento de productos de gen hacia los cloroplastos está controlado por una secuencia de señal descubierta en el extremo aminoterminal de diversas proteínas y cuya ruptura se produce durante la importación de cloroplastos dando lugar a la proteína madura (por ejemplo, Comai y col., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Estas secuencias de señal pueden ser fusionadas a productos de gen heterólogos para llevar a cabo la importación de productos heterólogos hacia el interior de los cloroplastos (van den Broeck y col. Nature 313: 358-363 (1985)). El ADN que codifica las secuencias de señal apropiadas puede ser aislado a partir del extremo 5' de los cADNs que codifican la proteína RUBISCO, la proteína CAB, la enzima sintasa EPSP, la proteína GS2 y muchas otras proteínas que son conocidas por encontrarse en los cloroplastos.
Otros productos de gen están localizados en otros orgánulos tales como las mitocondrias y los peroxisomas (por ejemplo, Unger y col., Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)). Los cADNs que codifican estos productos también pueden ser manipulados para llevar a cabo el direccionamiento de productos de gen heterólogos hacia estos orgánulos. Ejemplos de dichas secuencias son las ATPasas codificadas en el núcleo y las isoformas de amino transferasa específicas de aspartato para mitocondrias. El direccionamiento de cuerpos proteínicos celulares ha sido descrito por Rogers y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 6512-6516 (1985)).
Además, se han caracterizado secuencias que provocan el direccionamiento de productos de gen hacia otros compartimentos celulares. Las secuencias aminoterminales son responsables del direccionamiento hacia el ER, el apoplasto, y la secreción extracelular procedente de células de aleurona (Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). Adicionalmente, las secuencias aminoterminales en combinación con las secuencias carboxiterminales son las responsables del direccionamiento vacuolar de los productos génicos (Shinsi y col., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)).
Mediante la fusión de las secuencias apropiadas descritas anteriormente dirigidas hacia las secuencias de transgen de interés, es posible dirigir el producto transgénico hacia cualquier orgánulo o compartimiento celular. Para el direccionamiento de cloroplastos, por ejemplo, la secuencia de señal del cloroplasto procedente del gen RUBISCO, el gen CAB, el gen sintasa EPSP, o el gen GS2, es fusionada en estructura con el ATG aminoterminal del transgen. La secuencia de señal seleccionada debería incluir la posición de rotura conocida y la fusión construida debería tener en cuenta cualesquier aminoácidos después de la posición de rotura que sean requeridos para la rotura. En determinados casos este requerimiento puede completarse mediante la adición de un pequeño número de aminoácidos entre la posición de rotura y el ATG del transgen o, de forma alternativa, mediante la sustitución de algunos aminoácidos dentro de la secuencia del transgen. Las fusiones construidas para la importación de cloroplastos pueden ser evaluadas en eficacia de recaptación de cloroplastos mediante la traducción in vitro de construcciones transcritas in vitro seguido de la recaptación de cloroplastos in vitro usando las técnicas descritas por (Bartlett y col., en: Edelmann y col. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, páginas 1081-1091 (1982): Wasmann y col. Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Estas técnicas de construcción son bien conocidas en la técnica y son igualmente aplicables a mitocondrias y peroxisomas. La elección del direccionamiento que puede ser requerido para los genes de celulasa dependerá de la localización en la célula del precursor requerido como punto de partida para un mecanismo dado. Normalmente, éster será citosílico o cloroplástico, aunque en algunos casos puede ser mitocondrial o peroxisomal.
Los mecanismos descritos anteriormente para el direccionamiento celular pueden ser utilizados no sólo en combinación con sus promotores derivados, sino también en combinación con promotores heterólogos de tal modo que se alcance un objetivo celular específico con la regulación transcripcional de un promotor que presenta un modelo de expresión diferente al del promotor del cual deriva la señal de direccionamiento.
Ejemplos de Construcción de Casetes de Expresión
La presente invención abarca la expresión de genes de celulasa bajo la regulación de cualquier promotor que sea expresable en vegetales, independientemente del origen del promotor.
Además, la invención abarca el uso de cualquier promotor expresable en plantas en combinación con cualesquiera secuencias adicionales requeridas o seleccionadas para la expresión del gen de celulasa. Dichas secuencias incluyen, pero no están restringidas a, terminadores transcripcionales, secuencias extrañas para potenciar la expresión (tal como los intrones [por ejemplo, Adh intrón 1], secuencias víricas [por ejemplo, TMV-\Omega]), y secuencias destinadas al direccionamiento del producto génico hacia orgánulos específicos y hacia compartimientos celulares.
1. Expresión Constitutiva: el Promotor CaMV 35S
La construcción del plásmido pCGN1761 es descrita en la solicitud de patente publicada EP 0 392 225 (ejemplo 23). El pCGN1761 contiene promotor 35S "doble" y el terminador transcripcional tml con una única posición EcoRI entre el promotor y el terminador y presenta una cadena principal de tipo pUC. Se construyó un derivado de pCGN1761 que presenta un poliligando modificado que incluye posiciones NotI y XhoI además de la existente posición EcoRI. Este derivado fue denominado pCGN1761ENX. El pCGN1761ENX es útil para la clonación de secuencias de cADN o de secuencias génicas (incluyendo las secuencias ORF microbianas) dentro de su poliligando con el propósito de su expresión bajo el control del promotor 35S en plantas transgénicas. La casete de terminador tml-secuencia de gen de promotor 35S de dicha construcción puede ser escindida mediante posiciones HindlII, SphI, SalI y XbaI 5' respecto del promotor y posiciones XbaI, BamHI y BglI 3' respecto del terminador para transferir los vectores de transformación como los descritos anteriormente. Además, el fragmento de promotor 35S doble puede ser eliminado mediante escisión 5' con HindIII, SphI, SalI, XbaI o Pstl, y mediante escisión 3' con cualquiera de las posiciones de restricción del poliligando (EcoRI, NotI o XhoI) para la sustitución con otro promotor.
2. Modificación de pCGN1761ENX mediante Optimización de la Posición de Inicio Translacional
Para cualquiera de las construcciones descritas en esta sección, se pueden realizar modificaciones alrededor de las posiciones de clonación mediante la introducción de secuencias que pueden potenciar la traducción. Esto es particularmente útil cuando se quiere introducir genes derivados de microorganismos en casetes de expresión vegetal ya que estos genes pueden no contener secuencias adyacentes a su metionina de inicio que puede ser adecuada para iniciar la traducción en plantas. En los casos en los que los genes derivados de microorganismos van a ser clonados en casetes de expresión vegetal en su ATG, puede ser útil modificar la posición de su inserción para optimizar su expresión. La modificación de pCGN1761ENX es descrita a modo de ejemplo para incorporar una de las varias secuencias optimizadas para la expresión en plantas (por ejemplo, Joshi, ver anteriormente).
El pCGN1761ENX es sometido a rotura con SphI, es tratado con polimerasa de ADN T4 y es religado, destruyendo de este modo la posición SphI localizada en 5' con respecto al promotor 35S doble. Esto genera el vector pCGN1761ENX/Sph-. El pCGN1761ENX/Sph- es sometido a rotura con EcoRI, y es ligado a un adaptador molecular madurado de la secuencia 5'-AATTCTAAAGCATGCCGATCGG-3'/5'-AATTCCGATCGGCATGCTTTA-3'. Esto genera el vector pCGNSENX que incorpora la secuencia de iniciación translacional vegetal cuasi-optimizada TAAA-C adyacente al ATG que es en sí mismo parte de una posición SphI que es adecuada para clonar genes heterólogos en su metionina de inicio. Por debajo de la posición SphI, se retienen las posiciones EcoRI, NotI y XhoI.
Se construye un vector alternativo que utiliza una posición NcoI en el ATG de inicio. Este vector, designado pCGN1761NENX es construido mediante la inserción de un adaptador molecular madurado de la secuencia 5'-AATTCTAAACCATGGCGATCGG-3'/5'-AATTCCGATCGCCATGGTTTA-3' en la posición EcoRI del pCGN1761
ENX. De este modo, el vector incluye la secuencia cuasi-optimizada TAAACC adyacente al ATG de inicio que está dentro de la posición NcoI. Por debajo de las posiciones EcoRI, NotI y XhoI. Sin embargo, antes de esta manipulación, las dos posiciones NcoI del vector pCGN1761ENX (en las posiciones superiores de la unidad del promotor 35S 5') son destruidas usando técnicas similares a las descritas anteriormente para el SphI o, de forma alternativa, usando PCR "dentro-fuera" (Innes y col. PCR Protocols: A guide to methods and applications. Academic Press, Nueva Cork (1990). Esta manipulación puede ser llevada a cabo en busca de cualquier efecto negativo sobre la expresión mediante la inserción de cualquier cADN de planta, o de cualquier secuencia de gen informador, en la posición de clonación seguida de un análisis rutinario de expresión en plantas.
3. Expresión bajo un Promotor Regulable Químicamente
Esta sección describe la sustitución del promotor 35S doble en el pCGN1761ENX por cualquier promotor elegido; a modo de ejemplo, el promotor regulable químicamente PR-1a es descrito en la patente de EE.UU. 5.614.395, que es incorporada aquí al completo a modo de referencia, y el promotor PR-1 de Arabidopsis regulable químicamente es descrito en la Solicitud Provisional de EE.UU. Nº 60/027.228, incorporada aquí a modo de referencia. Preferiblemente el promotor elegido es escindido de su fuente mediante enzimas de restricción, pero de forma alternativa puede ser amplificado mediante PCR usando prímeros que porten las posiciones de restricción terminales apropiadas. Cuando se emprenda la amplificación mediante PCR, el promotor debe volver a ser secuenciado en el vector objetivo. El promotor PR-1a de tabaco regulable químicamente es separado del plásmido pCIB1004 (véase EP 0 332 104, ejemplo 21, para la construcción) y es transferido al plásmido pCGN1761ENX. El pCIB1004 es sometido a rotura con NcoI y el saliente 3' resultante del fragmento linealizado es redondeado mediante tratamiento con polimerasa de ADN T4. A continuación el fragmento es sometido a rotura con HindlII y el promotor PR-1a resultante que contiene el fragmento es purificado con gel y es clonado en el pCGN1761ENX al que se le ha eliminado el promotor 35S doble. Esto se realiza mediante rotura con XhoI y redondeo con polimerasa T4, seguido de rotura con HindlII y aislamiento del fragmento que contiene el terminador de vector de mayor tamaño, en el que es clonado el fragmento de promotor pCIB1004. Esto genera un derivado de pCGN1761ENX con el promotor PR-1a y el terminador tml y un poliligando interviniente con posiciones únicas EcoRI y NotI. Los genes de celulasa seleccionados pueden ser insertados en este vector, y los productos de fusión (es decir, promotor-gen-terminador) pueden ser transferidos posteriormente a cualquier vector de transformación seleccionado, incluyendo los descritos en esta solicitud.
Se pueden emplear diversos reguladores químicos para inducir la expresión de la secuencia codificadora de celulasa en las plantas transformadas de acuerdo con la presente invención. En el contexto de la descripción inmediata, "reguladores químicos" incluyen productos químicos que son conocidos por ser inductores del promotor PR-1a en plantas, o por ser derivados suyos. Un grupo preferido de reguladores para los genes de celulasa inducibles químicamente de esta invención está basado en la estructura de benzo-1,2,3-tiadiazol (BTH) e incluye, aunque no se limita a, los siguientes tipos de compuestos: ácido benzo-1,2,3-tiadiazolcarboxílico, ácido benzo-1,2,3-tiadiazoltiocarboxílico, cianobenzo-1,2,3-tiadiazol, hidracida de ácido benzo-1,2,3-tiadiazol carboxílico, ácido benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carboxílico, amida de ácido benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carboxílico, hidracida de ácido benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carboxílico, benzo-1,2,3-tiadiazolcarboxilato de alquilo en el que el grupo alquilo contiene de uno a seis átomos de carbono, benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carboxilato de metilo, benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carboxilato de n-propilo, benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carboxilato de bencilo, sec-butilhidracida de ácido benzo-1,2,3-tiadiazol-7-carboxílico, y derivados apropiados. Otros inductores químicos pueden incluir, por ejemplo, ácido benzoico, ácido salicílico (SA), ácido poliacrílico y sus derivados sustituidos; los sustituyentes adecuados incluyen restos alquilo inferiores, restos alcoxi inferiores, restos alquiltio inferiores y halógenos. Otro grupo más de reguladores para las secuencias de ADN inducibles químicamente de esta invención se basa en la estructura de ácido carboxílico de la piridina, tal como la estructura de ácido isonicotínico y preferiblemente como la estructura del ácido haloisonicotínico. Se prefieren los ácidos dicloroisonicotínicos y sus derivados, por ejemplo los ésteres de alquilos inferiores. Los reguladores adecuados de este tipo de compuestos son, por ejemplo, el ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA), y sus ésteres de alquilos inferiores, especialmente el metil éster.
4. Expresión Constitutiva: el Promotor de Actina
Se conocen varias formas de actina expresables en la mayoría de los tipos de células y, por consiguiente, el promotor de actina es una buena elección como promotor constitutivo. En particular, el promotor procedente del gen ActI del arroz ha sido clonado y caracterizado (McElroy y col., Plant Cell 2: 163-171 (1990)). Se descubrió que un fragmento del promotor de 1,3 kb contiene todos los elementos reguladores requeridos para la expresión en los protoplastos del arroz. Además, se han construido numerosos vectores de expresión basados en el promotor ActI específicamente para su uso en monocotiledóneas (McElroy y col., Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)). Estos incorporan el intrón 1 de ActI, la secuencia de flanqueo AdhI 5' y el intrón 1 de AdhI (procedente del gen de deshidrogenada de alcohol) y la secuencia procedente del promotor 35S de CaMV. Los vectores que mostraron la mayor expresión fueron las fusiones de 35S y del intrón de ActI o de la secuencia de flanqueo ActI 5' y del intrón ActI. La optimización de las secuencias alrededor del ATG iniciador (del gen informador GUS) también potenció la expresión. Las casetes de expresión del promotor descritas por McElroy y col. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) pueden ser modificadas fácilmente para la expresión de genes de celulasa y son particularmente adecuadas para el uso en hospedantes monocotiledóneos. Por ejemplo, el promotor que contiene fragmentos puede ser eliminado de las construcciones de McElroy y puede ser usado para sustituir al promotor 35S doble en el pCGN1761ENX, que a continuación queda disponible para la inserción de secuencias de gen específicas. Los genes de fusión construidos de esta forma pueden ser transferidos a continuación a vectores de transformación apropiados. En un informe separado también se ha descubierto que el promotor ActI del arroz con su primer intrón dirige una expresión elevada en cultivos de células de cebada (Chibbar y col. Plant Cell Rep. 12: 506-509 (1993)).
5. Expresión Constitutiva: el Promotor de Ubiquitina
La ubiquitina es otro producto génico conocido por acumularse en muchos tipos de células y cuyo promotor ha sido clonado a partir de varias especies para su uso en plantas transgénicas (por ejemplo, el girasol - Bidet y col., Plant Science 79: 87-94 (1991), el maíz - Christensen y col., Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)). El promotor de ubiquitina del maíz ha sido desarrollado en sistemas monocotiledóneos transgénicos y su secuencia y vectores construidos para transformación monocotiledónea están descritos en la publicación de patente EP 0 342 926 (a nombre de Lubrizol). Además, Taylor y col. (Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)) describen un vector (pAHC25) que comprende el promotor de ubiquitina de maíz y el primer intrón y su elevada actividad en suspensiones celulares de numerosas monocotiledóneas cuando es introducido vía bombardeo de microproyectiles. El promotor de ubiquitina es adecuado para la expresión de genes de celulasa en plantas transgénicas, especialmente en monocotiledóneas. Los vectores adecuados son los derivados del pAHC25 o de cualquiera de los vectores de transformación descritos en esta solicitud, modificados mediante la introducción del promotor de ubiquitina apropiado y/o de las secuencias de intrón adecuadas.
6. Expresión Específica de Raíz
Otro modelo de expresión para las celulasas de la presente invención es la expresión de raíz. Un promotor de raíz adecuado es el descrito por de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991)) y también el descrito en la solicitud de patente publicada EP 0 452 269 (a nombre de Ciba-Geigy). Este promotor es transferido a un vector adecuado tal como el pCGN1761ENX para la inserción de un gen de celulasa y la posterior transferencia de la casete promotor-gen-terminador completa a un vector de transformación de interés.
7. Promotores Inducibles mediante Heridas
Los promotores inducibles mediante heridas también pueden ser adecuados para la expresión de genes de celulasa. Muchos de dichos promotores han sido descritos (por ejemplo, Xu y col. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann y col. Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22; 783-792 (1993), Firek y col. Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), Warner y col., Plant J. 3: 191-201 (1993)) y todos son adecuados para su uso en la presente invención. Logemann y col. Describen las secuencias 5' superiores del gen wunI de la patata dicotiledónea. Xu y col. Muestran que un promotor inducible mediante herida procedente de la patata dicotiledónea (pin2) es activo en el arroz monocotiledóneo. Además, Rohrmeier & Lehle describen la clonación del cADN de WipI de maíz que es inducido mediante herida y que puede ser usado para aislar el promotor relacionado usando técnicas estándar. De forma similar, Firek y col. y Warner y col. han descrito un gen inducido mediante herida procedente del Asparagus officinalis, que es expresado en una herida local y en posiciones de invasión de patógenos. Usando técnicas de clonación bien conocidas en la técnica, estos promotores pueden ser transferidos a vectores adecuados, fusionados a los genes de celulasa de esta invención, y usados para expresar dichos genes en las posiciones de herida de la planta.
8. Expresión Preferida en Médula
La solicitud de patente WO 93/07278 (a nombre de Ciba-Geigy) describe el aislamiento del gen trpA del maíz que es expresado preferentemente en células de médula. Se presentan la secuencia de genes y el promotor hasta una extensión de -1726 a partir del inicio de la transcripción. Usando técnicas de biología molecular estándares, se puede transferir este promotor, o partes de él, a un vector tal como el pCGN1761 en el que puede reemplazar al promotor 35S y puede ser usado para conducir la expresión de un gen extraño de un modo más adecuado para la médula. De hecho, se pueden transferir fragmentos que contienen el promotor más adecuado para la médula, o partes suyas, a cualquier vector, y ser modificados para su utilización en plantas transgénicas.
9. Expresión Específica de Hoja
Hudspeth & Grula (Plant Molec. Biol. 12: 579-589 (1989) han descrito un gen de maíz que codifica carboxilasa de fosfoenol (PEPC, del inglés "phosphoenol carboxylase"). Usando técnicas estándares de biología molecular se puede usar el promotor correspondiente a este gen para conducir la expresión de cualquier gen de un modo específico de hoja en plantas transgénicas.
10. Expresión con Direccionamiento a Cloroplastos
Chen & Jagendorf (J. Biol. Chem. 268: 2363-2367 (1993) han descrito la utilización con éxito de un péptido tránsito de cloroplasto para la importación de un transgen heterólogo. Dicho péptido usado es el péptido tránsito procedente del gen rbcS procedente Nicotiana plumbaginifolia (Poulsen y col., Mol. Gen. Genet. 205: 193-200 (1986)). Usando las enzimas de restricción DraI y SphI, ó Tsp5091 y SpHI y la secuencia de ADN que codifica este péptido tránsito puede ser escindido del plásmido prbcS-8B y puede ser manipulado para el uso con cualquiera de las construcciones descritas anteriormente. El fragmento DraI-SphI se extiende desde -58 referido al ATG rbcS de inicio hasta, e incluyendo, el primer aminoácido (también una metionina) del péptido maduro que se encuentra inmediatamente después de la posición de rotura de importación, mientras que el fragmento Tsp509I-SphI se extiende desde -8 referido al ATG rbcS de inicio hasta, e incluyendo, el primer aminoácido del péptido maduro. De este modo, dichos fragmentos pueden ser insertados de forma apropiada en el poliligando de cualquier casete de expresión elegida, generando una fusión transcripcional hacia el director no-traducido del promotor elegido (por ejemplo, 35S, PR-1a, actina, ubiquitina, etc.), a la vez que se permite la inserción de un gen de celulasa en fusión correcta por debajo del péptido tránsito. En la técnica este tipo de construcciones son rutinarias. Por ejemplo, mientras que el extremo DraI ya esta redondeado, la posición 5' Tsp5091 puede ser redondeada mediante un tratamiento de polimerasa T4, o de forma alternativa puede ser ligada a una secuencia ligando o adaptadora para facilitar su fusión con el promotor elegido. La posición 3' SphI puede mantenerse como tal, o, alternativamente, puede ser ligada a secuencias adaptadoras o de ligando para facilitar su inserción en el vector elegido de tal modo que se disponga de posiciones de restricción apropiadas para la posterior inserción de un gen de celulasa seleccionado. Idealmente el ATG de la posición SphI se mantiene y comprende el primer ATG del gen de celulasa seleccionado. Chen & Jagendorf proporcionan secuencias de consenso para la rotura ideal para la importación de cloroplastos, y en todos los casos se prefiere una metionina para la primera posición de la proteína madura. En las posiciones siguientes existe una mayor variación y el aminoácido puede no ser tan crítico. En cualquier caso, se puede determinar la eficacia de importación de las construcciones de fusión in vitro usando los métodos descritos por Bartlett y col. (En: Edelmann y col. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, pág. 1081-1091 (1982)) y por Wasmann y col. (Mol. Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Normalmente, la mejor estrategia puede ser generar fusiones usando el gen de celulasa seleccionado sin ninguna modificación en el extremo amino, e incorporar únicamente modificaciones cuando sea evidente que dichas fusiones no son importadas por los cloroplastos con una alta eficacia, en cuyo caso se pueden hacer modificaciones de acuerdo con la bibliografía establecida (Chen & Jagendorf; Wasman y col.; Ko & Ko, J. Biol. Chem. 267: 13910-13916 (1992)).
Un vector preferido es construido transfiriendo el péptido tránsito DraI-SphI que codifica el fragmento procedente de prbcS-8B al vector de clonación pCGN1761ENX/Sph-. Este plásmido es sometido a rotura con EcoRI y los extremos son redondeados mediante tratamiento con polimerasa de ADN T4. El plásmido prbcS-8B es sometido a rotura con SphI y es ligado a un adaptador molecular templado de la secuencia 5'-CCAGCTGGAATTCCG-3'/5'-CGGAATTCCAGCTGGCATG-3'. El producto resultante es fosforilado en el extremo 5' mediante tratamiento con quinasa T4. La posterior rotura con DraI libera el péptido tránsito que codifica el fragmento que está ligado en las posiciones ex-EcoRI de extremo redondeado del vector modificado descrito anteriormente. Mediante secuenciamiento se identifican los clones orientados con el extremo 5' del injerto adyacente al extremo 3' del promotor 35S. Estos clones portan una fusión de ADN de la secuencia directora 35S a la secuencia de péptido tránsito del promotor rbcS-8A que se extiende desde -58 referido al ATG de rbcS hasta el ATG de la proteína madura, e incluyendo en dicha posición una única posición SphI, y una posición EcoRI recién creada, así como las posiciones existentes NotI y XhoI del pCGN1761ENX. Este nuevo vector se designa pCGN1761/CT. Las secuencias de ADN son transferidas al pCGN1761/CT en cuadro mediante amplificación usando técnicas PCR y mediante incorporación de una posición SphI, NSphI ó NlaIII en el ATG amplificado, el cual, después de la rotura con enzima de restricción con la enzima apropiada, es ligado al pCGN1761/CT sometido a rotura con SphI. Para facilitar la construcción, puede requerirse cambiar el segundo aminoácido del gen clonado, sin embargo en casi todos los casos el uso de PCR junto con mutagénesis dirigida de posición estándar permitirá la construcción de cualquier secuencia deseada alrededor de la posición de rotura y de la primera metionina de la proteína madura.
Otro vector preferido se construye sustituyendo el promotor 35S de pCGN1761ENX con el fragmento BamHI-SphI de prbcS-8A que contiene el promotor rbcS-8A regulado de longitud completa desde -1038 (referido a la posición de inicio transcripcional) hasta la primera metionina de la proteína madura. El pCGN1761 modificado con la posición SphI destruida es sometido a rotura con PstI y EcoRI y es tratado con polimerasa de ADN T4 para redondear los extremos. El prbcS-8A es sometido a rotura con SphI y es ligado al adaptador molecular templado de la secuencia descrita anteriormente. El producto resultante es fosforilado en el extremo 5' mediante tratamiento con quinasa T4. La posterior rotura con BamHI libera el péptido tránsito promotor que contiene el fragmento que es tratado con polimerasa de ADN T4 para redondear el extremo BamHI. El fragmento de péptido tránsito promotor generado de esta forma es clonado en el vector pCGN1761ENX preparado, generando una construcción que comprende el promotor rbcS-8A y el péptido tránsito con una posición SphI localizada en la posición de rotura para la inserción de genes heterólogos. Además, por debajo de la posición SphI existen posiciones de clonación EcoRI (recreada), NotI y XhoI. Esta construcción se designa pCGN1761rbcS/CT.
Se pueden considerar manipulaciones similares para utilizar otras secuencias codificadoras de péptido tránsito de cloroplasto GS2 procedentes de otras fuentes (monocotiledóneas y dicotiledóneas) y de otros genes. Además, se pueden seguir procedimientos similares para lograr el direccionamiento hacia otros compartimentos subcelulares tales como las mitocondrias.
Transformación de Dicotiledóneas
Las técnicas de transformación para dicotiledóneas son bien conocidas en la técnica e incluyen técnicas basadas en Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium. Las técnicas que no requieren Agrobacterium incluyen la recaptación de material genético exógeno directamente por los protoplastos o por las células. Esto se puede realizar mediante PEG o mediante recaptación mediada por electroporación, mediante entrega mediada por bombardeo de partículas, o mediante microinyección. Ejemplos de estas técnicas son descritos por Paszkowski y col., EMBO J 3: 2717-2722 (1984), Potrykus y col., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich y col., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), y Klein y col., Nature 327: 70-73 (1987). En cada caso, las células transformadas son regeneradas hasta plantas completas usando técnicas estándar conocidas en la técnica.
La transformación mediada por Agrobacterium es una técnica preferida para la transformación de dicotiledóneas debido a su elevada eficacia de transformación y a su amplia utilidad con muchas especies diferentes. Las muchas especies de cultivos que son transformables de forma rutinaria mediante Agrobacterium incluyen el tabaco, el tomate, el girasol, el algodón, la colza, la patata, la soja, la alfalfa y el álamo (EP 0 317 511 (algodón [1313]), EP 0 249 432 (tomate, a nombre de Calgene), WO 87/07299 (Brassica, a nombre de Calgene), EE.UU. 4.795.855 (álamo)). La transformación de Agrobacterium incluye típicamente la transferencia del vector binario que porta el ADN extraño de interés (por ejemplo, pCIB200 ó pCIB2001) a una cepa de Agrobacterium apropiada que puede depender del complemento de genes vir portado por la cepa hospedante de Agrobacterium tanto sobre un plásmido Ti co-residente como cromosomalmente (por ejemplo, la cepa CIB542 para pCIB200 y pCIB2001 (Uknes y col., Plant Cell 5: 159-169 (1993)). La transferencia del vector binario recombinante a Agrobacterium se lleva a cabo mediante un procedimiento de cruce triparental usando E. coli que porta el vector binario recombinante, una cepa de E. coli asistente que porta un plásmido tal como el pRK2013 y que es capaz de movilizar el vector binario recombinante hasta la cepa de Agrobacterium objetivo. De forma alternativa, el vector binario recombinante puede ser transferido hasta Agrobacterium mediante transformación de ADN (Höfgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).
La transformación de las especies vegetales objetivo mediante Agrobacterium recombinante incluye normalmente el co-cultivo de la Agrobacterium con explantas procedentes de la planta y sigue protocolos bien conocidos en la técnica. El tejido transformado es regenerado sobre un medio seleccionable que porta el marcador de resistencia frente a antibióticos o a herbicidas presente entre los extremos del ADN T del plásmido binario.
Transformación de Monocotiledóneas
La transformación de la mayoría de especies monocotiledóneas es hoy día rutinaria. Las técnicas preferidas incluyen la transferencia directa de genes al interior de los protoplastos usando técnicas PEG o de electroporación, y bombardeo de partículas en tejido calloso. Las transformaciones pueden ser consideradas con ADN de una única especie o con ADN de múltiples especies (es decir, co-transformación) y ambas técnicas son adecuadas para el uso con esta invención. La co-transformación puede presentar la ventaja de evitar la construcción de un vector complejo y de generar plantas transgénicas con posiciones no ligadas para los genes de interés y para el marcador seleccionable, permitiendo la eliminación del marcador seleccionable en generaciones sucesivas, si esto es lo que se desea. Sin embargo, una desventaja del uso de la co-transformación es la eficacia inferior al 100% con la que se integran especies de ADN separadas en el genoma (Schocher y col., Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)).
Las Solicitudes de Patente EP 0 292 435 ([1280/1281] a nombre de Ciba-Geigy), EP 0 392 225 (a nombre de Ciba-Geigy) y WO 93/07278 (a nombre de Ciba-Geigy) describen técnicas para la preparación de callos y de protoplastos a partir de una línea innata de élite de maíz, la transformación de protoplastos usando PEG ó electroporación, y la regeneración de plantas de maíz a partir de protoplastos transformados. Gordon-Kamm y col. (Plant Cell 2: 603-618 (1990)) y Fromm y col. (Biotechnology 8: 833-839 (1990)) han publicado técnicas para la transformación de la línea de maíz derivada de A188 usando bombardeo de partículas. Además, la solicitud WO 93/07278 (a nombre de Ciba-Geigy) y Koziel y col. (Biotechnology 11: 194-200 (1993)) describen técnicas para la transformación de líneas innatas de élite de maíz mediante bombardeo de partículas. Esta técnica utiliza embriones de maíz inmaduros de una longitud entre 1,5 y 2,5 mm, escindidos de una espiga de maíz 14-15 días después de la polinización, y un dispositivo PDS-1000He Biolistics para el bombardeo.
La transformación del arroz también puede ser considerada mediante técnicas de transferencia directa de genes utilizando protoplastos o bombardeo de partículas. La transformación mediada por protoplastos ha sido descrita para los tipos Japonica e Indica (Zhang y col., Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto y col. Nature 338: 274-277 (1989); Datta y col. Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Ambos tipos también son transformables de forma rutinaria usando bombardeo de partículas (Christou y col. Biotechnology 9: 957-962 (1991)).
La Solicitud de Patente EP 0 332 581 (a nombre de Ciba-Geigy) describe técnicas para la generación, la transformación y la regeneración de protoplastos de Pooideae. Estas técnicas permiten la transformación de Dactylis y de trigo. Además, la transformación de trigo había sido descrita por Vasil y col. (Biotechnology 10: 667-674 (1992)) usando bombardeo de partículas en el interior de células de callos regenerables a largo plazo de tipo C, y también por Vasil y col. (Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)) y por Weeks y col. (Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)) usando bombardeo de partículas de embriones inmaduros y de callos derivados de embriones inmaduros. Sin embargo, una técnica preferida para la transformación del trigo incluye la transformación del trigo mediante bombardeo de partículas de embriones inmaduros e incluye una etapa de elevada sacarosa o de elevada maltosa antes de la entrega de genes. Con anterioridad al bombardeo, cualquier número de embriones (de 0,75-1 mm de longitud) son colocados en placa sobre un medio MS con un 3% de sacarosa (Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) y 3 mg/l de 2,4-D para la inducción de embriones somáticos que se dejan progresar en condiciones de oscuridad. Al día elegido para el bombardeo, los embriones son eliminados del medio de inducción y son colocados sobre osmoticum (es decir, medio de inducción con sacarosa o maltosa añadidas a una concentración deseada, normalmente del 15%). Se deja que los embriones plasmolicen durante 2-3 horas y a continuación son bombardeados. Lo normal son veinte embriones por objetivo, aunque no es un valor crítico. Un plásmido portado de genes adecuado (tal como el pCIB3064 o el pSG35) es precipitado sobre partículas de oro de tamaño micrométrico usando procedimientos estándar. Cada placa de embriones es disparada con el dispositivo de helio DuPont Biolistics® usando una presión de chorro de aproximadamente 71 bar (1000 psi) usando una pantalla estándar de 80 mesh. Después del bombardeo, los embriones son devueltos a la oscuridad para que se recuperen durante aproximadamente 24 h (todavía en el osmoticum). Después de 24 horas, los embriones son retirados del osmoticum y son devueltos al medio de inducción donde permanecen durante aproximadamente un mes antes de la regeneración. Aproximadamente un mes después las explantas de los embriones con callos embriogénicos en desarrollo son transferidos al medio de regeneración (MS + 1 mg/litro de NAA, 5 mg/litro de GA), que además contiene el agente de selección apropiado (10 mg/l de basta en el caso del pCIB3064 y 2 mg/l de metotrexato en el caso del pSOG35). Después de aproximadamente un mes, los retoños desarrollados son transferidos a contenedores estériles de mayor tamaño conocidos como "GA7s" que contenían MS con la mitad de fuerza, un 2% de sacarosa, y la misma concentración del agente de selección. La solicitud de Patente 08/147.161 describe métodos para la transformación de trigo y es incorporada aquí a modo de referencia.
Transformación de Cloroplastos
La tecnología de transformación de plástidos se describe de forma amplia en las Patentes de EE.UU. con Nº 5.451.513, 5.545.817 y 5.545.818, todas las cuales son incorporadas por completo aquí expresamente a modo de referencia; en la solicitud PCT nº WO 95/16783, que es incorporada aquí al completo a modo de referencia; y en McBride y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91, 7301-7305, que también es incorporada aquí al completo a modo de referencia. La técnica básica para la transformación de cloroplastos incluye introducir regiones de ADN de plástido clonado flanqueando a un marcador seleccionable junto con el gen de interés en un tejido objetivo adecuado, por ejemplo, usando biolistics o transformación de protoplastos (por ejemplo, transformación mediada por cloruro de calcio o por PEG). Las regiones de flanqueo de 1 a 1,5 kb, denominadas secuencias dirigidas, facilitan la recombinación homóloga con el genoma de plástido y de este modo permiten la sustitución o la modificación de regiones específicas del plastoma. Inicialmente, se utilizaron mutaciones puntuales en el rARN 16S de cloroplasto y en los genes rps12 que les confieren resistencia frente a la espectinomicina y/o la estreptomicina como marcadores seleccionables para la transformación (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., y Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530, incorporado aquí a modo de referencia; Staub, J. M. y Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45, incorporado aquí a modo de referencia). Esto dio como resultado transformantes homoplasmáticos estables con una frecuencia de aproximadamente uno por 100 bombardeos de hojas objetivo. La presencia de posiciones de clonación entre estos marcadores permitió la creación un vector plástido dirigido para la introducción de genes extraños (Staub, J. M. y Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606, incorporado aquí a modo de referencia). Se obtuvieron incrementos sustanciales en la frecuencia de transformación mediante la sustitución de los genes de rARN recesivo o de resistencia a antibióticos de proteína-r con un marcador seleccionable dominante, codificando el gen bacteriano aadA la enzima desintoxicante de espectinomicina aminoglicósido-3'-adeniltransferasa (Svab, Z. y Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917, incorporado aquí a modo de referencia). Previamente, este marcador había sido usado con éxito para la transformación de alta frecuencia del genoma de plástido de la alga verde Chlamydomonas reinharddtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 4083-4089, incorporado aquí a modo de referencia). Otros marcadores seleccionables útiles para la transformación de plástidos son conocidos en la técnica y están incluidos dentro del alcance de la invención. Normalmente, se requieren aproximadamente 15-20 ciclos de división celular después de la transformación para alcanzar un estado homoplastídico.
La expresión de plástidos, en cuyos genes son insertados mediante recombinación homóloga dentro de todos los varios miles de copias del genoma de plástido circular presente en cada célula vegetal, se aprovecha de la enorme ventaja en el número de copia sobre los genes expresados nuclearmente para permitir niveles de expresión que fácilmente puede sobrepasar el 10% de las proteínas solubles de la planta. Sin embargo, dichos elevados niveles de expresión pueden poseer problemas potenciales de viabilidad, especialmente durante el crecimiento y desarrollo tempranos de la planta. Se dan problemas similares mediante la expresión de enzimas o proteínas bioactivas que pueden muy importantes para la supervivencia de plantas transgénicas y, por tanto, si son expresadas constitutivamente pueden no ser introducidas con éxito en el genoma de la planta. De este modo, en un aspecto, la presente invención ha combinado la expresión en el genoma nuclear de una polimerasa de ARN T7 de fago dirigido a cloroplasto bajo el control del promotor PR-1a inducible químicamente (EE.UU. nº 5.614.395, incorporado aquí a modo de referencia) del tabaco con un transgen informador de cloroplasto regulado por las secuencias promotor/terminador de gen 10 T7. Por ejemplo, cuando se polinizan transformantes homoplásticos de plástido para el gen uidA heredado maternamente que codifica el informador de glucuronidasa (GUS) usando líneas que expresan la polimerasa T7 en el núcleo, se obtienen plantas F1 que portan ambos constructos de transgen pero que no expresan la proteína GUS. La síntesis de grandes cantidades de GUS activa enzimáticamente es activada en los plástidos de estas plantas sólo después de la aplicación foliar del compuesto inductor de PR-1a, éster de ácido benzo(1,2,3)tiadiazol-7-carbotióico y S-metilo (BTH). Como se establece más adelante en la Sección C de los Ejemplos, la presente invención también implica la síntesis de grandes cantidades de enzimas de degradación de la celulosa usando este sistema de expresión de polimerasa de ARN T7 dirigida.
La invención será descrita con más detalle mediante referencias a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos son proporcionados con fines ilustrativos únicamente, y no pretenden ser limitantes a no ser que se especifique lo contrario.
Ejemplos
Las técnicas estándar de ADN recombinante y de clonación molecular usadas aquí son bien conocidas en la técnica y son descritas por J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y por T. J. Silhavy, M.L. Berman, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y por Ausubel, F. M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. Y Wiley-Interscience (1987).
A. Expresión de Celulasas en el Citosol Vegetal Ejemplo A1 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E1 de T. fusca fusionada con el promotor PR-1a del tabaco
El plásmido pGFE1 (Jung y col. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 3032-3043) que contiene el gen E1 de T. fusca (número de acceso GenBank L20094), que codifica una proteína con actividad de endoglucanasa, fue usado como molde para PCR con un prímero de "cadena alta" izquierda-derecha que comprende un ATG antes del primer codón de la proteína E1 madura, los primeros 21 pares base de la proteína madura y una posición de restricción NcoI en el recién creado ATG (prímero E11: GCG CCC ATG GAC GAA GTC AAC CAG ATT CGC) y un prímero de "cadena baja" derecha-izquierda homólogo a las posiciones 322 a 346 a partir del recién creado ATG del gen E1 (prímero E12: CCA GTC GAC GTT GGA GGT GAA GAC). Esta reacción PCR fue llevada a cabo con polimerasa de ADN AmpliTaq de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) durante cinco ciclos a 94ºC (30 s), 40ºC (60 s) y 72ºC (30 s) seguido de 25 ciclos a 94ºC (30 s), 55ºC (60 s) y 72ºC (30 s). Esto generó un producto de 352 pb que contiene una posición NcoI en su extremo izquierdo y una posición EcoRI en su extremo derecho y que comprende el extremo 5' del gen E1 sin la secuencia de señal. El fragmento fue purificado con gel usando procedimientos estándar, fue sometido a rotura con NcoI y EcoRI (todas las enzimas de restricción fueron compradas a Promega, Madison, WI ó a New England Biolabs, Beverly, MA) y fue ligado a las posiciones NcoI y EcoRI del pTC191 (De La Fuente y col. (1994) Gene 139, 83-86) para obtener pE1.
El plásmido pGFE1 fue digerido a continuación con EcoRI y con ScaI. El fragmento EcoRI de 3,0 kb de longitud que contiene el extremo 3' del gen E1 fue purificado con gel y fue ligado con pE1, el cual había sido digerido previamente con EcoRI, para obtener pCTE1 que contiene el gen E1 completo sin una secuencia de señal. El plásmido pCTE1 fue digerido con NcoI y con SacI. El fragmento de 3,3 kb de longitud que contiene el gen E1 fue purificado con gel y fue ligado en posiciones NcoI y SacI del pJG203 entre un promotor PR-1a de tabaco de 903 pb de longitud y las señales de terminación del gen nos (Uknes y col. (1993), The Plant Cell 5, 159-169, modificado mediante la eliminación de una posición SacI adicional, Joern Goerlach, cuaderno nº 2941, páginas 4-9 y 13-15), dando lugar a pTPR1E1 que contiene el gen E1 fusionado al promotor PR-1a del tabaco (Figura 1).
El plásmido pTPR1E1 fue digerido con XhoI y con XbaI y el fragmento de 4,5 kb de longitud que contiene el constructor quimérico de gen E1 fue purificado con gel y fue ligado en posiciones XhoI y XbaI de pBHYGM para obtener el vector binario pEGL101. El pBHYGM es un vector pGPTV-Hyg modificado (Becker y col. (1992) Plant Mol. Biol. 20, 1195-1197) producido mediante la inserción de un poliligando que contiene posiciones de restricción BfrIl ApaIl lClall Small Bfrll Xball Salll Pstll Sphll Hindlll en las posiciones EcoRI y Xbal del pGPTV-
Hyg.
Ejemplo A2 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E2 de T. fusca fusionada con el promotor PR-1a del tabaco
El plásmido pJT17 que contiene el gen E2 de T. fusca (Ghangas y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54, 2521-2526; Lao y col. (1991) J. Bacterial. 173, 3397-3407), (número de acceso GenBank M73321), que codifica una proteína con actividad de celobiohidrolasa, fue usado como molde para PCR con un prímero de "cadena alta" izquierda-derecha que comprende un ATG antes del último codón de la secuencia señal E2, los primeros 18 pares base de la proteína madura y una posición de restricción NcoI en el ATG recién creado (prímero E21: GCG CGC CAT GGC CAA TGA TTC TCC GTT CTA C) y un prímero de "cadena baja" derecha-izquierda homólogo a las posiciones 310 a 334 a partir del ATG recién creado del gen E2 (prímero E22: GGG ACG GTT CTT CAG TCC GGC AGC). Esta reacción PCR fue llevada a cabo con polimerasa de ADN AmpliTaq de acuerdo con las recomendaciones del fabricante durante cinco ciclos a 94ºC (30 s), 40ºC (60 s) y 72ºC (30 s) seguido de 25 ciclos a 94ºC (30 s), 55ºC (60 s) y 72ºC (30 s). Esto generó un producto de 341 pb que contiene una posición NcoI en su extremo izquierdo y una posición EcoRI en su extremo derecho que comprende el extremo 5' del gen E2 sin una secuencia de señal. El fragmento fue purificado con gel usando procedimientos estándar, fue sometido a rotura con NcoI y con EcoRI y fue ligado en las posiciones NcoI y EcoRI del pTC191 para obtener pE2.
A continuación el plásmido pJT17 fue digerido con EcoRI y con SacI. El fragmento de 1,7 kb de longitud que contiene el extremo 3' del gen E2 fue purificado con gel y fue ligado con pE2, el cual había sido digerido previamente con EcoRI y con SacI, para obtener pCTE2 que contiene el gen E2 completo sin una secuencia de señal. El plásmido pCTE2 fue digerido con NcoI y con SacI y el fragmento de 2,0 kb de longitud que contiene el gen E2 fue purificado con gel y fue ligado en las posiciones NcoI y SacI del pJG203, dando lugar a pTPR1E2 que contiene el gen E2 fusionado con un fragmento de promotor PR-1a de tabaco de 903 pb de longitud (Figura 1).
El plásmido pTPR1E2 fue digerido con XhoI y con XbaI y el fragmento de 2,9 kb de longitud que contiene el constructo quimérico de gen E2 fue purificado con gel y fue ligado en las posiciones XhoI y XbaI del pBHYGM para construir el pEGL102.
Ejemplo A3 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca fusionada con el promotor PR-1a del tabaco
El plásmido pD374, una versión modificada del pD370 (Collmer y Wilson (1983) Biotechnology 1, 594-601; Lao y col. (1991) J. Bacterial. 173, 3397-3407) que contiene el gen E5 de T. fusca (número de acceso GenBank L01577), que codifica una proteína con actividad de endoglucanasa, fue usado como molde para PCR con un prímero de "cadena alta" izquierda-derecha que comprende un ATG antes del último codón de la proteína E5 madura, los primeros 21 pares base de la proteína madura y una posición de restricción NcoI en el ATG recién creado (prímero E51: CGC CCA TGG CCG GTC TCA CCG CCA CAG TC) y un prímero de "cadena baja" derecha-izquierda homólogo a las posiciones 89 a 114 a partir del ATG recién creado del gen E5 (prímero E52: GAC GAC CTC CCA CTG GGA GAC GGT G). Se usó polimerasa de ADN AmpliTaq para el PCR de acuerdo con las recomendaciones del fabricante durante cinco ciclos a 94ºC (30 s), 40ºC (60 s) y 72ºC (30 s) seguido de 25 ciclos a 94ºC (30 s), 55ºC (60 s) y 72ºC (30 s). Esto generó un producto de 119 pb que contiene una posición NcoI en su extremo izquierdo y una posición XhoI en su extremo derecho que comprende el extremo 5' del gen E5 sin una secuencia de señal. El fragmento fue purificado con gel, fue sometido a rotura con NcoI y con EcoRI y fue ligado en las posiciones NcoI y EcoRI del pCIB4247 para obtener pCE5. El pCIB4247 es un derivado del pUC19 (Yanisch-Perron y col. (1985) Gene 33, 103-119) que contiene un poliligando con posiciones de restricción NcoI, XhoI y EcoRI.
Con el fin de reconstituir el gen E5 completo, se subclonó un fragmento XhoI/PvuII de pD374 de 1,4 kb de longitud que contiene el extremo 3' del gen E5 en posiciones XhoI y EcoRV de pICEM19R+, un derivado de pUC19 que contiene un poliligando con posiciones de restricción XhoI, EcoRV y EcoRI, escindido como un fragmento XhoI/EcoRI y ligado en las posiciones XhoI y EcoRI del pCE5 para formar el pCTE5 que contiene el gen E5 completo. El pCTE5 fue digerido con EcoRI, los extremos salientes de la posición EcoRI fueron rellenados con el fragmento Klenow de Polimerasa I de ADN (Promega, Madison, WI) y el plásmido de ADN fue digerido con NcoI. El fragmento de 1,5 kb de longitud que contiene el gen E5 fue purificado con gel y fue ligado en posiciones NcoI y EcoICRI del pJG203, dando lugar al pTPR1E5 que contiene el gen E5 fusionado a un promotor PR-1a del tabaco de 903 pb de longitud (Figura 1).
El plásmido pTPR1E5 fue digerido con ApaI, XbaI y SacI y el fragmento ApaI/XbaI de 2,7 kb de longitud que contiene el constructo quimérico de gen E5 fue purificado con gel y fue ligado en las posiciones ApaI y XbaI del pBHYGM para construir el pEGL105.
Ejemplo A4 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca fusionada con el promotor CaMV 35S
Un fragmento NcoI/EcoRI de 1,5 kb de longitud de pCTE5 que contiene el gen E5 y cuyos extremos salientes habían sido rellenados previamente con Polimerasa de ADN Klenow fue purificado con gel y fue ligado en la posición rellena EcoRI del pCGN1761 entre un promotor CaMV 35S duplicado (Kay y col. (1987) Science 236, 1299-1302) y las señales de terminación del gen tml (Ream y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1660-1664), dando como resultado el p35SE5 (Figura 1). Un fragmento del p35SE5 de 4,6 kb de longitud que contiene el gen quimérico fue insertado en la posición XbaI del pBHYGM para obtener el pEGL35S.
Ejemplo A5 Preparación de genes quiméricos que contienen la secuencia codificadora de celulasa E1 de T. fusca fusionada con el promotor CaMV 35S
Un fragmento NcoI(rellenado)/SacI de pCTE1 de 3,3 kb de longitud que contiene el gen E1 es purificado con gel y es ligado en la posición rellenada EcoRI del pCGN1761. El gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de E1 fusionada al promotor CaMV 35S es insertada en la posición XbaI del pBHYGM.
Ejemplo A6 Preparación de genes quiméricos que contienen la secuencia codificadora de celulasa E2 de T. fusca fusionada con el promotor CaMV 35S
Un fragmento NcoI(rellenado)/SacI de pCTE2 de 2,0 kb de longitud que contiene el gen E2 es purificado con gel y es ligado en la posición rellenada EcoRI del pCGN1761. El gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de E2 fusionada al promotor CaMV 35S es insertada en la posición XbaI del pBHYGM.
Ejemplo A7 Transformación de discos de hojas de tabaco mediante A. tumefaciens
Los constructos de vector binario pEGL101, pEGL102, pEGL105 y pEGL355 fueron transformados en la cepa de A. tumefaciens GV3101 (Bechtold, N. y col. (1993), CR Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie, 316: 1194-1199) mediante electroporación (Dower, W. J. (1987), Plant Mol. Biol. Reporter 1:5). Se usa el mismo procedimiento para la transformación de tabaco con otros constructos que contienen genes quiméricos de celulasa.
Discos de hojas de Nicotiana tabacum cv "Xanthi nc" de la línea transgénica "NahG" que sobreexpresa un gen de hidroxilasa de salicilato (Gaffney y col. (1993) Science 261: 754-756) fueron co-cultivados con clones de Agrobacterium que contienen los constructos anteriormente mencionados (Horsch y col. (1985), Science 227: 1229-1231) y los transformantes fueron seleccionados por su resistencia frente a 50 \mug/ml de higromicina B. Se seleccionaron aproximadamente 50 líneas de higromicina independientes (líneas T0) para cada constructo y fueron sembradas en un medio libre de hormonas.
Ejemplo A8 Transformación de maíz
La transformación de maíz mediante bombardeo de partículas de embriones inmaduras se lleva a cabo como describen Koziel y col. (Biotechnology 11, 194-200, 1993).
Ejemplo A9 Transformación de trigo
La transformación de embriones inmaduros de trigo y de callos derivados de embriones inmaduros usando bombardeo de partículas se lleva a cabo como describen Vasil y col. (Biotechnology 11: 1553-1558, 1993) y Weeks y col. (Plant Physiology 102: 1077-1084, 1993).
Ejemplo A10 Selección de líneas transgénicas con expresión de gen de celulasa inducible
Para cada línea transgénica, grupos de hojas duplicados de aproximadamente 2-3 cm^{2} fueron incubados durante 2 días en 3 ml de éster de ácido benzo(1,2,3)tiadiazol-7-carbotióico de S-metilo (BTH, 5,6 mg/10 ml) o en agua destilada esterilizada con una irradiación de aproximadamente 300 \mumol/m^{2}/s. El material de hoja fue cosechado, fue sometido a congelación flash y fue molido en nitrógeno líquido. El ARN total fue extraído (Verwoerd y col. (1989) NAR 17, 2362) y se llevó a cabo un análisis Northern blot como se ha descrito (Ward y col. (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094) usando sondas radiomarcadas específicas de cada gen de celulasa.
Se permitió que las líneas transgénicas con altos niveles de expresión de transgen inducible florecieran y se auto-polinizaran, produciendo semillas T1. Diez semillas T1 de cada línea transgénica fueron germinadas en el suelo y las plantas resultantes fueron auto-polinizadas. Las semillas T2 procedentes de estas plantas fueron germinadas sobre un medio de agar T (Nitsch y Nitsch (1969) Science 163, 85-87) que contiene 50 \mug/ml de higromicina B para identificar líneas homozigotas para el marcador seleccionable y para el transgen ligado.
Ejemplo A11 Inducción de expresión de celulasa en plantas transgénicas
Se germinan las semillas de líneas transformantes nucleares homozigotas de forma aséptica sobre un medio de agar T y son incubadas con una irradiación de 300 \mumol/m^{2}/s durante aproximadamente 4-6 semanas. De forma alternativa, las semillas son germinadas en el suelo y son cultivadas en el invernadero durante aproximadamente 2 meses. El material de líneas que expresa genes de celulasa bajo una expresión constitutiva (promotor CaMV 35S) es cosechado y es sometido a congelación flash directamente en nitrógeno líquido, mientras que las líneas que contienen genes de celulasa fusionados con el promotor químicamente inducible PR-1a son pulverizadas en primer lugar con 1 mg/ml
de BTH o de agua, son incubadas durante de 1 a 7 días, y el material es cosechado y sometido a congelación flash.
Ejemplo A12 Determinación del contenido de celulasa de plantas transgénicas
Con el fin de determinar la cantidad de celulasa presente en los tejidos de plantas transgénicas, se lleva a cabo un análisis Western blot quimioluminiscente (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y Harlow y Lane (1988) Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, usando antisueros preparados contra las proteínas E1, E2 y E5 y patrones de proteínas E1, E2 y E5 purificadas (proporcionados por D. Wilson, Cornell University, Ithaca, N.Y.).
Ejemplo A13 Determinación de la actividad de celulasa en plantas transgénicas
El material de hojas es cosechado como se ha descrito anteriormente y es homogeneizado en una disolución tampón de PC (fosfato 50 mM, citrato 12 mM, pH 6,5). Se prepara una curva patrón (de 10 nanomolar a 10 micromolar) diluyendo las cantidades apropiadas de 4-metilumbeliferona (MU, Sigma Cat. Nº M1381) en tampón PC. Se distribuyen alícuotas duplicadas de 100 \mul de cada patrón y alícuotas duplicadas de 50 \mul de cada muestran en pocillos separados en una placa de microtitulación de 96 pocillos. A continuación se añaden 50 \mul de 4-metilumbeliferil-b-D-celobiopiranósido 2 mM (MUC, Sigma Cat. Nº M6018) preparados en disolución tampón PC a cada pocillo de muestra y la placa es sellada para evitar la evaporación, y es incubada durante 30 minutos a 55ºC o a otras temperaturas en el intervalo entre 37ºC y 65ºC. Se detiene la reacción añadiendo 100 \mul de glicina/NaOH 0,15 M (pH 10,3) y se mide la emisión de fluorescencia MU a 460 nm resultado de la actividad de celulasa con un fluorómetro de microplaca (longitud de onda de excitación = 355 nm).
B. Expresión de Celulasas Dirigida a las Vacuolas Ejemplo B1 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca fusionada con el promotor PR-1a del tabaco
El plásmido pD374 que contiene el gen E5 de T. fusca (véase el Ejemplo A3) fue usado como modelo para PCR con un prímero de "cadena alta" izquierda-derecha que se extiende desde la posición 1.135 hasta la 1.156 en el gen E5 con respecto al ATG endógeno, y que comprende una posición NcoI adicional en su extremo izquierdo (prímero VAC1: CAT GCC ATG GGT GAG GCC TCC GAG CTG TTC C) y un prímero de "cadena baja" derecha-izquierda cuya secuencia era homóloga a las 21 últimos pb del gen E5 y que incluye 21 pb de una secuencia dirigida vacuolar derivada de un gen de quitinasa del tabaco (Shinshi y col. (1990) Plant Mol. Biol. 14, 357-368, Neuhaus y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10362-10366), el codón de parada del mismo gen de quitinasa del tabaco y la posición de restricción SacI (prímero "VAC": TGC GAG CTC TTA CAT AGT ATC GAC TAA AAG TCC GGA CTG GAG CTT GTC CCG CAC). Se usó polimerasa de ADN AmpliTaq para el PCR de acuerdo con las recomendaciones del fabricante durante cinco ciclos a 94ºC (30 s), 40ºC (60 s) y 72ºC (30 s), seguidos de 25 ciclos a 94ºC (30 s), 55ºC (60 s) y 72ºC (30 s). Esto generó un producto de 283 pb que contiene el extremo 3' del gen E5 fusionado con la secuencia dirigida vacuolar. El fragmento fue purificado con gel, fue sometido a rotura con NcoI y SacI y fue ligado en las posiciones NcoI y SacI del pJG203 para obtener el pJGDE5.
A continuación el plásmido pD374 fue digerido con NcoI y SacI, el fragmento de 1,1 kb de longitud que contiene el extremo 5' del gen E5 que incluye la secuencia de señal fue purificado con gel y fue ligado a las posiciones NcoI y SacI del pJGDR5 para obtener pVACE5 que contiene el gen E5 completo con la secuencia de señal y la secuencia dirigida a vacuolas fusionadas con un promotor PR-1a de tabaco de 903 pb de longitud (Figura 1).
El plásmido pVACE5 fue digerido con ApaI, XbaI y ScaI y el fragmento de 2,8 kb resultante que contiene el gen quimérico E5 fue purificado con gel y fue ligado en las posiciones ApaI y XbaI del pBHYGM para obtener pEGL115.
Ejemplo B2 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E1 de T. fusca fusionada con el promotor PR-1a del tabaco
Se construye un vector de transformación binario de Agrobacterium que contiene la secuencia codificadora de celulasa E1 de T. fusca, su secuencia señal y una secuencia dirigida a vacuolas fusionadas con el promotor PR-1a de tabaco tal como se describe en el Ejemplo B1 para la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca.
Ejemplo B3 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E2 de T. fusca fusionada con el promotor PR-1a del tabaco
Se construye un vector de transformación binario de Agrobacterium que contiene la secuencia codificadora de celulasa E2 de T. fusca, su secuencia señal y una secuencia dirigida a vacuolas fusionadas con el promotor PR-1a de tabaco tal como se describe en el Ejemplo B1 para la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca.
Ejemplo B4 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca fusionada con el promotor CaMV 35S
El plásmido pVACE5 fue digerido con NcoI y EcoICRI. El fragmento resultante de 1,6 kb cuyos extremos NcoI salientes habían sido rellenados previamente con Polimerasa de ADN Klenow fue purificado con gel y fue ligado en la posición rellenada EcoRI del pCGN1761 para obtener el p35SVACE5, que contiene el gen E5 con la secuencia señal y con la secuencia dirigida a vacuolas fusionadas con el promotor CaMV 35S (Figura 1). Un fragmento del p35SE5 de 4,7 kb de longitud que contiene el gen quimérico E5 fue insertado en la posición XbaI del pBHYGM para construir el pEGL315.
Ejemplo B5 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E1 de T. fusca fusionada con el promotor CaMV 35S
Se construye un vector de transformación binario de Agrobacterium que contiene la secuencia codificadora de celulasa E1 de T. fusca, su secuencia señal y una secuencia dirigida a vacuolas fusionadas con el promotor CaMV 35S tal como se describe en el Ejemplo B4 para la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca.
Ejemplo B6 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E2 de T. fusca fusionada con el promotor CaMV 35S
Se construye un vector de transformación binario de Agrobacterium que contiene la secuencia codificadora de celulasa E2 de T. fusca, su secuencia señal y una secuencia dirigida a vacuolas fusionadas con el promotor CaMV 35S tal como se describe en el Ejemplo B4 para la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca.
Ejemplo B7 Transformación de discos de hojas de tabaco mediante A. tumefaciens
Los constructos de vector binario pEGL115 y pEGL315 fueron transformados en la cepa GV3101 de A. tumefaciens (Bechtold, N. y col. (1993), CR Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie, 316: 1194-1199) mediante electroporación (Dower, W. J. (1987), Plant Mol. Biol. Reporter 1:5). Se usa el mismo procedimiento para la transformación de tabaco con otros constructos que contienen genes quiméricos de celulasa.
Se co-cultivaron discos de hojas de Nicotiana tabacum cv "Xanthi nc" y de la línea transgénica "NahG" que sobreexpresan un gen de hidroxilasa de salicilato (Gaffney y col. (1993) Science 261: 754-756) con clones de Agrobacterium que contienen los constructos anteriormente mencionados (Horsch y col. (1985), Science 227: 1229-1231) y los transformantes fueron seleccionados en función de su resistencia frente a 50 \mug/ml de higromicina B. Se seleccionaron aproximadamente 50 líneas de higromicina independientes (líneas T0) para cada constructo y fueron cultivadas en un medio libre de hormonas.
Ejemplo B8 Transformación de maíz
La transformación de maíz mediante bombardeo con partículas de embriones inmaduros es llevada a cabo tal como se describe en Koziel y col. (Biotechnology 11, 194-200, 1993).
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Ejemplo B9 Transformación de trigo
La transformación de embriones de trigo inmaduros y de callos derivados de embriones inmaduros usando bombardeo de partículas se lleva a cabo tal como se describe en Vasil y col. (Biotechnology 11: 1553-1558, 1993) y Weeks y col. (Plant Physiology 102: 1077-1084, 1993).
Ejemplo B10 Selección de líneas transgénicas con expresión de gen de celulasa inducible
Para cada línea transgénica, grupos de hojas duplicados de aproximadamente 2-3 cm^{2} fueron incubados durante 2 días en 3 ml de éster de ácido benzo(1,2,3)tiadiazol-7-carbotióico de S-metilo (BTH, 5,6 mg/10 ml) o en agua destilada esterilizada con una irradiación de aproximadamente 300 \mumol/m^{2}/s. El material de hoja fue cosechado, fue sometido a congelación flash y fue molido en nitrógeno líquido. El ARN total fue extraído (Verwoerd y col. (1989) NAR 17, 2362) y se llevó a cabo un análisis Northern blot como se ha descrito (Ward y col. (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094) usando sondas radiomarcadas específicas de cada gen de celulasa.
Se permitió que las líneas transgénicas con altos niveles de expresión de transgen inducible florecieran y se auto-polinizaran, produciendo semillas T1. Diez semillas T1 de cada línea transgénica fueron germinadas en el suelo y las plantas resultantes fueron auto-polinizadas. Las semillas T2 procedentes de estas plantas fueron germinadas sobre un medio de agar T (Nitsch y Nitsch (1969) Science 163, 85-87) que contiene 50 \mug/ml de higromicina B para identificar líneas homozigotas para el marcador seleccionable y para el transgen ligado.
Ejemplo B11 Inducción de expresión de celulasa en plantas transgénicas
Se germinan las semillas de líneas transformantes nucleares homozigotas de forma aséptica sobre un medio de agar T y son incubadas con una irradiación de 300 \mumol/m^{2}/s durante aproximadamente 4-6 semanas. De forma alternativa, las semillas son germinadas en el suelo y son cultivadas en el invernadero durante aproximadamente 2 meses. El material de líneas que expresa genes de celulasa bajo una expresión constitutiva (promotor CaMV 35S) es cosechado y es sometido a congelación flash directamente en nitrógeno líquido, mientras que las líneas que contienen genes de celulasa fusionados con el promotor químicamente inducible PR-1a son pulverizadas en primer lugar con 1 mg/ml de BTH o de agua, son incubadas durante de 1 a 7 días, y el material es cosechado y sometido a congelación flash.
Ejemplo B12 Determinación del contenido de celulasa de plantas transgénicas
Con el fin de determinar la cantidad de celulasa presente en los tejidos de plantas transgénicas, se lleva a cabo un análisis Western blot quimioluminiscente (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y Harlow y Lane (1988) Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, usando antisueros preparados contra las proteínas E1, E2 y E5 y patrones de las proteínas E1, E2 y E5 purificadas (proporcionados por D. Wilson, Cornell University, Ithaca, N.Y.).
Ejemplo B13 Determinación de la actividad de celulasa en plantas transgénicas 1. Ensayo fluorométrico
El material de hojas es cosechado como se ha descrito anteriormente y es homogeneizado en una disolución tampón de PC (fosfato 50 mM, citrato 12 mM, pH 6,5). Se prepara una curva patrón (de 10 nanomolar a 10 micromolar) diluyendo las cantidades apropiadas de 4-metilumbeliferona (MU, Sigma Cat. Nº M1381) en tampón PC. Se distribuyen alícuotas duplicadas de 100 \mul de cada patrón y alícuotas duplicadas de 50 \mul de cada muestran en pocillos separados en una placa de microtitulación de 96 pocillos. A continuación se añaden 50 \mul de 4-metilumbeliferil-b-D-celobiopiranósido 2 mM (MUC, Sigma Cat. Nº M6018) preparados en disolución tampón PC a cada pocillo de muestra y la placa es sellada para evitar la evaporación, y a continuación es incubada durante 30 minutos a la temperatura deseada (55ºC-60ºC es óptima para las celulasas de T. fusca). Se detiene la reacción añadiendo 100 \mul de glicina/NaOH 0,15 M (pH 10,3) y se mide la emisión de fluorescencia a 460 nm con un fluorómetro de microplaca (longitud de onda de excitación = 355 nm). Con el fin de calcular la actividad específica de celulasa (pmoles MU/mg de proteína/minuto), se determina la cantidad de proteína en cada extracto usando un ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
2. Actividad de CMCasa (de acuerdo con Wilson (1988) Methods in Enzymology, 160: 314-315)
El material de hoja es homogeneizado en 0,3 ml de disolución tampón de fosfato de potasio 0,05 M (pH 6,5) y es incubado con 0,1 ml de carboximetilcelulosa (CMC, Sigma, Nº de catálogo C-5678) durante 15-60 minutos a la temperatura deseada (55ºC-60ºC es el óptimo para las celulasas de T. fusca). Después de añadir 0,75 ml de reactivo DNS (200 g/l de tartrato de potasio y sodio, 10 g/l de ácido dinitrosalicílico, 2 g/l de fenol, 0,5 g/l de sulfito sódico, 10 g/l de hidróxido sódico) las muestras son llevadas a ebullición durante 15 minutos. Las muestras son enfriadas y se mide la densidad óptica a 600 nm. La cantidad de azúcares reductores liberados de la CMC es determinada usando una curva patrón de glucosa y la actividad de celulasa es expresada en moles equivalentes de glucosa que reduce azúcar por minuto. Con el fin de calcular la actividad específica de celulasa, se determina la cantidad de proteína de cada extracto usando un ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
De manera alternativa, la actividad de celulasa sobre la CMC se mide con un método de viscosidad tal como se describe en Durbin y Lewis (1988) Methods in Enzymology, 160: 314-315.
3. Ensayo de Papel de Filtro (de acuerdo con Wilson (1988) Methods in Enzymology, 160: 314-315, incorporado a modo de referencia)
El material de hoja es homogeneizado en una disolución tampón de fosfato de potasio 0,05 M (pH 6,5) y los extractos resultantes son añadidos a un disco de papel de filtro (Whatman Nº 1). Tras una incubación durante 4-24 horas a la temperatura deseada (55ºC-60ºC es lo óptimo para las celulasas de T. fusca), la reacción es detenida y se determina el contenido de azúcares reductores. De forma alternativa, la actividad de celulasa sobre la CMC se mide con un método de viscosidad tal como se describe en Durbin y Lewis (1988) Methods in Enzymology, 160: 314-315.
C. Expresión de Genes de Celulasa dentro de Cloroplastos del Tabaco Ejemplo C1 Preparación de un gen quimérico que contiene la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca fusionada con un promotor 10 de gen T7 de bacteriófago y el terminador en el vector pC8 de transformación de plástido
El plásmido pCTE5 fue digerido con EcoRI, tratado con polimerasa de ADN Klenow para rellenar los extremos 3' recesivos, es digerido con NcoI y el fragmento de ADN de 1,5 kb resultante fue purificado con gel y ligado a un fragmento de ADN NcoI de 7,5 kb (extremo cohesivo)/XbaI (relleno) procedente del vector de transformación de plástido pC8 para crear el plásmido de pC8E5 (Figura 2). El pC8 (Dr. Pal Maliga, Rutgers University, sin publicar) es un derivado del vector de transformación de plástido pPRV111A (Zoubenko, O. V., Allison, L. A., Svab, Z., y Maliga, P. (1994) Nucleic Acids Res 22, 3819-3824, incorporado aquí al completo a modo de referencia; número de acceso GenBank U12812) que porta un gen de aminoglicósido-3'-adeniltransferasa que confiere resistencia a la espectinomicina bajo el control de promotor de gen psbA de plástido de tabaco y las secuencias de ARN no traducidas (UTR) psbA 5' y 3'. El extremo 3' de la casete aadA en el pPRV111A está flanqueado por un ADN de plástido de tabaco de 1,8 kb que contiene el gen tmV completo y una porción 5' del gen de rADN 16S, mientras que el extremo 5' está inmediatamente adyacente a una posición de clonación múltiple (EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SaII, PstI, SphI, HindIII) que a su vez está flanqueada por el ADN de plástido de 1,2 kb que contiene el gen ORF 70B y una porción del operón rps 7/12. Estas regiones homólogas de flanqueo sirven para dirigir la integración del ADN heterólogo interviniente en la región repetida inversa del genoma de plástido de tabaco en las posiciones de nucleótido 102.309 y 140.219 de la secuencia publicada del genoma de plástido de Nicotiana tabacum (Shinozaki, K. y col. (1986) EMBO J. 5, 2043-2049). El pC8 fue obtenido mediante clonación en las posiciones EcoRI y HindIII del poliligando pPRV111A, gen quimérico de E. coli uidA que codifica \beta-galacturonidasa (GUS) controlado por el promotor 10 de gen T7 de bacteriófago y por las secuencias terminadoras derivadas del vector de expresión pET21d (Novagen, Inc., Madison, WI).
Ejemplo C2 Preparación de un vector de transformación de plástido de tabaco modificado que contiene la secuencia codificadora de celulasa E5 de T. fusca fusionada con un promotor 10 de gen T7 de bacteriófago y el terminador diseñado para la transcripción de lectura reducida
El plásmido pC8 fue digerido con SpeI y NcoI y se aisló mediante purificación con gel un fragmento de 235 pb que contiene el promotor 10 de gen T7 y una porción del promotor de gen psbA divergente y 5' UTR, y fue clonado en las posiciones de restricción NcoI y SpeI del vector pGEM5Zf+ (Promega, Madison WI) para construir el plásmido pPH118. El pPH118 fue digerido con StuI y el fragmento de vector de 3210 pb fue purificado con gel y fue religado para construir el plásmido pPH119, que carece de la secuencia duplicada de 10 pb CGAGGCCTCG (posición StuI subrayada), la cual, mediante análisis de secuencia, fue descubierta en el plásmido pC8. La eliminación del fragmento StuI/StuI de 10 pb en el pPH119 fue verificada mediante secuenciamiento usando prímeros directos e inversos M13 universales.
Con el fin de obtener un fragmento de ADN no plástido para usarlo como espaciador entre el gen marcador seleccionable psbA/aadA y el promotor 10 de gen T7 de pET21d en el pC8, se digirió el vector lanzadera de levadura pRS305 (Sikorski, R. S., y Hieter, P. (1989) Genetics 122, 19-27; número de acceso GenBank U03437) con EcoRI y HincII y se aisló y purificó con gel un fragmento de 256 pb del gen LEU2 de Saccharomyces cerevisiae que codifica la secuencia. El plásmido pPH119 fue digerido con EcoRI y DraIII y se aisló y purificó con gel un fragmento de 2645 pb. El pPH119 fue digerido con EcoRI, tratado con polimerasa de ADN Klenow para rellenar el extremo saliente 3', fue digerido con DraIII y se purificó con gel un fragmento de 569 pb. Los tres fragmentos fueron ligados para crear el plásmido pPH120 en el que el fragmento de gen LEU2 es insertado entre los promotores 10 de gen T7 divergente y psbA del pPH119.
El vector de transformación de plástido pC+E5 (Figura 2) fue construido digiriendo el plásmido pPH120 con NcoI/EcoRI y purificando con gel un fragmento de 386 pb, digiriendo el plásmido pC8E5 con NcoI/HindIII y purificando con gel un fragmento de 1595 pb, digiriendo el pC8 con HindIII/EcoRI y purificando con gel un fragmento de 7287 pb, y ligando los fragmentos en una reacción de tres vías.
Ejemplo C3 Construcción de un gen de polimerasa de ARN T7 de bacteriófago dirigida a plástidos fusionado con el promotor PR-1a del tabaco
Para construir el pPH110 se ligaron un ligando sintético de oligonucleótidos que comprende una posición de restricción NcoI y un codón de inicio ATG seguido de los primeros siete codones de péptido tránsito del plástido del gen rbcS (que codifican la pequeña subunidad de carboxilasa de bisfosfato de ribulosa) y la posición de restricción PstI (cadena alta: 5'-CAT GGC TTC CTC AGT TCT TTC CTC TGC A-3'; cadena baja: 5'-GAG GAA AGA ACT GAG GAA GC-3'), un fragmento de ADN PstI/SacI de pCGN4205 (McBride, K. E. y col. (1994) PNAS 91, 7301-7305) que contiene el gen de polimerasa de ARN T7 (T7 Pol) fusionado en marco con la porción 3' de la secuencia codificadora del péptido tránsito del gen rbcS, un fragmento de ADN NcoI/KpnI de 0,9 kb del pCIB296 que contiene el promotor PR-1a del tabaco con una posición de restricción NcoI introducida en el codón de inicio (Uknes y col. (1993) Plant Cell 5, 159-169) y los fragmentos SfiI/KpnI de 4,9 kb y SacI/SfiI de 6,6 kb del vector de transformación binario de Agrobacterium pSGCGC1 (un derivado del pGPTV-Hyg que contiene el poliligando procedente del pGEM4 (Promega, Madison WI) clonado en las posiciones SacI/HindIII).
Ejemplo C4 Transformación biolística del genoma de plástido de tabaco
Se germinó semillas de Nicotiana tabacum c.v. "Xanthi nc" a razón de siete por placa en una disposición circular de 2,5 cm en un medio de agar T y fueron bombardeadas in situ 12-14 días después de la siembra con partículas de wolframio de 1 \mum (M10, Biorad, Hercules, CA) recubiertas con ADN de los plásmidos pC8E5 y pC+E5 básicamente como se ha descrito (Svab, Z. y Maliga, P. (1993) PNAS 90, 913-917). Las semilleros bombardeados fueron incubados en medio T durante dos días después de lo cual las hojas fueron escindidas y colocadas con el lado abaxial hacia arriba bajo una luz brillante (350-500 \mumol de fotones/m^{2}/s) sobre placas de medio RMOP (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. y Maliga, P. (1990) PNAS 87, 8526-8530) que contiene 500 \mug/ml de dihidrocloruro de espectinomicina (Sigma, St. Louis, MO). Los brotes resistentes que aparecen por debajo de las hojas decoloradas de tres a ocho semanas después del bombardeo fueron subclonadas en el mismo medio selectivo, se dejó que formaran callos, y los brotes secundarios fueron aislados y subclonados. La segregación completa de copias del genoma de plástido transformado a un estado homoplastídico en subclones independientes fue determinada mediante técnicas estándar de análisis de Southern blot (Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). El ADN celular total digerido con BamHI/EcoRI (Mettler, I.J. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5, 346-349) fue separado sobre geles de azarosa de Tris-borato (TBE) al 1%, fue transferido a membranas de nylon (Amersham) y fue evaluado con secuencias de ADN imprimadas aleatorias marcadas con ^{32}P que corresponden a un fragmento BamHI/HindIII de 0,7 kb del pC8 que contiene una porción de la secuencia dirigida a plástido rps7/12. Los brotes homoplastídicos fueron arraigados asépticamente en un medio MS/IBA que contiene espectinomicina (McBride, K. E. y col. (1994) PNAS 91, 7301-7305) y fueron transferidos al inverna-
dero.
Ejemplo C5 Introducción del gen quimérico PR-1a/T7 Pol en el genoma nuclear del tabaco mediante transformación de disco de hojas mediada por Agrobacterium
Se regeneraron plantas de tabaco NT-pPH110 resistentes a la higromicina tal como se ha descrito a partir de brotes obtenidos después del co-cultivo de discos de hojas de N. tabacum "Xanthi" y "NahG" con Agrobacterium GV3101 que porta el vector binario pPH110. Para cada línea transgénica se incubaron grupos de hojas duplicados de aproximadamente 2-3 cm^{2} durante 2 días en 3 ml de BTH (5,6 mg/10 ml) o en agua destilada esterilizada con una irradiación de aproximadamente 300 \mumol/m^{2}/s. El material de hoja fue cosechado, sometido a congelación flash y molido en nitrógeno líquido. El ARN total fue extraído (Verwoerd y col. (1989) NAR 17, 2362) y se llevó a cabo el análisis Northern blot tal como se ha descrito (Ward y col. (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094) usando una sonda de gen de polimerasa de ARN T7 radiomarcada. Las plantas de diecinueve líneas T1 NT-110X (historial genético de Xanthi) y siete líneas T1 NT-110N (historial genético de NahG) que muestran un intervalo de expresión de Pol T7 fueron transferidas al invernadero y fueron auto-polinizadas. La progenie que segrega 3:1 para el marcador de resistencia a la higromicina ligado fueron selladas y se seleccionó las líneas T2 homozigotas.
Ejemplo C6 Inducción de expresión de celulasa en plástidos de plantas transgénicas
Se usaron plantas homozigotas NT-110X y NT-110N que contienen el constructo PR-1a-ARN T7 Pol para polinizar líneas transformantes homoplastídicas de plástido Nt_pC8E5 y Nt_pC+E5 que portan los constructos de celulasa pC8E5 y pC+E5 heredados maternamente. La progenie Nt_pC+E5 x NT-110X ó NT_110N, y Nt_pC8E5 x NT-110X ó NT-110N F1 (que eran heterocigotos para la casete de expresión nuclear de polimerasa PR-1/T7 y homoplastídicos para la casete de expresión de T7/plástido de celulasa) fue germinada en el suelo. Después de alcanzar una altura de 20-40 cm, las plantas fueron rociadas con el compuesto inductor BTH para provocar la expresión regulada por T7 Pol del gen de celulasa E5 que se encuentra en los plástidos. El material vegetal fue cosechado justo antes de la inducción y a las 8 horas y después de 1, 2, 3, 7 y 14 ó 28 días tras la inducción, y fue sometido a congelación flash como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo C7 Determinación del contenido de mARN de celulasa E5 en plantas transgénicas
El ARN total fue extraído del tejido congelado de las plantas de control rociadas con BTH y con polvo humedecible y PR-1a/polimerasa T7 x plástido T7/celulasa, y se llevó a cabo un análisis Northern blot con muestras de 5 \mug tal como se ha descrito (Ward y col. (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094) usando como sonda un fragmento de ADN radiomarcado que contiene la secuencia codificadora de celulasa de E5. Se determinó la acumulación de mARN de celulasa de E5 relativa para cada tiempo cuantificando la radioactividad en bandas que se hibridan con la sonda de celulasa E5 radiomarcada con el fin de determinar la evolución con el tiempo de la inducción de mARN en pliegue. El material de la planta transgénica del ejemplo C6 muestra una acumulación de mARN de celulasa significativa en dicho ensayo después de la inducción, alcanzando un máximo a los 14 días tras la inducción. Antes de la inducción, no se detecta mARN de celulasa.
Ejemplo C8 Determinación del contenido de celulasa de plantas transgénicas
Con el fin de determinar la cantidad de celulasa presente en los tejidos de plantas transgénicas, se lleva a cabo un análisis Western blot quimioluminiscente (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y de Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, usando antisueros cultivados contra la proteína E5 y patrones de proteína E5 purificada (proporcionados por D. Wilson, Cornell University, Ithaca, N.Y.). El material de planta transgénica del ejemplo C6 muestra una expresión de celulasa y una acumulación significativas en este ensayo después de la inducción (aproximadamente el 0,3% de la proteína soluble total después de 14 días tras la inducción; no se detectó proteína antes de la inducción).
Ejemplo C9 Determinación de la actividad de celulasa en plantas transgénicas
Se cosecha material de hojas tal como se ha descrito anteriormente y es homogeneizado en una disolución tampón PC (fosfato 50 mM, citrato 12 mM, pH 6,5). Se prepara una curva patrón (de 10 nanomolar a 10 micromolar) diluyendo las cantidades apropiadas de 4-metilumbeliferona (MU, Cat. Sigma nº M1381) en disolución tampón PC. Se distribuyen alícuotas duplicadas de 100 \mul de cada patrón y alícuotas duplicadas de 50 \mul de cada muestra en pocillos separados de una placa de microtitulación de 96 pocillos. A continuación se añaden 50 \mul de 4-metilumbeliferil-b-D-celobiopiranósido 2 mM (MUC, Cat. Sigma nº M6018) preparados en disolución tampón PC a cada pocillo de muestra y la placa es sellada para evitar la evaporación e incubada durante 30 minutos a 55ºC o a otras temperaturas que oscilan entre 37ºC y 65ºC. Se detiene la reacción añadiendo 100 \mul de glicina/NaOH 0,15 M (pH 10,3) y se mide la emisión de fluorescencia a 460 nm con un fluorómetro de microplaca (longitud de onda de excitación = 355 nm).
Ejemplo C10 Inducción de la expresión de GUS en plástidos de plantas transgénicas
La línea transformante de plástido de N. tabacum "Xanthi" 4276P descrita por McBride y col. ((1994) PNAS 91: 7301-7305) fue polinizada mediante plantas homozigotas NT-110X6b-5 que contienen el PR-1a/polimerasa de ARN T7. El 4267P difiere del pC8 tan sólo en lo que se refiere a (a) el promotor usado para expresar el marcador aadA seleccionable (que presenta el promotor de gen de ARN ribosomal 16S en lugar del promotor de gen psbA usado en el pC8), (b) la presencia de una región 3' no traducida de un gen psbA entre el gen GUS y el terminador T7, y (c) la ausencia de un operador lac y de la secuencia de posición de restricción StuI duplicada en el promotor T7. Las plantas F1 procedentes de este cruce heterocigoto para la casete de expresión nuclear de polimerasa PR-1a/T7 y homoplastídico para la casete de expresión de plástido T7/GUS fueron germinadas en el suelo. Después de alcanzar una altura de 20 a 40 cm, las plantas fueron rociadas con una suspensión de polvo humedecible inerte o con una formulación del compuesto inductor BTH con polvo humedecible. Las plantas de control no transformadas cultivadas en el suelo al mismo tiempo, . tabacum "Xanthi", NT-110X6b-5 y 4276P, también fueron rociadas de forma similar. El material vegetal (una hoja para cada una de las tres plantas independientes de cada genotipo) fue cosechado justo antes de la pulverización y tras 8 horas, 1, 2, 3, 7 y 28 días después de la pulverización, y fue sometido a congelación flash tal como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo C11 Determinación del contenido de mARN GUS de plantas transgénicas
El ARN total fue extraído del tejido congelado de BTH y de plantas de control pulverizadas con polvo humedecible y de plantas PR-1a/polimerasa T7 x plástido T7/GUS, y se llevó a cabo el análisis Northern blot con muestras de 5 \mug de ARN tal como se ha descrito (Ward y col. (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094) usando como sonda un fragmento 5' radiomarcado de 500 pb del gen GUS. La acumulación de mARN GUS a cada tiempo fue determinada mediante la cuantificación de la radioactividad en las bandas que se hibridan con la sonda GUS radiomarcada, así como mediante el escrutinio de la fluorescencia de bromuro de etidio presente en la banda de ARN prominente que se hizo visible a partir del 3 días después de la pulverización y que se observó cómo co-migraba con la banda de ARN GUS que se está hibridando en los análisis de Northern blot. En el plástido se observó que el ARN GUS inducible químicamente alcanzó un nivel de pico de 14% del ARN total teñible con etidio (esto incluye todas las especies de ARN presentes en la planta, incluyendo el ARN ribosomal codificador no proteínico que constituye la mayor parte del ARN teñible de la planta) entre 7 y 28 días después de la inducción con BTH (véase la Tabla 1) y es mucho mayor (más de 1000 veces) que el pico de la acumulación de mARN GUS inducible químicamente para transformantes nucleares PR-1a/GUS.
Ejemplo C12 Determinación del contenido de proteína GUS en plantas transgénicas
Con el fin de determinar la cantidad de GUS presente en los tejidos de plantas transgénicas, se llevó a cabo el análisis quimioluminiscente Western blot (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y con Harlow y Lane (1988) Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, usando antisueros GUS, adquiridos en Molecular Probes, y patrones de proteína GUS purificados (Sigma). Las proteínas procedentes de material de hoja molido y congelado cosechadas como se ha indicado anteriormente fueron solubilizadas mediante extracción en Tris 50 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, PTT 1 mM, AEBSF 1 mM y DTT 1 mM y se analizó de 5 a 25 \mug de proteína en cada línea de geles de poliacrilamida al 10%. La acumulación de proteína GUS en las plantas de plástido transformado se mantiene más de 7-28 días e incluso más, y es extraordinariamente elevada (mucho mayor que el pico de acumulación de GUS del PR-1a/GUS nuclear), excediendo el 20% del total de proteína a los 28 días. En comparación, la acumulación de proteína GUS en los transformantes PR-1a/GUS nucleares alcanza el máximo un poco antes (aproximadamente a los 3 días de la inducción, en lugar de a los 7-28 días) y la acumulación de proteína no es sostenida, sino que disminuye hasta los límites de detección a los 28 días.
Ejemplo C13 Determinación de la actividad de GUS en plantas transgénicas
El tejido congelado de hoja fue molido en un mortero con una mano de mortero en presencia de nitrógeno líquido para producir un polvo fino. Los extractos de hoja fueron preparados en una disolución tampón de extracción de GUS (fosfato sódico 50 mM pH 7,0, Triton-X 100 al 0,1%, sarkosyl al 0,1%, beta-mercaptoetanol 10 mM) tal como ha sido descrito por Jefferson, R. A. y col. (1986), PNAS USA 83, 8447-8451. Las reacciones fueron llevadas a cabo en los pocillos de placas de microtitulación opacas mezclando 10 \mul de extracto con 65 \mul de tampón de ensayo de GUS (fosfato sódico 50 mM pH 7,0, EDTA 10 mM, Triton-X 100 al 0,1%, beta-mercaptoetanol 10 mM) que contiene 4-metil umbeliferil glucurónido (MU) en una concentración final de 2 mM en un volumen total de 75 \mul. La placa fue incubada a 37ºC durante 30 minutos y la reacción fue detenida mediante la adición de 225 \mul de carbonato sódico 0,2 M. Se determinó la concentración del indicador fluorescente liberado mediante la lectura de la placa en un lector de placas Flow Labs Fluoroskan II ELISA. Los valores de fluorescencia duplicados fueron promediados para cada muestra, y se restó la fluorescencia de fondo (reacción sin MUG) para obtener la concentración de MU de cada muestra. La cantidad de proteína en cada extracto fue determinada usando la técnica de ácido bicinconínico (BCA, Pierce Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante excepto en que los extractos de proteína fueron pretratados con iodacetamida (Sigma) para eliminar la señal de fondo provocada por el reductor (beta-mercaptoetanol) presente en el tampón de extracción. Se determinó la actividad específica para cada muestra y se expresó en pmoles de MU/mg de proteína/ minuto. Para cada muestra de tejido evaluada de un tiempo concreto tras la aplicación de BTH, se dividió la actividad específica de la muestra inducida por BTH por la actividad específica de la muestra de control anterior al tratamiento con BTH, dando lugar de este modo a la inducción de expresión GUS. (Véase la Tabla 1).
TABLA I pPH110X6b x 4276P: Inducción de ARN de GUS y Actividad de GUS por Pulverización con BTH
Días + BTH Actividad GUS Inducción de pliegue % ARN Total Inducción de pliegue
(pmol MU/mg/min) (actividad GUS) (ARN de GUS)
0,0 598 1 < 0,013 1
0,3 434 0,7 <0,013 24
1,0 14.516 24 0,108 959
2,0 230.031 380 0,873 1.897
3,0 456.486 749 2,663 2.396
7,0 2.424.725 3.999 7,745 2.875
28,0 1.922.466 3.106 24,596 3.392
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Lebel, Edouard
\hskip3.9cm
Heifetz, Peter 
\hskip3.9cm
Ward, Eric 
\hskip3.9cm
Uknes, Scott 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevas Plantas Transgénicas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Novartis Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 3054 Cornwallis Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Research Triangle Park
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NC
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 27709
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
COMPUTADORA: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/054.528
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 04-AGOSTO-1997
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/025.985
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-SEPTIEMBRE-1996
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Meigs, J. Timothy
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 38.241
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: CGC1884/PCT
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 919-541-8587
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 919-541-8689
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia iniciadora de la traducción de consenso para la expresión del gen uidA de E. coli en plantas, tal como sugiere Clontech".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGACCATG GTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia iniciadora de la traducción de consenso para la expresión del gen uidA de E. coli en plantas, tal como sugiere Joshi".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAACAATGG CT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Adaptador molecular usado para generar el vector pCGNSENX".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAAAG CATGCCGATC GG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Adaptador molecular usado para generar el vector pCGNSENX".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCCGATC GGCATGCTTT A 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Adaptador molecular usado en la fabricación de pCGN1761NENX".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCTAAAC CATGGCGATC GG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Adaptador molecular usado en la fabricación de pCGN1761NENX".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTCCGATC GCCATGGTTT A 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia adaptadora molecular usada en la fabricación del vector pCGN1761/CT".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGCTGGAA TTCCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia adaptadora molecular usada en la fabricación del vector pCGN1761/CT".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAATTCCA GCTGGCATG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Prímero E11".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCCCATGG ACGAAGTCAA CCAGATTCGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Prímero E12".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGTCGACG TTGGAGGTGA AGAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Prímero E21".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCGCCATG GCCAATGATT CTCCGTTCTA C 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Prímero E22".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGACGGTTC TTCAGTCCGG CAGC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Prímero E51".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCCCATGGC CGGTCTCACC GCCACAGTC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Prímero E52".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGACCTCC CACTGGGAGA CGGTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Prímero VAC1".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATGCCATGG GTGAGGCCTC CGAGCTGTTC C 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Prímero VAC2".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCGAGCTCT TACATAGTAT CGACTAAAAG TCCGGACTGG AGCTTGCTCC GCAC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Secuencia presente en el plásmido pC8 que incluye una posición StuI (Ejemplo C2)".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGAGGCCTCG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cadena alta del ligando de oligonucleótido usado en el Ejemplo C3".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATGGCTTCC TCAGTTCTTT CCTCTGCA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "Cadena baja del ligando de oligonucleótido usado en el Ejemplo C3".
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGAAAGAA CTGAGGAAGC 
\hfill

Claims (16)

1. Un método para producir etanol que comprende fermentar una planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una celulasa, en el que dicha planta es capaz de sobreexpresar dicha celulasa.
2. El método tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADN heteróloga que codifica una celulasa y que está integrada de forma estable en el ADN nuclear o de plástido de dichas plantas y que está bajo el control de un promotor inducible.
3. El método tal como se ha reivindicado en la reivindicación 2, en el que el promotor inducible es inducible por herida o es inducible químicamente.
4. El método tal como se ha reivindicado en la reivindicación 3, en el que el promotor inducible es seleccionado del grupo que consiste en los promotores PR-1, PR-2, PR-3, PR-4 y PR-5.
5. El método tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la celulasa es seleccionada del grupo que consiste en endoglucanasas, exoglucanasas y \beta-D-glucosidasas.
6. El método tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la celulasa deriva de una fuente no vegetal.
7. El método tal como se ha reivindicado en la reivindicación 6, en el que la celulasa es codificada por una región codificadora aislada a partir de una bacteria.
8. El método tal como se ha reivindicado en la reivindicación 7, en el que la bacteria es del género Thermomonospora.
9. El método tal como se ha reivindicado en la reivindicación 8, en el que la bacteria es Thermomonospora fusca.
10. El método tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la secuencia de ácido nucleico además codifica una secuencia dirigida.
11. El método tal como se ha reivindicado en la reivindicación 10, en el que la secuencia dirigida es una secuencia dirigida a vacuolas.
12. El método tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende las etapas de:
1.
proporcionar una planta transgénica tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;
2.
cosechar la planta de la etapa a);
3.
aplastar, moler o cortar la planta cosechada en la etapa b);
4.
añadir la planta de la etapa c) a un biorreactor.
13. El uso de una planta transgénica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una celulasa, en el que dicha planta es capaz de sobreexpresar dicha celulasa, en un método para la producción de etanol.
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