ES2250165T3 - Sitio de fijacion moduladora a canales de potasio para el escrutinio. - Google Patents

Sitio de fijacion moduladora a canales de potasio para el escrutinio.

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ES2250165T3 ES00949423T ES00949423T ES2250165T3 ES 2250165 T3 ES2250165 T3 ES 2250165T3 ES 00949423 T ES00949423 T ES 00949423T ES 00949423 T ES00949423 T ES 00949423T ES 2250165 T3 ES2250165 T3 ES 2250165T3
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Abstract

Utilización de cultivos celulares o de sistemas productores de proteínas, que contienen de un modo natural o por transfección la información genética para el canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3 y que traducen esta información genética en una proteína, para el descubrimiento de sustancias, que también modulan positivamente, es decir activan, como la retigabina, a este canal a través del sitio de fijación selectiva para retigabina.

Description

Sitio de fijación moduladora a canales de potasio para el escrutinio.
El invento se refiere a un nuevo sitio de fijación moduladora selectiva a canales de potasio, para el escrutinio y el descubrimiento de nuevas sustancias activas destinadas al tratamiento de enfermedades, que se han de atribuir a una hiperexcitación o a una falta de excitabilidad de células neuronales.
Los canales de potasio tienen unas funciones manifiestamente múltiples y variadas en células excitables y no excitables eléctricamente. A estas funciones, pertenecen, entre otras, el control del potencial membranal, la regulación de la secreción de insulina a partir de células \beta pancreáticas, el control de la liberación de citocinas a partir de linfocitos T, la regulación del balance de sales y de agua en células renales, y el control de la excitabilidad eléctrica y de la plasticidad sináptica en neuronas.
Por lo tanto, no es sorprendente que la actividad de los canales de potasio esté sujeta a un gran número de mecanismos de control, a los que pertenecen el potencial redox de una célula, las sustancias mensajeras secundarias calcio y ciclo-adenosina monofosfato (c-AMP), proteína-cinasas y -fosfatasas, y el potencial membranal.
Además, las estructuras de las proteínas de canales de potasio, que han sido caracterizadas hasta ahora, tienen múltiples variantes de diferentes motivos de base, y por consiguiente son muy heterogéneas. A causa de estas múltiples funciones, tampoco es sorprendente que se presenten diferentes canales de potasio de una manera ubicua en el reino vegetal y en el reino animal (1).
Mediante estas múltiples estructuras, en unión con la muy grande amplitud de banda de las vías de modulación, los canales de potasio se adaptan selectivamente a sus misiones heterogéneas. Las sustancias, que modulan selectivamente a canales de potasio, son medicamentos interesantes para un gran número de diferentes enfermedades. En la bibliografía se discuten canales de potasio como dianas para el tratamiento de la apoplejía, la epilepsia y la enfermedad de Alzheimer, en los casos de enfermedades psiquiátricas, en los casos de trastornos del sueño, en los casos de trastornos del ritmo cardíaco, en el caso de la diabetes del tipo II, en los casos de disfunciones osmóticas tal como en el caso de un glaucoma, en el caso del crecimiento de células tumorales, pero también en los casos de procesos inflamatorios y de trastornos del rendimiento de aprendizaje, en los casos de hipertensión sanguínea, debilidad de la vejiga y asma.
Hasta ahora, se pudieron implementar con éxito el tratamiento de la diabetes y el tratamiento de trastornos del ritmo del corazón y de la hipertensión sanguínea con medicamentos selectivos (1).
En 1998, Schröder y colaboradores informaron por primera vez que una insignificante influencia, debida a una mutación, solamente de un miembro de la gran familia de los canales de potasio, puede perturbar sustancialmente el frágil equilibrio entre la excitación y la inhibición en el caso de células excitables. En el caso de este canal determinado, se trata de un heterooligómero a base de las subunidades con las denominaciones KCNQ2 y KCNQ3. Por mutación de una de las dos subunidades, la función de este canal se reduce en aproximadamente un 25%. Esto conduce en los pacientes afectados a que éstos padezcan de ataques epilépticos ya en la edad de la lactancia (2).
Este canal es el primer canal de potasio, que pudo ser asociado inequívocamente a una enfermedad de un ser humano.
Schröder postuló que una modulación positiva de este canal debería provocar un fuerte efecto anticonvulsivo. Él sacó la conclusión de que, mediante aumento del nivel de la sustancia mensajera intracelular cAMP, se influye positivamente sobre la actividad del canal; él pudo mostrar en sus sistemas in vitro, que en el caso de un nivel aumentado de cAMP aumentaba realmente la actividad del canal.
Aproximadamente en la misma época, Wang y colaboradores (3) mostraron que el antes mencionado canal heterooligómero detectado en seres humanos, que consiste en KCNQ2 y KCNQ3, es la sustancia correlacionada molecular del canal M, descrito funcionalmente hace mucho tiempo.
El canal M es formado selectivamente sólo en células neuronales (2,3) y allí está acoplado, a través de proteínas de señales intracelulares (proteínas G), selectivamente en el sistema nervioso central a subtipos muscarinérgicos del receptor de acetilcolina. En un tejido periférico, no es expresado el canal. Mientras que los agonistas muscarínicos disminuyen la actividad del canal, ésta puede ser aumentada mediante antagonistas muscarínicos.
El agonista muscarínico pilocarpina provoca graves convulsiones en un animal. La extinción, resultante de ello, de las células, en las que se expresa el receptor muscarínico (y por consiguiente también el canal M), conduce a que los animales, después de este tratamiento, desarrollen epilepsias espontáneas.
Mediante otro agonista muscarínico, la oxotremorina, se puede provocar en un animal en dosis subletales un temblor esencial, que se asemeja al temblor de un paciente de Parkinson. Sustancias antagonistas muscarínicas se emplean clínicamente para el tratamiento de este temblor.
A partir de estas descripciones ejemplares queda claro que una modulación indirecta (provocada a través de receptores muscarínicos o causada por un aumento del nivel de cAMP) del canal M constituye una posibilidad muy interesante de intervenir en diferentes enfermedades.
En particular esto se puede describir más detalladamente para varias enfermedades.
Epilepsia
La enfermedad de epilepsia está caracterizada por la aparición repetida de ataques convulsivos. Ella aparece en la población con una prevalencia de 0,5-1%. Los ataques convulsivos epilépticos resultan de una sincronización anormal y de una descarga masiva de un gran número de células nerviosas en una unidad de células nerviosas, existente en el cerebro. Dependiendo de la participación de diferentes regiones del cerebro, esto da como resultado un trastorno transitorio, a modo de un ataque, del movimiento (convulsiones motrices), de la sensación, del comportamiento o de la capacidad de percepción (4).
El ataque convulsivo es, sin embargo, solamente un síntoma, que se puede provocar en principio en el caso de cualquier individuo, cuando es suficientemente fuerte el estímulo para la activación y la sincronización. Por lo tanto, la enfermedad de epilepsia está caracterizada por una sensibilidad aumentada a estímulos externos o internos para la sincronización y la activación. La excitabilidad y por consiguiente la sensibilidad de células nerviosas es mayor en el caso de pacientes epilépticos que en el caso de pacientes no epilépticos.
Hace poco tiempo se pudo mostrar, tal como ya se ha mencionado, que los canales de potasio, que se componen de las subunidades KCNQ2 y KCNQ3, controlan de una manera decisiva la excitabilidad de células nervio-
sas (2).
Ya una reducción de la función de estos canales en aproximadamente un 25% conduce en niños lactantes, que no disponen de suficientes mecanismos compensadores, a una epilepsia. Tal reducción débil de la función de este canal de potasio se detectó para una forma explicada genéticamente de la epilepsia, la BFNC (de benign familial neonatal convulsions = convulsiones familiares benignas de recién nacidos) (2).
Este canal de potasio es detectable solamente en el cerebro y en células nerviosas, pero no en otros tejidos (2,3).
En los casos de otras formas de la epilepsia, todavía no se pudo explicar la causa genética, pero la enfermedad va acompañada siempre con una excitabilidad elevada de unidades de células nerviosas. La terapia hasta ahora usual se aplica sintomáticamente. Agentes antiepilépticos ya introducidos, tales como carbamazepina, fenitoína y lamotrigina, actúan como bloqueadores de canales de sodio dependientes del aprovechamiento. Estos canales son necesarios para transmitir excitaciones celulares a lo largo de las fibras nerviosas.
Los bloqueadores de canales de sodio reducen la transmisión de excitaciones y actúan anticonvulsivamente de esta manera. La hiperexcitación, en que ésta se basa,, no es reducida. Otros agentes antiepilépticos, tales como fenobarbital, clonazepam, vigabatrina, topiramato o valproato, refuerzan la transmisión nerviosa inhibidora o reducen la transmisión nerviosa excitadora, es decir disminuyen la posibilidad de que una excitación se transfiera a otras células nerviosas. Tampoco aquí se influye sobre la causa de la enfermedad, la hiperexcitabilidad de células nerviosas individuales en que se basa, sino que se reduce la propagación de las señales. Los medicamentos, que sin embargo modulan positivamente de una manera selectiva al canal de potasio antes mencionado, pueden influir directamente sobre la excitabilidad de células nerviosas. Puesto que el canal es detectable solamente en un tejido neuronal, es de esperar para tales sustancias un efecto selectivo sin efectos colaterales sobre otros tejidos.
Enfermedad de Alzheimer
Tal como se ha mencionado, el canal de potasio, que consiste en las subunidades KCNQ2 y KCNQ3, constituye la sustancia correlacionada molecular del canal M (3). El canal M está acoplado negativamente a través de un estrecho acoplamiento con un subtipo del receptor de acetilcolina, el receptor muscarínico del sistema nervioso central. Los receptores muscarínicos situados fuera del sistema nervioso no están acoplados con el canal M. Una activación de receptores muscarínicos conduce a una reducción de la probabilidad de apertura de este canal, es decir a una reducción de la función.
Esto ya es aprovechado farmacológicamente. Por medio de una débil inhibición de la enzima acetilcolina-esterasa, que descompone a la acetilcolina, mediante medicamentos tales como el donepezil-HCl (Aricept®) se aumenta la concentración de acetilcolina en el cerebro, se activa el receptor muscarínico y con ello se modula negativamente
(= se inhibe) el canal de potasio.
Esto tiene como consecuencia un aumento de la excitabilidad de células nerviosas colinérgicas. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, se destruyen células nerviosas selectivamente colinérgicas, lo cual conduce a los conocidos síntomas de la pérdida de memoria (demencia). Mediante aumento de la excitabilidad de las células nerviosas colinérgicas remanentes, éstas pueden compensar la función de las células nerviosas extinguidas, con lo cual se contrarresta la pérdida de memoria.
Sin embargo, los inhibidores enzimáticos de la colina-esterasa tienen decisivas desventajas. Puesto que una trasmisión colinérgica de señales en todo el cuerpo desempeña un cometido importante, por tanto también en los músculos del esqueleto y en otros tejidos, y puesto que las sustancias inhiben en todos los sitios a la colina esterasa, se llega a un gran número de efectos colaterales tales como mareos, dispepsia, dolores de vientre, nauseas y/o vómitos, diarrea, anorexia y mialgia. Ocasionalmente aparecen también debilidad, ataxia, falta de sueño, disminución del peso y bradicardia.
Con el fin de orillar estas desventajas, se encuentra en la fase de desarrollo la sustancia linopirdina, que no influye sobre el sistema colinérgico, sino que bloquea al canal M (= KCNQ2 + KCNQ3) (3).
Sin embargo, este medicamento tiene la desventaja de que no presenta ninguna suficiente selectividad frente al canal M.
Se bloquean con similar afinidad ciertos canales, que desempeñan un gran cometido en la función del músculo cardíaco (miocardio), en particular el canal KCNQ1, pero también los canales eag1, erg1, erg3, elk1, Kv1.2 y Kv4.3, que están ampliamente propagados en el corazón y en otros tejidos (3).
La meta de la inhibición selectiva de KCNQ2/3 no se pudo conseguir por lo tanto con medicamentos que modulan el sitio de fijación de linopirdina.
También el nuevo ligando para el sitio de fijación de linopirdina, XE991, inhibe con una afinidad similar a los canales KCNQ1 y Kv.4.3, ambos de los cuales son importantes para la función del corazón. Un bloqueo de estos canales específicos para el corazón puede provocar trastornos fatales del ritmo, de modo que es dudoso un desarrollo ulterior de estas sustancias.
Enfermedad de Parkinson
También en los casos de otras enfermedades se pretende una modulación de receptores muscarínicos centrales para el tratamiento.
Así, ciertos antagonistas de receptores muscarínicos, p.ej. en el caso de la enfermedad de Parkinson, se emplean para el tratamiento de los síntomas de esta enfermedad, sobre todo del temblor. Igual que en el caso de la enfermedad de Alzheimer, sin embargo, tampoco aquí es suficiente la selectividad de ligandos de receptores muscarínicos para receptores centrales, y se llega a indeseados efectos colaterales por interacciones con receptores muscarínicos periféricos y con otros canales de iones y receptores. Puesto que ciertos receptores muscarínicos centrales están acoplados con el canal M, los activadores del canal M pueden ejercer esta función más selectivamente que los antagonistas muscarínicos. Sin embargo, estos medicamentos no fueron descritos todavía hasta ahora.
Enfermedades neurodegenerativas
Junto a las enfermedades antes mencionadas, la influencia sobre la excitabilidad de células nerviosas desempeña sin embargo un importante cometido también en el caso de enfermedades neurodegenerativas (5).
Una degeneración de células nerviosas aparece siempre que exista un desequilibrio entre el consumo de energía y la aportación de energía.
En el caso de un ataque de apoplejía, p.ej. falta la aportación de sangre, y las células nerviosas mueren. En el caso de hiperexcitaciones tóxicas, tal como en el caso del estado epiléptico o de la esclerosis lateral amiotrófica, las células, a causa de la hiperexcitación, consumen energía de una manera aumentada y ya no es suficiente el abastecimiento con nueva energía (5). Adicionalmente, por las células se segrega el neurotransmisor glutamato. Las neuronas ya no pueden mantener ni despolarizar el potencial membranal a causa de la concentración elevada de glutamato y del abastecimiento insuficiente de energía. Mediante la activación del canal KCNQ2/3, las células se hiperpolarizan y se pueden reponer de los noxos (sustancias y circunstancias nocivas) que se han descrito.
Una disminución selectiva de la excitabilidad de tales células nerviosas puede prevenir por lo tanto la extinción de células nerviosas. Sin embargo, hasta ahora, aparte de la disminución de la temperatura corporal, no había ningún método directo seguro para disminuir la excitabilidad de células nerviosas (5).
Mediante el descubrimiento de la importancia del canal KCNQ2/KCNQ3 para el control selectivo de la excitabilidad de células nerviosas, quedó claro que una activación de este canal puede prevenir daños para las células nerviosas.
Por las razones mostradas, se necesita una influencia selectiva sobre el canal con las subunidades KCNQ2 y KCNQ3, con el fin de conseguir, en el caso de la activación, un efecto selectivo, p.ej. anticonvulsivo, anti-Parkinson y neuroprotector, y, en el caso de la inhibición, un efecto selectivo reforzador de la memoria.
Junto a las enfermedades mencionadas, se puede influir sobre todos los estados, que van acompañados por una hiperexcitación o una falta de excitación de células nerviosas que son portadoras del canal M o se encuentran en sus campos de proyección.
Esta meta no se puede conseguir con los medicamentos ni con las estrategias de tratamiento hasta ahora existentes.
Conforme al invento se pudo mostrar, por fin, que el agente anticonvulsivo retigabina (fórmula I, 5, 6) activa, es decir modula positivamente, de una manera muy selectiva al canal que consiste en las subunidades KCNQ2
y KCNQ3.
Fórmula 1
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Hasta ahora no era posible una modulación positiva directa de este canal de potasio.
No se conocían sitios algunos de fijación moduladora, a los que puedan atacar ciertas sustancias con el fin de modular positiva o negativamente al canal.
Sustancias tales como linopirdina y XE991 (3), estaban solamente en situación del bloquear al canal.
Además, estas sustancias no son suficientemente selectivas, puesto que probablemente atacan en la zona de los poros de los canales, una zona, que es similar en todos los canales de potasio y es responsable de la selectividad del canal para iones de potasio.
Las sustancias, que influyen sobre el nivel de la sustancia mensajera cAMP, o las sustancias que influyen sobre el receptor muscarínico, ejercen solamente un efecto indirecto y no selectivo sobre el canal.
El efecto anticonvulsivo de la retagabina se puede atribuir a la activación de los canales de potasio (7,8).
La retigabina, que es un 2-amino-4-(4-fluorobencilamino)-1-etoxicarbonil-aminobenceno, y un procedimiento para su preparación, se describen por primera vez en el documento de patente EP 554.543.
Las investigaciones realizadas han puesto de manifiesto que la retigabina no presenta ningún efecto sobre un gran número de diferentes canales de potasio (véase la Tabla 1).
Éstos son en particular:
Kir1.1 (ROMK1), Kir2.1 (IRK1), Kir2.2 (IRK2), Kir2.3 (IRK3), Kir3.1 (GIRK1), Kir3.2 (GIRK2), Kir3.3
(GIRK3), Kir3.4 (GIRK4), TWIK1, heteromultímeros a base de GIRK1 y GIRK2, a base de GIRK2 y GIRK4, a base de GIRK2 y GIRK3, r-eag1, r-erg1, r-erg3 y canales de potasio dependientes de ATP (Kir6.2).
Por consiguiente, se pudo mostrar con la retigabina un sitio de fijación, que es altamente selectivo para el canal que consiste en las subunidades KCNQ2 y KCNQ3.
La retigabina activaba, además de ello, al canal homómero, que consiste exclusivamente en la subunidad KCNQ2. En células, que expresan solamente el canal homómero a base de la subunidad KCNQ3, se pueden medir solamente una corrientes eléctricas insignificantes (marginales), dependientes de la tensión eléctrica.
En estas células no se puede provocar ninguna corriente eléctrica mediante la aplicación de retigabina (véase la Tabla 1). Mientras que se pudieron detectar en células nerviosas canales heteromultímeros que consistían en KCNQ2 y KCNQ3 como sustancia correlacionada molecular del canal M, canales homomultímeros que consisten exclusivamente en subunidades de KCNQ2 o KCNQ3, se pueden preparar ciertamente de una manera artificial en sistemas de cultivos celulares, pero hasta ahora no fueron detectados. Se puede partir del hecho de que el canal heteromultímero, que consiste en KCNQ2 y KCNQ3, es la forma presente fisiológicamente de este canal de potasio, y que la retigabina activa selectivamente a este canal.
Esta es la comprobación efectuada por primera vez de que es posible una modulación positiva selectiva de este canal, es decir que el canal posee un sitio de fijación moduladora, que está situado fuera de los poros del canal.
Los sitios de fijación situados dentro de los poros del canal conducen a un bloqueo del canal, al efectuarse la fijación del ligando.
Los autores de este invento pudimos mostrar que el sitio de fijación para la retigabina está situado en la subunidad de canal KCNQ2.
Los canales homomultímeros, que consisten solamente en la subunidad KCNQ2, son activados por la retigabina, pero en células nerviosas solamente se pueden detectar canales heteromultímeros con las subunidades KCNQ2 y KCNQ3.
El efecto de la retigabina sobre estos canales heteromultímeros es muy fuerte y dependiente de las concentraciones.
Si sobre el canal se influye positivamente de modo máximo por adición intracelular de concentraciones saturadoras del estable compuesto análogo a cAMP 8Br cAMP (10 mm), como se describe en (2), entonces todavía se puede provocar una manifiesta activación por retigabina.
Los autores pudimos mostrar de esta manera que el efecto selectivo de la retigabina es independiente del contenido de cAMP en la célula.
Por lo tanto, mediante la retigabina se pueden provocar unos efectos, que van más allá de los efectos descritos por Schröder y colaboradores en (2).
TABLA 1 Efecto de la retigabina sobre diferentes canales de potasio clonados
Subunidad de canal de potasio Sistema de expresión Efecto de retigabina 10 \muM
Kir1.1 (ROMK1) Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
Kir2.1 (IRK1) Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
Kir2.2 (IRK2) Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
Kir2.3 (IRK3) Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
Kir3.1 (GIRK1) Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
Kir3.2 (GIRK2) Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
Kir3.3 (GIRK3) Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
Kir3.4 (GIRK4) Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
TWIK1 Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
GIRK1 \textamp GIRK2 Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
GIRK2 \textamp GIRK4 Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
GIRK2 \textamp GIRK3 Óvulos de ranas de uñas Ningún efecto
r-eag1 Células CHO Ningún efecto
r-erg1 Células CHO Ningún efecto
r-erg3 Células CHO Ningún efecto
KCNQ2 Células CHO Activación débil por adición de
retigabina 10 \muM (165 \pm 65 pA)
KCNQ2 Células CHO Ningún efecto
KCNQ2 \textamp KCNQ3 Células CHO Activación muy fuerte por adición de
retigabina 10 \muM (1.527 \pm 177 pA)
KCNQ2 \textamp KCNQ3, en presencia de Células CHO Activación fuerte por adición de
estables compuestos análogos a cAMP retigabina 10 \muM (1.100 - 1.400 pA)
Descripción del método para la Tabla 1
Para los ensayos con óvulos de ranas de uñas (= Xenopus laevis) se aplicaron mediante una inyección a presión en los óvulos, el valor empírico para transfecciones efectuadas con éxito, de desde 500 pg hasta 37 ng de la información genética multiplicada (ARNc) para el canal que se había de investigar mediante una reacción en cadena de polimerasa, presente en forma de clon, conocida de la bibliografía. Los oocitos se colocaron después de este tratamiento en un medio nutritivo y se mantuvieron con vida. Después de una semana, los óvulos se llevaron individualmente a una cámara de derivación y se investigaron electrofisiológicamente, mediante utilización del borne de tensión de 2 electrodos. En tal caso los óvulos se hiperpolarizaron y despolarizaron, partiendo de un potencial de retención de -80 mV en pasos de 10 mV hasta diferentes potenciales membranales comprendidos entre -130 y +30 mV en cada caso durante
2 segundos (s), y se midió la corriente eléctrica membranal resultante. Estos ensayos se llevaron a cabo en presencia de una solución testigo, así como de 1, 10 y 100 \muM de retigabina, y se compararon las curvas obtenidas de corriente y tensión eléctricas. En ninguna de las formulaciones investigadas se pudo influir mediante retigabina sobre la actividad del canal de potasio transfectado.
En el caso de los ensayos llevados a cabo en células CHO (de ovario de hámster chino) la sustancia genética para el canal a investigar se introdujo en la célula también mediante liposomas, la derivación mediante la técnica de "Patch clamp" (control en parche) se llevó a cabo a las 48-72 horas después de la transfección. Nuevamente, las células se mantuvieron a -80 mV y se hiper- y des-polarizaron en pasos de 10 mV desde -100 hasta +50 mV en presencia de una solución testigo o de retigabina. Adicionalmente, de modo correspondiente a un método ya descrito (Rundfeldt, 1999b) se añadió retigabina en la concentración de 10 \muM a células que se habían despolarizado ligeramente (-60 ó -50 mV), y se cuantificó la corriente eléctrica provocada de esta manera. Este último método fue utilizado con el fin de cuantificar las corrientes eléctricas provocadas por retigabina, que se representan en la tabla. En el caso de células, en las que se pudo activar una corriente eléctrica por adición de retigabina, es decir en células que contenían la subunidad KCNQ2 ó KCNQ2 juntamente con la KCNQ3, la curva de corriente y tensión eléctricas, que se había obtenido por hiper- / des-polarización escalonada,. se había desplazado en su activación hacia potenciales más
negativos.
De esto se deduce una apertura más temprana del canal y, vinculada con ella, una hiperpolarización de las neuronas. Con el fin de efectuar la comprobación de si es todavía posible la activación del canal KCQ2/3 (canal M), provocada por retigabina, cuando el canal está máximamente activado por c-AMP, tal como se describió en Schröder y colaboradores en 1988, en unos ensayos se añadieron a la solución contenida en pipetas una concentración saturadora del compuesto análogo a cAMP, 8-bromo-cAMP, 8-bromo-cAMP, no hidrolizable. También en estas circunstancias saturadas, la retigabina pudo activar fuertemente al canal.
Mediante utilización del sitio de fijación moduladora conforme al invento, se pueden buscar por fin nuevas sustancias que modulen o bien positivamente (activen), o también que modulen negativamente, al canal antes mencionado.
Una premisa para la provocación de un efecto, es la fijación de una posible sustancia activa a una sustancia propia del cuerpo, a la que se designa como receptor.
Mediante la fijación se debe provocar en este sitio de fijación una modificación de la conformación. La modificación de la conformación conduce a una modificación de la función del receptor afectado. Este proceso confiere al receptor el efecto propiamente dicho de la sustancia activa que se ha de ensayar.
Basándose en estos reconocimientos realizados, se pudieron constituir por fin diferentes sistemas de escrutinio, con los cuales se pueden encontrar ligandos todavía más selectivos o que actúan más intensamente para la activación o inhibición del canal M.
La implementación más sencilla de un sistema de escrutinio es un ensayo de fijación.
Para esto se necesitan un ligando marcado a través de isótopos ("caliente"), específico para el sitio de fijación que se ha de investigar, el mismo ligando en una forma no marcada ("fría") así como sustancias de ensayo que se han de investigar, y una formulación proteínica, que contiene el receptor.
Para la realización del ensayo de fijación, son obtenibles comercialmente, o se describieron múltiples veces, equipos y prescripciones de trabajo.
En primer lugar, la fracción proteínica para la saturación de sitios inespecíficos de fijación se mezcla con el ligando específico frío en una alta concentración. Después de haber separado por filtración y enjuagado la fracción proteínica, entonces se añaden a la fracción proteínica el ligando específico caliente en una cantidad definida y la sustancia a ensayar en diferentes concentraciones. Después de un período de tiempo de acción definido para la equilibración de ambas sustancias junto al sitio de fijación, el material sobrenadante se separa rápidamente por filtración, y nuevamente se eliminan por enjuagado las porciones no fijadas al receptor. Mediante medición de la radiactividad remanente o de una marcación de otro tipo del ligando específico en la fracción proteínica, se puede comprobar si el ligando específico se había expulsado por la sustancia a ensayar desde el sitio de fijación, y cuánta cantidad de éste se había
expulsado.
Cuando con una concentración creciente de la sustancia de ensayo disminuye la cantidad del ligando específico en la fracción proteínica, entonces hay que partir del hecho de que la sustancia de ensayo expulsa competitivamente al ligando específico de un modo dependiente de la concentración desde su sitio de fijación, y por consiguiente por si mismo es un ligando para este sitio de fijación.
Como ligando caliente y frío sirve una retigabina marcada y respectivamente no marcada, o un ligando caracterizado por retigabina, con unas propiedades fisicoquímicas todavía mejores.
Los ensayos de fijación son caracterizados en cuanto a su especificidad casi exclusivamente por los ligandos utilizados; sin ligandos específicos, no se pueden realizar ensayos de fijación.
La formulación proteínica puede tener diferentes fuentes, pero siempre tiene que contener el receptor que se ha de investigar, aquí el canal M. o partes del canal M que llevan el sitio de fijación, tales como la subunidad KCNQ2 o partes de ésta.
Es decisivo el hecho de que es posible una fijación competitiva del ligando específico a la proteína.
La proteína se puede obtener
\bullet
a partir de un tejido neuronal natural de seres humanos (después de su muerte (post mortem) o a partir de un tejido retirado quirúrgicamente) o de animales
\bullet
a partir de cultivos celulares que contienen el canal M, tales como el linaje celular diferenciado PC12 ó NG108-15, o a partir de linajes celulares humanos, tales como el linaje hNT
\bullet
a partir de cultivos celulares, que por una transfección transitoria o estable (= incorporación de información genética en la célula mediante métodos conocidos en la bibliografía) habían sido provistos de la información genética para la preparación de la subunidad de canal KCNQ2 a solas o en combinación con la subunidad KCNQ3, o con partes de la subunidad KCNQ2, y que traducen esta información en una proteína funcional
\bullet
a partir de otros sistemas que producen proteínas, tales como cultivos de células de levadura, cultivos de bacterias, plantas o cultivos de virus, siempre y cuando que en las levaduras, las bacterias, las plantas o los virus se haya implantado la información genética para la producción del receptor.
Los ensayos de fijación tienen la ventaja de que por empleo del ligando específico se hallan solamente sustancias, que se fijan al mismo sitio de fijación que el ligando específico. Por lo tanto, no son altos los requisitos establecidos en cuanto a la pureza de la fracción proteínica y se puede trabajar con un material natural, tal como un tejido cerebral.
Los ensayos de fijación están sin embargo limitados al mismo tiempo en cuanto a su poder informativo.
Así, solamente se puede comprobar si una sustancia que se ha de investigar se fija o no al sitio de fijación
(= receptor) dudoso.
Por el contrario, no se investiga si la sustancia provoca también un efecto mediante la fijación al receptor.
Teóricamente, siempre se pueden concebir sustancias que se fijan y no provocan ningún efecto (= ligandos neutros), sustancias que a través del receptor activan al substrato (aquí al canal M) (= agonistas), o sustancias que inhiben al substrato a través del receptor (= antagonistas).
Tal como antes se ha mencionado, los agonistas del canal M presentan interés, entre otras cosas, para la epilepsia, al contrario de lo cual los antagonistas del canal M presentan importancia p.ej. para la enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, es necesario utilizar ensayos funcionales para la caracterización del efecto de la sustancia de ensayo.
El método más seguro para la caracterización de ligandos de receptores consiste en las investigaciones electrofisiológicas en linajes celulares o cultivos celulares, tales como se han descrito para la retigabina (8). Estas investigaciones son muy costosas, puesto que cada célula individual debe ser derivada mediante electrodos de vidrio bajo un control de inspección.
La sustancia de ensayo y la de referencia (retigabina) se añaden a las células mediante sistemas especiales de aplicación, y se valora la influencia sobre la función celular dependiendo de la concentración aplicada de la sustancia de ensayo.
En los últimos tiempos, sin embargo, se describieron de manera acrecentada ensayos funcionales de escrutinio con alto caudal de paso de sustancias (hasta varios miles de sustancias por hora, del inglés High Throughput Screening, HTS).
Puesto que aquí, al contrario que el ensayo de fijación, se valora la función celular en comparación con el efecto del ligando específico (aquí retigabina o un ligando caracterizado por retigabina con propiedades fisicoquímicas todavía mejores) es necesario que el sitio de fijación a investigar se presente en el sistema en una forma genéticamente definida y al mismo tiempo como una unidad funcional. En el caso del sistema puede tratarse de cultivos celulares o de construcciones artificiales similares a células producidas artificialmente (membranas dobles de lípidos), con un receptor / canal almacenado funcionalmente. Los cultivos celulares deben expresar de una manera segura y reproducible el receptor a investigar (aquí el canal M) y deben incorporarlo funcionalmente en la membrana.
Además, se debe introducir un sistema reportero en las células o bien en construcciones similares a células, que indique de una manera segura y legible mecánicamente una activación o una desactivación del canal.
El cultivo celular no debe contener, junto al receptor (presente de un modo natural o incorporado por transfección), ningún canal/receptor adicional, o en lo posible solamente debe contener el menor número posible de tales canales/receptores adicionales con función similar o con íntima afinidad para el canal/receptor que se ha de investigar, con el fin de excluir ampliamente resultados falsamente positivos.
Como cultivos celulares, se pueden utilizar linajes celulares no neuronales, tales como la célula CHO o la célula HEK (de riñón embrionario humano) ampliamente propagada, pero también un gran número de otros linajes celulares, tales como p.ej. linajes celulares de insectos o linajes celulares humanos, cuando éstos habían sido provistos por transfección con el genoma para el canal M (KCNQ2/3) o también exclusivamente con la subunidad KCNQ2, y expresan funcionalmente a éste/ésta.
Se pueden utilizar también linajes celulares naturales, que lleven el canal M, tales como p.ej. el linaje celular PC13 (después de una diferenciación con el factor de crecimiento nervioso NGF) o el linaje celular NG108-15 (después de una diferenciación para dar el fenotipo neuronal), pero éstos acarrean consigo el riesgo de que junto con el canal M se expresen todavía otros canales de potasio con una característica similar.
Como sistemas reporteros son apropiados por ejemplo colorantes fluorescentes sensibles al calcio, añadidos externamente. Para que estos colorantes se puedan utilizar como un método indirecto para la detección de una despolarización, los sistemas celulares deben contener, junto a los canales de potasio a investigar, también canales de potasio activables de modo dependiente de la tensión eléctrica. Puesto que mediante una despolarización de células (p.ej. mediante un bloqueo del canal M) se activan canales de calcio y de esta manera afluye calcio dentro de las células, se pueden utilizar colorantes conocidos, que reflejen la concentración intracelular de calcio. También se pueden introducir por transfección genes de quimioluminiscencia en los linajes celulares que se han de utilizar. Las proteínas resultantes reaccionan a la afluencia de calcio con una quimioluminiscencia. Los agonistas del canal M se pueden detectar mediante el hecho de que la membrana se ha hiperpolarizada o de que se impide una despolarización inducida externamente. Unos colorantes dependientes del calcio indican que, a causa de la despolarización ausente en comparación con el testigo, no se presenta una afluencia de calcio.
Las antagonistas del canal M provocan por si mismos una despolarización medible y conducen a la afluencia de calcio. De esta manera se pueden encontrar tanto agonistas como también antagonistas del canal M en uno de tales sistemas. Para la cuantificación del efecto, es necesario que se emplee como testigo positivo un patrón conocido.
La retigabina es el primer agonista selectivo del canal M que se conoce.
En la presente solicitud de patente se hace referencia a la siguiente bibliografía:
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Claims (7)

1. Utilización de cultivos celulares o de sistemas productores de proteínas, que contienen de un modo natural o por transfección la información genética para el canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3 y que traducen esta información genética en una proteína, para el descubrimiento de sustancias, que también modulan positivamente, es decir activan, como la retigabina, a este canal a través del sitio de fijación selectiva para retigabina.
2. Utilización de cultivos celulares o de sistemas productores de proteínas, que contienen de un modo natural o por transfección la información genética para el canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3 y que traducen esta información genética en una proteína, para el descubrimiento de sustancias, que modulan negativamente, es decir reducen en su función, a este canal a través del sitio de fijación selectiva para retigabina.
3. Utilización de cultivos celulares o de sistemas productores de proteínas, que contienen de un modo natural o por transfección la información genética para el canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3 y que traducen esta información genética en una proteína, para el descubrimiento de sustancias mediante ensayos de fijación, que fijan a este canal junto al sitio de fijación selectiva para retigabina.
4. Utilización de formulaciones de células para la producción de fracciones de una formulación de células, que ya no contienen la información genética para el canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3, pero que contienen la proteína correspondiente a la información genética, para el descubrimiento de sustancias, que modulan positiva o negativamente al canal de potasio a través del sitio de fijación selectiva para retigabina.
5. Utilización de células o de formulaciones de células en sistemas de escrutinio automatizables para el escrutinio con alto caudal de paso mediando utilización de colorantes fluorescentes sensibles al calcio, o de genes de quimioluminiscencia como sistema reportero para el descubrimiento de sustancias, que modulan positiva o negativamente al canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o unión con la subunidad KCNQ3, a través del sitio de fijación selectiva para retigabina.
6. Utilización de formulaciones, que no contienen la información genética completa para el canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3, pero que contienen el componente de la información genética, que ha codificado el sitio de fijación para retigabina, o que contienen solamente la parte de la proteína, que contiene el sitio de fijación para retigabina, con el fin de constituir sistemas para el descubrimiento de sustancias, que modulan según una manera positiva o negativa al canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3 a través del sitio de fijación selectiva para retigabina.
7. Utilización de cultivos celulares o sistemas productores de proteínas, que contienen una parte de la información genética del canal KCNQ2 a solas o en unión con KCNQ3 en común con la información genética para partes de otros canales u otras proteínas, como información genética quimérica, y cuya traducción proporciona una proteína quimérica, que contiene el sitio de fijación para retigabina, para la constitución de sistemas para el descubrimiento de sustancias que modulan según una manera positiva o negativa al canal de potasio con las subunidades KCNQ2 a solas o en unión con la subunidad KCNQ3 a través del sitio de fijación selectiva para retigabina.
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Ghezzi et al. Functional up‐regulation of the M‐current by retigabine contrasts hyperexcitability and excitotoxicity on rat hypoglossal motoneurons
Pomierny et al. Inhibition of vesicular glutamate transporters (VGLUTs) with Chicago Sky Blue 6B before focal cerebral ischemia offers neuroprotection
Chen et al. Supraspinal contribution to development of both tonic nociception and referred mirror hyperalgesia: a comparative study between formalin test and bee venom test in the rat
Suryavanshi et al. Increased presynaptic excitability in a migraine with aura mutation
Huang et al. Aging is associated with an increase in dye coupling and in gap junction number in satellite glial cells of murine dorsal root ganglia
Beyeler et al. Stimulation of serotonin2C receptors elicits abnormal oral movements by acting on pathways other than the sensorimotor one in the rat basal ganglia
BRPI0806568A2 (pt) Uso de eslicarbazepina ou acetato de eslicarbazepina, e, composição farmacêutica
Joviano‐Santos et al. New insights into the elucidation of angiotensin‐(1–7) in vivo antiarrhythmic effects and its related cellular mechanisms
Miyazato et al. Locus coeruleus involvement in the effects of immobilization stress on the p13 midlatency auditory evoked potential in the rat
Bączyk et al. From physiological properties to selective vulnerability of motor units in amyotrophic lateral sclerosis
Ichisaka et al. Activity-dependent change in the protein level of brain-derived neurotrophic factor but no change in other neurotrophins in the visual cortex of young and adult ferrets
Piriyaprasath et al. Effects of stress contagion on anxiogenic‐and orofacial inflammatory pain‐like behaviors with brain activation in mice