ES2258099T3

ES2258099T3 - Regulacion de la serina proteasa similar a la prostatina humana.

Info

Publication number: ES2258099T3
Application number: ES01967085T
Authority: ES
Inventors: Yonghong Xiao
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2021-06-22
Also published as: DK1297006T3; WO2001098466A2; ATE317399T1; US7538205B2; EP1297006B1; EP1297006A2; DE60117155T2; WO2001098466A3; DE60117155D1; AU2001287555A1; US20060154293A1; US20040141962A1; US7049420B2; PT1297006E

Abstract

Un polinucleótido aislado seleccionado entre el grupo constituido por a) un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº 6; b) un polinucleótido que comprende la secuencia SEQ ID Nº 5; c) un polinucleótido cuya secuencia se desvía de las secuencias de polinucleótidos especificadas en (a) y (b) debido a la degradación del código genético y que muestra la actividad biológica de (a)

Description

Regulación de la serina proteasa similar a la prostatina humana.

Campo técnico de la invención

La invención se refiere al área de la regulación enzimática. Más particularmente, la invención se refiere a la regulación de actividad enzimática de tipo prostatina humana.

Antecedentes de la invención

Las serina proteasas están implicadas en una diversidad de funciones biológicas, incluyendo comunicación célula -
célula, migración de células, y remodelación de tejidos. De este modo, existe una necesidad en la técnica para identificar las serina proteasas humanas adicionales que se pueden regular para proporcionar efectos terapéuticas.

Resumen de la invención

Un objeto de la primera invención es proporcionar reactivos y procedimientos de regulación de actividad enzimática de tipo prostatina humana. Estos y otros objetos de la invención están proporcionados por una o más de las realizaciones descritas más adelante.

Una realización de la invención es un polipéptido enzimático de tipo prostatina que comprende

la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6.

Todavía otra realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes que disminuyen la actividad enzimática de tipo prostatina humana. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con el polipéptido enzimático de tipo prostatina que comprende:

la secuencias de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6.

Se detecta la unión entre el compuesto de ensayo y el polipéptido enzimático de tipo prostatina. Un compuesto de ensayo que se une al polipéptido enzimático de tipo prostatina se identifica en consecuencia como un agente potencial para la disminución de la actividad enzimática de tipo prostatina.

Otra realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes que disminuyan la actividad enzimática de tipo prostatina humana. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un polinucleótido que codifica un polipéptido enzimático de tipo prostatina, en la que el polinucleótido comprende

la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 5.

Se detecta la unión del compuesto una actividad enzimática de tipo prostatina humana. Se identifica un compuesto de ensayo que se une al polinucleótido como un agente potencial para disminuir la actividad enzimática de tipo prostatina humana. El agente puede actuar mediante la disminución de la cantidad de la enzima de tipo prostatina que interactúa con el ARNm enzimático de tipo prostatina.

Otra realización de al invención es un procedimiento de selección de agentes que regulan la actividad enzimática de tipo prostatina humana. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un polipéptido enzimático de tipo prostatina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 6.

Se detecta una actividad enzimática de tipo prostatina del polipéptido. Un compuesto de ensayo que incrementa la actividad enzimática de tipo prostatina del polipéptido con relación a la actividad enzimática de tipo prostatina en ausencia del compuesto de ensayo se identifica por lo tanto como un agente potencial para aumentar la enzimática de tipo prostatina humana. Un compuesto de ensayo que disminuye la actividad enzimática de tipo prostatina del polipéptido con relación a la actividad enzimática de tipo prostatina humana en ausencia del compuesto de ensayo se identifica por lo tanto como un agente potencial para la disminución de la actividad enzimática de tipo prostatina humana.

Incluso otra realización de la invención es un procedimiento de selección de agentes que disminuyen la actividad enzimática de tipo prostatina humana. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un producto enzimático de tipo prostatina de un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 5.

Se detecta la unión del compuesto de ensayo al producto enzimático de tipo prostatina. Se identifica por lo tanto un compuesto de ensayo que se une al producto enzimático como un agente potencial para disminuir la actividad enzimática de tipo prostatina humana.

Todavía otra realización de la invención es un procedimiento de reducción de la actividad enzimática de tipo prostatina humana. Una célula se pone en contacto con un reactivo que se une específicamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido enzimático de tipo prostatina o el producto codificado por el nucleótido, en el que el polipéptido comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 5.

Por lo tanto, la actividad enzimática de tipo prostatina en la célula disminuye.

De este modo la invención proporciona reactivos y procedimientos para regular la actividad enzimática de tipo prostatina humana que se puede usar entre otros, para suprimir la actividad metastático de células malignas.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido enzimático de tipo prostatina (SEQ ID Nº: 1).

Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la Fig. 1 (SEQ ID Nº: 2).

Fig. 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína identificada por Swiss Prot Nº de acceso Q16651 (SEQ ID Nº: 3).

Fig. 4 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido enzimático de tipo prostatina (SEQ ID Nº: 4).

Fig. 5 muestra la secuencia de ADN que codifica un polipéptido enzimático de tipo aprostatina (SEQ ID Nº: 5).

Fig. 6 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN de la Fig. 5 (SEQ ID Nº: 6).

Fig. 7 muestra el alineamiento de la enzima de tipo prostatina como se muestra en la SQ ID Nº: 2 con la proteína humana identificada por Swiss Prot Nº de acceso Q16651 (SEQ ID Nº: 3).

Fig. 8 muestra los resultados de investigación el sitio anterior.

Fig. 9 muestra lo resultados de investigación de BLOQUES.

Fig. 10 muestra el alineamiento de BLAST contra swiss/Q16651/PSS8_HUMANO.

Fig. 11 muestra la predicción de genes.

Fig. 12 muestra la expresión relativa de la enzima de tipo prostatina en diversos tejidos humanos.

Fig. 13 muestra la expresión relativa de la enziam de tipo prostatina en diversos tejidos y células respiratorios humanos. Clave: HBEC = células epiteliales bronquiales humanas cultivadas; H441 = células de tipo Clara; SMC = células de músculo liso de las vías áreas cultivadas; SAE = células epiteliales de las vía áreas pequeñas cultivadas,
AII = células de tipo II alveolares cultivadas primarias; Mono = monocitos; Cult. Mono = monocitos cultivados (de tipo macrófago).

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido enzimático de tipo prostatina y que se selecciona entre el grupo constituido por:

1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de tipo prostatina que comprende:

la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 6.

2. un polinucleótido que comprende la SEQ ID Nº: 5;

3. un polipéptido cuya secuencia deriva de la secuencia de polinucleótidos especificada en (a) a (c) debido a la degeneración del código genético; y que muestra la actividad biológica de 1.

La enzima de tipo prostatina humana como se muestra en la SEQ ID Nº: 2 es 47% idéntica a en 243 aminoácidos a la proteína humana identificada por Swiss Prot Nº de acceso Q16651 (SEQ ID Nº: 3) y anotada como precursor de prostatina (Fig. 1). La prostatina es una serina proteasa de tipo tripsina que se ha purificado a partir de fluido seminal humano y se localiza en las células epiteliales y conductos de la glándula prostática, así como n el colon, pulmón, páncreas, glándula salivar, hígado, y bronquios. (Yu y col., J. Biol. Chem. 269, 11843 - 48, 1994). La enzima de tipo prostatina humana contiene una región tripsina - serina y una tripsina - histidina como se muestra en la figura 1. Otros dominios identificados en la enzima de tipo prostatina humana incluyen dominios de fibronectina, dominios Kringle, y dominios Apple, como se muestra en la Fig. 3. De este modo, la enzima de tipo prostatina humana se cree que es útil para los mismos propósitos que las serina proteasas identificadas previamente, incluyendo prostatina. La regulación de la enzima de tipo prostatina humana se puede usar, por ejemplo, para tratar afecciones tales como osteoporosis, COPD, metástasis de tumores, y enfermedades neurodegenerativas.

El documento WO 0116290 muestra las proteasas EOS como un miembro de la familia de la serina proteasa S1, que se expresa en plaquetas y leucocitos y específicamente en eosinófilos y macrófagos. Su secuencia de ADN (SEQ ID Nº 1) es 99,7% idéntica en superposición de 438 bases superpuestas con la SEQ ID Nº 1 y 98,6% en superposición de 728 bases con la SEQ ID Nº 5 (944 pares de bases en la SEQ ID Nº 2 y 95,6% a la SEC ID Nº 6 de la presente solicitud.

El documento WO 0124815 describe polipéptidos de tipo plasminógeno. El gen N 1 es un gen que muestra homología a la prostatina humana. El gen se expresa en eosinófilos y tejidos epiteliales y de curación de heridas, así como en células T y células dendríticas primarias. Su secuencia de ADN (SEQ ID Nº 1, 1836 pares de bases) es 99,7% idéntica en superposición de 435 bases con la SEQ ID Nº 1 (786 pares de bases de longitud) y 100% idéntica en 607 de superposición de bases con la SEQ ID Nº 5 (944 pares de bases de longitud) de la presente solicitud. Su secuencia de proteínas (SEQ ID Nº 4) es 93,4% idéntica a la SEQ ID Nº 2 y 95,1% idéntica en superposición de 228 aminoácidos con la SEQ ID Nº 6 (272 aminoácidos de longitud) de la presente solicitud.

El documento WO 0198468 describe serina proteasas humanas (PTRS-2) que muestran características estructurales en términos de homología con miembros de la familia de la tripsina. Su secuencia de ADN (SEQ ID Nº 23, 2036 pares de bases) es 99,7 idéntica en superposición de 438 bases con la SEQ ID Nº 1 (786 pares de bases de longitud) y 100% idéntica en 607 de superposición de bases con la SEQ ID Nº 5 (944 pares de bases de longitud). Su secuencia de proteínas (SEQ ID Nº 2, 365 aminoácidos) es 93,4% idéntica a la SEQ ID Nº 2 y 95,1% idéntica en superposición de 228 aminoácidos con la SEQ ID Nº 6 (272 aminoácidos de longitud) de la presente solicitud.

Polipéptidos

Los polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana comprenden al menos 6, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, ó 260aminoácidos contiguos seleccionados entre la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2 o la SEQ ID Nº: 6 o una variante biológicamente activa de la misma, como se describe más adelante. Un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana de la propia invención puede ser una parte de una proteína enzimática de tipo prostatina humana, una proteína enzimática de tipo prostatina humana de longitud completa, o una proteína de fusión que comprende toda o una porción de una proteína enzimática de tipo prostatina humana.

Variantes biológicamente activas

Las variantes de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana que son biológicamente activas, por ejemplo, mantienen la actividad de la serina proteasa, también son también polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana. Preferiblemente, las variantes de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana de origen natural o no natural tienen secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente 50, 55, 60, 65, ó 70, preferiblemente aproximadamente 75, 80, 85, 90, 96, 96, ó 98% idénticas a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6 o un fragmento de las mismas. El porcentaje de identidad entre una variante supuesta de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana y una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6 se determina usando el programa de alineamiento Blast2 (Blosum62, Expect 10, códigos genéticos convencionales).

Variaciones en el porcentaje de identidad se pueden deber, por ejemplo, a sustituciones de aminoácidos, inserciones, o supresiones. Las sustituciones de aminoácidos se definen como uno por uno reemplazos de aminoácidos. Son conservadoras por naturaleza cuando el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales y/o químicas similares. Los ejemplos de reemplazos conservadores son sustitución de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina.

Las inserciones o supresiones son cambiosa o dentro de una secuencia de aminoácidos. Típicamente caen en el intervalo de aproximadamente a 1 a 5 aminoácidos. La guía en la determinación los residuos de aminoácidos que se pueden sustituir, insertar, o suprimir sin abolir la actividad biológica o inmunológica de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede encontrar usando programas de ordenador bien conocidos en la técnica, tal como el software DNASTAR. Si un cambio de aminoácidos da como resultado un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana biológicamente activos se puede determinar fácilmente ensayando para evaluar la actividad de la serina proteasa, como se describe, por ejemplo, en los ejemplos específicos más adelante.

Proteínas de fusión

Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos contra secuencias de aminoácidos de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana y para uso en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, las proteínas de fusión, se pueden usar para identificar proteínas que interactúan con porciones de polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. La cromatografía de afinidad de proteína o ensayos basados en genotecas para interacciones proteína - proteína, tales como los sistemas de representación visual de fagos o dos híbridos de levaduras, se pueden usar para este propósito. Tales procedimientos son bien conocidos en al técnica y también se pueden usar como selecciones de fármacos.

Una proteína de fusión de polipéptido enzimático de tipo prostatina humana comprende dos segmentos de polipéptidos condensados juntos mediante un enlace peptídico. El primer segmento polipeptídico comprende al menos 6, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 25, 250, ó 260 aminoácidos contiguos de las SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6
o de una variante biológicamente activa, tal como las descritas anteriormente. El primer segmento de polipéptidos también puede comprender proteína enzimática de tipo prostatina de tipo prostatina humana de longitud completa.

El segundo segmento de polipéptidos puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento de proteínas. Las proteínas usadas comúnmente en una construcción de proteínas de fusión incluyen \beta-galactosidasa, \beta- glucuronidasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteínas autofluorescenets, incluyendo proteína fluorescente azul (BFP), glutation-S-transferasa (GST), luciferosa, peroxidasa de rábano picante (HRP), y cloranfenical acetiltransefrasa (CAT). Adicionalmente, las marcas de epítopos, marcas de hemaglutinina de la gripe (HA), marcas Myc, marcas VSG-G, y marcas de tioredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir proteína de unión a maltosa (MBP), marca S, Lex unas fusiones de dominio de unión a ADN (DBD), fusiones de dominio de unión a GAL4 ADN, y fusiones de proteína BP16 de virus herpes simplex (HSV). Una proteína de fusión también se puede modificar por ingeniería genética para que contenga un sitio de escisión localizado entre la secuencia que codifica los polipéptidos de la enzima de tipo prostatina humana y la secuencia de proteína heterólogas, de manera que el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se pueda escindir y purificar fuera del resto heterólogo.

Una proteína de fusión se puede sintetizar químicamente, como se muestra en al técnica. Preferiblemente una proteína de fusión se produce mediante dos segmentos de polipéptidos que se unen covalentemente o mediante procedimientos convencionales en la técnica de biología molecular. Los procedimientos de ADN recombinante se pueden usar para preparar proteínas de fusión, por ejemplo, preparando una construcción de ADN que comprende secuencias codificadoras seleccionadas entre la SEQ ID Nº: 1 o la SEQ ID Nº: 5 en un marco de lectura apropiado con nucleótidos que codifican el segundo segmento de polipéptidos y que expresa la construcción de ADN en una célula hospedadora, como se conoce en la técnica. están disponibles muchos kits para construir proteínas de fusión de compañías tales como Promega Corporation (Madison, WI), Stratagene (La Jolla, CA), CLONTECH (Mountain View, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), MLB Internacional Corporation (MIC, Watertown, MA), y Quantum Biotechnologies (Monreal, Canadá, 1-888-DNA-KITS).

Identificación de especies homólogas

Se pueden obtener homólogos de Especies de polipéptido enzimático de tipo prostatina usando polinucleótidos polipeptídicos de tipo prostatina humana (descritos más a delante) para preparar sondas adecuadas para seleccionar genotecas de expresión de ADNc de otras especies, tal como ratones, monos, o levadura, que identifican los ADNc que codifican homólogos de polipéptido enzimático de tipo prostatina humana, y que expresan los ADNc como se conoce en la técnica.

Polinucleótidos

Un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana puede ser de cadena sencilla o doble y comprende una secuencia codificadora o el complemento de una secuencia codificadora para un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Una secuencia codificadora de longitud completa para una enzima de tipo prostatina humana se muestra en la SEQ ID Nº: 1 y SEQ ID Nº: 5.

Las secuencias de nucleótidos degenerados que codifican polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana, así como secuencias de nucleótidos homólogos que son al menos aproximadamente 50, preferiblemente aproximadamente 75, 90, 96, ó 98% idénticas a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID Nº: 1 o SEQ ID Nº: 5 también son polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana. El porcentaje de identidad de secuencias entre las secuencias de dos polinucleótidos se determina usando programas de ordenador tales como ALIGN que emplean el algoritmo FASTA, usando una investigación de hueco afín con una penalización abierta de hueco de -12 y una penalización de extensión de hueco de -2. Moléculas de ADN complementario (ADNc), homólogos de especies, y variantes de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana son también polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana.

Identificación de variantes y homólogos de polinucleótidos

Las variantes y homólogos de polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana descritas anteriormente son polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana. Típicamente, las secuencias de polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana homólogas se pueden identificar mediante hibridación de polinucleótidos candidatos a polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana conocidos en condiciones rigurosas, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, usando las siguientes condiciones de lavado -2X SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M, pH 7,0), SDS al 0,1%, temperatura ambiente dos veces, 30 minutos cada una; después SSC 2 X, SDS al 0,1%, 50ºC una vez, 30 minutos; después 2 x SSC, temperatura ambiente dos veces, 10 minutos cada una - - secuencias homólogas se pueden identificar que contienen como mucho aproximadamente 25 - 30% de discordancias pares de bases. Más preferiblemente, cadenas de ácido nucleico homólogo contienen 15 - 25% de discordancias pares de bases, incluso más preferiblemente 5 - 15% de discordancias pares de bases.

Los homólogos de especies de los polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana descritos en esta memoria descriptiva también se pueden identificar preparando sondas o cebadores apropiadas y seleccionando genotecas de expresión de ADNc a partir de otras especies, tales como ratones, monos, o levadura. Se pueden identificar variantes humanas de polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana, por ejemplo, seleccionando genotecas de expresión de ADNc. Se conoce bien que la T_{m} de un ADN de doble cadena disminuye en 1 - 1,5ºC con cada disminución de 1% en homología (Bonner y col., J. Mol. Biol. 81, 123 (1973). Por lo tanto se pueden identificar variantes de polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana o polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana de otras especies mediante la hibridación de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana con un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana homólogo supuesto con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº: 1 o SEQ ID Nº: 5 o la complementaria de las mismas para formar un híbrido de ensayo. La temperatura de fusión del híbrido de ensayo se compara con la temperatura de fusión de un híbrido que comprende polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos perfectamente complementarias, y se calcula el número de porcentaje de discordancias de pares de bases dentro del híbrido de ensayo.

Las secuencias de nucleótidos que se hibridan a los polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana o sus complementos después de la hibridación rigurosa y/o condiciones de lavado son también polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana. Las condiciones de lavado rigurosas se conocen bien y entendidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición, 1989, en las páginas 9.50 - 9.51.

Típicamente, para condiciones de hibridación rigurosas se debe elegir una combinación de temperatura y concentración de sal para que esté aproximadamente 12 - 20ºC por debajo de la T_{m} calculada del híbrido en estudio. La T_{m} de un híbrido entre un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana que tiene una secuencia de nucleótidos mostrada en al SEQ ID Nº: 1 o SEQ ID Nº: 5 o la complementaria de las mismas y una secuencia de polinucleótidos que es al menos aproximadamente 50, preferiblemente aproximadamente 75, 90, 96, ó 98% idénticas a una de las secuencias de nucleótidos se puede calcular, usando la ecuación de Bolton y McCartthy, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 48, 1390 (1962):

T_{m} = 81,5º - 16,6 (log_{10} [Na^{+}]) + 0,41 (%G + C) - 0,63 (% de formamida) - 600/l), en la que l = la longitud del híbrido en pares de bases.

Las condiciones de lavado rigurosas incluyen, por ejemplo, 4 X SSC a 65ºC, o formamida al 50%, 4 X SSCA 42ºC, o 0,5 x ssc, sds AL 0,1% A 65ºC. Las condiciones de lavado altamente rigurosas incluyen, por ejemplo, 0,2 X SSC a 65ºC.

Preparación de polinucleótidos

Un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana de origen natural se puede aislar libre de otros componentes celulares tal como componentes de membrana, proteínas, y lípidos. Los polinucleótidos se pueden preparar mediante una célula y se aísla usando técnicas de purificación de ácidos nucleicos convencionales, o sintetizarse usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PRC), o mediante el uso de un sintetizador automático. Los procedimientos para aislar polinucleótidos son rutinarios y se conocen en al técnica. Cualquier técnica como tal para obtener un polinucleótido se puede usar para obtener polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana. Por ejemplo, se pueden usar enzimas de restricción y sondas para aislar fragmentos de polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana. Los polinucleótidos aislados están en preparaciones que están al menos 70, 80, ó 90% libres de otras moléculas.

Las moléculas de ADNc enzimáticas de tipo prostatina humana se pueden preparar con técnicas de biología molecular convencionales, usando ARNm enzimático de tipo prostatina humana como molde. Las moléculas de ADNc enzimáticas de tipo prostatina humana se pueden después de esto replicar usando técnicas de biología molecular conocidas en al técnica y descritas en manuales tales como Sambrook y col., (1989). Una técnica de amplificación, tal como PCR, se puede usar para obtener copias adicionales de polinucleótidos de la invención, usando o bien ADN o ADNc genómico humano como molde.

Como alternativa, se pueden usar técnicas de química sintética para sintetizar polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana. La degeneración del código genético permite secuencias de nucleótidos alternativos a sintetizar que codificarán un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana que tiene, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6 o una variante biológicamente activa de las mismas.

Ampliación de polinucleótidos

Se pueden usar diversos procedimientos basados en PCR para ampliar las secuencias de ácidos nucleicos descritas en esta memoria descriptiva para detectar secuencias hacia arriba tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR del sitio de restricción usa cebadores universales para recuperar la secuencia desconocida adyacente a un locus conocido (Sarkar, PCRMethos Applic. 2, 318 - 322, 1993). El ADN genómico se amplifica primero en presencia de un cebador a una secuencia de engarce y un cebador específico a la región conocida. Las secuencias amplificadas se someten después a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador de engarce y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada ronda de PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y se secuencia usando transcriptaza inversa.

La PCR inversa también se puede usar para amplificar o ampliar secuencias usando cebadores divergentes basándose n una región conocida (Triglia y col., Nucleic Acids Res. 16, 8186, 1988). Se pueden diseñar cebadores usando un software comercialmente disponible, tal como OLIGO 4.06 Primer Análisis software (National Biosciences Inc., Plymouth. Minn.), a ser de 22 - 30 nucleótidos de longitud, que tienen un contenido de GC de 50% o más, y para hibridarse a la secuencia diana a temperaturas aproximadamente 68 - 72ºC. El procedimiento usa varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en al región conocida de un gen. Después el fragmento se hace circular mediante ligamiento intramolecular y se usa como un molde de PCR.

Otro procedimiento que se puede usar es la PCR de captura, que implica amplificación de PCR de fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en ADN cromosómico artificial y de levaduras (Lagertrom y col., PCR Methods Applic. 1, 111 - 119, 1991). En este procedimiento, las digestiones y ligamientos por enzimas de restricción múltiples también se pueden usar para colocar una secuencia de doble cadena modificada por ingeniería genética en un fragmento desconocido de la molécula de ADN antes de realizar la PCR.

Otro procedimiento que se puede usar para recuperar secuencias desconocidas es el de Parker y col., Nucleic acxids Res. 19, 3055 - 3060, 1991). Adicionalmente, PCR, cebadores jerarquizados, y genotecas PROMOTERFINDER (CLONTECH, Palo Alto, California) se pueden usar para la secuenciación anterior de ADN genómico (CLONTECH, Palo Alto, California). este procedimiento evita la necesidad de seleccionar genotecas y es útil en el hallazgo de uniones intrón / exón.

Cuando se seleccionan ADNc de longitud completa, es preferible usar genotecas que se han seleccionado por tamaño que incluyen ADNc mayores. Las genotecas cebadas al azar son preferibles, porque contendrán más secuencias que contienen las regiones 5' de genes. El uso de una genoteca cebada al azar puede ser especialmente preferida para situaciones en las que una genoteca oligo d(T) no produce un ADNc de longitud completa. Las genotecas genómicas pueden ser útiles para la ampliación de la secuencia en regiones reguladoras no transcritas en 5'.

Los sistemas de de electroforesis capilares disponible comercialmente se pueden usar para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de productos de PCR o de secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear polímeros sueltos para la separación electroforética, cuatro tintes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que son activados por láser, y detección de las longitudes de onda emitidas por una cámara de dispositivo acoplado de carga. La intensidad de rendimiento/luz se puede convertir en señal eléctrica usando un software apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y la secuencia NAVIGATOR, Perkin Elmer), y el procedimiento entero de carga de muestras a análisis por ordenador y representación visual de datos electrónicos se puede controlar por ordenador. La electroforesis capilar es especialmente preferible para la secuenciación de pequeñas piezas de ADN que podría estar presente en cantidades limitadas en una muestra particular.

Obtención de polipéptidos

Los polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana se pueden obtener, por ejemplo, mediante purificación a partir de células humanas, mediante expresión de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana, o mediante síntesis química directa.

Purificación de proteínas

Los polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana se pueden purificar a partir de cualquier célula que expresa la enzima, incluyendo células hospedadoras que se han transfectado con construcciones de expresión enzimáticas de tipo prostatina humana. El corazón fetal humano proporciona una fuente especialmente útil de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana. Un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se separa de otros compuestos que normalmente se asocian con el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana en al célula, tales como ciertas proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan, a cromatografía por exclusión de tamaño, fraccionamiento de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis de gel preparativa. Una preparación de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana tiene al menos 80% de pureza; preferiblemente, las preparaciones tienen 90%, 95%, o 99% de pureza. la pureza de las preparaciones se pueden determinar mediante cualquier medio conocido en al técnica, tal como electroforesis de gel de SDS - poliacrilamida.

Expresión de polinucleótidos

Para expresar un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana, el polinucleótido se puede insertar en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificadora insertada. Los procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana y elementos de control transcripcional y traduccional apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Ausubel
y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y. 1989.

Se puede utilizar una diversidad de sistemas de vectores de expresión / hospedadores para que contengan y expresen secuencias que codifican un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos, plásmidos, o cósmidos recombinantes; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células de plantas transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus del mosaico de tabaco, TMV) o o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas de células de animales.

Los elementos de control o secuencias reguladoras son las regiones no traducidas del vector - - potenciadores, promotores, regiones no traducidas de 5' y 3' - - que interactúan con proteínas de células hospedadoras que llevan a cabo la transcripción y traducción. Tales elementos pueden variar en su longitud y especificidad. dependiendo del sistema de vector y huésped utilizados, se pueden usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, se pueden usar los promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido BUESCRIPT (Stratagene, Lajilla, california) o plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. El promotor de polihedrina de baculovirus se puede usar en células de insectos. Los promotores o potenciadores derivados de genomas de células de plantas (por ejemplo, choque térmico, RUBISCO, y genes de proteínas de almacenamiento) o a partir de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias guías) se pueden clonar en el vector. En sistemas de células de mamíferos, son preferibles promotores a partir de genes de mamíferos o a partir de virus de mamíferos. Es necesario generar una línea celular que contiene copias múltiples de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana, vectores basaos en SV40 o ERV se puede usar con un marcador seleccionable apropiado.

Sistemas de expresión bacterianos y de levadura

En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar numerosos sistemas de expresión dependiendo del uso propuesto para el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana para la inducción de anticuerpos, se pueden usar vectores que dirigen la expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector CLUESCRIPT, una secuencia que codifica el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede ligar en el vector en fase con secuencias para la Met amino terminal y los posteriores 7 residuos de la \beta-galactosidasa de manera que se produzca una proteína híbrida. Los vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503 - 5509, 1989) o vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también se pueden usar para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutation S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción a perlar de glutation - agarosa seguido de la elución en presencia de glutation libre. Pas proteínas preparadas en tales sistemas se pueden diseñar para que incluyan heparina, trombina, o sitios de escisión del factor Xa de la proteasa de manera que el polinucleótido clonado de interés se libera del resto GSTa a voluntad.

En la levadura Saccharomyces ceervisiae, un número de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa, y PHG se pueden usar. Para revisión, véase Ausubel y col., (1989) y Grant y col., Methods Enzymol. 153, 516 - 544, 1987.

Sistemas de expresión de plantas e insectos

Si se usan vectores de expresión de plantas, las expresiones de secuencias que codifican polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana se pueden dirigir mediante cualquier número de promotores. Por ejemplo, se pueden usar promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV solos o en combinación con la secuencia guía omega a partir de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6, 307 - 311, 1987). Como alternativa, promotores de plantas tales como la pequeña subunidad de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi y col., EMBO J. 3, 1671 - 1680, 1984: Broglie y col., Science 224, 838 - 843, 1984; Winter y col., Results Probl. Cell Differ. 17, 85 - 105, 1991). Estas construcciones se pueden introducir en células de plantas mediante transformación de ADN directa o mediante transfección mediada por patógenos. Tales técnicas se describen en numerosas revisiones generalmente disponibles (por ejemplo, Hobbs o Murray, en MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, Nueva York, N. Y. p. 191 - 196, 1992).

También se puede usar un sistema de insecto para expresar un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Por ejemplo, en un sistema tal como virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) se usa como vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana se pueden clonar en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina, y colocado bajo control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana hará el gen de polihedrina inactivo y producirá virus recombinante que carece de proteína de revestimiento. Los virus recombinantes se pueden usar después para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se pueden expresar polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana (Engelhard y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224 - 3227, 1994).

Sistemas de expresión de mamíferos

Se pueden usar numerosos sistemas de expresión a base de virus para expresar polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana en células hospedadoras de mamíferos. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como vector de expresión, se pueden ligar polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana en un complejo de transcripción / traducción de adenovirus que comprende el último promotor y secuencia guía tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral se puede usar para obtener un virus viable que es capaz de expresar un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana en células hospedadoras infectadas (Logan y Shenk, Proc. Natl. Acad. Science. 81, 3655 - 3659, 1984). Si se desea, se pueden usar potenciadores de trasncripción, tales como el potenciador del virus de sarcoma rous (RSV) para incrementar la expresión en células hospedadoras de mamíferos.

También se pueden usar cromosomas artificiales humanos (HACs) para distribuir fragmentos más largos de ADN que pueden estar contenidos y expresados en un plásmido. los HAC de 6 M a 10 M se construyen y se distribuyen a las células mediante procedimientos de distribución convencionales (por ejemplo, liposomas, polímeros de amino policatiónicos, o vesículas).

Las señales de iniciación específicas también se pueden usar para lograr traducción más eficaz de secuencias que codifican polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana. Tales señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana, puede ser necesario su codón de inicio, y secuencias cadena arriba se insertan en el vector de expresión adecuado, sin señales de control de transcripción o de traducción. Sin embargo, en los casos en los que solamente la secuencia de codificación, o un fragmento de la misma, esté insertada, se deben proporcionar señales de control de traducción exógenas (incluyendo el codón de inicio ATG). El codón de inicio debe estar en el correcto marco de lectura para asegurar la traducción de al inserción entera. Los elementos de traducción exógenos y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de expresión se puede potenciar mediante la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema de célula particular que se usa (véase Scharf y col., Results Probl. Cell Differ. 20, 125 - 162, 1994).

Células hospedadoras

Una cepa de células hospedadoras se puede elegir para su capacidad de modular al expresión de las secuencias insertadas o para procesar el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana de la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosialción, fsoforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento post - traduccional que escinde una forma "prepro" del polipéptido también se puede usar para facilitar la inserción correcta, plegamiento y/o función. Están disponibles diferentes células hospedadoras que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para actividades post - traduccionales (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y W138) de la colección americana de cultivos tipo (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 - 2209) y se pueden elegir para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína foránea.

La expresión estable se prefiere para la producción de largo plazo, alto rendimiento de proteínas recombinantes. Por ejemplo, líneas celulares que expresan de manera estable los polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana se pueden transformar usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión exógenos y un gen marcador seleccionable sobre el mismo o en un vector separado. Después de al introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante 1 - 2 días en un medio enriquecido antes de que se desvíen a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan con éxito las secuencias de enzima de tipo prostatina humana. Los clones resistentes de células transformadas de manera estable se pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiados para el tipo de célula. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE, R. I. Freshney, ed., 1986.

Se puede usar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no se limitan a, genes de la timidina quinasa de virus herpes simplex (Wigler y col., Cell 11, 223 - 32, 1977) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowry y col., Cell 22, 817 - 23, 1980) que se pueden emplear en células tk o aprf, respectivamente. También, se puede usar resistencia a antimetabolito, antibiótico, o herbicida como la base para la selección. Por ejemplo, dhfr confiere resistencia a metotrexato (Wigler y col., Proc. natl. Acad. Sci. 77, 3567 - 70, 1980), npt confiere resistencia a los aminoglicósidos, neomicina y G-418 (Colbere - Garapin y col., J. Mol. Biol. 150, 1 - 14, 1981) y als y pat confieren resistencia a clorsulfuron y fosfinotricin acetiltransefrasa, respectivamente (Murray, 1992, anteriormente). Se han descrito los genes seleccionables adicionales. Por ejemplo, trpB permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o his, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci 85, 8047 - 51, 1988). Se pueden usar marcadores visibles tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, se pueden usar para identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de expresión de proteína estable o transitoria atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes y col., Methods Mol. Biol. 55, 121 - 131, 1995).

Detección de expresión

Aunque la presencia de la expresión del gen marcador sugiere que el polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana también esté presente, su presencia y expresión puede necesitar confirmarse. Por ejemplo, si una secuencia que codifica un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana está insertado en una secuencia del gen marcador, células transformadas que contienen secuencias que codifican un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se pueden identificar mediante la ausencia de una función del gen marcador. Como alternativa, un gen marcador se puede colocar en tándem con una secuencia que codifica un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección usualmente indica la expresión del polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana.

Como alternativa, las células hospedadoras que contienen un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana y que expresan un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se pueden identificar mediante una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN - ADN o ADN - ARN y técnicas de o bioensayo o inmunoensayo de proteínas que incluyen, tecnologías de membrana, solución, o basadas en chip para la detección y/o cuantificación de ácidos nucleicos o proteína. Por ejemplo, la presencia de una secuencia de polinucleótidos que codifican un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se puede detectar mediante hibridación o amplificación de ADN - ADN o ADN o ARN que usan sondas o fragmentos o fragmentos de polinucleótidos que codifican un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana. Los ensayos basados en la amplificación de ácidos nucleicos implican el uso de oligonucleótidos seleccionados entre las secuencias que codifican un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana para detectar transformantes que contienen un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana.

Se conocen en la técnica una diversidad de protocolos para detectar y medir la expresión de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana, usando anticuerpos o bien policlonales o monoclonales específicos para el polipéptido. Los ejemplos incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Un inmunoensayo de dos sitios, a base de monoclonal que usa anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos que no interfieren sobre un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se puede usar, o se puede emplear un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen en Hampton y col., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St Paul, Minn., 1990) y Maddox y col., J. Exp. Med. 158, 1211 - 1216, 1983).

Los expertos en la técnica conocen una diversidad de marcas y técnicas de conjugación y se pueden usar en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Los medios para producir hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas a polinucleótidos que codifican polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana incluyen oligomarcaje, traducción nic, marcaje de extremo, o amplificación de PCR que usan un nucleótido marcado. Como alternativa, las secuencias que codifican un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Tales vectores se conocen en al técnica, están comercialmente disponibles, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN polimerasa apropiada tal como T7, T3, o SP6. Estos procedimientos se pueden llevar a cabo usando una diversidad de kits comercialmente disponibles (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemicals). Las moléculas indicadoras o marcas adecuadas que se pueden usar para al fácil detección incluyen radionúclidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidoers, partículas magnéticas, y similares.

Expresión y purificación de polipéptidos

Se pueden cultivar células hospedadoras transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se pueden cultivar en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo de células. El polipéptido producido por una célula transformada se puede secretar o estar contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Como entenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana se pueden diseñar para que contengan secuencias señales que dirigen la secreción de polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana a través de una membrana celular procariótica o eucariótica o que dirige la inserción de membrana del polipéptido enzimático de tipo prostatina humana unido a
membrana.

Como se ha descrito anteriormente, se pueden usar otras construcciones para unir una secuencia que codifica un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la purificación de proteínas solubles. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes metálicos tales como módulos de histidina - triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión / afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seatle, Wash.). La inclusión de secuencias de engarces escindibles tales como las específicas para el factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana también se pueden usar para facilitar la purificación. Un vector como tal proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana y seis restos histidina que preceden un sitio de escisión de tioredoxina o de enteroquinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación por IMAC (cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados como se describe en Porath y col., Exp. Purif. 3, 263 - 2981, 1992), mientras que el sitio de escisión de la enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana a partir de la proteína de fusión. Los vectores que contienen proteínas de fusión se describen en Kroll y col., DNA Cell Biol. 12, 441 - 453, 1993.

Síntesis química

Las secuencias que codifican un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede sintetizar, en conjunto o en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en al técnica (véase Caruthers y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215 - 223, 1980; Horn y col., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225 - 232, 1980). Como alternativa, el propio polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede producir usando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tales como mediante síntesis directa del péptido usando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 - 2154, 1963; Roberge y col., Science 269, 202 - 204, 1995). La síntesis de proteína se puede realizar usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos de Applied Biosystems 431 A (Perkin Elmer). Opcionalmente, se pueden sintetizar de manera separada los polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.

El péptido recientemente sintetizado se puede purificar sustancialmente mediante cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa (por ejemplo, Cgreighton, PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman y co., Nueva York, N. Y., 1983). La composición de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede confirmar mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, anteriormente). Adicionalmente, cualquier porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede alterar durante la síntesis directa y/o combinada usando proce-
dimientos químicos con secuencias de otras proteínas para producir un polipéptido variante o una proteína de fusión.

Producción de polipéptidos alterados

Como comprenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptido enzimático de tipo prostatina humana que poseen codones de origen natural. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped procariótico o eucariótico se puede seleccionar para incrementar la tasa de expresión de proteína o para producir una transcripción de ARN que tiene propiedades deseables, tales como una semivida que es más larga que la de una transcripción generada a partir de la secuencia de origen natural.

Las secuencias de nucleótidos descritas en esta memoria descriptiva se pueden modificar por ingeniería genética usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica que alteran las secuencias que codifican el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana por una diversidad de razones, incluyendo, pero sin limitación, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o expresión del polipéptido o producto de ARNm. La mezcla de ADN mediante fragmentación genética y reensamblaje de PCR de fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos se pueden usar para modificar por ingeniería genética las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio se puede usar para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glucosilación, cambiar el codón de preferencia, producir variantes de ayuste, introducir mutaciones, y así sucesivamente.

Anticuerpos

Cualquier tipo de anticuerpo conocido en al técnica se puede generar para que se una específicamente a un epítope de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. "Anticuerpo" como se usa en esta memoria descriptiva incluye moléculas intactas de inmunoglobulina, así como fragmentos de las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2}, y Fv, que son capaces de unirse a un epítope de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Típicamente, al menos 6, 8, 10, ò 12 fragmentos de aminoácidos contiguos se requieren para formar un epítopo. Sin embargo, los epítopes que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25, ó 50 aminoácidos.

Un anticuerpo que se une específicamente a un epítope de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se pueden usar de manera terapéutica, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como transferencia de Western, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayo inmunoquímicos conocidos en la técnica. Se pueden usar diversos inmunoensayos para para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Se conocen en al técnica numerosos protocolos para la unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos. Tales inmunoensayos típicamente implican la medición de formación de complejo entre un inmunógeno y un anticuerpo que específicamente se une al inmunógeno.

Típicamente, un anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana proporciona una señal de detección al menos 5-, 10-, ó 20 veces más que una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usa en un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana en solución.

Los polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana se pueden usar para inmunizar un mamífero tal como un ratón, rata, conejo, cobaya, mono, o ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, se puede conjugar un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana a una proteína vehículo, tal como albúmina sérica bovina, tiroglobulina, y hemocianina de lapa de ojo de cerradura. Dependiendo de al especie de huésped, se pueden usar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, ges minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles prurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemociania de lapa de ojo de cerradura, y dinitroffenol). Entre los adyuvantes usados en seres humanos, BCG (bacilos Calmette - Guerin), y Corynebacterium parvum son especialmente útiles.

Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se pueden preparar usando cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas de células continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B humanas, y al técnica de hibridoma de EBV (Kohler y col., Nature 256, 495 - 497, 1985; Kozbor y col., J. Imanol. Methods 81, 31 - 42, 1985; Cote y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026 - 2030, 1983; Cole y col., Mol. Cell Biol. 62, 109 - 120, 1984).

Además, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el ayuste de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con especificidad antigénica apropiada y actividad biológica (Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851 - 6855, 1984; Neuberger y col., Nature 312, 604 - 608, 1984; Takeda y col., Nature 314, 452 - 454, 1985). Los anticuerpos monoconales y otros también se pueden "humanizar" para prevenir un paciente de armar una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a anticuerpos humanos a usar directamente en terapia o pueden requerir alteración de unos pocos residuos claves. Las diferencias de secuencia entre anticuerpos de roedores y secuencias humanas se pueden minimizar reemplazando residuos que difieren de aquellos en las secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida al sitio de residuos individuales o mediante injerto de regiones determinantes de complementariedad entera. Como alternativa, se pueden producir anticuerpos humanizados usando procedimientos recombinantes, como se describe en el documento GB2188638B. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana puede contener sitios de unión a antígeno que están o bien parcial o totalmente humanizados, como se describe en el documento U. S. 5.565.332.

Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla se pueden adaptar usando procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de cadena sencilla que se unen específicamente a polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composición idiomática, se pueden generar mediante mezclado de cadenas de genotecas de inmunoglobulinas combinatorias al azar (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120 - 23, 1991).

Los anticuerpos de cadena sencilla también se puede construir usando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como PCR, usando ADNc de hibridoma como molde (Thirion y col., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507 - 11). Los anticuerpos de cadena sencilla pueden ser mono- o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La construcción de anticuerpos tetravalentes, de cadena sencilla biespecíficos se enseña, por ejemplo, en Coloma y Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159 - 63. La construcción de anticuerpos tetravalentes, de cadena sencilla biespecíficos se enseña n Mallender y Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199 - 206.

Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de cadena sencilla se puede construir usando la síntesis manual o automática de nucleótidos, se clona en una construcción de expresión usando procedimientos de ADN recombinante convencionales, y se introduce en una célula para expresar la secuencia codificadora. Como alternativa, los anticuerpos de cadena sencilla se pueden producir directamente usando, por ejemplo, la tecnología de fago filamentosa (Verhaar y col., 1995, Int. J. Cancer 61, 497 - 501; Nicholls y col., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81 - 91).

Los anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina humana también se pueden producir induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o mediante selección de genotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de unión altamente específica como se describe en la bibliografía (Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833 - 3837, 1989; Winter y col., Nature 349, 293 - 299, 1991).

Otros tipos de anticuerpos se pueden construir y usar terapéuticamente. Por ejemplo, anticuerpos quiméricos se pueden construir como se describe en el documento WO 93/03151. También se pueden preparar as proteínas de unión que se derivan de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, tales como los "diacuerpos" descritos en el documento WO 94/13804.

Los anticuerpos se pueden purificar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por afinidad mediante pase sobre una columna a la que se une un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Los anticuerpos unidos se pueden después eluir de la columna usando un tampón con alta concentración de sal.

Oligonucleótidos de polaridad opuesta

Los oligonucleótidos de polaridad opuesta son secuencias de nucleótidos que son complementarios a una secuencia de ADN o ARN específica. Una vez introducidos en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear o bien la transcripción o la traducción. Preferiblemente, un oligonucleótido de polaridad opuesta es de al menos 11 nucleótidos de longitud, pero puede ser de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 o más nucleótidos de longitud. También se pueden usar secuencias más largas. Las moléculas de oligonucleótidos de polaridad opuesta se pueden proporcionar en una construcción de ADN e introducir en una célula como se ha descrito anteriormente para disminuir el nivel de productos génicos enzimáticos de tipo prostatina humana en la célula.

Los oligonucleótidos de polaridad opuesta pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar manualmente o mediante un sintetizador automático, mediante unión covalente al extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con enlaces internucleótidos no fosfodiéster tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, fosfato ésteres, carbamatos, acetamidato, carboximetil ésteres, carbonatos, y fosfato triésteres. Véase Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1 - 8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1 - 72, 1994; Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 543 - 583, 1990.

Se pueden obtener modificaciones de expresión génica enzimática de tipo prostatina humana diseñando oligonucleótidos de polaridad opuesta que forman dúplex para el control, 5', o regiones reguladoras del gen enzimático de tipo prostatina humana. Se prefieren los oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 desde el sitio de partida. De manera similar, la inhibición se puede lograr usando metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice es útil porque provoca inhibición de la capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para la unión de polimerasas, factores de transcripción, o chaperones. Los avances terapéuticos que usan ADN triple se han descrito en al bibliografía (por ejemplo, Gee y col., en Huber y Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y., 1994). Un oligonucleótido de polaridad opuesta también se puede diseñar para bloquear la traducción de ARNm previniendo la transcripción de la unión a ribosomas.

No se requiere complementariedad precisa para la formación de complejos útiles entre un oligonucleótido de polaridad opuesta y la secuencia complementaria de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana. Los oligonucleótidos de polaridad opuesta que comprende, por ejemplo, 2, 3, 4, ó más tramos de nucleótidos contiguos que son precisamente complementarios aun polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana, cada uno separado por un tramo de nucleótidos contiguos que no son complementarios a nucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana, pueden proporcionar suficiente especificidad de dirección para ARNm enzimático de tipo prostatina humana. Preferiblemente, cada tramo de nucleótidos contiguos complementarios es al menos 4, 5, 6, 7, u 8 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias que intervienen no complementarias son preferiblemente 1, 2, 3, ó 4 nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica pueden fácilmente usar el punto de fusión calculado de un par de polaridad opuesta para determinar el grado de discordancia que se tolerará entre un par de oligonucleótidos de polaridad opuesta y una secuencia de polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana.

Los oligonucleótidos de polaridad opuesta se pueden modificar sin que afecte su capacidad para hibridarse a un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana. Estas modificaciones pueden ser internas o en uno o ambos extremos de la molécula de polaridad opuesta. Por ejemplo, los enlaces fosfato internucleósido se pueden modificar añadiendo restos colesteril o diamina con números variables de residuos de carbono entre los grupos amino y ribosa terminal. Las bases modificadas y/o azúcares, tales como arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido sustituido en 3', 5' en las que el grupo hidroxilo o el grupo fosfato 5' estás sustituidos, también se pueden emplear en un oligonucleótido de polaridad opuesta modificado. Estos oligonucleótidos modificados se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Agrawal y col., Trends Biotechnol. 10, 152 - 158, 1992; Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 543 - 584, 1990; Uhlmann y col., Tetrahedron. Lett. 215, 3539 - 3542, 1987.

Ribozimas

Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica. Véase, por ejemplo, Cech, Science 236, 1532 - 1539; 1987; Cech, Ann. Rev, Biochem. 59, 543 - 569; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605 - 609; 1992, Couture y Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510 - 515, 1996. Las ribozimas se pueden usar para inhibir la función génica mediante la escisión de una secuencia de ARN, como se sabe en la técnica (por ejemplo, Haseloff y col., patente de Estados Unidos Nº 5.641.673). El mecanismo de la acción de ribozima implica hibridación específica de secuencias de la molécula de ribozima al ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleotítica. Los ejemplos incluyen, moléculas de ribozima de motivo de cabeza de martillo modificadas por ingeniería genética que pueden específicamente y eficazmente catalizar la escisión endonucleolítica de secuencias de nucleótidos específicas.

La secuencia codificadora de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana. Los procedimientos de diseño y construcción de ribozimas que pueden escindir otras moléculas de ARN en trans de una manera altamente específica de secuencia se han desarrollado y descrito en la técnica (véase, Haseloff y col., Nature 334, 585 - 591, 1988). Por ejemplo, la actividad de escisión de ribozimas se puede dirigir a ARN específicos mediante ingeniería genética de una región de "hibridación" discreta en la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria al ARN diana y de este modo se hibrida específicamente con la diana (véase, por ejemplo, Gerlach y col., documento EP 321.201).

Los sitios específicos de escisión de ribozimas en una diana de ARN enzimático de tipo prostatina humana se puede identificar mediante exploración de la molécula diana para los sitios de escisión de ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, las secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del ARN diana que contiene el sitio de escisión se pueden evaluar para características estructurales que pueden hacer la diana inoperable. La adecuación de dianas de ARN enzimático de tipo prostatina humana también se pueden evaluar ensayando la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasa. Las secuencias complementarias más largas se pueden usar para incrementar la afinidad de la secuencia de hibridación para la diana. Las regiones de hibridación y de escisión de la ribozima se pueden relacionar integralmente de manera que tras la hibridación del ARN diana a través de las regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima pueda escindir la diana.

Las ribozimas se pueden introducir en las células como parte de una construcción de ADN. Se pueden usar procedimientos mecánicos, tales como microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación, o precipitación por fosfato de calcio, para introducir una construcción de ADN que contiene ribozima en las células que se desea que disminuyan la expresión enzimática de tipo prostatina humana. Como alternativa, si se desea que las células mantengan de manera estable al construcción de ADN, la construcción se puede suministrar sobre un plásmido y mantenerse como un elemento separado p integrado en el genoma de las células, como se conoce en la técnica. Una construcción de ADN que codifica ribozima puede incluir elementos reguladores, tal como un elemento promotor, un potenciador o elemento UAS, y una señal terminadora transcripcional, para controlar la transcripción de ribozimas en las células.

Como se muestra en Haseloff y col., patente de Estados Unidos Nº 5.641.673, las ribozimas se pueden modificar por ingeniaría genética de manera que la expresión de ribozimas se producirá en respuesta a factores que inducen la expresión de un gen diana. Las ribozimas también se pueden modificar por ingeniería genética para proporcionar un nivel adicional de regulación, de manera que la destrucción de ARNm se produce solamente cuando se inducen tanto una ribozima como un gen diana en las células.

Genes diferencialmente expresados

En esta memoria descriptiva se describen procedimientos para la identificación de genes cuyos productos interactúan con enzimas de tipo prostatina humana. Tales genes pueden representar genes que se expresan diferencialmente en trastornos que incluyen, pero no se limitan a, trastornos COPD, CNS, y cáncer. Además, tales genes pueden representar genes que están regulados diferencialmente en respuesta a manipulaciones relevantes a la progresión o tratamiento de tales enfermedades. Adicionalmente, tales genes pueden tener expresión temporalmente modulada, incrementada, o disminuida en diferentes fases de desarrollo de tejidos u organismos. Un gen diferencialmente expresado también puede tener su expresión modulada en condiciones control frente a experimentales. Además, el gen enzimático de tipo prostatina o producto génico puede él mismo ensayarse para evaluar la expresión diferencial.

El grado al que la expresión difiere en un estado normal frente a patológico necesita solamente ser suficientemente largo para visualizarse mediante técnicas de caracterización convencionales mediante las que las diferencias de expresión se pueden visualizar incluyen pero no se limitan a, RT (transcriptasa inversa) cuantitativa, PCR, y análisis de Northern.

Identificación de genes diferencialmente expresados

Para identificar el ARN de los genes diferencialmente expresados o, preferiblemente, ARNm se aísla a partir de tejidos de interés. Por ejemplo, muestras de ARN se obtienen a partir de tejidos de sujetos experimentales y a partir de tejidos correspondientes de sujetos de control. Cualquier técnica de aislamiento de ARN que no se selecciona contra el aislamiento de ARNm se puede utilizar para la purificación de tales muestras de ARN. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley y Sons, Inc. Nueva York, 1987 - 1993. Se pueden procesar fácilmente grandes números de muestras de tejido usando técnicas bien conocidas por lo expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, el procedimiento de aislamiento de ARN de una sola etapa de Chomczynski, patente de estados Unidos nº 4.843.155.

Las transcripciones dentro de las muestras de ARN recogidas que representan ARN producidas por genes diferencialmente expresados se identifican mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en al técnica. Incluyen, por ejemplo, selección diferencial (Tedder y col., Proc. Natl. Acad. Sci, U. S. A. 85, 208 - 12, 1988), hibridación sustractiva (Hedrick, y col., Nature 308, 149 - 53; Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 2825, 1984), y representación visual diferencial (Liang y Pardee, Science 257, 967 - 71, 1992; patente de estados Unidos Nº 5.262.311), y microensayos.

La información de expresión diferencial puede ella misma sugerir procedimientos relevantes para el tratamiento de trastornos que implican la enzima de tipo prostatina humana. Por ejemplo, el tratamiento puede incluir una modulación de la expresión de los genes diferencialmente expresados y/o el gen que codifica la enzima de tipo prostatina humana. La información de la expresión diferencial puede indicar si la expresión o actividad del gen p producto génico expresado diferencialmente o el gen de la enzima de tipo prostatina humana están regulados hacia arriba o regulados hacia abajo.

Procedimientos de selección

La invención proporciona ensayos para la selección de compuestos de ensayo que se unen o modulan la actividad de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana o un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana. Un compuesto de ensayo preferiblemente se une a un polipéptido o polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana. Más preferiblemente, un compuesto de ensayo disminuye o aumenta el tipo de prostatina humana en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, ó 100% con relación a la ausencia del compuesto de ensayo.

Compuestos de ensayo

Los compuestos de ensayo pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en la técnica o pueden ser compuestos previamente desconocidos que tienen cualquier actividad farmacológica. Los compuestos pueden ser de origen natural o diseñados en el laboratorio. Se pueden aislar a partir de microorganismos, animales, o plantas, y se pueden producir de manera recombinante, o sintetizarse mediante procedimientos químicos conocidos en la técnica. Si se desea, los compuestos de ensayo se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos procedimientos de genotecas combinatorios conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitación a, genotecas biológicas, librerías paralelas dirigibles espacialmente de fase sólida o de fase en solución, procedimientos de genotecas sintéticos que requieren descircunvolución, el procedimiento de genotecas "una perla un compuesto", y procedimientos de genoteca sintéticos que usan selección por cromatografía de afinidad. El planteamiento de genoteca biológico está limitado a genotecas de polipéptidos, mientras que otros cuatro planteamientos son aplicables a polipéptido, oligómero no peptídico, p genotecas de moléculas pequeñas de compuestos. Véase Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.

Los procedimientos para la síntesis de genotecas moleculares se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo, De Witt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6909, 1993; Erb y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 11422, 1994; Zuckermann y col., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho y col., Science 261, 1303, 1993; Carell y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell y col., Angew.Cem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop y col., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994). Las genotecas de compuestos pueden estar presentes en solución (véase, por ejemplo, Houghten, BioTechniques 13, 412 - 421, 1992), o sobre perlar (Lam, Nature 354, 82 - 84, 1991), chips (Fodor, Nature 364, 555 - 556, 1993), bacterias o esporas (Landner, patente de Estados Unidos Nº 5.223.409), plásmidos (Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1865 - 1869, 1992), o fago (Scott y Smith, Science 249, 386 - 390, 1990; Devlin, Science 249, 404 - 406, 1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378 - 6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301 - 310, 1991; y Ladner, patente de Estados Unidos Nº 5.223.409).

Selección de alto rendimiento

Los compuestos de ensayo se pueden seleccionar por la capacidad de unirse a polipéptidos o polinucleótidos enzimáticos de tipo prostatina humana o que afectan a la actividad enzimática de tipo prostatina humana o a la expresión génica enzimática de tipo prostatina humana que usa selección de alto rendimiento. Usando la selección de alto rendimiento, muchos compuestos discretos se pueden ensayar en paralelo de manera que grandes números de compuestos de ensayos se pueden seleccionar rápidamente. Las técnicas más ampliamente establecidas utilizan placas de microtitulación de 96 pocillos. Los pocillos de las placas de microtitulación típicamente requieren volúmenes de ensayo que varían entre 50 y 500 \mul. Además de las placas, muchos instrumentos, materiales, pipeteadores, robots, lavadores de placas, y lectores de placas están comercialmente disponibles para ajustarse al formato de 96 pocillos.

Como alternativa, se pueden usar "ensayo de formato libre", o ensayos que no tienen barrera física entre muestras. Por ejemplo, un ensayo que usa células pigmentadas (melanocitos) en un ensayo homogéneo simple para genotecas de péptidos combinatorias está descrito por Jayawickreme y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 19, 1614 - 18 (1994). Las células se colocan en agarosa en placas petri, después se colocan perlas que llevan compuestos combinatorios sobre la superficie de la agarosa. Los compuestos combinatorios están parcialmente liberados de las perlas. Los compuestos activos se pueden visualizar como áreas pigmentadas oscuras debido a que, ya que los compuestos se difunden localmente en la matriz de gel, los compuestos activos provocan que las células cambien de color.

Otro ejemplo del ensayo de formato libre lo describe Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Tradictional Approaches," reseñado en la primera conferencia anula de la sociedad para la selección biomolecular en Filadelfia, Pa. (Nov. 7 - 10, 1995). Chelsky situó un ensayo enzimático homogéneo simple para evaluar la carbonico anhidrasa en el interior de un gel de agarosa de manera que al enzima en el gel provocaría un cambio de color a lo largo de todo el gel. Después de esto, las perlas que llevan compuestos combinatorios por medio de un fotoengarce se situaron dentro del gel y los compuestos se liberaron parcialmente mediante luz UV. Los compuestos que inhibían la enzima se observaron como zonas locales de inhibición que tienen menos cambio de
color.

Todavía otro ejemplo está descrito por Salmon y col., Molecular Diversity 2, 57 - 63 (1996). En este ejemplo, se seleccionaron genotecas combinatorias para los compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre células cancerosas que crecen en agar.

Otro procedimiento de selección de alto rendimiento está descrito por Beutel y col., patente de Estados Unidos 5.976.813. En este procedimiento, las muestras de ensayo se colocan en una matriz porosa. Después e colocan uno o más componentes de ensayo dentro, en la parte superior de, o en el fondo de una matriz tal como un gel, una hoja de plástico, un filtro, u otra forma de soporte sólido fácilmente manipulado. Cuando las muestras se introducen en la matriz porosa se difunden lo suficientemente lentas, de manera que los ensayos se puedan realizar sin que las muestras de ensayo se desarrollen juntas.

Ensayos de unión

Para los ensayos de unión, el compuesto de ensayo es preferiblemente una molécula pequeña que se une a y ocupa, por ejemplo, el sitio de unión de ATP/GTP de la enzima o el sitio activo del polipéptido enzimático de tipo prostatina humana, de manera que se evita la actividad biológica normal. Los ejemplos de tales moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas de péptidos o de tipo péptido.

En los ensayos de unión, o bien el compuesto de ensayo o el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana puede comprender una marca detectable, tal como una marca fluorescente, radioisotópica, quimioluminiscente, o enzimática, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa. La detección de un compuesto de ensayo que se une al polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede después llevar a cabo, por ejemplo, mediante conteo directo de radioemisión, mediante conteo por centelleo, o mediante al determinación de la de la conversión de un sustrato apropiado a un producto detectable.

Como alternativa, la unión de un compuesto de ensayo a un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se pueden determinar sin marcar cualquiera de los interactuantes. Por ejemplo, se puede usar un microfisiómetro para detectar la unión de un compuesto de ensayo con el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Un microfisiómetro (por ejemplo, Citosensor ^{TM}) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su ambiente usando un sensor pootenciométrico dirigible por luz (LAPS). Se pueden usar cambios en estas velocidad de acidificación como un indicador de al interacción entre un compuesto de ensayo y un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana (McConnell y col., Science 257, 1906 - 1912, 1992).

La determinación de la capacidad de un compuesto de ensayo de unirse a un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana también se puede llevar a cabo usando una tecnología tal como Análisis de interacción Biomolecular de tiempo real (BIA) (Sjolander y Urbaniczky, Anal.Chem. 63, 2338 - 2345, 1991, y Szabo y col., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699 - 705, 1995), BIA es una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore ^{TM}). Los cambios en la resonancia de plasmón superficial de fenómeno óptico (SPR) se pueden usar como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede usar como una "proteína de cebo" en un ensayo de dos híbridos o ensayo de tres híbridos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.283.317; Zervos y col., Cell 72, 223 - 232, 1993; Madura y col., J. Biol. Chem. 268, 12046 - 12054, 1993; Bartel y col., BioTechniques 14, 920 - 924, 1993; Iwabuchi y col., Oncogene 8, 1693 - 1696, 1993; y Brent documento WO 94/10300), para identificar otras proteínas que se unen a o interactúan con el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana y modulan su actividad.

El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que constan de dominios de unión y activación de ADN separables. En resumen, el ensayo utiliza dos construcciones diferentes de ADN. Por ejemplo, en una construcción, el polinucleótido que codifica un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se puede condensar a un polinucleótido que codifica el dominio de unión a ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL - 4). En otra construcción una secuencia de ADN que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") puede estar condensada a un polinucleótido que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas de "cebo" y "prey" son capaces de interactuar in vivo para formar un complejo dependiente de proteína, los dominios de unión a ADN y de activación del factor de transcripción están en proximidad estrecha. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ), que está unido de manera operable a una sitio regulador transcripcional sensible al factor de transcripción. La expresión del gen indicador se puede detectar, y las colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional se pueden aislar y para obtener la secuencia de ADN que codifica la proteína que interactúa con el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana.

Puede ser deseable inmovilizar o bien el polipéptido (o polinucleótido) enzimático de tipo prostatina humana o el compuesto de ensayo para facilitar la separación de formas unidas o no unidas de uno o ambos de los interactuantes, así como acomodar la automatización del ensayo. De este modo, o bien el polipéptido (o polinucleótido) enzimático de tipo prostatina humana o el compuesto de ensayo puede estar unido a un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, portaobjetos de vidrio o de plástico, placas de cultivo de tejidos, pocillos de microtitulación, tubos, chips de silicio, o partículas tales como perlas (incluyendo, pero sin limitación a, látex, poliestireno, o perlas de vidrio). Cualquier procedimiento conocido en la técnica se pueden usar para unirse al polipéptido (o polinucleótido) enzimático de tipo prostatina humana o el compuesto de ensayo a un soporte sólido, incluyendo el uso de enlaces covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o pares de restos de unión unidos respectivamente al polipéptido (o polinucleótido) enzimático de tipo prostatina humana o compuesto de ensayo y el soporte sólido. Los compuestos de ensayo están preferiblemente unidos al soporte sólido en un conjunto, de manera que la localización de los compuestos de ensayo individuales se pueden rastrear. La unión de un compuesto de ensayo a un polipéptido (o polinucleótido) enzimático de tipo prostatina humana se pueden llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado que contienen los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga.

El polipéptido enzimático de tipo prostatina humana puede ser una proteína de fusión que comprende un dominio que permite que el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana se una a un soporte sólido. Por ejemplo, las proteínas de fusión glutatión - S - transferasa se pueden adsorber en perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, San Luis, Mo) o placas de microtitulación derivatizadas de glutatión, que después se combinan con el compuesto de ensayo y el polipéptido enzimático de tipo prostatina humana no adsorbido; la mezcal después se incuba en condiciones que conducen a la formación del complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH). Después de la incubación, las perlas o pocillos de placa de microtitulación se lavan para retirar cualesquiera compuestos no unidos. La unión de los interactuantes se puede determinar o bien directa o indirectamente, como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos se pueden disociar del soporte sólido antes de que se determina la unión.

Otras técnicas para la inmovilización de proteínas o polinucleótidos sobre un soporte sólido también se pueden usar en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, o bien un polipéptido (o polinucleótido) enzimático de tipo prostatina humana o un compuesto de ensayo se pueden inmovilizar utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Los polipéptidos (o polinucleótidos) enzimáticos de tipo prostatina humana biotinilados o los compuestos de ensayo se pueden preparar a partir de biotina - NHS(N-hidroxisuccinimida) usando técnicas bien conocidas en al técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.) y se inmovilizan en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas de estreptavidina (Pierce Chemicals). Como alternativa, se pueden derivatizar a los pocillos de la placa, los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido, polinucleótido, enzimático de tipo prostatina humana o un compuesto de ensayo, pero que no interfieren con un sitio de unión deseado, tal como el sitio de unión ATP/GTP o el sitio activo del polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Se puede atrapar diana o proteína no unida en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos.

Los procedimientos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados de GST, incluyen la inmunodeteccción de complejos usando anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido enzimático de tipo prostatina humana o compuesto de ensayo, y electroforesis de gel SDS en condiciones no reductoras.

La selección de los compuestos de ensayo que se unen a un polipéptido o polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana también se puede llevar a cabo en una célula intacta. Cualquier célula que comprende un polipéptido o polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se puede usar en un sistema de ensayo basado en células. Un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana puede ser de origen natural en la célula o se puede introducir usando técnicas tales como los descritos anteriormente. La unión del compuesto de ensayo a un polipéptido o polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se determina como se ha descrito anteriormente.

Ensayos enzimáticos

Los compuestos de ensayo se pueden ensayar para evaluar la capacidad de incrementar o disminuir la actividad de tipo prostatina humana de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. La actividad enzimática de tipo prostatina humana se puede medir, por ejemplo, como se describe en Yu y col., J. Biol. Chem. 269, 18843 - 48, 1994.

Los ensayos enzimáticos se pueden llevar a cabo después de poner en contacto o bien un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana purificado, una preparación de membrana celular, o una célula intacta con un compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que disminuye una actividad de la serina proteasa de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana mediante al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% se identifica como un agente terapéutico potencial para disminuir la actividad enzimática de tipo prostatina humana. Un compuesto de ensayo que incrementa la actividad de la serina proteasa de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% se identifica como un agente terapéutico potencial para aumentar la actividad enzimática de tipo prostatina humana.

Expresión génica

Los compuestos de ensayo que aumentan o disminuyen la expresión génica enzimática de tipo prostatina humana se identifican. Se pone en contacto un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana purificado con un compuesto de ensayo, y se determina la expresión de un producto polipeptídico o de ARN del polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana purificado. El nivel de expresión de un ARNm o polipéptido apropiado en presencia del compuesto de ensayo se compara con el nivel de expresión de ARNm o polipéptido en ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo se puede después identificar como un modulador de expresión basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de un ARNm o polipéptido es mayor en la presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un estimulador o potenciador de la expresión de ARNm o polipéptido. Como alternativa, cuando al expresión del ARNm o polipéptido es menor en la presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un inhibidor de la expresión de ARNm o polipéptido.

El nivel de la expresión de ARNm o polipéptido enzimático de tipo prostatina humana en las células se puede determinar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica para detectar ARNm o polipéptido. Se pueden usar procedimientos o bien cualitativos o cuantitativos. La presencia de productos polipeptídicos de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se puede determinar, por ejemplo, usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo procedimientos inmunoquímicos tales como radioinmunensayo, transferencia de Western, e inmunohisdtoquímica. Como alternativa, la síntesis de polipéptidos se puede determinar in vivo, en un cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro mediante la detección de de la incorporación de aminoácidos marcados en un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana.

Tal selección se puede llevar a cabo o bien en un sistema de ensayo sin células o en una célula intacta. Cualquier célula que expresa un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se puede usar en un sistema de ensayo a base de células. El polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana puede ser de origen natural en la célula o se puede introducir usando técnicas tales como las descritas anteriormente. Se puede usar o bien un cultivo primario o una línea celular estabilizada, tal como CHO o células 293 de riñón embrionario humano.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas que se pueden administrar a un paciente para lograr un efecto terapéutico pueden comprender un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana, polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana, anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana, o miméticos, agonistas, antagonistas, o inhibidores de un polipéptido enzimático de tipo prostatina humana. Las composiciones se pueden administrar solas o en combinación con al menos otro agente, tal como compuesto estabilizador, que se puede administrar en cualquier vehículo estéril, biocompatible farmacéutico, incluyendo, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y agua. Las composiciones se pueden administrar a un paciente solo, o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante cualquier número de vías que incluyen, pero no se limitan a, medio oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, parenteral, tópica, sublingual, o rectal. Las composiciones farmacéuticas para administración oral se pueden formular usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidas en al técnica en dosificaciones adecuadas para la administración oral. Tales vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, ges, jarabes, suspensiones, y similares, para la ingestión por un paciente.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mediante una combinación de compuestos activos con excipientes sólidos, moliendo opcionalmente una mezcal resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir loa auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son carbohidratos o cargas de proteínas, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata, u otras plantas; celulosa, tal es como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o sodio carboximetilcelulosa; gomas que incluyen arábiga o de tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno,. Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes o solubilizantes, tales como la polivinil pirrolidona reticulada, agar, ácido algínico, o una sal de los mismos, tales como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas se pueden usar junto con revestimientos adecuados, tales como soluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos combinados o mezclas de disolventes. Materias colorantes o pigmentos se pueden añadir a los comprimidos o revestimientos de grageas para la identificación de productos o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, por ejemplo, dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste por presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un revestimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener ingredientes activos mezclados con una carga o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalemente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquido, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas de inyección pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como sodio carboximetil celulosa, sorbitol, o dextrano. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones oleosas de inyección adecuadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de asidos grasos sintéticos, tales como electo de etilo o triglicéridos, o liposomas. Los polímeros de amino policatiónicos no lipídicos también se pueden usar para distribución. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Para la administración tópica o nasal, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera particular a pernear. Tales agentes penetrantes se conocen generalmente en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar de una manera que se conoce en la técnica, por ejemplo, por medio de procedimientos de mezcal, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento, o liofilización. La composición farmacéutica se puede proporcionar en forma de una sal y se puede formar con muchos ácidos, incluyendo, pero sin limitación, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a se más solubles en disolventes acuosos u otros protónicos que son las correspondientes formas de base libre. En otros casos, al preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener cualquiera o todo lo siguiente: histidina 1 - 50 mM, sacarosa al 0,1% - 2%, y manitol al 2 - 7%, a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que está combinado con tampón antes de uso.

Los detalles adicionales sobre técnicas de formulación y administración se pueden encontrar en la última edición de REMINGTON PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack Publishing Co., Easton, Pa). Después que se han preparado las composiciones farmacéuticas, se pueden colocar en un recipiente apropiado y marcarse para tratamiento de una afección indicada. Tal marcaje incluirá la cantidad, frecuencia, y procedimiento de administración.

Indicaciones y procedimientos terapéuticos

1.: Invasión y metástasis de células tumorales. El gen enzimático de tipo prostatina humana proporciona una diana terapéutica para disminuir la actividad enzimática de tipo prostatina humana, en particular para tratar o prevenir cáncer metastático. El cáncer es una enfermedad provocada fundamental mente por transformación celular oncogénica. Existen varios sellos de células transformadas que las distinguen de sus homólogas normales y son el fundamento de de al patofisiología de cáncer. Éstos incluyen proliferación celular no controlada, insensibilidad a señales inductoras de muerte (inmortalización), motilidad celular adecuada, e invasividad, capacidad aumentada de restablecer el suministro de sangre a través de la inducción de la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis), inestabilidad genética, y expresión génica desregulada. Diversas combinaciones de estas fisiologías aberrantes, junto con la adquisición de resistencia a fármacos conducen a un estado patológico intratable en el que el fallo de órganos y muerte de pacientes sucede por último.

: La mayoría de las terapias de cáncer convencionales dirigen la proliferación celular y dependen de las capacidades proliferativas diferenciales entre células transformadas y normales para su capacidad. Este planteamiento está impedido por el hecho de que varios tipos de células normales importantes son también altamente proliferativos y esas células cancerosas frecuentemente se hacen resistentes a esos agentes. De este modo, los índices terapéuticos para terapias anticancerosas tradicionales raramente exceden 2,0.

: La llegada de identificación diana molecular dirigida genómica ha abierto la posibilidad de identificar nuevas dianas específicas de cáncer para la intervención terapéutica que proporcionará, tratamientos más seguros, más eficaces para pacientes de cáncer. De este modo, los genes asociados a tumores recientemente descubiertos y sus productos se pueden ensayar para evaluar su(s) papel(es) en la enfermedad y usarse como herramientas para descubrir y desarrollar terapias innovadoras. Los genes que juegan papeles importantes en cualesquiera procesos fisiológicos indicados anteriormente se pueden caracterizar como dianas de cáncer.

: Los genes o fragmentos génicos identificados mediante agentes genómicos se pueden fácilmente expresar en uno o más sistemas de expresión heterólogos para producir proteínas recombinantes funcionales. Estas proteínas se caracterizan in vitro por sus propiedades bioquímicas y después se usan como herramientas en programas de selección molecular de alto rendimiento para identificar moduladores químicos de sus actividades bioquímicas. Los agonistas y/o antagonistas de actividad proteica diana se pueden identificar de estar manera y posteriormente ensayar en modelos celulares y de enfermedad in vivo para evaluar la actividad anticáncer. La optimización de compuestos guía con ensayo iterativo en modelos biológicos y análisis farmacocinéticas y toxicológicos detallados forman la base de desarrollo de fármacos y posterior ensayo en seres humanos.

: Por ejemplo, el bloqueo de un dominio de fibronectina de enziam de tipo prostatina puede suprimir o prevenir la migración o metástasis de células tumorales en respuesta a fibronectina (9, 10). Los cánceres cuya metástasis se pueden suprimir incluyen adenocarcinoma, melanoma, cánceres de la glándula adrenal, vejiga, hueso, mama, cuello de útero, vesícula biliar, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata, testículos, y útero. Las células de tumores circulantes detenidos en los lechos capilares de órganos diferentes debe invadir el revestimiento celular endotelial y membrana basal subyacente (BM) con el fin de invadir el tejido (s) extravascular (es) cuando establecen metástasis (1, 2). Las células tumorales metastáticos a menudo de unen a o cerca de las articulaciones intracelulares entre células endoteliales adyacentes. A tal unión de las células metastáticos sigue la ruptura de las articulaciones, retracción de los bordes de las células endoteliales y migración a través de la rotura en el endotelio hacia la BM subyacente (1, 11).

: Una vez localizadas entre las células endoteliales y la BM, las células invasoras deben degradar las glicoproteínas subendoteliales y proteoglicanos de la BM con el fin de que migren fuera del compartimiento vascular. Se cree que varias enzimas celulares (por ejemplo, colagenasa IV, activador de plasminógeno, catepsina B, elastasa) están implicadas en la degradación de la BM (2, 11). La supersión de la actividad enzimática de tipo prostatina humana se puede por lo tanto usar para suprimir la invasión y metástasis de células tumorales.

2.: Angiogénesis de tumores. El factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF) se ha extraído de la matriz extracelular subendotelial producida in vitro (3) y a partir de las membranas basales de la córnea (4), sugiriendo que al matriz extracelular puede servir como un depósito para bFGF. La tinción inmunohistoquímica reveló la localización de bFGF en membranas basales de tejidos y vasos sanguíneos diversos (5). A pesar de la presencia ubicua de bFGF en tejidos normales, la proliferación celular endotelial en estos tejidos es usualmente muy bajos, que sugiere que bFGF está en algún modo secuestrado de su sitio de acción. Por lo tanto, es posible, que la supresión de al actividad enzimática de tipo prostatina humana puede suprimir la liberación de la bFGF activo de la matriz extracelular y membranas basales. Además, el desplazamiento de bFGF de su almacenamiento dentro de las membranas basales y matriz extracelular puede además proporcionar un mecanismo novedoso para la inducción de neovascularización y situaciones patológicas. La restricción de factores de crecimiento de células endoteliales en al matriz extracelular puede prevenir su acción sistémica sobre el endotelio vascular, de esta manera manteniendo una tasa muy baja de recambio de células endoteliales y desarrollo de vasos. Por otra parte, la liberación del bFGF de almacenamiento en al matriz celular puede provocar la proliferación de células endoteliales y neovascularización en procesos tales como curación de heridas, inflamación y desarrollo de tumores (6, 7).

3.: Inflamación e inmunidad celular. La actividad enzimática de tipo prostatina puede estar implicada en la capacidad de las células activadas del sistema inmune de dejar la circulación e inducir respuestas tanto inflamatorias como autoinmunes. De este modo, la inflamación e inmunidad celular puede estar normalizada mediante la regulación de la actividad de la enzima de tipo prostatina.

4.: Infección viral. La retirada de los componentes de la superficie celular mediante la enzima de tipo prostatina puede influenciar la capacidad de los virus de unirse a la superficie de las células. La regulación de la enzima de tipo prostatina se puede por lo tanto usar para tratar infecciones virales.

5.: Enfermedades neurodegenerativas. También es posible que la actividad enzimática de tipo prostatina se puede usar para degradar, por ejemplo, las placas amiloides de proteína de priones de Genstmann - Straussler Syndrome, Creutzfeldt Jacob disease, y Scrapie.

6.: Reestenosis y aterosclerosis. la proliferación de células de músculo liso (SMC) en respuesta a la lesión endotelial y acumulación de lipoproteínas ricas en colesterol son episodios básicos en la patogénesis de aterosclerosis y reestenosis (8). es posible que la enzima de tipo prostatina puede estar implicada en la ruta catabólica que puede permitir la acumulación celular e intersticial sustancial de lipoproteínas ricas en colesterol. Esta última ruta se espera que sea altamente aterogénica mediante la promoción de la acumulación de lipoproteínas ricas en apoB y apoN (es decir, LDL, VLDL, quilomicrones), independiente de la inhibición por retroalimentación por el contenido en esterol celular. Los niveles alterados de actividad enzimática de tipo prostatina pueden por lo tanto inhibir tanto la proliferación como la acumulación de de SMC y de este modo puede detener la progresión de la progresión de reestenosis y aterosclerosis.

7.: Osteoporosis. la osteoporosis es una enfermedad caracterizada por baja masa ósea y deterioro microarquitectural de tejido óseo, que conduce a un aumento en la fragilidad ósea y un incremento posterior en el riesgo de fractura. Es el trastorno óseo metabólico humano más común. La osteoporosis establecida incluye la presencia de fracturas.

: El recambio óseo se produce por la acción de dos tipos de célula efectoras principales dentro del hueso: el osteoclasto, que es responsable de la resorción ósea, y el osteoblasto, que sintetiza y mineraliza la matriz ósea. Las acciones de los osteoclastos y osteoblastos están altamente coordinadas. Los precursores de osteoclastos se reestablecen en el sitio de recambio, se diferencian y se funden para formar los osteoclastos maduros que después resorben el hueso. Unida a al superficie de hueso, los osteoclastos producen un microambiente ácido en una articulación estrechamente definida entre la membrana del borde de osteoclasto especializado y la matriz ósea, de este modo permitiendo la solubilización localizada de la matriz ósea. esto a su vez facilita la proteolisis del colágeno óseo desmineralizado. La degradación de la matriz se cree que libera el factor de crecimiento asociado a la matriz y citoquinas, que reestablece los osteoblastos de una manera controlada temporal y espacial. Los osteoblastso sintetizan y secretan nuevas proteínas de matriz óseas, y posteriormente mineralizan esta nueva matriz. En el esqueleto normal esto es un proceso fisiológico que no da como resultado un cambio neto en masa ósea. En los estados patológicos, tales como osteoiporosis, el equilibrio entre resorción y formación se altera de manera que se produce pérdida ósea. Véase el documento WO 99/45923.

: El propio osteoclato es al diana directa o indirecta de todos los agentes de osteoporosis actualmente disponibles. La terapia antirresortiva previene la pérdida ósea adicional en individuos tratados. Los osteoblastos se derivan de células del tronco multipotente que reside en la médula ósea y también da lugar a adipositos, condrocitos, fibroblastos y células musculares. La potenciación selectiva de la actividad de osteoblastos es un objetivo altamente deseable para la terapia de osteoporosis daría como resultado un incremento de la masa ósea, mejor que una prevención de pérdida ósea adicional. Una terapia anabólica eficaz se esperaría que condujera a una reducción significativamente mayor en el riesgo de fractura que en los tratamientos actualmente disponibles.

: Los agonistas o antagonistas a los polipéptidos recientemente descubiertos puede actuar como antirresortivo alterando directamente la diferenciación de osteoblastos, adhesión de osteoclastos a la matriz ósea o función de osteoclastos de la degradación de la matriz ósea. Los agonistas o antagonistas podrían indirectamente alterar la función de osteoclastos interfiriendo la síntesis y/o modificación de moléculas efectoras de diferenciación o función de osteoclastos tales como citoquinas, péptido u hormonas esteroides, proteasas, etc.

: Los agonistas o antagonistas a los polipéptidos recientemente descubiertos pueden actuar como anabólicos potenciando directamente la diferenciación de osteoblastos y/o su función formadora de la matriz ósea. Los agonistas o antagonistas podrían también indirectamente alterar la función de osteoblastos potenciando la síntesis de factores de crecimiento, péptido u hormonas esteroiddes o disminuyendo la síntesis de moléculas inhibidoras.

: Los agonistas y antagonistas se pueden usar para imitar, aumentar o inhibir la acción de los polipéptidos recientemente descubiertos que pueden ser útiles para tratar osteoporosis, enfermedad de Paget, degradación de implantes óseos particularmente implantes dentales.

8.: COPD. Enfermedad pulmonar (o vías respiratorias) obstructiva crónica (COPD) es una afección definida fisiológicamente como obstrucción de las vías respiratorias que generalmente se produce por una mezcal de enfisema y obstrucción de las vías respiratorias periféricas debido a bronquitis crónica (Senior y Shapiro, Pulmonary Diseases and Disorders, 3ª ed. Nueva York, McGraw - Hill, 1998, p. 659 - 681, 1998; Barnes, Chest, 117, 10S - 14S, 2000). El enfisema se caracteriza por la destrucción de las paredes alveolares que conducen a un agrandamiento anormal de los espacios aéreos del pulmón. La bronquitis crónica está definida clínicamente por la ausencia de tos productiva crónica durante tres meses en cada uno de los años sucesivos. En COPD, la obstrucción de las vías respiratorias es usualmente progresiva y es solamente parcialmente reversible. Con mucho, el factor de riesgo más importante para el desarrollo de COPD es fumar cigarrillos, aunque la enfermedad se produce en no fumadores.

: La inflamación crónica de las vías respiratorias es una característica patológica calve de COPD (Senior y Shapiro, 1998). La población de las células inflamatorias comprende números crecientes de macrófagos, neutrófilos, y linfocitos CD8^{+}. Los irritantes inhalados, tales como humo de cigarrillos, activan los macrófagos que son residentes en el tracto respiratorio, así como células epiteliales que conducen a la liberación de quimioquinas (por ejemplo, interleuquina - 8) y otros factores quimiotácticos. Esto a factores quimiotácticos actúan para incrementar el tráfico de neutrófilos / monocitos que la sangren el tejido pulmonar y vías respiratorias. Los neutrófilos y monocitos reestablecidos en las vías respiratorias pueden liberar una diversidad de mediadores que dañan potencialmente tales enzimas proteolíticas y especies de oxígeno reactivas. la degradación de matriz y enfisema, junto con el engrosamiento de las paredes de las vías respiratorias, disfunción de tensioactivos, e hipersecreción de moco, son todas secuelas potenciales de esta respuesta inflamatoria que conduce a alteración de las vías respiratorias e intercambio de gas.

: COPD se caracteriza por daño a al matriz extracelular de pulmón y el enfisema se puede ver como el proceso patológico que afecta al parénquima pulmonar. Este proceso eventualmente conduce a la destrucción de las paredes de las vías respiratorias en el agrandamiento del espacio aéreo (Senior y Shapiro, en PULMONARY DISEASES AND DISORDERS, 3ª edición, Nueva York, MacGraw-Hill, 1998, p. 659 - 681, 1998). La observación de la deficiencia no heredada de la antitripsina a1 (a1-AT), el inhibidor primario de la elastasa de neutrófilos, predispone a los individuos a la aparición temprana de enfisema, y la instilación intrapulmunar de enzimas elastólicas en animales experimentales provoca enfisema, conducen a la hipótesis de lastasa:antielastasa para la aptogénesis de enfisema (Eriksson, Acta Med. Scand, 177 (Suppl.), 432, 1965, Gross, J. Occup. Med. 6, 481 - 84, 1964). Estos a su vez conduce al concepto de que al destrucción de elastina en el parénquima pulmonar es la base del desarrollo de enfisema.

: Un amplio intervalo de células inmunes e inflamatorias que incluyen neutrófilos, macrófagos, linfocitos T y eosinófilos contienen enzimas proteolíticas que podrían contribuir a la destrucción de la matriz extracelular pulmonar (Shapiro, 1999). Además, un número de diferentes clases de proteasas se han identificado que tienen el potencial para contribuir a la destrucción de la matriz pulmonar. Éstas incluyen serian proteasas, metaloproteasas de matriz y cisteína proteasas. De estas clases de enzimas, un número puede hidrolizar elastina y se ha mostrado que están elevadas en pacientes de COPD (elastasa de neutrófilos, MMP-2, 9, 12) (Culpitt y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160, 1635 - 39, 1999, Shapiro, Am. J. Crit. Care Med. 160 (5), S29 - S32, 1999).

: Se espera que en el futuro miembros novedosos de las clases existentes de proteasas y nuevas clases de proteasas se identificará que juegan un papel significativo en el daño de la matriz pulmonar extracelular que incluye la proteolisis de elastina. Las dianas de proteasas novedosas permanecen por lo tanto como dianas terapéuticas muy atractivas.

9.: Otras indicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Los anticuerpos enzimáticos de tipo prostatina antihumana se pueden aplicar para la inmunodetección y diagnosis de micrometástasis, lesiones autoinmunes, y fallo renal en especimenes de biopsia, muestras de plasma, y fluidos corporales. Como alternativa, si se desea se puede suministrar una función enzimática de tipo prostatina a una célula introduciendo un polinucleótido que codifica una enzima de tipo prostatina en la célula.

Por ejemplo, un agente identificado como se describe en esta memoria descriptiva (por ejemplo, agente de modulación, uan molécula de ácido nucleico de polaridad opuesta, un anticuerpo específico, ribozima o una pareja de unión polipeptídica) se puede usar en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios de tratamiento con tal agente. Como alternativa, un agente identificado como se describe en esta memoria descriptiva se puede usar en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente.

Un reactivo que afecta la actividad enzimática de tipo prostatina se puede administrar a una célula humana, o bien in vitro o in vivo, para reducir la actividad enzimática de tipo prostatina. El reactivo preferiblemente se une a un producto de expresión de un gen enzimático de tipo prostatina humana. Si el producto de expresión es un polipéptido, el reactivo es preferiblemente un anticuerpo. Para tratamiento de células humanas ex vivo, un anticuerpo se puede añadir a una preparación de células del tronco que se han retirado del cuerpo. Las células se pueden después reemplazar en el mismo u otro cuerpo humano, con o sin propagación clonal, como se conoce en la técnica.

El reactivo se distribuye usando un liposoma. Preferiblemente, el liposoma es estable en el animal que se ha administrado durante al menos aproximadamente 30 minutos, más preferiblemente durante al menos 1 hora, e incluso mas preferiblemente durante al menos 24 horas. Un liposoma comprende una composición de lípidos que es capaz de dirigir un reactivo, particularmente un polinucleótido, a un sitio particular en un animal, tal como un ser humano. Preferiblemente, la composición de lípidos del liposoma es capaz de dirigir a un órgano específico de un animal, tal como el pulmón o hígado.

Un liposoma útil comprende una composición de lípidos que es capaz de fusionarse con la membrana plasmática de la célula diana para distribuir su contenido a la célula. Preferiblemente, la eficacia de transfección de un pilosota es aproximadamente 0,5 \mug de ADN por 16 nmoles de liposomas distribuidos a aproximadamente 10^{6} células, más preferiblemente aproximadamente 1,0 \mug de ADN por 16 nmoles de liposoma distribuido a aproximadamente 10^{6} células, e incluso más preferiblemente aproximadamente 2,0 \mug de ADN por 16 nmoles de liposoma distribuido a aproximadamente 10^{6} células. Preferiblemente, un liposoma está entre aproximadamente 100 y 500 nm, más preferiblemente entre aproximadamente 150 y 450 nm, e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 200 y 400 nm de diámetro.

Los liposomas adecuados para uso incluyen los liposomas usados convencionalmente en, por ejemplo, procedimientos de distribución génica conocidos por los expertos en la técnica. Los liposomas más preferidos incluyen liposomas que tienen una composición lipídica policatiónica y/o liposomas que tienen una estructura central de colesterol conjugada a polietilenglicol. Opcionalmente, un liposoma comprende un compuesto capaz de dirigir el liposoma a una célula tumoral, tal como un ligando de célula tumoral expuesto sobre la superficie exterior del liposoma.

La formación de complejo de un liposoma con un reactivo tal como un oligonucleótido de polaridad opuesta o ribozima se puede lograr usando procedimientos que son convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de estados Unidos Nº 5.705.151). Preferiblemente, entre aproximadamente 0,1 \mug y aproximadamente 10 \mug de polinucleótidos se combina con aproximadamente 8 nmoles de liposomas, más preferiblemente entre aproximadamente 0,5 \mug y aproximadamente 5 \mu de polinucleótido se combinan con aproximadamente 8 nmoles de liposomas, e incluso más preferiblemente aproximadamente 1,0 \mug de polinucleótidos se combina con 8 nmoles de liposomas.

Los anticuerpos se pueden distribuir a tejidos específicos in vivo usando la distribución dirigida mediada por receptores. Las técnicas de distribución de ADN mediada por receptores se muestran, por ejemplo, en, Findeis y col., Trnds in Biotechnol. 11, 202 - 05 (1993); Chiou y col., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRASNFER (J. A. Wolff, ed); Wu y Wu, J. Biol. Chem. 263, 621 - 24 (1988); Wu y col., J. Biol. Chem. 269, 542 - 46 (1994); Zenke y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 3655 - 59 (1990); Wu y col., J. Biol. Chem. 266, 338 - 42 (1991).

Si el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo se pueden construir e introducir en una célula bien ex vivo o in vivo usando técnicas bien establecidas que incluyen, pero no se limitan a, transferencia de ADN mediada por transferina - policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex revestidas por ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, "pistola de genes", y transfección mediada por DEAE o calcio -
fosfato.

Determinación de una dosis terapéuticamente eficaz

La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz estará dentro de la capacidad de los expertos en la técnica. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de ingrediente activo que incrementa o disminuye la actividad enzimática de tipo prostatina humana con relación a la que se produce en la ausencia de la dosis terapéuticamente eficaz.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente o bien en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración apropiado y vía de administración. Tal información se puede después usar para determinar dosis y vías útiles para la administración a seres humanos.

La eficacia y toxicidad terapéutica, por ejemplo, DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y DL_{50} (la dosis letal del 50% de la población), se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales. La relación de dosis del agente tóxico a efectos terapéuticos es el índice terapéutico es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación, DL_{50}/DE_{50}.

Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos de células en estudios animales se usan en al formulación de una dosificación para uso humano. La dosificación contenida en tale composiciones está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía en este intervalo dependiendo de al forma de dosificación empleada, sensibilidad del paciente, y vía de administración.

La dosificación exacta la determinará el facultativo, a la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar suficientes niveles del ingrediente activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado patológico, salud general del sujeto, edad, peso, y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación(es)
de fármacos, sensibilidades a la reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de larga duración se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y velocidad de eliminación de la formulación particular.

Las cantidades de dosificación normal pueden variar entre 0,1 y 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. La guía para las dosificaciones y procedimientos particulares de distribución se proporciona en la bibliografía y está generalmente disponible por los facultativos en la técnica. Los expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para los nucleótidos y para proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la distribución de polinucleótidos o polipéptidos será específica para las células, condiciones, localizaciones particulares, etc.

Las dosificaciones eficaces s in vivo de un anticuerpo están en el intervalo de aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 50 \mug/kg, aproximadamente 50 \mug a aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 500 \mug/kg de peso corporal del paciente, y aproximadamente 200 a aproximadamente 250 \mug/kg de peso corporal de paciente. Para la administración de polinucleótidos que codifican anticuerpos de cadena sencilla, las dosificaciones eficaces s in vivo están en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 ng, 500 ng a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5 \mug a aproximadamente 500, y aproximadamente 20 \mug a aproximadamente 100 \mug de ADN.

Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo es preferiblemente un oligonucleótido de polaridad opuesta o una ribozima. Los polinucleótidos que expresan oligonucleótidos de polaridad opuesta o ribozimas se pueden introducir en las células mediante una diversidad de procedimientos, como se ha descrito anteriormente.

Preferiblemente, un reactivo reduce la expresión de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina o actividad de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, ó 100% con relación a la ausencia del reactivo. La eficacia del mecanismo elegido que disminuye el nivel de expresión de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina o actividad de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina se puede determinar usando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como la hibridación de sondas de nucleótidos para ARNm específico de la enzima de tipo prostatina, RT - PCR cuantitativa, detección inmunológica de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina, o medición de á actividad enzimática de tipo prostatina.

Cualquiera de las composiciones farmacéuticas se puede administrar en combinación con otros agentes terapéuticos apropiados. La selección de los agentes apropiados para uso en la terapia de combinación la pueden hacer los expertos en la técnica, de acuerdo con principios farmacéuticos convencionales. La combinación de los agentes terapéuticos puede actuar de manera sinérgica para efectuar el tratamiento o prevención de los diversos trastornos descritos anteriormente. Usando este planteamiento, se puede ser capaz de lograr la eficacia terapéutica con dosificaciones menores de cada agente, de este modo reduciendo el potencial de los efectos secundarios adversos.

Cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos anteriormente se puede aplicar a cualquier sujeto en necesidad de tal terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y, los más preferiblemente, seres humanos.

Ejemplo 1 Detección de la actividad enzimática de tipo prostatina

El polinucleótido de la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 5 se inserta en el vector de expresión pCEV4 y la expresión del polipéptido enzimático de tipo prostatina del vector pCEV4 obtenido se transfiere a células 293 de riñón embrionario humano. A partir de estas células se obtienen extractos y se mide la actividad proteasa usando sustratos de tiobenciléster, como se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.500.344. Para controlar las actividades enzimáticas de los gránulos y fracciones de columna, se realizan ensayos a temperatura ambi9ente que usan 5,5'-dotiobis-(ácido 2-nitrobenzoici) (DTNB) (Sigma) para detectar el grupo saliente HSBzl (_{410 =} 13600 M^{-1} cm^{-1}).

La actividad de la BLT-esterasa se estima usando un ensayo de microvaloración (Green y Shaw, Anal. Biochem. 93, 223 - 226, 1979). En resumen, se añaden 50 \mul de muestra a 100 \mul de DTNB 1 mM, preparado en HEPES 10 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, pH 7,2. La reacción se inicia mediante la adición de 50 \mul de BLT (Sigma) proporcionando una concentración final de 500 \muM. Para las determinaciones de Metase, se añaden 50 \mul de diluciones de la muestra en HEPES 0,1 M, CaCl_{2} 0,05 M, pH 7,5 a 100 \mul de DTNB 1 mM, y la reacción se inicia mediante la adición de 50 \mul de Boc - Ala - Ala - Met - S Bencil (Bzl) proporcionando una concentración final de 150 \muM. La duración del ensayo depende del desarrollo de color, la velocidad a la que se mide (DO _{410}) sobre un lector de microplacas Dynatech MR 5000. Se desarrollan controles de la muestra y DTNB solos o DTNB y sustrato solos.

Para comparaciones más sensibles de actividades enzimáticas, se usan sustratos de tiobencil éster para medir las actividades de la proteasa. El sustrato de quimasa Suc - Phe - Leu - Phe - SBzl se compra de BACHEM Bioscience Inc, Filadelfia, Pa, Z - Arg - SBzl (el sustrato de triptasa, Kam y col., J. Biol. Chem. 262, 3444 - 3451, 1987); Boc - Ala - Ala - AA - SBzl (AA = Asp, Met, Lau, Nle, o Ser), y Suc - Ala - Ala - Met - SBzl (Odake y col., Biochemistry 30, 2217 - 2227, 1991; Harper y col., Biochemistry 23, 2995 - 3002, 1984) se sintetizan previamente. Boc - Ala - Ala - SBzl es el sustrato para Asp - asa el péptido tiobencil ésteres que contienen Met, Leu o Nle son sustratos para Met - asa SP. Los ensayos se realizan a temperatura ambiente en tampón HEPES 0,1 M, pH 7,5, que contiene CaCl_{2} 0,01 M y Me_{2}O al 8% usando 4,4'- ditiopiridina 0,34 mM (Aldritiol-4, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis) para detectar el grupo saliente HSBzl que reacciona con 4,4'-ditiopiridina para liberar tiopiridona (324 = 19800 M^{-1} cm^{-1}, Grasetti y Murray, Arch. Biochem. Biophys. 119, 41 - 49, 1967). Las tasas iniciales se miden a 324 nm usando un espectrofotómetro Beckman 35 cuando se añaden 10 - 25 \mul de una solución made de enzima a una cubeta que contiene 2,0 ml de tampón, 150 \mul de 4,4'-ditiopiridina, y 25 \mul de sustrato. Se añaden el mismo volumen de sustrato y 4,4'-ditiopiridina a la célula de referencia con el fin de compensar la tasa de hidrólisis de fondo de los sustratos. Las tasas iniciales se miden por duplicado para cada concentración de sustrato y se promedian en cada caso. Las concentraciones de sustrato son 100 - 133 \muM. Se muestra que el polipéptido de la SEQ ID Nº 2 y o la SEQ ID Nº 6 tienen actividad enzimática de tipo prostatina.

Ejemplo 2 Identificación de un compuesto de ensayo que se une a un polipéptido enzimático de tipo prostatina

Los polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina purificados que comprenden una proteína glutation-S-transefrasa y se absorben en placas de microvaloración de 96 pocillos derivatizadas de glutation se ponen en contacto con los compuestos de ensayo de una genoteca de moléculas pequeñas a pH 7,0 en una solución de tampón fisiológico. Los polipéptidos enzimáticos de tipo prostatina comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº 2 o la SEQ ID Nº 6. Los compuestos de ensayo comprenden una marca fluorescente. Las muestras se incuban durante 5 minutos a una hora. Las muestras de control se incuban en ausencia de un compuesto de ensayo.

La solución tampón que contiene los compuestos de ensayo se lava a partir de los pocillos. La unión de un compuesto de ensayo a un polipéptido enzimático de tipo prostatina se detecta mediante mediciones de fluorescencia del contenido de los pocillos. Un compuesto de ensayo que incrementa la fluorescencia en un pocillo en al menos 15% con reacción a la fluorescencia de un pocillo en el que no se incubó un compuesto de ensayo se identifica como un compuesto que se une a un polipéptido de tipo prostatina.

Ejemplo 3 Identificación de un compuesto de ensayo que disminuye la actividad enzimática de tipo prostatina

Se ponen en contacto extractos celulares de la línea celular de cáncer de colon humano HCT116 con compuesto de ensayo de una genoteca de moléculas pequeñas y se ensayan para evaluar la enzimática de tipo prostatina. Los extractos control, en la ausencia de un compuesto de ensayo, también se ensayan. La actividad de la proteasa se puede medir usando sustratos de tiobenciléster, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.5000.344. Para controlar las actividades enzimáticas de los gránulos y fracciones de columna, se realizan ensayos a temperatura ambiente usando 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) (Sigma) para detectar el grupo saliente HSBzl (410 = 13600 M^{-1}
cm^{-1}).

La actividad de la BTL-esterasa se estima usando un ensayo de microtitulación (Green y Shaw, Anal. Brochem. 93, 223 - 226, 1979). En resumen, se añaden 50 \mul de muestra a 100 \mul de DTNB 1 mM, preparado en HEPES 10 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, pH 7,2. La reacción se inicia mediante la adición de 50 \mul de BLT (Sigma) proporcionando una concentración final de 500 \muM. Para las determinaciones de Metase, se añaden 50 \mul de diluciones de la muestra en HEPES 0,1 M, CaCl_{2} 0,05 M, pH 7,5 a 100 \mul de DTNB 1 mM, y la reacción se inicia mediante la adición de 50 \mul de Boc - Ala - Ala - Met - S Bencil (Bzl) proporcionando una concentración final de 150 \muM. La duración del ensayo depende del desarrollo de color, la velocidad a la que se mide (DO _{410}) sobre un lector de microplacas Dynatech MR 5000. Se desarrollan controles de la muestra y DTNB solos o DTNB y sustrato solos.

Para comparaciones más sensibles de actividades enzimáticas, se usan sustratos de tiobencil éster para medir las actividades de la proteasa. El sustrato de quimasa Suc - Phe - Leu - Phe - SBzl se compra de BACHEM Bioscience Inc, Filadelfia, Pa, Z - Arg - SBzl (el sustrato de triptasa, Kam y col., J. Biol. Chem. 262, 3444 - 3451, 1987); Boc - Ala - Ala -
AA - SBzl (AA = Asp, Met, Lau, Nle, o Ser), y Suc - Ala - Ala - Met - SBzl (Odake y col., Biochemistry 30, 2217 -
2227, 1991; Harper y col., Biochemistry 23, 2995 - 3002, 1984) se sintetizan previamente. Boc - Ala - Ala - SBzl es el sustrato para Asp - asa el péptido tiobencil ésteres que contienen Met, Leu o Nle son sustratos para Met - asa SP. Los ensayos se realizan a temperatura ambiente en tampón HEPES 0,1 M, pH 7,5, que contiene CaCl_{2} 0,01 M y Me_{2}O al 8% usando 4,4'- ditiopiridina 0,34 mM (Aldritiol-4, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis) para detectar el grupo saliente HSBzl que reacciona con 4,4'-ditiopiridina para liberar tiopiridona (324 = 19800 M^{-1} cm^{-1}, Grasetti y Murray, Arch. Biochem. Bipphys. 119, 41 - 49, 1967). Las tasas iniciales se miden a 324 nm usando un espectrofotómetro Beckman 35 cuando se añaden 10 - 25 \mul de una solución made de enzima a una cubeta que contiene 2,0 ml de tampón, 150 \mul de 4,4'- ditiopiridina, y 25 \mul de sustrato. Se añaden el mismo volumen de sustrato y 4,4'-ditiopiridina a la célula de referencia con el fin de compensar la tasa de hidrólisis de fondo de los sustratos. Las tasas iniciales se miden por duplicado
para cada concentración de sustrato y se promedian en cada caso. Las concentraciones de sustrato son 100 - 133 \muM.

Como alternativa, la actividad de la prostatina se puede medir como se describe en Yu y col., J. Biol. Chem. 269, 11843 - 48, 1994.

Un compuesto de ensayo que disminuye la actividad enzimática de tipo prostatina del extracto con relación al extracto control en al menos 20% se identifica como un inhibidor enzimático de tipo prostatina.

Ejemplo 4 Identificación de un compuesto de ensayo que disminuye la expresión del gen de la enzima de tipo prostatina

Un compuesto de ensayo se administra a un cultivo de la línea de células tumorales de mama MDA-468 y se incuba a 37ºC durante 10 a 45 minutos. Un cultivo del mismo tipo de células se incuba durante el mismo tiempo sin el compuesto de ensayo proporciona un control negativo.

Se aísla ARN de los dos cultivos como se describe en Chirgwin y col., Biochem. 18, 5294 - 99, 1979). Se preparan transferencias de Northern usando 20 a 30 \mug de ARN total y se hibrida con una sonda específica de enzima de tipo prostatina marcada con ^{32}P a 65ºC en Express - hyb (CLONTECH). La sonda comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados entre el complemento de la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 5. Un compuesto de ensayo que disminuye la señal específica de enzima de tipo prostatina con relación a la señal obtenida en la ausencia del compuesto de ensayo se identifica como un inhibidor de la expresión del gen de la enzima de tipo prostatina.

Ejemplo 5 Tratamiento de un tumor de mama con un reactivo que se une específicamente a un producto génico de la enzima de tipo prostatina

La síntesis de oligonucleótidos de la enzima de tipo prostatina que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos seleccionados entre el complemento de la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID No 5 se realiza sobre un sintetizador de serie de Pharmacia Gene Assembler usando el procedimiento de fosforamidito (Uhlmann y col., Chem. Rev. 90, 534 - 83, 1990). Después del ensamble y desprotección, los oligonucleótidos se precipitan en etanol dos veces, se secan, y se suspenden en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la concentración deseada. La purificación de estos oligonucleótidos se ensaya mediante electroforesis de gel capilar y HPLC de intercambio iónico. Los niveles de endotoxinas en la preparación de oligonucleótido se determinan usando el ensayo Limulus Amebocyte (Bang, Biol, Bull. (Woods Hole, Mass.) 105, 361 - 362, 1953).

Una composición acuosa que contiene los oligonucleótidos de polaridad opuesta a una concentración de 0,1 - 100 \muM se inyecta directamente en un tumor de mama con una aguja. La aguja se coloca en los tumores y se extrae mientras la expresión de la composición acuosa dentro del tumor.

El tumor de mama se controla durante un período de días o semanas. Se pueden proporcionar durante ese tiempo inyecciones adicionales de los oligonucleótidos de polaridad opuesta. La metástasis del tumor de mama se suprime debido al descenso de la actividad de la enzima de tipo prostatina de las células tumorales de mama.

Ejemplo 6 Expresión de la serina proteasa de tipo prostatina humana recombinante

El vector de expresión de Pichia pastoris pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) se usa para producir grandes cantidades de los polipéptidos de la serina proteasa de tipo prostatina humana recombinante en levadura. La secuencia de ADN que codifica la serina proteasa de tipo prostatina humana se deriva de la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 5. Antes de la inserción en el vector pPICZB, la secuencia de ADN se modifica mediante procedimientos bien conocidos de tal forma que contiene en su extremo 5' un codón de inicio y en su extremo 3' un sitio de escisión de enteroquinasa, y una marca indicadora His6 y un codón de terminación. Además, en ambas secuencias de reconocimiento de los extremos para las endonucleasas de restricción se añaden después de la digestión del sitio de clonación múltiple de pPICZ B con las correspondientes enzimas de restricción la secuencia de ADN modificada se liga en pPICZB. El vector de expresión se diseña para la expresión inducible en Pichia pastoris, conducida por un promotor de levadura. El vector pPICZ/md - His6 resultante se usa para transformar la levadura.

La levadura se cultiva en condiciones usuales en matraces de 5 litros y la proteína producida de manera recombinante se aísla del cultivo mediante cromatografía de afinidad (resina Ni-NTA) en presencia de urea 8 M. El polipéptido unido se eluye con tampón, pH 3,5, y se neutraliza. La separación del polipéptido de la marca indicadora His6 se realiza mediante proteolisis específica del sitio usando enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se obtiene el polipéptido de la serina proteasa de tipo prostatina humana.

Ejemplo 7 Ensayo in vivo de la validación de compuestos/diana 1. Ensayos mecánicos agudos 1.1 Reducción en los niveles de hormona en plasma mitogénica

Este ensayo de no tumor mide la capacidad de un compuesto de reducir o bien el nivel endógeno de una circulante o el nivel de hormona producida en respuesta a un estímulo biológico. Se administra a los roedores compuesto de ensayo (p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c.). A un tiempo predeterminado después de la administración del compuesto de ensayo, se recoge el plasma sanguíneo. Se ensaya el plasma para evaluar los niveles de la hormona de interés. Si los niveles circulantes normales de la hormona son demasiado bajos y/o variable para proporcionar resultados consistentes, el nivel de la hormona se puede elevar mediante un pretratamiento con un estímulo biológico (es decir, LHRH se puede inyectar i. m. en ratones a una dosificación de 30 ng/ratón para inducir un impulsos de síntesis de testosterona). El programa de de recogida de plasma se ajustaría para que coincida con el pico de la respuesta de hormona inducida. Los efectos de los compuestos de comparan con el grupo control vehículo - tratado. Se realiza un ensayo F para determinar si la varianza es igual o desigual seguido de un ensayo de t de Student. La significación es valor de p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control del vehículo.

1. 2. Mecanismo de fibra hueca de ensayo de acción

Las fibras huecas se preparan con línea(s) celular(es) deseada(s) y se implantan intraperitonealmente y/o subcutáneamente en roedores. Los compuestos de administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c. Se recogen las fibras de acuerdo con el protocolo de ensayo de lector específico, éstos pueden incluir ensayos para la expresión génica (bADN, PCR, o TaqMan), o una actividad bioquímica específica (es decir, niveles de AMPc. Los resultados se analizan mediante ensayo de t de Student, con significación a p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control de vehículo.

2. Ensayos in vivo funcionales subagudos 2 1. Reducción de masa de tejidos dependientes de hormona

Éste es otro ensayo no - tumor que mide la capacidad de un compuesto de reducir la masa de un tejido dependiente de hormona (es decir, vesículas seminales en machos y úteros en hembras). Se administra a los roedores compuesto de ensayo (p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c.) de acuerdo con un programa predeterminado y durante una duración predeterminada (es decir, 1 semana). A la terminación del estudio, se pesan los animales, se elimina es órgano diana, se expresa cualquier fluido, y el peso del órgano se registra. También se puede recoger plasma sanguíneo. El plasma se puede ensayar para determinar los niveles de una hormona de interés o para niveles de un agente de ensayo. Los pesos de los órganos se pueden compra directamente o se pueden normalizar para el peso corporal del animal. Los efectos del compuesto se comparan con el grupo control tratado con vehículo. Se realiza un ensayo F para de terminar si al varianza es igual o desigual seguido de un ensayo de t de Student. La significación es valor de p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control del vehículo.

2. 2. Ensayo de proliferación de fibra hueca

Las fibras huecas se preparan con línea(s) celular(es) deseada(s) y se implantan intraperitonealmente y/o subcutáneamente en roedores. Los compuestos de administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c. Se recogen las fibras de acuerdo con el protocolo de ensayo de lector específico. La proliferación celular se determina midiendo un marcador de un número de células (es decir, MTT o LDH). El número de células y cambio en número de células del inóculo de partida se analizan mediante el ensayo de t de Student o ensayo de Rank Sum después de que la varianza entre grupos se compare mediante un ensayo F, con significación a p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control de vehículo.

2. 3. Modelos antiangiogénesis 2. 3. 1. Angiogénesis corneal

Gránulos Hydron son o sin factores de crecimiento o células se implantan en un microbolsillo creado quirúrgicamente en la córnea del roedor. La administración del compuesto puede ser sistémica o local (compuesto mezclado con factores de crecimiento en el gránulo de hydron). Se recogen las córneas a los 7 días después del implante inmediatamente después de la infusión intracardíaca de carbono coloidal y se fijan en formalina al 10%. La lectura se puntúa de manera cualitativa y/o análisis de imagen. Las puntuaciones cualitativas se comparan mediante ensayo de Rank Sum. Los datos de análisis de imágenes se evalúan midiendo el área de neovascularización (en píxeles) y las medias de los grupos se comparan mediante ensayo de t de Student (2 colas). La significación es p < 0,05 cuando se compara con el grupo del factor de crecimiento o células solamente.

2. 3. 2. Angiogénesis de Matrigel

Matrigel, que contiene células o factores de crecimiento, se inyecta subcutáneamente. Los compuestos de administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c. Se recogen obturadores de Matrigel en momentos de tiempo predeterminados y se preparan para lectura. La lectura en un ensayo basado en ELISA para la concentración de hemoglobina y/o examen histológico (es decir, recuento de vasos, tinción especial de marcadores se superficie endotelial: CD31, factor-8). Las lecturas se analizan mediante ensayo de t de Student, después la varianza entre grupos de compara mediante un ensayo F, con la significación determinada a p < 0,05 cuando se compara a con el grupo control de vehículo.

3. Eficacia antitumoral primaria 3. 1. Modelos de terapia tempranos 3. 1. 1. Tumor subcutáneo

Células o fragmentos tumorales de implantan subcutáneamente el día 0. Se administran vehículo y/o compuestos p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado comenzando en un tiempo, usualmente el día 1, antes de la capacidad de medir el peso del tumor. Se registran los pesos corporales y medidas de los tumores 2 - 3 veces a ala semana. Se calculan los pesos del cuerpo y tumores netos medios para cada día de recogida de datos. La eficacia anti tumor se puede determinar inicialmente comparando el tamaño de los tumores tratados (T) y control (C) en un día dado mediante el ensayo de t de Student, después la varianza entre grupos se compara mediante un ensayo F, con una significación determinada a p \leq 0,05. El experimento también se puede continuar pasado el final de la dosificación en cuyo caso las mediciones de tumor se continuarían para registrar y controlar el retraso de crecimiento de tumor. Los retrasos de crecimiento de tumor se expresan como la diferencia en el tiempo mediano para los grupos tratados y de control para alcanzar un tamaño predeterminado dividido por el tiempo mediano para el grupo de control en alcanzar ese tamaño. Los retrasos de crecimiento de comparan generando curvas de Kaplan - Meier a partir de los tiempos para los tumores individuales en alcanzar el tamaño de evaluación. La significación es \leq 0,05.

3. 1. 2. Modelos de tumores intraperitoneales / intracraneales

Células de tumores se inyectan intraperitonealmente o intracranealmente el día 0. Los compuestos se administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado comenzando el día 1. Se registran las observaciones de morbilidad y/o mortalidad dos veces al día. Se miden los pesos corporales y se registran dos veces a la semana. Los datos de morbilidad/mortalidad se expresan en términos del tiempo mediano de de supervivencia y el número de supervivientes a largo plazo se indica de manera separada. La significación es < 0,05 mediante un ensayo de log- intervalo comparado con el grupo control en el experimento.

3. 2. Modelos de enfermedad establecido

Células o fragmentos de tumores se implantas subcutáneamente y se desarrollan hasta el tamaño deseado para que el tratamiento comience. Una vez en el intervalo de tamaño predeterminado, los ratones se distribuyen al azar en grupos de tratamiento. Los compuestos se administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado. Los pesos de los tumores y del cuerpo se miden y se registran 2 - 3 veces al día y se representan gráficamente para comparación. Se realiza un ensayo F si la varianza es igual o desigual seguido de un ensayo de t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo de control. Las mediciones de tumor se pueden registrar después de que la dosificación se ha detenido para controlar el retraso de desarrollo de tumor. Los retrasos de crecimiento de tumor se expresan como la diferencia en el tiempo mediano para los grupos tratados y de control para alcanzar un tamaño predeterminado dividido por el tiempo mediano para el grupo de control en alcanzar ese tamaño. Los retrasos de crecimiento de comparan generando curvas de Kaplan - Meier a partir de los tiempos para los tumores individuales en alcanzar el tamaño
de evaluación. La significación es el valor de p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo de control de vehículo.

3.3. Modelos de enfermedad ortotópicos 3. 3. 1. Ensayo de almohadilla de grasa mamaria

Células o fragmentos de tumores, de origen adenocarcinoma mamario, se implantan directamente en una almohadilla de grasa mamaria expuesta y reflejada quirúrgicamente en roedores. La almohadilla de grasa se vuelve a colocar en su posición original y se cierra el sitio quirúrgico. También se pueden administrar hormonas a los roedores para soportar el crecimiento de los tumores. Los compuestos de administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado. Los pesos de los tumores y del cuerpo se miden y se registran 2 - 3 veces al día. Los pesos de los tumores medios de todos los grupos después de la inoculación se representan gráficamente para comparación. Se realiza un ensayo F si la varianza es igual o desigual seguido de un ensayo de t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo de control.

Las mediciones de tumor se pueden registrar después de que la dosificación se ha detenido para controlar el retraso de desarrollo de tumor. Los retrasos de crecimiento de tumor se expresan como la diferencia en el tiempo mediano para los grupos tratados y de control para alcanzar un tamaño predeterminado dividido por el tiempo mediano para el grupo de control en alcanzar ese tamaño. Los retrasos de crecimiento de comparan generando curvas de Kaplan - Meier a partir de los tiempos para los tumores individuales en alcanzar el tamaño de evaluación. El valor de significación de p es \leq 0,05 cuando se compara con el grupo de control de vehículo. Además, este modelo proporciona una oportunidad de incrementar al tasa de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La metástasis se puede determinar a la terminación del estudio contando el número de focos visibles por órgano diana, o midiendo el peso del órgano diana. Las medias de estos puntos finales se comparan mediante el ensayo de t de Student después de llevar a cabo un ensayo F, con significación determinada a p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control en el experimento.

3. 3. 2. Ensayo intraprostático

Células o fragmentos de tumores, de origen adenocarcinoma prostático, se implantan directamente en un lóbulo dorsal expuesto quirúrgicamente de la próstata en roedores. La próstata se externaliza mediante una incisión abdominal de manera que el tumor se pueda implantar específicamente en el lóbulo dorsal mientras se verifica que que el implante no entra en las vesículas seminales. La próstata inoculada con éxito se vuelve a colocar en el abdomen y piel se cierran. También se pueden administrar hormonas a los roedores para soportar el crecimiento de los tumores. Los compuestos de administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado. Los pesos de los tumores y del cuerpo se miden y se registran 2 - 3 veces al día. En un momento predeterminado, el experimento se termina y el animal se disecciona. El tamaño del tumor primario se mide en tres dimensiones usando o bien un calibre o un micrómetro ocular unido a una extensión de disección. Se realiza un ensayo F si la varianza es igual o desigual seguido de un ensayo de t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo de control. Este modelo proporciona una oportunidad de incrementar la tasa de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La metástasis se puede determinar a la terminación del estudio contando el números de focos visibles por órgano diana (es decir, los pulmones), o midiendo el peso del órgano diana (es decir, los ganglios linfáticos regionales). Las medias de estos puntos terminales se comparan mediante ensayo de t de Student después de llevar a cabo un ensato de F, con la significación determinada a p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control en el
experimento.

3. 3. 3. Ensayo intrabronquial

Células de tumores de origen pulmonar se pueden implantar intrabronquialmente realizando una incisión a través de la piel y exponiendo la tráquea. La tráquea se agujerea con el extremo biselado de una aguja de 25 de galga y las células de tumores se inoculan en el bronquio principal usando una aguja de galga 27 terminada aplastada con una curva de 90º. Los compuestos se administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado. Los pesos de los tumores y del cuerpo se miden y se registran 2 - 3 veces al día. En un momento predeterminado, el experimento se termina y el animal se disecciona. El tamaño del tumor primario se mide en tres dimensiones usando o bien un calibre o un micrómetro ocular unido a una extensión de disección. Se realiza un ensayo F si la varianza es igual o desigual seguido de un ensayo de t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo de control. Este modelo proporciona una oportunidad de incrementar la tasa de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La metástasis se puede determinar a la terminación del estudio contando el números de focos visibles por órgano diana (es decir, pulmón contralateral), o midiendo el peso del órgano diana. Las medias de estos puntos terminales se comparan mediante ensayo de t de Student después de llevar a cabo un ensato de F, con la significación determinada a p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control en el experimento.

3. 3. 4. Ensayo intracecal

Células de tumores de origen gastrointestinal se pueden implantar intracelalmente realizando una incisión abdominal a través de la piel externalizando el intestino. Se inoculan células de tumores en la pared cecal sin penetrar el lumen del intestino usando una aguja de galga 27 ó 30. Los compuestos se administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado. Los pesos de los tumores y del cuerpo se miden y se registran 2 - 3 veces al día. En un momento predeterminado, el experimento se termina y el animal se disecciona. El tamaño del tumor primario se mide en tres dimensiones usando o bien un calibre o un micrómetro ocular unido a una extensión de disección. Se realiza un ensayo F si la varianza es igual o desigual seguido de un ensayo de t de Student para comparar los tamaños de los tumores en los grupos tratados y control al final del tratamiento. La significación es p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo de control. Este modelo proporciona una oportunidad de incrementar la tasa de metástasis espontánea de este tipo de tumor. La metástasis se puede determinar a la terminación del estudio contando el números de focos visibles por órgano diana (es decir, el hígado), o midiendo el peso del órgano diana. Las medias de estos puntos terminales se comparan mediante ensayo de t de Student después de llevar a cabo un ensayo de F, con la significación determinada a p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control en el
experimento.

4. Eficacia antitumoral secundaria (metastática) 4. 1. Metástasis espontánea

Células de tumores se inoculan s. c. y los tumores se dejan crecer a un intervalo predeterminado para estudios de metástasis espontánea al pulmón o hígado. Después se escinden los tumores primarios. Los compuestos se administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado que puede incluir el período que conduce a la escisión de del tumor primario para evaluar las terapias dirigidas a la inhibición de las fases tempranas de metástasis tumoral. Las observaciones de morbilidad y/o mortalidad se registran diariamente. Los pesos corporales se miden y registran dos veces a la semana. Los puntos finales potenciales incluyen tiempo de supervivencia, números de focos visibles por órgano diana, o peso de órgano diana. Cuando se usa el tiempo de supervivencia en el punto final no se determinan los otros valores. Los datos de supervivencia se usan para generar curvas de Kaplan - Meier. La significación es p \leq 0,05 mediante un ensayo de log - intervalo comparado con el grupo de control en el experimento. El número medio de focos de tumores visibles, como se determina en un microscopio de disección, y los pesos de órgano diana se comparan mediante ensato de t de Student después de conducir un ensayo de F, con la significación determinada a p \leq 0,05 cuando se compara con el grupo control en el experimento para ambos de estos puntos finales.

4. 2. Metástasis forzada

Células de tumores se inyectan en la vena de al cola, vena portal, o el ventrículo izquierdo del corazón en estudios de metástasis de pulmón, hígado, y hueso experimentales (forzados), respectivamente. Los compuestos se administran p. o., i. p., i. v., i. m., o s. c., de acuerdo con un programa predeterminado. Las observaciones de morbilidad y/o mortalidad se registran diariamente. Los pesos corporales se miden y registran dos veces a la semana. Los puntos finales potenciales incluyen tiempo de supervivencia, números de focos visibles por órgano diana, o peso de órgano diana. Cuando se usa el tiempo de supervivencia en el punto final no se determinan los otros valores. Los datos de supervivencia se usan para generar curvas de Kaplan - Meier. La significación es p < 0,05 mediante un ensayo de log - intervalo comparado con el grupo de control en el experimento. El número medio de focos de tumores visibles, como se determina en un microscopio de disección, y los pesos de órgano diana se comparan mediante ensato de t de Student después de conducir un ensayo de F, con la significación determinada a p < 0,05 cuando se compara con el grupo control en el experimento.

Ejemplo 8 Ensayo de proliferación de inhibición: los oligonucleótidos de polaridad opuesta suprimen el crecimiento de líneas celulares cancerosas

La línea celular usada APRA el ensayo es la línea celular de cáncer de colon HCT116. Las células se cultivan en RPMI-1640 con suero de ternera fetal al 10 - 15% a una concentración de 10.000 células por mililitro en un volumen de 0,5 ml y se mantiene a 37ºC en una atmósfera 95% de aire/5% de CO_{2}.

Los oligonucleótidos defosforotioato se sintetizan en un sintetizador de ADN modelo 380B de Applied Biosystems usando química de fosforoamidito. Se usa una secuencia de 24 bases complementarias a los nucleótidos en la posición 1 a 24 de la SEQ ID Nº 1 o SEQ ID Nº 5 como el oligonucleótido de ensayo. Como control, se usa otra secuencia: 5' - TCA ACT GAC TAG ATG TAC ATG GAC - 3'. Después de ensamblaje y desprotección, los oligonucleótidos se precipitan con etanol dos veces, se seca, y se suspenden en solución salina tamponada con fosfato a la concentración deseada. La pureza de los oligonucleótidos se ensaya mediante electroforesis en gel capilar y HPLC de intercambio iónico. Los oligonucleótidos purificados se añaden al medio de cultivo a una concentración de 10 \muM una vez al día durante siete días.

La adición del oligonucleótido de ensayo durante siete días da como resultado una reducción significativa de la expresión de la serina proteasa de tipo prostatina humana como se determina por transferencia de Western. Este efecto no se observa con el oligonucleótido de control. Después de 3 a 7 días, el número de células en los continuos de continua usando un contador d4e células automático. El número de células tratadas con el oligonucleótido de ensayo (expresado como 100%) se compara con el número de células en cultivos tratados con el oligonucleótido de control. El número de células tratadas con el oligonucleótido de ensayo es más del 30% del control, que indica que la inhibición de la serina proteasa de tipo prostatina humana sobre células de cáncer.

Ejemplo 9 Ensayo in vivo de validación de compuestos/diana 1. Dolor Dolor agudo

El dolor agudo se mide sobre una placa caliente principalmente en ratas. Se usan dos variantes de ensayo de placa caliente: en la variante clásica los animales variantes se ponen en una superficie caliente (52 a 56ºC) y se mide el tiempo de latencia hasta que los animales muestran comportamiento nocifensivo, tal como por etapas o lamedura de las patas. La otra variante es una placa caliente de temperatura creciente donde los animales experimentales se ponen sobre una superficie de temperatura neutra. Posteriormente esta superficie se calienta de manera lenta pero constante hasta que los animales comienzan a lamer una pata trasera. La temperatura que se alcanza cuando el lamido de la pata trasera comienza se mide para evaluar el umbral de dolor.

Los compuestos se ensayan contra un grupo de control tratado con vehículo. La aplicación de la sustancia se realiza en momentos de tiempo diferente mediante vías de aplicación diferentes (i. v., i. p. p. o., i. t., i. c. v., s. c., intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de dolor.

Dolor persistente

El dolor persistente se mide con el ensayo de formalina o capsaicina, principalmente en ratas. Una solución de formalina al 1 a 5% o 10 a 100 \mug de capsaicina se inyecta en una pata trasera del animal experimental. Después de la aplicación de formalina o capsaicina los animales muestran reacciones nocifensivas de tipo retroceso, lamido y golpeado de la pata afectada. El número de reacciones nocifensivas dentro de un marco de tiempo de hasta 90 minutos es una medida de al intensidad de dolor.

Los compuestos se ensayan contra un grupo de control tratado con vehículo. La aplicación de sustancias se realiza en momentos de tiempo diferentes mediante vías de aplicación diferentes (i. v., i. p., p. o., i. t., i. c. v., s. c., intradérmica, transdérmica) antes de la administración de formalina o capsaicina.

Dolor neuropático

El dolor neuropático se induce mediante variantes diferentes de lesión de nervio ciático unilateral principalmente en ratas. La operación se realiza bajo anestesia. La primera variante de lesión de nervio ciático se produce colocando ligaduras constrictoras holgadas alrededor del nervio ciático común. La segunda variante es al ligadura estrecha de aproximadamente la mitad del diámetro del nervio ciático común. En la siguiente variante, se usa un grupo de modelos en el que las ligaduras o secciones transversales se hacen de los nervios espinales o bien Ly o L6, o el nervio espinal L% solamente. La cuarta variante implica una axotomia de las tres ramas terminales del nervio ciático (nervios tibial y común perineales) que dejan el nervio sural restante intacto mientras que la última variante comprende la axotomía de solamente la rama tibial que deja los nervios sural y común sin lesionar. Los animales de control se tratan con una operación fingida.

Después de la operación, los animales lesionados en los nervios desarrollan una alodinia mecánica crónica, alodinia fría, así como una hiperalgesia térmica. La alodinia mecánica se mide por medio de un transductor de presión (anestesiómetro electrónico de von Frey, IITC Inc. - Life Science Instruments, Woodland Hills, S. A, Estados Unidos; sistema electrónico von Frey, Somedic sales AB, Orbi, Suecia). La hiperalgesia térmica se mide por medio de una fuente de calor radiante (ensayo Plantar, Ugo Basile, Comerio, Italia), o por medio de una placa fría de 5 a 10ºC donde las reacciones nocifensivas de la pata trasera afectada se cuentan como una medida de la intensidad de dolor. Un ensayo adicional para el dolor inducido por frío es el recuento de reacciones nocifensivas, o duración de respuestas nocifensivas después de la administración plantar de acetona al miembro posterior afectado. El dolor crónico en general se determina registrando el ritmo circadiano en actividad (Surjo y Arndt, Universidad de Colonia, Colonia, Alemania), y puntuando diferencias en el andar (foots print patterns; programa FOOTPRINTS, Klapdor y col., 1997. A low cost method to analyse footprint patterns. J. Neurosci. Methods 75,
49 - 54).

Los compuestos se ensayan contra los grupos de control operados fingidamente o tratado con vehículo. La aplicación de sustancia se realiza en momentos de tipo diferentes mediante las vías de aplicación diferentes (i. v., i. p., p. o., i. t., i. c. v., s. c., intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de dolor.

Dolor inflamatorio

El dolor inflamatorio se induce principalmente en ratas mediante la inyección de 0,75 mg de carragenano o adyuvante de Freund en una pata trasera. Los animales desarrollan un edema con alodinia mecánica así como hiperalgesia térmica. La alodinia mecánica se mide por medio de un transductor de presión (anastesiómetro electrónico de von Frey, IITC Inc. - Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, Estados Unidos). La hiperalgesia térmica se mide por medio de una fuente de calor radiante (ensayo Plantar, Ugo Basile, Comerio, Italia, estimulador térmico de la pata, G. Ozaki, Universidad de California, Estados Unidos). Para la medición de edema se están usando dos procedimientos. En el primer procedimiento, los animales se sacrifican y las patas traseras afectadas se seccionan y se pesan. El segundo procedimiento comprende diferencias en el volumen de la pata midiendo el desplazamiento de agua en un pletismómetro (Ugo Basile, Comerio, Italia).

Los compuestos se ensayan contra grupos de control inflamados así como tratados con vehículo. La aplicación de sustancia se realiza en momentos de tipo diferentes mediante las vías de aplicación diferentes (i. v., i. p., p. o., i. t., i. c. v., s. c., intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de dolor.

Dolor neuropático diabético

Ratas tratadas con una sola inyección intraperitoneal de 50 a 80 mg/kg de estreptozotocina desarrollan una hiperglucemia profunda y aloidinia mecánica dentro de 1 a 3 semanas. La aloidinia mecánica se mide por medio de un transductor de presión (anestesiómetro electrónico de von Frey, IITC Inc. - Life Science Instruments, Woodland Hills, S. A, Estados Unidos

Los compuestos se ensayan contra grupos de control tratados con vehículo diabéticos y no diabéticos. La aplicación de sustancia se realiza en momentos de tipo diferentes mediante las vías de aplicación diferentes (i. v., i. p., p. o., i. t., i. c. v., s. c., intradérmica, transdérmica) antes del ensayo de dolor.

2. Enfermedad de Parkinson Lesión por 6-hidroxidopamina (6-OH-DA)

La degeneración de las rutas nigroestriada y estratopalidal dopaminérgica es el episodio patológico central en la enfermedad de Parkinson. Este trastorno se ha imitado experimentalmente en ratas usando inyecciones estereotáxicos unilaterales individuales / secuenciales de 6-OH-DA en el haz prosencefálico medio (MFB).

Se usan machos de ratas Wistar (Harlan Winkelmann, Alemania), que pesan 200 \pm 250 g en el comienzo del experimento. Las ratas se mantienen en un ambiente controlado de temperatura y humedad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con el acceso libre a alimento y agua cuando no están en condiciones experimentales. Los siguientes protocolos in vivo están aprobados por las autoridades gubernamentales. Se hacen todos los esfuerzos para minimizar que el animal sufra, para reducir el número de animales usados, y para utilizar técnicas alternativas in vivo.

A los animales se les administra pargilina el día de la cirugía (Sigma, St Louis, MO, Estados Unidos; 50 mg/kg i. p.) con el fin de inhibir el metabolismo de 6-OHDA por la monoamino oxidasa y desmetilimipramina HCl (Sigma; 25 mg/kg i. p.) con el fin de evitar la ingesta de 6-OHDA por terminales noradrenérgicos. Treinta minutos más tarde las ratas de anestesian con pentobarbital de sodio (50 mg/kg( y se colocan en una llama estereotáxico. Con el fin de lesionar la rura DA nigroestriada se inyectan 4 \mul de ácido ascórbico al 0,01% - solución salina que contiene 8 \mug de 6-OHDA HBr (Sigma) en el haz prosencefálico medio izquierdo a una velocidad de 1 \mul/min (2,4 mm anterior, 1,49 mm lateral, -2,7 mm ventral a Bregma y a superficie del cráneo). Se deja la aguja en lugar 5 minutos adicionales para permitir que se produzca la difusión

Ensayo de escalón

La aquinesia del miembro anterior se determina tres semanas después del establecimiento de la lesión usando un protocolo de ensayo por etapas modificado. En resumen, los animales son mantenidos por el experimentador con una mano fijando los miembros traseros y elevando ligeramente la parte del miembro por encima de la superficie. Una pata está tocando la mesa, y después de mueve lentamente oblicuamente (5 s durante 1 m), primero en la dirección delantera y después en la trasera. El número de etapas de ajuste se cuenta para ambas patas en la dirección delantera y trasera de movimiento. La secuencia de ensayo es posición delantera y trasera de la para derecha ajustando el escalón, seguido de direcciones delantera y trasera de la pata izquierda. El ensayo se repite tres veces tres días consecutivos, después de un período inicial de entrenamiento de tres días antes de del primer ensayo. El escalón ajustado delantero no revela diferencias consistentes entre animales lesionados y de control sanos. Por lo tanto el análisis de restringe a escalón ajustado trasero.

Ensayo de equilibrio

Los ajustes de equilibrio después del desafío postural también se miden durante las sesiones de ensayo de escalón. Las ratas se mantienen en la misma posición como se describe en el ensayo de escalón y, en lugar de moverse lateralmente, se inclina por el experimentador hacia el lado de la para que toca la pata. Esta maniobra da como resultado la pérdida de equilibrio y la capacidad de las ratas de recuperar el equilibrio mediante movimientos de de la pata delantera se puntúa en una escala que varía entre 0 y 3. La puntuación 0 se proporciona para una colocación normal de la parte delantera. Cuando el movimiento de la parte delantera se retrasa pero se del equilibrio postural detectado, se proporciona la puntuación 1. La puntuación 2 representa una reacción de la pata delantera, clara, todavía insuficiente, como se evidencia mediante la contracción muscular, pero que carece de éxito cuando recupera el equilibrio, y al puntuación 3 se proporciona para ninguna reacción de movimiento. El ensayo se repite tres veces al día en cada lado durante tres días consecutivos después de un período de entrenamiento inicial de tres días antes del primer ensayo.

Ensayo de escalera (estiramiento de pata)

Una versión modificada del ensayo de la escalera se usa para la evaluación del comportamiento de estiramiento de la pata tres semanas después del establecimiento de la lesión primaria y secundaria. Se usan cajas de ensayo de plexiglás con una plataforma central y escalera removible sobre cada lado. El aparato de diseña de tal manera que solamente la pata sobre el mismo lado en cada escalera se puede usar, proporcionando de esta manera una medida de uso del miembro delantero independiente. Para cada ensayo los animales se dejan en las cajas de ensayo durante 15 minutos. La escalera doble se llena con gránulos 7 x 3 de pienso (gránulos de alimento de precisión, fórmula: P, dieta de roedor purificada, tamaño 45 mg; Sandown Scientific) en cada lado. Después de cada ensayo se cuentan separadamente el número de gránulos comidos (gránulos recuperados con éxito) y el número de gránulos tomados (tocados pero abandonados) para cada pata y la tasa de éxito (gránulos comidos / gránulos tomados). Después de tres días de privación de alimento (12 g por animal al día) los animales se ensayan durante 11 días. Se lleva a cabo un análisis completo solamente durante los últimos cinco días.

Tratamiento MPTP

La neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) provoca degeneración de neuronas dopaminérgicas mesencefálicas (DAergica) en roedores, primates no humanos, y seres humanos y, haciendo de esta manera, reproduce muchos de los síntomas de la enfermedad de Parkinson. MPTP conduce a un marcado descenso en los niveles de dopamina y sus metabolitos, y en el número de terminales dopaminérgicos en el estriado así como pérdida grave de los cuerpos celulares de tirosina hidrolasa (TH)-inmunorreactivos en la sustancia negra, pars compacta.

Con el fin de obtener lesiones graves y de larga duración, y reducir la mortalidad, los animales reciben inyecciones individuales de MPTP, y después de ensayan para evaluar la gravedad de la lesión 7 - 10 días después. Las inyecciones sucesivas de MPTP se administran los días 1, 2, y 3. Los animales reciben la aplicación de 4 mg/kg de clorhidrato de MPTP (Sigma) en solución salina una vez al día. Todas las inyecciones son intraperitoneales (i. p.) y al solución madre de MPTP se congela entre inyecciones. Los animales se decapitan el día 11.

Inmunohistología

A la finalización de los experimentos de comportamiento, todos los animales se anestesian con 3 ml de tiopental (1 g/40 ml i. p., Tyrol Pharma). Los ratones se prefunden transcardialmente con PBS 0,01 M (pH 7,4) durante 2 minutos, seguido de paraformaldehído al 4% (Merck) en PBS durante 15 minutos. Se retiran los cerebros y se colocan en paraformaldehído al 4% durante 24 horas a 4ºC. Para deshidratación se transfieren después a una solución de sacarosa al 20% (Meck) en PBS 0,1 M a 4ºC hasta que se humedecen. Los cerebros se congelan en metilbutano a -20ºC durante 2 minutos y se almacenan a -70ºC. Usando un microtomo de arrastre (mod. 3800 - Frigocut, Leica), se toman secciones de 25 \mum del genu del cuerpo calloso (AP 1,7 mm) al hipocampo (AP 21,8 mm) y de AP 24,16 a AP 26,72. Se cortan 46 secciones y se almacenan en clasificadores en tampón Tris 0,25 M (pH 7,4) para inmunohistoquímica.

Se procesa una serie de secciones para evaluar la inmunohistoquímica de la tirosina hidrolasa sin flotar (TH). Después de tres enjuagues en PBS 0,1 M, la actividad de la peroxidasa se inactiva durante 10 minutos en H_{2}O_{2} al 0,3% \pm PBS. Después de enjuagar en PBS, se preincuban secciones en suero bovino normal al 10% (Sigma) durante 5 minutos como agente de bloqueo y se transfieren a cualquier antisuero de conejo anti - rata TH primario (dilución 1:2000).

Después de la incubación durante toda una noche a temperatura ambiente, se enjuagan secciones para inmunorreactividad TH en PBS (2 x 10 minutos) y se incuban en inmunoglobulina G anti - conejo biotinilada enjuagada en cabra (dilución 1:200) (Vector) durante 90 minutos, se enjuga repetidamente y se transfiere a solución de Vectastaína ABC (Vector) durante 1 hora. El clorhidrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB; Sigma) en PBS 0,1 M, suplementado con H_{2}O_{2} al 0,005%, sirve como cromógeno en la reacción posterior de visualización. Se montan secciones sobre portaobjetos revestidos de gelatina, se dejan durante toda una noche, se tiñen por contraste con hematoxilina deshidratada en concentraciones crecientes de alcohol y se limpian en butilacetato. Los cubreobjetos se montan en entellan.

Ensayo de la varilla rotatoria

Los inventores usan una modificación del procedimiento descrito por Rozas y Labendaira - García (1997), con un sistema Rotamex CR-1 (Columbus Instruments, Columbus, OH) que comprende un ordenador personal IBM - compatible, una carta de adquisición de datos CIO-24, una unidad de control, y una unidad de varilla rotatoria de cuatro bandas. La unidad de varilla rotatoria consta de un eje rotante (diámetro 7,3 cm) y compartimientos individuales para cada ratón. El software del sistema permite la programación previa de los protocolos de sesión con velocidades rotacionales variantes (0 - 80 rpm). Se usan rayos infrarrojos para detectar un ratón que cae en la rejilla de base debajo de la varilla rotatoria. El sistema registra la caída como el final del experimento para ese ratón, y el tiempo total de la varilla rotatoria, así como, así como el tiempo de caída y todos los parámetros de establecimiento se registran. El sistema también permite que una corriente débil pase a través de la rejilla de base, para ayudar el
entrenamiento.

3. Demencia La tarea de reconocimiento de objetos

La tarea de reconocimiento de objetos se ha diseñado para determinar los efectos de las manipulaciones experimentales del comportamiento cognitivo de roedores. Una rata se coloca en un campo abierto, en el que están presentes dos objetos idénticos. Las ratas inspeccionan ambos objetos durante la primera prueba de la tarea de reconocimiento de objetos. En una segunda prueba, después de un intervalo de retención de por ejemplo 24, horas, uno de los dos objetos usados en esta prueba inicial, el objeto "familiar", y un objeto novedoso se colocan en el campo abierto. El tiempo de inspección en cada uno de los objetos se registra. Las medidas básicas en la tarea OR es el tiempo gastado por una rata que explora los dos objetos de la segunda prueba. La buena retención se refleja por unos tiempos de exploración más altos hacia el objeto novedoso que el objeto "familar".

La administración del potenciador de cognición supuesto a la primera prueba predominantemente permite la determinación de los efectos tras la adquisición, y eventualmente tras los procedimientos de consolidación. La administración del compuesto de ensayo después de la primera prueba permite la determinación de los efectos taras los procedimientos de consolidación, mientras que la administración antes de la segunda prueba permite medir los efectos tras los procedimientos de recuperación.

La tarea de evitación pasiva

La tarea de evitación pasiva determina el comportamiento de memoria en ratas y ratones. El aparato de anulación inhibidora consta de una caja de dos compartimientos con un compartimiento luminoso y un compartimiento oscuro. Los dos compartimientos están separados por una puerta de guillotina que puede operar el experimentador. Un umbral de 2 cm separa los dos compartimientos cuando la puerta de guillotina se levanta. Cuando la puerta está abierta, la iluminación en el compartimiento oscuro es aproximadamente 2 lux. La intensidad de la luz es aproximadamente 500 lux en el centro del suelo del compartimiento luminoso.

Se proporcionan dos sesiones de habituación, una sesión de choque, y una sesión de retención, separadas por intervalos intersesión de 24 horas. En las sesiones de habituación y la sesión de retención la rata se deja explorar el aparato durante 300 segundos. La rata se coloca en el compartimiento luminoso, en frente de la pared opuesta de la puerta de guillotina. Después de un período de acomodación de 15 segundos, se abre al puerta de guillotina de manera que todas las partes del aparato se puedan visitar libremente. Las ratas normalmente evitan las áreas de luz brillante y entrarán dentro del compartimiento oscuro en unos pocos segundos.

En la sesión de choque la puerta de guillotina entre los compartimientos se reduce tan pronto como la rata ha entrado en el compartimiento oscuro con sus cuatro patas, y se administra un choque en las patas de 1 mA de alerta se administra durante 2 segundos. La rata se retira del aparato y se vuelve a colocar en su jaula de alojamiento. El procedimiento durante la sesión de retención es idéntica a la de las sesiones de habituaciones.

La latencia a través de la etapa, que es la primera latencia de entrada en el compartimiento oscuro (en segundos) durante la sesión de retención es un índice del comportamiento de memoria del animal; cuanto más larga es al latencia para entrar al compartimiento oscuro, mejor es la retención. Un compuesto de ensayo se proporciona una hora y media antes de la sesión de choque, junto con 1 mg /kg de escopolamina. La escopolamina altera el comportamiento de la memoria durante la sesión de retención 24 horas después. Si el compuesto de ensayo aumenta la latencia de entrada comparado con los controles tratados con escopolamina, es probable que posean potencial que eleva la cognición.

La tarea de escape del agua de Morris

La tarea de escape de Morris mide la orientación espacial de aprendizaje de roedores. Es un sistema de ensayo que se ha usado en gran medida para investigar los efectos de los agentes terapéuticos supuestos sobre las funciones cognitivas de ratas y ratones. El comportamiento de un animal se determina en un tanque de agua circular con una plataforma de escape que se sumerge aproximadamente 1 cm por debajo de la superficie del agua. La plataforma de escape no es visible para un animal que nada en el tanque de agua. Se proporcionan señales extra laberinto abundantes por los muebles en la habitación, incluyendo escritorios, equipo de ordenador, un segundo tanque de agua, la presencia del experimentador, y por un radio de una repisa que esta jugando suavemente.

Los animales reciben cuatro pruebas durante cinco sesiones de adquisición. Una prueba se comienza colocando un animal en el estanque, enfrente de la pared del tanque. Cada una de las cuatro posiciones de partida en los cuadrantes norte, este, sur, y oeste se usa una vez en una serie de cuatro pruebas; su orden está distribuido al azar. La plataforma de escape está siempre en la misma posición. Se termina una prueba tan pronto como el animal había subido sobre la plataforma de escape o cuando habían transcurrido 90 segundos, cualquiera de los casos sucede primero. El animal de deja estar sobre al plataforma durante 30 segundos. Después se saca de la plataforma y se comienza la siguiente prueba. Si un animal no encuentra la plataforma en 90 segundos lo pone sobre la plataforma el experimentador y se deja estar durante 30 segundos. Después de la cuarta prueba del quinto sesión diaria, se proporciona una prueba adicional como una prueba de sonda: la plataforma se retira, y el tiempo que el animal pasa en los cuatro cuadrantes de mide durante 30 ó 60 segundos. En la prueba dé sonda, todos los animales comienzan desde la misma posición de partida, opuesto al cuadrante donde la plataforma de escape se había posicionado durante la
adquisición.

Se toman cuatro medidas diferentes para evaluar el comportamiento de un animal durante el entrenamiento de adquisición; latencia de escape, distancia viajada, distancia a la plataforma, y velocidad de natación. Las siguientes medidas se evalúan para la prueba de sonda: tiempo(s) en cuadrantes y distancia viajada (cm) en los cuatro cuadrantes. La prueba de sonda proporciona información adicional sobre cómo de bien un animal aprende la posición de la plataforma de escape. Si un animal gasta más tiempo y nada una distancia más larga en el cuadrante donde la plataforma se ha posicionado durante las sesiones de adquisición que en cualquier otro cuadrante, se concluye que la posición de la plataforma se ha aprendido bien.

Con el fin de determinar los efectos de los compuestos potenciadores de cognición supuestos, se usan ratas o ratones con lesiones de cerebro específicas que alteran las funciones cognitivas, o animales tratados con compuestos tales como escopolamina o MK-801, que interfieren con el aprendizaje normal, o animales viejos que padecen déficit cognitivos.

La tarea de alternación espontánea de laberinto T

La tarea de alternación espontánea de laberinto T (TeMCAT) determina el comportamiento de memoria espacial en ratones. El brazo de partida y los dos brazos de objetivo del laberinto en T se proporcionan con puertas de guillotina que se pueden operar manualmente por el experimentador. Un ratón se pone en el brazo de partida en el comienzo del entrenamiento. Se cierra la puerta de guillotina. Al final de la prueba, la "prueba forzada", se bloquea el brazo objetivo a o bien izquierdo o derecho bajando la puerta de guillotina. Después de que el ratón se ha liberado del brazo de partida, negociará el laberinto, eventualmente entra en el brazo objetivo abierto, u regresa a la posición de partida, donde se confinará durante 5 segundos, reduciendo la puerta de guillotina. Después, el animal puede elegir libremente entre el brazo objetivo izquierdo y derecho (todas las puertas de guillotina abiertas) durante las 14 pruebas "de elección libre". Tan pronto como el ratón ha entrado en el brazo objetivo, se cierra la otra. El ratón eventualmente regresa al brazo de partida y es libre de visitar cualquiera de los brazos objetivo si lo desea después de que se ha confinado el en brazo de partida durante 5 segundos. Después de la finalización de las 14 pruebas de elección libre en una sesión, se retira el animal del laberinto, el animal nunca está manipulado.

Se calcula el porcentaje de alteraciones de las 14 pruebas. Este porcentaje y el tiempo total necesario para completar la primera prueba forzada y las posteriores 14 pruebas de elección libre /en s) se analiza. Los déficit cognitivos se inducen usualmente por una inyección de escopolamina, 30 minutos antes del comienzo de la sesión de entrenamiento. La escopolamina reducía el porcentaje de alteraciones que cambia o reduce el nivel. Un potenciador de cognición, que está ya administrado antes de la sesión de entrenamiento, antagonizará, al menos parcialmente la reducción inducida por escopolamina en la tasa de alternancia espontánea.

Ejemplo 10 Expresión específica de tejidos de la serina proteasa de tipo prostatina

Como una primera etapa para establecer un papel para la serina proteasa de tipo prostatina en la patogénesis de COPD, el perfil de expresión del gen se realizó usando PCR cuantitativa de tiempo real (TaqMan) con muestras de ARN aisladas de un amplio intervalo de células y tejidos humanos. Las muestras de ARN se compraron o bien en proveedores comerciales o purificadas en casa. Dos paneles de ARN se usaron para perfilar: un panel de órgano de cuerpo entero (Tabla 1) y un panel específico respiratorio (Tabla 2).

PCR cuantitativa de tiempo real. Esta técnica es un desarrollo del análisis cinético de PCR primero descrito por Higuchi y col., (BioTechnology 10, 413 - 17, 1992; BioTechnology 11, 1026 - 30, 1993). El principio es que en cualquier ciclo dado dentro de la fase exponencial de la PCR, de la PCR, la cantidad de producto es proporcional al número inicial de copias de molde. La amplificación de PCR se realiza en presencia de una sonda de oligonucleótidos (sonda TaqMan) que es complementaria a la secuencia diana y marcada con un tinte indicador fluorescente y un tinte inactivador. Durante la fase de extensión de la PCR, la sonda se escinde por la actividad de la 5'-3' endonucleasa de la Taq ADN polimerasa, que libera el fluoróforo del efecto del tinte inactivador (Holland y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 88, 7276 - 80, 1991). Debido a que la emisión de fluorescencia aumenta en proporción directa a la cantidad de de producto amplificado específico, la fase de crecimiento exponencial de producto PCR se puede detectar y usar para determinar la concentración de molde inicial (Heid y col., Genome Res. 6, 986 - 94, 1996, y Gibson y col., Genome Res. 6, 995 - 1001, 1996).

Extracción de ARN y preparación de ADNc. Se aisló el ARN total de cada una de las muestras "en casa" enumeradas en al tabla 2 usando el sistema RNeasy de Qiagen (Crawley, West Sussex, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración del ARN purificado se determinó usando el kit de cuantificación de ARN de RiboGreen (Molecular Probes Europe, Holanda). Las concentraciones de ARn de las muestras compradas en proveedores comerciales también se determinaron usando RiboGreen. Para la preparación de ADNc, se realizó transcripción inversa de 1 \mug de ARN total usando 200 U de SUPERSCRIPT ^{TM} RNase H^{-} Reverse Transcriptase (Life Technologies, Paisley, Reino Unido), ditiotreitol 10 mM, 0,5 mM de cada dNTP, y hexámeros aleatorios 5 \muM (PE Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, Reino Unido) en un volumen final de 20 \mul de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Análisis cuantitativo TaqMan. Se diseñaron cebadores específicos y sonda de acuerdo con las recomendaciones de PE Applied Biosystems y se enumeran a continuación:

: Cebador delantero: 5' - AGAGTGGCGACCGCTACAAG - 3'

: Cebador inverso: 5' - TGGTAGAGGCCGTCGCAG - 3'

: Sonda: 5' - (FAM)- CGAGTCCAGCAGCGGCACCCTTACT - 3' donde FAM = 6-carboxi-fluoresceína.

La cuantificación de PCR se realizó con 10 ng de ARN de transcripción inversa de cada muestra. Cada determinación se hizo por duplicado.

La mezcla de reacción de ensayo era como sigue: 1X final TaqMan Universal PCR Master Mix (de solución madre 2 X) (PE Applied Biosystems, CA); cebador delantero 900 nM; cebador inverso 900 nM; sonda 200 nM; 10 ng de ADNc; y agua hasta 25 \mul.

Se llevá a cabo cada una de las siguientes etapas una vez: pre PCR, 2 minutos a 50ºC, y 10 minutos a 95ºC.

Las siguientes etapas se llevan a cabo 40 veces: desnaturalización, 15 segundos a 95ºC, hibridación/extensión, 1 minuto a 60ºC.

PCR cuantitativa de tiempo real se hizo usando un detector de secuencias ABI Prism 7700.

El valor C_{T} generado para cada reacción se usó para determinar la concentración inicial del molde (número de copias) mediante interpolación de una curva patrón universal. El nivel de expresión del gen diana en cada muestra se calculó con relación a la muestra con la expresión menor del gen.

La expresión de enzima de tipo prostatina en diversos tejidos humanos se muestra en al figura 12. Los niveles más altos de ARNm se detectaron en testículos, médula ósea, bazo, y pulmón. De manera interesante, la expresión de la enzima no se detectó en próstata ni hígado, que son tejidos que muestran alta expresión de la propia prostatina (Yu y col., J. Biol. Chem. 270, 13483 - 13489). Además, la prostatina no se expresa en testículos, en contraste a la enzima de tipo prostatina.

La expresión de la enzima de tipo prostatina en pulmón se investigó adicionalmente analizando la expresión del gen en alguno de los tipos de células constituyentes. Esto reveló la expresión consistente y abundante de la enzima de tipo prostatina en leucocitos polimorfonucleares (Fig. 13). Aunque había expresión relativamente alta del gen en monocitos circulantes a partir del donante, la expresión no se detectó en monocitos de otros dos donantes. La expresión en la tráquea y células de tipo II alveolares no estaba clara.

La función de prostatina es desconocida, aunque su amplia expresión sugiere su implicación en procesos biológicos importantes. Es probable que sea una enzima unida a membrana, indicada por la presencia de un anclaje a membrana C-terminal de tipo supuesto, y como tal, puede estar implicada en el procesamiento de péptidos y proteínas en superficies celulares epiteliales. El perfil de expresión es enzima de tipo prostatina es completamente diferente a la de la prostatina, quizás indicando que estas dos proteasas tienen funciones fisiológicas diferentes. La expresión relativamente alta de la enzima en leucocitos polimorfonucleares, uno de los tipos de células inflamatorias clave del pulmón, sugiere que la enzima de tipo prostatina puede estar implicada en procesos inflamatorios, y que al desregulación de la proteasa podría jugar un papel significativo en al destrucción de al matriz pulmonar en enfermedades tales como COPD. Por lo tanto, la enzima de tipo prostatina, representa una diana terapéutica potencial para COPD.

TABLA 1 Panel de ARN de órganos humanos usados para la PCR cuantitativa a tiempo real

Todas las muestras se obtuvieron en Clontech Reino Unido Ltd, Basingstoke, Reino Unido
Tejido	Nº de cat.
Glándula suprarrenal	Panel Humano V, K4004-1
Médula ósea	Panel Humano II, K4001-1
Cerebro	Panel Humano I, K4000-1
Colon	Panel Humano II, K4001-1
Corazón	Panel Humano III, K4002-1
Riñón	Panel Humano I, K4000-1
Hígado	Panel Humano I, K4000-1
Pulmón	Panel Humano I, K4000-1
Glándula mamaria	Panel Humano III, K4002-1
Páncreas	Panel Humano V, K4004-1

TABLA 1 (continuación)

Tejido	Nº de cat.
Próstata	Panel Humano III, K4002-1
Glándula salivar	Panel Humano V, K4004-1
Músculo esquelético	Panel Humano III, K4002-1
Intestino delgado	Panel Humano II, K4001-1
Bazo	Panel Humano II, K4001-1
Estómago	Panel Humano II, K4001-1
Testículos	Panel Humano III, K4002-1
Timo	Panel Humano II, K4001-1
Tiroides	Panel Humano V, K4004-1
Útero	Panel Humano III, K4002-1

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TABLA 2 Panel de ARN específico respiratorio humano usado para la PCR cuantitativa a tiempo real

Tejido/Tipo de célula	Proveedor, Nº de cat.
Pulmón (fetal)	Takara (Japón)
Pulmón	Clontech, panel Humano I, K-4000-1
Tráquea	Clontech, panel Humano I, K-4000-1
Células epiteliales bronquiales humanas cultivadas	Material propio
Células de músculo liso de las vías respiratorias cultivadas	Material propio
Células epiteliales pequeñas de las vías respiratorias cultivadas	Material propio
Células de tipo II alveolares cultivadasprimarias	Material propio
Células H441cultivadas (de tipo Clara)	Material propio
Leucocitos polimorfonucleares aislados recientemente	Material propio
Monocitos aislados recientemente	Material propio
Monocitos cultivados (tipo macrófago)	Material propio

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Referencias

1. Nicolson (1988) Organ specificity of tumor metastasis: Role of preferential adhesion, invasion and growth of malignant cells at specific secondary sites. Cancer Met. Rev. 7, 143-188.

2. Liotta et al. (1983) Tumor invasion and the extracellular matrix. Lab. Invest. 49, 639-649.

3. Vlodavsky et al. (1987) Endothelial cell-derived basic fibroblast growth factor: Synthesis and deposition into subendothelial extracellular matrix. Proc. Natl. Acad Sci. USA 84, 2292-2296.

4. Folkman et al. (1980) A heparin-binding angiogenic protein- -basic fibroblast growth factor- -is stored within basement membrane. Am. J. Pathol. 130, 393400.

5. Cardon-Cardo et al. (1990) Expression of basic fibroblast growth factor in normal human tissues. Lab. Invest. 63, 832-840.

6. Vlodavsky et al. (1991) Extracellular sequestration and release of fibroblast growth factor: a regulatory mechanism? Trends Biochem. Sci. 16, 268-271.

7. Vlodavsky et al. (1993) Extracellular matrix-bound growth factors, enzymes and plasma proteins. In BASEMENT MEMBRANES: CELLULAR AND MOLECULAR ASPECTS Rohrbach & Timpl, eds., pp327-343. Academic Press Inc., Orlando, Fla.

8. Ross (1993) The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature (Lond). 362, 801-809.

9. McCarthy et al. (1986). Hincan fibronectin contains distinct adhesion- and motility-promoting domains for metastatic melanoma cells. J. Cell Biol 102, 179-88.

10. Van Muijen et al. (1995) Properties of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells. Recent Results in Cancer Research 139, 104-22.

11. Price et al. (1997) The Biochemistry of Cancer Dissemination, in Critical Reviews in Biochemistry and Mol. Biol. 32, 175-253.

<110> Bayer AG

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<120> REGULACIÓN DE SERINA PROTEASA DE LA TIPO PROSTATINA HUMANA

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<130> Países extranjeros Lio087

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<140>

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<141>

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<150> Estados Unidos 60/213.474

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<151> 23 - 06 - 2000

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<150> Estados Unidos 60/227.612

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<151> 22 - 03 - 2001

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<160> 6

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 786

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 262

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 343

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

4

5

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<210> 4

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<211> 265

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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6

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<210> 5

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<211> 944

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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7

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<210> 6

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<211> 272

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<212> PTR

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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8

9

Claims

1. Un polinucleótido aislado seleccionado entre el grupo constituido por

a): un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº 6;

b): un polinucleótido que comprende la secuencia SEQ ID Nº 5;

c): un polinucleótido cuya secuencia se desvía de las secuencias de polinucleótidos especificadas en (a) y (b) debido a la degradación del código genético y que muestra la actividad biológica de (a).

2. Un vector de expresión que contiene cualquier polinucleótido de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped que contiene el vector de expresión de la reivindicación 2.

4. Un polipéptido purificado sustancialmente codificado por un polinucleótido de la reivindicación 1.

5. Un procedimiento para producir un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

a): cultivar la célula huésped de la reivindicación 3 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido; y

b): recuperar el polipéptido del cultivo de células huéspedes.

6. Un procedimiento para la detección de un polinucleótido que codifica un polipéptido en una muestra biológica que comprende una muestra biológica que comprende las siguientes etapas:

a): hibridizar cualquier polinucleótido de la reivindicación 1 a un material de ácido nucleico de una muestra biológica, formando por lo tanto un complejo de hibridación; y

b): detectar dicho complejo de hibridación.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que antes de la hibridación, el material del ácido nucleico de la muestra biológica se amplifica.

8. Un procedimiento para la detección de un polinucleótido de la reivindicación 1 o un polipéptido de la reivindicación 4 que comprende las etapas de:

a): poner en contacto una muestra biológica con un reactivo que interactúa específicamente con el polinucleótido o el polipéptido y

b): detectar la interacción.

9. Un kit de diagnóstico para llevar a cabo el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.

10. Un procedimiento de selección de agentes con disminución de la actividad de un polipéptido, que comprende las etapas de:

a): poner en contacto un compuesto de ensayo con cualquier polipéptido codificado por cualquier polinucleótido de la reivindicación 1;

b): detectar la unión del compuesto de ensayo al polipéptido, en el que un compuesto de ensayo que se une al polipéptido se identifica como un agente terapéutico potencial para disminuir la actividad de dicho polipéptido.

11. Un procedimiento de selección de agentes que regulan la actividad de un polipéptido, que comprende las etapas de:

a): poner en contacto un compuesto de ensayo con cualquier polipéptido codificado por cualquier polinucleótido de la reivindicación 1; y

b): detectar una actividad del polipéptido, en el que un compuesto de ensayo que incrementa la actividad se identifica como un agente terapéutico potencial para aumentar la actividad del polipéptido, y en el que un compuesto de ensayo que disminuye la actividad del polipéptido se identifica como un agente terapéutico potencial para disminuir la actividad del polipéptido.

12. Un procedimiento de selección de agentes que disminuyen la actividad de un polipéptido, que comprende las etapas de:

a): poner en contacto un compuesto de ensayo con un polinucleótido de la reivindicación 1; y

b): detectar la unión del compuesto de ensayo al polinucleótido, en el que un compuesto de ensayo que se une al polinucleótido se identifica como un agente terapéutico potencial para disminuir la actividad de dicho polipéptido.