ES2251722T3 - Procedimiento y aparato para la realizacion de analisis automatizados. - Google Patents

Procedimiento y aparato para la realizacion de analisis automatizados.

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Abstract

SE PRESENTA UN DISPOSITIVO PARA ANALIZAR UNA MUESTRA DE SANGRE COMPLETA. EL DISPOSITIVO COMPRENDE UNA ANALIZADOR DE HEMATOLOGIA CONVENCIONAL INTEGRADO CON UN ANALIZADOR DE CIOMETRIA DE FLUORESCENCIA. SE SUMINISTRA UN CONTROLADOR PARA CONTROLAR LOS ANALIZADORES, QUE OBTIENE Y UTILIZA LOS DATOS DE AMBOS ANALIZADORES Y EMITE UN RESULTADO CUANTITATIVO. TAMBIEN SE SUMINISTRAN METODOS PARA ANALIZAR UNA MUESTRA DE SANGRE COMPLETA. UNO DE TALES METODOS COMPRENDE LOS PASOS DE REALIZAR SOBRE UN INSTRUMENTO SIMPLE UN ANALISIS DE IMPEDANCIA ASOCIADA CON LA MUESTRA DE SANGRE COMPLETA, UN ANALISIS DE DISPERSION DE LA LUZ ASOCIADA CON LA MUESTRA DE SANGRE, Y UN ANALISIS DE LA FLUORESCENCIA ASOCIADA CON LA MUESTRA DE SANGRE. LOS DATOS SON RECOGIDOS Y UTILIZADOS. SE OBTIENE UN RESULTADO.

Description

Procedimiento y aparato para la realización de análisis automatizados.
Antecedentes
Esta invención se refiere en general a análisis de partículas. Más en concreto, se refiere a métodos y dispositivos para llevar a cabo análisis automatizado de células sanguíneas integrando análisis de "impedancia", "dispersión de luz" y "fluorescencia" y técnicas de citometría de flujo. Esta invención también se refiere a un sistema de reactivo multipropósito y un método para análisis rápido de una muestra de sangre entera.
La sangre periférica de un humano contiene generalmente glóbulos rojos (RBC), plaquetas (PLT), y glóbulos blancos (WBC), todos los cuales están suspendidos en un medio conductor denominado comúnmente plasma. El plasma incluye proteínas, aniones y cationes. El plasma también contiene componentes que contribuyen a la formación de coágulos de sangre.
La sangre en un adulto contiene generalmente de aproximadamente 4,5 a 5 millones de RBCs o eritrocitos por milímetro cúbico. Los RBCs maduros no tienen núcleos y tienen generalmente forma de discos circulares bicóncavos con un diámetro de aproximadamente 7,5 a 8 micras (\mu), y un grosor de aproximadamente 1,5 a 1,8 micras. Los RBCs contienen hemoglobina que da a la sangre su color rojo. La hemoglobina contribuye a transportar oxígeno y dióxido de carbono y desempeña un papel en el mantenimiento del pH de la sangre.
La sangre en un adulto contiene generalmente de aproximadamente 200.000 a 400.000 plaquetas por milímetro cúbico. Las plaquetas son pequeñas partículas celulares biconvexas cuyo volumen medio es de aproximadamente 7 \mul a 8 \mul. Su configuración general incluye una porción central granular embebida en una matriz homogénea.
La sangre periférica también contiene glóbulos rojos de niveles de maduración anteriores que son importantes indicadores de diagnóstico. Dos de estos son los reticulocitos y los glóbulos rojos nucleados.
En la primera etapa de desarrollo el glóbulo rojo consta en su mayor parte de núcleo, y se denomina un eritroblasto. Cuando el eritroblasto madura, el núcleo resulta más pequeño, anucleolado, y casi más esférico. La madurez siguiente implica una pérdida completa de núcleo. Los glóbulos rojos inmaduros que conservan un núcleo se denominan glóbulos rojos nucleados (NRBCs). El recuento de NRBCs ha sido útil en la monitorización de pacientes en muchos estados de enfermedad. Sin embargo, los NRBCs en sangre periférica contribuyen frecuentemente a una enumeración inexacta del recuento de glóbulos blancos, debido en parte a la presencia de un núcleo que los hace difíciles de distinguir de los glóbulos blancos pequeños.
Los reticulocitos son glóbulos rojos en el nivel de maduración entre NRBCs y RBCs maduros. Los reticulocitos proporcionan un medio de evaluar el estado anémico del paciente. La anemia se produce generalmente como resultado de un aumento no compensado de la velocidad de extracción de eritrocitos de la sangre, o una disminución de la velocidad a la que se forman y liberan a la sangre. Un recuento incrementado de reticulocitos en un paciente anémico indica renovación eritroide rápida que sugiere pérdida aguda de sangre o hemólisis.
En sangre humana normal, la concentración de glóbulos blancos, denominados WBCs o leucocitos, es mucho menor que la concentración de glóbulos rojos. La concentración normal de WBCs es aproximadamente 7000 por microlitro. Su tamaño varía, en muchos de ellos desde aproximadamente 7,5 a 12,5 micras de diámetro. Son de forma casi más esférica que los RBCs y generalmente de volumen algo mayor. Los WBCs se pueden clasificar en general en granulares o no granulares. Los WBCs granulares incluyen neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Los WBCs no granulares incluyen monocitos y linfocitos. Estas categorías de WBCs se suelen denominar colectivamente una "diferencial de cinco partes" y, en general, las más significativas de estas categorías son neutrófilos y linfocitos.
Los neutrófilos comprenden en general desde aproximadamente 50 a 60% de todos los WBCs. Su citoplasma contiene numerosos gránulos diminutos que pueden ser teñidos. En determinadas condiciones los neutrófilos pueden salir de los vasos sanguíneos y desintegrarse, liberando por ello gránulos a los tejidos conectivos. Estos gránulos son ricos en algunas enzimas que son activas y participan en el mecanismo de defensa del cuerpo.
Los linfocitos incluyen aproximadamente 30% de los WBCs en humanos. El núcleo de un linfocito normal ocupa casi todo el volumen de la célula, y así el citoplasma que rodea el núcleo es una envuelta bastante fina. El citoplasma linfocítico se puede teñir con colorantes debido al contenido de ácido ribonucleico del citoplasma.
Los linfocitos pueden salir de los vasos sanguíneos y entrar en el tejido conectivo donde también constituyen una parte del mecanismo de defensa del cuerpo, jugando un papel principal en las respuestas inmunológicas del cuerpo.
Hay tres "subconjuntos" principales de linfocitos que actualmente son clínicamente significativos: linfocitos T, linfocitos B, y células killer naturales, también denominadas "linfocitos granulares grandes" o células NK. Cada uno de estos subconjuntos se puede distinguir en base a la existencia de marcadores celulares superficiales distintivos o antígenos. Además, los linfocitos B tienen una alta densidad de inmunoglobulina de sus superficies, mientras que los linfocitos T tienen poca o nula. Los linfocitos T se caracterizan por varios marcadores superficiales contra los que se puede producir anticuerpos.
Se han identificado categorías de linfocitos T según sus marcadores superficiales y función general. Las células T helper ayudan a las células B a producir algunas clases de moléculas de anticuerpo, y ayudan a otras células T en sus respuestas inmunes. Las células T "supresoras" son células reguladoras que pueden suprimir la respuesta de otras células T o B. Las células T supresoras incluyen varios subconjuntos que son también reconocidos por distintos marcadores superficiales.
La capacidad de contar, calibrar y clasificar células sanguíneas es útil al evaluar la salud de un individuo. Por ejemplo, el nivel de linfocitos CD4 circulantes (células T helper que tienen un antígeno CD4 expresado en la superficie de la célula) es considerado actualmente el mejor predictor único de la progresión de las infecciones VIH. El nivel de CD4 se puede usar para clasificar individuos para alistamiento en regímenes de tratamiento experimentales, determinar cuando se deberá inicial terapia antiviral, y comprobar las respuestas al tratamiento en ensayos clínicos. Dado que los niveles de linfocitos CD4 pueden ser importantes para algunos individuos infectados con VIH, es deseable medir este parámetro con exactitud.
En el estado corriente de la técnica de análisis celular, se utilizan dos tecnologías para contar y clasificar células. Se denominan en general "citometría de flujo" y "citometría de imagen". La tecnología de la citometría de flujo, que consiste esencialmente en pasar células de una en una a través de una zona de detección de una celda de flujo, se prefiere en aplicaciones clínicas donde la carga de pruebas del paciente es una métrica importante. Esto se debe principalmente a que tiene al menos una ventaja de orden de magnitud en el número de células que se puede analizar por segundo.
La instrumentación que incorpora citometría de flujo se puede subdividir además en dos métodos que se pueden clasificar en general como "hematología convencional" y "citometría de fluorescencia".
Una distinción primaria entre los dos métodos es que la hematología convencional distingue en general las células por medio del tamaño y la forma usando sólo primariamente tecnologías de impedancia y dispersión de luz, mientras que la citometría de fluorescencia usa el contenido de ácido nucleico de las células y/o antígenos de superficie además del tamaño y la forma al distinguir células. Por lo tanto, el método de fluorescencia se puede usar para subdividir los tipos de células en clasificaciones más estrictas.
Una segunda distinción entre los dos métodos es que la hematología convencional da lugar a términos absolutos, mientras que los resultados de la citometría de fluorescencia son en términos relativos. Los analizadores hematológicos suministran volúmenes y diluciones exactos, y son así capaces de medir concentraciones absolutas de células, o recuentos absolutos de tipos de células por microlitro de sangre humana. El método de citometría de fluorescencia da solamente concentraciones relativas, o porcentajes de los varios tipos de células.
Una tercera distinción es que el método de hematología es generalmente automático, mientras que el método de citometría de fluorescencia tal como se practica en general hoy día, es a lo sumo semiautomático, tanto en la preparación de la muestra como en el análisis de la muestra. Por lo tanto, el método de citometría de fluorescencia requiere considerablemente mucha más mano de obra que el método hematológico.
Ambos métodos usan análisis célula a célula. Por lo tanto, debido a la alta concentración de células en sangre entera, hay que diluir las muestras de sangre antes del análisis de manera que las células individuales puedan ser aisladas para detección dentro de una celda de flujo.
Un ejemplo de un instrumento para llevar a cabo mediciones hematológicas automáticas es el instrumento Cell-Dyn® 3000, comercializado durante varios años por Sequoia-Turner, un predecesor en interés de Abbott Laboratories. WO 93/16384 incluye una descripción detallada de este instrumento y de un método para enumerar y cualificar selectivamente poblaciones de células heterogéneas en condiciones de procesado citolíticas. El instrumento Cell-Dyn® 3000 usa mediciones de "impedancia" para contar y calibrar RBCs y PLTs, mediciones de "absorción" para determinar la concentración de hemoglobina en RBCs (MCH), y mediciones de "dispersión óptica" para contar y clasificar WBCs y la diferencial de cinco partes.
El instrumento Cell-Dyn® 3000 prepara automáticamente muestras de sangre, mide parámetros celulares y genera resultados de prueba. La completa automatización de la preparación de la muestra es tal que no se requiere intervención sustantiva del operador una vez que la muestra de sangre entera del paciente ha sido presentada al analizador. Como se ha indicado previamente, para asegurar "recuentos de paciente" exactos para las varias clases de células, el instrumento Cell-Dyn® 3000 proporciona volúmenes de muestra, volúmenes de reactivo y volúmenes de dilución exactos. Los recuentos de paciente se definen en general como el número de "eventos" por microlitro de sangre. Los eventos pueden ser RBCs, PLTs, WBCs, y sus clases y subclases.
Otros dispositivos disponibles en el mercado para llevar a cabo mediciones hematológicas incluyen el Coulter® STKR, el Sysmex® NE8000, y el Technicon® H-1. Cada uno de ellos usa combinaciones de dispersión, impedancia, y absorción para distinguir y cuantificar células, y así se pueden clasificar como un instrumento hematológico convencional.
En contraposición, el citómetro de flujo de fluorescencia incorpora los principios del análisis de células por fluorescencia con la dispersión de luz. En general, esto requiere teñir la célula con un colorante de color apropiado, o unir una etiqueta de fluorocromo a un antígeno o anticuerpo en la superficie de la célula, indicando así la aparición de una reacción específica antígeno-anticuerpo.
En citometría de flujo de fluorescencia, una suspensión de partículas previamente teñidas o marcadas con fluorescente, típicamente células en una muestra de sangre u otro fluido biológico, es transportada a través de una celda de flujo donde las partículas individuales de la muestra son iluminadas con uno o varios haces de luz enfocados. Uno o más detectores detectan la interacción entre el (los) haz (haces) de luz y las partículas marcadas que fluyen a través de la celda de flujo. Es común que algunos de los detectores estén diseñados para medir emisiones fluorescentes, mientras que otros detectores miden la intensidad de dispersión o la duración del pulso. Así, cada partícula que pasa a través de la celda de flujo se puede correlacionar con un espacio de características cuyos ejes son los colores de emisión, intensidades de luz, u otras propiedades, es decir, dispersión, medidas por los detectores. Preferiblemente, las diferentes partículas de la muestra se pueden correlacionar con regiones distintas y sin solapamiento de los espacios de características, que permite analizar cada partícula en base a su aplicación en los espacios de características. A este respecto, la citometría de flujo difiere de los instrumentos hematológicos convencionales en que parte del eje del espacio de características incluye emisiones de fluorescencia.
Como se ha observado anteriormente, las subclases de linfocitos son determinantes de la salud. Así, es deseable medir con exactitud estos y otros parámetros. Aunque los instrumentos conocidos de hematología y citometría de flujo fluorescente han realizado avances significativos en la capacidad de caracterizar células sanguíneas, un problema que todavía existe en este campo es la dificultad de obtener valores exactos de recuento de paciente para algunas clases de células.
Un ejemplo de este problema es el recuento de células CD4 del paciente. Los métodos de análisis corrientes calculan el recuento de células CD4 del paciente a partir de parámetros celulares medidos en un instrumento de hematología y un instrumento separado de citometría de flujo de fluorescencia. Este cálculo puede proporcionar una variabilidad de hasta 100% en recuentos absolutos de CD4 de paciente realizados en un solo individuo con un intervalo de tiempo de una semana. Véase, por ejemplo: Update, Testing in the Blood Bank, Volumen 5, Nº 2, páginas 1 a 6, publicado en 1991 por Ortho Diagnóstico Systems, Inc.
Los artículos siguientes describen dificultades adicionales del desarrollo de recuentos de CD4 de paciente usando métodos y dispositivos corrientes;
*
The Lancet, Volumen 340, 22 agosto 1992, página 485, describe una variación de los resultados del recuento de CD4 cuando se usan diferentes analizadores. La variación parece derivar de diferentes resultados del recuento de linfocitos.
*
Journal of Infectious Diseases, 1990, Volumen 161, páginas 356 a 357, describe variaciones en el recuento de CD4 debido a variabilidad en la concentración referida de linfocitos. La variación resultante de resultados de CD4 tiene un efecto perjudicial en la moral del paciente.
*
Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 1990, Volumen 3, Nº 2, páginas 144 a 181, refiere grandes variaciones en el recuento de CD4 para sujetos VIH positivos y de control. La fracción de linfocitos positivo CD4 es relativamente constante, mientras que el recuento WBC y la fracción de WBCs que son linfocitos varían en gran medida. Esta variabilidad apunta a la necesidad de procedimientos de análisis estandarizados.
*
Laboratory Medicine, Agosto 1983, Volumen 14, Nº 8, páginas 509 a 514, describe numerosos resultados espurios y sus causas en analizadores hematológicos automatizados.
Una razón de la variabilidad de los recuentos de CD4 de paciente es la preparación manual de la muestra que no se puede controlar exactamente y depende de la competencia del operador. Por ejemplo, un procedimiento convencional para determinar un recuento de CD4 de paciente comienza con extraer dos tubos de sangre de un paciente. Un tubo se analiza en un instrumento de hematología que genera varios parámetros medidos y/o calculados para la muestra de sangre, incluyendo un recuento total de linfocitos del paciente, un porcentaje de linfocitos y un recuento total de WBC del paciente. El segundo tubo de sangre se analiza en un instrumento de citometría de flujo de fluorescencia. Los pasos de preparación de la muestra para las pruebas de citometría de flujo requieren mucha mano de obra y son dependientes del operador. Estos pasos no se prestan fácilmente a automatización y precisión.
Para preparar la muestra para el instrumento de citometría de flujo, el operador pipeta manualmente un volumen de sangre del tubo de muestra a un tubo de análisis. Se añade un volumen del anticuerpo monoclonal marcado con fluorocromo deseado. Después, se incuba la mezcla de muestra/anticuerpo durante un tiempo predeterminado a una temperatura predeterminada para permitir que tengan lugar las uniones anticuerpo/antígeno. Después de la incubación, el operador añade un volumen de reactivo lisante RBC para destruir los RBCs en la muestra. La temporización es importante durante la etapa de lisis. Si el operador no permite que la reacción de lisis continúe durante un tiempo suficientemente largo, pueden permanecer RBCs en la muestra y distorsionar las mediciones. Si el operador permite que la reacción de lisis continúe demasiado tiempo, el reactivo lisante puede atacar a los WBCs.
Después de determinar que la reacción de lisis ha terminado, el operador centrifuga y lava la muestra para quitar los residuos que queden sobre los RBCs lisados. El paso de centrifugación/lavado se puede realizar varias veces hasta que el operador quede satisfecho de que la muestra está suficientemente limpia. Residuos, "estroma" de glóbulos rojos, pueden interferir con los procesos de detección del citómetro de flujo típico. La muestra contiene ahora WBCs con anticuerpos unidos a células que llevan los antígenos de superficie complementarios. El operador vuelve a suspender la muestra en un volumen de fijador, y pasa después la muestra por el instrumento de citometría de flujo de fluorescencia.
El instrumento de citometría de flujo de fluorescencia genera solamente valores porcentuales para subconjuntos de linfocitos. Esto es debido al menos parcialmente al hecho de que numerosas diluciones manuales y reducciones de volumen realizadas durante los pasos de preparación de la muestra no permiten el aislamiento de un volumen de medición exacto. Así, el instrumento de citometría de flujo de fluorescencia identifica las células T helper positivas CD4 como el porcentaje de linfocitos que son positivo para CD3 (marcador de células T), y positivo para CD4 (marcador T helper).
Los recuentos de CD4 de paciente se calculan después usando las ecuaciones siguientes:
(%linf/100)X(recuento WBC) = recuento linf
(% T helper en linf/100) x recuento linf = recuento CD4
El recuento linf y los recuentos de WBC de paciente se toman del instrumento de hematología, mientras que el valor "% células T helper en linf" se toma del instrumento de fluorescencia después de aplicar un factor de corrección en base a la aplicación de dispersión y fluorescencia del citómetro de flujo.
Los métodos corrientes de calcular valores de recuento de paciente para subconjuntos de linfocitos tienen varios problemas. Ante todo, el cálculo se basa en valores obtenidos de instrumentos separados, cada uno de los cuales tiene su propia calibración y funciones generales separadas. Además, se puede usar diferentes métodos de verificación en los diferentes instrumentos.
No solamente son las mediciones de instrumentos de hematología diferentes de las mediciones de instrumentos de fluorescencia, sino que también puede haber variaciones en resultados obtenidos de diferentes instrumentos de hematología.
Los intentos anteriores de automatizar la preparación de la muestra en verificación de citometría de fluorescencia solamente han tenido éxito parcial. Tales sistemas todavía requieren que el operador realice pasos de preparación de la muestra tal como separar los linfocitos de otras células sanguíneas periféricas por centrifugación por gradiente de densidad, y/o lisar glóbulos rojos, quitar glóbulos rojos fantasmas y residuos celulares por centrifugación, o preservar la morfología de los glóbulos blancos restantes suspendiendo los glóbulos blancos en una solución salina isotónica conteniendo fijadores apropiados. Estas operaciones requieren en general que el operador altere manualmente el volumen de la muestra, poniendo así en peligro la exactitud del volumen de la muestra que se puede lograr con dispensadores de volumen mecánicos automáticos.
Otro problema de la técnica presente de hacer las mediciones en instrumentos separados es que se precisa un volumen relativamente grande de sangre del paciente para llenar dos tubos. Éste es un problema a causa de la mayor probabilidad de que la sangre se hemolice (se destruyan glóbulos rojos) cuando se extraen cantidades más grandes de sangre. Además, puede no ser aconsejable o posible extraer una cantidad suficiente de sangre de algunos pacientes.
En análisis de leucocitos, es deseable lisar todos los RBCs. Dado que el número de RBCs supera al de WBCs en aproximadamente 700 a 1, un pequeño número de glóbulos rojos no lisados puede distorsionar considerablemente los recuentos de glóbulos blancos del paciente. Algunos reactivos usados para lisar glóbulos rojos requieren un período de incubación demasiado largo para ser prácticos en un analizador clínico automático. Por ejemplo, la solución de Tris cloruro amónico tamponada recomendada por K. A. Murihead en Clinical Cytometry, Ann.N.Y. Acd. Sci., vol. 468, pp. 113-127 (1986), tarda aproximadamente 5 a 10 minutos en lisar glóbulos rojos, lo que puede no ser práctico para automatización.
Además, una hemólisis incompleta con algunos reactivos líticos puede dar lugar a estroma de glóbulos rojos que retienen suficiente hemoglobina o materia particulada para generar altos recuentos de fondo del paciente en sistemas electro-ópticos clínicos automáticos. Cuando esto ocurre, suele ser necesario sacar los WBCs a analizar del estroma de glóbulos rojos por centrifugación, un procedimiento que es un factor limitador al adaptar un sistema de reactivo para automatización.
Algunos sistemas de reactivo actualmente usados requieren tinción citoquímica de WBCs fijados antes del análisis diferencial. Estos sistemas requieren la adición temporizada de múltiples reactivos y períodos de incubación y pueden no ser adaptables en general a cuantificar glóbulos rojos nucleados o subconjuntos de linfocitos. Además, cada paso de adición de reactivo u otra manipulación de una muestra de sangre puede disminuir la precisión del recuento final obtenido del paciente.
La etapa anterior de RBC, el glóbulo rojo nucleado, NRBC, cuando se halla en la sangre periférica en analizadores hematológicos convencionales, se puede confundir con un linfocito pequeño, puesto que la lisis no destruirá el núcleo del NRBC. A causa de la relación de RBCs a WBCs, incluso un porcentaje relativamente pequeño de NRBCs puede conducir a error sustancial en el recuento de WBC y linfocitos. Esto puede ser problemático en muestras de neonatos o pediátricas, en las que la presencia de NRBCs en sangre periférica es una condición normal. Por esta razón, el laboratorio puede hacer inspecciones manuales en portaobjetos en algunas de estas muestras. Los analizadores hematológicos convencionales solamente son capaces de indicar estas muestras observando la dispersión del grupo usual de dispersión de linfocitos. La inspección manual da lugar a un recuento del número de NRBCs por 100 células nucleadas. Este porcentaje se usa después para corregir los recuentos del analizador WBC de la siguiente
manera:
recuento WBC corregido = recuento del analizador (1-porcentaje NRBC manual/100)
Es claro que se necesita un recuento automático exacto de NRBCs.
Otra clase importante de glóbulos rojos inmaduros son los "reticulocitos" que contienen típicamente cantidades detectables de ARN. Un método manual de identificar y contar reticulocitos implica precipitar el ARN con un colorante. Se extrae un frote de la sangre teñida y se examina manualmente al microscopio. El ARN precipitado aparece como puntos o filamentos intracelulares. El porcentaje de reticulocitos se determina contando manualmente 1.000 RBCs bajo un microscopio y dividiendo por 10 los cuantificados como reticulocitos. El recuento de reticulocitos del paciente se deriva del recuento de RBCs del paciente según la ecuación siguiente:
recuento de reticulocitos = (recuento de RBCs) x (reticulocitos por ciento)/100
Tanto la precisión como la exactitud de este método manual son inferiores a las deseables. Puede haber considerable variación de identificación de reticulocitos así como variación de las técnicas de recuento. Por consiguiente, se necesita un sistema de análisis de células que elimine las deficiencias antes descritas.
Resumen de la invención
La invención se define en las reivindicaciones independientes 1 y 17.
Se facilita un dispositivo para analizar una muestra de sangre entera. El dispositivo, un sistema de instrumentos automáticos para distinguir y diferenciar células en una muestra, incluye un analizador hematológico convencional plenamente integrado con un analizador de citometría de fluorescencia. Ambos analizadores son controlados por un controlador que utiliza los resultados obtenidos de cada analizador para referir resultados de prueba en términos absolutos o cuantitativos. También se facilitan métodos para analizar una muestra de sangre entera. Dicho método incluye los pasos de realizar automáticamente tanto análisis hematológico convencional como de citometría de fluorescencia en una muestra. Se recogen datos y se utilizan y se refiere un resultado cuantitativo cuando sea apropiado.
Otra realización proporciona un sistema de instrumentos automáticos incluyendo un manipulador de muestras para recibir un recipiente de muestras y aspirar y dispensar la muestra, un analizador de muestras que realiza dispersión de luz multiángulo y detección de señal de fluorescencia, y un controlador que integra plenamente el analizador para que el sistema de instrumentos pueda referir resultados cuantitativos de ambos resultados hematológicos convencionales y citométricos de fluorescencia. El sistema de instrumentos es capaz, además, de realizar estas funciones, secuencialmente si es necesario, sin intervención del operador del instrumento una vez que el operador ha seleccionado la serie de pruebas que realizará el instrumento de un menú presentado al operador, y sin separar células de la muestra durante ninguna fase del análisis.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema analítico celular según las ideas de la presente invención.
La figura 2 es un diagrama de bloques de una realización de un subsistema de software usado con el sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 3 ilustra una realización de una zona de procesado de muestras del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 4 es un diagrama más detallado de la zona de procesado de muestras representada en la figura 3.
La figura 4A es una vista en alzado frontal de un conjunto de ventilación/aspiración del sistema representado en la figura 4.
La figura 4B es una vista en perspectiva de un conjunto de sonda de incubación utilizado en el sistema de la figura 4.
La figura 5 ilustra una realización de un sistema de distribución de fluido del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
Las figuras 6A, 6B y 6C ilustran la sonda de incubación del sistema analítico celular durante la deposición, limpieza y aspiración.
La figura 7 es un diagrama que ilustra una realización de un sistema de aspiración y deposición del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 8 es un diagrama que ilustra una realización de un sistema de transferencia de incubación del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 9 es un diagrama que ilustra una realización de un sistema de administración de colorante de reticulocito del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 10A es un diagrama que ilustra una realización de un sistema de administración de muestra de impedancia del sistema analítico celular mostrado en la figura 1. En esta vista, las válvulas están abiertas, y la muestra se está transfiriendo a granel a la proximidad del transductor de impedancia mediante la bomba 220.
La figura 10B es un diagrama del sistema de administración de muestra de impedancia representado en la figura 10A. En esta vista, las válvulas están cerradas, y se está dosificando un volumen de la muestra al transductor de impedancia.
La figura 11A es un diagrama que ilustra una realización de un sistema óptico de administración de muestra del sistema analítico celular mostrado en la figura 1. En esta vista, las válvulas están abiertas, y la muestra se está transfiriendo a granel a la proximidad de la celda de flujo mediante la bomba 232.
La figura 11A es un diagrama del sistema óptico de administración de muestra representado en la figura 11A. En esta vista, las válvulas están cerradas, y un volumen de la muestra está siendo dosificado al transductor de celda de flujo óptico.
La figura 12 es un diagrama que ilustra una realización de un sistema de administración de muestras HGB del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
Las figuras 13A-13F son diagramas de temporización que ilustran una realización de un método integrado, automático, de procesado de muestras de hematología/inmunología del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
Las figuras 14A y 14B son ilustraciones de reticulocitos aislados como se describe en la sección 4 siguiente.
La figura 15 es un diagrama que ilustra una realización de un transductor de celda de flujo óptico del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 16 es una vista en sección de la celda de flujo óptico representada en la figura 15.
La figura 17 es un diagrama que ilustra una realización de un transductor de impedancia del sistema analítico celular de la figura 1.
La figura 18 es un diagrama que ilustra una realización de un transductor HGB del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 19 es un diagrama que ilustra una realización de un banco óptico del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 20 es un diagrama que ilustra el sistema de recogida de recorrido directo del banco óptico representado en la figura 19.
La figura 21 es un diagrama que ilustra el sistema de recogida de dispersión lateral del banco óptico representado en la figura 19.
La figura 22 es un diagrama del condensador del banco óptico representado en la figura 19.
La figura 23 es un diagrama del ventilador de rayos de la celda de flujo al cátodo del banco óptico representado en la figura 19.
La figura 24 es un diagrama del conjunto de lentes PMT del banco óptico representado en la figura 19.
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La figura 25 es un diagrama de bloques que ilustra una realización del módulo analizador del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 26 es un diagrama de bloques que ilustra una realización del módulo de adquisición de datos representado en la figura 25.
La figura 27 es un diagrama de bloques que ilustra otros detalles del módulo analizador representado en la figura 25.
La figura 28 es un diagrama que ilustra los depósitos de datos del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
Las figuras 29 y 30 son diagramas de estado que ilustran una realización de la arquitectura de software representada en la figura 28.
La figura 31 es una vista genérica en alzado de un aparato conteniendo una boquilla para introducir un fluido.
La figura 32 es una vista en perspectiva de la boquilla de la figura 31.
La figura 33 es una vista en sección de una porción de la boquilla de la figura 32, estando dispuestos los conductos representados en la figura 32 mutuamente paralelos para claridad.
La figura 34 es una vista en sección de una porción de la boquilla de la figura 32 ilustrando la introducción de fluido.
La figura 35 es una vista en sección sustancialmente similar a la de la figura 34 ilustrando la introducción de fluido.
La figura 36 es una vista en sección sustancialmente similar a la de la figura 35 ilustrando la introducción de fluido.
La figura 37 es un diagrama esquemático de un aparato de preparación de muestras aquí descrito.
La figura 38 es una vista parcialmente cortada de una porción del aparato de la figura 37.
La figura 39 es una vista parcialmente cortada de otra porción del aparato de la figura 37.
Las figuras 40A-40C ilustran datos visualizados para NRBC obtenidos por una realización del sistema analítico celular.
Las figuras 41A y 41B ilustran datos visualizados para NRBC obtenidos por una realización del sistema analítico celular.
La figura 42 es un diagrama esquemático de bloques del circuito de triple disparo descrito en la sección 2 siguiente.
La figura 43 es una ilustración de las configuraciones e interacciones del haz láser y corriente de flujo.
Las figuras 44A-44F son vistas en alzado lateral de porciones de una realización del sistema analítico celular de la figura 1.
Las figuras 45A-45F ilustran datos visualizados obtenidos con una realización del sistema analítico celular.
La figura 46 muestra un histograma de volumen de RBC obtenido con una realización del sistema analítico celular.
Las figuras 47 y 48 son ilustraciones de diagramas de dispersión de plaquetas obtenidos con una realización del sistema analítico celular.
Las figuras 49A y 49B ilustran divisiones de eventos detectadas por una realización del sistema analítico celular.
Las figuras 50A y 50B muestran valores ALL de células FL3 altas detectados por una realización del sistema analítico celular.
Las figuras 51A y 51B son ejemplos de una línea divisoria trazada con una realización del sistema analítico celular entre granulocitos y células mononucleares.
Las figuras 52A y 52B muestran ejemplos de un histograma y línea divisoria angular formados por una realización del sistema analítico celular.
La figura 53 ilustra un ejemplo de un histograma ALL y líneas divisorias obtenidas con una realización del sistema analítico celular.
La figura 54 ilustra una división trazada a un valor igual a la media de valores IAS más 2,5 veces una desviación estándar de los valores IAS por una realización del sistema analítico celular.
La figura 55 muestra una división trazada entre 1/4 y 3/4 de la distancia de líneas de separación de linfocito-estroma y linfocito-monocito formadas por una realización del sistema analítico celular.
La figura 56 presenta un histograma y una línea divisoria generada por una realización del sistema analítico celular.
La figura 57 presenta otro histograma y una línea divisoria generada por una realización del sistema analítico celular.
La figura 58 ilustra un ejemplo de un diagrama de dispersión de reticulocitos trazado por una realización del sistema analítico celular.
La figura 59 muestra un ejemplo de histograma de reticulocitos trazado por una realización del sistema analítico celular.
Las figuras 60A-60F ilustran un ejemplo de procesado de datos como se describe en el Ejemplo 6.
Las figuras 61A-61G ilustran ilustraciones de datos acumulados por una realización del sistema analítico celular.
Y las figuras 62A-62D ilustran una correlación entre fracciones de linfocitos que son positivos para CD3 y CD4, positivos para CD3 y CD8, positivos para CD19, y positivos para CD3 solo.
Las figuras 63A-63F son tablas que ilustran válvulas y funciones de válvula descritas en la sección 13F.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Realizaciones de la presente invención incluyen un sistema de instrumentos analíticos y un método para analizar muestras de fluido. En general, un sistema de instrumentos automáticos incluye un analizador hematológico convencional completamente integrado con un controlador y un citómetro fluorescente. El sistema de instrumentos es capaz de distinguir y clasificar células, por lo que los datos recogidos por el analizador hematológico son utilizados automáticamente por el citómetro fluorescente para procesar muestras, analizar muestras y clasificar células dentro de la muestra y referir resultados cuantitativos así como cualitativos.
El sistema de instrumentos automatizado aquí descrito combina o integra hematología convencional con citometría fluorescente en una sola plataforma analizadora. Hasta ahora, este acercamiento no ha sido posible. Ambos métodos se benefician de esta combinación única. La información de fluorescencia se mejora con la automatización total y las concentraciones absolutas. La información hematológica se mejora añadiendo citometría de fluorescencia a la tecnología de colorimetría, impedancia, y dispersión de luz multi-ángulo, permitiendo excelente hematología y automatización total de pruebas que actualmente se realizan manualmente, o en analizadores separados y distintos.
A los efectos de esta descripción, la automatización se distingue porque el operador no tiene que intervenir en el proceso de preparación de la muestra o análisis de la muestra, una vez que la muestra, es decir, sangre entera, orina, saliva, etc, ha sido presentada al instrumento. Además, todos los pasos y funciones de manejo, procesado y análisis de la muestra los realiza automáticamente el instrumento en base a las pruebas seleccionadas por el operador. Todos los datos y demás información perteneciente a cada muestra de prueba inicial son monitoreados, recogidos y procesados por el controlador de instrumento.
Las realizaciones de la invención incluyen en general un analizador hematológico automático y un analizador de citometría de flujo integrados con un controlador que verifica y controla los analizadores, recoge datos de los analizadores y refiere un resultado. Como ilustración a modo de ejemplo, la integración de los analizadores con un controlador permite al operador introducir datos acerca de una muestra de sangre entera en el controlador. El operador selecciona una serie de pruebas a realizar en la muestra, en general sangre entera, con la ayuda del controlador. El operador presenta la muestra de sangre entera a los analizadores integrados en una zona centralizada de manejo o procesado de muestra. El controlador activa los analizadores, dejando que los analizadores realicen automáticamente análisis en la muestra de sangre entera bajo la dirección del controlador. El controlador utiliza datos obtenidos de los analizadores para formular un resultado. El controlador refiere el resultado al operador. Se ha de notar que no se necesita ninguna acción del operador después de que la muestra de sangre entera ha sido presentada a los analizadores integrados. Dado que la preparación de la muestra de sangre entera está totalmente automatizada, en una realización preferida, primero se realizan pruebas hematológicas convencionales, siguiendo las pruebas de muestra incubada. Dado que los analizadores están integrados con el controlador, el controlador obtiene datos del analizador hematológico y el analizador de citometría de flujo. Así, el controlador es capaz de referir al operador un análisis combinado de sangre del paciente. Además, las concentraciones absolutas son referibles a causa de la precisión y repetibilidad de dilución, preparación de células y análisis automatizados. Se ha eliminado todo error humano porque el sistema de instrumentos es lo único que toca la muestra una vez que el operador ha programado el instrumento y colocado la muestra a bordo.
Aunque se explicará con detalle realizaciones específicas de la invención para esclarecer la comprensión, se ha de recordar que también son posibles otras realizaciones. También es posible cualquier combinación deseable de elementos de las realizaciones descritas.
1. Visión general del sistema
La figura 1 es un diagrama de bloques de un sistema analítico celular 60. El sistema 60 incluye un módulo analizador 64, un módulo de estación de datos 68, y una unidad neumática 72. El módulo analizador 64 está conectado operativamente al módulo de estación de datos 68 por un enlace serie de datos 76 que implementa un protocolo HDLC (enlace de datos de alto nivel). La unidad neumática 72 está conectada operativamente al módulo analizador 64 por un enlace serie de datos 84 y una red de tubos 80.
El módulo analizador 64 aspira muestras, diluyente y reactivos, diluye muestras, mide y recoge datos, transmite datos medidos al módulo de estación de datos 68, gestiona reactivos, y desecha residuos. Un módulo analizador ejemplar 64 incluye su propia fuente de alimentación, transductor de impedancia, transductor HGB, celda de flujo óptico/transductor (dispersión de luz y fluorescencia), detectores ópticos, circuitos electrónicos, depósitos de reactivo, sistema fluídico, procesador de muestras integrado y totalmente automatizado para pruebas tanto de hematología como de citometría fluorescente, y los sistemas necesarios de incubación y/o enfriamiento. Un módulo analizador ejemplar incluye un microordenador Motorola tipo 68302 que controla los componentes mecánicos del analizador 64 y ejecuta las secuencias de flujo del analizador.
La unidad neumática 72 aloja fuentes neumáticas para mover fluidos a través del módulo analizador 64. La unidad neumática 72 recibe instrucciones del módulo analizador 64 mediante dicho enlace serie de datos 84.
El módulo de estación de datos 68 proporciona controles generales al módulo analizador 64, convierte los datos medidos en resultados de prueba significativos, guarda los datos medidos y los resultados de prueba, imprime informes, y proporciona comunicación bidireccional con un ordenador central fuera de línea (no representado). Un módulo ejemplar de estación de datos 68 incluye un microordenador de tipo 80386 o 80486, pantalla en color, unidad de disco de 3 1/2 pulgadas, disco duro de al menos 540 megabytes, teclado tipo PC, puntero, y conexiones LAN. La estación de datos 68 incluye memoria, tal como una RAM, una ROM, una EPROM, una SRAM y análogos, que tienen suficientes algoritmos de software para manipular datos medidos, calcular parámetros, y visualizar resultados en varios formatos, incluyendo histogramas, diagramas de dispersión, y otros gráficos multidimensionales.
2. Sistema de reactivo multipropósito de lisis rápida
El sistema analítico celular 60 utiliza un sistema de reactivo multipropósito adecuado para el análisis rápido de células de sangre periférica nucleadas, incluyendo glóbulos blancos ("WBC") y glóbulos rojos nucleados ("NRBC"). El sistema de reactivo multipropósito puede lisar de forma sustancialmente completa y rápida glóbulos rojos, conservando al mismo tiempo sustancialmente la morfología de los glóbulos blancos y la antigenicidad de antígenos de superficie de linfocitos.
El sistema de reactivo multipropósito se describe plenamente en una Patente de Estados Unidos 5516695 titulada "Sistema de reactivo multipropósito para lisis rápida de muestras de sangre entera", presentada el 29 de agosto de 1994.
Una realización del sistema de reactivo multipropósito incluye desde aproximadamente 3 a aproximadamente 7 gramos por litro de una sal de amonio no cuaternario, desde aproximadamente 0,04 a aproximadamente 0,1% en peso en volumen (es decir, gramos por 100 ml) de un aldehído alifático con uno a cuatro carbonos, desde aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM de una solución tampón no fosfato que es sustancialmente inerte al aldehído alifático, y agua. El pH del sistema de reactivo está dentro de un rango de pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5 y la osmolaridad del sistema de reactivo es entre aproximadamente 160 y 310 (mOsm/L). El índice de refracción del sistema de reactivo puede ser similar al de la salina y deberá estar preferiblemente dentro del rango de aproximadamente 1,333 a aproximadamente 1,336. La solución tampón no fosfato es inerte al aldehído alifático en el que la solución tampón no fosfato no reaccionará con el aldehído alifático. Así, en general, la solución tampón no fosfato no deberá contener un grupo amino primario.
Otra realización del sistema de reactivo multipropósito incluye aproximadamente 135 mm de cloruro de amonio, aproximadamente 0,075% por volumen de formaldehído, aproximadamente 20 mM de solución tampón acetato, aproximadamente 10 mM de bicarbonato potásico, y aproximadamente 0,01% en peso en volumen (es decir, gramos por 100 ml) de saponina y análogos. El pH del sistema de reactivo se regula a aproximadamente pH 6,2 y la osmolaridad del sistema de reactivo es desde aproximadamente 267 a 270 mOsm/L.
El sistema de reactivo multipropósito se utiliza en la determinación automática de recuentos diferenciales de glóbulos blancos del paciente, glóbulos rojos nucleados, y inmunofenotipificación del linfocito. Un método para el análisis rápido de células nucleadas de sangre periférica entera incluye los pasos siguientes: mezclar el sistema de reactivo multipropósito descrito con una muestra de sangre entera anticoagulada (por lo que la sangre se diluye de 10 a 100 veces), mezclar la mezcla de diluyente-sangre a temperaturas desde aproximadamente 25°C a 46°C durante al menos aproximadamente 10 segundos, y analizar las células sanguíneas periféricas nucleadas con el sistema analítico celular automatizado de la presente invención.
Un método de usar el sistema de reactivo multipropósito en el análisis diferencial de glóbulos blancos periféricos es un método rápido de reactivo único de lisar simultáneamente glóbulos rojos y fijar glóbulos blancos, donde los glóbulos blancos mantienen sus características de dispersión de luz. En general, las células fluyen a través de una cámara de visión óptica donde un proceso de medición fotoeléctrico registra la luz absorbida o el tipo de luz dispersada por cada célula en ángulos seleccionados.
Un primer ingrediente del sistema de reactivo multipropósito es una sal de amonio no cuaternario. Preferiblemente, no se deberá usar sales de di- ni tri-amonio. Se puede usar varias sales de monoamonio, en particular las sales halogenadas, desde aproximadamente tres a aproximadamente siete gramos por litro, y preferiblemente a aproximadamente 5 gramos por litro. Los ejemplos de tales sales de amonio no cuaternario incluyen NH_{4}X, donde X es un halógeno. Dicha sal de amonio no cuaternario es NH_{4}CI.
Un segundo ingrediente del sistema de reactivo multipropósito es un aldehído alifático de cadena corta. Preferiblemente, tales aldehídos alifáticos tienen de uno a cuatro carbonos. Los aldehídos ejemplares incluyen formaldehído y el polímero paraformaldehído. En relaciones y concentraciones apropiadas, el aldehído, en unión con la sal de monoamonio no cuaternario, y la solución tampón, lisará rápidamente y de forma sustancialmente completa glóbulos rojos. Además, el aldehído fijará glóbulos blancos y conservará sustancialmente la integridad de su membrana. El formaldehído, o aldehído comparable, está presente en cantidades desde aproximadamente 0,04% a aproximadamente 0,10% en volumen, y preferiblemente desde aproximadamente 0,08% a aproximadamente 0,1% en volumen.
Un tercer ingrediente del sistema de reactivo multipropósito es una solución tampón no fosfato que es sustancialmente inerte al componente aldehído del sistema de reactivo. Así, la solución tampón no debe contener un grupo amino primario. La solución tampón también deberá tener una capacidad tampón efectiva entre un pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,5, y una osmolaridad de aproximadamente 230 a aproximadamente 310 mOsm/L. Los ejemplos de soluciones tampón orgánicas efectivas son solución tampón de acetato, solución tampón de succinato, solución tampón de maleato, y solución tampón de citrato. Los ejemplos de soluciones tampón biológicas efectivas son solución tampón de ácido 2-(N-morfolina) etano sulfónico (MES), solución tampón de ácido 3-(N-morfolina) propano sulfónico (MOPS), y solución tampón de ácido N-(2-hidroxietil) piperazina-N'-(2-etano sulfónico) HEPES. Un acetato, u otra solución tampón adecuada, estará presente en cantidades desde concentraciones de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM, y preferiblemente a una concentración de aproximadamente 20 mM.
Un componente opcional del diluyente de sangre multipropósito es un reactivo tensioactivo. El agente tensioactivo preferido es saponina, un extracto vegetal que está disponible en un polvo de calidad comercial aislado de corteza de quillaja así como otras fuentes. Aunque la pureza química de la saponina comercial varía de un lote a otro, es más selectiva hacia glóbulos rojos que son las sales de amonio cuaternario. La saponina, u otro reactivo tensioactivo, está presente en cantidades de desde aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg/l, y preferiblemente a aproximadamente 100 mg/l. La saponina, en concierto con los otros ingredientes del sistema de reactivo multipropósito, lisa de forma sustancialmente completa los glóbulos rojos presentes en sangre entera.
La fracción de eritrocito (es decir, glóbulos rojos) de muestras de sangre normales se lisará normalmente dentro de aproximadamente 20 segundos a temperaturas ambiente. Sin embargo, las muestras de sangre difíciles de lisar (tales como muestras de sangre de bebés, pacientes con diálisis de riñón, pacientes con mieloma múltiple, diabéticos, o pacientes con uremia, por ejemplo) requieren incubar la sangre con el sistema de reactivo a temperaturas de aproximadamente 38°C a aproximadamente 40°C durante hasta aproximadamente 20 segundos para lisis completa del eritrocito. La incubación de muestras de sangre con el sistema de reactivo multipropósito, incluso a estas temperaturas ligeramente elevadas, preserva efectivamente la integridad de la membrana de los glóbulos blancos y retiene la antigenicidad de los antígenos de superficie de linfocitos. En contraposición, si se utiliza saponina por sí misma para lisar los glóbulos rojos, se debería usar a una concentración de aproximadamente 10 a 20 veces más alta que las explicadas anteriormente. Tales concentraciones pueden poner en peligro la integridad de los glóbulos blancos y requerir un enfriamiento rápido de la actividad lítica del reactivo para preservar la morfología de los glóbulos blancos. Una ventaja de las realizaciones de este sistema de reactivo es que los constituyentes combinados del sistema de reactivo multipropósito sirven para fijar suavemente los glóbulos blancos al mismo tiempo que se lisan los glóbulos rojos. Por lo tanto, la integridad de los glóbulos blancos se preserva sustancialmente incluso en períodos de incubación relativamente largos. De hecho, incluso los glóbulos blancos frágiles, tal como los vistos en pacientes de leucemia linfocítica crónica, se estabilizan en el sistema de reactivo multipropósito durante períodos de incubación de hasta aproximadamente 20 minutos.
Un ingrediente opcional adicional del sistema de reactivo multipropósito es una sal álcali, preferiblemente una sal álcali monovalente de bicarbonato. Aunque una sal álcali monovalente de bicarbonato no es un componente esencial del diluyente, se puede añadir al diluyente para elevar su osmolaridad sin reducir la lisabilidad de los glóbulos rojos del sistema de reactivo. Otros muchos compuestos, tal como cloruro sódico, cloruro de potasio o solución tampón de fosfato, disminuyen la lisabilidad del sistema de reactivo cuando se utilizan para incrementar la osmolaridad del sistema de reactivo. Sales álcali monovalentes ejemplares de bicarbonato son bicarbonato potásico, bicarbonato sódico, bicarbonato de litio y análogos. El bicarbonato potásico, u otra sal álcali de bicarbonato, puede estar presente en cantidades de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 0,015% en peso en volumen, y preferiblemente a aproximadamente 0,01% en peso en volumen.
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Otro ingrediente opcional del sistema de reactivo multipropósito es un agente anticoagulación de plaquetas. Por ejemplo, se puede añadir un etilendiaminetetraacetato (EDTA) sal al sistema de reactivo para reducir la agregación de plaquetas en la mezcla de muestra/reactivo. EDTA tetrasódico, u otra EDTA sal, está presente en cantidades desde aproximadamente 20 a aproximadamente 200 mgs por litro y preferiblemente a aproximadamente 100 mgs por litro.
Otra realización del sistema de reactivo multipropósito permite el análisis cuantitativo de subpoblaciones de linfocitos. La subclasificación de linfocitos se logra mezclando anticuerpos monoclonales fluorocromo-conjugados (dirigidos a antígenos específicos de superficie de linfocitos) con muestras de sangre entera antes de añadir el sistema de reactivo multipropósito, o diluyente de sangre. La concentración de fracciones de anticuerpo marcadas añadidas a una muestra de sangre depende de la preparación de anticuerpos individuales, pero es comúnmente de aproximadamente la mitad a una décima parte del volumen de la sangre para preparados de anticuerpos comerciales. Después de añadir el sistema de reactivo y lisar los glóbulos rojos, los productos de reacción linfocito-anticuerpo se pueden analizar en un sistema de citometría de flujo automatizado. No hay que "separar" los linfocitos de las células lisadas por centrifugación y lavado como es común en la técnica.
El sistema de reactivo descrito no "enfría" los marcadores fluorescentes, tal como isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE), que se utilizan para anticuerpos marcados con fluorocromo. La subclasificación de linfocitos es una herramienta de diagnóstico en la lucha contra muchas enfermedades, tal como SIDA. La capacidad de identificar marcadores superficiales en poblaciones de células sanguíneas puede ser importante cuando se une al conocimiento de los componentes de superficie y las características de subpoblaciones de linfocitos y otras fracciones de glóbulos blancos tal como monocitos y neutrófilos.
3. Diferenciación de glóbulos rojos nucleados y reactivo
El sistema analítico celular 60 utiliza un método automático para análisis simultáneo de WBC/Dif y NRBC en una muestra de sangre entera usando un método único de disparo triple con reactivo lisante; tal como el sistema de reactivo de lisis rápida descrito anteriormente. Este método, reivindicado en U.S. 5.559.037, titulada "Método para análisis rápido y simultáneo de glóbulos rojos nucleados", y presentada el 15 de diciembre de 1994 permite los recuentos NRBL exactos y datos WBC/Dif, simultáneamente de una muestra de sangre entera conteniendo NRBC.
Un aspecto importante del método NRBC es que las señales de residuos (tanto fluorescentes como no fluorescentes) se bloquean por el método de disparo triple y las señales que caen por debajo del disparo ALL pero por encima del disparo FL3 se pueden identificar y contar como NRBC. Por lo tanto, se obtienen recuentos exactos de NRBC, esencialmente libres de contaminación de residuos nucleares fluorescentes. También se puede detectar blastos frágiles y células muertas (no viables) utilizando los métodos de esta invención.
En el método de disparo triple, es posible contar con precisión simultáneamente WBC/Dif y NRBC mezclando la muestra de sangre con un diluyente de sangre que lisa rápidamente RBC y preserva WBC, y al que se ha añadido un colorante nuclear adecuado que teñirá núcleos desnudos de los NRBC. Tal diluyente se describe anteriormente. La mezcla de diluyente/muestra se pasa después, esencialmente una célula cada vez por una celda de flujo óptico iluminada. Esto hace que las células dispersen la luz iluminante y que los núcleos teñidos presentes fluorescan. Las señales de luz dispersada y fluorescente son detectadas por medios conocidos y, utilizando el método de disparo triple en unión con el procesado de las señales detectadas, es posible identificar y cuantificar WBC, WBC/Dif y NRBC.
El método de disparo triple es único porque el análisis simultáneo de WBC/Dif/NRBC se puede llevar a cabo automáticamente, con exactitud, y rápidamente sin interferencia de otros residuos celulares tales como ARN de reticulocitos lisados, cuerpos de Howell Jolly, plaquetas reticuladas, plaquetas gigantes, ADN de WBC y fragmentos megacariocíticos, parásitos, y fragmentos RBC.
El método de disparo triple también permite el análisis exacto de WBC/Dif en una muestra de sangre que contiene NRBC restando señales identificada como NRBC de las señales WBC totales antes de realizar análisis WBC/Dif. Solamente se necesita un colorante para tinción de NRBC y el análisis WBC/Dif se puede realizar por la diferencia de las características de dispersión de luz de las subclases de WBC.
El método NRBC logra todos los objetivos descritos anteriormente por un método único de disparo triple en el espacio tridimensional de Pérdida de Luz Axial (ALL), Ángulo de Dispersión Intermedio (IAS) y Fluorescencia Roja (FL3).
Para realizarlo, se colocan preferiblemente uno o varios detectores 380 (figuras 19, 20 y 21) en el recorrido directo de luz para medir la dispersión directa de ángulo intermedio (IAS) 384 y la dispersión directa de ángulo pequeño (SAS) o pérdida de luz axial (ALL, también denominada extinción directa) 382.
ALL es generalmente la disminución de energía luminosa debido a una célula que pasa delante de un haz láser y que se detecta por un fotodiodo. La pérdida de luz se debe generalmente a dispersión y se define como la disminución de energía luminosa que llega a un detector en el recorrido de un haz láser debido al paso de una célula a través de dicho haz (en general ALL se detecta en un ángulo de desde aproximadamente 0° a aproximadamente 1°). En contraposición, la dispersión directa de ángulo pequeño (SAS) es energía luminosa que llega a un detector fuera de (pero dentro de un ángulo estrecho de aproximadamente 1° a 3°) el haz láser incidente debido a dispersión de una célula que pasa por el haz. Se dispone generalmente un tope de haz para evitar que el haz láser llegue al detector. Los sistemas de medición ALL recogen luz dentro del cono incidente de iluminación láser, mientras que los sistemas de dispersión de ángulo pequeño recogen luz fuera de este cono. En los sistemas de medición ALL, la señal de interés es una señal negativa restada de la señal láser de régimen constante, mientras que en la medición de dispersión directa de ángulo pequeño la señal es una pequeña señal positiva impuesta a un nivel de luz de fondo muy bajo. La dispersión directa de ángulo intermedio (IAS) es similar a la dispersión directa de ángulo pequeño, a excepción de que la luz se dispersa en un ángulo más grande del haz láser incidente. Más específicamente, IAS se refiere a luz dispersada en un aro entre aproximadamente 3° y 10° lejos de la línea incidente o central de un haz láser. En una realización preferida, ALL se recoge en los ángulos inferiores a aproximadamente 0,3° horizontalmente e inferiores a aproximadamente 1,2° verticalmente del eje del láser, y AS se recoge a ángulos entre aproximadamente 3° y 10° del eje del láser.
Otra ventaja técnica del sistema descrito es que requiere mucha menos concentración del colorante para teñir efectiva y rápidamente NRBC para detección y recuento exactos a causa de que la lisis completa del citoplasma de NRBC hace sus núcleos más accesibles al colorante. Esta condición permite una relación alta de señal a ruido (S/N), superior a 100, en detección NRBC. La concentración de un colorante vital requerido en este sistema para realizar rápidamente el análisis simultáneo de WBC/Dif/NRBC es solamente 1 a 2 \mug/ml que es al menos 50 veces menos que en la técnica anterior.
Los colorantes vitales (colorantes nucleares que tiñen solamente células muertas o dañadas) que se puede usar en la presente invención, pueden ser cualquier colorante vital con coeficiente de extinción relativamente alto y baja intensidad de fluorescencia cuando no están unidos a ácido nucleico. Las características espectrales, es decir, Extinción (EX) max. (nm)/Emisión (EM) max. (nm), de los colorantes vitales deben ser compatibles con la fuente de luz láser utilizada en el sistema.
Son deseables las características siguientes de los colorantes vitales para el sistema descrito:
Alto coeficiente de extinción.
Alto rendimiento cuántico.
Alta afinidad de unión a ácido nucleico.
Baja fluorescencia cuando no se une a ácido nucleico.
Compatibilidad de características espectrales de la fuente de luz (por ejemplo, EX max.-488 nm y EM max. - 630 nm con una fuente de luz láser de argón).
Son varios los colorantes nucleares cualificados para uso en el sistema descrito con fuente de luz apropiada. Algunos de los colorantes comercializados que se puede usar en el sistema descrito son YOYO-1, YOYO-3,
TOTO-1, TOTO-3, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1, y muchos más. Los expertos en la técnica saben que los colorantes con diferente EX max pueden ser excitados con una fuente de luz apropiada tal como lámparas de He-Ne, xenón o mercurio.
Los colorantes que se puede usar con un láser de argón también comercializados son yoduro de propidio (PI), bromuro de etidio (EBr), homodímero de etidio-1 (EthD-1), homodímero de etidio-2 (EthD-2) o dietilen triamina (DTA).
En una aplicación del método NRBC, el colorante vital usado es PI.
Una porción de una muestra de sangre entera, aproximadamente 25 microlitros, se deposita por medio de una sonda de aspiración de muestra en la copa WBC 138 que contiene aproximadamente 850 microlitros de un reactivo lisante isotónico. Se utiliza un reactivo lisante antes descrito para lisar la fracción de eritrocito de la muestra de sangre y para lisar el citoplasma de NRBC para exponer los núcleos de NRBC presente. Este sistema de reactivo se caracteriza porque realiza un proceso de un reactivo/un paso que logra finalidades multipropósito. Este reactivo es suficientemente suave para preservar la morfología de todos los glóbulos blancos frágiles, y al mismo tiempo lisar eficientemente todos los glóbulos rojos. Estas dos finalidades se realizan incluso en muestras hemaglobinofáticas, que pueden requerir que se prolongue el tiempo de lisis.
Sin que importe la formulación del reactivo lisante utilizado con el método de triple disparo, el reactivo contendrá además, o se combinará con, una concentración pequeña de un colorante nuclear vital que marque efectivamente los NRBC que puedan estar presentes en la sangre periférica. Preferiblemente, para uso con el analizador aquí referenciado, la química de la lisis se configurará de tal manera que el índice de refracción coincida con el de una solución envolvente sustancialmente a menos de 0,1%.
La mezcla de reactivo lisante y muestra permanecerá normalmente en la copa WBC 138 solamente durante aproximadamente 11 segundos. Allí se lisa y mezcla a 42°C \pm 3°C. En este punto, se pipeta el contenido de la copa WBC directamente a una celda de flujo óptico 170 para detección.
El proceso de medición comienza cuando la corriente de células pasa a través de la celda de flujo 170, que ha sido diluido con la adición de lisis de manera que las células pasen por la fila única de volumen iluminada por láser, en una corriente de muestra de flujo laminar rodeada por diluyente/solución envolvente.
En este punto la presencia de una célula es detectada por un fotodiodo compuesto 380 que detecta pérdida de luz axial (ALL) y dispersión de ángulo intermedio (IAS), tubo fotomultiplicador que detecta fluorescencia roja, y un circuito único de disparo triple, representado en la figura 2, en el espacio tridimensional de características de ALL, IAS, y FL3 (fluorescencia roja). El circuito de disparo triple cualifica señales para digitalización usando lógica Y/O. Una señal cualificada debe ser mayor que el disparo IAS, mientras que al mismo tiempo debe ser mayor que el disparo ALL o el disparo FL3. La combinación de este circuito único de disparo, y las propiedades lisantes que incluyen un fijador equilibrado, permiten que los núcleos NRBC expuestos se tiñan rápidamente, y sean contados claramente y sin ambigüedad y excluidos del recuento celular diferencial WBC sin la interferencia usual de fondo, tanto fluorescente como no fluorescente, tal como fragmentos de ADN, estroma de RBC, y plaquetas.
Cuando las células, así disparadas, pasan por dicho volumen iluminado, se generan pulsos en los detectores 380, 400, 401 y 404. Después, las amplitudes de estos pulsos son filtradas, amplificadas, digitalizadas y almacenadas en modo de lista en el correspondiente espacio pentadimensional de características de ALL, IAS, FL3, PSS (dispersión lateral polarizada); y DSS (dispersión lateral despolarizada). El tiempo de recuento normal a través de celda de flujo 170 es 10 segundos. A la relación de caudal y dilución descrita anteriormente, con un recuento normal de WBC de paciente de 7000 células por microlitro de volumen de sangre, la tasa de recuento de eventos resultante sería 5000. En muestras de recuento bajo, este tiempo de recuento se puede ampliar automáticamente para mejorar las estadísticas de la medición. A la conclusión del tiempo de medición, la corriente de muestra es pipetada a residuos, y la sonda se limpia y seca y prepara para procesar una muestra siguiente.
Después se aplican algoritmos a los datos de modo de lista de dicho espacio de características de ALL, IAS, FL3, PSS, y DSS, y se enumeran y/o señalizan los tipos siguientes de células dentro de menos de 30 segundos de tiempo de procesado:
Tipos de células enumeradas Porcentajes Señalizadas o
Enumeradas
Concentración de glóbulos blancos (WBC)
Concentración de neutrófilos %N de WBC
Concentración de linfocitos %LINF de WBC
Concentración de monocitos %MONO de WBC
Concentración de eosinófilos % EOS de WBC
Concentración de basófilos %BASO de WBC
NRBC %NRBC de WBC
Concentración de banda (BANDA)
Concentración de blastos (BLST)
Conc. gran. inmaduros (IG)
Concentración de linf.-variante (VARL)
Las señales ALL e IAS son detectadas y recogidas para el análisis WBC/Dif y las señales FL3 de núcleos NRBC teñidos se recogen para análisis de NRBC, como se describirá más adelante. El circuito de triple disparo, representado en la figura 42, cualifica estas señales para digitalización usando lógica Y/O. Para ser cualificada una señal debe ser mayor que el disparo IAS, mientras que al mismo tiempo debe ser mayor que el disparo ALL o el disparo FL3.
Los varios componentes y señales generadas o utilizadas identificadas en la figura 42 corresponden a las marcas siguientes:
900
- Comparador de voltaje ALL
902
- Señal ALL
904
- Voltaje umbral ALL (Vth1)
906
- Salida del comparador de voltaje ALL
910
- Señal FL3
912
- Voltaje umbral FL3 (Vth2)
914
- Comparador de voltaje FL3
916
- Salida del comparador de voltaje FL3
918
- Señal IAS
920
- Voltaje umbral IAS (Vth3)
922
- Comparador de voltaje IAS
924
- Salida del comparador de voltaje IAS
926
- Puerta O
928
- Salida de puerta O
930
- Puerta Y
932
- Salida de disparo válida.
Señales en tiempo real procedentes de sus canales respectivos están presentes en las entradas de los comparadores de voltaje. Los comparadores de voltaje 900, 914 y 922 funcionan comparando las "entradas +" (902, 910 y 918) con las "entradas -" (904, 912 y 920) con salidas resultantes (906, 916, 924). Si la "entrada +" es de un voltaje más alto que la "entrada -", la salida será alta. Si la "entrada +" es de un voltaje más bajo que "entrada -", la salida será
baja.
Los voltajes umbral son voltajes independientes que se determinan por parámetros del sistema.
Las salidas de comparadores 900 y 914 son entradas a la puerta O 926 para dar la salida resultante 928 de la puerta O. La puerta O funciona comparando sus entradas. La salida será alta si una o ambas entradas son altas.
La salida de la puerta O 928 y la salida de los comparadores 922 y 924 son entradas a la puerta Y 930. La puerta Y funciona comparando sus entradas para derivar su salida 932 que también es la salida de disparo válida. La salida será alta solamente si ambas entradas son altas.
La salida de disparo válida 932 solamente será alta si la señal IAS 918 es mayor que su voltaje umbral 920, y una o ambas, la señal ALL 902 es mayor que su voltaje umbral 904 o la señal FL3 910 es mayor que su voltaje umbral
912.
Usando el circuito de disparo anterior, los NRBCs forman un agrupamiento único en dicho espacio tridimensional, véase las figuras 40A-40C y 41A y 41B, que se puede contar fácilmente durante el análisis óptico diferencial de WBC, y excluir de forma no ambigua del recuento de WBC. Así, se refiere un recuento de NRBC por 100 WBC y NRBC absoluto por \mul de sangre del paciente. En consecuencia, los NRBC se restan de los recuentos totales de WBC permitiendo el análisis exacto WBC total y Diferencial en presencia de NRBC en una muestra de sangre. Se eliminan sustancialmente el ruido de fondo, tanto fluorescente como no fluorescente, de fragmentos de ADN, estroma de RBC, plaquetas, cuerpos de Howell-Jolly, punteado basófilo, ARN de reticulocitos lisados y ADN de WBC y fragmentos megacariocíticos. Los núcleos NRBC teñidos se separan de las varias señales de ruido de fondo mediante el proceso de triple disparo descrito (en ALL, IAS y FL3) y solamente las señales FL3+ de los núcleos NRBC encima del disparo FL3 en el diagrama de puntos de ALL en función de FL3 se cuentan como NRBC (figuras 40A-40C y 41A y
41B).
4. Método y reactivo de reticulocitos
En un aspecto del sistema analítico celular 60 se utiliza una composición reactiva acuosa estable para la detección y enumeración de reticulocitos. Este reactivo incluye: un colorante de cianina asimétrico capaz de teñir reticulocitos, desde aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM de una solución tampón seleccionada del grupo que consta de solución tampón de imidazol, solución tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-peperazinetano sulfónico ("Hepes"), solución tampón de ácido bis (2-hidroxietil)-1-piperazineetano sulfónico ("Bis-Tris") y solución tampón de Tris hidroximetil aminometano ("Tris"); un pH de desde aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0; una osmolaridad ajustada a aproximadamente 230 a aproximadamente 340 mOsm/L con una sal álcali mono- o divalente; y un surfactante iniónico (desde aproximadamente 5 mg/dl a aproximadamente 1,0 g/dl dependiendo del surfactante) que facilita la permeación de la membrana y estabiliza los colorantes de cianina en una solución isotónica acuosa. Preferiblemente los colorantes son cíclicos sustituidos y exhiben mejor fluorescencia al unirse con ADN o ARN. Aún más preferiblemente, el reactivo incluye desde aproximadamente 0,1 \mug/ml a aproximadamente 0,3 \mug/ml de un colorante de cianina asimétrico cíclico sustituido.
Los métodos para la detección rápida y continua y la enumeración de reticulocitos y diferenciales CBC utilizan el sistema de reactivo de la presente invención. Tales métodos son distintos debido a la ausencia particular de la necesidad de realizar un paso de incubación separado. El período de incubación mínimo, de 10 a 60 segundos, es todo lo necesario.
\newpage
El método y reactivo descritos son la materia de US 5691204, titulada "Composición y método para el análisis rápido de reticulocitos", presentada el 21 de abril de 1995.
El método permite la enumeración de reticulocitos a partir de una muestra de sangre entera diferenciando simultáneamente una alícuota separada de la muestra para obtener un análisis completo de células sanguíneas ("CBC"). Este método incluye dirigir una o varias alícuotas de la muestra a varias posiciones dentro de un analizador automático para análisis y diferenciación, mientras que una alícuota de reticulocitos de la muestra se combina con un reactivo de tinción.
La alícuota de reactivo/reticulocito combinada se dirige después a una celda de flujo óptico 170 del analizador automático 60. La alícuota de reactivo/reticulocitos se pasa después a través de una zona de detección iluminada 300 esencialmente una célula cada vez para producir eventos de fluorescencia y dispersión de luz. Estos eventos son detectados y el número de reticulocitos presentes en dicha muestra se determinan a partir de ellos.
Los colorantes asimétricos utilizables con el sistema de reactivo tienen en general las características siguientes:
1.
Absorción máxima: 488 +20 nm
2.
Alta afinidad de unión a ácido nucleico
3.
Alto rendimiento cuántico: \geq 0,1
4.
Coeficiente de extinción molar: \geq 10.000
5.
Mejora de fluorescencia a la unión a ARN o ADN: \geq 20
6.
Tasa de permeación de membrana: < 2 minutos.
Típicamente, los colorantes utilizados en los métodos descritos de enumeración de reticulocito y reactivo acuoso son altamente inestables en entornos acuosos. Sin embargo, la formulación de reactivo descrita proporciona mayor estabilidad y duración en almacenamiento al reactivo acabado.
Una realización preferida del sistema de reactivo incluye desde aproximadamente 0,05 \mug/ml a aproximadamente 0,5 \mug/ml de Sybr 11, un colorante de propiedad comercializado por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), desde aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM de solución tampón de imidazol, y desde aproximadamente 5 mg/dl a aproximadamente 20 mg/dl de N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida ("BIGCHAP"), desde aproximadamente 0,02% a aproximadamente 0,055% de Proclin® 300 (5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona + 2-metil-4-isotiazolin-3-ona). El pH se regula a desde aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,2 con 1N HCI y la osmolaridad ajustada con NaCl desde aproximadamente 270 a aproximadamente 310 mOsm/L.
Un ingrediente principal del sistema de reactivo es el colorante. Una clase de colorantes son colorantes asimétricos de cianina tal como los descritos en W094/24213, "Colorantes asimétricos cíclicos-sustituidos".
Además, los colorantes utilizados en esta invención exhiben mejor fluorescencia a la unión con ADN o ARN. Tales colorantes útiles también deben tener alta afinidad de unión a ARN y ADN y un rendimiento cuántico alto. Se anticipa que se puede usar varios colorantes asimétricos de cianina que exhiben las características aquí descritas y reivindicadas. Algunos ejemplos de tales colorantes incluyen, aunque sin limitación, Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16, también obtenidos de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) ("MPI"). También son útiles, al llevar a la práctica la invención, otros colorantes asimétricos de cianina tal como Syto 12, que se obtienen también de MPI. Se considera que Syto 12 es un colorante de cianina asimétrico neutro incluyendo un sistema de anillo de benzazolio sustituido enlazado a un puente de metina a un sistema de anillo piridínico o de quinolina.
Otro ingrediente del sistema de reactivo es una solución tampón cuyo pKa es desde aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0 y es capaz de mantener la concentración requerida (para teñir ARN o ADN) del colorante de cianina en una solución acuosa en un período de tiempo prolongado. Tales soluciones tampón no deberán reaccionar con los colorantes de cianina o los surfactantes iniónicos usados en la puesta en práctica de esta invención para estabilizar el colorante. Las soluciones tampón ejemplares incluyen imidazol, Hepes, Bis-Tris y Tris.
Otro ingrediente del sistema de reactivo es un surfactante iniónico. Dependiendo del surfactante, o combinación de surfactantes iniónico, que se usen, la concentración deberá ser desde aproximadamente 5 mg/dl a aproximadamente 1 g/dl. El (los) surfactante(s) parece(n) mejorar la velocidad de la permeación del colorante de cianina a través de la membrana celular (en 30 segundos). Además, el surfactante mejora la solubilidad y la estabilidad de los colorantes de cianina en una solución acuosa isotónica. Sin embargo, tal(es) surfactante(s) no deberán precipitar o reaccionar con los colorantes de cianina o lisar RBCs, incluso a las concentraciones bajas. Ejemplos de tales surfactantes son, aunque sin limitación, BIGCHAP, n-dodecil-D-maltósido, copolímero bloque polioxipropileno-polioxietileno ("Pluronic® F127"), n-tetradecil-D-maltósido, decanoil-N-metil-glucamida, n-dodecil-D-glucopiranósido y n-decil-D-glucopiranósido.
Otro ingrediente del sistema de reactivo es una sal álcali mono-, o divalente para regular la osmolaridad del reactivo desde aproximadamente 230 mOsm/L a aproximadamente 340 mOsm/L para evitar la lisis de glóbulos rojos, incluyendo los reticulocitos, o los glóbulos blancos. Tales sales no deberán reaccionar con los colorantes de cianina o precipitar en solución. Los ejemplos de tales sales incluyen NaCl, KCI, LiCl, CaCl_{2}, MgCl_{2}, ZnCl_{2} y
otros.
Un ingrediente opcional es un conservante para evitar el crecimiento microbiano en el reactivo. Tal conservante no deberá cambiar las propiedades de dispersión de luz o emisión fluorescente de las células o células teñidas. Los ejemplos de tales conservantes incluyen Proclin® 300, Proclin® 150, azida sódica y otros.
Sin embargo, en general, un método para llevar a la práctica la presente invención incluye la mezcla de una muestra de sangre entera con un reactivo para teñir el ARN de los reticulocitos presentes, pasar la mezcla, esencialmente una célula cada vez, por una celda de flujo óptico iluminada, detectar la luz dispersada y fluorescencia emitida y determinar la cantidad de reticulocitos presentes en la muestra sin someter la mezcla de muestra/reactivo a un paso o período de incubación separado.
Para analizar en una muestra de sangre entera el porcentaje así como los recuentos absolutos de reticulocitos en el analizador hematológico multiparamétrico antes descrito, se deposita aproximadamente 18,75 \mul de una muestra de sangre entera por medio de una sonda de aspiración de muestra en la copa RBC 134 que contiene aproximadamente 7856 \mul de un diluyente/solución envolvente (una salida isotópica) y se mezclan los fluidos. La muestra diluida es transportada después a un agujero de impedancia envuelto 174 para determinar electrónicamente el recuento absoluto de RBC de la muestra. Mientras tanto, aproximadamente 200 \mul de la muestra diluida son transferidos a una copa Retic 136 que contiene 600 \mul del reactivo descrito, donde se mezclan. La muestra preparada (mezclada) es transportada después a la celda de flujo óptico envuelta 170 para detección. El proceso de medición comienza cuando la corriente de células pasa a través de la celda de flujo esencialmente una célula cada vez, en una corriente de muestra de flujo laminar rodeada por un diluyente-solución envolvente, que se describe a continuación.
En este punto, y como se representa en el espacio bidimensional de características de IAS y FL1 del citograma de las figuras 14A y B, la presencia de una célula es detectada por un fotodiodo de dispersión de ángulo intermedio 380 que detecta luz en un cono de 3° a 10°, y un tubo fotomultiplicador ("PMT") 400 que detecta fluorescencia verde, FL1. Cuando pasan células a través de dicho volumen iluminado, estos detectores generan y miden pulsos. Las amplitudes de estos pulsos son después filtradas, amplificadas, digitalizadas y almacenadas en modo de lista en el correspondiente espacio bidimensional de características de IAS y FL1. Las células son contadas durante 8 segundos. A la relación de caudal y dilución descrita anteriormente, con un recuento de RBC de un sujeto normal de 5 millones por microlitro de volumen de sangre, la tasa de recuento de eventos resultante sería 5950 por segundo. Después se aplican algoritmos a los datos de modo de lista de dicho espacio de características de IAS y FL1 y se miden los parámetros siguientes dentro de 20 segundos de tiempo de cálculo:
1. Puerta RBC: Los WBCs y las plaquetas se excluyen conmutando por puerta la población RBC, incluyendo reticulocitos, pero excluyendo WBCs y plaquetas.
2. El porcentaje de reticulocitos: la población RBC conmutada por puerta es reanalizada según el tamaño de sus señales FL1. Se aplica un ajuste logarítmico al histograma FL1 para definir la región que pertenece a RBCs maduros, y las células cuyas señales FL1 caen encima de la región se marcan como reticulocitos. El porcentaje de reticulocitos se calcula dividiendo el recuento de reticulocitos por los recuentos RBC totales.
3. Los recuentos de reticulocitos totales: Se obtienen multiplicando el porcentaje de reticulocitos por los recuentos RBC absolutos de la muestra partir del modo CBC.
4. Índice de Madurez de Reticulocitos ("RMI"): El RMI se expresa como el porcentaje de reticulocitos cuyas señales FL1 son más de una (1) desviación estándar ("D.E.") por encima de la fluorescencia media de una población normal de reticulocitos.
Tal descripción se hace meramente por razones de conveniencia y la expresión de RMI no se limita de ningún modo solamente a los algoritmos aquí explicados.
5. Tinción y análisis alternativos de reticulocitos
La clase alternativa descrita de tinciones de reticulocitos es estable a luz a temperatura ambiente, posee mayor mejora de fluorescencia del colorante unido sobre el colorante no unido, exhibe selectividad ARN sobre ADN, permite mejor paso por puerta de las células de reticulocitos, proporciona permeación más rápida de membranas celulares, y posee una absorción óptica máxima estrechamente alineada con la emisión máxima de un láser de argón (aproximadamente 488 nm).
\newpage
Un colorante preferido pertenece a una clase de moléculas que tiene la fórmula estructural siguiente:
62 
\vskip1.000000\baselineskip
donde:
x = O, S, Se o C(CH_{3})_{2}2
R_{1} = alquilo que tiene de 1-6 carbonos
R_{2} = alquilo que tiene de 1-6 carbonos
R_{3} = benceno fundido, alquilo (que tiene 1-6 carbonos), metoxi o hidrógeno
R_{4} = alquilo que tiene 1-6 carbonos, metoxi o hidrógeno
n = cero o un entero de 1-6
Esta clase de colorantes se denominará aquí "2,2'-colorantes".
La realización preferida del colorante de reticulocito mostrado anteriormente es donde:
Preferiblemente, x es azufre (S)
Preferiblemente, R_{3} y R_{4} son hidrógeno
Preferiblemente, n = O y
Preferiblemente, R_{1} y R_{2} son etilo.
Este colorante se enumera en el Koch-light Biochemical Catalogue 1985, y 1988/89, página 53, en forma de una sal yoduro, y se denomina yoduro de 1,3'-dietil-2,2'-quinoliltiacinina. También se enumera en el catálogo Nippon Kankoh-Shikiso Kenkyusho, página 7. Por razones de conveniencia en lo que sigue, este colorante específico, la realización especialmente preferida, se denominará "DE22QTC", y la clase general de colorantes, definida anteriormente, "2,2'-colorantes".
En general, estos colorantes se utilizan en forma de sus sales, siendo los yoduros especialmente convenientes. En el sentido en que se utiliza en esta memoria descriptiva, todas las referencias a estos colorantes se deberán entender como incluyendo tales colorantes en forma de sal.
En una realización, un reactivo útil para teñir material conteniendo ARN que se compone de un 2,2'-colorante es capaz de teñir material conteniendo ARN.
Otra realización proporciona un método para teñir material conteniendo ARN, donde una solución de tinción acuosa de un 2,2'-colorante, que es capaz de teñir material conteniendo ARN, se pone en contacto con un material conteniendo ARN durante un período de tiempo adecuado para permitir que el colorante de la solución de tinción penetre en el material conteniendo ARN.
Otra realización proporciona un método para enumeración de reticulocitos en una muestra de sangre entera usando citometría de flujo donde una solución de tinción acuosa de un 2,2'-colorante, que es capaz de teñir material conteniendo ARN, se pone en contacto con un material conteniendo ARN durante un período de tiempo adecuado para permitir que el colorante de la solución de tinción se equilibre con el material conteniendo ARN. La muestra teñida se dirige después a través de la zona de detección óptica de un instrumento de citometría de flujo e ilumina una vez dentro de la zona de detección óptica con un haz de luz incidente. La fluorescencia de los reticulocitos en solución de muestra se mide después cuando pasan por la zona de detección óptica.
Una ventaja importante de los 2,2'-colorantes es que parecen ser más estables en solución acuosa que naranja de tiazol. Esto se ha examinado usando muestras de DE22QTC, naranja de tiazol (ambos a 0,1 \mug/ml en diluyente isotónico) y "Retic-COUNT" almacenados ambos a 4°C en oscuridad y en luz de sala a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) durante un período de 5 días.
Los 2,2'-colorantes exhiben una fluorescencia considerablemente mayor cuando ARN en vez de ADN es la sustancia de unión, en base de peso por peso DE22QTC permite el paso fácil por puerta de glóbulos rojos lejos de plaquetas y glóbulos blancos usando una estrategia no adoptada previamente para análisis de reticulocitos. El colorante, por su tinción significativa de plaquetas en el período de 30 minutos de una prueba típica y su tinción esperada de glóbulos blancos en el mismo período, proporciona diferenciación significativa de ambos grupos de células de todos los glóbulos rojos en un gráfico de fluorescencia frente a dispersión directa. La tinción rápida es una propiedad no mostrada por otros muchos colorantes; por ejemplo, naranja de tiazol no tiñe plaquetas considerablemente en el período de 30 minutos de tiempo aunque después de varias horas, se produce tinción.
DE22QTC, cuando se une a ARN o ADN, tiene una absorción máxima de casi exactamente 488 nm, y un desplazamiento Stokes de aproximadamente 33 nm. Por lo tanto, este colorante se puede usar con ventaja máxima con el láser de iones argón estándar. Además, se pueden usar los filtros ópticos fácilmente disponibles usados para ensayos a base de fluorescencia y no hay que modificar el instrumento.
Los 2,2'-colorantes se pueden usar en cualquier técnica de ensayo convencional que requiera la tinción de reticulocitos con un marcador fluorescente. En particular, estos colorantes se pueden usar en cualquier ensayo para el que se recomienda actualmente naranja de tiazol, tal como detección de reticulocitos y enumeración en un citómetro de flujo de láser de iones argón.
Cuando se utiliza esta clase de colorantes para detectar y diferenciar reticulocitos, hay que prever un lugar de incubación y controles de temperatura asociados y manipuladores de muestras dentro del instrumento y conectar operativamente al analizador para mantener la automatización del sistema de instrumentos de la invención aquí descrito.
6. Reactivo HGB
El reactivo de hemoglobina ("HGB") explicado aquí se describe en U.S. 5612223, "Reactivo libre de cianuro y método para la determinación de hemoglobina", presentada el 11 de marzo de 1994.
Un reactivo libre de cianuro debe ser capaz de lisar rápidamente los eritrocitos y complejar rápidamente con la hemoglobina de manera que se forme una estructura cromogénica detectable para la detección y medición. El reactivo descrito es estable durante muchas semanas y es especialmente ventajoso porque el cromógeno resultante parece estar libre de interferencia de otros componentes de la sangre y se puede medir a longitudes de onda en el rango espectral de instrumentos hematológicos automáticos ya existentes en este campo. A efectos de comparación, el método de met hemoglobina cyan mide típicamente la absorbancia a 540 nm. Se puede formar según la presente invención un cromógeno marrón rojizo que tiene una absorción máxima a aproximadamente 544 nm.
Un reactivo HGB que se considera útil en la presente invención es una solución acuosa de un compuesto de formación de ligando tal como imidazol y derivados de imidazol. El compuesto de formación de ligando está presente a concentraciones de 0,1 M a 2,0 M imidazol, del reactivo presente, liga con la hemoglobina que se libera de los eritrocitos en la muestra. Otros compuestos de formación de ligandos útiles en la presente invención incluyen N-hidroxiacetamida, N-hidroxil amina, piridina, oxazol, tiazol, pirazol, pirimidina, purina, quinolina e isoquinolina. Los aniones que pueden unir el hierro heme oxidado incluyen cianato, fluoruro, azida, nitrito, hidróxido, acetato y formato; las sales aceptables de estos aniones incluyen sodio, potasio, amonio y análogos.
El reactivo contiene además un surfactante con fuerte capacidad eritrolítica. Se puede usar óxido de laurildimetilamina (Ammonix L. O.) [Stepan Chemical Company; Northfield, Illinois], y octilfenoxi polietoxietanol (Triton X 100) u otros detergentes fuertes como el componente surfactante del reactivo lisante. El surfactante deberá estar presente a concentraciones desde aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,0% (p/v). El pH del reactivo deberá ajustarse a entre 11 y 14, preferiblemente 12,5. Se puede utilizar bases monovalentes, tal como hidróxido de sodio e hidróxido de potasio, para ajuste del pH.
Según el método para determinar HGB (descrito con más detalle más adelante en la sección 8 E y el Ejemplo 2 de la presente), el reactivo lisante se mezcla con una muestra de sangre entera en la relación de aproximadamente 50-1000:1 reactivo a la sangre. La muestra y el reactivo se pueden mezclar rápidamente para lograr eritrolisis y conversión de hemoglobina al cromógeno. La mezcla de muestra y reactivo se puede presentar después a un espectrofotómetro de absorbancia donde se mide la densidad óptica del cromógeno formado. Cuando el ligando es imidazol, la medición se puede hacer entre 540 nm y 550 nm. La concentración de hemoglobina total en la muestra se refiere a la densidad óptica del cromógeno convertido.
7. Diluyente isotónico-reactivo envolvente
El sistema analítico celular 60 de la presente invención utiliza una solución isotónica tamponada con surfactante iniónico adecuada para minimizar la tensión superficial de la corriente envuelta y para el análisis rápido de glóbulos rojos y plaquetas. El sistema de reactivo puede reducir de forma sustancialmente completa la formación de burbuja y mejorar un flujo suave de la corriente envuelta para impedancia y celdas de flujo óptico. El diluyente-reactivo envolvente descrito a continuación también mejora la separación de los glóbulos rojos microcíticos de las plaquetas, conservando al mismo tiempo sustancialmente la morfología de ambas poblaciones de glóbulos rojos y plaquetas para medición exacta y precisa de recuentos y volumen.
En una realización, desde aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de una solución de sal isotónica tamponada cuyo pKa es desde aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, es capaz de mantener el pH del reactivo dentro de un rango de pH de desde aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,6, está presente una sal monovalente de EDTA de aproximadamente 0,1 gramo por litro a aproximadamente 0,4 gramo por litro para evitar la presencia de agregados de plaquetas, también se utiliza una sal monovalente suficiente para regular la osmolaridad del reactivo desde aproximadamente 270 mOsm/L a aproximadamente 320 mOsm/ L, así como un surfactante iniónico que reduce la tensión superficial, evita la formación de burbuja y mejora la separación de los glóbulos rojos microcíticos de las plaquetas, seleccionado a partir del grupo n-dodecil-D-maltósido, n-tetradecil-D-maltósido, decanoil-N-metil-glucamida, n-dodecil-D-glucopiranósido y n-decil-D-glucopiranósido, y finalmente está presente un conservante para evitar el crecimiento microbiano y agua desionizada.
En una realización preferida, el reactivo incluye desde aproximadamente 2,45 gramos por litro de fosfato sódico, dibásico, aproximadamente 0,40 gramos por litro de fosfato potásico, monobásico, aproximadamente 0,20 gramos de EDTA disodio por litro, aproximadamente 8,05 gramos de cloruro de sodio por litro, aproximadamente 0,40 gramos de cloruro de potasio por litro, aproximadamente 0,012 gramos por litro de n-dodecil-D-maltósido y aproximadamente 0,03 gramos por litro de proclina 300, pH ajustado a 7,4 y osmolaridad ajustada a 315 mOsm/L.
En la realización más preferida, se mezcla rápidamente 17,5 microlitros de una muestra de sangre con 7400 microlitros de diluyente reactivo envolvente (dilución 1:420), y se pasa 0,5 microlitros de la muestra diluida por un transductor de impedancia de enfoque hidrodinámico (con envoltura) durante 12 segundos para recuento de glóbulos rojos y medición de volumen así como recuentos de plaquetas, y se pasan 2,5 microlitros de la muestra diluida por una celda de flujo óptico con envuelta durante 6 segundos para determinación del recuento exacto y preciso de plaquetas. Las señales de ruido de fragmentos de células anormales frágiles se excluyen de los recuentos ópticos de plaquetas delimitando con precisión la población de plaquetas por el algoritmo de plaquetas del sistema analítico celular 60. Ejemplos típicos de distribución de glóbulos rojos y plaquetas de muestras de sangre normales y anormales del sistema analítico celular 60 se presentan en las figuras 45A-45F y las figuras 46-47.
8. Módulo analizador A. Transporte automático de muestras
El analizador 64 puede estar provisto de un autocargador (no representado) para transportar automáticamente tubos de muestra al analizador 64 para procesado. Tal autocargador puede incluir un soporte que retiene hasta aproximadamente 100 tubos de muestra de varios tamaños. Un presentador que presenta secuencialmente los tubos de muestra al analizador 64 para aspiración, está conectado operativamente con el autocargador. Una mezcladora que mezcla la muestra justo antes de la aspiración de muestra, también puede estar asociada operativamente con el autocargador. Un lector de código de barras para leer la etiqueta de código de barras en cada tubo también puede estar asociado operativamente con el autocargador y conectado operativamente al controlador de sistema para introducir información de muestra en el controlador del sistema.
B. Procesado y medición automáticos de muestras
La figura 3 ilustra una vista desde arriba de una realización de una zona de procesado automático de muestras 110 para uso en el sistema analítico celular 60 representado en la figura 1. La zona de procesado 110 es parte de la porción del analizador 64 del sistema analítico celular 60. La zona de procesado 110 incluye una zona de copas de muestra 114 y una zona de incubación 118.
Como se representa en la figura 3, la zona de incubación 118 incluye un bloque termostatizado 120 para alojar módulos de reactivo 122, bandejas de incubación de subconjunto/fenotipificación 124 y unidad de lavado y secado de sonda 144. El bloque termostatizado 120 incluye un controlador de temperatura (no representado) para calentar y/o enfriar las bandejas de incubación 124 y módulos de reactivo 122 dispuestos en el bloque termostatizado 120.
Los módulos de reactivo 122 incluyen cavidades 128 para contener un volumen de reactivo de anticuerpo. En la realización ilustrada, cada módulo de reactivo 122 tiene una carcasa con una cavidad de reactivo 128, preferiblemente en número de seis, empaquetadas con un panel particular de reactivos. Los reactivos en cada panel se seleccionan de manera que, para las pruebas asociadas con cada panel, se utilice una cantidad aproximadamente igual de reactivo de cada cavidad 128. Si se requieren menos de seis reactivos para la prueba asociada con el panel, las cavidades excedentes 128 se tapan con un tapón (no representado). Cada módulo de reactivo 122 también está provisto de una memoria, tal como una RAM no volátil y análogos, para almacenar información de ID y uso del módulo. Los módulos de reactivo 122 están preferiblemente enchavetados de manera que puedan asentar en un agujero (no representado), situado en el bloque termostatizado 120, en una orientación predefinida. Esto permite que la unidad central de proceso (CPU) del analizador 64 almacene la posición y, a partir de la información de uso, el volumen del contenido de cada cavidad 128 en cada módulo de reactivo 122.
Las bandejas de incubación de subconjunto/fenotipificación 124 son, en la realización ilustrada, de forma sustancialmente rectangular, y tienen varias filas de lugares de incubación 132 formadas en ellas. Cada lugar de incubación 132 es capaz de contener una mezcla de muestra de sangre y anticuerpo que se incuba en preparación para la prueba de inmuno/fenotipo. Las bandejas de subconjunto/fenotipificación 124 asientan extraiblemente en agujeros (no representados) en el bloque termostatizado 120 de tal manera que sus temperaturas sean controladas por el controlador de temperatura del bloque termostatizado 120.
La zona de copas de muestra 114 incluye una fila de copas de muestra, colectores 114b y drenajes 114a.
En una realización preferida, estas copas incluyen una copa "RBC" 134, una copa "RETIC" 136, una copa "WBC" 138, una copa de "transferencia" 140, una copa "HGB" 142, y copa de "lavado" 144a. Cada copa de muestra está abierta en la parte superior para recibir un fluido. Los fondos de las copas RBC 134, RETIC 136, WBC 138 y HGB 142 están conectados a una red de tubos 182 (representada en la figura 5) para transportar muestras a celdas de flujo/transductores de medición. También es posible depositar fluidos, tal como diluyente, reactivo, agente lisante y análogos, en las copas mediante la red de tubos 182. Esto se puede llevar a cabo conectando la red de tubos 182 a orificios (no representados) formados en las paredes de las varias copas. La colocación de estos orificios y sus respectivos diámetros interiores permiten que la mezcla tenga lugar como resultado del movimiento del fluido producido por el mecanismo de distribución, que es preferiblemente una jeringa de dilución acoplada a la red de tubos 182.
Los RBCs son lisados en la copa WBC 138 usando, por ejemplo, el sistema de reactivo multipropósito de agente lisante rápido explicado previamente. Por consiguiente, la copa WBC 138 incluye un controlador de temperatura o calentador para calentar la mezcla de agente lisante rápido y muestra, preferiblemente a aproximadamente 40°C. Además, la copa WBC 138 incluye una mezcladora vorticial 610 (figura 37) para obtener mezcla vorticial movida por motor de la combinación de reactivo lisante y sangre entera.
Por razones de claridad, una realización ejemplificativa de la preparación de la muestra se explica con referencia a las figuras 37 a 39.
Una realización ilustrada en la figura 37 proporciona un aparato 610. El aparato 10 incluye en general un aparato mezclador 612, un dispensador de fluido 614 y un controlador de mezcla 616. El aparato mezclador se describe mejor y reivindica en la Solicitud de Patente de Estados Unidos, número de serie 08/356.412, presentada el 15 de diciembre de 1994, cuyo contenido completo se incorpora aquí por referencia.
El aparato mezclador 612 está asociado operativamente con el dispensador de fluido 614 de tal manera que el dispensador de fluido 614 introduzca un primer fluido, tal como una muestra de sangre entera, una suspensión de células y análogos, en el aparato mezclador 612. El dispensador de fluido 614 está conectado eléctricamente con el controlador de mezcla 616 por el conductor 618 de manera que el controlador de mezcla 616 verifique y coordine la operación del dispensador de fluido 614. El controlador de mezcla 616 está conectado eléctricamente con una fuente 620 de energía eléctrica por el conducto 622 para suministrar energía eléctrica al controlador de mezcla 616. En una realización ejemplar, el dispensador de fluido 614 es un pipetador asociado operativamente con una fuente adecuada de fluido a preparar por el aparato 610. El controlador de mezcla 616 puede ser un ordenador que tiene memoria que contiene y ejecuta rutinas apropiadas para controlar la operación del aparato 610.
La realización ilustrada del aparato mezclador 612 incluye una carcasa primera o interna 624, una carcasa segunda o externa 626 y un elemento de unión 627. La carcasa interna 624 y la carcasa externa 626 son sustancialmente cilíndricas e incluyen extremos abiertos para facilitar la introducción de fluido desde el dispensador de fluido 614 al interior 628 de la carcasa interna 624. La carcasa interna 624 y la carcasa externa 626 están dispuestas de forma sustancialmente coaxial, estando dispuesta la carcasa interna 624 sustancialmente dentro de la carcasa externa 626.
El elemento de unión 627, ilustrado en las figuras 37 y 39, rodea sustancialmente y conecta operativamente los extremos abiertos del elemento interior 624 y el elemento exterior 626. El elemento de unión 627 incluye un primer saliente sustancialmente anular 630 que acopla con una ranura sustancialmente anular 632 en el elemento interior 624 junto a su extremo abierto y un segundo saliente sustancialmente anular 634 que acopla con una ranura sustancialmente anular 636 en el elemento exterior 626 junto a su extremo abierto. Para facilitar la retención del saliente 630 dentro de la ranura 632, un aro en O 638 está dispuesto de manera que rodee sustancialmente una superficie de diámetro externo del saliente sustancialmente anular 630. El aro en O 638 funciona esencialmente como una abrazadera elástica para fijar sustancialmente el saliente 630 dentro de la ranura 632. El aro en O 38 mantiene el extremo abierto de la carcasa interna 624 sustancialmente estacionario con respecto al extremo abierto de la carcasa externa 626 durante el funcionamiento del aparato 610.
La carcasa interna 624 incluye estructuras para introducir y sacar fluido del interior 628 de la carcasa interna 624. Específicamente, la carcasa interna 624 incluye una entrada de fluido 642 y una salida de fluido 644. En una realización, la entrada de fluido 642 y la salida de fluido 644 se pueden hacer de tubo de acero inoxidable. En otra realización, la entrada de fluido 642 puede incluir un conducto, tal como una bobina y análogos, dispuesto junto a la carcasa interna 624 de tal manera que se pueda transferir energía térmica desde la carcasa interna 624 al conducto aplicando por ello energía térmica al fluido antes de la introducción en el interior 628 de la carcasa interna 624. La entrada de fluido 642, en una realización ejemplar, está desviada axialmente aproximadamente 36,5 mm (1,43 pulgadas) de un extremo distal de la carcasa interna 624. La salida de fluido 644 está dispuesta sustancialmente en el centro en un extremo próximo 646 de la carcasa interna 624. Para facilitar el movimiento de fluido desde el interior 628 de la carcasa interna 624 a la salida de fluido 644, el extremo próximo 646 está inclinado o en pendiente desde una pared axial de la carcasa interna hacia la salida de fluido 644.
La entrada de fluido 642 está conectada por fluido por un conducto adecuado 648 a una fuente 650 de un segundo fluido, tal como una solución lisante, diluyente o análogos, a introducir en el interior 628 de la carcasa interna 624. La fuente 650 puede incluir un mecanismo, tal como una bomba de jeringa y análogos, para mover positivamente fluido desde la fuente 650 a través del conducto 648 a la entrada de fluido 642 y el interior 628 de la carcasa interna 624. La salida de fluido 644 está conectada por fluido por un conducto adecuado 652 a un depósito 654. El depósito 654 puede ser otra porción de un instrumento analítico con el que el aparato 610 está asociado operativamente. En otras realizaciones, el depósito 654 puede retener fluido del interior 628 de la carcasa interna 624 hasta que sea necesario para procesado adicional.
En algunas realizaciones, puede ser deseable mantener fluido dentro del interior 628 de la carcasa interna 624 a una temperatura deseada. Este fluido puede proceder del dispensador de fluido 614, de la fuente 650 o una combinación de fluidos del dispensador de fluido 614 y la fuente 650. Para ello, un elemento de calentamiento 656 está asociado operativamente con la carcasa interna 624. En la realización ilustrada, el elemento de calentamiento 656 es un elemento de calentamiento eléctrico. El elemento de calentamiento 656, en la realización ilustrada, rodea sustancialmente y contacta una porción de una superficie de diámetro externo de la carcasa interna 624. De esta forma, se transfiere energía térmica generada por el elemento de calentamiento 656 a la carcasa interna 624 y desde allí al contenido, es decir, fluido, dispuesto en el interior 628 de la carcasa interna 624.
El elemento de calentamiento 656 está conectado eléctricamente por un conductor 658 a un controlador de calentador 660. El controlador de calentador 660 aplica energía eléctrica apropiada al elemento de calentamiento 656 de tal manera que la cantidad deseada de energía térmica sea generada por el elemento de calentamiento 656 y aplicada a la carcasa interna 624.
Para comprobar la temperatura asociada con el elemento de calentamiento 656 y la carcasa interna 624, se ha dispuesto un sensor 664 conectado operativa y térmicamente con el elemento de calentamiento 656 y la carcasa interna 624. En una realización ejemplar, se forma un rebaje en la carcasa interna 624 para recibir el sensor 664 de tal manera que un perfil externo de la carcasa interna 624 sea sustancialmente constante y liso. En una realización, el sensor 664 es un detector de temperatura de resistencia.
El controlador de calentador 660 opera en general comparando una señal eléctrica indicativa de la temperatura asociada con la carcasa interna 624 con una señal de referencia y usando un resultado de la comparación para activar el elemento de calentamiento 656.
La carcasa interna 624 no sólo puede mantener un fluido en el interior 628 a un nivel deseado de energía térmica, sino que también puede combinar o mezclar fluidos, tal como un primer fluido del dispensador de fluido 614 y un segundo fluido de la fuente 650, si se desea. Para facilitar la combinación de fluidos, un extremo próximo de la carcasa interna 624 está conectado operativamente con un motor principal 686 de tal manera que la carcasa interna 624 se mueva en respuesta a la acción del motor principal 686. Un extremo próximo de la carcasa externa 626 está fijado al motor principal 686 por sujetadores 687. En una realización ejemplar, el motor principal 686 es un motor eléctrico de corriente continua, tal como el modelo número LC22-107 que se puede adquirir de SKC Shinano Kenshi Corp., de Culver City, California. Esta realización del motor principal 686 opera a aproximadamente 3.000 rpm.
Un conjunto de articulaciones 688 conecta operativamente o con accionamiento el motor principal 686 con la carcasa interna 624. El conjunto de articulaciones 688 incluye un elemento de accionamiento 690 (figura 38) y un cojinete 692. Un eje 696 en el elemento de accionamiento 690 está acoplado con el cojinete 692 por medios apropiados, tal como una arandela de bloqueo retenida alrededor de una ranura en el eje 696. El cojinete 692 está acoplado con el extremo próximo de la carcasa interna 624 por un aro en O 694 que proporciona un acoplamiento mecánico elastomérico amortiguado, relativamente blando, del cojinete 692 a la carcasa interna 624. El aro en O 694 también compensa elastoméricamente el desplazamiento angular central producido por el movimiento (por ejemplo, excéntrico) solamente en el extremo próximo de la carcasa interna 624. Como se representa en la figura 38, el eje 696 está desviado de una línea media del elemento de accionamiento 690.
El elemento de accionamiento 690 incluye un agujero 698 para recibir un eje de accionamiento, que puede girar, asociado con el motor principal 686 de tal manera que el movimiento del eje de accionamiento del motor principal 686 produzca movimiento complementario del elemento de accionamiento 690. Otro agujero 700, dispuesto de forma sustancialmente ortogonal al agujero 698, está dispuesto en el elemento de accionamiento 690 para recibir un sujetador que puede apoyar sobre el eje de accionamiento del motor principal 686 de tal manera que el elemento de accionamiento 690 se mueva conjuntamente con el eje de accionamiento del motor principal 686.
La carcasa interna 624 se mueve en respuesta a la operación del motor principal 686. El movimiento de la carcasa interna 624 no es idéntico al movimiento rotativo del eje de accionamiento del motor principal 686. El movimiento de la carcasa interna 624 se define, en parte, por la disposición desviada del eje 696 y la unión entre el extremo abierto de la carcasa interna 624 y el extremo abierto de la carcasa externa 626 proporcionada por el elemento de unión 627. Por consiguiente, los extremos abiertos de la carcasa interna 624 y la carcasa externa 626 permanecen sustancialmente estacionarios con movimiento relativo correspondiente a la flexibilidad proporcionada por la naturaleza elastomérica del elemento de unión 627. Sin embargo, el extremo próximo de la carcasa interna 624 se puede mover libremente conjuntamente con el eje 696 en el elemento de accionamiento, que se mueve en respuesta al movimiento del eje de accionamiento del motor principal 686. Dado que el eje 696 está dispuesto desviado en el elemento de accionamiento 690, el movimiento del eje 696 sigue en general un recorrido sustancialmente excéntrico. Así, la carcasa interna 624 "vibra" en general en respuesta a la operación del motor principal 686. Se ha de notar que la carcasa interna 624 no gira libremente con respecto a la carcasa externa 626 en respuesta al motor principal 686.
Para controlar la operación del motor principal 686, y por lo tanto para controlar el movimiento de la carcasa interna 624, se ha dispuesto un controlador 702. Específicamente, el controlador 702 está conectado eléctricamente con el motor principal 686 por el conductor 704. Un sensor 706 está asociado operativamente con la carcasa interna 624 y conectado eléctricamente con el controlador 702 por un conductor 708 para proporcionar al controlador 702 realimentación indicativa del movimiento de la carcasa interna 624. El controlador 702 está conectado eléctricamente con el controlador de mezcla 616 por un conductor 701 y con la fuente 620 por un conductor 703. Así, el controlador 702 y el controlador de mezcla 616 son capaces de regular positivamente la operación del motor principal 686 produciendo el movimiento deseado de la carcasa interna 624.
Para proporcionar un campo magnético para interacción con el sensor 706 en esta realización, un imán 710 (figura 38) está provisto del elemento de accionamiento 690. En una realización, el imán 710 se retiene dentro de un rebaje 712 en el elemento de accionamiento 690 por medios adecuados, tal como un adhesivo como un cemento epoxi. El imán 710 está orientado dentro del rebaje 712 de tal manera que un polo sur del imán 710 mire al sensor 706. Así, cuando el elemento de accionamiento 690 se mueve en respuesta a la operación del motor principal 686, el imán 710 genera una señal eléctrica periódica en el sensor 706. La señal eléctrica es sustancialmente periódica con una frecuencia que es sustancialmente igual a una frecuencia rotacional del eje de accionamiento del motor principal 686.
Ahora se ofrecerá un ejemplo de operación del aparato 610. Se ha de notar que la explicación siguiente tiene fines ilustrativos solamente.
Se supone, por razones de claridad, que el aparato 610 está en reposo (es decir, nada está energizado). Un operador accede al controlador de mezcla 616 para iniciar la operación del aparato 610. Un primer fluido adecuado, tal como sangre entera, una muestra biológica y análogos, se pone a disposición del dispensador de fluido 614. Un segundo fluido adecuado, tal como un diluyente de sangre, un agente lisante y análogos, se pone a disposición en la fuente 650.
El controlador de mezcla 616 envía una señal eléctrica al controlador de calentador 660 mediante el conductor 662 de tal manera que el controlador de calentador 660 conecte eléctricamente la fuente 620 de energía eléctrica al elemento de calentamiento 656. La energía eléctrica de la fuente 620 pasa a lo largo de conductores 668 y 658 al elemento de calentamiento 656. La energía eléctrica es convertida en energía térmica por el elemento de calentamiento 656. La energía térmica en el elemento de calentamiento 656 se transfiere a la carcasa interna 624. En una realización, el elemento de calentamiento 656 recibe energía eléctrica hasta que el sensor 664 detecta que la temperatura asociada con la carcasa interna 624 es aproximadamente 43 grados Celsius (\pm1,5 grados Celsius). Usando un nivel de temperatura de menos de aproximadamente 45 grados Celsius, en caso de que el primer fluido sea sangre entera, parte de los antígenos de superficie de las células sanguíneas no se desnaturalizan sustancialmente y algunas proteínas sanguíneas no coagulan sustancialmente. Si se desnaturalizan suficientes antígenos de superficie de células sanguíneas o si coagulasen suficientes proteínas sanguíneas, dichas sustancias podrían recubrir porciones del aparato 610 y el instrumento asociado. Los recubrimientos podrían desalojar variablemente y poner en peligro la operación del aparato 610 y el instrumento asociado.
El controlador de calentador 660 mantiene la temperatura deseada asociada con la carcasa interna 624 regulando el flujo de energía eléctrica desde la fuente 620 de energía eléctrica al elemento de calentamiento 656. Por consiguiente, el controlador de calentador 660, y así el elemento de calentamiento 656, pueden operar de forma sustancialmente continua durante el funcionamiento del aparato 610 o el instrumento con el que el aparato 610 está asociado.
Una vez que la carcasa interna 624 tiene la temperatura deseada asociada con ella, el controlador de mezcla 616 envía una señal eléctrica al controlador 702 a lo largo del conductor 701. En respuesta a esta señal eléctrica, el controlador 702 conecta eléctricamente el motor principal 686 con la fuente 620 de energía eléctrica energizando por lo tanto el motor principal 686. El motor principal 686 mueve o hace vibrar la carcasa interna 624.
Un volumen predeterminado del segundo fluido, tal como aproximadamente 1275 microlitro ("\mul") de agente lisante, se desplaza de la fuente 650 al conducto 648 por un mecanismo adecuado, tal como una bomba de jeringa y análogos. El segundo fluido fluye mediante la entrada de fluido 642 en la carcasa interna 624 hacia el interior 628 de la carcasa interna 624. Se ha de notar que, si se desea, el motor principal 686 puede ser energizado antes o después de disponer el volumen predeterminado del segundo fluido dentro del interior 628 de la carcasa interna 624. El volumen predeterminado de segundo fluido se mueve conjuntamente con la carcasa interna 624 en respuesta a la acción del motor principal 686 durante un primer período de tiempo predeterminado, que puede ser del orden de aproximadamente 5 segundos. Después del primer período de tiempo predeterminado, el segundo fluido tiene sustancialmente la misma energía térmica que la carcasa interna 624.
El controlador de mezcla 616 envía una señal eléctrica al dispensador de fluido 614 a lo largo del conductor 618. El dispensador de fluido 614 hace que se introduzca un volumen predeterminado del primer fluido, tal como aproximadamente 37,5 \mul de sangre entera, en el interior 628 de la carcasa interna 624. En una realización, el dispensador de fluido 614 puede ser un pipetador que tiene una boquilla de descarga que se puede aproximar al agujero 640 en el elemento de unión 627. Una vez que la boquilla de descarga está en posición apropiada con respecto al agujero, se desplaza el volumen predeterminado del primer fluido al interior 628 de la carcasa interna 624.
Una vez que se ha introducido la cantidad predeterminada de primer fluido en el interior 628 de la carcasa interna 624, el primer fluido y el segundo fluido se mueven dentro de la carcasa interna 624 en respuesta a la acción del motor principal 686 durante un segundo período de tiempo predeterminado que puede ser aproximadamente 11 segundos. El motor principal 686 opera preferiblemente a una frecuencia que no es igual a una frecuencia resonante asociada con el aparato 610.
En una realización ejemplar, donde el primer fluido es sangre entera y el segundo fluido es agente lisante, como se describe anteriormente, el primer fluido y el segundo fluido se mezclan de forma sustancialmente completa debido al movimiento de fluido dentro de la carcasa interna 624 en respuesta al motor principal 686. La relación del primer fluido al segundo fluido es aproximadamente 1 a aproximadamente 35. Los glóbulos rojos en la sangre entera son lisados de forma relativamente rápida y los glóbulos blancos son fijados de forma relativamente rápida, es decir, conservando sustancialmente la morfología de los glóbulos blancos. Dado que el segundo fluido y la carcasa interna 624 están sustancialmente al mismo nivel de energía térmica, el primer fluido también llega sustancialmente al mismo nivel de energía térmica después del segundo período de tiempo predeterminado.
Después de que los fluidos primero y segundo se han movido en el interior 628 de la carcasa interna 624 durante el período de tiempo deseado, cesa la operación del motor principal 686. La mezcla del primer fluido y el segundo fluido pasa por la salida de fluido 644 y el conducto 652 hacia el depósito 654. La mezcla es desplazada por un mecanismo apropiado, tal como una bomba de jeringa, asociada operativamente con la salida de fluido 644. La mezcla se puede procesar más o retener en el depósito 654 hasta que se necesite. El aparato 610 está listo para operación posterior.
La figura 4 es una ilustración más detallada de la zona de procesado de muestras 110 representada en la figura 3. Como se representa en la figura 4, la zona de procesado de muestras 110 incluye un conjunto de sonda de ventilación/aspiración 148 y un conjunto de sonda de incubación 152. La figura 4 muestra también el conjunto de ventilación 148a, el panel frontal 158a, la chapa base 158b y el lector de código base 120a. El conjunto de sonda de ventilación/aspiración 148 (representado en la figura 4A) incluye una aguja de ventilación 154, una sonda de aspiración 156, un conjunto de accionamiento 158 para mover el conjunto de sonda de aspiración 148 a lo largo de un conjunto deslizante 160, un conjunto de accionamiento 159 para mover la aguja de ventilación 154 a lo largo del mismo conjunto deslizante 160, y un conjunto de accionamiento vertical 161. El conjunto deslizante 160 está colocado encima de las copas de muestra de manera que la aguja de ventilación 154 y la sonda de aspiración 156 se puedan colocar directamente sobre el tubo de muestra y las copas de muestra.
El conjunto de accionamiento de sonda de aspiración 158 mueve la sonda de aspiración 156 sobre las copas de muestra o el tubo de muestra de manera que la sonda 156 pueda entrar en el tubo de muestra o copas de muestra para aspirar o depositar fluido. Cuando la sonda de aspiración 156 está efectuando su acercamiento a un recipiente pre-evacuado u otro tubo de muestra sellado (no representado), el conjunto de ventilación de accionamiento 159 mueve primero la aguja de ventilación 154 sobre el tubo de muestra. Un conjunto de pistón (no representado) mueve el conjunto de sonda de ventilación/aspiración 148 hacia abajo de manera que la aguja de ventilación 154 perfore el tapón del tubo de muestra. Mientras la aguja de ventilación 154 permanece introducida en el tapón, el conjunto de accionamiento vertical 161 hace que la sonda de aspiración 156 deslice a través de la aguja de ventilación 154 al tubo de muestra para aspirar la muestra.
Preferiblemente, el sistema analítico celular 60 tiene la flexibilidad de aspirar fluido de tubos de muestra de varios tamaños y de adaptarse a varios cierres de tubo. Por consiguiente, el conjunto de accionamiento vertical 161 está provisto de un interruptor que detecta cuándo llega la sonda de aspiración 156 a la parte inferior del tubo y para el movimiento descendente adicional de la sonda de aspiración 156. El conjunto de accionamiento vertical 161 eleva después la sonda de aspiración 156 y comienza la aspiración de sangre.
El conjunto de sonda de incubación 152 (representado en la figura 4B) puede incluir una sonda de incubación 160, un primer conjunto de accionamiento de sonda de incubación 164 para mover un segundo conjunto de accionamiento 168 a lo largo de un primer conjunto deslizante 166, y un segundo conjunto de accionamiento de sonda de incubación 168 para mover un conjunto de accionamiento vertical 169 y la sonda de incubación 160 a lo largo de un segundo conjunto deslizante 170. Esto permite que la sonda de incubación 160 se mueva en una dirección diagonal y se coloque directamente encima de las copas requeridas de procesado de muestra en la zona de procesado de muestras 110. La sonda de incubación 160 también se puede colocar encima de cualquiera de los lugares de incubación 132 en las bandejas de subconjunto/fenotipificación 124, cualquiera de la seis cavidades de reactivo 128 en cada uno de los módulos de reactivo 122, o la copa de lavado de incubación 144.
El conjunto de accionamiento vertical 169 mueve la sonda de incubación 160 verticalmente de manera que la sonda de incubación 160 pueda entrar en las copas de muestra, los lugares de incubación 132, o las cavidades de reactivo 128 para aspirar o dispensar fluidos.
La figura 5 ilustra además el procesado de muestras del analizador. Como se representa en la figura 5, varias copas de procesado de muestra 132, 134, 136, 138, 140 y 142 están conectadas a las celdas de flujo/transductores 170, 174, 178 mediante una red de tubos de transporte 182. La copa RBC 134, la copa RETIC 136, y la copa WBC 138 están en comunicación de fluido con el transductor de impedancia 174 y la celda de flujo óptico 170. La copa HGB 142 está en comunicación de fluido con el transductor HGB 178.
Las figuras 6A, 6B y 6C ilustran la sonda de incubación 160 durante la deposición, limpieza y aspiración, respectivamente. La sonda 160 está formada por un tubo central 184 y un tubo exterior 186. La sonda de incubación 160 aspira y deposita fluidos a través del tubo central 184. La sonda de incubación 160 se puede usar para limpiar las copas de muestra y/o lugares de incubación pulverizando fluido limpiador mediante una región anular formada entre el tubo central 184 y el tubo externo 186 a la vez que aspira a través del tubo central 184.
En la realización descrita, al módulo analizador 64 se le suministra diluyente, reactivos de anticuerpos monoclonales (MAb) si es necesario, varios reactivos lisantes y colorante de reticulocito. El diluyente, los reactivos lisantes y el colorante de reticulocito se suministran mediante depósitos 192 y 196 (representados en las figuras 7, 8 y 9) acoplados al analizador 64. Los depósitos 192 para diluyente y reactivos lisantes también están acoplados a recipientes de almacenamiento a granel 193. Cuando la secuencia de flujo pide el llenado de un depósito, el interruptor detector de nivel (no representado) en los depósitos 192 verifica una condición de lleno en el depósito, y si el instrumento controlador determina que el depósito puede tolerar la secuencia de llenado en ese momento, una línea neumática de control 189 se conmuta de aplicar una presión positiva a aplicar un vacío de aproximadamente 15 pulgadas de mercurio. Este vacío hace que fluya fluido del recipiente de almacenamiento a granel 193 al depósito 192 hasta que el interruptor detector de nivel detecte que el depósito 192 está lleno, tiempo en el que la línea neumática de control 189 vuelve a una presión positiva y cesa el flujo de fluido del recipiente de almacenamiento a granel 193 al depósito 192. Los reactivos Mab se pueden suministrar por módulos de reactivo preempaquetados desechables 122 (representados en las figuras 3 y 4).
El analizador 64 está provisto de sensores de fluido (no representados) para determinar cuándo uno de los recipientes a granel está vacío. Estos sensores detectan burbujas de aire aspiradas a los tubos entre los recipientes de almacenamiento a granel 193 y los depósitos 192. El analizador 64 informa al módulo de estación de datos 68 que, a su vez, envía señales al operador acerca del recipiente vacío. El operador puede sustituir entonces el recipiente vacío por uno lleno e indicar mediante la interface de usuario a la estación de datos 68 que el recipiente ha sido sustituido. Hasta que el recipiente sea sustituido, el analizador 64 no aspirará más muestras de los tubos de muestra, aunque el procesado de muestras ya iniciado continuará con el reactivo suficiente que queda en los depósitos.
La aspiración y dispensación por la sonda de aspiración 156 y la sonda de incubación 160 se efectúan por una serie de bombas de pistón 190. Las figuras 7 y 8 ilustran cómo la sonda de aspiración 156 y la sonda de incubación 160 están conectadas a bombas de pistón 190 y los depósitos de reactivo 192. El volumen y caudal de estas transferencias de fluido son controlados por el analizador 64 y la estación de datos 198.
Como se representa en la figura 7, la sonda de aspiración 156 está acoplada a un depósito de diluyente 192 mediante una válvula 194 y la bomba de pistón 190. La figura 8 ilustra la sonda de incubación 160 acoplada a un depósito de diluyente 192 mediante una válvula 200 y una bomba de pistón 190.
Preferiblemente, las bombas de pistón 190 son bombas rotativas reversibles capaces de aspirar un volumen predeterminado de fluido por cada rotación del pistón. Cada bomba de pistón 190 aspira fluido cuando su pistón gira en una dirección, y deposita fluido cuando su pistón gira en otra dirección. Se describen bombas de pistón adecuadas en las Patentes de Estados Unidos 4.941.809, 5.015.157, 5.020.980 y 5.044.889.
La figura 9 ilustra cómo el depósito de colorante de reticulocito 196 está conectado a la copa de reticulocito 136 mediante válvulas 202 y 203 y una jeringa de colorante de reticulocito 191.
También se puede medir y suministrar diluyente a las copas de muestra mediante jeringas de diluyente (no representadas) y la red de tubos 182. Las jeringas de diluyente y la jeringa de colorante de reticulocito 191 son sustancialmente similares a las jeringas de distribución 204, 206, 208, representadas en las figuras 10A, 10B, 11A, 11B y 12. Las jeringas de diluyente se puede conectar a la red de tubos 182.
Las figuras 10A, 10B, 11A, 11B y 12 ilustran cómo se suministran muestras preparadas para la medición desde las copas de muestra a las celdas de flujo/transductores 170, 174, 178.
La figura 10A ilustra la transferencia a granel de muestra desde una copa de muestra 216 a la proximidad del transductor de impedancia 174 mediante la bomba 220. La figura 10B ilustra la distribución dosificada de la muestra por la jeringa de distribución de RBC 204 al transductor de impedancia 174. La copa de muestra 216 está conectada a la jeringa RBC 204, el transductor de impedancia 174 y una bomba peristáltica 220 por tubos 182. Una primera válvula 210 está colocada en el tubo 182 hacia abajo de la copa de muestra 216, y una segunda válvula 212 está colocada en el tubo 182 hacia arriba de la bomba peristáltica 220. El caudal y la operación general de la jeringa RBC 204 son controlados automáticamente por los circuitos electrónicos y software del analizador.
La transferencia a granel de muestra desde la copa de muestra 216 a la proximidad del transductor de impedancia 174 se produce cuando las válvulas primera y segunda 210, 212 están abiertas, como se representa en la figura 10A, y la bomba peristáltica 220 es accionada. La distribución dosificada de la muestra desde la jeringa RBC 204 al transductor de impedancia 174 se produce cuando las válvulas primera y segunda 210, 212 están cerradas, como se representa en la figura 10B, y el émbolo 224 de la jeringa RBC 204 se desplaza una distancia predeterminada a una velocidad especificada.
La figura 11A ilustra la transferencia a granel de muestra de una copa de muestra 230 a la proximidad de la celda de flujo óptico 170 mediante la bomba 232. La bomba 232 puede ser sustancialmente parecida a la bomba 220. La figura 11B ilustra la distribución dosificada de la muestra por la jeringa de distribución WBC 206 a la celda de flujo óptico 170. La copa de muestra 230 está conectada a la jeringa WBC 206, la celda de flujo óptico 170 y una bomba peristáltica 232 por tubos 182. Una primera válvula 236 está colocada en el tubo 182 hacia abajo de la copa de muestra 230, y una segunda válvula 238 está colocada en el tubo 182 hacia arriba de la bomba peristáltica 232.
Como se representa en la figura 11A, la transferencia a granel de muestra de la copa de muestra 230 a la proximidad del transductor óptico 170 se produce cuando las válvulas primera y segunda 236, 238 están abiertas y la bomba 232 es accionada, desplazando por lo tanto un volumen de muestra a la proximidad de la celda de flujo óptico 170. La distribución dosificada de la muestra por la jeringa WBC 206 a la celda de flujo óptico 170 se produce cuando las válvulas primera y segunda 236, 238 están cerradas, como se representa en la figura 11B, y el émbolo 240 de la jeringa WBC 206 se desplaza una distancia predeterminada a una velocidad especificada.
La figura 12 ilustra la transferencia a granel de una muestra desde una copa de muestra HGB 142 al transductor HGB 178. La copa de muestra HGB 142 está conectada al transductor HGB 178 y una bomba 246 por tubos 182. La bomba 246 puede ser sustancialmente parecida a la bomba 220. Una válvula 248 está colocada en el tubo 182 hacia abajo de la copa de muestra HGB 142. La transferencia a granel de muestra desde la copa de muestra HGB 142 al transductor HGB 178 se produce cuando la válvula 248 está abierta y la bomba peristáltica 246 es activada.
C. Celda de flujo óptico/Transductor
Dentro de la celda de flujo óptico 170 las células individuales están aisladas dentro de una corriente de fluido de manera que las propiedades ópticas de cada célula se puedan detectar y convertir a información significativa. Las figuras 15 y 16 ilustran una celda de flujo 170 para uso con el sistema analítico celular 60.
En una realización (ilustrada en la figura 43), la celda de flujo óptico 170 es un bloque de cuarzo claro con una cámara de flujo interior rectangular, alargada, fina 300 (figura 16) de dimensiones transversales de aproximadamente 160 \mu por 400 \mu. Un canal sustancialmente cónico en un ángulo de aproximadamente 30 grados converge a la cámara de flujo 300 en su extremo. Se inyecta una corriente de muestra diluida desde una boquilla 270 colocada en el centro de una corriente envuelta móvil 304 a la cámara de flujo 300 de tal forma que la porción de muestra de la corriente sea enfocada a una dimensión en sección transversal muy pequeña, aproximadamente 5 \mu x 80 \mu, normal al eje de flujo de la corriente y confinada en el centro de la cámara de flujo 300. Este proceso se denomina enfoque hidrodinámico o de fluido. En una posición predeterminada a lo largo del eje de la corriente enfocada, se dirige un haz láser a la cámara de flujo 300 desde una dirección ortogonal a la corriente de muestra fluida. En la región donde el haz láser intersecta la corriente de muestra enfocada, el haz láser también es enfocado ópticamente, como se describe más adelante en la sección 8. F, a una dimensión de aproximadamente 17 \mu en una dirección paralela al eje de flujo de la corriente. Así, se crea un volumen de muestra iluminado en el centro de la cámara de flujo 300 en la región donde se enfocan la corriente y el haz láser, delimitada en dos dimensiones por la extensión de la corriente, y en una tercera dimensión por la extensión del haz láser. Este volumen iluminado, con las dimensiones de aproximadamente 5 \mu x 80 \mu x 17 \mu es la región detectora de la celda de flujo 170. Cada célula es detectada cuando pasa por esta región y los datos son recogidos y procesados por el controlador y se refieren los resultados. Véase la figura 43.
A continuación se explican detalles ejemplares de la boquilla 270 con referencia a las figuras 31 a 36.
Como se representa en la figura 32, las realizaciones aquí descritas se refieren a una boquilla de fluido 270 y un método para introducir un fluido 812, el fluido 812 implicado es el fluido usado en el instrumento analítico.
En un empleo, ilustrado en la figura 31, la boquilla de fluido 270 está asociada operativamente con un conducto o una guía de flujo 814 del fluido 812 y una celda de flujo 170 que detecta un elemento de interés, tal como una célula, una partícula y análogos, presente en el fluido 812. En la realización ilustrada, la guía de flujo 814 incluye un conducto formado a partir de un material adecuado, tal como un polímero parecido a acrílico, incluyendo un agujero 818 para recibir la boquilla de fluido 270. La boquilla de fluido 270 está centrada sustancialmente con respecto a la guía de flujo 814 para facilitar la dirección del fluido 812 desde la boquilla de fluido 270 al agujero 818. Un conducto 820 está conectado por fluido con el agujero 818 de tal manera que un fluido deseado 844 de una fuente adecuada se pueda depositar en el agujero 818 a través del conducto 820. La celda de flujo 170, como se ha descrito anteriormente, puede ser una celda óptica de flujo que mide el elemento de interés en el fluido 812 cuando el fluido 812 fluye desde la boquilla de fluido 270 a través de la celda de flujo 170. La celda de flujo 170 se puede utilizar, en algunas realizaciones, para efectuar un análisis diferencial de glóbulos blancos, análisis de plaquetas y/o análisis de reticulocitos. En estas realizaciones, los pasos preparatorios para cada análisis se pueden realizar en recorridos de procesado, que pueden estar separados, y el análisis se puede realizar en una sola celda de flujo 170.
La construcción de la boquilla de fluido 270 se ilustra más claramente en las figuras 32 y 33. La boquilla de fluido 270 incluye en general un colector 822 y una pluralidad de conductos conectados de forma fluida con el colector 822. El número exacto de conductos se puede elegir para facilitar un empleo particular de la boquilla de fluido 270. Específicamente, en una realización ejemplar, un primer conducto 262, un segundo conducto 264 y un tercer conducto 266 están conectados de forma fluida con una porción del colector 822. Los conductos 262, 264 y 266 se pueden usar como entradas de fluido 812. Así, los conductos 262, 264 y 266 pueden estar conectados de forma fluida con fuentes adecuadas de fluido deseado 812.
En una realización particular, el colector 822 está hecho de un polímero adecuado, tal como acrílico y análogos, y tiene una longitud axial de aproximadamente 17,8 mm (0,7 pulgadas). Los conductos 262, 264 y 266 son de un metal adecuado, tal como acero inoxidable 316 y análogos. El conducto 262 puede tener una longitud axial de aproximadamente 1,14 pulgadas, un diámetro interno de aproximadamente 0,58 mm (0,023 pulgadas) y un diámetro externo de aproximadamente 1,58 mm (0,0625 pulgadas). Los conductos 264 y 266 pueden tener una longitud axial de aproximadamente 12,7 mm (0,5 pulgadas), un diámetro interno de aproximadamente 0,48 mm (0,019 pulgadas) y un diámetro externo de aproximadamente 1,59 mm (0,0625 pulgadas). Las superficies de diámetro exterior de los conductos 262, 264 y 266 se pueden recubrir con un adhesivo, tal como una epoxi y análogos, e introducir en agujeros complementarios 830, 832 y 834, respectivamente, formados en el colector 822. En la realización ilustrada, los conductos 262, 264 y 266 están desviados axial y circunferencialmente en el colector 822. El conducto 266 está desviado axialmente aproximadamente 1,8 mm (0,07 pulgadas) de un extremo 831 del colector 822. El conducto 264 está desviado aproximadamente 6,6 mm (0,26 pulgadas) del extremo 831 y el conducto 266 está desviado aproximadamente 11,4 mm (0,45 pulgadas) axialmente del extremo 831. Circunferencialmente, el conducto 262 está desviado aproximadamente 60 grados del conducto 264 y el conducto 266 está desviado aproximadamente 60 grados del conducto 264. Así, el conducto 262 está desviado aproximadamente 120 grados del conducto 266.
El colector 822 conecta de forma fluida los conductos 262, 264 y 266 con los conductos 272, 274 y 276, respectivamente, que también están asociados operativamente con el colector 822. El colector 822 puede permitir que uno de los conductos 272, 274 y 276 esté dedicado a un fluido particular o prueba realizada por el instrumento con el que la boquilla 270 está asociada.
Los conductos 272, 274 y 276 están dispuestos de forma sustancialmente coaxial y sustancialmente en el centro con respecto a la guía de flujo 814. La disposición de los conductos 272, 274 y 276 con respecto a la guía de flujo 814 y la celda de flujo 170 se puede elegir para proporcionar la exactitud posicional deseada del flujo de fluido 812 desde la boquilla 270 a la celda de flujo 170. El colector 822 incluye un agujero 42 para recibir la disposición sustancialmente coaxial de los conductos 272, 274 y 276. El colector 822 permite que el fluido 812 en los conductos 262, 264 y 266 fluya a través del colector 822 y a los conductos 272, 274 y 276, respectivamente. Los conductos 272, 274 y 276 son sustancialmente lineales en toda su longitud. Sin embargo, en algunas realizaciones, para preservar la disposición coaxial de los conductos 272, 274 y 276, se puede disponer un espaciador, no representado, radialmente entre los conductos 272 y 274 y entre los conductos 274 y 276. El separador está configurado, tal como disponiendo relieves, canales y análogos en la superficie de diámetro externo, de modo que no interfieran con el movimiento del fluido 812 en los conductos 272, 274 y 276. Aunque la realización ilustrada muestra extremos distales de los conductos 272, 274 y 276 desviados axialmente uno de otro, esto no es necesario.
En una realización ejemplar, el conducto 272 se hace de un metal adecuado, tal como acero inoxidable 304, tubo de aguja hipodérmica de temple nº 3 (duro pleno) y análogos. El conducto 272 tiene una longitud axial de aproximadamente 64,8 mm (2,55 pulgadas), un diámetro interno de aproximadamente 0,33 mm (0,013 pulgadas) y un diámetro externo de aproximadamente 0,64 mm (0,025 pulgadas). El conducto 274 también se hace de un metal adecuado, tal como acero inoxidable 304, tubo de aguja hipodérmica de temple nº 3 (duro pleno) y análogos. El conducto 274 tiene un diámetro interno de aproximadamente 0,97 mm (0,038 pulgadas), un diámetro externo de aproximadamente 1,27 mm (0,050 pulgadas) y una longitud axial de aproximadamente 57,4 mm (2,26 pulgadas). El conducto 276 se hace de un metal adecuado, tal como tubo de aguja hipodérmica de acero inoxidable 304 y análogos. El conducto 276 tiene un diámetro interno de aproximadamente 0,062 pulgadas, un diámetro externo de aproximadamente 1,98 mm (0,078 pulgadas) y una longitud axial de aproximadamente 50 mm (1,97 pulgadas).
En una realización, la guía de flujo 814 incluye una porción sustancialmente ahusada que tiene un diámetro interno de aproximadamente 6,35 mm (0,25 pulgadas), en el punto "A", y un diámetro interno de aproximadamente 3 mm (0,118 pulgadas), en el punto "B". Ambos puntos A y B se marcan en la figura 31. La relación entre las dimensiones de los conductos relevantes 272, 274 y 276 y las dimensiones correspondientes de la guía de flujo 814 puede ser predeterminada para proporcionar enfoque deseado del fluido 812, para reducir una probabilidad de contacto entre la guía de flujo 814 y el fluido 812, para optimizar la celda de flujo 170, por ejemplo, la óptica, la operación, etc. En algunas realizaciones, la relación dimensional se puede relacionar con el caudal diferencial. Específicamente, en una realización ejemplar, una sección transversal latitudinal de porciones relevantes de la guía de flujo 814 es proporcional a un caudal diferencial relacionado.
En una realización ejemplar, la porción ahusada define una pendiente de aproximadamente 60 grados. Una porción de transporte de fluido de la celda de flujo 170 junto a un extremo distal de la boquilla de fluido 270 define una pendiente de aproximadamente 30 grados con un diámetro interno de aproximadamente 3 mm (0,118 pulgadas). Las dimensiones se pueden elegir para producir la exactitud posicional prevista del flujo de fluido 812 con respecto a la celda de flujo 170.
Habiendo descrito así con detalle la construcción de la boquilla de fluido 270, ahora se explicará con detalle un método de introducir fluido con la boquilla de fluido 270.
Una fuente de fluido 812, tal como sangre, un componente de la sangre y análogos, a procesar por la celda de flujo 170, está conectada por fluido con uno de los conductos 262, 264 ó 266 de tal manera que fluya fluido 812 desde la fuente al conducto seleccionado 262, 264 ó 266. Los otros conductos 262, 264 ó 266 que no están conectados de forma fluida con la fuente de fluido 812, no reciben fluido 812. El fluido 812 contiene un elemento de interés, tal como una partícula, una célula y análogos, detectable por la celda de flujo 170.
Una fuente de otro fluido 844, tal como agua, solución tampón, diluyente u otro fluido que no reaccione adversamente con el fluido 812, y análogos, está conectada por fluido con el conducto 820 de tal manera que el otro fluido 844 fluya desde la fuente al conducto 820 y la guía de flujo 814. El fluido 844 que fluye desde el conducto 820 a la guía de flujo 814 rodea una porción de los conductos 272, 274 y 276, como se representa en las figuras 34 a 36. Las disposiciones desviadas de los conductos 272, 274 y 276 permiten la reducción de las discontinuidades del flujo de fluido 844. Una reducción gradual en la sección transversal latitudinal del recorrido de flujo de fluido mediante la guía de flujo 814 permite una reducción de la probabilidad de difusión de fluido dentro de la guía de flujo 814. Si se desea, cuando fluye fluido 812 desde uno de los conductos 272, 274 ó 276, los otros dos conductos 272, 274 ó 276 se pueden limpiar o "purgar" con fluido 844 aplicando una fuente apropiada de presión relativamente reducida, por ejemplo, a los conductos 272, 274 ó 276 que se limpian. Alternativamente, después de haber introducido secuencialmente fluido 812 mediante cada uno de los conductos 272, 274 y 276, todos los conductos 272, 274 y 276 se pueden limpiar simultáneamente pasando un fluido apropiado por los conductos. Así, dado que todos los conductos 272, 274 y 276 se pueden limpiar de forma sustancialmente simultánea, se puede incrementar la producción de la celda de flujo 170 reduciendo el tiempo de parada necesario para limpiar la boquilla 270 realizando también la introducción rápida de fluido 812. Esto también puede aumentar correspondientemente la producción del instrumento analítico con el que la celda de flujo 170 está asociada.
En una realización ejemplar, el caudal de fluido 844 es mayor que el caudal de fluido 812. Por ejemplo, en una realización, el caudal de fluido 812 es aproximadamente 2,5 \mul por segundo y el caudal del fluido 844 es aproximadamente 300 \mul por segundo. Este caudal diferencial dirige de forma fluida o enfoca el flujo de fluido 812 hacia la celda de flujo 170. En general, la velocidad diferencial de flujo puede ser predeterminada de tal manera que se facilite la detección del elemento de interés en el fluido 812 por la celda de flujo 170.
El enfoque de fluido proporcionado por el caudal diferencial es sustancialmente similar independientemente del conducto 272, 274 ó 276 elegido para introducir el fluido 812 puesto que el fluido 812 introducido desde el conducto 272, 274 ó 276 es enfocado de forma fluida sustancialmente hacia la misma posición con respecto a la celda de flujo 170. Esto permite que los fluidos 812 de cada uno de los conductos 272, 274 y 276, y las pruebas realizadas por el instrumento con el que la boquilla de fluido 270 está asociada, compartan la misma celda de flujo 170. Por consiguiente, cada uno de los conductos 272, 274 y 276 puede estar conectado de forma fluida con una fuente separada de fluido 812 de tal manera que se reduzca la probabilidad de que el fluido 812 de una fuente pueda encontrar el fluido 812 de otra fuente. Así, se puede reducir la probabilidad de cruce de fluido 812 y/o contaminación de fluido 812. Los fluidos 812 de cada uno de los conductos 272, 274 y 276 pueden ser procesados por la celda de flujo 170 de forma sustancialmente paralela, mejorando por ello la producción de la boquilla de fluido 270 y el instrumento con el que la boquilla 270 está asociada.
Esta capacidad de la boquilla de fluido 270 se ha verificado empíricamente. En un experimento, ilustrado en las figuras 34 a 272, se analizó una realización ejemplar de la boquilla de fluido 270 por un método de elementos finitos para revelar las propiedades fluidas asociadas con la boquilla 270. En esta realización, el conducto 272 tiene un diámetro interno de aproximadamente 0,33 mm (0,013 pulgadas). El extremo distal del conducto 274 está desviado de forma próxima aproximadamente 7,4 mm (0,29 pulgadas) del extremo distal del conducto 272. Los conductos 272 y 274 definen un recorrido de flujo de fluido sustancialmente anular que tiene un diámetro interno de aproximadamente 0,64 mm (0,025 pulgadas) y un diámetro externo de aproximadamente 0,94 mm (0,037 pulgadas). El extremo distal del conducto 276 está desviado de forma próxima aproximadamente 0,29 pulgadas de un extremo distal del conducto 274. Los conductos 274 y 276 definen un recorrido de flujo de fluido sustancialmente anular que tiene un diámetro interno de aproximadamente 1,25 mm (0,049 pulgadas) y un diámetro externo de aproximadamente 1,55 mm (0,061 pulgadas).
El análisis de elementos finitos se realizó usando un programa informático FIDAP, versión 6.01, que se puede adquirir de Fluid Dynamics International de Evanston, Illinois. Se analizaron modelos axisimétricos constantes de flujo de fluido mediante los conductos 272, 274 y 276 y modelos tridimensionales constantes de flujo de fluido mediante la celda de flujo 170 para mostrar que la posición del fluido enfocado de forma fluida 812 con respecto a la celda de flujo 170 es independiente del conducto 272, 274 o 276 usado para introducir fluido 812. En todos los casos, el caudal de fluido del fluido 844 es aproximadamente 300 \mul por segundo y el caudal de fluido del fluido 812 mediante el conducto elegido 272, 274 ó 276 está sustancialmente dentro del rango de aproximadamente 2,5 \mul por segundo a aproximadamente 2,0 \mul por segundo. Los análisis supusieron propiedades fluidas newtonianas sin condiciones límite de deslizamiento en las superficies sólidas.
En un ejemplo, para simular análisis diferencial de glóbulos blancos, análisis de plaquetas, y análisis de reticulocitos, se realizaron tres análisis de fluido separados. El fluido del análisis diferencial de glóbulos blancos 812 se introduce a través del conducto 272, como se representa en la figura 34, a un caudal de fluido de aproximadamente 2,5 \mul por segundo. Como se representa en la figura 35, el fluido de análisis de plaquetas 812 se introduce a través del conducto 274 también a un caudal de fluido de aproximadamente 2,5 \mul por segundo. El fluido de análisis de reticulocitos 812 se dirige a través del conducto 276, como se representa en la figura 36, a una velocidad de aproximadamente 2,0 \mul por segundo. Después de la comparación de las figuras 34 a 272, los recorridos de flujo de fluido de los conductos respectivos 272, 274 y 276 resultantes de los análisis de fluido demuestran que no se produce contaminación de un flujo de fluido 812 por un flujo de fluido anterior 812 y que la posición del fluido enfocado de forma fluida 812 con respecto a la celda de flujo 170 es independiente de qué conducto 272, 274 ó 276 se seleccione.
La independencia de la posición del fluido enfocado de forma fluida 812 con respecto a la celda de flujo 170 con respecto a la selección del conducto 272, 274 ó 276 también se verifica experimentalmente midiendo ópticamente el flujo de fluido 812 conteniendo perlas de 7 \mum de diámetro secuencialmente mediante cada uno de los conductos 272, 274 y 276. El fluido 812 conteniendo las perlas se introduce a un caudal de fluido de aproximadamente 2 \mul por segundo.
% C.V., índice en coincidencia
ALL IAS DSS
Conducto 272 4,7 3,2 2,6
4,3 3,1 2,2
Conducto 274 5,0 3,6 2,0
4,6 4,2 2,6
Conducto 276 4,3 31 2,4
5,1 28 2,7
Como es evidente por los coeficientes de variación anteriores, los coeficientes de variación (CV) para tres propiedades ópticas medidas (ALL: pérdida de luz axial; IAS: dispersión de ángulo intermedio; y DSS: dispersión lateral despolarizada) son sustancialmente similares para todos los conductos 272, 274 y 276. Esta semejanza en la respuesta óptica verifica que la boquilla de fluido 270 se puede usar para múltiples mediciones del fluido de interés 812 antes de cualquier paso de limpieza, incrementando por ello la producción o capacidad analítica de la celda de flujo 170 y cualquier instrumento asociado con la celda de flujo 170. El número de mediciones de fluido 812 o introducciones de fluido 812 que se pueden producir antes de la limpieza corresponde al número de conductos provistos con la boquilla de fluido 270. Independientemente del número de conductos implicados, las realizaciones aquí descritas permiten sustancialmente la limpieza simultánea de sustancialmente todos los conductos.
Si el fluido 812 tuviese suficiente propensión a interactuar con o adherirse a una porción de los conductos 272, 274 y 276, los restos de un primer fluido en el conducto 272, 274 ó 276 pueden encontrar (es decir, transferir) un segundo fluido pasado por el mismo conducto 272, 274 ó 276. Cuestiones similares están presentes con respecto a los conductos 262, 264 y 28. Estas cuestiones pueden poner en peligro la exactitud de la celda de flujo 170.
Para afrontar estas cuestiones, es posible dedicar un conducto específico 272, 274 o 276 a un fluido específico 812 o prueba realizada por la celda de flujo 170. El número de conductos 272, 274 y 276 así dedicado puede depender de las propiedades de los fluidos 812 introducidos por la boquilla de fluido 270. Aislando sustancialmente al menos uno de los conductos 272, 274 y 276, se puede reducir la transferencia de un fluido 812 a otro fluido 812. Por ejemplo, un conducto 272, 274 ó 276 podría estar dedicado a una prueba que utilice un fluido 812 conteniendo un marcador fluorescente relativamente brillante, tal como auromina O y análogos, y otro conducto 272, 274 ó 276 podría estar dedicado a una prueba que utilice un fluido conteniendo un marcador fluorescente relativamente tenue. Una vez que los fluidos salen de los conductos 272, 274 ó 276, el volumen y flujo de fluido 844 mediante la guía de flujo 814 es suficiente para reducir la probabilidad de difusión de fluido 812 enfocando al mismo tiempo de forma fluida el fluido 812 hacia una celda de flujo común 170. Así, las dos pruebas se pueden realizar sustancialmente secuencialmente por la misma celda de flujo 170 sin poner en peligro sustancialmente la exactitud o sensibilidad de la celda de flujo
170.
Al subir a la sección transversal rectangular de la celda de flujo 170, la velocidad aumenta rápidamente, lo que enfoca hidrodinámicamente la corriente de muestra a un núcleo central que mide aproximadamente 5 \mu x 80 \mu de sección transversal. La pequeña dimensión de 5 \mu, que es en la dirección de enfoque de la lente condensadora de ángulo ancho ilustrada en la figura 22, garantiza mínimo desenfoque y por lo tanto igual brillo de células fluorescentes situadas en posiciones diferentes dentro de la corriente. Además, dado que la anchura de la cámara de flujo 300 es mucho más grande que la corriente de muestra, la cámara de flujo 300 no se obstruirá fácilmente; sin embargo, todavía da resolución comparable a la proporcionada por una región de detección más pequeña.
Una lente de enfoque (representada en la figura 19) enfoca un haz láser en la cámara de flujo 300, y detectores (representados en las figuras 20 y 21) detectan las propiedades de dispersión de luz y/o fluorescencia de células que pasan por la cámara de flujo 300. Estas características se describen con más detalle en la sección 8.F de esta descripción.
D. Transductor de impedancia
El sistema analítico celular 60 puede usar un transductor de impedancia 174 para contar glóbulos rojos y plaquetas. La figura 17 ilustra una realización preferida de un transductor de impedancia 174 que realiza recuento y determinación de tamaño de células basados en impedancia, y hace uso de enfoque hidrodinámico. El recuento de células por impedancia se basa en la detección de cambios de resistencia eléctrica producidos por una partícula cuando pasa por un orificio pequeño 314. La conducción la facilita un fluido electrolítico (tal como salina tamponada y análogos) en dos cámaras 310, 312 del transductor de impedancia 174.
Una boquilla de introducción de muestra 316 y enfoque hidrodinámico dirigen células al orificio 314 del transductor de impedancia 174. Cuando cada célula pasa por el orificio 314, aumenta la resistencia eléctrica del recorrido a través de las cámaras 310, 312 y el orificio 314. Una fuente de corriente 317 conectada a dos electrodos, descritos más adelante, dispuestos en las cámaras 310, 312 a ambos lados del orificio 314 hace que este aumento de resistencia se manifieste como un pulso de voltaje eléctrico. La boquilla de introducción de muestra 316 también sirve como el electrodo de lado situado hacia arriba. El electrodo secundario 318 está situado hacia abajo del orificio 314. El número de pulsos es indicativo del recuento de células, mientras que la amplitud de cada impulso está relacionada con el volumen de células. Se crean histogramas de volumen representando las distribuciones de frecuencia de amplitudes de pulsos. Estos histogramas se utilizan para obtener parámetros RBC y PLT tal como MCV (volumen medio de células) y RDW (anchura de la distribución de glóbulos rojos).
El transductor de impedancia 174 se hace preferiblemente de un material que es no conductor y transparente, tal como acrílico, un polímero similar o análogos. El electrodo secundario 318 en el transductor 174 es preferiblemente de platino porque la electrólisis a esta polaridad crea gases corrosivos que pueden disolver algunos otros materiales de electrodo. Se puede usar para el electrodo 318 otros materiales que tienen una resistencia similar a la corrosión. El volumen de la cámara 310 en el lado ascendente del transductor 174 se puede reducir sin afectar a la operación del transductor 174 para las aplicaciones descritas. La boquilla de introducción de muestra 316 se coloca preferiblemente dentro de aproximadamente 1,5 mm del orificio 314. La distancia entre la boquilla 316 y el orificio 314 se deberá mantener durante la operación, así como una velocidad de envuelta relativamente alta (aproximadamente 10 m/s a través del orificio).
Aproximadamente 30% de las células que fluyen a través de un transductor de impedancia enfocado de forma no hidrodinámica pasan cerca de los bordes del orificio de la celda de flujo en vez de pasar por su centro. Esto puede obstruir el orificio y producir mediciones distorsionadas. El enfoque hidrodinámico se puede utilizar en el transductor de impedancia 174 del sistema analítico celular 60 para reducir las obstrucciones y mejorar la exactitud de la medición.
El enfoque hidrodinámico se lleva a cabo en el transductor de impedancia 174 mediante el procedimiento siguiente. La jeringa de distribución de RBC 204 (representada en las figuras 10A y 10B) suministra la muestra a la boquilla 316 del transductor de impedancia 174 a una velocidad de aproximadamente 0,333 \mul/s. Cuando la muestra fluida sale de la boquilla del transductor de impedancia 316, se acelera a una velocidad de aproximadamente 10 m/s por un flujo envolvente RBC 315. Dado que la velocidad de flujo volumétrico de la muestra, que es preferiblemente sustancialmente constante a aproximadamente 0,333 \mul/s, es el producto de la velocidad y el área en sección transversal, esta zona disminuye a medida que se acelera la muestra. En una realización preferida, la aceleración a 10 m/s hace que el diámetro de la corriente de muestra disminuya a aproximadamente 6,5 \mum.
El transductor de impedancia 174 está provisto de un tubo de residuos 314a situado inmediatamente hacia abajo del orificio 314 para "capturar" glóbulos rojos cuando salen del orificio. Si los glóbulos rojos no se desechan después de salir del orificio 314, pueden volver a la proximidad del orificio, y por lo tanto generar señales que distorsionan las mediciones de plaquetas y en menor grado distorsionan la medición de glóbulos rojos. Para contribuir a capturar células medidas, se facilita un flujo secundario (mediante el orificio E) solamente para empujar las células hacia abajo del tubo de residuos 314a.
El transductor de impedancia 174 también está provisto de varios orificios (A, B, C, D y E). El orificio A proporciona un agujero de ventilación para ventilar aire (u otros gases) del lado ascendente del orificio 314. El orificio B proporciona una entrada para inyectar aire a la cámara 310 para drenar el lado ascendente del transductor 174. El orificio D proporciona el drenaje para el lado ascendente del transductor, junto con un orificio de entrada envolvente. El orificio C proporciona una entrada para inyectar aire a la cámara 312 para drenar el lado descendente del transductor 174. El orificio C también proporciona un agujero de ventilación para ventilar gas del lado descendente del transductor 174. El orificio E proporciona un drenaje y una entrada para el flujo secundario. El orificio G proporciona una salida para residuos. El orificio H, aunque no se usa en la presente realización, se puede usar para proporcionar un punto de entrada tangencial para fluidos adicionales al lado ascendente del transductor 174.
E. Transductor HGB
El transductor HGB 178 mide la absorción óptica de células en una muestra de sangre para determinar los niveles de HGB en la muestra de sangre. Un transductor HGB 178 se representa en la figura 18, junto con un diagrama de bloques de circuitería para detectar y analizar señales del transductor HGB 178. En una realización, la concentración de HGB se mide en gramos por decilitro, y es proporcional a la cantidad de luz absorbida por una muestra en la región verde de longitud de onda (aproximadamente 540 nm).
El transductor HGB 178 genera una señal eléctrica que está relacionada con la absorción de luz del líquido en la cámara de transductor HGB 338. La absorción de luz se mide en el transductor HGB 178 para una muestra preparada conteniendo hemoglobina y para una solución de referencia clara. La diferencia en señal eléctrica generada por el transductor durante estas dos mediciones es aproximadamente proporcional al contenido de hemoglobina de la muestra preparada.
La cámara de transductor HGB 338, que puede ser transparente, está colocada entre una fuente de luz 322, tal como un diodo fotoemisor y análogos, y un detector 326, tal como un fotodiodo, un fototransistor y análogos (figura 18). Un filtro de interferencia 326, preferiblemente a un régimen de aproximadamente 540 nm, se coloca entre la cámara de transductor HGB 338 y el detector 324. La corriente salida del detector 324, que es aproximadamente proporcional a la energía luminosa recibida, es amplificada por un amplificador de corriente a voltaje 332. El procesado de señal analógica de las señales HGB se explica en la sección B.F de esta descripción en conexión con los sistemas electrónicos.
Se mezcla sangre entera en la copa HGB 142 por la velocidad del reactivo lisante HGB entrante a una relación de dilución preferiblemente de aproximadamente 190:1. Se utiliza una bomba 246, que puede ser peristáltica, para aspirar una muestra de la copa HGB 142, mediante una red de tubos 182 conectada a la copa HGB 142, y a la cámara de transductor HGB 338. La copa HGB 142 se enjuaga lavando el reactivo lisante HGB para reducir toda transferencia de una muestra con las muestras siguientes. Se coloca reactivo HGB directamente al transductor HGB para proporcionar la lectura de referencia HGB.
F. Banco óptico
Una vista en planta del banco óptico 350 se representa en la figura 19. El banco óptico 350 está montado en el módulo analizador 64 e incluye una fuente de luz láser 352, espejos 354, 356, lentes 358, 360, una celda de flujo 170 (sílice fundida en una realización ejemplar), y varios detectores 400, 402, 404. El haz láser 368 se dirige por un espejo trasero 354, un espejo delantero 356, un ajustador de haz 370, es conformado y enfocado por un par de lentes cilíndricas 358 y una lente de enfoque de láser 360.
El láser 352 es preferiblemente un láser de argón refrigerado por aire, verticalmente polarizado 488 nm (Uniphase 2114B-125LAB, o equivalente) que opera en el modo TEM (electromagnético transversal) con realimentación de luz. En este modo, la intensidad luminosa tiene una distribución gaussiana y está en fase. El haz láser 368 se mantiene a aproximadamente 10 mW por el sistema de realimentación de luz dentro de la circuitería láser.
Los elementos ópticos entre el láser 352 y la celda de flujo óptico 170 están construidos de manera que la cintura del haz focal gaussiano en la cámara de flujo 300 de la celda de flujo óptico 170 sea sustancialmente elíptica y mida aproximadamente 17 \mu de alto por aproximadamente 64 \mu de ancho. La cintura del haz se define como la posición a lo largo del eje del haz láser donde la dimensión del haz en sección transversal, en una dirección dada normal al eje, es mínima. En la realización preferida representada en la figura 19, el sistema óptico se caracteriza por dos planos de simetría ortogonales, un plano vertical y un plano horizontal, conteniendo cada uno de estos planos el eje óptico del haz láser. Por lo tanto, en cualquier posición a lo largo del eje del haz, la extensión del haz se define por dos dimensiones ortogonales, una dimensión vertical, y una dimensión horizontal. La dimensión vertical se define como la distancia lineal, en el plano vertical medido normal al eje óptico, entre los puntos donde la intensidad es 1/e^{2} veces la intensidad máxima que se produce en el centro del haz. La dimensión horizontal correspondiente se define de forma idéntica a excepción de que cae en el plano horizontal. Esta configuración del haz se lleva a cabo por un par de lentes cilíndricas 358 que hacen de un expansor vertical del haz. Preferiblemente la lente situada hacia arriba tiene una longitud focal de aproximadamente -18,8 mm, y la lente situada hacia abajo tiene una longitud focal de aproximadamente +75,4 mm. Las lentes 358 están colocadas ligeramente descentradas de la condición confocal de manera que se produzca una cintura vertical y horizontal coincidente en la cámara de flujo 300. Preferiblemente, la lente de enfoque 360 es esférica con una longitud focal de aproximadamente 79,5 mm.
Un mecanismo de ajuste fino del haz 370 está colocado entre la lente de enfoque de láser 360 y la celda de flujo 170. Este mecanismo consta de un par de pequeñas cuñas de 10° con un espacio de aire ajustable que se usa para producir un desplazamiento lateral fino del haz láser con relación a la corriente de muestra. Estas cuñas se orientan con las superficies de entrada y salida normales al eje del haz láser. El espacio de aire se puede ajustar por medio de un tornillo de paso 32 en una dirección paralela al eje del láser. La relación del espacio de aire al desplazamiento lateral del haz es 10,5/1 al utilizar vidrio BK7 como el material de cuña. Una vuelta completa del tornillo de paso 32 mueve así el haz láser incidente lateralmente \pm75 \mu con relación a la corriente de muestra, sin producir ningún cambio en el ángulo de iluminación incidente. La resolución del desplazamiento lateral del haz es algo inferior a \pm1 \mu. Este sistema, en unión con el diseño de la óptica de captación de ángulo delantero y lateral, permite el fácil control para alinear de forma óptima el haz láser a la corriente de muestra sin afectar a la alineación de la óptica siguiente.
La cámara de flujo 300 de la celda de flujo 170 tiene preferiblemente una relación de aspecto de aproximadamente 2,5x. El enfoque hidrodinámico dentro de la celda de flujo óptico 170 crea una corriente central de muestra sustancialmente elíptica con una relación de aspecto de aproximadamente 15x. Cuando el caudal de muestra es aproximadamente 2,0 \mul/s, la corriente de muestra resultante es un cilindro sustancialmente elíptico. Las dimensiones de longitud y anchura de la corriente de muestra son aproximadamente 80 \mu x 5,0 \mu. La anchura de la corriente de aproximadamente 5 \mu corresponde a la cintura focal horizontal de aproximadamente 80 \mu. Esto da lugar a una variación de intensidad máxima dentro de la corriente de aproximadamente 1%.
La cintura focal vertical de aproximadamente 17 \mu da lugar a una anchura de impulso de aproximadamente 2,0 a 3,5 \mu/s, dependiendo del tamaño de célula, siempre que una célula pasa por el haz láser 368 a la velocidad nominal de la corriente de aproximadamente 8 metros/s.
Los detectores 380, 400, 402, y 404 miden los efectos de las células que pasan a través de la celda de flujo 170. Preferiblemente, los detectores 380, 400, 402, y 404 son capaces de medir al menos siete parámetros ópticos. Se coloca uno o más detectores preferiblemente en el recorrido directo de luz para medir la dispersión directa de ángulo intermedio y la dispersión directa de ángulo pequeño o la pérdida de luz axial (ALL, también denominada extinción directa). ALL es generalmente la disminución de energía luminosa debida a que una célula pasa delante de un haz láser y es detectada por un fotodiodo. La pérdida de luz se debe generalmente a dispersión. Preferiblemente, un parámetro medido es ALL, definido como la disminución de energía luminosa que llega a un detector en el recorrido de un haz láser debido al paso de una célula por dicho haz. La dispersión directa de ángulo pequeño, en contraposición, es energía luminosa que llega a un detector fuera de (pero dentro de un estrecho ángulo de 1° a 3°) el haz láser incidente debido a dispersión de una célula que pasa a través del haz. Se dispone generalmente un tope de haz para impedir que el haz láser llegue al detector. Los sistemas de medición ALL recogen luz dentro del cono incidente de iluminación láser, mientras que los sistemas de dispersión de ángulo pequeño recogen luz fuera de este cono. En sistemas de medición ALL, la señal de interés es una señal negativa restada de la señal láser de régimen constante, mientras que en medición de dispersión directa de ángulo pequeño la señal es una señal positiva pequeña impuesta en un nivel de luz de fondo muy bajo. La dispersión directa de ángulo intermedio (IAS) es similar a la dispersión directa de ángulo pequeño, a excepción de que la luz se dispersa a un ángulo más grande del haz láser incidente. Más específicamente, IAS se refiere a luz dispersada en un aro entre aproximadamente 3 y 10 grados lejos de la línea incidente o central de un haz láser. En una realización preferida, ALL se recoge en los ángulos de menos de aproximadamente 0,3 grados horizontalmente y menos de aproximadamente 1,2 grados verticalmente del eje del láser, e IAS se recoge a ángulos de entre aproximadamente 3 grados y 10 grados del eje del láser.
El sistema óptico de recorrido directo preferido representado en las figuras 19 y 20 incluye una lente esférica plano-convexa 376 y un fotodiodo de dos elementos 380 situado en el plano focal trasero de la lente. En esta configuración preferida, cada punto dentro del fotodiodo de dos elementos 380 se aplica a un ángulo específico de recogida de luz de células que pasan por la cámara de flujo 300, independientemente de la posición de las células. Así, el elemento interno 382 es preferiblemente sustancialmente rectangular, que por consiguiente se aplica a la asimetría de la divergencia de haz láser, y mide ALL. El elemento externo 384 es preferiblemente un aro sustancialmente circular y por consiguiente se aplica al rango de ángulos de recogida de dispersión directa deseados para la medición de IAS.
Esta alineación del recorrido directo es independiente de la celda de flujo óptico 170 y la alineación fina de haz láser. Para proporcionar la geometría de recogida deseada, la posición lateral del detector de dos elementos se alinea con respecto a la lente de recogida 376. Cambiar la celda de flujo óptico 170, o reajustar el haz láser incidente 368 por medio del elemento 370, que solamente reposiciona el haz sin efectuar redistribución angular, no tiene efecto en la aceptación angular del detector 380, y por lo tanto no requiere ningún reajuste correspondiente de la óptica de recorrido directo.
Alternativamente, el detector unitario de dos elementos 380 se podría sustituir por dos detectores separados. En este caso, se colocaría un espejo con un agujero central de diámetro apropiado en el plano trasero de la lente 376. El espejo reflejaría IAS a uno de los detectores. Una hendidura, coincidente con el agujero central del espejo y conformada para pasar solamente el haz láser, transmitiría luz para medición ALL al segundo detector situado detrás del espejo.
Ambos esquemas antes descritos son una variación en sistemas de recogida de ángulo pequeño. Los esquemas descritos no requieren una barra de oscurecimiento y sus ajustes relacionados. En el primer caso preferido, ambos detectores se pueden incorporar en un chip. No se requiere espejo. La incorporación de un filtro de densidad neutra 386, como se representa en la figura 20, es deseable para evitar que la señal All sature el elemento ALL interior 382. Preferiblemente, el filtro 386 se obtiene recubriendo el elemento ALL interior 382 con un recubrimiento de Neutral Density 2.0 (un recubrimiento que transmite aproximadamente 1 de la luz incidente). Se puede recubrir un recubrimiento antirreflexión sobre el elemento IAS exterior 384.
En una realización ejemplar, como se ilustra en las figuras 19 y 21, los detectores restantes 400, 402 y 404 son tres tubos fotomultiplicadores (PMTs) que detectan dispersión lateral (luz dispersada en un cono cuyo eje es aproximadamente perpendicular al haz láser incidente) o fluorescencia (luz emitida por las células a una longitud de onda diferente del haz láser incidente). Un polarizador móvil, 436, colocado en el recorrido de luz de PMT 400 configura los PMTs 400 y 401 para detectar dispersión lateral despolarizada (DSS) y dispersión lateral polarizada (PSS), respectivamente, mientras que los filtros móviles (430, 432, 434) permiten la detección de emisiones fluorescentes a longitudes de onda especificadas de las células. FL1, fluorescencia verde, se detecta entre aproximadamente 515 y 545 nm. FL2, fluorescencia amarilla, se detecta entre aproximadamente 565 y 595 nm. FL3, fluorescencia roja, se detecta entre aproximadamente 615 y 645 nm. Las emisiones de dispersión lateral y fluorescente se dirigen a estos PMTs por divisores de haz dicroicos 401 y 403 que transmiten y reflejan eficientemente las longitudes de onda requeridas para permitir una detección eficiente.
La sensibilidad se mejora en los PMTS 400, 402, y 404, cuando se mide fluorescencia, utilizando un sistema de recogida por inmersión como se ilustra en la figura 22. En este ejemplo, el sistema de recogida por inmersión es uno que acopla ópticamente la primera lente 414 a la celda de flujo 170 por medio de una capa de coincidencia de índice de refracción 416, permitiendo la recogida de luz en un ángulo ancho. En una realización preferida, este ángulo de recogida es aproximadamente 130° a la corriente de muestra, comparable a aproximadamente 44° en un sistema condensador de espacio de aire típico con una apertura numérica de 0,5. Se puede mostrar matemáticamente que la energía de fluorescencia recogida de una partícula fluorescente es proporcional a (1-cosU), donde U se define como la mitad del ángulo cónico de recogida. Así el sistema de 130° preferido recoge casi 8 veces más energía que el sistema de 44°, una diferencia que permite la detección de fluorescencia con láseres más pequeños de baja potencia y/o marcadores de fluorescencia más débiles. El sistema también se corrige en color de manera que se pueda usar un recorrido óptico dado para longitudes de onda sustancialmente diferentes sin reenfoque. Esto permite que un solo PMT detecte varias longitudes de onda de luz interponiendo o sacando filtros ópticos 430, 432, 434.
Como se representa en las figuras 21, 22 y 24, el sistema ilustrado de recogida por inmersión es telocéntrico de tal manera que la superficie de cátodo de un PMT dado se conjugue con un tope de apertura de objetivo 410 (representado en la figura 22) y situado al infinito con respecto a la cámara de flujo 300 de la celda de flujo 170. Esta construcción reduce la necesidad de alineación precisa de los PMTs uno con respecto a otro y la cámara de flujo 300.
Como se representa en la figura 22, el condensador 412 incluye preferiblemente un primer elemento plano-semiesférico 414 acoplado ópticamente a la celda de flujo de cuarzo 170 por una capa de gel de coincidencia de índice 416. En general, el condensador 412 es un sistema de lentes ópticas con corrección de aberración suficiente para recogida de luz de ángulo grande, pero no suficiente para formación de imágenes limitada por difracción utilizada en microscopia de alta resolución. Un gel adecuado es el que se puede adquirir de Dow Corning (número de identificación #02-3067). Las especificaciones de una realización preferida del condensador se exponen en la Tabla 1.
TABLA 1
R_{1} \rightarrow \infty
t_{12} = 1,82 (ventana de SiO_{2})
R_{2} \rightarrow \infty
t_{23} = 3,913 (FK5 - vidrio flint en corona #487704)
R_{3} = -3,913
d_{34} = 0,929 (Espacio de aire)
R_{4} = -54,7
t_{45} = 5,14 (FK5)
R_{5} = -9,753
d_{56} = 3,348 (Espacio de aire)
R_{6} = 45,7
t_{67} = 2,0 (SF5 - vidrio flint denso #673322)
R_{7} = 16,853
t_{78} = 7,9 (BK7)
R_{8} = -24,028
t_{89} = 0,635 (Espacio de aire)
R_{9} = 35,649
t_{910} = 2,0 (SF5)
R_{10} = 13,014
TABLA 1 (continuación)
t_{1011} = 6,95 (BK7)
R_{11} = -120,59
A = 3,913 + 0,02/-0,12
B = 1,82 \pm 0,02
C = 0,16 \pm 0,02
D = 0,929
El sistema óptico PMT es preferiblemente modular y se ilustra en las figuras 23 y 24. Cada módulo PMT incluye 1 ó 2 PMTs y un conjunto de hendidura/lente de campo 420, que incluye una hendidura 422 y lentes de campo 424 y 425 (figuras 23 y 24). La hendidura 422, que se conjuga con la cámara de flujo 300, minimiza la luz de fondo al cátodo del PMT 400. Las lentes de campo 424 (preferiblemente con longitud focal de aproximadamente -12,0 mm) y 425 (preferiblemente con longitud focal de aproximadamente 15,0 mm) efectúan la configuración telocéntrica explicada anteriormente. Filtros ópticos 430, 432, 434 y el polarizador 436 están introducidos en los recorridos de luz de los PMTs para cambiar la longitud de onda y/o la polarización de la luz detectada. Además, las dimensiones siguientes se refieren a la figura 24:
A = 46,0
B = 20,61
C = 22,98
D = + 14,976
E = 13,292
F = 0,522
G = 2,0
H = 6,7
I = 3,8
J = 3,78
K = 22,98
L = F_{530} = -12,025
R_{1} = -6,248
\Phi = 5,0
t_{1} = 2,0 (BK7)
R_{2} \rightarrow \infty
Q_{2} = 10,0
M = 6,43
Se deberá indicar que el sistema se diseña de manera que se pueda añadir fácilmente un tercer módulo PMT, que, con la adición de espejos dicroicos apropiados y filtros de paso de banda, permitiría incorporar hasta 6 PMTs en el sistema. Por ejemplo, cabría imaginar un análisis sofisticado que requiera mediciones simultáneas de cuatro detectores de fluorescencia junto con dispersión lateral polarizada (PSS) y despolarizada (DSS).
En una realización ejemplar, ALL se mide por un fotodiodo sustancialmente rectangular y un filtro N.D. 2,0 (véase la figura 20). IAS se mide por un fotodiodo de aro exterior sin filtro. PSS se mide con un Hamamatzu R928 PMT (402) sin filtro. DSS se mide por un R928 PMT (400) y un polarizador horizontal (436). FL1 se mide con un R928 (400) PMT y un filtro 530/30 (un filtro de paso de banda centrado a aproximadamente 530 nm con una banda de paso de aproximadamente 30 nm, 430). FL2 se mide por un R928 PMT 402 y un filtro de paso de banda 580/30 (432). FL3 se mide con un R928 PMT (404) y un filtro de paso de banda 630/30 (434).
9. Unidad neumática
En una realización preferida del sistema analítico celular 60, la unidad neumática 72 es una unidad separada que tiene un suministro de potencia dedicado. Esta construcción reduce el peso, tamaño y consumo de potencia del módulo analizador 64 y el módulo de estación de datos 68.
La unidad neumática 72 incluye una bomba de presión y una bomba de vacío. Proporciona una presión regulada de aproximadamente 0,58\cdot10^{5} Pa (8 1/2 psi), otra presión desde aproximadamente 12-15 psi, una presión mayor de aproximadamente 0,83\cdot10^{5} Pa - 1,03\cdot10^{5} Pa (12-15 psi), una presión más alta de aproximadamente 2,75\cdot10^{5} Pa (40 libras por pulgada cuadrada) y un vacío de aproximadamente 0,52\cdot10^{5} Pa (15 pulgadas de mercurio).
Las presiones de vacío son controladas por el software analizador presente en una memoria adecuada, tal como una RAM, una ROM, una EPROM, una SRAM y análogos.
10. Estación de datos/ordenador
El módulo de estación de datos 68 es preferiblemente un ordenador compatible PC basado en 80386 ó 80486 incluyendo un terminal de visualización, unidad de disco, disco duro, teclado, puntero y conexión LAN. En una realización ejemplar, el terminal de visualización es en color, la unidad de disco es de 3,5 pulgadas, el disco duro tiene al menos 540 megabytes de memoria y el teclado es de tipo PC. La estación de datos 68 puede estar provista de memorias, tal como RAMs, ROMs, SRAMs, EPROMs y análogos, conteniendo suficientes algoritmos de software para manipular datos medidos, calcular parámetros, y presentar resultados en varios formatos, incluyendo histogramas, diagramas de dispersión, y otros gráficos multidimensionales.
La estación de datos 68 del sistema analítico celular 60 tiene memorias y otros dispositivos que aplican algoritmos para varios análisis celulares. Estos algoritmos se utilizan para analizar grupos de puntos de datos generados por el módulo de análisis 64 para producir información de relevancia clínica. El instrumento de hematología/inmunología integrado descrito proporciona una plataforma única en que se puede implementar dicho software, proporcionando por ello un instrumento que no sólo automatiza el procesado y la medición de muestras de hematología e inmunología, sino que también automatiza el análisis de datos.
La estación de datos 68 también proporciona depósitos de datos que son colecciones de registros de muestras relacionados. La figura 28 ilustra un conjunto preferido de depósitos de datos, incluyendo registros de datos, historias de pacientes, archivos de control de calidad (QC), archivos de partículas de referencia estándar, archivos duplicados pareados, lotes de algoritmos de Bull (X-B), archivos de media móvil, y archivos de calibración.
11. Sistemas electrónicos
Los sistemas electrónicos se hallan en el módulo analizador 64, módulo de estación de datos 68, y unidad neumática 72. El analizador 64 proporciona la plataforma de hardware para adquisición de datos y control de fluidos y movimiento. En una realización ejemplar, la estación de datos 68 es un ordenador general que sirve como una interface de usuario y procesa, visualiza y guarda los datos adquiridos. La unidad neumática 72 controla las fuentes de vacío y presión.
En una realización preferida, los tres módulos están físicamente separados, y cada unidad es alimentada desde una toma CA separada. La estación de datos 68 y la unidad neumática 72 comunican con el analizador 64 mediante canales de comunicación serie independientes 76, 84.
La figura 25 es un diagrama de bloques que ilustra algunos componentes electrónicos de hardware del analizador 64. Estos componentes incluyen un módulo central de proceso 500 (CPM), un subsistema de adquisición de datos 502, y un subsistema de control de movimiento 504. El CPM 500 controla el subsistema de adquisición de datos 502, el subsistema de control de movimiento 504, y funciones de comunicación.
Una realización preferida del CPM 500 incluye las características siguientes:
*
Procesador Multiprotocolo Integral Motorola 68302 a 20 MHz
*
RAM dinámica de 1 MB expansible en pasos de 1 MB hasta 4 MB
*
128 KB EPROM
*
2 KB RAM no volátil
*
Controlador DMA para transferencias rápidas de 16 bits de datos de pulso adquiridos de convertidores A/D a CPM RAM
*
Bus buffer de 8 bits para funciones de diagnóstico y de control de adquisición de datos
*
Dos Enlaces Serie de Módulo de Procesado de Motor (MPM)
*
Un enlace serie periférico
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Un enlace serie de unidad neumática
*
Un enlace serie HDLC
*
Canal de acceso directo a memoria (DMA) dedicado al enlace serie HDLC
*
Un puerto RS-232 para lector de código de barras
*
Un puerto RS-232 para terminal de diagnóstico.
La figura 26 es un diagrama de bloques que ilustra detalles del subsistema de adquisición de datos 502 representado en la figura 25. Las características de célula o muestra se convierten en señales eléctricas en el transductor HGB 178, el transductor de impedancia 174, y la celda de flujo óptico 170. El transductor de impedancia 174 y la celda de flujo óptico 170 producen en general pulsos eléctricos como sus señales de salida, y el transductor HGB 176 envía una señal de baja frecuencia. La salida de cada celda de flujo/transductor se trata por separado por el subsistema de adquisición de datos 502.
Las señales de salida del transductor de impedancia 174 y la celda de flujo óptico 170 se generan por varios detectores 510. Estos detectores constan de los PMTs y fotodiodos del banco óptico 350 o la circuitería eléctrica del transductor de impedancia 174. La salida de cada detector es alimentada a través de un módulo preamplificador 512 y un módulo de procesado de señal 514 a un módulo convertidor analógico a digital (ADC) 516. Los módulos de procesado de señal 514 incluyen circuitería para la medición de atributos de pulso tal como altura de pulso y análogos. El convertidor ADC 516 es un convertidor multiplexado que cambia salidas analógicas del módulo de procesado de señal 514 a valores digitales que representan estos atributos de pulso. Los valores digitales son transferidos después al CPM 500 mediante acceso directo a memoria (DMA) 518. El CPM 500 procesa la información y envía después los datos a la estación de datos 68 mediante el enlace de datos 76 de control de enlace de datos de alto nivel (HDLC, un protocolo de comunicaciones). El subsistema de adquisición de datos 502 también genera los voltajes analógicos requeridos para varios valores paramétricos, tal como niveles de disparo, niveles de paso por puerta, potencia de salida del láser, y otros.
Las salidas del transductor HGB 178 son alimentadas mediante una placa detectora HGB/multiplexor analógico 328 directamente al módulo ADC 516. En general, la placa HGB 328 incluye un amplificador de transresistencia 332 y una fuente de corriente 334 (figura 18). La placa HGB 328 y sus componentes se explican con más detalle en la sección 8.F de esta descripción.
A. Módulo ADC
El módulo ADC 516 contiene un convertidor analógico a digital. El módulo ADC 516 es multiplexado para medir voltajes analógicos de los módulos de procesado de señal 514 y voltajes auxiliares dentro del módulo ADC 516 propiamente dicho.
La representación digital de cada medición de voltaje tiene una etiqueta identificadora asociada. En una corriente de datos, la etiqueta indica el valor específico medido que sigue. Todas las etiquetas son de 7 bits de largo, lo que permite un máximo de 128 parámetros diferentes.
Los módulos de procesado de señal 514 contienen un circuito de mantenimiento de pico asignado a cada señal de salida de los preamplificadores 512. Un circuito de mantenimiento de pico recibe un pulso eléctrico como su señal de entrada y genera un voltaje constante igual al voltaje máximo detectado durante el pulso. Un secuenciador de etiquetas programable en el módulo ADC 516 apunta a uno de estos circuitos de mantenimiento de pico a la vez, enrutando el valor a medir (el voltaje de salida de régimen constante) al módulo ADC, que realiza la conversión de dicha señal particular de su forma análoga (voltaje) a un valor digital. Después de dejar tiempo suficiente para esta conversión, el secuenciador de etiquetas apunta al circuito de mantenimiento de pico siguiente que mantiene un valor a medir. Cuando termina cada conversión, se une a los datos la etiqueta correspondiente que identifica la señal medida. De esta forma, el secuenciador de etiquetas comparte el tiempo con el módulo ADC asignando un intervalo de tiempo a cada entrada. Los resultados de estas conversiones son transferidos a la memoria principal en el CPM 500 mediante LA DMA 518. El DMA se utiliza para transferir datos a altas tasas sin intervención de la CPU.
B. Preamplificador de transductor de impedancia
El preamplificador 512 contiene una fuente de corriente constante programable de bajo ruido. Esta corriente constante se divide entre dos recorridos. Un recorrido de corriente fluye a través de los electrodos en el transductor de impedancia; el otro fluye al preamplificador 512. Dado que la suma de ambas corrientes es constante, un cambio en la corriente a través de los electrodos (producido por el paso de células a través del transductor de impedancia 174) se refleja como un cambio en el voltaje de salida del preamplificador 512.
C. Procesado de señal del transductor de impedancia
La salida del preamplificador de transductor de impedancia se dirige a dos recorridos independientes, teniendo cada uno una ganancia de 12 bits, restaurador de línea base, detector de pulso, y circuito de mantenimiento de pico. Un recorrido es para detección de pulso RBC, y el otro trayecto es para detección de pulso PLT. El mismo pulso se analiza así simultáneamente en los dos criterios diferentes siguientes.
Un pulso se detecta como válido si su valor máximo excede de un umbral dado. El subsistema de adquisición de datos 502 reconoce umbrales de nivel y umbrales de pendiente. El umbral de pendiente mejora el tiempo muerto del contador de hardware permitiendo el recuento de dos pulsos que llegan muy próximos en el tiempo.
Cada tipo de célula requiere sus propios criterios de cualificación. Los pulsos RBC deberán exceder un cierto nivel y pendiente. Se deberá superar una cierta pendiente negativa para reposicionar el detector para el pulso siguiente.
Los pulsos PLT se producen en la misma secuencia con los pulsos RBC. Sin embargo, los PLTs se pueden distinguir de los RBCs porque los PLTs son más pequeños. Un pulso se clasifica como un PLT detectado si excede de un umbral de nivel inferior, pero no supera un umbral superior. Además, el pulso debe exceder una pendiente positiva predeterminada para considerarse un PLT válido. Se deberá exceder una cierta pendiente negativa para reposicionar el detector para el pulso siguiente.
Si un pulso cumple los criterios de cualificación, se envía una señal de disparo al circuito de mantenimiento de pico, y se inicia la conversión ADC siguiente. Los pulsos de disparo del transductor de impedancia 174 son contados en dos contadores de 16 bits dedicados. Un contador es para RBCs, y el otro contador es para PLTs.
Cada recorrido de salida de los preamplificadores del transductor de impedancia incluye un circuito de restauración de línea base para restar el componente DC de fondo de las señales amplificadas. El voltaje desviado creado por estos circuitos es monitoreado, proporcionando así una herramienta para diagnóstico.
D. Preamplificadores ópticos
La luz emitida por la celda de flujo óptico 170 es recogida a ángulos diferentes por los detectores 510, que incluyen fotodiodos (PD1 y PD2) y fotomultiplicadores (PMT1, PMT2, y PMT3). Estas señales tienen un rango dinámico ancho, y por consiguiente se facilita una amplia gama de ajuste de ganancia. Para los PMTs, el ajuste de ganancia se realiza preferiblemente controlando un voltaje de dinodo en el PMT propiamente dicho (aproximadamente 200V a aproximadamente 1100V). Este procedimiento puede regular la ganancia en un rango aproximado de 105. Los preamplificadores ópticos de los PMTs convierten la salida de corriente de los PMTs a un voltaje con ganancia fija.
La ganancia de cada fotodiodo (PD) es programable en su preamplificador en pasos de potencia de 2. Los preamplificadores PD convierten la corriente de salida PD a voltaje.
E. Procesado de señales ópticas
Las salidas de los preamplificadores ópticos se enrutan a cinco recorridos o canales independientes. Cada canal incluye su propio restaurador de línea base, detector de pulso, circuito de mantenimiento de pico, y ganancia programable de 12 bits (captura postpico).
Un pulso "óptico" es detectado como válido si su valor máximo excede de un umbral predeterminado programable. Un pulso válido genera un pulso digital de disparo. El impulso de excitación se puede programar de manera que sea una de varias combinaciones lógicas seleccionadas de canales (PD1, PD2, PMT1, PMT2, PMT3). Cada canal tiene su propio umbral inferior programable.
El impulso de disparo inicia la captura de pico y conversión ADC siguiente de los valores máximos capturados para los cinco canales. El disparo puede ser cualificado requiriendo un criterio de paso por puerta. Por ejemplo, el disparo puede ser invalidado si la señal en PD1, PD2, o PMT2 excede de un umbral de puerta predeterminado.
Se ha dispuesto un circuito restaurador de línea base para restar el componente DC de las señales de pulso, reduciendo por ello toda desviación de fondo DC. El tiempo de respuesta de estos circuitos es más lento que la anchura del pulso medio. El voltaje desviado creado por estos circuitos es monitoreado, proporcionando una herramienta para diagnóstico.
Los pulsos de disparo de la celda de flujo óptico 170 son contados en dos contadores de 16 bits dedicados. Un contador es para las células con puerta (las que no han sido rechazadas por los criterios de paso por puerta), y el otro contador es para el número total de células que cumplen el requisito de umbral más bajo.
F. Procesado de señales HGB
La figura 18 es un diagrama de bloques de un sistema simplificado de medición de hemoglobina (HGB). Se mide la concentración de hemoglobina contenida en la muestra preparada, por ejemplo, en gramos por decilitro. Esta concentración es proporcional a la absorbancia de la luz por la muestra en la región de longitud de onda verde (aproximadamente 540 nanómetros).
El recorrido de luz consta de un diodo fotoemisor controlado por corriente 322, una cámara de transductor 338, un filtro 326 (aproximadamente 540 nm), y un fotodiodo 324.
La corriente de salida del fotodiodo, que es proporcional a la energía luminosa recibida, es amplificada por el amplificador de transresistencia 332. La salida del amplificador de transresistencia 332 se envía al módulo ADC 516.
La diferencia entre voltajes desarrollados al medir una solución de referencia clara en la cámara de transductor 338 y al medir la muestra preparada conteniendo hemoglobina es representativa de la concentración de hemoglobina.
G. Sello de tiempo
El módulo de procesado de señal 514 usa un contador de 16 bits (no representado) para generar un sello de tiempo con una resolución de aproximadamente 0,5 ms. El valor de sello de tiempo se almacena con los datos de cada iteración de secuencia automática que dio lugar a datos válidos adquiridos en el módulo ADC 516.
H. Control de movimiento
La figura 27 es un diagrama de bloques que ilustra una realización ejemplificativa del subsistema de control de movimiento 504. Las secuencias de flujo y las operaciones de tratamiento automático de muestras del analizador 64 son controladas mediante el subsistema de control de movimiento 504.
Como se ilustra, el subsistema de control de movimiento 504 incluye un módulo de procesado de motor 520 (MPM), un módulo de control de válvula 522 (VCM), un módulo sensor de fluido 524 (FSM), y un módulo de entrada digital 526 (DIM). Los MPMs 520 comunican con el CPM 500 mediante dos enlaces serie independientes 530, 532 (500 KB), y cada MPM 520 controla preferiblemente hasta 12 motores paso a paso 534. Los VCMs 522 controlan todas las válvulas en el analizador 64. Los DIMS 526 verifican todas las entradas digitales (interruptores, sensores ópticos, y sensores magnéticos). El FSM 524 verifica todos los sensores de fluido.
Los VCMs 522, DIMs 526, y el FSM 524 son módulos inteligentes que comunican preferiblemente con el CPM 500 mediante un bus periférico serie diferencial semi-duplex. Se puede añadir módulos periféricos adicionales a este bus.
12. Software
El software controla las operaciones principales del sistema analítico celular 60, incluyendo las secuencias de flujo del analizador, la temporización y secuencia de eventos, recogida de datos y conversión de datos medidos a resultados significativos. El software es residente en memorias adecuadas, tal como RAMs, ROMs, EPROMs, SRAMs y análogos, que se hallan en el sistema 60. Los componentes de software están divididos preferiblemente en la seis dominios (representados por círculos) mostrados en la figura 2.
El dominio de interface de operador 90 regula la interacción de usuario con la estación de datos 68 incluyendo todos los dispositivos de entrada controlados por operador unidos a la estación de datos, la definición y generación de todas las pantallas de la estación de datos, y la definición de toda salida impresa.
El software operativo de estación de datos 92 controla el procesado de muestra, gestión de datos, seguridad, comunicaciones con el módulo analizador y sistemas de información de laboratorio (LIS), y generación de salidas impresas.
El software de algoritmos 96 puede incluir cualquier combinación deseada de matemática aplicada. Los algoritmos se aplican en el análisis de datos de muestra, la conversión de datos en modo de lista a resultados gráficos y numéricos, y el análisis estadístico de agrupaciones de resultados numéricos. Estos algoritmos incluyen preferiblemente técnicas de agrupamiento para identificar tipos o condiciones discretos de células.
El software operativo de analizador (AOS) 98 controla los circuitos electrónicos del módulo analizador (hardware), recogida de datos, y comunicaciones con el módulo de estación de datos. La temporización y programación de todas las actividades del analizador, incluyendo las secuencias de flujo del analizador, también son controladas por el AOS 98.
El software de secuencia de flujo (FSQ) 100 controla los componentes mecánicos responsables de mover fluidos a través del módulo analizador 64, incluyendo la ejecución de protocolos de procesado automático de muestras y verificación de hematología e inmunología integradas.
Los microprogramas 102 incluyen una red de dispositivos controladores residentes en EPROM para varios módulos de hardware del analizador 64 y la unidad neumática 72.
La interface de operador (OI), el software operativo de estación de datos (DSOS) y los algoritmos usan el módulo de estación de datos 68 como su plataforma. El AOS 98, el software FSQ 100 y los microprogramas 102 residen y usan el módulo analizador 64 como su plataforma. El software preferido es una aplicación multitarea y multihilo.
El AOS 98 reside en el CPM 500 y es el controlador principal de la operación detallada del analizador 64. Comunica con varios microcontroladores esclavos responsables de temporización de los motores paso a paso, conversión analógico a digital, verificación/control en bucle cerrado de vacío/presión, control de válvulas, y entradas de sensores digitales. Además, es responsable de la comunicación de datos, estado y control con la estación de datos 68 a la que está conectado. El AOS 98 se ejecuta preferiblemente en un chip CPU Motorola 68302. Sus microprogramas se almacenan en EPROM(s) externa(s), y el AOS descargado y las secuencias de flujo se almacenan en RAM en placa. Una realización de una operación AOS se muestra en las figuras 29 y 30.
El AOS 98 incluye características multitarea para realizar las secuencias de flujo. El AOS descarga secuencias de flujo de la estación de datos, almacenándolas en su memoria. El AOS ejecuta las secuencias de flujo requeridas para las verificaciones de muestra deseadas según la dirección de la estación de datos 68.
Cada secuencia de flujo requiere tareas de múltiples componentes del analizador según un programa. Las figuras 13A-13F son diagramas de temporización de una secuencia de flujo ejemplar para integrar y automatizar la preparación hematológica e inmunológica de la muestra y la medición en una sola unidad. El eje horizontal superior, como se ve, representa el tiempo en segundos, y el eje vertical inferior enumera componentes de procesado y medición de muestras del analizador 64. Las rejillas del diagrama describen las actividades de los componentes del analizador. Cada uno de los componentes enumerados a lo largo del eje vertical izquierdo en las figuras 13A-13F realiza un conjunto específico de tareas en la secuencia de flujo. Cuando un componente ha terminado su tarea, comienza a buscar su instrucción siguiente sin esperar a que los componentes situados hacia abajo terminen el trabajo en la muestra corriente.
El AOS mantiene una colección de puntos de referencia y parámetros de hardware relacionados con recuento. Se facilita un conjunto para cada tipo de recuento (CBC WBC, CBC OPLT, etc). Además, se facilita un conjunto a efectos de diagnóstico. El AOS acomoda la descarga de cualquiera de estos conjuntos de la estación de datos 68. Además, cualquier conjunto puede ser activado (es decir, usado para configurar el hardware) bajo orden de la estación de datos 68 o software de secuencia de flujo.
Además de los puntos de referencia y parámetros de hardware relacionados con recuento, el AOS mantiene una colección de parámetros independientes de recuento de eventos. El AOS acomoda la modificación de cualquiera de estos parámetros de la estación de datos 68. En contraposición a los parámetros relacionados con recuento, el AOS carga estos valores directamente.
Para comenzar una secuencia de flujo, el AOS 98 determina que una muestra está disponible para aspiración. Esto se basa en la activación por parte del operador de un pulsador o una orden de un mecanismo autocargador. Toda la información conocida por el analizador 64 acerca de la muestra se envía a la estación de datos 68. La estación de datos 68 responde con información acerca de las mediciones que hay que realizar en la muestra. En base a esta respuesta, y en unión con el estado del analizador 64 (es decir, reactivos, incubaciones, señalizadores de habilitación/inhabilitación de aspiración de secuencia de flujo), el AOS determina si proseguir o no con la aspiración de muestra. Tanto si se produce aspiración como si no, el AOS informa a la estación de datos 68 del estado de la muestra.
Cuando una secuencia de flujo requiere incubación, el AOS proporciona a la secuencia de flujo la capacidad de "asignar" un lugar no usado 132 en la zona de procesado de muestras 110 para una incubación. El tipo de muestra (y, por lo tanto, la secuencia de flujo apropiada a ejecutar a la terminación de la incubación) se especifica como parte del proceso de asignación. Cuando se inicia la incubación, el AOS pone en marcha un temporizador de incubación asociado con un lugar de incubación particular 132. También están asociados con cada lugar de incubación 132 un identificador de muestra, tipo de muestra y tiempo de incubación. El AOS actualiza periódicamente los temporizadores de incubación activos y reconoce la terminación de intervalos de incubación. Cuando termina, el AOS continúa la ejecución de la secuencia de flujo para dicha prueba. El AOS refiere el tiempo total de incubación de cada muestra incubada y el número de lugar de incubación (posición) como parte de los datos acumulados para cada prueba en cada muestra. Después de procesar la muestra incubada y de limpiar y secar el lugar de incubación, la secuencia de flujo notifica al AOS que el lugar está disponible de nuevo para asignación.
El AOS 98 inhibe la aspiración de muestras a la zona de incubación 118 cuando las bandejas de incubación apropiadas 124 no están presentes. Los cambios en las bandejas de incubación 124 o módulos de reactivo 122 son remitidos a la estación de datos 68. Siempre que se inhabilita una aspiración, el AOS envía un mensaje de aviso a la estación de datos 68.
A la petición de la estación de datos, el AOS suministra el estado de incubación corriente de todos los lugares en el analizador 64. Esta información incluye el tiempo de incubación, estado del lugar (limpio/sucio) y recuentos de uso de lugar.
El intérprete de secuencia de flujo 100 es capaz de ejecutar simultáneamente múltiples secuencias de flujo. El intérprete de secuencia de flujo permite que las secuencias de flujo coordinen sus actividades mediante el establecimiento y la verificación de varios "señalizadores". La lógica de secuencia de flujo hace decisiones en base al estado de los señalizadores que son puestos y quitados por otras secuencias de flujo que se ejecutan simultáneamente.
El intérprete de secuencia de flujo soporta tiempos fijos o variables de recuentos de eventos de muestra. Los tiempos variables de recuento de eventos se pueden establecer mediante puntos de referencia de software o hardware. Los tiempos variables de recuento de eventos están provistos preferiblemente de un límite superior definido por las secuencias de flujo.
El intérprete de secuencia de flujo permite que las secuencias de flujo inicien intervalos de recogida de datos y recuento de eventos. Los datos generados durante el intervalo de recogida de datos son enviados automáticamente a la estación de datos 68 por el AOS. Los datos enviados a la estación de datos 68 incluyen preferiblemente al menos el identificador de muestra, contadores de hardware, datos en modo de lista, y tiempo de incubación (si lo hay). Los tipos de recuento incluyen preferiblemente:
- CBC: recuento completo de sangre incluyendo todas las mediciones hematológicas excepto las relacionadas con reticulocitos.
- RETICS
- SUBCONJUNTO/FENOTIPO
El AOS permite que el analizador 64 solape la actividad de recuento en las celdas de flujo/transductores 170, 174, 178. Así, mediante multiplexión y segmentación, la actividad del analizador maximiza la producción del instrumento.
El analizador 64 puede estar conectado a recipientes externos para residuos (no representados) o almacenamiento de reactivo a granel (193). AOS verifica los sensores que detectan cuándo el recipiente de residuos está lleno o el recipiente de almacenamiento de reactivo a granel 193 está vacío. La aspiración adicional de muestras la inhibe el AOS 98 hasta que se remedia la condición.
El AOS lee y modifica la memoria no volátil de acceso serie en cada módulo de reactivo de anticuerpo 122. Al menos la información siguiente se almacena en cada memoria de módulo de reactivo de anticuerpo:
-
Número de lote
-
Fecha de caducidad
-
Tipo de prueba (número de panel)
-
Número de módulo
-
Número de cavidades utilizadas en el módulo
-
Usos del módulo
-
Señalizador inicializado
-
Redundancia/control de error.
Los módulos de reactivo de anticuerpo 122 se leen como parte de inicialización normal del analizador. Después, cualquier operación que afecte al estado del módulo 122 se registra en la memoria del módulo.
El AOS 98 comunica con los módulos de procesado de motor 520 que son responsables de controlar los motores paso a paso 534 del analizador. El AOS reposiciona los módulos de procesado de motor 520 a la inicialización. El AOS hace el seguimiento de la posición de cada motor en el analizador 64 y verifica esta información con módulo procesado de motor de control 520. Las discrepancias de posición se refieren a la estación de datos 68.
A la terminación con éxito del autodiagnóstico a la conexión, el analizador 64 acepta software operativo AOS descargado de la estación de datos 68. A la terminación de la descarga de software, se suministra una dirección de inicio desde la estación de datos 68 especificando la dirección en la que iniciar la ejecución.
13. Ejemplos de procesado de muestras A. Procesado general de muestras
Los párrafos siguientes explican con detalle una operación ejemplar del sistema analítico celular 60. Se puede lograr una mejor comprensión de detalles del sistema 60 por referencia a esta explicación. Aunque se explican ejemplos específicos para esclarecer la comprensión, se ha de recordar que el sistema 60 puede realizar otros pasos de método sin apartarse del alcance previsto de las reivindicaciones.
El protocolo de procesado automático de muestras del sistema analítico celular 60 se puede considerar en tres fases - preparación de muestra, medición de muestra, y análisis de muestra. El protocolo particular para cada una de estas fases depende de la prueba. Por ejemplo, la preparación, medición, y análisis para el diferencial WBC difiere del de plaquetas, reticulocitos, subconjuntos de linfocitos, etc. Sin embargo, los pasos generales son comunes a cada fase.
En la primera fase, preparación automática de muestra, el analizador 64 aspira un volumen de la muestra, transporta la muestra a las copas designadas, y mezcla la muestra con diluyente y/o reactivo según sea preciso para preparar la muestra para medición. La preparación puede implicar solamente diluir la muestra, y los medios de dilución también pueden ser la lisis para sacar RBCs. A veces, como en la prueba de reticulocitos, la fase de preparación implica dos pasos, un primer paso, predilución con un diluyente/reactivo envolvente, y un segundo paso, dilución añadiendo un volumen conocido de colorante fluorescente.
En otras pruebas, tal como la prueba de subconjunto de linfocitos, la fase de preparación puede implicar muchos pasos y requerir una incubación prolongada con un reactivo. Cuando esto ocurre, el conjunto de sonda de aspiración 148 pone un volumen de la muestra en la copa de transferencia 140 y vuelve a una posición lista para aspirar una muestra de paciente siguiente. Los pasos restantes en el proceso de preparación los ejecuta el conjunto de sonda de incubación 152. Estos pasos pueden incluir además dividir la muestra en una o varias porciones en lugares de incubación 132, añadir un reactivo Mab específico a cada porción, e incubar. La mayoría de estos pasos, realizados por la sonda de incubación 152, pueden tener lugar mientras el conjunto de sonda de ventilación/aspiración 148 está ocupado con el procesado de las muestras siguientes.
Después de terminar la incubación, el conjunto de sonda de incubación 152 completa la fase de preparación mezclando la porción de muestra incubada con un reactivo de lisis para quitar los glóbulos rojos de manera que la porción de muestra esté lista para ser dirigida a la celda de flujo óptico para medición.
La segunda fase, la fase de medición, comienza cuando las copas de muestra contienen una muestra que está lista para medición. La muestra es enrutada después mediante una red de tubos 182 conectados desde la parte inferior de las copas de muestra al transductor de medición deseado 170, 174, 178. Después de salir del transductor, las muestras se envían a recipientes de residuos (no representados). Las señales son detectadas por los detectores apropiados para cada prueba, amplificadas después, procesadas, digitalizadas, y almacenadas en un archivo de modo de lista correspondiente a la prueba particular.
La tercera fase, la fase de análisis, comienza con los datos de modo de lista. Se aplican algoritmos a los datos que aplican las varias partículas o tipos de células al espacio de características con ejes correspondientes a los detectores apropiados para cada prueba, identificando por lo tanto grupos de población únicos, y enumerando las células dentro de cada grupo. La salida final puede ser gráfica y/o numérica, y puede ser una medida o función de volumen de la célula, contenido de hemoglobina, tipo de población, o alguna otra característica celular. La salida es cuantificada por lo general tanto en términos absolutos como en porcentajes. Por ejemplo, los subtipos de poblaciones de células se dan como porcentajes de células padre y también se enumeran como eventos por microlitro de sangre del paciente. Siempre que se analizan muestras incubadas, primero se realiza el análisis de las pruebas hematológicas convencionales. Cuando ha terminado la medición de muestra incubada, tiene lugar el análisis de muestra incubada y se termina el análisis combinado del paciente.
El protocolo de prueba para las fases de preparación y medición de la muestra del procesado de muestras se implementan automáticamente por medio de secuencias de flujo, cuya complejidad varía. En pruebas que implican incubación prolongada, la secuencia de flujo integra la verificación de incubación y no incubación de manera que siempre que se incube una muestra, el analizador 64 puede proseguir con pruebas siguientes. Cuando la muestra de incubación está lista para medición, se interrumpe el procesado de más muestras y la muestra incubada experimenta medición y análisis.
B. Procesado de muestras de hemoglobina
Se puede lograr una mejor comprensión de esta explicación con referencia a las figuras 5 y 12. Por ejemplo, una porción de muestra de paciente 166, de aproximadamente 18,75 microlitros de volumen, se deposita en la copa HGB 142 por medio de la sonda de aspiración 156, donde se mezcla con un volumen grande de reactivo lisante HGB con una dilución resultante de aproximadamente 200: 1. Después de aproximadamente 20 segundos de tiempo de lisis, la copa contiene solamente hemoglobina diluida, que es transferida para medición mediante la línea 182 al transductor de hemoglobina 178 por medio de la bomba peristáltica 246. La transmitancia óptica de la muestra de hemoglobina en la cámara de transductor 338 se mide por medio de la fuente LED 122 y el fotodiodo 324. La transmitancia, representada por T, es amplificada, procesada, digitalizada y almacenada. Después, se convierte en absorción en la fase de análisis por medio de un algoritmo A = log(1/T), que además se convierte en concentración de hemoglobina, HGB, en gramos por decilitro de muestra de paciente, por medio de un calibrador previamente determinado. La prueba de hemoglobina, en combinación con los resultados de la prueba de impedancia RBC, permite la determinación de los parámetros medidos y calculados siguientes:
HGB = (concentración de hemoglobina)
MCH = HGBx10/RBC (hemoglobina celular media)
MCHC = HGBx100/H CT (concentración celular media de hemoglobina).
donde RBC es el recuento de glóbulos rojos (RBCs por \mul) y HCT es el hematocrito (fracción de volumen, en porcentaje, de la muestra de sangre que consta de glóbulos rojos), que se miden en el transductor de impedancia 174.
C. Procesado de muestras de RBC y plaquetas
El lector deberá consultar las figuras 4 y 5. Una porción de muestra de paciente 166, de aproximadamente 18,75 microlitros en volumen, se deposita en la copa 134 por medio de una sonda de aspiración 156, donde se mezcla con un volumen de diluyente/reactivo envolvente con una dilución resultante de aproximadamente 420:1. El diluyente/reactivo envolvente es adecuado tanto como un soporte envolvente en los sistemas de flujo laminar en la celda de flujo de impedancia 174 y la celda de flujo óptico 170 y como una muestra diluyente de manera que los RBC y las plaquetas avancen en fila única en cada transductor. La formulación incluye un surfactante que permite distinguir de forma no ambigua los glóbulos rojos pequeños de plaquetas grandes.
Después de terminar la mezcla en la copa RBC 134, la muestra diluida se transfiere al transductor de impedancia 174 (figuras 10A y 10B) por la bomba 220, las válvulas 210 y 212, y el conjunto de jeringa 204, 224. Las plaquetas son clasificadas por tamaño y contadas en el transductor de impedancia 174 (figura 17). Las plaquetas también son transferidas y contadas en el transductor óptico 170 (figura 16). A causa del menor volumen iluminado y ruido más bajo en el transductor óptico, el recuento óptico de plaquetas tiene rendimiento excelente. El recuento de plaquetas del transductor óptico 170 se refiere como datos de paciente, utilizándose el recuento de impedancia como una herramienta de diagnóstico para verificar el rendimiento del instrumento.
El transductor de impedancia 174 se utiliza para referir los parámetros de tamaño de plaquetas. Se establece un umbral inferior que distingue las plaquetas del ruido, y se establece un umbral superior que distingue las plaquetas de los RBCs. Las amplitudes de pulso son filtradas, amplificadas, digitalizadas y almacenadas como eventos de modo de lista. A partir de estos datos se aplican algoritmos para calcular los siguientes parámetros de tamaño de plaquetas, y visualizar el histograma de plaquetas:
Recuento de plaquetas (PLT)
Volumen medio de plaquetas (MPV)
Anchura de distribución de plaquetas (PDW)
Plaquetocrito (PCT = MPV x PLT)
Concentración de plaquetas (utilizada a efectos de diagnóstico de instrumento).
La muestra diluida de la copa RBC 134 también es transferida al transductor óptico por las válvulas 236 y 238, la bomba 232, y la jeringa 240, 206. Las plaquetas se determinan en el espacio bidimensional de características usando los parámetros ópticos PSS (dispersión lateral polarizada) e IAS (dispersión de ángulo intermedio). Los pulsos de los detectores 384 y 402 son procesados, digitalizados y almacenados en archivos de modo de lista para procesado por algoritmos. El caudal de muestra para medir plaquetas es aproximadamente 2,5 microlitros por segundo, y el tiempo de recuento a través de la celda de flujo es aproximadamente 6 segundos para pacientes normales. Este tiempo de recuento se prolonga automáticamente para muestras de recuento bajo para mejorar la estadística del recuento. El recuento referido del transductor óptico es la concentración de plaquetas (PLT).
El transductor de impedancia 174 también se utiliza para determinar parámetros de tamaño y recuento de RBC. El umbral superior usado para detectar plaquetas en el transductor de impedancia 174 también es el umbral inferior para el recuento de RBC. Los pulsos por encima de este umbral son procesados, digitalizados y almacenados en el archivo de modo de lista de RBC. Se aplican algoritmos para calcular los parámetros RBC siguientes y visualizar el histograma RBC:
Concentración de glóbulos rojos (RBC)
Volumen medio de células (MCV)
Anchura de distribución de glóbulos rojos (RDW)
Hematocrito (HCT).
D. Procesado diferencial WBC de muestras
Con referencia a las figuras 4 y 5, se deposita una porción de muestra de paciente 166, aproximadamente 37,5 microlitros, por medio de la sonda de aspiración de muestra 156 en la copa WBC 138 que contiene aproximadamente 850 microlitros de agente lisante WBC.
El reactivo lisante es un proceso de un reactivo/un paso que logra finalidades multipropósito. Es delicadamente suficiente para preservar la morfología de los glóbulos blancos frágiles y al mismo tiempo lisar eficientemente sustancialmente todos los glóbulos rojos. Estas dos finalidades se realizan incluso en muestras hemaglobinofáticas, que pueden requerir que el tiempo de lisis se prolongue más de 11 segundos. Además, en la realización preferida, el reactivo lisante contiene una concentración pequeña de un colorante nuclear vital que marca efectivamente los glóbulos rojos nucleados (NRBCs) que pueden estar presentes en la sangre periférica. La química de la lisis se ha predeterminado de tal manera que el índice de refracción coincida con el de la envuelta sustancialmente en menos de aproximadamente 0,1%.
La mezcla de agente lisante y muestra permanece normalmente en la copa 138 durante aproximadamente 11 segundos, donde se lisa y agita a una temperatura elevada. En una realización preferida, la temperatura de lisis se controla a 42°C ±3°. En este punto, el contenido de la copa 138 se pipeta directamente a la celda de flujo óptico
170.
Con referencia a las figuras 19 y 20, el proceso de medición comienza cuando la corriente de células pasa a través del transductor óptico 170, habiéndose diluido con la adición de agente lisante de manera que las células pasen a través de la iluminación de láser en una sola fila, en una corriente de muestra de flujo laminar rodeada por diluyente/envuelta 304 (ilustrada en la figura 16). El volumen iluminado está delimitado en las dos dimensiones normales al eje de flujo por la corriente celular hidrodinámicamente enfocada, y en una dimensión paralela al eje de flujo por la cintura vertical del haz láser que es aproximadamente de 17 micras. El caudal de muestra durante esta prueba es aproximadamente 2,5 microlitros por segundo, y el volumen de detección iluminado correspondiente de las células WBC y NRBC se aproxima a un cilindro elíptico con dimensiones de aproximadamente 80 \mu x 5 \mu x 17 \mu. La dimensión de aproximadamente 17 \mu se mide a lo largo del eje del cilindro.
La presencia de una célula en la región iluminada es detectada por los fotodiodos 382 y 384, el tubo fotomultiplicador 404, y un único circuito de disparo umbral triple que opera en tres dimensiones del espacio de características. Es decir, procesa los tres parámetros de ALL (Pérdida de Luz Axial), IAS (dispersión intermedia), y FL3 (fluorescencia roja) y cualifica señales para digitalización usando lógica Y/O. Una señal cualificada debe ser mayor que el umbral IAS, al mismo tiempo que debe ser mayor que el umbral ALL o el umbral FL3. La combinación de este circuito único de disparo y las propiedades lisantes (que incluyen un fijador equilibrado, que permite teñir rápidamente los núcleos NRBC) cuenta claramente y de forma no ambigua y excluye NRBCs del recuento diferencial WBC. Esta prueba cuenta poblaciones WBC y NRBCs sin la interferencia usual de señales de fondo, tanto fluorescentes como no fluorescentes, tal como las emitidas por fragmentos de ADN, estroma de RBC, y plaquetas.
Cuando las células que cumplen el triple criterio de umbral pasan por el volumen iluminado, se generan pulsos en los detectores 382, 384, 400, 402, y 404. Las amplitudes de estos pulsos son filtradas, amplificadas, digitalizadas y almacenadas en modo de lista en el correspondiente espacio de características pentadimensional de ALL, IAS, FL3, PSS (dispersión lateral polarizada), y DSS (dispersión lateral despolarizada). El tiempo de recuento normal a través de celda de flujo 170 es aproximadamente 10 segundos. Al caudal y la relación de dilución descritos, y con un recuento normal de WBC de paciente de aproximadamente 7000 células por microlitro de volumen de sangre, la tasa de recuento de eventos resultante sería aproximadamente 5000. En muestras de recuento bajo, este tiempo de recuento puede ser prolongado automáticamente para mejorar la exactitud estadística de la medición. A la conclusión del tiempo de medición, la corriente de muestra es pipetada a residuos, y la sonda 156 se limpia y seca y prepara para procesar una muestra siguiente.
Se aplican algoritmos a los cinco parámetros cuantificados en los datos de modo de lista (ALL, IAS, FL3, PSS, y DSS), y los tipos de células siguientes son cuantificados y/o señalizados dentro de menos de aproximadamente 30 segundos de tiempo de procesado: Concentración de glóbulos blancos (WBC), Concentración de neutrófilos (NEU) y porcentaje (%N), Concentración de linfocitos (LINF) y porcentaje (%L), Concentración de monocitos (MONO) y porcentaje (%M), Concentración de eosinófilos (EOS) y porcentaje (%E), Concentración de basófilos (BASO) y porcentaje (%B), Glóbulos rojos nucleados (NRBC) y porcentaje de WBC (%NRBC), Concentración de blastos (BLST), Concentración de granulocitos inmaduros (IG), concentración de linf-variantes (VARL), y Concentración de banda (BAND).
E. Procesado de muestras de subconjuntos de linfocitos
En una realización preferida, el procesado de muestras para pruebas de subconjuntos de linfocitos implica los pasos siguientes como se ilustra en las figuras 3, 4, y 5. La sonda de aspiración 156 aspira primero una cantidad de sangre entera suficiente para la prueba de subconjunto y deposita la cantidad en la copa de transferencia 140. El volumen de sangre requerido es aproximadamente 50N microlitros, donde N es el número de pares Mab (anticuerpo monoclonal) requerido para la prueba. En el panel estándar, se espera que N sea 5, y así el volumen requerido para deposición en la copa 140 es aproximadamente 250 microlitros. En este punto la sonda de aspiración 156 se limpia y vuelve después a la estación de muestra 166 para procesar muestras siguientes al mismo tiempo que el conjunto de sonda de incubación 152 continúa el procesado de muestras de subconjuntos.
La sonda de incubación 160 aspira la sangre de la copa de transferencia 140 y deposita aproximadamente 40 microlitros en cada una de las cinco copas secuenciales 132 en bandejas de incubación 124. Después, la sonda de incubación 160 se limpia antes de pasar al módulo de reactivo 122, sacar aproximadamente 20 microlitros del primer par Mab 128, y depositarlos en la primera copa de incubación correspondiente 132. Después de limpiar de nuevo la sonda 160, vuelve al módulo de reactivo 122 y transfiere del segundo par Mab 128 aproximadamente otros 20 microlitros de reactivo a la segunda copa de incubación correspondiente 132. Este proceso continúa hasta que cada una de las copas de incubación requeridas contiene una mezcla de sangre y Mab para incubación.
En este punto, la sonda de incubación 160 se limpia y seca y espera a que termine la primera incubación de Mab/muestra de sangre. Toda la actividad del conjunto de aspiración de muestra 148 se suspende después hasta que las muestras incubadas del conjunto son procesadas de la siguiente manera. La sonda de incubación 160 deposita aproximadamente 30 microlitros del primer subconjunto incubado 132 en la copa WBC 138 que contiene aproximadamente 670 microlitros de reactivo lisante WBC. Después de que la muestra incubada es lisada y arremolinada a aproximadamente 42°C ± 3° durante aproximadamente 11 segundos, el primer par Mab/sangre incubado está listo para medición, después de lo que el contenido de la copa 138 es pipetado directamente a la celda de flujo óptico 170.
El proceso de medición comienza cuando la corriente de células intersecta el volumen iluminado por láser en la celda de flujo 170. Se adquieren datos de los detectores ópticos 382, 384, 400 y 402, mediante la electrónica del sistema y el software del analizador y almacenan en modo de lista para cada mezcla de Mab/reactivo de sangre. La muestra ha sido diluida de manera que las células dentro de la corriente pasen por la zona de iluminación del láser en una sola fila. Cada célula es detectada por la presencia de pulsos indicativos de cuatro características: ALL (Pérdida de Luz Axial), IAS (dispersión de ángulo intermedio), FL1 (fluorescencia verde), y FL2 (fluorescencia naranja). La amplitud de cada impulso es amplificada, digitalizada y almacenada en modo de lista en el eje apropiado del espacio de características.
El análisis comienza con la aplicación de algoritmos a los cuatro datos dimensionales almacenados, a partir de los que se calculan los porcentajes del subconjunto. Después de terminar el tiempo de recuento para la medición del primer subconjunto, la sonda 160 se limpia y seca antes de volver al subconjunto incubado siguiente 132 y repetir el proceso hasta que todos los subconjuntos han sido medidos y analizados. El análisis final, con resultados en porcentajes y recuentos absolutos por microlitro de volumen de sangre del paciente, es un compuesto de todas las mediciones de subconjunto antes descritas y la medición hematológica diferencial WBC.
El tiempo de recuento normal a través de la celda de flujo 170 es aproximadamente 10 segundos. En algunas muestras de recuento bajo, este tiempo de recuento se prolongará automáticamente para mejorar la estadística del recuento de la medición.
Después de terminar el proceso de medición de muestra, el conjunto de aspiración de muestra 148 se reactiva y está preparado para continuar el procesado de muestras siguientes.
Las características descritas de preparación automática de muestras acomodan numerosos paneles de anticuerpos para uso en varias pruebas de inmunología y fenotipificación. Para subconjuntos de linfocitos, cada panel incluye preferiblemente cinco conjuntos de anticuerpos de dos colores. Preferiblemente, cada conjunto de anticuerpos incluye un anticuerpo (Mab) marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceína) y análogos, y un segundo Mab marcado con PE (Ficoeritrina) y análogos. Los anticuerpos se distinguen por números de designación de grupo (CD). Ilustrándolo por medio de un ejemplo, se puede incluir en un panel al menos los Mabs de subconjunto de linfocitos siguientes.
Combinación de Mabs Tipo de células enumerado Porcentajes de células
CD45/CD14+CD13 Linfocitos % de WBC
CD3/CD4 Subconjunto T helper % de Ts, linfs \textamp WBCs
CD3/CD8 Subconjunto T supresor % de Ts, linfs \textamp WBCs
CD3/CD16 Células T tot./NK tot. % de linfs \textamp WBCs
CD5/CD19 Células T tot./B tot. % de linfs \textamp WBCs
También se propone un panel reducido que se podría usar para verificar células CD4 positivas en pacientes con VIH. Se puede incluir al menos los Mabs siguientes en este panel:
Combinación de Mabs Tipo de células enumerado
CD45/CD 14+CD13 Linfocitos
CD3/CD4 Subconjunto T helper
En otras pruebas Mab de fenotipificación, el número de pares Mab, N, podría ser 1, y por lo tanto el volumen requerido de muestra sería aproximadamente 50 microlitros. Se puede usar cualquier combinación de Mabs. Para algunas pruebas, el volumen de reactivo Mab requerido podría basarse en una estimación del recuento de WBC de paciente obtenido de las mediciones hematológicas hechas en la muestra. Por ejemplo, en casos extremos de leucocitosis o leucopenia, puede ser necesario regular la relación de anticuerpo Mab a sangre del paciente para garantizar una unión adecuada de anticuerpos o para evitar fondo excesivo libre de anticuerpos. Dado que las mediciones hematológicas no requieren incubación, prosiguen a través del transductor de celda de flujo antes de que terminen las preparaciones de muestras de subconjuntos de linfocitos. Por lo tanto, la estación de datos puede calcular un recuento estimado de paciente a partir de los resultados hematológicos para dicha muestra para permitir que el analizador 64 regule, según sea necesario, las relaciones de Mab a sangre para llevar a cabo estas pruebas.
F. Procesado de muestras de reticulocitos
Con referencia a las figuras 4a y 5 para procesar pruebas de reticulocitos, después de que la sonda de aspiración 156 ha terminado de mezclar las diluciones de RBC y plaquetas en la copa RBC 134, la sonda de aspiración 156 quita aproximadamente 200 microlitros de sangre diluida a aproximadamente 420:1 y los pone en la copa RETIC 136. La copa RETIC 136 contiene aproximadamente 600 microlitros de reactivo retic, haciendo que la relación de dilución resultante sea aproximadamente 1680:1.
El reactivo de la realización preferida contiene un colorante fluorescente con una excitación máxima cerca de la longitud de onda láser de argón de 488 nm y un rendimiento cuántico alto. El reactivo preferido tiñe ADN y ARN rápidamente, y de tal forma que un histograma de fluorescencia de dimensión única evite la confusión WBC normal. Es tan sensible que el analizador 64 detectará dos fragmentos de ARN en una célula. El método es linear hasta aproximadamente un recuento de reticulocitos de 90%.
Después de un período de incubación apropiado (aproximadamente 25 segundos con el reactivo preferido descrito anteriormente) o inmediatamente después de la mezcla, la mezcla de sangre diluida y reactivo retic se transporta a la celda de flujo óptico 170. Este proceso de transporte puede ser temporizado para proporcionar suficiente tiempo de incubación para la tinción de los reticulocitos, es decir, 25 segundos, si no se necesitan procesos de incubación separados.
Cuando la población que incluye glóbulos rojos maduros y reticulocitos pasa por el volumen iluminado por láser en la celda de flujo 170, se miden las propiedades de dispersión y fluorescencia de la muestra utilizando el fotodiodo 384 y el tubo fotomultiplicador 400, que está configurado para FL1 con un filtro de fluorescencia verde 430. Las amplitudes de los pulsos son filtradas, amplificadas, digitalizadas y almacenadas como datos en modo de lista en el espacio bidimensional de características de IAS y FL1. El tiempo de medición a través de la celda de flujo es aproximadamente 8 segundos con un caudal de muestra de aproximadamente 2 microlitros por segundo. A aproximadamente 5.000.000 RBC de paciente por microlitro de sangre, una realización preferida mide aproximadamente 50.000 eventos, que corresponde a 500 eventos de reticulocito en un paciente con una concentración de reticulocitos de
1%.
Se aplica un algoritmo que excluye WBCs y plaquetas y cuenta reticulocitos por medio de eventos de fluorescencia positivos superpuestos en el histograma RBC negativo. Este método también caracteriza un índice de madurez de reticulocitos, RMI, por medio de intensidad de fluorescencia. El tiempo para procesar una muestra que incluye pruebas hematológicas estándar y reticulocitos en la realización preferida es aproximadamente 45 segundos. Los parámetros siguientes se refieren a la prueba de reticulocitos: Concentración de reticulocitos (RETC), porcentaje de reticulocitos (%R de RBC) e Índice de madurez de reticulocitos (RMI).
También se puede utilizar otro método que usa incubación prolongada del colorante nuclear para medir reticulocitos utilizando la sonda de incubación 160 y la sonda de aspiración 156 en un método similar al utilizado en procesado de subconjuntos de linfocitos, como se explica anteriormente.
Por razones de ilustración, aquí se presentan varios usos de una realización explicada. La explicación siguiente se expone a efectos ejemplificativos solamente y esta explicación no es exhaustiva. A continuación se explican específicamente formas de usar una realización descrita para efectuar un análisis integrado de células sanguíneas, un análisis de hemoglobina, un análisis de glóbulos rojos y plaquetas, un análisis diferencial de glóbulos blancos, un análisis de reticulocitos, análisis de inmunofenotipo de linfocitos, medición de un conjunto T helper, medición de un subconjunto T supresor y medición de linfocitos T y B. Se hacen referencias apropiadas a software, que puede estar presente en una RAM, una ROM, una EPROM, una SRAM u otro dispositivo de memoria adecuado, utilizado al realizar los pasos descritos. El código fuente para el software se presenta en el Apéndice A y el Apéndice B que aparecen inmediatamente antes de las reivindicaciones. Los números de pasos indicados en los ejemplos se reproducen como números de "STEP" situados en las líneas apropiadas en el código fuente del software. Porciones del software se pueden entender más fácilmente si se combinan con la referencia a las figuras 44A-44F y 63A-63F.
Ejemplo 1 Análisis integrado de células sanguíneas
Se puede utilizar una realización de la invención para efectuar análisis celulares de muestras de sangre entera. Sigue un ejemplo de dicho procedimiento de análisis. Los pasos del procesado de muestra son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice A. Los pasos del análisis de datos son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice B.
1 - El operador coloca un tubo de muestra conteniendo una muestra de sangre entera en el soporte de tubo de muestra.
2 - El conjunto de ventilación baja y perfora el tapón del tubo de muestra (Paso A1).
3 - La sonda de aspiración se baja al tubo de muestra (Paso A2).
4 - Se aspira 75 \mul de sangre a la sonda de aspiración (Paso A3).
5 - La sonda de aspiración se eleva y saca del tubo, limpiándose mientras sube (Paso A4).
6 - Se lleva a cabo una verificación para garantizar que la sonda de aspiración se ha elevado completamente (Paso A5).
7 - La sonda de aspiración se mueve a un punto directamente sobre la copa HGB (Paso A6).
8 - El conjunto de ventilación sube para retirarse del tapón del tubo de muestra (terminación del paso A7).
9 - La sonda de aspiración se baja ligeramente hacia la copa HGB (Paso A8).
10 - Se deposita 18,75 \mul de sangre en la copa HGB para análisis HGB (Paso A9).
11 - La sonda de aspiración se mueve a una posición directamente sobre la copa WBC (Paso A10).
12 - Se deposita 18,75 \mul de sangre en la copa WBC para análisis WBC (Paso A11).
13 - La sonda de aspiración se mueve a una posición directamente sobre la copa RBC (Paso A12).
14 - La sonda de aspiración se baja a la copa RBC (Paso A13).
15 - Se abre una válvula que suministra diluyente a la sonda de aspiración (Paso A14).
16 - Se dispensa 2000 \mul de diluyente mediante la sonda de aspiración, junto con los 18,75 \mul de sangre restantes, a la copa RBC para análisis de RBC y plaquetas (Paso A15).
17 - Se aspira 1000 \mul de la mezcla de sangre/diluyente a la sonda de aspiración desde la copa RBC (Paso A16).
18 - La sonda de aspiración se eleva y limpia (Paso A17).
19 - La sonda de aspiración se desplaza a una posición directamente sobre la copa RETIC (Paso A18).
20 - La sonda de aspiración se baja ligeramente hacia la copa RETIC (Paso A19).
21 - Se dispensa 200 \mul de la mezcla de sangre/diluyente de la sonda de aspiración a la copa RETIC para análisis de reticulocitos (Paso A20). Se deposita simultáneamente 600 \mul de reactivo retic en la copa RETIC desde un orificio fijo.
18 - El conjunto de ventilación se vuelve a su posición inicial (Paso A21).
19 - La sonda de aspiración se desplaza a la copa de lavado (Paso A22).
20 - La sonda de aspiración se baja a la copa de lavado (Paso A23).
21 - La sonda de aspiración se lava (Paso A24).
22 - La sonda de aspiración se eleva (Paso A25).
23 - La sonda de aspiración se vuelve a su posición inicial (Paso A26).
24 - El instrumento ejecuta el procesado de muestra y análisis de datos para análisis de HGB, WBC, RBC, plaquetas y reticulocitos, como se describe con detalle en los ejemplos siguientes (algoritmo de nivel superior archivo mcCBCAlgorithm.cc).
25 - Los resultados de los análisis se almacenan y presentan, tal como se ilustra en las figuras 45A a 45F.
Ejemplo 2 Análisis de hemoglobina (HGB)
Se puede utilizar una realización de la invención para realizar análisis de hemoglobina de muestras de sangre entera. Sigue un ejemplo de dicho procedimiento de análisis. Los pasos del procesado de muestra son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice A. Los pasos del análisis de datos son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice B.
1 - Se dispensa 1590 \mul de agente lisante de HGB a la copa HGB (paso H1).
2 - Se deposita 18,75 \mul de sangre entera en la copa HGB desde la sonda de aspiración, como parte de la secuencia del Ejemplo 1 (Paso A9).
3 - Se dispensa 4273 \mul de agente lisante de HGB a la copa HGB de manera que produzca mezcla de fluidos (Paso H2).
4 - Pueden transcurrir aproximadamente 7 segundos para permitir la lisis celular.
5 - La muestra HGB lisada se desplaza a través de los tubos del instrumento para facilitar la transferencia al transductor HGB (Paso H3).
6 - Se bombea la muestra HGB lisada al transductor HGB (Paso H4).
7 - Se drena y enjuaga la copa HGB (Paso H5).
8 - la copa HGB se llena de agente lisante de HGB para formar la muestra de referencia (Paso H6).
9 - Se lee la transmisión de luz en el transductor HGB (Paso H7). El transductor contiene la muestra HGB lisada, y este paso se produce aproximadamente 15-20 segundos después de la mezcla de la muestra de sangre y agente lisante.
10 - La muestra de referencia se desplaza a través de los tubos del instrumento para facilitar la transferencia al transductor HGB (paso H8).
11 - La muestra de referencia se fuerza al transductor HGB (paso H9).
12 - Se reposiciona la bomba de jeringa usada para dispensar agente lisante de HGB (Paso H10).
13 - Se drena la copa HGB (Paso H11).
14 - Se quita holgura de la bomba de jeringa de agente lisante HGB (Paso H 12).
15 - Se lee la transmisión óptica de la muestra de referencia en el transductor HGB (Paso H13).
16 - Los datos de la muestra y muestra de referencia se almacenan en un archivo para análisis siguiente descrito en los pasos 17-22 y se ejecutan con el algoritmo archivo mcRBCAlgorithm.cc).
17 - Se inicializan las variables de análisis y los señalizadores (subrutinas ParamDefaults y ClassFlagDefaults).
18 - Los datos HGB son transferidos desde un archivo de datos a dispositivo de almacenamiento local (subrutina GetHBGData).
19 - La concentración de hemoglobina se calcula como HGB = log (medición de ref/medición de muestra)
* 0,64 * (factores de calibración) (subrutina DoHGBAnalysis).
20 - Calcular parámetros HGB celulares (subrutina DoHGBnalysis) usando parámetros RBC (concentración de glóbulos rojos) y HCT (hematocrito) determinados por análisis RBC descrito más adelante:
Hemoglobina celular media
MCH = HGB/RBC * (factor de conversión unitario)
Concentración celular media de hemoglobina
MCHC = HGB * (factor de conversión unitario)/HCT.
21 - Poner señalizadores HGB si algunos resultados son anormales o sospechosos (subrutina SetHgbFlags).
22 - Devolver resultados de análisis y señalizadores para el almacenamiento (subrutinas SendNumResults y SendAlertResults) y presentación en el dispositivo de visualización.
Ejemplo 3 Análisis de glóbulos rojos (RBC) y plaquetas (PLT)
Se mezcla rápidamente 17,5 microlitros de una muestra de sangre con 7400 microlitros del reactivo de la presente invención (dilución 1:420), y se pasa 0,5 microlitro de la muestra diluida por un transductor de impedancia enfocado hidrodinámicamente (envuelto) 174 durante 12 segundos para recuento de glóbulos rojos y medición de volumen así como recuentos de plaquetas. Además, se pasa 2,5 microlitros de la muestra diluida por una celda de flujo óptico envuelta 170 durante 6 segundos para recuentos exactos y precisos de plaquetas. Las señales de ruido de fragmentos de células anormales frágiles se excluyen del recuento óptico de plaquetas delimitando con precisión la población de plaquetas por un algoritmo de plaquetas.
Se utilizó una realización de la presente invención para realizar análisis de glóbulos rojos (RBS) y plaquetas (PLT) de muestras de sangre entera. Sigue un ejemplo de dicho procedimiento de análisis. Los pasos del procesado de muestra son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice A. Los pasos del análisis de datos son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice B.
1 - Se drena la copa RBC (Paso RBC1).
2 - Se dispensa 2,2 ml de diluyente RBC a la copa RBC con la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC2).
3 - Se dispensa 18,75 \mul de sangre entera y 2000 \mul de diluyente RBC mediante la sonda de aspiración a la copa RBC, como se describe en el Ejemplo 1 (Paso A15).
4 - Se dispensa 3,2 ml de diluyente a la copa RBC con la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC3).
5 - La mezcla de sangre y diluyente se desplaza a la proximidad del transductor de impedancia con la bomba peristáltica de RBC (Paso RBC4).
6 - Se llena la jeringa de distribución de RBC (Paso RBC5).
7 - Se inicia el flujo de diluyente a través del transductor óptico (Paso RBC6).
8 - La mezcla de sangre y diluyente se desplaza a la proximidad del transductor óptico con la bomba peristáltica óptica (Paso RBC7).
9 - Se aproxima la mezcla de sangre y diluyente al transductor de impedancia con la jeringa de distribución de RBC (Paso RBC8).
10 - La mezcla de sangre y diluyente se envía mediante el transductor óptico a aproximadamente 52 \mul/s con la jeringa de distribución óptica (Paso RBC9).
11 - El flujo a través del transductor óptico se reduce a aproximadamente 2,5 \mul/segundo (Paso RBC10).
12 - La mezcla de sangre y diluyente se envía a través del transductor de impedancia a aproximadamente 0,5 \mul/segundo con la jeringa de distribución de RBC (Paso RBC11).
13 - Se recogen datos del transductor óptico (Paso RBC12). Se aplica una puerta de hardware para recoger solamente datos correspondientes a plaquetas.
14 - Se recogen datos del transductor de impedancia (Paso RBC13). Se utiliza una puerta de hardware para recoger y datos separados referentes a plaquetas (<35 fL), y datos relativos a glóbulos rojos (> 30 fL) en base a la magnitud de los picos de impedancia.
15 - Se drena la copa RBC (Paso RBC14).
16 - Se reposiciona la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC15).
17 - La copa RBC se llena de diluyente (Paso RBC16).
18 - Se drena la copa RBC (Paso RBC17).
19 - Se quita holgura de la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC1 8).
20 - Se enjuagan las líneas RBC al transductor óptico (Paso RBC19).
21 - Se lava el transductor de impedancia en contracorriente (Paso RBC20).
22 - Se lavan otras líneas RBC (Paso RBC21).
23 - Se reposiciona la jeringa de distribución de RBC (Paso RBC22).
24 - Se quita holgura de la jeringa de distribución RBC.
25 - Los datos del transductor de impedancia y el transductor óptico se guardan en un archivo para uso en análisis de RBC (pasos 26-34, ejecutados por el algoritmo archivo mcRBCAlgorithm.cc) y análisis de plaquetas siguientes (pasos 35-50, ejecutados por el algoritmo archivo mcPLTalgorithm.cc).
26 - Se inicializan señalizadores y parámetros (subrutinas ParamDefaults y ClassFlagDefaults).
27 - Se recuperan datos de impedancia RBC de un archivo y almacenan localmente (subrutina GetRBCData).
28 - Se genera un histograma de 256 rectángulos de valores de impedancia RBC (subrutina mmHist256).
29 - Los umbrales de rectángulo para el histograma se ponen de la siguiente manera (subrutina BinCut):
a. Se determina el modo de histograma.
b. A ambos lados del modo, se identifica el primer rectángulo con una población inferior a 0,04 veces la población del modo. Estos límites se denominan los discriminantes, y solamente se utilizan valores entre ellos para calcular los parámetros de distribución RDW (Anchura de distribución RBC) y MCV (Volumen medio de células).
c. A la izquierda (es decir, para valores inferiores de volumen RBC) del umbral de rectángulo inferior, se identifica el primer valle o rectángulo de recuento cero, si está presente, y se pone como el umbral de recuento. Se considera que los valores superiores a este umbral son debidos a RBCs.
30 - Se calcula RBC (concentración de glóbulos rojos) (subrutina CalcRedConc).
RBC = (número de eventos) * (proporción que son RBCs) * (relación de dilución) * (factor de corrección de coincidencia) * (factores de calibración)/(velocidad de flujo * tiempo de medición);
Donde número de eventos es el número de células detectado por la puerta de hardware en el paso 14;
Proporción que son RBCs es el recuento de histograma a la derecha del umbral de recuento dividido por el recuento de histograma total.
El factor de corrección de coincidencia explica el recuento de células dobles y es igual a 2 - exp (concentración RBC no corregida * volumen del transductor/relación de dilución)
31 - Calcular MCV y RDW (subrutina CalcRedDist):
MCV = (media del histograma entre discriminantes) * (0,8 fL por rectángulo) * (factor de calibración)
RDW = desviación estándar de volumen RBC/volumen medio de células (dentro de discriminantes).
32 - Poner señalizadores asociados RBC para indicar resultados anormales del análisis (subrutina SetRbcFlag).
33 - Los resultados numéricos y de señalizador RBC son devueltos al sistema para almacenamiento y visualización (subrutina SendNumResults y SendAlertResults). Ejemplos de resultados numéricos RBC se muestran en las figuras 45A-45F.
34 - Se genera un histograma para el almacenamiento y visualización de valores de volumen RBC (subrutina MakeDisplayHist). Ejemplos de histogramas de volumen RBC se muestran en las figuras 45A-45F y la figura 46.
35 - Se inicializan señalizadores y parámetros (subrutinas ParamDefauls y ClassFlagDefaults).
36 - Se recuperan datos ópticos y de impedancia de plaquetas de un archivo y se almacenan localmente (subrutinas GetPLTiData y GetPLToData). Los datos de impedancia constan de valores de impedancia que representan volúmenes de plaquetas. Los datos ópticos constan de valores ópticos de dispersión lateral polarizada (PSS) y dispersión de ángulo intermedio (IAS).
37 - Se genera un histograma de 256 rectángulos de datos de impedancia de plaquetas) (subrutina mmHist256). Esto representa valores de volumen del orden de 0 a 35 fL.
38 - se ponen umbrales de rectángulo a ambos lados del modo de histograma (subrutina BinCut) de la siguiente manera:
a. Se identifican los primeros rectángulos a ambos lados del modo cuyo recuento es inferior a 0,04 veces el recuento del modo.
b. Se identifica, si existe, un segundo pico más allá del umbral original, junto con el valle entre dicho pico y el modo.
c. Si existe un segundo pico y el recuento en el valle es inferior a 0,02 veces el recuento del modo, el umbral se desplaza al valle.
39 - PLTi, la concentración de plaquetas basada en valores de impedancia (subrutina CalcPLTiConc):
PLTi = (número de eventos) * (proporción que son plaquetas) * (relación de dilución) * (factores de calibración)/(velocidad de flujo * tiempo de medición);
donde el número de eventos es el número de células detectado por la puerta de hardware en el paso 14;
la proporción que son plaquetas es el recuento de histograma a la derecha del umbral izquierdo dividido por el recuento de histograma total.
40 - Se calculan los parámetros de distribución de plaquetas MPV (volumen medio de plaquetas) y PDW (anchura de distribución de plaquetas) (subrutina CalcPLTDist):
MPV = (número de rectángulos de la media de los valores de histograma entre umbrales) * (0,137 fL por rectángulo) * (factores de calibración)
PDW = (desviación estándar de valores de volumen de plaquetas entre umbrales)/(volumen medio de plaquetas).
41 - Los señalizadores de plaquetas asociados con impedancia se ponen a resultados anormales del análisis (subrutina SetPLFTiFlags).
42 - Se aplica una puerta de ruido a los datos ópticos de plaquetas en log(PSS) = 8,0 (subrutinqa PLToNoiseGate).
43 - Se aplican puertas de banda de regresión a los datos ópticos restantes de plaquetas como sigue (subrutina PLToRegressBandGate):
a. Se calcula una regresión lineal para los datos ópticos de plaquetas encima de la puerta de ruido en el plano de análisis log (IAS) en función de log(PSS), junto con una estimación de error estándar para esta regresión.
b. La puerta de banda de regresión superior se traza paralela a y a una distancia de 2,0 errores estándar encima de la línea de regresión.
c. La puerta de banda de regresión inferior se traza paralela a y a una distancia de 2,5 errores estándar por debajo de la línea de regresión.
44 - Los datos ópticos de plaquetas encima de la puerta de ruido y entre las puertas de banda de regresión se verifican en busca de una población superior (subrutina PLToFindUpperPopulation):
a. Los puntos restantes se proyectan en la línea de regresión del paso 43.
b. Se genera un histograma de 256 rectángulos, se reduce a 64 rectángulos por promediado, se filtra con un filtro vagón de 7 patillas, y se expande a 256 rectángulos por interpolación.
c. Se identifica un modo en los 2/3 inferiores del histograma.
d. Se busca un segundo pico en el 1/4 superior del histograma.
e. Si existe un segundo pico en el 1/4 superior, la puerta de población superior se pone al valle entre el modo y el segundo pico. De otro modo, la puerta de población superior se pone en el borde derecho del histograma. Las células no excluidas previamente que están por encima de esta puerta son la "población superior". Las células no excluidas previamente que están por debajo de esta puerta son la "población inferior".
f. La población superior se compara con un conjunto de criterios para determinar si incluye RBCs microcíticos. Si es así, se pone un señalizador de aviso.
\newpage
45 - Se calcula la concentración de plaquetas determinada ópticamente (PLTo) (subrutina CalcPLToParams):
PLTo = (número de eventos) * (proporción que son plaquetas) * (relación de dilución)/(velocidad de flujo * tiempo de medición)
donde el número de eventos es el número de eventos ópticos contados por hardware que caen dentro de la puerta de hardware cuadrada en el espacio log(IAS) en función de log(PSS);
la proporción que son plaquetas es el recuento de la población superior dividida por la suma del recuento de las poblaciones superior e inferior.
46 - Se calcula el plaquetocrito (PCT, o fracción de sangre entera compuesta de plaquetas) (subrutina CalcPCT):
PCT = PLTo * MPV * (factor de conversión unitario).
47 - Se ponen señalizadores asociados con parámetros de plaquetas determinados ópticamente para indicar resultados anormales (subrutina SetPLToFlgs).
48 - Los resultados numéricos y señalizadores asociados con parámetros de plaquetas determinados ópticamente son devueltos al sistema para el almacenamiento y visualización (subrutina SendNumResults y SendAlertResults). Ejemplos de resultados numéricos de plaquetas se muestran en las figuras 45A-45F, las figuras 47 y 48.
49 - Se genera un histograma de valores de impedancia de plaquetas para el almacenamiento y visualización (subrutina MakeDisplayHist). Se representa un ejemplo de histograma de impedancia de plaquetas en la figura 47.
50 - Se genera un diagrama de dispersión de valores ópticos de plaquetas y puertas para el almacenamiento y visualización (subrutina SendScatResults). Ejemplos de diagramas de dispersión de plaquetas se muestran en las figuras 45A-45F, las figuras 47 y 48.
Ejemplo 4 Análisis diferencial de glóbulos blancos (WBC)
Se puede usar una realización de la invención para realizar un ejemplo de análisis diferencial de glóbulos blancos (WBC) de muestras de sangre entera. Sigue un ejemplo de dicho procedimiento de análisis. Los pasos del procesado de muestra son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice A. Los pasos del análisis de datos son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice B.
1 - El motor de copa WBC comienza el movimiento de mezcla de la copa (Paso W1).
2 - Se dispensa 1275 \mul de agente lisante WBC a la copa WBC con la jeringa de diluyente WBC (Paso W2).
3 - Se deposita 37,5 \mul de sangre entera en la copa WBC con la sonda de aspiración (Paso A9 del Ejemplo 1).
4 - Se reposiciona la jeringa de diluyente WBC (Paso W3).
5 - La jeringa de diluyente WBC se desplaza para quitar holgura (Paso W4).
6 - Se deja transcurrir aproximadamente 9,4 segundos después de la mezcla de la muestra de sangre y agente lisante WBC.
7 - Se inicia flujo envolvente en el transductor óptico (Paso RBC6 del Ejemplo 3).
8 - La mezcla de sangre y agente lisante se desplaza a la línea de transductor óptico usando la bomba peristáltica HGB (Paso W5).
9 - Se drena y enjuaga la copa WBC (Paso W6).
10 - La realineación de la válvula permite el flujo de muestra WBC mediante el transductor óptico (Paso W7).
11 - El flujo de muestra WBC comienza mediante el transductor óptico a aproximadamente 27,6 \mul/s con la jeringa de distribución óptica (Paso W8).
12 - El caudal de muestra WBC se reduce a aproximadamente 2,5 \mul/segundo (Paso W9).
13 - El transductor óptico recoge datos ópticos WBC (Paso W10).
14 - Se reposiciona la jeringa de distribución óptica (Paso W11).
15 - Se quita holgura de la jeringa de distribución óptica (Paso W12).
16 - Los datos del transductor óptico se guardan en un archivo para uso en análisis WBC diferencial siguiente (pasos 17 - XX, ejecutados por el archivo de algoritmo mcWBCAlgorithm.cc).
17 - Se recupera datos WBC de un archivo y almacenan localmente (subrutina GetWBCData). Estos datos constan de valores de pérdida de luz axial (ALL), dispersión de ángulo intermedio (IAS), dispersión lateral polarizada (PSS), dispersión lateral despolarizada (DSS), y fluorescencia roja (FL3) para cada evento detectado.
Los pasos 18-22 identifican glóbulos rojos nucleados (NRBCs).
18 - Se genera un histograma de 256 rectángulos de valores FL3 (subrutina mmHist256).
19 - Los eventos se dividen en "FL3 alto" o "FL3 bajo" identificando un valle cerca de log(FL3) = 100 (subrutina FindFI3Cells). Un ejemplo de esta división se ilustra en las figuras 49A y 49B.
20 - Se genera un histograma de los valores ALL de las células FL3 altas (subrutina mmHist256). Un ejemplo de este histograma se ilustra en las figuras 50A y 50B.
21 - Se identifica un pico a un valor de menos de ALL = 75; si existe (subrutina AbalyzeFI3Cekks). Si no existe, no se refieren NRBCs.
22 - Si existe un pico a ALL<75, los eventos con un valor PSS mayor que el umbral PSS (aproximadamente 45) se clasifican como NRBCs y no experimentan análisis adicional.
Los pasos 23-26 identifican neutrófilos y eosinófilos.
23 - Se utiliza un gráfico de todos los eventos en el plano PSS en función de ALL para identificar los dos picos más grandes, que son el pico de neutrófilos y el pico de monolitos (subrutina FindMGLine).
24 - Se traza una línea entre los dos picos. Comenzando en el valor mínimo a lo largo de esta línea, se traza una línea divisoria entre los granulocitos (por encima de la línea) y células mononucleares (por debajo de la línea) (subrutina FindMGLine, continuación). Un ejemplo de la línea divisoria se ilustra en las figuras 51A y 51B.
25 - Para los granulocitos (por encima de la línea), se genera un histograma de los valores de arctan(DSS/PSS) (subrutina FindNELine).
26 - Se busca en el histograma del paso 25 un valle entre los valores angulares de 10° y 31° (subrutina
FindNELine, continuación). Las células con un valor angular de arctan(DSS/PSS) mayor que este valle se clasifican como eosinófilos, y las células con valores angulares inferiores a este valle se clasifican como neutrófilos. Un ejemplo de este histograma y línea divisoria angular se ilustra en las figuras 52A y 52B.
Los pasos 27-28 identifican monocitos y estroma.
27 - A partir de las células restantes se genera un histograma de 256 rectángulos de valores ALL (subrutina mmHist256).
28 - En el histograma ALL se buscan dos valles, en la región alta (rectángulos 100-160) y en la región baja (rectángulos 45-75). Las células encima del valle superior se clasifican como monocitos. Las células por debajo del valle más bajo se clasifican como estroma (subrutina FindLymphLines). Un ejemplo del histograma ALL y líneas divisorias se ilustra en la figura 53.
Los pasos 29-30 se utilizan para identificar linfocitos.
29 - A partir de las células restantes se genera un histograma de 256 rectángulos de valores IAS (subrutina mmHist256).
30 - Se identifica un valle, si existe, entre los rectángulos 70 y 110. Si tal valle no existe, se traza una línea divisoria a un valor igual a la media de los valores IAS más 2,5 veces la desviación estándar de los valores IAS. Las células a la izquierda de este valle o línea se clasifican como linfocitos. Un ejemplo de esta división se ilustra en la figura 54.
Los pasos 31-32 se utilizan para identificar basófilos.
31 - A partir de las células restantes se genera un histograma de 256 rectángulos de valores ALL (subrutina mmHist256).
32 - Se identifica un valle en el histograma ALL, si existe, entre 1/4 y 3/4 de la distancia de las líneas de separación linfocito-estroma y linfocito-monocito determinadas en el paso 28. Si no existe tal valle, se traza una línea divisoria por defecto a la mitad de esta distancia. Las células con valores ALL por encima de esta línea se clasifican como basófilos. Los eventos con valores ALL por debajo de esta línea se clasifican como ruido (subrutina FindBasoLines). Un ejemplo de esta división se ilustra en la figura 55.
33 - Se generan histogramas y estadísticas para cada población clasificada (subrutina DoPopStats).
34 - Se ponen señalizadores de alerta para resultados anormales del análisis (subrutina SetFlags). En particular, este paso incluye realizar una comprobación estadística de la presencia de RBCs resistentes a lisis y de blastos. Se pone un señalizador de alerta de blasto si una combinación ponderada de las estadísticas siguientes es superior a un valor umbral (aproximadamente 3,874):
Estadística de población Factor de ponderación
Porcentaje de monocitos 0,030352
Media de linfocitos ALL 0,013182
Media de monocitos ALL 0,016766
Coeficiente de variación de monocitos ALL 0,152739
Coeficiente de variación de monocitos IAS -0,041058
Media de monocitos PSS -0,051015
Coeficiente de variación de monocitos PSS 0,028661
Coeficiente de variación de linfocitos y monocitos PSS -0,02960
Media de todos WBC FL3 0,024813
35 - Todos los resultados numéricos y señalizadores de alerta son devueltos al sistema para almacenamiento y visualización (subrutina SendNumResults y SendFlagResults).
36 - Se genera un conjunto de diagramas de dispersión y envía al sistema para almacenamiento y visualización (subrutina SendScatResults). Una pantalla típica presentará ALL en función de IAS, DSS en función de PSS, y ALL en función de FL3, como se ilustra en las figuras 45A-45F.
Ejemplo 5 Análisis de reticulocitos
Se puede usar una realización de la invención para realizar análisis de reticulocitos de muestras de sangre entera. Sigue un ejemplo de dicho procedimiento de análisis. Los pasos del procesado de muestra son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice A. Los pasos del análisis de datos son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice B. Los diagramas de dispersión generados por este análisis se ejemplifican en las figuras 14A y 14B.
1 - El análisis comienza con una copa RBC vacía.
2 - Se dispensa 2200 \mul de diluyente RBC a la copa RBC con la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC2).
3 - Se dispensa 18,75 \mul de sangre entera y 2000 \mul de diluyente RBC mediante la sonda de aspiración a la copa RBC, como se describe en el Ejemplo 1 (Paso A15).
4 - Se dispensa 3656 \mul de diluyente a la copa RBC con la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC3). Se produce una relación de dilución de aproximadamente 420:1.
5 - Se aspira 500 \mul de la mezcla de sangre/diluyente a la sonda de aspiración desde la copa RBC (Paso A16).
6 - La sonda de aspiración se eleva y limpia (Paso A17).
7 - La sonda de aspiración se desplaza a una posición directamente sobre la copa RETIC (Paso A18).
8 - La sonda de aspiración se baja ligeramente hacia la copa RETIC (Paso A19).
9 - Se dispensa 200 \mul de la mezcla de sangre/diluyente de la sonda de aspiración a la copa RETIC para análisis de reticulocitos (Paso A20).
10 - Se dispensa 600 \mul de colorante de reticulocito mediante un orificio fijo a la copa RETIC con la jeringa de diluyente de reticulocito (Paso R1). Se produce una relación de dilución de aproximadamente 1680:1.
11 - Se reposiciona la jeringa de diluyente de reticulocito (Paso R2).
12 - La muestra de reticulocitos se transfiere a cerca de la celda de flujo óptico con la bomba peristáltica de RBC (Paso R3).
13 - Se inicia un breve contraflujo en la línea de muestra WBC a la celda de flujo óptico para evitar transferencia (Paso R4).
14 - La copa RETIC se drena (Paso R5).
15 - El flujo de la muestra de reticulocitos se inicia mediante la celda de flujo óptico a 78 \mul/s usando la jeringa de distribución óptica (Paso R6) para desplazar el volumen muerto de la línea de fluido.
16 - El flujo de la muestra de reticulocitos mediante la celda de flujo óptico se reduce a aproximadamente 2,0 \mul/s (Paso R7).
17 - La copa RETIC se llena de diluyente para enjuague (Paso R8).
18 - Se recogen datos de reticulocitos en el transductor óptico (Paso R9). Una puerta de hardware recoge datos para cada evento óptico con un valor de dispersión de ángulo intermedio (IAS) mayor que un cierto valor umbral.
19 - La copa RETIC se drena, enjuaga y drena (Paso R10).
20 - Se reposiciona la jeringa de distribución óptica (Paso R11).
21 - Se enjuagan las líneas de distribución de muestra de reticulocitos (Paso R12).
22 - Se quita holgura de la jeringa de distribución óptica (Paso R13).
23 - Se almacenan datos ópticos de reticulocitos en un archivo para análisis siguiente. El análisis de los pasos 24-33 se controla por un algoritmo archivo mmRETCAlgorithm.cc.
24 - Se recuperan datos de un archivo y almacenan localmente (subrutina GetRETCData). Estos datos constan de valores de dispersión de ángulo intermedio (IAS) y fluorescencia verde (FL1).
25 - Se genera un histograma de 256 rectángulos de valores log(IAS) (subrutina mmHist256).
26 - Se identifica un valle entre los canales 150 y 190, si existe. Las células con valores log(IAS) inferiores a este valle (o 170, si no existe valle) se consideran plaquetas y quitan del análisis posterior (subrutina FindPLTs). Un ejemplo de este histograma y línea divisoria se ilustra en la figura 56.
27 - A partir de las células restantes se genera un histograma de 256 rectángulos de valores log(FL1) (subrutina mmHist256).
28 - Se identifica un valle, si existe, en la región superior de este histograma (entre los rectángulos 175 y 225). Las células con valores log(FL1) mayores que este valle (o 200, si no existe valle) se consideran WBCs y quitan del análisis (subrutina FindWBCs).
29 - Se busca en el histograma log(FL1) un valle a la derecha del pico mayor (RBC). Si existe tal valle, las células a la derecha se clasifican como reticulocitos. Si no existe valle, se pone una línea divisoria en el canal 120 (cursor de reticulocitos por defecto). Las células a la derecha de esta línea divisoria se clasifican como reticulocitos (subrutina FindRETCs). Ejemplos de este histograma y las líneas divisorias se ilustran en las figuras 45F y 57.
30 - Se calcula el índice de madurez de reticulocitos (RMI). Este valor es igual al porcentaje de reticulocitos que caen en una región de "FL1 alto", definida como la que tiene rectángulos de histograma log(FL1) más altos que el límite inferior de reticulocitos (establecido en el paso 29) más un valor fijo (aproximadamente 24) (subrutina GetFionalCounts).
31 - Los resultados numéricos son devueltos al sistema para el almacenamiento y visualización (subrutina SendNumResults).
\newpage
32 - Se genera un diagrama de dispersión para almacenamiento y visualización (subrutina SendScatResults). Un ejemplo de un diagrama de dispersión de reticulocito se ilustra en las figuras 14A y 58.
33 - Se genera un histograma de valores log(FL1) para visualización y almacenamiento (subrutina SendHistResults). Ejemplos de histogramas de reticulocitos se ilustran en las figuras 14B, 45F y 59.
Ejemplo 6 Análisis de inmunofenotipificación de linfocitos
Se puede emplear una realización de la invención para realizar análisis de inmunofenotipificación del linfocito de muestras de sangre entera. Sigue un ejemplo de dicho procedimiento de análisis. Los pasos del procesado de muestra son controlados por software tal como el presentado en el Apéndice A.
1. Se aspiran 100 \mul de sangre entera por la sonda de aspiración y se depositan en la copa de transferencia (subrutina subasp.f). Este volumen se puede ajustar si necesario para proporcionar suficiente sangre para ejecutar todos los ensayos de inmunofenotipificación deseados para dicha muestra.
2. La sonda de incubación aspira aproximadamente 70 \mul de la copa de transferencia y los deposita en el número apropiado de copas de incubación (subrutina subprep.f).
3. Se aspira reactivos, tal como reactivos de anticuerpos para inmunofenotipificación, por la sonda de incubación y depositan en las copas de incubación apropiadas (subrutina subinc.f).
4. Se produce un retardo de tiempo apropiado para incubación.
5. Se añade aproximadamente 670 \mul de diluyente WBC a la copa WBC. Este paso y los pasos de procesado de muestra siguientes (5 a 8) son controlados por software tal como el de la subrutina subvu.f.
6. Después de la incubación, se aspiran aproximadamente 30 \mul de la muestra por la sonda de incubación y depositan en la copa WBC.
7. La mezcla de muestra y diluyente es mezclada por la copa WBC durante aproximadamente 5 segundos.
8. La mezcla se envía mediante el transductor óptico para la medición de propiedades ópticas. Las propiedades medidas pueden incluir pérdida de luz axial (ALL), dispersión de ángulo intermedio (IAS), y dos valores de fluorescencia (FL1 y FL2).
9. Los datos se almacenan para análisis siguiente. Los pasos de análisis generales pueden incluir los aquí indicados.
10. Se crea un gráfico de valores ALL en función de IAS dividido en regiones bivariantes polares. Tales regiones están delimitadas por radios y arcos que derivan de un origen. El origen se puede variar, pero por lo general está colocado en el límite ALL máximo y el punto IAS cero. Véase la figura 60A.
11. Se crea un segundo gráfico de log(FL2) en función de log(FL1) y divide en regiones bivariantes polares. El origen para esta división está por lo general en (0,0). Una ilustración de un ejemplo del gráfico de ALL en función de IAS y el gráfico de log(FL2) en función de log(FL1) se presenta en las figuras 60A y 60D.
12. En ambos gráficos se busca picos de linfocito hacia la izquierda y después radialmente hacia fuera. Los umbrales se ponen a 1/10 de las alturas de pico. Las células cuyos puntos de datos asociados están dentro de los umbrales se consideran linfocitos.
13. El número de eventos de linfocito en cada gráfico se cuenta y comparan entre sí y con el recuento de linfocitos hematológicos para detectar posibles errores. Véase las figuras 60B, 60C, 60E y 60F.
14. El análisis estadístico puede refinar más los límites de los valores IAS y ALL que identifican más específicamente linfocitos. Esta delineación puede formar elipsoides, polígonos, u otras zonas geométricas dentro del espacio del análisis de ALL en función de IAS.
15. Puede proseguir el análisis de la misma muestra tratada con diferentes reactivos de anticuerpos. Las células se consideran para análisis solamente si sus valores IAS y ALL caen dentro de los límites determinados por la identificación de linfocitos (pasos 10 a 14).
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Ejemplo 6A
Medición del subconjunto T Helper
Se puede usar una realización de la invención para medir la fracción de linfocitos que son células T Helper siguiendo un procedimiento similar al siguiente:
1. Se incuba una porción de una muestra de sangre entera con una mezcla de reactivo incluyendo anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores CD45 en WBCs y emitirán fluorescencia detectable por uno de los dos detectores de fluorescencia (FL1 o FL2) y anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a ambos receptores CD13 y CD14 en WBCs y emitirán fluorescencia detectable por el otro de los dos detectores de fluorescencia. En este Ejemplo, el anticuerpo CD45 se une a isotiocianato de fluoresceína (FITC) y los anticuerpos CD13 y CD14 se unen a ficoeritrina (PE). Se produce incubación típica durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
2. Se incuba una segunda porción de la misma muestra de sangre entera con una mezcla de reactivo incluyendo anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores CD3 en WBCs y emitirán fluorescencia detectable por uno de los dos detectores de fluorescencia (FL1 o FL2) y anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores CD4 en WBCs y emitirán fluorescencia detectable por el otro de los dos detectores de fluorescencia. En este Ejemplo, los anticuerpos CD3 se unen a FTC y los anticuerpos CD4 se unen a PE.
3. La primera muestra de sangre incubada se analiza de forma parecida a la descrita en el Ejemplo 6. Este análisis produce una región de valores IAS y ALL (la puerta de linfocito) que corresponde a linfocitos, que se caracterizan por la presencia de receptores CD45 y la ausencia de receptores CD13 y CD14. En la figura 61A se presenta un gráfico de niveles de fluorescencia correspondientes a actividad CD13/CD14 y actividad CD45 y la designación resultante de linfocitos. Un gráfico de los valores IAS y ALL para las mismas células y la puerta de linfocitos resultante se presenta en 61B.
4. La pureza de la puerta de linfocitos procedimiento se puede determinar calculando la fracción de todas las células dentro de la puerta de linfocitos que demuestran la presencia de receptores CD45 y la ausencia de receptores CD13 y CD14, como se indica con los niveles de fluorescencia detectados por los detectores FL1 y FL2. Un gráfico de los niveles de fluorescencia correspondientes a actividad CD13/CD14 y actividad CD45 para células dentro de la puerta de linfocitos se presenta en la figura 61C.
5. La segunda muestra de sangre incubada se analiza de forma parecida a la descrita en los pasos 1 a 8 del Ejemplo 6. Cada célula cuyos valores de IAS y ALL caen dentro de la puerta de linfocitos se caracteriza como positiva o negativa para cada uno de los dos anticuerpos dentro de la mezcla de reactivo (CD3 y CD4), en base a una comparación de los niveles detectados de FL1 y FL2 con los niveles de fluorescencia de células de control incubadas con una mezcla de anticuerpos considerada no de unión y marcada con PE y FITC. Los niveles de fluorescencia de las células de control (que representan reacciones negativas) se ilustran en la figura 61D.
6. La fracción de linfocitos que son células T Helper se determina como la fracción de células dentro de la puerta de linfocitos que son positivas para CD3 y positivas para CD4. Un gráfico de los niveles de fluorescencia correspondientes a actividad CD3 y actividad CD4 para células dentro de la puerta de linfocitos, mostrando la fracción que es positiva para ambos, se presenta en la figura 61E.
7. La concentración de células T Helper se puede determinar como la fracción de linfocitos que son positivos para CD3 y positivos para CD4 (determinada en el paso 6) por el recuento de linfocitos determinado en el análisis diferencial WBC descrito en el Ejemplo 4.
Ejemplo 6B
Medición del subconjunto T supresor
Se puede usar un procedimiento similar para cuantificar el subconjunto de linfocitos de células T supresoras, caracterizado por ser positivo para CD3 y CD8.
1. Se incuba una porción de una muestra de sangre entera con una mezcla de reactivo incluyendo anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores CD45 en WBCs y anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores CD13 y CD14 en WBCs, como en el paso 1 del Ejemplo 6A. El análisis de esta muestra incubada se ejecuta como se describe en los pasos 3 y 4 del Ejemplo 6A, produciendo una puerta de linfocitos. Se produce incubación típica durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
2. Se incuba una segunda porción de la misma muestra de sangre entera con una mezcla de reactivo incluyendo anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores CD3 en WBCs y emitirán fluorescencia detectable por uno de los dos detectores de fluorescencia (FL1 o FL2) y anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a CD8 receptores en WBCs y emitirán fluorescencia detectable por el otro de los dos detectores de fluorescencia. En este Ejemplo, los anticuerpos CD3 se unen a FITC y los anticuerpos CD8 se unen a PE.
3. La segunda muestra de sangre incubada se analiza de forma parecida a la descrita en los pasos 1 a 8 del Ejemplo 6. Cada célula cuyos valores de IAS y ALL caen dentro de la puerta de linfocitos se caracteriza como positiva o negativa para cada uno de los dos anticuerpos dentro de la mezcla de reactivo (CD3 y CD8), en base a una comparación de los niveles detectados de FL1 y FL2 para controlar los niveles de fluorescencia.
4. La fracción de linfocitos que son células T supresoras se determina como la fracción de células dentro de la puerta de linfocitos que son positivas para CD3 y positivas para CD8. Un gráfico de los niveles de fluorescencia correspondientes a actividad CD3 y actividad CD8 para células dentro de la puerta de linfocitos, mostrando la fracción que es positiva para ambos, se presenta en la figura 61F.
5. La concentración de células T supresoras se puede determinar como la fracción de linfocitos que son positivas para CD3 y positivas para CD8 (determinado en el paso 5) por el recuento de linfocitos determinado en el análisis WBC diferencial descrito en el Ejemplo 4.
Ejemplo 6C
Medición de Linfocitos T y B
El número de linfocitos T y B se puede medir usando un procedimiento similar al descrito en los Ejemplos 6A y 6B. La primera muestra incubada, utilizada para establecer la puerta de linfocitos, es la misma mezcla de anticuerpos marcados CD45 y CD13/CD14 como en los Ejemplos 6A y 6B. La segunda porción de la muestra de sangre se incuba con una mezcla de anticuerpos CD3 (macados con FITC) y anticuerpos CD19 (marcados con PE). Las fracciones de células T y células B se determinan a partir de la fracción de células que son positivas CD3 y negativas CD19 (células T) y la fracción que son negativas CD3 y positivas CD19 (células B). Un gráfico de los niveles de fluorescencia correspondientes a actividad CD3 y actividad CD19, indicando las fracciones de células T y células B, se presenta en la figura 61G.
La validez de las mediciones de subconjuntos de linfocitos descritas en estos Ejemplos se demuestra comparando los resultados del análisis usando una realización de esta invención con resultados de ensayos de citometría de flujo manual convencional. Los resultados de tal comparación, entre una realización de la presente invención (denominados BB3) y análisis convencionales en un sistema FACScan de Becton Dickinson Immunocytometry Systems, se presentan en las figuras 62A-62D.
Los gráficos de las figuras 62A-62D ilustran la correlación entre fracciones de linfocitos que son positivas para CD3 y CD4 (figura 62A), positivas para CD3 y CD8 (figura 62B), positivas para CD19 (figura 62C), y positivas para CD3 solo (figura 62D).
Ejemplo 7 Análisis de NRBC
Se mezclan veinticinco (25) \mul de una muestra clínica de sangre entera en línea en el sistema instrumental analítico celular descrito anteriormente, con 675 \mul del reactivo multipropósito, precalentados a 42°C en la copa WBC 138. La muestra/reactivo se mezcla e incuba durante 11 segundos. Esta mezcla es transportada después a la celda de flujo 170 que tarda aproximadamente 8 1/2 segundos en un análisis WBC/Dif/NRBC. Las figuras 40A-40C y 41A y 41B muestran el resultado de este análisis en muestra conteniendo 56NRBC/100BC y 140 NRBC/100 WBC, respectivamente.

Claims (34)

1. Un sistema de instrumentos automatizados para distinguir y diferenciar células en una muestra de sangre entera, incluyendo dicho sistema:
a) un manipulador de muestras para recibir copas de muestras (216, 230), aspirar dicha muestra y dispensarla a un recipiente de recepción de muestra (134) y otro recipiente de recepción de muestra (138) para dilución sin y con adición de lisis, respectivamente;
b) un analizador (64) incluyendo una célula de flujo óptico (170) para el paso desde dicho recipiente de recepción de muestra (134) y desde dicho otro recipiente de recepción de muestra (138), y para la detección de señales de fluorescencia y dispersión de luz multiángulo, incluyendo además dicho analizador un transductor de impedancia (174) para el paso de muestra desde dicho recipiente de recepción de muestra (134), y para la detección de señales de impedancia, y
c) un controlador de sistema (68, 92, 98) conectado operativamente a dicho manipulador de muestras y a dicho analizador (64) y capaz de controlar automáticamente la operación de ambos en respuesta a un protocolo seleccionado, y de almacenar datos generados por detección de dichas señales de fluorescencia y dispersión de luz multiángulo, y de dichas señales de impedancia,
siendo capaz dicho controlador de sistema de procesar automáticamente al menos una muestra y de
referir sus resultados de prueba, incluyendo dichos resultados de la prueba información cuantitativa acerca de glóbulos rojos, glóbulos blancos y células o cuerpos de células fluorescentes.
2. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 1, caracterizado porque dicho controlador de sistema (68, 92, 98) incluye memoria y software capaz de manipular los datos medidos, calcular parámetros y visualizar resultados de la prueba en varios formatos.
3. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 2, caracterizado porque dichos formatos refieren resultados de la prueba incluyendo información acerca de las células o cuerpos de células fluorescentes que incluyen antígenos de superficie de células marcados por fluorescencia.
4. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 1 ó 2, donde el protocolo se selecciona por medio de una interface de operador (90).
5. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 2, caracterizado porque dichos formatos refieren resultados de la prueba que incluyen más información cuantitativa acerca de plaquetas.
6. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 2, caracterizado porque dichos formatos refieren resultados de la prueba incluyendo información acerca de células o cuerpos de células fluorescentes que incluyen además glóbulos rojos nucleados.
7. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 2, caracterizado porque dichos formatos refieren resultados de la prueba incluyendo información acerca de células o cuerpos de células fluorescentes donde las células o cuerpos de células fluorescentes incluyen además reticulocitos.
8. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 3, caracterizado porque dichos formatos refieren información cuantitativa de glóbulos blancos incluyendo datos generados por señales dispersión de luz y fluorescentes.
9. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 2 ó 8, caracterizado porque dichos formatos refieren resultados de la prueba incluyendo información de glóbulos blancos que incluye un diferencial de cinco partes.
10. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 2, donde el protocolo incluye instrucciones de analizador basadas al menos en parte en datos previamente generados por el analizador (64).
11. El sistema de instrumentos automatizados de las reivindicaciones 2 ó 9, caracterizado porque dichos formatos refieren resultados de la prueba que incluyen información de glóbulos blancos incluyendo un diferencial de cinco partes que incluye una análisis de subconjuntos de linfocitos.
12. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 2 ó 11, caracterizado porque dichos formatos refieren resultados de la prueba que incluyen información de glóbulos blancos incluyendo un diferencial de cinco partes que incluye una análisis de subconjuntos de linfocitos que usa anticuerpos monoclonales marcados por fluorescencia.
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13. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 1, 2 ó 3, donde el analizador (64) incluye además al menos un lugar de incubación controlado por temperatura (118).
14. El sistema de instrumentos automatizados para distinguir y diferenciar células en una muestra de sangre entera de la reivindicación 2, incluyendo además dicho sistema:
a) una estación de procesado de operación/instrucción; y
b) una estación de recogida de datos y de procesado de datos (500);
estando interconectado operativamente dicho controlador (68, 92, 98) a dicha estación de procesado de operación/instrucción, dicho manipulador de muestras, dicho analizador (64), y dicha estación de recogida y procesado de datos (500), refiriendo dichos formatos resultados de la prueba incluyendo información cuantitativa acerca de antígenos de superficie de célula.
15. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 14, donde el analizador de muestras (64) es capaz de responder al controlador (64, 92, 98) en base al menos en parte a datos previamente generados por el analizador (64) para células en la muestra.
16. El sistema de instrumentos automatizados de la reivindicación 15, donde el analizador de muestras (64) es capaz además de realizar una análisis automatizado de subconjuntos de linfocitos.
17. Un método automatizado para distinguir y diferenciar células en una muestra de sangre entera con un sistema de instrumentos automatizados, incluyendo el método automatizado realizado por el sistema de instrumentos automatizados los pasos de:
a) aspirar una muestra de sangre entera;
b) dispensar la muestra en un recipiente de recepción de muestra (134) y a otro recipiente de recepción de muestra (138) para dilución sin y con adición de lisis, respectivamente;
c) pasar la muestra dispensada de dicho recipiente de recepción de muestra (134) y de dicho otro recipiente de recepción de muestra (138) a una célula de flujo óptico (170) y detectar señales de fluorescencia y dispersión de luz multiángulo;
d) recoger primeros datos generados por detección de las señales de fluorescencia y dispersión de luz multiángulo;
e) pasar la muestra dispensada de dicho recipiente de recepción de muestra (134) a un transductor de impedancia (174) y detectar señales de impedancia;
f) recoger segundos datos generados por detección de las señales de impedancia;
g) correlacionar y procesar dichos datos primeros y segundos para producir información acerca de glóbulos rojos, glóbulos blancos y células o cuerpos de células fluorescentes en la muestra de sangre entera; y
h) referir resultados de la prueba incluyendo información acerca de glóbulos rojos, glóbulos blancos y células o cuerpos de células fluorescentes en la muestra de sangre entera.
18. El método automatizado de la reivindicación 17, incluyendo además dispensar la muestra a dicho recipiente de recepción de muestra (134) y análisis óptico de la muestra dispensada con dicha célula de flujo óptico (170) para determinar plaquetas en la muestra de sangre entera.
19. El método automatizado de la reivindicación 17, donde se analiza la presencia de glóbulos blancos y células o cuerpos de células fluorescentes en la muestra dispensada.
20. El método automatizado de la reivindicación 19, donde las células o cuerpos de células fluorescentes son glóbulos rojos nucleados.
21. El método automatizado de la reivindicación 17, incluyendo dispensar la muestra al recipiente de recepción de muestra (134, 136) y análisis de la muestra dispensada al recipiente de recepción de muestra (134, 136) para fluorescencia de dispersión de luz multiángulo con la célula de flujo óptico (170).
22. El método automatizado de la reivindicación 21, incluyendo analizar la muestra dispensada para recoger datos usados para referir un resultado incluyendo información acerca de células o cuerpos de células fluorescentes en la muestra de sangre entera, y las células o cuerpos de células son reticulocitos.
23. El método automatizado de la reivindicación 17, donde la información referida acerca de glóbulos blancos es cuantitativa y se obtiene de procesar datos generados por dispersión de luz y señales fluorescentes.
24. El método automatizado de la reivindicación 23, donde la información cuantitativa de glóbulos blancos incluye un diferencial de cinco partes.
25. El método automatizado de la reivindicación 24, donde el diferencial de cinco partes incluye además un porcentaje de glóbulos rojos nucleados.
26. El método automatizado de la reivindicación 17, donde la muestra dispensada se analiza para proporcionar información acerca de la viabilidad de la célula en la muestra de sangre entera.
27. El método automatizado para distinguir y diferenciar células en una muestra de sangre entera según la reivindicación 19, con un sistema de instrumentos automatizados capaz de realizar análisis de hematología y análisis de citometría fluorescente al que se suministra una muestra de sangre entera, incluyendo además el método automatizado los pasos de:
i) seleccionar una serie de una o varias pruebas a realizar en la muestra de sangre entera por el sistema de instrumentos automatizados;
j) correlacionar dicha una o varias pruebas a realizar en la muestra de sangre entera por el sistema de instrumentos automatizados;
k) diluir la muestra dispensada en el recipiente de recepción de muestra (134) con un reactivo diluyente produciendo por ello una muestra diluida;
i) lisar la muestra dispensada en el otro recipiente de recepción de muestra (138) con un reactivo de lisis, produciendo por ello una muestra lisada;
m) transportar la muestra diluida mediante un primer transductor de flujo (174) del sistema de instrumentos automatizados;
n) detectar y contar glóbulos rojos en dicha muestra diluida con dicho primer transductor de flujo (174);
o) transportar la muestra diluida mediante un segundo transductor de flujo (170);
p) contar y diferenciar al menos uno de plaquetas y reticulocitos en la muestra diluida con el segundo transductor de flujo (170);
q) transportar dicha muestra lisada mediante el segundo transductor de flujo (170);
r) detectar y diferenciar glóbulos blancos con el segundo transductor de flujo (170);
s) detectar dispersión de luz multiángulo y fluorescencia de la muestra lisada o la muestra diluida y contar y diferenciar glóbulos rojos nucleados o reticulocitos o ambos con el segundo transductor de flujo (1 70);
t) almacenar, correlacionar y procesar primeros y segundos datos de detección y diferenciación del transductor de flujo para las pruebas realizadas en la muestra de sangre entera; y
u) referir resultados de cada prueba realizada en la muestra de sangre entera en base a los primeros y segundos datos de detección y diferenciación del transductor de flujo, donde el sistema de instrumentos automatizados realiza automáticamente los pasos de método (j) a (u) con la muestra de sangre entera o una muestra dispensada, utilizándose los resultados del análisis de hematología al referir al menos los resultados del análisis de citometría fluorescente.
28. El método de la reivindicación 27, incluyendo además los pasos de:
v) teñir dicha muestra diluida produciendo por ello una muestra teñida en otro recipiente de recepción de muestra (136);
w) transportar dicha muestra teñida mediante el segundo transductor de flujo (170), donde los reticulocitos en dicha muestra teñida son contados y diferenciados.
29. El método de la reivindicación 27, donde dicho primer transductor de flujo incluye una célula de flujo de impedancia (170).
30. El método de la reivindicación 27, donde la muestra diluida es transportada por el sistema de instrumentos automatizados mediante el segundo transductor de flujo (170) y se detecta dispersión de luz multiángulo para contar y diferenciar plaquetas en la muestra diluida.
31. El método de la reivindicación 27, donde los glóbulos rojos nucleados y glóbulos blancos son contados y diferenciados de dicha muestra lisada.
32. El método automatizado de la reivindicación 27, donde una información cuantitativa de glóbulos blancos referida se obtiene de dispersión de luz multiángulo y datos detectados por fluorescencia.
33. El método automatizado de la reivindicación 32, donde el resultado de glóbulos blancos incluye un diferencial de cinco partes.
34. El método automatizado de la reivindicación 33, donde el diferencial de cinco partes incluye además un porcentaje de glóbulos rojos nucleados.
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