ES2255050T3 - Vectores de expresion que codifican proteinas de fusion biespecificas biologicamente activas en celulas de mamiferos. - Google Patents

Vectores de expresion que codifican proteinas de fusion biespecificas biologicamente activas en celulas de mamiferos.

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ES2255050T3
ES2255050T3 ES94300692T ES94300692T ES2255050T3 ES 2255050 T3 ES2255050 T3 ES 2255050T3 ES 94300692 T ES94300692 T ES 94300692T ES 94300692 T ES94300692 T ES 94300692T ES 2255050 T3 ES2255050 T3 ES 2255050T3
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Lisa K. Gilliland
Martha S. Hayden
Peter S. Linsley
Jurgen Bajorath
Perry H. Fell
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Bristol Myers Squibb Co
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Abstract

Un vector de expresión que codifica una proteína de fusión biespecífica biológicamente activa que comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende (1) una secuencia de ADN que codifica una primera región de enlace capaz de enlazar una diana, (2) una secuencia de ADN que codifica una segunda región de enlace capaz de enlazar una diana, cada región capaz de enlazar una diana diferente, y (3) un conector que codifica un péptido helicoidal hidrófilo que liga la secuencia de ADN que codifica la primera región de enlace y la secuencia de ADN de la segunda región de enlace.

Description

Vectores de expresión que codifican proteínas de fusión biespecíficas biológicamente activas en células de mamíferos.
La presente invención se refiere a vectores de expresión que codifican proteínas de fusión biespecíficas y a los
procedimientos para producir una proteína de fusión biespecífica biológicamente activa en una célula de
mamífero.
Antecedentes de la invención
Debido a los problemas asociados con la tecnología de anticuerpos tradicional tales como la obtención de anticuerpos a partir de suero o la tecnología de hibridomas, se ha usado la ingeniería genética con una frecuencia cada vez mayor para diseñar, manipular y producir anticuerpos o moléculas derivadas de anticuerpos (tales como proteínas de fusión biespecíficas) con un conjunto deseado de propiedades de enlace y funciones efectoras.
Las dificultades encontradas con la producción de hibridomas estables para que producen anticuerpos humanos han llevado al desarrollo de tecnologías alternativas diseñadas para burlar la producción de anticuerpos in vivo y las técnicas in vitro convencionales (Mayforth R. D., Quintans, J. (1990) Current Concepts: Designer and catalytic antibodies. New Eng. J. Med. 323:173-178; Waldmann, T. A. (1991) Monoclonal antibodies in diagnosis and theraphy. Science 252:1657-1662; Winter, G., Milstein, C. (1991) Man-made Antibodies. Nature 349:293-299; Morrison, S. L. (1992) In Vitro antibodies: strategies for production and application. Ann. Rev. Immunol. 10:239-266).
Los intentos iniciales para emparejar las especificidades de enlace de dos anticuerpos completos frente a diferentes antígenos diana con objetivos terapéuticos utilizaron moléculas "heteroconjugadas" químicamente conjugadas (Staerz, U. D., Kanagawa, O., Bevan, M. J. (1985) Hybrid antibodies can target sites for attack by T cells. Nature 314:628-631; Perez, P., Hoffman, R. W., Shaw, S., Bluestone, J. A., Segal, D. M. (1985) Specific targeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target antibody. Nature 316:354-356; Liu, M. A., Kranz, D. M., Kurnick, J. T., Boyle, L. A., Levy, R., Eisen, H. N. (1985) Heteroantibody duplexes target cells for lysis by cytotoxic T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648-8652; Jung, G., Ledbetter, J. A., Muller-Eberhard, H. J. (1987) Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4611-4615; Emmrich, F., Rieber, P., Kurrie, R., Eichmann, K. (1988) Selective stimulation of human T lymphocyte subsets by heteroconjugates of antibodies to the T cell receptor and to subset-specific differentation antigens. Eur. J. Immunol. 18:645-648; Ledbetter, J. A., June, C. H., Rabinovitch, P. S., Grossmann, A., Tsu, T. T., Imboden, J. B. (1988) Signal transduction through CD4 proximity to the CD3/T cell receptor. Eur. J. Immunol. 18:525-532).
Estos intentos demostraron que los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor superficial de la célula T CD3 humana o de la murina enlazado químicamente con los anticuerpos de las células anti-diana desencadenan la lisis de las células diana mediante los linfocitos T citotóxicos, superando la principal restricción de histocompatibilidad del complejo de CTL.
Se han producido anticuerpos biespecíficos a partir de hibridomas híbridos mediante técnicas de heterohibridoma y se han demostrado propiedades in vitro similares a aquellas observadas en los heteroconjugados (Milstein, C., Cuello, A. C. (1983) Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry. Nature 305:537-540; Staerz, U. D., Bevan, M. J. (1986) Hybrid hybridoma producing a bispecific monoclonal antibody that can focus effector cell activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1453-1457; Clark, M. R., Waldmann, H. (1987) T-cell killing of target cells induced by hybrid antibodies: comparison of two bispecific monoclonal antibodies. J. Natl. Cancer Inst. 79:1393-1401; Lanzavecchia, A., Scheidegger, D. (1987) The use of hybrid hybridomas to target cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 17:105-111; Gilliland, L. K., Clark, M. R., Waldmann, H. (1988) Universal bispecific antibody for targeting tumour cells for destruction by cytotoxic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7719-7723). Sin embargo, dichos anticuerpos se produjeron a partir de fusiones celulares.
A pesar de los prometedores resultados obtenidos usando anticuerpos heteroconjugados o biespecíficos procedentes de fusiones celulares, diversos factores los hacen impracticables para aplicaciones terapéuticas a gran escala. Entre dichos factores se incluyen (1) rotura rápida de grandes heteroconjugados in vivo, (2) las técnicas de trabajo intensivo necesarias para generar cualquier tipo de molécula, (3) la necesidad de una purificación extensa para separar los anticuerpos homoconjugados o monoespecíficos, y (4) rendimientos bajos.
De manera general, los procedimientos asociados con el uso de anticuerpos heteroconjugados o biespecíficos implican hipótesis de coexpresión con dos especificidades diferentes, en las que las secuencias que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada (H) y/o ligera (L) no se enlazan, y sufren de esta manera del problema de la asociación aleatoria de H-L, y/o la asociación aleatoria (HL) - (HL), que produce únicamente un pequeño porcentaje del producto correcto y a difíciles esquemas de purificación. La purificación puede llegar a ser molesta y la caracterización difícil, si existe un número excesivo de moléculas de proteína monoespecífica o no específica.
En un esfuerzo por eliminar estos problemas, se ha usado la ingeniería genética para generar anticuerpos de cadena única bifuncionales o biespecíficos in vitro (Haber y col., 1990; Wels, W., Harwerth, I. M. Zwickl, M., Hardman, N., Groner B., Hynes, N. E. (1992) Construction, bacterial expresión and characterization of a bifunctional single-chain antibody phosphatase fusion protein targeted to the human ERBB-2 receptor. Biotechnology 10:1128-1132; A. Traunecker y col. (1991) EMBO Journal 10(12):3655-3659). Sin embargo, dichos esfuerzos no han sido prometedores.
Se han producido anticuerpos de cadena única bifuncionales o biespecíficos en un sistema bacteriano. Sin embargo, se han producido dichas proteínas de fusión en forma inactiva (Haber y col., 1990). De manera adicional, las proteínas de fusión producidas de esta manera presentan reducciones en las afinidades y/o apetencias de enlace, o requieren procedimientos complicados de aislamiento y purificación para recuperar los productos deseados (Haber y col., 1990; Wels y col., 1992a).
Se han construido vectores de expresión que codifican un anticuerpo de cadena única enlazados mediante a) un conector Asp-Pro con el fragmento FB de la proteína A del Staphylococcus (WO 88/09344), o b) mediante una bisagra de anticuerpo natural con otras regiones de enlace (Huston y col, 1991, Methods in Enzymol., 203: 46-98). Sin embargo, la proteína biespecífica codificada por estos vectores no se produce en una forma biológicamente activa.
Se han expresado anticuerpos monovalentes de cadena única y anticuerpos bifuncionales de cadena única (Wels, 1992b). Las moléculas de anticuerpo fueron diseñadas mediante ingeniería genética para minimizar su tamaño y permitir su modificación funcional. Por otra parte, el anticuerpo bifuncional es únicamente bifuncional en que se ensambló el gen de la fosfatada alcalina en 3' con el gen scFv. Estos anticuerpos bifuncionales incluyen una región de enlace única (por ejemplo, V_{L} + V_{H}) y el gen de la fosfatasa alcalina se usó meramente como un marcador para detectar de esta manera el enlace de los anticuerpos con su diana. Se han construido otras proteínas de fusión que enlazan con una diana única. Por ejemplo, el Documento EP0439095 describe la construcción de un vector de expresión que codifica la región V_{H} de un anticuerpo enlazado mediante una región bisagra de anticuerpo con un ligando biológicamente activo tal como una linfoquina. El Documento WO 92/00092 describe un vector de expresión que codifica una región extracelular CD28 o B7 enlazada a las regiones bisagra CH2 y CH3 de la IgG humana.
Se han expresado moléculas janusin que contienen secuencias FvCD3 y CD4 (A. Traunecker y col. ``Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells, EMBO Journal 10(12): 3655-3659). El constructo janusin comprende un fragmento de la molécula CD4 en el término amino del constructo y en la región de enlace (es decir, V_{L} + V_{H}) de CD3 en el término carboxi del constructo. Las moléculas janusin no comprenden conectores del péptido helicoidal que separan las regiones variables CD3 de las porciones de la molécula CD4. Más aún, las moléculas janusin se encuentran algunas veces en formas multiméricas o agregadas. Se requiere algunas veces purificación adicional para evitar la formación del agregado.
Existe necesidad de la presente invención en vista de los problemas descritos anteriormente en el presente documento que conciernen a la producción del anticuerpo. En la actualidad existe un problema persistente asociado con la tecnología de anticuerpos, nominalmente, la dificultad de obtención de grandes cantidades de anticuerpos específicos. Históricamente, los anticuerpos se han obtenido a partir de suero o hibridomas de origen ratón. Sin embargo, el suero está a menudo en cantidades limitadas y calidad variable. Más aún, los anticuerpos de origen ratón tienen utilidad limitada para el tratamiento humano debido a su propensión a iniciar una respuesta inmune a veces perjudicial para sujetos no ratón.
Con el fin de superar los problemas que apuran de manera específica la tecnología de anticuerpos y de manera más general los problemas asociados con la producción de cantidades sustanciales de moléculas de proteínas funcionales, se describe en el presente documento un nuevo vector de expresión que facilita la expresión de las proteínas de fusión biológicamente activas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un vector de expresión que codifica proteínas de fusión monoespecíficas o biespecíficas.
El vector comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una primera región de enlace capaz de enlazar una diana y una secuencia de ADN que codifica una segunda región de enlace capaz de enlazar una diana, cada dominio es capaz de enlazar una diana diferente. Un conector que codifica un péptido helicoidal hidrófilo enlaza la secuencia de ADN que codifica la primera región de enlace y la secuencia de ADN de la segunda región de enlace.
La primera región de enlace se enlaza con moléculas seleccionadas entre el grupo constituido por CD1, CD2, CD3, TcR, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66. CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, B7, B7(2),
CTLA4, BR96, GP39, LFA-3, L6, ICAM-2, e interleucina (IL) 1-8. La segunda región de enlace enlaza con moléculas seleccionadas entre el grupo constituido por CD1, CD2, CD3, TcR, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66. CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, B7, B7(2), CTLA4, BR96, GP39, LFA-3, L6, ICAM-2, e interleucina (IL) 1-8. El conector comprende una secuencia de ADN que codifica aminoácidos hidrófilos y al menos un pentámero EEAKK.
El péptido conector helicoidal comprende de manera preferible la SEC ID Nº: 12.
El vector de expresión comprende preferiblemente de manera adicional una secuencia de ADN que codifica una etiqueta molecular.
La primera región de enlace se enlaza de manera preferible con uno cualquiera de CD3, TcR, CD3/TcR, L6, CD28, CD40, B7, B7(2), CTLA4, o GP39 y el segundo región de enlace se enlaza de manera preferible con uno cualquiera de CD3, tcR, CD3/TcR, L6, CD28, CD40, B7, BT(2), CTLA4, GP39. De manera preferible, la primera región de enlace es reactiva con CD3, TcR, CD3/TcR, CD28 o CTLA4 y la segunda región de enlace es reactiva con L6.
La primera región de enlace y/o la segunda región de enlace pueden ser al menos un fragmento de un antígeno superficial celular. De manera preferible, el antígeno superficial celular es CD3, L6, CD28 o B7. De manera preferible, la primera región de enlace es al menos un fragmento de la molécula B7 y la segunda región de enlace es reactiva con L6.
La primera región de enlace y/o la segunda región de enlace pueden ser una región o regiones variables de un anticuerpo.
Un vector de expresión preferido de la invención es el vector de expresión denominado CC9-2 (ATCC Nº 69235).
La invención proporciona también una célula eucariota transfectada in vitro mediante un vector de expresión de la invención. La invención proporciona de manera adicional una célula eucariota transfectada in vivo mediante un vector de expresión de la invención en el que la célula eucariota se selecciona entre el siguiente grupo constituido por: ovino, porcino, murina o bovino. Esto proporciona también un procedimiento para producir una proteína de fusión biespecífica activa que comprende cultivar estas células eucariotas con el fin de producir la proteína y recuperar la proteína producida de esta manera.
La presente invención proporciona también un procedimiento para producir una proteína de fusión biespecífica biológicamente activa en una célula de mamífero. Este procedimiento comprende: (a) transfectar la célula de mamífero con el vector de expresión recombinante de la invención; (b) cultivar la célula de mamífero así transfectada en la etapa (a); y (c) recuperar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa producida de esta manera mediante la célula de mamífero cultivada. De manera preferible, la recuperación de la proteína biespecífica biológicamente activa comprende: (a) identificar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa mediante la presencia de la etiqueta molecular; y (b) separar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa que tiene la etiqueta molecular así identificada de las moléculas sin etiqueta molecular, con el fin de recuperar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa producida de esta manera mediante la célula de mamífero
cultivada.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un diagrama del vector de expresión pCDM8 que incluye el cassette de cadena única monoespecífico recombinante que incluye etiquetas moleculares diferentes, o un codón de terminación simple.
La Figura 2A es un diagrama del vector de expresión pCDM8 que incluye el cassette de cadena única biespecífico recombinante.
La Figura 2B es una fotografía del western blot de moléculas de proteínas de fusión de cadena única anti-L6, anti-CD3, y anti-CD3-L6. Se recogió medio de cultivo libre de suero agotado a partir de transfecciones de células COS y se purificó mediante cromatografía de afinidad de la proteína A. Se resuspendió la proteína en un tampón de carga y se sometió a electroforesis en gradiente de gel (5-16%) SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras (A) o reductoras (B), se emborronó con nitrocelulosa, y se detectó con IgG anti-humana conjugada con fosfatasa alcalina. Panel A: banda 1 = L6 mAb quimérico (0,5 mu g); banda 2 = anti-L6 WTD (0,5 mu g); banda 3 = CD3-L6FvIg biespecífico (0,5 mu g); banda 4 = L6FvIg (0,6 mu g); y banda 5 = CD3Fv-Ig (0,4 mu g). Panel B: banda 1 = CD3FV-Ig (0,4 mu g); banda 2 = L6FvIg (0,6 \mug); banda 3 = CD3-L6FvIg biespecífico (0,5 \mug); banda 4 = anti-L6 WTD (0,5 \mug); y banda 5 = L6 mAb quimérico (0,5 \mug).
La Figura 3 son representaciones gráficas FACS que muestran los L6FvIg, CD3FvIg, CD3-L6FvIg y BR96 enlazando con células que expresan el antígeno diana.
La Figura 4A muestra que se fusionó L6Fv con diversos derivados mutantes diferentes del dominio IgG1 Fc humano. Se indican cada mutante y los cambios de secuencia introducidos en la bisagra y/o dominio CH2. De manera adicional, se muestra la capacidad de cada constructo para mediar CDC y ADCC.
La Figura 4B es un gráfico de líneas del análisis de saturación de los derivados L6 o L6 quiméricos que se incubaron con células de tumor H2981 a concentraciones progresivamente más bajas (dilución tres veces en serie), y se detectó el enlace con un antiidiotipo conjugado con FITC frente a L6 como segunda etapa de reactivo. Se generaron a partir de estos datos las curvas de saturación del enlace, y se representó gráficamente la intensidad de fluorescencia en función de la concentración del anticuerpo. Leyenda: L6 quimérica (diamante abierto), WTD (cuadrado abierto), DM1 (triángulo abierto), HS1 (signo más), HS2 (signo "X", y HS3 (círculo abierto).
La Figura 4C es un gráfico de líneas del análisis de la inhibición de células de tumor H2981 que se incubaron con diluciones en serie de cada derivado de anticuerpo durante 30 min y L6 conjugado con FITC a 1 \mug/ml durante 30 min antes del análisis FACS. Se representó la intensidad de la fluorescencia en función de la concentración de anticuerpos para cada molécula. Leyenda L6 quimérica (diamante abierto), WTD (cuadrado abierto), DM1 (triángulo abierto), HS1 (signo más), HS2 (signo "X"), y HS3 (círculo abierto).
La Figura 4D es un gráfico de líneas que muestra los resultados cuando se marcaron células de tumor H2981 durante 2 horas con ^{51}Cr, se lavaron, y se añadieron a IMDM / FBS al 10% que contenía diluciones 10 veces en serie de derivados de anticuerpo, y PBL humanas como células efectoras en una relación efector a diana de 100:1. Los ensayos se incubaron durante 4,5 horas, se hicieron girar, y se midieron los recuentos liberados en 100 \mul con un contador gamma. Se calculó el porcentaje de muertes usando la siguiente fórmula: % de muertes = [(cpm promedio-liberación espontánea promedio) / (liberación máxima promedio-liberación espontánea promedio)] x 100. Los valores representan los promedios de los cultivos triplicados (SEM < 10%).
Las Figuras 5A-D son gráficos de líneas que muestran que CD3FvIg moviliza el calcio intracelular en las células T de la sangre periférica y que el pretratamiento con CD3FvIg desensibiliza la respuesta de las células T de la sangre periférica a la posterior simulación de CD2 entrecruzados.
La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra que la molécula biespecífica CD3-L6Ig media la adhesión entre H2981 y las células de Jurkat, y es capaz de esta manera de enlazar con células que expresan CD3- y L6- de manera simultánea.
La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra la citotoxicidad de las células T diana con proteínas de fusión biespecíficas CD3-L6FvIg con células de tumor H2981.
La Figura 8 es un gráfico de barras que muestra que las proteínas biespecíficas CD3-L6FvIg estimulan niveles altos de proliferación de células T cuando se enlazan con células de tumor H2981.
La Figura 9 es un diagrama esquemático que muestra la modificación del vector de expresión pCDM para la expresión de las regiones variables del anticuerpo monoespecífico como proteínas de fusión con el dominio Fc procedente de la IgG1 humana.
La Figura 10A es un diagrama de la estructura de los derivados L6Fv-Ig, con las secuencias conectoras indicadas por las líneas negras y cada dominio funcional indicado por una caja sombreada.
La Figura 10B es una comparación del constructo Fc de los L6, WTD, DM1, HS1, HS2 y HS3 quiméricos incluyendo sus secuencias, y si presentan actividad ADCC o CDC. Se fusionó el L6 Fv con diferentes derivados de mutantes del dominio Fc de la IgG1 humana. Se indicaron los cambios de secuencia introducidos en el dominio bisagra y/o el CH2 mediante aminoácidos subrayados, con la identificación del constructo relacionada a la izquierda.
La Figura 10C es un gráfico de líneas de las características ADCC de las células de tumor H2981 que se marcaron durante 2 h con ^{51}Cr, se lavaron, y se añadieron a IMDM + FBS al 10% que contenían diluciones diez veces en serie en una relación efector a diana de 100:1. Los ensayos se incubaron durante 4,5 horas, se hicieron girar, y se midieron los recuentos realizados en 100 \mul de sobrenadante. Se calculó el porcentaje de muertes como [cpm promedio-liberación espontánea promedio) / liberación máxima promedio-liberación espontánea promedio)] x 100. los valores representan los promedios de los cultivos triplicados (SEM < 10%). Leyenda: L6 quimérica (diamante abierto), WTD (cuadrado abierto), DM1 (triángulo abierto), HS1 (signo más), HS2 (signo "X"), y HS3 (círculo abierto).
La Figura 10D es un gráfico de líneas de un ensayo similar al de la Figura 10(C) que se llevó a cabo para medir la muerte del complemento pero usando complemento en lugar de PBL. Leyenda L6 quimérica (diamante abierto), WTD (cuadrado abierto), DM1 (triángulo abierto), HS1 (signo más), HS2 (signo "X"), y HS3 (círculo abierto).
La Figura 11 es el aminoácido y las secuencias de ácido nucleico del líder L6V_{L}, CD3 F_{V} (V_{L} - V_{H}) y el conector helicoidal del enlace Fv.
Las Figuras 12 (A/B) son geles PAGE que muestran que el CD3FvIg estimula la fosforilación fuerte de tirosina y la activación de PLC\gamma1 en las células T, e induce la asociación de PLC\gamma1 con pp35/36.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Tal como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.
Tal como se usa en el presente documento, "una proteína de fusión biespecífica" significa cualquier molécula inmunológicamente reactiva que reconoce y se enlaza de manera especifica al menos con dos dianas diferentes en momentos alternados o en el mismo tiempo y se expresa en forma de una cadena única.
Tal como se usa en el presente documento, "una proteína de fusión monoespecífica" significa cualquier molécula inmunológicamente reactiva que reconoce y se enlaza de manera especifica una diana, y es un complejo que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina, dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, o una cadena de inmunoglobulina ligera o pesada y/o cualquier fragmento de la misma, y se expresa en forma de una cadena única.
Tal como se usa en el presente documento, un "vector de expresión" significa una molécula de ácidos nucleico que comprende (1) un promotor y otras secuencias (por ejemplo secuencias líderes) necesarios para dirigir la expresión de un gen deseado o una secuencia de ADN y (2) el gen o secuencia de ADN deseado. De manera opcional, la molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia señal poli A para mejorar la estabilidad del gen transcripto y/o una secuencia mejoradora para aumentar la transcripción del gen afectando de esta forma la expresión del gen.
Tal como se usa en el presente documento, una "región de enlace" significa un emplazamiento de enlace que reconoce y enlaza el área completa de enlace de una diana o cualquier porción de la misma. Entre los ejemplos se incluye, pero no se limitan a, (1) una región variable única de un anticuerpo (V_{L} o V_{H}); (2) dos o más regiones variables (por ejemplo V_{L} + V_{H}; V_{L} + V_{L}; o V_{H} + V_{H}) o la región determinante del complementario (CDR) del mismo, o (3) un antígeno (tal como un antígeno de leucocito) o un fragmento del mismo.
Tal como se usa en el presente documento, una "etiqueta molecular" incluye cualquier secuencia de ADN que codifica una molécula que puede facilitar la detección y purificación de las proteínas de fusión descritas en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, un "cassette de cadena única biespecífico" incluye una secuencia de ADN que codifica un primer región de enlace capaz de enlazar una diana y una secuencia de ADN que codifica un segundo región de enlace capaz de enlazar una diana, cada dominio es capaz de enlazar una diana diferente en momentos alternos o al mismo tiempo, siendo codificados ambos dominios mediante secuencias de ADN que se encuentran en el mismo cassette. La primera y/o segunda regiones de enlace pueden ser dos regiones variables (V_{L} + V_{H}, V_{H} + V_{L}, V_{L} + V_{L}, o V_{H} + V_{H}) o una región variable única (V_{L} o V_{H}). De manera alternativa, la primera y/o segunda región de enlace puede ser un antígeno o un fragmento del mismo. Entre los ejemplos adecuados de antígenos se incluyen, pero no se limitan a, antígenos de leucocito. La primera región de enlace se localiza en o hacia el término amino de la proteína expresada mientras que la segunda región de enlace se localiza en o hacia el término carboxi de la proteína expresada (correspondiendo al extremo 5' o 3', de manera respectiva, de las secuencias de ADN del cassette de ADN de cadena única biespecífico).
Tal como se usa en el presente documento, un "cassette de cadena única" significa una secuencia que codifica proteínas que son capaces de reconocer y enlazar al menos un fragmento de su diana. Dichas proteínas pueden tener emplazamientos múltiples para reconocer y enlazar dianas múltiples.
Con el fin que la invención descrita en el presente documento pueda ser más completamente comprensible, se desarrolla la siguiente descripción.
A. Vectores
El vector de expresión descrito en el presente documento se puede modificar reemplazando completa o parcialmente las secuencias de ADN concretas que codifican las regiones de enlace (es decir, las secuencias de codificación de las mismas) o las secuencias reguladoras, es decir, un promotor u otras secuencias necesarias para dirigir la expresión del gen deseado (por ejemplo, las secuencias líder), dentro del plásmido de expresión.
La secuencia de ADN sustituida de esta manera en el vector de expresión modificado puede codificar cualquier región variable de cualquier anticuerpo u otro receptor. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede codificar la región o regiones variables de un anticuerpo que reconoce y enlaza los antígenos BR96, CD3, L6, CD28, CTLA4, o B7. De manera adicional, la secuencia de ADN puede codificar regiones variables capaces de enlazar con otros antígenos superficiales de células. De manera alternativa, las regiones de enlace pueden codificar todo o parte de un antígeno tal como el antígeno del leucocito. La consideración primaria sobre si insertar una secuencia de sustitución particular es si la secuencia sustituida de esta manera se coloca "en marco" de tal manera que se puede expresar la región de enlace deseado.
Se pueden clonar las secuencias sustituidas de esta manera mediante el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se puede usar la PCR para producir una multiplicidad de secuencias de ADN que se pueden insertar en el vector de expresión que puede transformar a su vez una célula eucariota, y expresar de esta manera la secuencia de ADN. Se pueden usar también otros procedimientos de clonación, por ejemplo, la reacción en cadena de la ligasa (LCR), que consigan la multiplicación de las secuencias específicas.
El promotor del vector de expresión se puede sustituir fácilmente con otros promotores que dependen del tipo de células usadas para la expresión de la secuencia de ADN que está siendo insertada. Entre los ejemplos adecuados de promotores se incluyen citomegalovirus (CMV), virus de la mieloblastosis aviar (AMV) y virus de la leucemia de murina de Moloney (MMLV).
Los anticuerpos en su forma monomérica nativa son macromoléculas de cuatro cadenas que contienen dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas por molécula. Cada cadena está compuesta por una región variable (V) y una región constante (C). La región variable de la cadena ligera (V_{L}) se codifica por los genes de la región variable (V) más la de unión (J); la región variable de la cadena pesada (V_{H}) se codifica por los genes de la región variable (V) más la de unión (J) con una región de (D) de intervención variable. Cada fragmento de región variable (V_{L} o V_{H}) codificado por secuencias V_{L} + J_{L} o por V_{H} + D_{H} + J_{H} se compone de aproximadamente 100 aminoácidos. Contenidas dentro de estas secuencias están tres regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que parecen contener los aminoácidos que alinean el emplazamiento de combinación de los anticuerpos. Los CDR se distribuyen en cuatro regiones de mucha menor variabilidad denominadas regiones marco (FR).
El hueco de enlace del antígeno del anticuerpo está formado típicamente por la asociación de los polipéptidos de la región V_{L} y V_{H} en su conformación de hoja plegada en \beta, con las regiones CDR contenidas en, o cerca de, los bucles entre cadenas. De manera ocasional, los pares V_{L} + V_{L} o los pares V_{L} + V_{H} (por ejemplo, los monómeros de cadena ligera G17-2) o bien el V_{L} o V_{H} en solitario, pueden enlazar con el antígeno.
Por tanto, la "región de enlace" comprende una o una combinación de las siguientes (a) una región V_{L} más una V_{H} de una inmunoglobulina (IgG, IgM u otra inmunoglobulina), (b) una región V_{L} de una inmunoglobulina (IgG, IgM u otra inmunoglobulina), (c) una región V_{H} más V_{H} de una inmunoglobulina (IgG, IgM u otra inmunoglobulina), (d) una región V_{L} única de una inmunoglobulina (IgG, IgM u otra inmunoglobulina), o (e) una región V_{H} única de una inmunoglobulina (IgG, IgM u otra inmunoglobulina).
Los vectores de expresión de acuerdo con la presente invención no se limitan a los vectores que incorporan secuencias de anticuerpos. Se pueden usar también las secuencias que codifican las regiones de enlace de otros tipos de proteínas tales como antígenos y receptores. De esta manera, los vectores codifican proteínas de fusión biespecíficas que pueden enlazar diferentes dianas múltiples, en momentos alternos o en esencialmente al mismo tiempo.
En una forma de realización de la presente invención, el cassette de cadena única recombinante comprende secuencias múltiples de ADN que codifican múltiples (1) regiones variables y/o (2) antígenos o fragmentos de los mismos, cada una con distintas especificidades. En el cassette, la secuencia que codifica una región variable se une de manera preferible al ADN que codifica a) otra región variable o b) un antígeno o antígenos, mediante conectores, todos los cuales están organizados en tándem. Típicamente, dichos conectores son de estructura helicoidal. Los conectores de péptidos helicoidales permiten un plegado apropiado de la molécula de proteína. De manera adicional, los conectores de péptidos helicoidales pueden mejorar la solubilidad de la molécula. A diferencia de la expresión de solo una región variable (V_{L} o V_{H}), dos regiones variables en forma de una proteína de cadena única (V_{L} + V_{H}; V_{L} + V_{L}; V_{H} + V_{H}) requieren el enlace de las regiones variables individuales mediante conectores cortos, por ejemplo, conectores
(Gly_{4} Ser)_{3}.
Se puede usar un intervalo completo de conectores cortos para unir las cadenas de inmunoglobulina de un V_{L} + V_{H} (fragmento F_{v)} (Huston, J. S., Levinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M. S., Novotny, J., Margolies, M. N, Ridge, R. J. Bruccoleri, R. E., Haber, E., Crea, R., Oppermann, H. (1988) Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an antidigoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Pluckthün, 1991). Dichos conectores son entidades pasivas durante el plegado de la proteína. De manera general, dichos conectores son hidrófilos y flexibles.
De manera convencional, existen diversos medios para enlazar las cadenas de inmunoglobulina de un fragmento F_{v}, es decir, mediante entrecruzamiento químico (Golckshuber y col., 1991); entrecruzamiento natural mediante puentes disulfuro (Glockshuber, 1990a); asociación natural sin puentes disulfuro; y conexión mediante un conector péptido genéticamente codificado (Bird, R. E., Hardman, K. D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, B. M., Lee, S. M., Lee, T., Pope, S. H., Riordan, G. S., Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins. Science 242:423-427; Huston y col., 1988a).
Los cassettes de cadena única pueden comprender conectores múltiples. La limitación principal en el número de conectores estriba en qué número sigue permitiendo la expresión de proteínas funcionales codificadas mediante los vectores de la invención.
Se pueden modificar los conectores que codifican los péptidos helicoidales de la invención (por ejemplo., SEC ID N^{os} 10, 11, 12), es decir, mediante sustituciones de aminoácidos dentro de la molécula, con el fin de producir moléculas derivadas de la misma. Dichas moléculas derivadas retendrían la propiedad funcional del conector péptido helicoidal, nominalmente, la molécula que tiene dichas sustituciones podría seguir permitiendo la expresión del producto de proteína biológicamente activo codificado por el nuevo vector de expresión de la invención.
Estas sustituciones de aminoácidos incluyen, pero no se limitan necesariamente a, sustituciones de aminoácidos conocidas en la técnica como "conservativas".
Por ejemplo, es un principio bien establecido de la química de proteínas que se pueden realizar de manera frecuente algunas sustituciones de aminoácidos, denominadas "sustituciones conservativas de aminoácidos" en una proteína sin alterar bien la conformación o la función de la proteína. Dichos cambios incluyen sustituir cualquiera de isoleucina (I), valina (V), y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E9 y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa.
Se pueden también considerar como conservativas otras sustituciones, dependiendo del entorno del aminoácido concreto y su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, se pueden intercambiar de manera frecuente glicina (G) y alanina (A), como lo pueden ser alanina y valina (V).
La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, puede intercambiarse de manera frecuente con leucina e isoleucina, y algunas veces con valina. Lisina (K) y arginina (R) se pueden intercambiar de manera frecuente en localizaciones en las que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y la diferencia en pK de estos dos residuos de aminoácido no resulta significativa. Se pueden considerar "conservativos" otros cambios adicionales, en entornos concretos.
Los vectores que codifican las proteínas de fusión que comprenden regiones variables de anticuerpo con secuencias de cadenas ligeras y/o pesadas, y región o regiones sin anticuerpos de enlace quedan comprendidos en la presente invención. La primera y/o segunda regiones de enlace pueden ser una región o regiones variables de un anticuerpo. De manera alternativa, la primera y/o segunda regiones de enlace pueden ser un antígeno o un fragmento o fragmentos del mismo. De manera preferible, el fragmento del antígeno incluye el fragmento que se puede reconocer y por el cual una molécula se puede enlazar tras el reconocimiento. Por ejemplo, en un antígeno de proteína transmembrana, el fragmento preferido sería el fragmento extracelular. Sin embargo, otros fragmentos quedan también abarcados por la invención.
Los ejemplos de antígenos y receptores adecuados incluyen, pero no se limitan a, moléculas CD y no CD.
Las moléculas CD incluyen, pero no se limitan a, CD1, CD2, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78.
Las moléculas no CD incluyen, pero no se limitan a, B7, B/(2), CTLA4, BR96, GP39, LFA-3, ICAM-2, e interleucina (IL) 1-8.
Por ejemplo, el antígeno CD28 es una glicoproteína homodimérica de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Aruffo, A., Seed, B. (1987) Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high-efficiency COS cell expression system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577) found on most mature T cells (Damle y col. (1983) J. Immunol. 131:2296-2300). Los anticuerpos monoclonales (Mabs) que son reactivos con el antígeno CD28 pueden aumentar las respuestas de las células T iniciadas con varios estímulos policlonales. Se ha identificado una molécula homóloga, "CTLA4", por selección diferencial de una biblioteca de ADNc de células T-citolíticas de murina (Brunet y col. (1987) Nature 328:267-270).
Los vectores de expresión de la invención abarcan vectores capaces de codificar proteínas de fusión multiespecíficas, es decir, una molécula capaz de reaccionar con muchas dianas. Por ejemplo, el vector de expresión puede codificar una proteína de fusión triespecífica capaz de expresarse en una cadena única, nominalmente, una proteína de fusión que reconoce y enlaza con tres dianas. De manera alternativa, la proteína de fusión puede reconocer y enlazar cuatro dianas.
En una forma de realización de la invención, el vector de expresión comprende (1) una secuencia de ADN que codifica una primera región de enlace de un anticuerpo o un antígeno de la superficie de la célula, (2) una secuencia de ADN que codifica una segunda región de enlace de un anticuerpo o un antígeno de la superficie de la célula, (3) un conector que codifica un péptido helicoidal que enlaza la secuencia de ADN que codifica la primera región de enlace y la secuencia de ADN que codifica la segunda región de enlace, y (4) una secuencia de ADN que codifica una etiqueta molecular para la detección de la proteína de fusión monoespecífica o biespecífica.
Se puede identificar la etiqueta molecular mediante la molécula apropiada que reconoce y enlaza la etiqueta molecular tal como un anticuerpo, una molécula complementaria sentido o antisentido, un enzima, etc. Entre los ejemplos de etiquetas moleculares se incluyen un fragmento F_{c}, un fragmento HIV, y la secuencia epitopo de la hemaglutinina HA1 (Pati y col. (1992) Gene 114 (2):285-8).
De acuerdo con una forma de realización preferida, el vector de expresión comprende un cassette de ADN de cadena única biespecífico recombinante que comprende (1) una secuencia de ADN que codifica una primera región de enlace de un anticuerpo o un antígeno de la superficie de la célula, (2) una secuencia de ADN que codifica una segunda región de enlace de un anticuerpo o un antígeno de la superficie de la célula, y (3) un conector que codifica un péptido helicoidal que enlaza la secuencia de ADN que codifica la primera región de enlace y la secuencia de ADN que codifica la segunda región de enlace, cada una de dichas regiones capaz de enlazar la misma o una diana o antígeno diferente.
De acuerdo con la práctica de la invención, la primera y/o segunda región de enlace puede ser reactiva con un antígeno de la superficie de la célula o un antígeno de leucocito. Los antígenos de la superficie de la célula incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como CD3, L6, CD28, CTLA4, CD40 o B7. De esta manera, la primera y/o segunda región de enlace puede ser reactiva con CD3. También, la primera y/o segunda región de enlace puede ser reactiva con L6. De manera adicional, la primera y/o segunda región de enlace puede ser reactiva con CD28. De manera adicional, la primera y/o segunda región de enlace puede ser reactiva con B7. De manera adicional, la primera y/o segunda región de enlace puede ser reactiva con CD40.
En una forma de realización preferida, el vector de expresión se designa como CC9-2, y está depositado en la American Tissue Culture Collection (ATCC) en el plásmido de E. coli CC9-2 que tiene la secuencia líder L6 V_{L}-CD3 sF_{V} - conector - L6 sF_{v} -inmunoglobulina F_{c} en pCDM8) que tiene el Nº ATCC 69235. Será evidente para una persona experta en la técnica que se puede usar cualquier secuencia de ADN. El único requerimiento es que debe conocerse la secuencia de codificación de la región(es) variable(s) o molécula que se va a usar de tal manera que se pueda insertar en el cassette para un alineamiento apropiado y correcto marco de lectura para la expresión.
De manera adicional, se proporciona un vector de expresión que codifica una proteína de fusión biespecífica que comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una región(es) variable(s) de cualquier anticuerpo y una secuencia de ADN que codifica un ligando. Los ejemplo de dichos ligandos incluyen, pero no se limitan a B7, CTLA4, CD28, CD40, CD3. Otros ejemplos de ligandos incluyen cualquiera de los antígenos de leucocitos.
Por ejemplo, la presente invención proporciona un vector de expresión que codifica una proteína de fusión biespecífica que comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una región que es reactiva con CD3 y una secuencia de ADN que codifica una región que es reactiva con L6. La primera o segunda región de enlace puede ser reactiva con CD3. La primera o segunda región de enlace puede ser reactiva con L6.
La presente invención proporciona también un vector de expresión que codifica una proteína de fusión biespecífica que comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una región que es al menos un fragmento de B7 (por ejemplo, la porción extracelular), y una secuencia de ADN que codifica una región que es reactiva con L6.
Esta invención proporciona de forma adicional un vector de expresión que codifica una proteína de fusión biespecífica que comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una región que es reactiva con CTL4 y una secuencia de ADN que codifica una región que es reactiva con L6. La primera o segunda región de enlace puede ser reactiva con CTL4. La primera o segunda región de enlace puede ser reactiva con L6.
Igualmente, la presente invención proporciona un vector de expresión que codifica una proteína de fusión biespecífica que comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una región que es reactiva con CD28 y una secuencia de ADN que codifica una región que es reactiva con L6. La primera o segunda región de enlace puede ser reactiva con CD28. La primera o segunda región de enlace puede ser reactiva con L6.
Por ejemplo, la presente invención proporciona un vector de expresión que codifica una proteína de fusión biespecífica que comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una región que es reactiva con CD3 y una secuencia de ADN que codifica la porción extracelular
de B7.
Se proporcionan los procedimientos para producir vectores de expresión y las proteínas de fusión biológicamente activas de acuerdo con la presente invención. De manera general estos procedimientos comprenden (1) aislamiento del ARNm a partir del hibridoma de una célula B u otra célula cultivada que sintetice un anticuerpo u otra proteína de enlace; (2) sintetizar ADNc mediante transcripción inversa; (3) clonar las regiones de enlace tales como la(s) región(es) variable(s) usando oligonucleótidos de cola anclada u oligonucleótidos degenerados como cebadores PCR; (4) secuenciar la(s) región(es) variable(s) clonada(s) de esta manera; (5) construir genes de fusión entre genes de región variable; (6) insertar la(s) región(es) variable(s) construida(s) de esta manera en un vector pUCIg (u otros vectores adecuados) y cortar con SalI y BclI; (7) seleccionar clones que tengan la configuración apropiada del fragmento y secuenciar dichos clones; (8) transferir los clones a un vector de expresión adecuado tal como pCDM8 o piLNXAn; (9) transfectar células COS mediante una técnica tal como la técnica DEAE-Dextrano; (10) incubar las células transfectadas de esta manera durante un tiempo suficiente para que se expresen las proteínas de fusión, típicamente aproximadamente 72 horas; y (11) seleccionar dichas células mediante FACS usando IgG cabra antihumano FITC y/o ELISA para la producción de proteínas de fusión biespecíficas biológicamente activas.
B. Procedimientos para producir la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa
Se proporciona un procedimiento para producir una proteína de fusión biespecífica biológicamente activa. Este procedimiento comprende cultivar las células transfectadas de esta manera con el vector de expresión de esta invención con el fin de producir la proteína de fusión biespecífica y recuperar la proteína producida de esta
manera.
Esta invención proporciona de manera adicional un procedimiento para producir una proteína de fusión biespecífica biológicamente activa en una célula de mamífero. Este procedimiento comprende (a) transfectar la célula de mamífero con el vector de expresión de la invención; (b) cultivar la célula de mamífero transfectada de esta manera en la etapa (a); y (c) recuperar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa producida de esta manera mediante la célula de mamífero cultivada.
El procedimiento para recuperar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa comprende: (a) identificar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa mediante la presencia de la etiqueta molecular; y (b) separar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa que tiene la etiqueta molecular identificada de esta manera de moléculas sin la etiqueta molecular, con el fin de recuperar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa mediante la célula de mamífero cultivada.
Aunque en los ejemplos que siguen se usan en origen células de mamífero, en principio, cualquier célula eucariota es útil en la práctica de la invención presente. Entre los ejemplos se incluyen células humanas, por ejemplo células de fibroblastos, y células de otros animales tales como ovinas, porcinas, de murina, bovinas. Los ejemplos específicos de células de mamífero incluyen células COS, HeLa, CHO, DUX, B11, Sp2/0, W138, DHK, y HEPG2.
Sería evidente que las proteínas de fusión biespecíficas biológicamente activas se pueden enlazar con marcadores detectables y agentes terapéuticos para uso en diagnosis, in vivo e in vitro, y para uso en terapia. Entre los marcadores detectables a los cuales se pueden enlazar dichas proteínas de fusión biespecíficas biológicamente activas se encuentran enzimas, iones paramagnéticos o compuestos, miembros del par de enlace específico avidina-biotina, fluoróforos, cromóforos, quimioluminóforos, metales pesados y radioisótopos. Entre los agentes terapéuticos a los cuales se pueden enlazar las proteínas de fusión biespecíficas biológicamente activas están los agentes antineoplásticos, las linfoquinas, y las toxinas.
C. Células transfectadas con los vectores de expresión de la invención
La introducción del vector de expresión en las células de mamífero se puede llevar a cabo mediante la transfección con fosfato de calcio (Graham y Vander Eb. (1973) Virol. 52:456-467) transfección DEAE-dextrano (Lopata, M. A. y col., (1984) Nucl. Acids Res. 12:5707), y electroporación (Potter, H y col. (1984) PNAS 81:7161). La elección del procedimiento de transfección depende en parte de qué tipo de transfección se va a llevar a cabo. Se pueden usar tanto la electroporación como la transfección con CaPO_{4} para producir de manera eficiente líneas celulares que contengan ADN integrado de forma estable. La electroporación se realiza de forma más sencilla usando cultivos en suspensión, mientras que la transfección con CaPO_{4} se realiza de forma más sencilla usando células adherentes. La transfección DEAE-dextrano no funciona bien cuando se producen líneas celulares estables, pero es más reproducible que la CaPO_{4}, cuando se usan transfecciones en protocolos no estacionarios. Se conocen en la técnica otros procedimientos de transfección.
Los vectores de expresión y las nuevas proteínas producidas mediante los procedimientos descritos en el presente documento no se limitan a las regiones variables que se muestran anteriormente en el presente documento sino que se aplican de manera general a la construcción, expresión, y selección de cualquier proteína de fusión biespecífica de cadena única.
D. Usos de las proteínas de fusión codificadas por los vectores de la invención
Los derivados de cadena única anti-L6 y anti-CD3 que carecen de etiquetas moleculares pueden ser útiles en terapia o diagnosis para el tratamiento o detección de las enfermedades asociadas con L6 o CD3. Por ejemplo, se podría ligar de forma química el L6sFv con un radionucleido para la detección, o fusionarse genéticamente con una toxina tal como PE40 para terapia.
Debido a que los fragmentos sFv más pequeños son más capaces para penetrar masas de tumores y muestran también mejores localizaciones en los emplazamientos del tumor, pueden ser efectivas dosis más pequeñas de L6sFv en apuntar agentes terapéuticos para células de tumores que expresan altos niveles de antígeno L6 (Colcher, D., Bird, R., Roselli, M., Hardman, K. D., Johnson, S., Pope, S., Dodd, S. W., Pantoliano, M. W., Milenic, D. E., Schlom, J. (1990) In vivo tumor targeting of a recombinant single-chain antigen-binding protein. J. Nat. Cancer Inst. 82:1191-1197; Yokota, T., Milenic, D. E., Whitlow, M., Schlom, J. (1992) Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms. Cancer Res. 52:3402-3408).
El CD3sFv puede resultar muy adecuado para la inducción de la inmunosupresión in vivo, ya que la liberación de una señal del receptor de una célula T en ausencia de una segunda señal tal como el enlace de CD28 puede llevar a la anergia de las células T. Se ha demostrado que los fragmentos F(ab')2 de OKT3 son inmunosupresores a la vez que reducen de manera marcada la toxicidad de la citoquina asociada con la inmunosupresión completa inducida por anticuerpos OKT3 (Woodle, E. S., Thistlethwaithe, J. R., Ghobrial, I. A., Jolliffe, L. K., Stuart, F. P., Bluestone, J. A. (1991) OKT3 F (ab')2 fragments: retention of the immunosuppressive properties of whole antibody with marked reduction in T cell activation and lymphokine release. Transplantation 52:354-360).
De forma interesante, los derivados de anticuerpos CD3 monoespecíficos de cadena única presentan propiedades funcionales distintas de las del anticuerpo nativo. El derivado CD3Fv-Ig induce fuertemente la fosforilación de la tirosina del PLC\gamma1 y aumenta la asociación de PLC\gamma1 con pp35/36 en comparación con el anti-CD3 mAb nativo. Se ha demostrado que esta asociación aumenta a medida que las células T se estimulan de manera máxima (Kanner, S. B., Deans, J. P., Ledbetter, J. A. (1992a) Regulation of CD3-induced phospholipase C-\gamma1 (PLC\gamma1) tyrosine phosphorylation by CD4 and CD45 receptors. Immunology 75:441-447; Kanner, S. B., Ledbetter, J. A. (1992b) CD45 regulates TCR-induced signalling through tyrosine phosphorylation of phospholipase C\gamma1. Biochem. Soc. Trans. 20:178-184). De manera adicional, la estimulación de las células T con CD3Fv-Ig da como resultado una mayor fosforilación global de la tirosina de las proteínas celulares que sigue a la activación. Es posible que debido a que las moléculas son más pequeñas que la mAb nativa, la región de enlace en CD3-\varepsilon sea más accesible y mejore la interacción con las tirosina quinasas asociadas con TCR/CD3.
En modelos animales y en ensayos clínicos en seres humanos, los mAb anti-TCR o anti-CD3 han demostrado mejorar las respuestas de las células T frente a las células diana cuando se entrecruzan con antígenos de las células diana. Los mAb heteroconjugados o específicos dirigen la actividad de los linfocitos T citotóxicos o de las células asesinas de linfocitos activados para matar células diana malignas (Staerz y col., 1986a; Perez y col., 1985a; Perez, P., Hoffman, R. W., Titus, J. A., Segal, D. M. (1986) Specific targeting of human peripheral blood T cells by heteroaggregates containing anti-T3 crosslinked to anti-target cell antibodies. J. Exp: Med. 163;166-178; Liu y col., 1985a; Staerz y col., 1986b) o células diana infectadas víricamente (Paya, C. V., McKean, D. J., Segal, D. M., Schoon, R. A., Schowalter, S. D. Leibson, P. J. (1989) Heteroconjugate antibodies enhance cell-mediated anti-herpes simples virus immunity. J. Immunol. 142:666-671; Zarling, J. M., Moran, P. A., Grosmaire, L- S., McClure, J., Shriver, K., Ledbetter, J. A. (1988) Lysis of cells infected with HIV-1 by human lymphocytes targeted with monoclonal antibody heteroconjugates. J. Immunol. 140:2609-2613; Voss, L. M., David, C. S., Showalter, S. D., Paya, C. V., Liebson, P. J. (1992) Heteroconjugate antibodies enhance cell-mediated anti-herpex simplex virus immunity in vivo. Int. Immunol. 4:417-420).
Aunque el mAb anti-CD3 puede inducir una potente toxicidad de citoquinas in vivo (Abramowicz, D., Schandene, L., Goldman, M., Crusiaux, A., Vereerstraeten, P., De Pauw, L., Wybran, J., Kinnaert, P., Dupont, E., Toussaint, C. (1989) Release of tumor necrosis factor, interleukin-2, and gamma interferon in serum after injection of OKT3 monoclonal antibody in kidney transplant recipients. Transplantation 47:606-608), los pacientes tratados con mAb biespecífico no desarrollaron toxicidad de citoquinas debido a que sus células T fueron pretratadas con el reactivo in vitro y a continuación se volvieron a administrar (Mezzanzanica, D., Canevari, S., Colnaghi, M. I. (1991) Retargeting of human lymphocytes against human ovarian carcinoma cells by bispecific antibodies: from laboratory to clinic. Int. J. Clin. Lab. Res. 21:159-164; Nitta, T., Sato, K., Yagita, H., Okumura, K., Ishii, S. (1990) Preliminary trial of specific targeting therapy against malignant gliom. Lancet 335:368-371). En modelos de murina, las moléculas más pequeñas que los mAb nativos tales como los fragmentos F (ab')2 muestran un incremento en la localización de tumores para ambas especificidades anti-tumor, el anti tumor monoespecífico y para el anti-CD3 biespecífico (van Dijk, J., Zegveld, S. T., Fleuren, G. J., Warnaar, S. O. (1991) Localization of monoclonal antibody G250 and bispecific monoclonal antibody CD3/G250 in human renal cell carcinoma xenografts: relative effects of size and affinity. Int. J. Cancer 48:738-743; Nelson, H., Ramsey, P. S., Kerr, L. A., McKean, D. J., Donohue, J. H. (1990) regional and systemic distribution of anti-tumor x anti-CD3 heteroconjugate antibodies and cultured human peripheral blood lymphocytes in a human color cancer xenograft. J. Immunol. 145:3507-3515).
La molécula CD3-L6FvIg puede ser útil como nueva molécula para la terapia del cáncer en mamíferos, por ejemplo, la terapia del cáncer humano. La molécula contiene una especificidad al enlace tanto para CD3 como para el antígeno del tumor L6, y se ha demostrado in vitro que induce la proliferación de células T en presencia de células tumorales L6 positivas, y para dirigir los asesinos CTL hacia estas células. Las dos especificidades de enlace diferentes se ligan a la bisagra, las regiones CH2 y CH3 de la IgG1 humana, inicialmente para servir como etiqueta para la caracterización y purificación de las moléculas biespecíficas. Esta etiqueta es propia de una región relativamente pequeña (aproximadamente 50 kDa) que retiene el tamaño global más pequeño de la proteína biespecífica etiquetada hasta aproximadamente dos tercios del tamaño de la IgG nativa. Puesto que la etiqueta es de origen humano, podría esperarse que la inmunogenicidad global de la molécula sea significativamente menor que la de la IgG de la murina completa. Podrían llevarse a cabo modificaciones adicionales para disminuir de manera adicional la inmunogenicidad de las proteínas biespecíficas tales como humanizando las regiones marco y construyendo la porción accesible al solvente del conector helicoidal para parecerse a hélices de proteínas humanas conocidas. Aunque la porción Ig actúa como una cola de afinidad, puede también aumentar la vida media de la proteína biespecífica in vivo.
En un informe, mAb quiméricos con regiones variables de cáncer anti-colorectal de ratón fusionados con la región constante de la IgG1 humana (Steplewskji, Z., Sun, L. K., Sherman, C. W., Ghrayeb, J., Daddona, P., Koprowski, H. (1988) Biological activity of human-mouse IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 chimeric monoclonal antibodies with antitumor activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4852-4856) administrados a diez pacientes con cáncer de colon metástico mostraron un aumento de seis veces en el tiempo de circulación (LoBuglio, A. F., Wheeler, R. H., Trang, J., Haynes, A., Rogers, K., Harvey, E. B., Sun, L., Ghrayeb, J., Khazaeli, M. B. (1989) Mouse / human chimeric monoclonal antibody in man: kinetics and immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4220-4224).
De manera adicional, la cola Ig usada en nuestra proteína de fusión biespecífica se muta en la región CH2 (prolina a serina en el residuo 238). Esta mutación ablaciona la actividad ADCC mediada por la interacción de la cola IgG1 humana con los receptores Fc. Esto evitaría el "asesinato recíproco" entre las células T CD3 positivas y el las células que transportan el l receptor Fc in vivo (Clark y col., 1987a). Finalmente, aunque la molécula biespecífica se expresa a partir de la transfección transitoria de las células COS, se puede expresar de manera potencial la proteína en un sistema de transfección estable.
Ventajas de la invención
La presente invención supera los problemas asociados con las metodologías actuales de producción de anticuerpos.
Para resolver los problemas encontrados por otros en la producción de una proteína de fusión biespecífica, adaptamos un sistema de expresión celular COS existente para conseguir la secreción de derivados de anticuerpos de cadena única funcionales a partir de un cassette de ADN de cadena única biespecífico recombinante. Los anticuerpos de cadena única se construyeron fusionando la región Fc de la IgG1 humana con las regiones variables de los anticuerpos de murina frente a antígenos humanos (por ejemplo., CD3 y L6). La región Fc sirvió como una secuencia etiqueta molecular conveniente para la identificación y purificación de las proteínas de fusión con especificidades variables. De manera adicional, las funciones efectoras conferidas por este segmento del anticuerpo pueden ser útiles en algunas aplicaciones terapéuticas.
A diferencia de los sistemas de expresión bacteriana en los que la recuperación de las moléculas biológicamente activas es problemática, incluso para las moléculas que poseen una especificidad de enlace única, la presente invención proporciona la expresión transitoria a partir de células COS que da como resultado cultivos sobrenadantes que contienen las proteínas de fusión biológicamente activas expresadas que podrían purificarse a continuación mediante cromatografía de afinidad convencional. De manera interesante, las moléculas de proteínas de fusión biespecíficas de cadena única producidas de esta manera presentan propiedades que fueron distintas de las de los anticuerpos padres.
Escogimos la expresión en mamíferos de estas moléculas de proteínas de fusión biespecíficas debido a que es problemática a partir de sistemas de expresión bacterianos, incluso para las moléculas que poseen únicamente una especificidad de enlace única la recuperación de las moléculas biológicamente activas. Con la expresión en mamíferos, se puede conseguir la producción simple y rápida de derivados de anticuerpos, ya que es importante que sea posible la caracterización, evaluación, y comparación entre las moléculas dentro de un período de tiempo relativamente corto.
Los genes de fusión, en los que están presentes las regiones de proteínas individuales en un cassette de ADN de cadena única biespecífico recombinante intercambiable crean el potencial para generar nuevas combinaciones, haciendo intercambios rápidos, y seleccionar regiones diferentes por su eficacia en la realización de una función deseada. Es preferible la expresión de los constructos en el sistema de transfección transitorio a otros procedimientos de producción para la recombinación inicial y las etapas de selección. Únicamente aquellas moléculas que presentan el subgrupo deseado de características a partir de esta selección requerirá el lanzamiento en un sistema de expresión secundario para la producción a gran escala, eliminando la producción voluminosa o complicada y los procedimientos de aislamiento para la mayoría de moléculas generadas.
Nos dispusimos a desarrollar un sistema para la construcción, expresión y análisis rápido de los emplazamientos de enlace del anticuerpo reunidos en las moléculas más grandes en forma de cassettes de ADN de cadena única biespecíficos recombinantes que tienen cassettes de ADN intercambiables, es decir, cassettes de ADN que codifican regiones variables de cadena única u otras regiones de enlace que se pueden intercambiar por otra. Las secuencias de la primera y segunda regiones se pueden sustituir o intercambiar. Secuencias diferentes pueden sustituir a otras existentes.
A diferencia de los constructos anteriormente descritos, los cassettes de cadena única biespecíficos son versátiles ya que se puede colocar cualquier región variable en cualquiera de la primera o segunda regiones de enlace.
Mediante la construcción de nuevas combinaciones de regiones estructurales de anticuerpos, por ejemplo moléculas que acoplan dos especificidades de enlace no relacionadas, se pueden producir las funciones efectoras deseadas que presentan un potencial terapéutico mejorado. Dichos derivados de anticuerpos de cadena única biespecíficos sirven como moléculas adaptadoras de los dos receptores de la superficie de la célula no interactuantes para crear un par receptor - ligando artificial.
Los datos del presente documento sugieren que las moléculas de proteínas de fusión biespecíficas expresadas de esta manera a partir de un cassette de ADN de cadena única biespecífico recombinante pueden ser capaces de dirigir una respuesta citotóxica mediante las células T frente a tumores humanos que expresan L6 in vivo así como in vitro, sin necesidad de manipulaciones de cultivos de tejido extensas o purificación a partir de anticuerpos monoespecíficos potencialmente tóxicos frente a CD3.
Los derivados de anticuerpos de cadena única que emparejan las especificidades de enlace de las células tumorales y el enlace y activación de las células T proporcionan una mejora significativa sobre las terapias basadas en anticuerpos monoclonales únicos para enfermedades humanas. La solución descrita aquí para el diseño, construcción, expresión, y ensayo de los genes de fusión es una versátil que ofrece ventajas significativas de rapidez, simplicidad y reproducibilidad para ensayar nuevas combinaciones entre las regiones funcionales de moléculas no relacionadas por su capacidad para funcionar conjuntamente en el interior de una molécula única de la manera deseada.
Se ilustra esta invención en el Ejemplo que sigue. Se describe esta sección para ayudar en la comprensión de la invención, pero no se pretende, y no debería interpretarse, que limite en forma alguna la invención que se define en las reivindicaciones que siguen.
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Ejemplo 1 Materiales y procedimientos
Modificación de los vectores de expresión: Se modificaron los plásmidos pCDM8 y piLNXAn sustituyendo el fragmento de relleno con diversos fragmentos de relleno más pequeños, cada uno de los cuales confiere alguna propiedad funcional a la proteína de fusión resultante.
El vector de expresión mamífero se esquematiza con las alteraciones y adiciones realizadas que se muestran a lo largo de la porción superior del vector. La expresión de los cassettes de fusión es impulsada por el promotor CMV, y la replicación en bacterias y células de mamíferos se alcanza mediante los orígenes apropiados indicados en la parte inferior del vector. El vector contiene el gen supE para suprimir las mutaciones no sentido en los genes de ampicilina y tetraciclina presentes en el plásmido p3 en las cepas bacterianas del huésped apropiado. Se proporcionan las señales de terminación y poli A adición mediante las regiones apropiadas de SV40.
Se usó el emplazamiento HindIII en el extremo 5' de la región de relleno para insertar un cassette HindIII-Sal I que contenía una secuencia líder para la secreción de las proteínas de fusión obtenidas a partir de las regiones variables de cadena ligera del anticuerpo anti-L6 (denominadas también en el presente documento como anti-L6) (Figura 1) Se codificó esta secuencia sobre los oligonucleótidos 72-mer complementarios con los extremos cohesivos sobresalientes HindIII y SalI. El oligonucleótido sentido usado fue L6VL-LP5/AGC TTA TGG ATT TTC AAG TGC AGA TTT TCA GCT TCC TGC TAA TCA GTG CTT CAG TCA TAA TGT CCA GAG GAG (SEC. ID Nº: 1) mientras que el oligonucleótido complementario fue L6VL-LP3/TCG ACT CCT CTG GAC ATT ATG ACT GAA GCA CTG ATT AGC AGG AAG CTG AAA ATC TGC ACT TGA AAA TCC ATA (SEC ID Nº: 2). Se fosforiló el oligonucleótido sentido con polinucleótido quinasa (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, ID) y se templó con el complemento antes de la ligadura de acuerdo con los procedimientos publicados anteriormente (Sambrook, J., Fristch, E. F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning - a laboratory manual, segunda edición. ISBN 0-87969-309-6. Sólo uno de los oligonucleótidos fue tratado con quinasa para evitar inserciones en tándem múltiple.
De manera adicional, se usó el emplazamiento XbaI en el extremo 3' del fragmento de relleno para insertar una etiqueta molecular o un codon de parada simple flanqueado por emplazamientos de restricción BclI y XbaI en los términos carboxilo (Figura 1). Las etiquetas moleculares ensayadas incluyeron un fragmento Fc de igG1 humana, un péptido del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) del bucle V3 de gp110, un péptido FLAG y la región constante de la región del C-kappa humano. Se aislaron las secuencias IgG1 humanas del ARN del transfectoma L6 quimérico mediante transcripción inversa acoplada (virus de la mieloblastosis aviar; Life Sciences, San Petersburgo, FL) y/o las reacciones PCR del ARN de un mieloma que expresa el L6 quimérico humano-ratón. Se construyeron diversos derivados de mutantes diferentes de la región Fc a partir de reacciones PCR usando cebadores delanteros que contenían las mutaciones apropiadas, bien en la bisagra o en la región CH2.
Se ensayaron los vectores de expresión modificados mediante la inserción y expresión de las regiones variables de dos especificidades de enlace de anticuerpos diferentes, el antígeno del tumor L6 humano y el CD\cdot-\varepsilon humano. Los derivados de anticuerpos de cadena única enlazan el antígeno con apetencias y afinidades variables, dependiendo de la etiqueta molecular con la cual se fusionaron. La región Fc de la IgG1 humana fue la etiqueta más satisfactoria en reproducir las características de enlace del anticuerpo nativo, a pesar de la ausencia de las regiones CH1 y Ck. Se construyeron y ensayaron otras etiquetas diversas, pero la Ck (Traunecker, A., Lanzavecchia, A. M., Karjalainen, K. (1991) Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells. EMBO J. 10: 3655-3659) y los péptidos FLAG fracasaron en funcionar de manera fidedigna. Se usó también el péptido
RKSIRIQRGPGRAFVTIGKI (SEC ID Nº: 3) del bucle V3 de gp110 codificado por el virus de la inmunodeficiencia humana como una cola de afinidad, reconocida por el péptido específico mAb 110.3. Esta etiqueta proporcionó resultados variables dependiendo del Fv al cual se fusionó, fracasando en funcionar apropiadamente cuando se fusionó con L6, pero comportándose satisfactoriamente cuando se fusionó con CD3.
El péptido 29 (RKSIRIQRGPGRAFVTIGKI) (SEC ID Nº: 3) se corresponde con un segmento del bucle V3 de gp 110 de HIV (péptido HIV). Se creó una etiqueta molecular fusionando dos oligonucleótidos 76-mer complementarios con extremos cohesivos y sobresalientes. El oligonucleótido sentido incluyó un Bcl I sobresaliente, las secuencias del bucle V3, y un codon de parada HIVSTOP5 GA TCA AGA TCC GCG GAA ATC GAT TAG AAT CCA GAG AGG CCC TGG GCG CGC CTT CGT TAC GAT CGG CAA GAT CTA GT /SEC ID Nº: 4), mientras que el cebador complementario contuvo el XbaI sobresaliente HIVSTOP3/CTA GAC TAG ATC TTG CCG ATC GTA ACG AAG GCG CGC CCA GGG CCT CTC TGG ATT CTA ATC GAT TTC CGC GGA TCT T (SEC ID Nº: 5). Se fosforiló el oligonucleótido sentido y se fusionó con el cebador inverso no fosforilado antes de la ligadura en un vector digerido BclI-XbaI tal como se ha descrito anteriormente.
Se ensayó si el péptido FLAG comercializado por IBI para uso como etiqueta amino terminal podría trabajar aún cuando se colocara en el extremo carboxilo de la proteína etiquetada. Se designaron oligonucleótidos complementarios que contenían las siguientes secuencias 51-mer: FLAG5/GAT CAA GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG TGA GCG GCC GCG AAT TCG TCT (SEC ID Nº: 6) y FLAG3/CTA GAG ACG AAT TCG CGG CCG CTC ACT TGT CAT CGT CGT CCT TGT AGT CTT (SEC ID Nº: 6). Estas secuencias se trataron con quinasa, se fusionaron y se ligaron en el vector distal en la región de enlace del anticuerpo. Las secuencias C-kappa humanas se obtuvieron mediante transcripción inversa y PCR a partir del ARN del L6 quimérico tal como se ha descrito anteriormente. El cebador delantero para el aislamiento del C-kappa fue L6CK5BCL/GGT GCT CTG ATC ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC (SEC ID Nº: 8), y el cebador inverso fue L6CK3XBA/CCT CCT CAT TCT AGA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT (SEC ID Nº: 9).
El conector péptido helicoidal usado para fabricar un cassette de ADN de cadena única biespecífico recombinante entre las regiones de enlace CD3 y L6 se codificó sobre los oligonucleótidos 78-mer complementarios con el extremo GATC cohesivo y sobresaliente. El oligonucleótido sentido es Fvlink1/GAT CAA TCC AAC TCT GAA GAA GCA AAG AAA GAG GAG GCC AAA AAG GAG GAA GCC AAG AAT CTA ACA GCC TCG AGA GC (SEC ID Nº: 10), y el oligonucleótido antisentido es Fvlink2/GAT CGC TCT CGA GGC TGT TAG ATT TCT TGG CTT CCT CCT TTT TGG CCT CCT CTT TCT TTG CTT CTT CAG AGT TGG ATT (SEC ID Nº: 11). El péptido codificado es hidrófilo con abundancia de aminoácidos cargados (DQSNSEEAKKEEAKKEEAKKSNSLESL) (SEC ID Nº:12) para aumentar la solubilidad de la molécula. La secuencia motivo (EEAKK)_{n}, es particularmente hidrófila debido a una abundancia de aminoácidos cargados.
Se llevaron a cabo las reacciones PCR (en un volumen total de reacción de 100 \mul) en tampón Taq polimerasa (Stratagene, Torrey Pines, CA o Boehringer-Mannheim), con 20 \mumol de cada dNTP, 50-100 pmol de cebadores, 1-10 ng de plantilla, y Taq polimerasa (Stratagen o Boehringer-Mannheim). Se llevaron a cabo las reacciones usando un Perkin-Elmer Cetus Termal Cycler con un programa de 30 ciclos, constituido de manera típica por etapas de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC. Los productos de la ligadura se transformaron en MC1061/p3 y se seleccionaron las colonias respecto de la inserción de los plásmidos apropiados. Se verificaron los clones positivos mediante secuenciamiento del ADN y mini transfección.
Aislamiento de las regiones V: Se aisló ARN procedente del transfectoma L6 quimérico usando la técnica de lisis NP-40 rápida y se amplificó el ADN de longitud completa para las cadenas tanto pesada como ligera usando cebadores idénticos a las secuencias publicadas para las regiones constantes L6 y humanas (Hieter, P. S., Maz, E. E., Seidman, J. G., Maizel, J. V. Jr., Leder, P. (1980) Cloned human and Mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. Cell 22:197-207; Liu y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3438-3442), pero con los emplazamientos de restricción ligados por clonación. Se usaron estos ADNc de longitud completa con plantillas en reacciones PCR secundarias para subclonar las regiones variables. En un ejemplo, se clonaron los subfragmentos de las regiones variables mediante PCR a partir de plantillas generadas con hexámeros aleatorios en lugar de con cebadores específicos.
Se extrajo el ARN procedente de células G19-4 usando la técnica de lisis NP-40 rápida. Se amplificaron las secuencias V_{L} y V_{H} del hibridoma anti-CD3 de G19-4 usando los procedimientos PCR establecidos (Orlandi, R., Gussow, D. H., Jones, P. T., Winter, G. (1989) Cloning immunoglobulin variable regions for expression by the Polymerase Chain Reaction. Proc. Nat. Acad. Sci. 86:3833-3837). Se llevó a cabo la síntesis de la primera cadena de ADNc usando la transcriptasa inversa AMV (Life Sciences) y los cebadores complementarios de las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada. Los primeros productos de la cadena de ADNc se encolaron con poli-G usando la transferasa Terminal (Stratagene, Torrey Pines, California). A continuación se llevó a cabo la PCR usando 100 pmol de cada cebador y 1-2 \mul de G purificado - gen de ADNc encolado - ADNc limpio a partir de la síntesis de primera cadena. El cebador delantero ANCTAIL contenía ADN no sentido y las secuencias poli-C complementarias para la secuencia de anclaje, el cebador delantero ANC-ER contenía un emplazamiento EcoRI y secuencias no sentido corriente arriba del emplazamiento de anclaje, y los cebadores inversos MH\gammaC y MCK-3 contenían las secuencias internas del cebador de la primera cadena, complementario a las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera, de manera respectiva. Las secuencias del cebador fueron como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
ANCTAIL:
5'-GCATGTGCAAGTCCGATGAGTCCCCCCCCCCCCCC-3'
\quad
SEC ID Nº: 13,
ANC-ER:
5'-ACGTCGAGAATTCGCATGTGCAAGTCCGATGAGTCC-3'
\quad
SEC ID Nº: 14,
MH\gammaC:
5'-A (TC) CTCCACACACAGG (AG) (AG) CCAGTGGATAGAC-3'
\quad
SEC ID Nº: 15,
MCK-1:
5'-CTTCCACTTGACATTGATGTCTTTG-3'
\quad
SEC ID Nº: 16,
MCK-3:
5'-CAAGAAGCACACGACTGAGGCA-3'
\quad
SEC ID Nº: 17.
Análisis FACS e inmunotinción: Se analizaron células Jurkat, linfocitos de sangre periférica, y/o células tumorales L6 positivas (H2981 o H3639) mediante inmunotinción indirecta. Antes de la tinción, se separaron las células H2981 de los matraces mediante incubación en tripsina-EDTA (GIBCO-BRL). Se incubaron las células con anticuerpos de cadena única o anticuerpos nativos pariente a diversas concentraciones en tampón de enlace (GIBCO-BRL), durante 40 minutos a 4ºC. Se lavaron las células tras la primera etapa y se incubaron con un reactivo FITC conjugado en la segunda etapa durante 30-40 minutos más a 4ºC. El anticuerpo de la segunda etapa fue uno de los siguientes: Ig cabra anti ratón para mAbs de murina, IgG cabra anti humano para fusiones de Ig únicas (Tago, Inc., Burlingame, CA), FITC-110.3 dirigido contra el bucle V3 de gp110 para péptidos de fusión de HIV, y el idiotipo de FITC-a (1B) contra el anticuerpo de L6 para todos los tipos de L6 que contienen constructos. Se analizó la fluorescencia en un separador de células FACS IV (Becton Dickenson and Co., Mountain View, CA) equipado con un amplificador logarítmico de cuatro décadas.
Se llevaron a cabo los ensayos de competición mezclando los dos anticuerpos en relaciones variables respecto de 10 \mug/ml de anticuerpos totales antes de la adición de las células. Se marcó uno de los dos anticuerpos con FITC usualmente quimérico o L6 de murina, o G19-4 nativo. Para los ensayos de inhibición, se añadió el primer anticuerpo 30 minutos antes de la adición del segundo anticuerpo FITC conjugado.
Cultivo celular, transfecciones, y purificación de proteínas de fusión: Se transfectaron células COS con plásmidos de expresión tal como se ha descrito anteriormente (Linsley, P. S., Brady, W., Grosmaire, L., Aruffo, A., Damle, N. K., Ledbetter, J. A. (1991) Binding of the b cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and interleukin 2 mRNA accumulation. J. Exp med. 173:721-730; Aruffo y Seed, 1987a). Se añadió el ADN del plásmido al medio de transfección a 1 \mug/ml en un volumen total de 12 ml/150 mm de placa. Se vertió medio de cultivo agotado libre de suero a partir de tres colecciones de células COS transfectadas y se usó para purificar las proteínas de fusión que contenían Ig, HIV, o etiquetas moleculares STOP. Se eliminaron los deshechos celulares mediante centrifugación a baja velocidad y se filtraron los sobrenadantes algunas veces a través de filtros de 0,2 \mum antes de la purificación. Se aplicó medio a partir de las transfecciones de Ig de fusión a una columna de proteína A inmovilizada (Repligen Corp., Cambridge, MA) equilibrada con citrato de sodio 0,05 M, pH 8,0 (Linsley y col., 1991a). para 500 ml de sobrenadante, se usó 1 ml de proteína A del volumen del lecho empaquetado. Tras dos aplicaciones de medio, se lavó la columna con fosfato de potasio 100 mM, pH 8,0, y se eluyó la proteína de enlace con citrato de sodio 0,05 M, pH 3. Se recogieron las fracciones en tubos que contenían 1/5 de volumen de TRis 1 M pH 8,0. Se vertieron las fracciones que contenían el pico de A_{230} de material absorbente y se dializaron frente a PBS antes del uso. Se determinó la concentración de proteína usando el kit de ensayo de proteínas BioRad basado en la técnica Lowry.
Para las proteínas de fusión que contenían las etiquetas moleculares, se hicieron las columnas de afinidad inmovilizando los anticuerpos apropiados (bien anti-L6 idiotipo mAb 13B o anti-HIV mAB 110.3 dirigido frente al bucle V3 de gp 110) usando Sepharose 4G CNBr activada de acuerdo con las instrucciones de Pharmacia. Las matrices de afinidad contuvieron de manera aproximada 5 mg de mAb por ml de volumen del lecho y el tamaño típico de columna fue de 1 x 5 cm (4 ml). Se ajustaron las muestras a pH 7 y se aplicaron a la columna de inmunoafinidad apropiada que ha necesitado previamente lavarse con ácido cítrico 0,1 M, pH 2,2 y equilibrarse en PBS, pH 7,2. La columna se lavó a fondo con PBS y el material de enlace se eluyó con citrato 0,1 M pH 3,0, seguido por la neutralización inmediata con Tris. Los derivados de anticuerpos purificados se dializaron finalmente en PBS y se filtraron
estériles.
Ensayos de adhesión celular: Se llevaron a cabo ensayos de adhesión, esencialmente tal como se ha descrito
(Linsley, P. S., Clark, E. A., Ledbetter, J. A. (1990) T-cell antigen CD28 mediates adhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5031-5035), en presencia de EDTA 10 mM. Se marcaron en primer lugar células Jurkat con ^{51}Cr y se incubaron con anticuerpos estimulados, se lavaron, y se incubaron con células tumorales H2981 y se examinaron microscópicamente. Para evitar enlaces no específicos con células H2981, se incubaron las células Jurkat y las monocapas H2981 con un anticuerpo irrelevante para saturar los receptores Fc antes de la adición de los derivados de anticuerpos de CD\cdotIg (denominada también en el presente documento como CD3FvIg), L6Ig (denominada también en el presente documento como L6FvIg), o CD3-L6Ig (denominada también en el presente documento como CD3-L6FvIg). Después que se completó la reacción de adhesión, se lavaron las monocapas cinco veces con medio RPMI en hielo seco, se solubilizaron mediante la adición de NaOH 0,5 M, y se midió la radioactividad en un contador gamma. Se calcularon los números de células de enlace dividiendo la radioactividad total del enlace (cpm) por la actividad específica (cpm por célula) de las células marcadas (Figura 6).
En la Figura 6, se plaquearon las monocapas de células tumorales H2981 en una densidad de 10^{5} células / pocillo en placas de 48 pocillos, se fijaron en paraformaldehído al 0,1% durante 20 min a 23ºC, se lavaron, se bloquearon en RPMI completo + FBS al 10%, y se preincubaron solas o con el anticuerpo indicado durante 1 h a 37ºC. Se usó un heteroconjugado de anti-CD3 (G19-4) y anti-L6 mAb como control positivo. Se usaron todos los anticuerpos a 20 \mug/ml excepto cuando se indicó. Las células Jurkat se marcaron con ^{51}Cr, se preincubaron en EDTA 10 mM, y se añadieron a las células tumorales y a los anticuerpos. La adhesión se inició haciendo girar las placas a 1000 rpm durante 2 min. Las reacciones se incubaron 45 min a 37ºC, se lavaron cinco veces en RPMI con hielo seco, y se lisaron en NaOH 0,5 N. Se determinaron los recuentos liberados mediante conteo gamma. Los datos representan el número de células enlazadas (x 10^{3}). Se muestran la desviación media y estándar (barras de errores) de las tres determinaciones replicadas.
SDS-PAGE y Western Blotting: Se manejaron geles de acrilamida formando un gradiente linear del 6-15% con un cargador al 4% a 225 Voltios durante 3 horas o durante la noche a 8 mAmp. Los geles se inmunoemborronaron en membranas de nitrocelulosa usando un aparato de transferencia Semiseco Western (Ellard Instruments, Seattle, WA) a 130 mAmp durante 1 hora. Los borrones se bloquearon con leche desnatada al 1%, NP-40 al 0,05% en PBS (BLTTO, es decir, tampón de bloqueo) durante 1-2 horas. La incubación del primer anticuerpo se llevó a cabo con IgG anti-humano cabra (Boehringer-Mannheim) conjugada con fosfatasa alcalina a una dilución 1:1500 en BLOTTO, o con la dilución apropiada de murina no conjugada o anticuerpo quimérico o anticuerpo antiidiotópico para la detección de fusiones no Ig, es decir, etiquetas de Ig carentes de Sf_{v}. En cualquier caso, los borrones se lavaron tres veces en BLOTTO y se incubaron con IgF anti-humano o anti-ratón cabra conjugada con fosfatasa alcalina si se requirió una segunda etapa. Se desarrollaron los borrones en Western Blue (Promega, Madison, WI) durante 5-15 minutos, y se cortó la reacción en agua destilada.
Inmunoprecipitación y western blotting con anti-p-tyr: Se estimularon o no estimularon (0) células T de Jurkat con G19-4 Mab nativo (Ledbetter, J. A., Norris, N. A., Grossmann, A., Grosmaire, L. S., June, C. H., Ucklin, F. M., Cosand, W. L., Rabinovitch P. S. (1989) Enhanced transmembrane signalling activity of monoclonal antibody heteroconjugates suggest molecular interactions between receptor son the T cell surface. Mol. Immunol. 26:137-145) o con CD3Fv-Ig a las concentraciones indicadas, y se lisaron en tampón RIFA modificado (Kanner, S. B., Reynolds, A. B., Parsons, J. T. (1989) Immunoaffinity purification of tyrosine phosphorylated cellular proteins. J. Immunol. Methods 120:115-124) conteniendo inhibidores de la fosfatasa y de la proteasa (ortovanadato de sodio 1 mM, PMSF 1 mM, EGTA 2 mM, aprotinina al 0,5% y 10 \mug/ml de leupeptina). Se clarificaron los lisados celulares (10 min a 14000 rpm) y se inmunoprecipitaron bien con anti-p-tyr de conejo o antisuero PLC\gammal. Se recuperaron los complejos inmunes con perlas de proteína A-Sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ) y se lavaron. Se separaron las proteínas mediante SDS-PAGE (8%) y se transfirieron en PVDF Immobilon (Millipore, Bedford, MA) durante 2 horas a 4ºC. Se bloquearon los inmunoborrones antes de la adición de 0,5 \mug/ml de anti-p-tyr de conejo de afinidad purificada en tampón de bloqueo. Se detectaron las proteínas con 1 \muCi/ml de proteína A marcada con ^{125}I de actividad muy específica (ICN Biomedical, Costa Mesa, CA) y se autoradiografiaron.
Ensayos de proliferación: Se aislaron linfocitos de sangre periférica mediante dilución y centrifugación a través de un medio de separación de linfocitos (Organon Teknika, Durham, NC). Se lavaron los linfocitos varias veces en RPMI 1640 libre de suero, y se ajustó la concentración celular a 10^{6} células/ml en RPMI que contenía FCS al 10%. Se cultivaron las células en p6 pocillo, placas de fondo plano (5 x 10^{4} células / pocillo en un volumen de 0,2 ml). Se midió la proliferación en muestras por triplicado mediante la captación de [^{3}H] de la timidina a 1 \muCi/ml durante las 6-8 horas últimas de un cultivo de tres días. Se prepararon células T activadas con PHA cultivando PBL con 1 \mug/ml de PHA (Wellcome, Charlotte, NC) durante 5 días, y quedando un día en medio ausente de PHA.
Se irradiaron células tumorales H2981 a 10.000 rads antes del uso en ensayos de proliferación. Se preenlazaron las células en proteínas de fusión y se lavaron antes de incubar con PBL (muestras "preenlazadas") o se incluyeron con proteínas de fusión en solución ("muestras en solución") durante los tres días de cultivo. El lavado de las muestras preenlazadas elimina la proteína no enlazada de tal manera que únicamente la proteína enlazada con las células del tumor contribuye a la estimulación de PBL durante el ensayo. Se valoró el PBL con respecto a las células irradiadas como sigue: (2:1), %:1, 125:1, (625:1), donde el primer número se refiere al número relativo de PBL presente (5 x 104 células / pocillo) en comparación con la disminución de números de las células tumorales.
Ensayos de citotoxicidad: Se incubaron células tumorales H2981 con [^{51}Cr] durante dos horas antes de la incubación con proteínas de fusión (0,1 \mug/ml a 10 \mug/ml) y PBL (para varios efectores: las relaciones diana oscilan entre 10:1 y 100:1). Se cultivaron las células en RPMI que contenía FCS al 10% en un volumen total de 0,2 ml durante cinco horas antes del recuento. Se cuantificó la liberación de cromo en un contador gamma para medir la citotoxicidad dirigida contra las células del tumor.
Las células COS son capaces de expresar anticuerpos a partir de un cassette de ADN de cadena única biespecífico recombinante: Dispusimos desarrollar un sistema para la expresión transitoria en mamíferos de moléculas de anticuerpo para facilitar su detección, purificación y caracterización rápida. Fue importante que el sistema fuera suficientemente versátil para acomodar moléculas de especificidades variables e intercambios de regiones para simplificar la generación, ensayo, y comparación entre diferentes anticuerpos biespecíficos de cadena única. Se ha usado el sistema de expresión transitoria de una célula COS de manera satisfactoria por los operarios antes de expresar los receptores solubles de la superficie de la célula creando proteínas de fusión entre la región extracelular del receptor superficial y la cadena pesada de la inmunoglobulina IgG1 humana (Aruffo y Seed, 1987b; Linsley y col., 1991b).
Se escogió este sistema como una alternativa atractiva para los sistemas de expresión bacteriana debido a que las moléculas se segregan y se podrían recuperar fácilmente en forma activa a partir de los cultivos sobrenadantes. Los experimentos examinaron si un sistema de expresión transitorio de células SOS puede ser capaz de expresar y segregar moléculas de IgG intactas funcionales usando ADNc más bien que secuencias genómicas. Los cassettes kappa y gamma ADNc de longitud completa que codifican la especificidad del antígeno anti tumor L6 se ligaron con pCDM8 y se cotransfectaron los vectores de inserción en las células COS mediante el procedimiento DEAE-Dextrano. Se encontró que los cultivos sobrenadantes contenían niveles de proteínas que oscilaban entre 100-500 ng/ml con la actividad del enlace para las células tumorales L6 positivo, indicando que las células COS eran capaces de reunir y segregar anticuerpos nativos a partir de un cassette de ADN de cadena única biespecífico recombinante.
Adaptación de los vectores de expresión en mamíferos: Una vez se verificó la capacidad de las células COS para expresar dichas moléculas, modificamos los vectores de expresión pCDM8 y piLNXAn para expresar moléculas de anticuerpo de cadena única usando cassettes intercambiables que codifican las regiones de proteínas individuales. Los vectores pCDM8 y piLNX usan bien el citomegalovirus o el promotor y mejorador AMV para conseguir la expresión de los genes insertados en el policonector / región de relleno localizado corriente debajo de las regiones de control. Se alteró esta región para contener dos cassettes de ADNc cotos que flanqueaban el emplazamiento de inserción de la región variable en el policonector. La Figura 1 esquematiza las modificaciones del vector y es una vista en esquema de las modificaciones del vector y la configuración de las regiones variables para las moléculas de cadena única expresadas. Se insertó un fragmento HindIII-SalI que contenía el péptido líder a partir de la región variable de cadena ligera L6 kappa en el extremo 5' del policonector para conseguir la secreción de las moléculas fusionadas a él. Se fusionó en marco un fragmento BclI-XbaI que codificaba la bisagra, las regiones CH2 y CH3 de la IgG1 humana, es decir, una etiqueta molecular, en el extremo 3' del policonector para facilitar la detección y purificación de las moléculas con especificidades diversas. Se conectaron los cassettes de ADN del anticuerpo de cadena única que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera uno con el otro mediante un conector péptido corto y se insertaron como fragmentos SalI-BclI (se usaron algunas veces otros extremos compatibles) entre estos con cassettes cortos de flanqueo de tal manera que se formó un marco de lectura abierto único. Tenemos adaptados por eso los vectores de expresión en mamíferos existentes para conseguir una expresión eficiente de los cassettes de ADNc que codifican moléculas de anticuerpo de cadena única (SCA de cualquier especificidad. El sistema permite la expresión, purificación, selección y alteración rápida de las proteínas de fusión de tal manera que se pueden comparar los cassettes que codifican las diferentes etiquetas moleculares, conectores, y especificidades de enlace por su relativa efectividad en la expresión de las moléculas solubles funcionales.
Construcción y expresión de derivados de anticuerpos L6F_{v}-Ig, CD3 F_{v}-Ig monoespecíficos, y CD3-L6Ig biespecíficos: Se usaron dos diferentes especificidades de enlace como modelos para ensayar el sistema de expresión de anticuerpos de cadena única adaptado. Se aislaron las regiones variables para las cadenas pesada y ligera de anticuerpos dirigidas contra el antígeno tumoral L6 y el receptor de la superficie de la célula T CD3 tal como se ha descrito en Materiales y Procedimientos.
Se fusionaron las regiones variables de anti-L6 o G19-4 en una región de codificación única usando el solapamiento de la extensión PCR para crear un conector (Gly_{4}Ser)_{3} entre el extremo carboxilo de V_{L} y el término amino de
V_{H}.
La figura 2A presenta el marco de lectura abierto único creado por fusión de las secuencias de la región variable de las cadenas ligera y pesada para el anticuerpo G19-4 con el conector (Gly_{4}Ser)_{3}.
Se construyeron los constructos de ADNc que codifican el péptido líder de la región variable de cadena ligera L6 (región flameada), las regiones de enlace del antígeno CD3-L6 (región no matizada) y la región de la IgG1 Fc humana (región matizada) tal como se ha descrito en Materiales y Procedimientos (Figura 2A).
En la Figura 2A Se modificó el vector de expresión en mamíferos pCDM8 mediante la eliminación del fragmento de relleno y la sustitución con las secuencias del adaptador para la expresión de las moléculas de anticuerpo de cadena única. Se insertó un fragmento HindIII-SalI que codificaba el péptido líder a partir de la región variable de cadena ligera de anti-L6 para conseguir la secreción de las moléculas expresadas. Se incluyó corriente abajo la región Fc de la IgG1 como un segmento ACLI-XbaI para facilitar la detección, purificación, y caracterización de los constructor de fusión. Se usó también una secuencia etiqueta molecular más pequeña que codificaba un fragmento del bucle V3 de gp110 de HIV para los constructos CD3. Se insertó, entre la secuencia líder y la etiqueta, un cassette de fusión entre V_{L} y V_{H}, con las dos regiones separadas por un aminoácido conector (Gly_{4}Ser)_{3}.
Se podrían construir moléculas biespecíficas insertando un segundo cassette V_{L}-V_{H} en el emplazamiento BclI entre el primer cassette y la región Fc. Se separaron las dos especificidades de enlace una de la otra mediante un oligonucleótido que codificaba un péptido conector helicoidal de 27 aminoácidos para evitar el impedimento estérico y mejorar la solubilidad.
Las secuencias que se presentan muestran las uniones entre cada región, con aminoácidos introducidos durante la construcción indicada en letra tipo grueso.
Se insertaron los cassettes de fusión de la región variable en el vector de expresión modificado para crear los genes de fusión esquematizados en la Figura 2A y transfectados en células COS. Se recogió medio agotado libre de suero, y las proteínas purificadas mediante cromatografía de afinidad de la columna A. Se sondaron western blots de proteínas sometidos a SDS-PAGE con reducción o sin reducción con IgG antihumana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina tal como se muestra en la Figura 2B. Los paneles A y B ilustran que las proteínas de fusión L6Fv-Ig y CD3Fv-Ig migraron como especies únicas de M_{r} 55.000 bajo condiciones de reducción o no reducción, el tamaño aproximado esperado para estos derivados de anticuerpo de cadena única. De manera similar, la molécula biespecífica CD3-L6FvIg migró como una especie única de M_{r} \sim 94.000 bajo cualquiera de estas condiciones. Mediante comparación el dímero L6 mAb quimérico o L6 de tipo salvaje (WTD) constituidos por regiones variables de ratón fusionadas con secuencias de tipo salvaje para bisagra humana-CH2-CH3, presentaron diferencias de mobilidad significativa dependiendo de la reducción y en el grado de desnaturalización, indicando las regiones constantes de cadena pesad de estas moléculas asociadas mediante puentes disulfuro para formar dímeros. De manera ocasiona, los western blot de SDS-PAGE no reductor presentaron una banda muy pálida para las moléculas monoespecíficas que migraban a M_{r} > 100.000 o para la molécula biespecífica que migraba a M_{r} > 200.000.
El cassette de fusión V_{L}-V_{H} se insertó en el vector adaptado de tal manera que se creó un marco de lectura abierto único incluyendo el péptido señal de cadena ligera anti-L6, la región variable de fusión que codifica la especificidad del anticuerpo de enlace, y la región Fc de la IgG1 humana. El cassette de fusión biespecífico CD3-L6 se creó fusionando los cassettes CD3 y L6 mediante un péptido conector helicoidal corto, y se insertó tal como para los constructor monoespecíficos. La etiqueta molecular utilizada en los ensayos iniciales del sistema de expresión fue un derivado mutante del Fc humano en el cual los disulfuros bisagra se cambiaron a serinas para reducir o eliminar el enlace disulfuro intracadena. Estos constructor de cadena única se transfectaron de manera individual en células COS y las proteínas de fusión se purificaron a partir de cultivos sobrenadantes mediante cromatografía de afinidad sobre proteína A inmobilizada.
Los rendimientos de la proteína purificada fueron típicamente de aproximadamente 2 mg/litro para la proteína de fusión L6Ig, de aproximadamente 10 mg/litro para CD3Ig, y de aproximadamente 0,5 mg/litro para la molécula biespecífica CD3-L6Ig. Se muestran en la Figura 2B los Western-blot de las proteínas se sometieron a SDS-PAGE no reductor y se sondearon con IgG anti-humana de cabra conjugada con fosfatasa alcalina. Es visible una especie única en las bandas CD3Ig y L6Ig migrando a Mr 55.000, el tamaño aproximado esperado para estos derivados de anticuerpos de cadena única, pero no en la banda control negativa (Figura 2B). La molécula biespecífica CD3-L6Ig migra a aproximadamente Mr-95.000-98.000, con una banda de peso molecular mayor visible a Mr > 200.000 (Figura 2B).
Actividades de enlace de las proteínas de fusión L6Ig, CD3Ig, y CD3-L6Ig: para investigar las actividades funcionales de nuestros derivados de anticuerpos de cadena única y verificar que las moléculas fueron capaces de enlazar con el antígeno específico, ensayamos en primer lugar el enlace de las proteínas de fusión de la región Fc con las células que expresan el antígeno diana. La línea de células tumorales humana H2981 expresa altos niveles del antígeno diana L6 pero no de CD3 o BR96, mientras que la línea de células tumorales humana H3396 expresa altos niveles de BR96, pero no de L6 o CD3, y la línea de células Jurkat humana expresa CD3, pero no L6 o BR96. Se detectó el enlace mediante el análisis clasificador de células activadas mediante fluorescencia usando Ig anti-humano de cabra conjugado con FITC como reactivo de la segunda etapa. Tal como se muestra en la Figura 3, las proteínas de fusión enlazan de manera específica con las células que expresan el antígeno diana similar al del anticuerpo nativo del padre (es decir, anticuerpos anti-L6 nativos y G19-4), pero fracasa al enlazar con células que carecen de niveles detectables del antígeno. La proteína de fusión biespecífica CD3-L6Ig enlaza con las células Jurkat y H2981, una indicación indirecta de que las moléculas poseen más de una especificidad. Se observaron resultados similares si se consiguió la detección usando IgG anti-humano de cabra o un anticuerpo anti-idiotópico FITC conjugado dirigido contra la especificidad que enlaza L6.
Se incubaron derivados de anticuerpo a 10 \mug/ml con células tumorales H2981 (L6 positivas), células Jurkat (CD3 positiva), o células tumorales H3396 (BR96 positiva) (Figura 3). Se lavaron las células y se incubaron con IgG anti-humano conjugado con FITC como reactivo de la segunda etapa. Se analizaron a continuación un total de 10.000 células teñidas mediante FACS (Figura 3). La Figura 3 muestra que L6Ig, CD3Ig, y CD3-L6 Ig enlazan con células que expresan el antígeno diana.
Con el fin de explorar las propiedades biológicas de las proteínas de fusión, escogimos diferentes ensayos funcionales basados en las propiedades esperadas o deseadas de cada molécula individual. Los resultados para cada molécula de cadena única se presentarán por tanto de manera separada comenzando con los derivados de anticuerpos de cadena única L6Ig.
Efectos de las variaciones en la secuencia de la etiqueta molecular sobre las actividades de enlace de las proteínas de fusión L6: Se construyeron diversas secuencias diferentes de etiquetas moleculares tal como se ha descrito en Materiales y Procedimientos y se fusionaron con la región de enlace L6 para determinar si los constructos de fusión expresados podrían detectarse y purificarse usando estas regiones como dianas de enlace para la proteína A o los anticuerpos específicos dirigidos contra ellos. El C-kappa, el péptido HIV, y el péptido FLAG fracasaron todos al funcionar como etiquetas moleculares eficaces cuando se fusionaron de manera directa con la región de enlace L6. estos tres péptidos dieron como resultado un fracaso de las células transfectadas para expresar L6 reconocible. Incluso cuando la detección no depende de la etiqueta molecular pero utiliza los anticuerpos antiidiotipo L6, no fueron detectables proteínas de fusión funcionales en los ensayos de enlace con células tumorales H2981.
Efectos de la variación en la región Fc sobre las funciones del efector mediante derivados L6: Se construyeron otros derivados L6, incluyendo un sFv simple de las regiones de enlace L6 con etiqueta no en serinas (HS1). molecular (sFv) y diversas fusiones -Ig ligadas a diferentes regiones mutantes Fc. Se proporcionó a cada constructo Fc una designación basada en las mutaciones introducidas en la bisagra y/o la región CH2, tal como se ilustra en la Figura 4A y 4B. El dímero de tipo salvaje (WTD) es de tipo salvaje para todas las secuencias de la región Fc, idéntico al anticuerpo nativo para los residuos de aminoácidos en esta región. Los constructor de monómeros contiene cambios de secuencias, es decir, residuos de cisterna, que mutan los disulfuros bisagra. El monómero mutante 1 (conocido también como mut1) (HS2) contiene una prolina que cambia a serina en el residuo 238 en la región CH2, una región importante en la mediación de las funciones del efector IgG1. El monómero mut1 (HS3) se muta por diversos residuos (234-238) en esta región de CH2. El dímero mut1 (DM1) contiene secuencias de tipo salvaje en la región bisagra de la región Fc, pero es también mutante para las secuencias CH2 que codifican los residuos 234-238.
Los Sfv para L6 contienen un codon STOP después del cassette de fusión más bien que cualquier otra secuencia péptido de etiqueta molecular. Cada una de estas moléculas se construyó y transfectó en células COS, y expresó proteínas purificadas sobre proteína A sefarosa o una columna de anticuerpo antiidiotipo L6 inmobilizado. Se compararon las proteínas de fusión con el anticuerpo L6 quimérico nativo y los derivados Fab' en análisis de enlace con saturación e inhibición (Figuras 4C-D). Los mutantes L6 Fc generaron curvas de saturación muy similares a aquellas de los anticuerpos nativos (Figura 4C9, mientras que la proteína de fusión Sfv enlaza muy mal (Figura 4B). Se llevaron a cabo los estudios de inhibición incubando cantidades crecientes del anticuerpo de ensayo con células tumorales antes de la adición de L6 quimérico conjugado con FITC. Se observaron de nuevo curvas similares para todas las fusiones de -Ig y el anticuerpo quimérico (Figura 4D), con la Sfv y la Fab' presentando capacidad reducida para inhibir el enlace del anticuerpo nativo (Figura 4C). A pesar del fracaso para competir con o inhibir el enlace del anticuerpo nativo, el comportamiento de la proteína de fusión Sfv fue ligeramente mejor que el de la molécula L6 Fab preparada químicamente en este experimento.
Se midieron las capacidades relativas de estas moléculas para mediar las funciones efectoras asociadas con la IgG1 humana mediante los ensayos de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y la lisis específica se representó de manera gráfica en función de la concentración del anticuerpo. Mientras que ninguno de los mutantes defectores en la región bisagra fueron afectados en su capacidad para mediar la ADCC, todos los mutantes de la región CH2 fracasaron en mediar este proceso. De manera sorprendente, descubrimos que aunque el L6 quimérico media CDC muy bien, ninguno de los derivados L6 fueron capaces de estimular la lisis mediada por el complemento de los tumores diana.
La(s) región(es) variable(s) del anticuerpo de murina dirigido contra el antígeno tumoral humano L6 se fusionaron con diversos derivados de la región Fc de la IgG1 humana expresada en las células COS, y las proteínas de fusión purificadas mediante cromatografía de afinidad (Figuras 10A-D).
Se indica cada región Fc construida con los cambios de secuencia indicados por los aminoácidos subrayados (Figuras 10A-D). Se comparó la proteína purificada a partir de cada constructo con el L6 quimérico en los ensayos de saturación e inhibición. De manera adicional, se midieron las capacidades de estas moléculas para mediar las funciones del efector IgG1 normal tales como ADCC y CDC mediante el marcado de las células tumorales H2981 durante 2 horas con 51Cr, lavado, y añadiéndolas a IMDM + FCS al 10% que contenía diluciones en serie 10 veces de anticuerpo, y PBL humano (ADCC) o complemento de conejo (CDC). Los ensayos se incubaron durante 4,5 horas, se hicieron girar, y los recuentos liberados se midieron con un contador gamma. Los valores representan los promedios de los cultivos por triplicados (SEM < 10%).
Los anticuerpos de cadena única CD3 presentan actividades biológicas cualitativamente similares pero cualitativamente distintas del anticuerpo nativo: Se construyeron diversas proteínas de fusión CD3 diferentes, incluyendo una -Ig de fusión, una proteína de fusión del péptido -HIV, un V_{L} - V_{H} sFv (no etiqueta), y la molécula biespecífica CD3-L6 Fv-Ig.
El péptido HIV sirvió como una etiqueta molecular eficaz cuando se fusionó con CD3.  Esto permitió la detección y purificación de las proteínas de fusión de cadena única CD3. Las moléculas etiquetadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad usando proteína A inmobilizada (fusiones -Ig) o anticuerpo 110.3 (fusiones HIV). Se usó el Sfv simple como una solución de sobrenadante filtrado, y se estimaron las concentraciones aproximadas valorando la capacidad del sobrenadante para inhibir el enlace del anticuerpo G19-4 con las células Jurkat. Deseamos investigar las respuestas celulares generadas mediante el enlace de estas moléculas alteradas con el complejo receptor de la célula T CD3. Se enlazó cada molécula con indo-1 cargado con linfocitos de sangre periférica o células T y se monitorizó la movilización del calcio intracelular mediante citometría de flujo. Tal como se muestra en las Figuras 5A-D, se aumentó la actividad señaladora transmembrana para las proteínas de fusión de HIV e Ig cuando se las comparó con las concentraciones equivalentes de anticuerpo G19-4. Aunque el Sfv simple generó una señal de calcio, no fue tan intensa o prolongada como la observada para el anticuerpo nativo.
Se muestran en la Figura 11 las secuencias de las regiones variables anti-CD3, que incluyen las secuencias de unión para los derivados mono- y biespecíficos. Las proteínas de fusión Ig se purificaron mediante cromatografía de afinidad usando proteína A inmobilizada y el Sfv se usó como sobrenadante filtrado. Se estimó la concentración de Sfv valorando la capacidad de la transfección del sobrenadante para bloquear el enlace de concentraciones conocidas de células Jurkat en G19-4 Mab padre. Para analizar la actividad señaladora de la molécula CD3Fv-Ig, se ensayó ésta por su capacidad para inducir la fosforilación de la tirosina de PLC\gammal. Se estimularon células T de Jurkat con el CD3Fv-Ig o el G19-4 Mab nativo y se separaron las proteínas de los lisados celulares mediante SDS-PAGE transferido en la membrana PVDF, y se sondaron con anti-p-tyr o anti-PLC\gammal. De manera sorprendente, encontramos que el CD3Fv-Ig indujo una fosforilación fuerte de la tirosina de las proteínas celulares en los lisados celulares completos incluyendo PLC\gammal y que se asoció una mayor cantidad de pp35/36 con PLC\gammal (Figuras 12A-B). Por otra parte, las proteínas CD3 Fv-Ig y CD3 Sfv indujeron flujos de calcio en PBL que fueron mayores en magnitud que aquellos observados para concentraciones equivalentes de G19-4 Mab nativo.
En la Figura 11, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anti-CD3 mab G19-4 se clonaron por PCR. El nucleótido y la secuencia de proteína del gen de fusión construido a partir de estos cassettes de ADNC se muestran con el conector (Gly_{4}Ser)_{3} en negrita. El término amino del cassette de fusión V_{L}-V_{H} se fusionó en el emplazamiento SalI con el péptido líder de la región variable de cadena ligera L6, y el término carboxilo se fusionó de manera directa con la región bisagra de la región Fc en el emplazamiento ACLI o a un péptido conector "helicoidal" corto para construir el derivado del anticuerpo CD3-L6FvIg biespecífico. Se fusionaron las regiones variables para L6 en marco al extremo opuesto del conector "helicoidal" tal como se muestra en las Figuras 1 y 2.
En las Figuras 12A-B, se estimularon las células Jurkat (10^{7} por muestra) durante 1 minuto (min) o 3 min con anti-CD3 Mab G19-4 nativo a 5, 20 u 80 \mug/ml o con CD3Fv-Ig a 1, 5, o 20 \mug/ml, tal como se indica. Se inmunoprecipitaron las proteínas a partir de los lisados celulares con anti-p-tir de conejo (Panel A) o antisuero de PLC\gammal (Panel B) y se recuperaron con proteína A Sefarosa, se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron en nitrocelulosa y detectaron con anti-p-tyr de conejo y proteína A marcada con ^{125}I.
Las Figuras 5A-D son gráficos de líneas que muestran que los derivados de fusión CD3Fv presentan niveles diferentes de actividad señaladora transmembrana. Las Figuras 5A-B muestran que el CD3FvIg moviliza el calcio intracelular en las células T de la sangre periférica. Se usaron la citometría de flujo y el tinte indo-1 enlazado con calcio para monitorizar la concentración del calcio libre intracelular ([Ca^{2+}]) siguiendo la estimulación con CD3FvIg (__ . __ .__), CD3 Mab nativo (- - - -), o un control de enlace de células no T-L6FvIg (. . . . .). Se añadió cada estímulo (2 \mug) a las células T cargadas con indo-1 a 1 min (flecha) donde 130 nm = células restantes, y como células que responden como porcentajes.
Las Figuras 5C-D muestran que el pretratamiento con CD3FvIg desensibiliza la respuesta de las células T de la sangre periférica con la posterior estimulación del CD2 entrecruzado. Se incubaron células cargadas con Indo-1 con 1 \mug de CD3FvIg, 2 \mug de CD3 mAb nativo, o L6FvIg (control del enlace de las células no T) durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Se añadió anti-CD2 mAb biotinilado (5 \mug) a 1 min y se entrecruzó por avidita (20 \mug) a 5 min. Las respuestas para el CD2 entrecruzado fueron monitorizadas a continuación durante 5 min. Los datos se representan como ([Ca^{2+}]) donde 130 nm = células restantes (panel A), y como células que responden como porcentajes
(panel B).
En los ensayos de proliferación de los linfocitos de sangre periférica y células T purificadas que responden a la estimulación con los derivados de anticuerpos CD3 a diversas concentraciones, encontramos que todos los derivados CD3 activaron las células T. En la Tabla 1, se muestran las respuestas proliferativas medidas a los tratamientos de anticuerpos de 1 \mug/ml. Se observó un modelo similar de respuestas proliferativas a 0,2 y 5 \mug/ml. Los datos indican que el enlace de los derivados CD3 obtiene respuestas proliferativas en células T similares a aquellas observadas con G19-4 nativo (en comparación con el CD3Fv-Ig) o el fragmento Fab (en comparación con el sFv) del anticuerpo de murina. Las moléculas fabricadas mediante ingeniería genética estimulan ligeramente niveles más fuertes de proliferación a partir de las células T purificadas, y niveles ligeramente débiles a partir de PBL, con la excepción de CD3Fv-Ig que actúa en sinergia con PMA para producir respuestas proliferativas más fuertes en PBL que aquellas observadas con G19-4 nativo.
Debido a que las dos proteínas de fusión CD3 etiquetadas presentan actividad señaladora transmembrana más fuerte que la del anticuerpo nativo, deseamos determinar como afectaba a estas moléculas la proliferación de células T. Se incubaron linfocitos de sangre periférica y células T purificadas durante 72 horas con derivados de anticuerpos a diversas concentraciones y pulsados con timidita tritiada durante 6 horas antes de cosechar y contar. La Tabla 1 presenta los resultados de los tratamientos con anticuerpos a 1 \mug/ml. Se observó un modelo similar de respuestas proliferativas tanto a 0,2 como a 5 \mug/ml.
TABLA 1 Las moléculas de cadena única CD3 estimulan la proliferación de células T en presencia de monocitos y son sinérgicas para la activación de las células T en presencia de PMA 0 9.3
Proliferación (3 días, cpm x 10^{-3})
Estímulo Células T purificadas PBMC + medio Células T purificadas
+ (2\mug/ml 9.3) + (0,5 ng/ml PMA)
Medio 0,8 2,7 6
G19-4 11,2 49 83,6
CD3FvIg 9,3 55,6 112,5
CD3HIV 105 30,5 103
G19-4 Fab 58,4 2,1 N. D.
OKT3 6,15 77 76
BC3 2,95 0,8 87,3
CD3STOP (25ul) 55 3,4 65
L6FvIg 0,5 2,6 5,7
Se midió la proliferación tras 72 horas de cultivo mediante células pulsantes durante 6 horas con 1 \muCi/pocillo [^{3}H]-timidina. Se purificaron células T a partir de monolitos y células B mediante dos adherencias plásticas seguido por un pasaje sobre columnas de nylon lana.
Los datos indican que bajo las condiciones examinadas aquí, el enlace de los derivados CD3 obtiene respuestas proliferativas en las células T similares a aquellas observadas con G19-4 (Ig de fusión) o el fragmento Fab (fusiones HIV y STOP) del anticuerpo de murina. Las moléculas fabricadas mediante ingeniería genética tendieron a estimular los niveles ligeramente más fuertes de proliferación entre las células T purificadas, y niveles ligeramente más débiles entre PBL, aunque las diferencias son insignificantes en la mayor parte de ejemplos. La única excepción de este modelo es la respuesta proliferativa más fuerte generada mediante los constructor CD3FvIg y CD3HIV en sinergia con PMA cuando se los compara con G19-4.
La proteína de fusión biespecífica CD3-L6 media la adhesión entre las células tumorales H2981 u las Jurkat. Se usó un ensayo de adhesión celular anteriormente desarrollado (Linsley y col., 1990a) para determinar si una molécula biespecífica CD3-L6 única fue capaz de enlazar con CD3- o L6- expresando células de manera simultánea. Se incubaron en primer lugar células Jurkat con anti-CD3 o con CD3-L6FvIg. Se lavaron las células y se añadieron a las células H2981 adherentes preincubadas con o sin L6FvIg. El examen microscópico de las monocapas de H2981 (Figura 6) demostró que la proteína CD3-L6FvIg media la adhesión entre las células Jurkat y las H2981 en presencia de EDTA, pero únicamente cuando los receptores CD3 y L6 no se bloquearon por el ligando. Para demostrar cualitativamente que las moléculas fueron verdaderamente bifuncionales, se premarcaron células Jurkat con ^{51}Cr y a continuación se incubaron con la proteína de fusión y las células tumorales H2981. El número de recuentos enlazados con la monocapa sin marcar en presencia de la proteína de fusión biespecífica CD3-L6 fue mucho mayor que para las células preenlazadas con los anticuerpos CD3 y L6 no ligados.
La proteína de fusión biespecífica CD3-L6Ig hace diana en la citotoxicidad de las células T respecto de las células tumorales H2981 (Figura 7). Se marcaron células tumorales H2981 durante 2 horas con ^{51}Cr y se incubaron con estímulos de anticuerpos y PBL en el efector para relaciones diana de 10:1 y 100:1 (Figura 7). Se midió la liberación de cromo tal como se ha descrito en materiales y Procedimientos, y se tabuló la lisis específica para cada derivado de anticuerpo a partir de cultivos por triplicado (SEM < 12%) (Figura 7). Para los ensayos de inhibición, se incubaron los derivados monoespecíficos de CD3 o L6Ig, con el tipo celular apropiado antes de la adición de la molécula biespecífica CD3-L6Ig (Figura 7). La preincubación con moléculas monoespecíficas fue incapaz de inhibir la estimulación de la citotoxicidad mediante el constructo biespecífico (Figura 7).
La proteína de fusión biespecífica CD3-L6 hace diana en la citotoxicidad de las células T respecto de las células tumorales H2981. A continuación, deseamos determinar las consecuencias biológicas de acoplar estas dos regiones de enlace con el antígeno en una molécula única. Razonamos que las moléculas bifuncionales fabricadas mediante ingeniería genética que promueven la adhesión entre las células tumorales y las células T pueden alterar la naturaleza o magnitud de las respuestas al enlace del receptor.
Para eliminar las contribuciones de fondo de las funciones del efector mediadas por IgG, se ligó la porción de enlace del antígeno de la molécula con el monómero mutante de Fc que fracasa al mediar estas funciones como resultado de la mutación de una prolina a serina en CH2 y diversas sustituciones de cisterna a serina en la región bisagra. Se llevó a cabo un ensayo de citotoxicidad estándar usando células tumorales H2981 como las dianas para la lisis. Se usó el PBL restante como efector de las células para determinar si las células restantes o nativas podrían activarse para dirigir su citotoxicidad hacia el tumor (Figura 7).
A relaciones efector diana de 10:1, la molécula CD3-L6FvIg media la lisis específica un 30%, mientras que a relaciones de 100:1, la lisis específica sube al 71%. El nivel de lisis específica para CD3FvIg y L6FvIg mezclados conjuntamente, o para cualquier molécula sola oscila entre un 3% a un 5% a E:T de 10:1, y un 9% a un 20% a E:T de 100:1. Aunque los niveles de muerte se redujeron ligeramente, los derivados de los anticuerpos CD3FvIg y L6FvIg fracasaron hasta bloquear de manera completa la citotoxicidad diana mediada por la proteína de fusión CD3-L6. Se usaron también como efectores blastos de células T activados con PHA, pero presentaron altos niveles de muerte de fondo.
La proteína de fusión biespecífica CD3-L6Ig estimula altos niveles de proliferación de las células T cuando se enlaza con las células tumorales H2981 (Figura 8). Se aislaron PBL y se cultivaron en presencia de los estimuladores indicados de proliferación de las células T y se irradiaron células tumorales H2981. se añadieron estimuladores en solución a 1 o 10 \mug/ml. Para experimentos de preenlace, se irradiaron células tumorales H2981 y se incubaron con 10 \mug/ml de derivados de anticuerpos durante una hora en hielo, se lavaron varias veces para eliminar el anticuerpo no enlazado, y se añadieron a relaciones variables en PBL a 5 x 10^{4} células/pocillo. Tras tres días de cultivo, se midió la proliferación mediante captación de [^{3}H] timidita durante 6 horas. Se determinaron los valores mediante cultivos por cuadruplicado para cada tratamiento (SEM < 15%).
La proteína de fusión biespecífica CD3-L6 estimula altos niveles de proliferación de células T in Vitro . Investigamos si estimulando el receptor de la superficie de la célula T CD3 (complejo CD3/TCR) mediante la proteína de fusión CD3-L6FvIg fue estimulatorio para la proliferación de células T. Los ensayos de proliferación se llevaron a cabo usando el PBL restante incubado con células tumorales H2981 irradiadas y el estímulo en solución (proteína de fusión).
De manera alternativa, se preenlazaron las proteínas estimulantes con las células tumorales irradiadas y se eliminó la proteína no enlazada mediante lavados diversos antes de la inclusión en el ensayo, eliminando las moléculas incapaces de enlazar con el antígeno L6 a partir de la contribución a la estimulación de las células T a través de CD3. Las células tumorales H2981 tendieron a enlazar no específicamente incluso con aquellos derivados de anticuerpos mutados en la región Fc, de tal manera que eliminan esta fuente de fondo no específica del ensayo, se incubó un anticuerpo irrelevante con las células antes de la adición del estímulo de interés. La Figura 8 presenta los resultados de la solución y los experimentos de proliferación preenlazados.
Los niveles de proliferación fueron marcadamente mejorados en presencia de la proteína de fusión biespecífica a
10 \mug/ml, y se observaron niveles significativos de proliferación incluso a 1 \mug/ml. El L6FvIg preenlazado con las células tumorales antes de la adición de la molécula biespecífica elimina esta estimulación de la proliferación de células T inducida por las células tumorales recubiertas. La proteína de fusión CD3IG podría estimular niveles significativos de proliferación cuando se presenta en solución independientemente de la presencia o ausencia de células tumorales. Estas moléculas fueron evidentemente eliminadas en las etapas de lavado de los ensayos de preenlazado de las células tumorales debido únicamente a los niveles de fondo de la proliferación se observaron bajo estas condiciones: Estos resultados demuestran la capacidad de la proteína de fusión biespecífica CD3-L6 para dirigir la citotoxicidad de la célula T y la proliferación estimulada de la célula T cuando se enlaza con las células tumorales H2981.

Claims (17)

1. Un vector de expresión que codifica una proteína de fusión biespecífica biológicamente activa que comprende un cassette de cadena única biespecífico recombinante que comprende (1) una secuencia de ADN que codifica una primera región de enlace capaz de enlazar una diana, (2) una secuencia de ADN que codifica una segunda región de enlace capaz de enlazar una diana, cada región capaz de enlazar una diana diferente, y (3) un conector que codifica un péptido helicoidal hidrófilo que liga la secuencia de ADN que codifica la primera región de enlace y la secuencia de ADN de la segunda región de enlace,
en el que la primera región de enlace enlaza con moléculas seleccionadas entre el grupo constituido por CD1, CD2, CD3, TcR, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66. CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, B7, B7(2), CTLA4, BR96, GP39, LFA-3, L6, ICAM-2, e interleucina (IL) 1-8, y,
en el que la segunda región de enlace enlaza con moléculas seleccionadas entre el grupo constituido por CD1, CD2, CD3, TcR, CD3/TcR, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CDw32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a,b, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49, CDw50, CD51, CDw52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62, CD63, CD64, CDw65, CD66. CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CD76, CDw78, B7, B7(2), CTLA4, BR96, GP39, LFA-3, L6, ICAM-2, e interleucina (IL) 1-8, y,
en el que el conector comprende una secuencia de ADN que codifica los aminoácidos hidrófilos y al menos un pentámero EEAKK.
2. Un vector de expresión de la reivindicación 1 en el que el péptido conector helicoidal comprende la SEC ID
Nº: 12.
3. Un vector de expresión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que comprende una secuencia de ADN que codifica una etiqueta molecular.
4. Un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la primera región de enlace enlaza con una cualquiera de CD3, TcR, CD3/TcR, L6, CD28, CD40, B7, B7(2), CTLA4, o GP39 y en el que la segunda región de enlace enlaza con una cualquiera de CD3, TcR, CD3/TcR, L6; CD28, CD40, B7, B7(2), CTLA4, GP39.
5. Un vector de expresión de la reivindicación 4 en el que la primera región de enlace es reactiva con CD3, TcR, CD3/TcR, CD28 o CTLA4 y la segunda región de enlace es reactiva con L6.
6. Un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la primera región de enlace es al menos un fragmento de un antígeno de la superficie de la célula.
7. Un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la segunda región de enlace es al menos un fragmento de un antígeno de la superficie de la célula.
8. Un vector de expresión de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el antígeno de la superficie de la célula es CD3, L6, CD28 o B7.
9. Un vector de expresión de la reivindicación 8, en el que la primera región de enlace es al menos un fragmento de la molécula B7 y la segunda región de enlace es reactiva con L6.
10. Un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la primera región de enlace es una región o regiones variables de un anticuerpo.
11. Un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la reivindicación 10, en el que la segunda región de enlace es una región o regiones variables de un anticuerpo.
12. Un vector de expresión de la reivindicación 11 designado CC9-2 (ATCC Nº 69235).
13. Una célula eucariota transfectada in vitro mediante el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
\newpage
14. Una célula eucariota transfectada in vitro mediante el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la célula eucariota se selecciona del siguiente grupo que consiste de ovina, porcina, de murina o bovina.
15. Un procedimiento para producir una proteína de fusión biespecífica biológicamente activa que comprende cultivar las células de la reivindicación 13 ó 14 con el fin de producir la proteína y recuperar la proteína producida de esta manera.
16. Un procedimiento para producir una proteína de fusión biespecífica biológicamente activa en una célula de mamífero que comprende:
(a)
transfectar la célula de mamífero con el vector de expresión recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12;
(b)
cultivar la célula de mamífero transfectada de esta manera en la etapa (a); y
(c)
recuperar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa producida de esta manera mediante la célula de mamífero cultivada.
17. Un procedimiento de la reivindicación 16, en el que la recuperación de  la proteína biespecífica biológicamente activa comprende:
(a)
identificar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa mediante la presencia de la etiqueta molecular; y
(b)
separar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa que tiene la etiqueta molecular identificada de esta manera de las moléculas sin etiqueta molecular, con el fin de recuperar la proteína de fusión biespecífica biológicamente activa producida de esta manera mediante la célula de mamífero cultivada.
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