ES2258774T3

ES2258774T3 - Una nueva proteina y proceso para preparacion de la misma.

Info

Publication number: ES2258774T3
Application number: ES96910198T
Authority: ES
Inventors: Fusao Makishima; Hiroyuki Takamatsu; Hideo Miki; Shinji Kawai; Michio Kimura; Tomoaki Matsumoto; Mieko Katsuura; Koichi Enomoto; Yusuke Satoh
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1995-04-19
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2006-09-01
Anticipated expiration: 2016-04-19
Also published as: EA000582B1; NO974812D0; US20090325864A1; MX9708011A; EP0955313B1; UA46767C2; EP0955313A1; CA2216741C; US20020102633A1; EA199700329A1; NO321153B1; US7268114B2; HU225424B1; DK0955313T3; BR9608019A; AU704515B2; PT955313E; US20030181378A1; HUP9801697A2; DE69636728D1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA QUE TIENE UNA SECUENCIA AMINOACIDA REPRESENTADA POR SEQ ID N :1, DEL LISTADO DE SECUENCIAS DERIVADAS DE MP52 HUMANA, Y UNA PROTEINA DIMERA DE LA MISMA. LA PROTEINA HOMODIMERA DESCRITA ANTERIORMENTE SE PUEDE OBTENER CONSTRUYENDO UN PLASMIDO QUE CONTIENE UNA SECUENCIA AMINOACIDA QUE CODIFICA PARA ADN, REPRESENTADA EN SEQ ID N :1 DEL LISTADO DE SECUENCIAS CON UNA METIONINA EN EL EXTREMO NTERMINAL; INTRODUCIENDO DICHO PLASMIDO EN E. COLI PARA EFECTUAR LA TRANSFORMACION; SOLUBILIZANDO LOS CUERPOS DE INCLUSION OBTENIDOS MEDIANTE CULTIVO DEL TRANSFORMANTE; PURIFICANDO LA PROTEINA MONOMERICA A PARTIR DE LA SOLUCION SOLUBILIZADA; REPLEGANDO DICHA PROTEINA MONOMERICA HASTA OBTENER UNA PROTEINA DIMERA; Y PURIFICANDO LA MISMA. LA PROTEINA HOMODIMERA DESCRITA ANTERIORMENTE ES UTIL COMO COMPOSICION FARMACEUTICA PARA TRATAR ENFERMEDADES OSEAS Y DEL CARTILAGO.

Description

Una nueva proteína y proceso para preparación de la misma.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias derivada de MP52. La invención se refiere también a una proteína homodímera de dicha proteína y una composición farmacéutica para tratamiento de enfermedades de cartílagos y huesos que contiene la proteína dímera como ingrediente activo. La invención se refiere también a un proceso para preparar la proteína arriba descrita en una gran cantidad y con alta pureza por cultivo de E. coli transformado con un plásmido que contiene una secuencia de DNA capaz de expresar la proteína arriba descrita. La invención se refiere adicionalmente a un método para el tratamiento de enfermedades de cartílagos y huesos, que comprende administrar a un humano una composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, una cantidad eficaz de la proteína homodímera.

2. Descripción de la técnica anterior

Composiciones farmacéuticas que comprenden vitamina D_{3}, calcitonina, estrógeno o sus derivados así como derivados bisfosfonato han sido utilizadas en la práctica clínica para prevenir y tratar enfermedades óseas. Recientemente, se ha comunicado que la proteína morfogenética ósea (en lo sucesivo BMP), la superfamilia de genes TGF-\beta que comprende BMP-2 a BMP-9 y proteínas afines, poseen actividad morfogenética ósea.

Adicionalmente, se ha consignado también la actividad morfogenética ósea de una de dichas proteínas denominada MP52 (documentos WO 93/16099 y WO 95/04819). Una región madura de la proteína MP52 se considera que es una proteína constituida por 120 residuos de aminoácidos que tienen la alanina N-terminal, y su secuencia de aminoácidos se describe en estas publicaciones.

Una proteína denominada GDF-5, que tiene una secuencia de aminoácidos análoga a MP52, se describe también en Nature, Vol. 368, p. 639-643 (1994) y en el documento WO 94/15949.

Sin embargo, estas proteínas no pueden prepararse fácilmente en una forma purificada en escala industrial.

Se han ensayado líneas de células de mamífero tales como células L para producir MP52 con tecnología de ingeniería genética. Sin embargo, no se ha encontrado fácil preparar MP52 en una forma purificada y con rendimiento alto con los sistemas de expresión.

Descripción detallada de la invención

Los autores de la presente invención han tratado de preparar MP52 utilizando E. coli en gran escala por tecnología de ingeniería genética. Resumidamente, los autores de la invención han tratado de preparar MP52 utilizando E. coli por adición de un codón que codifica metionina a la región madura codificante de DNA de MP52 que parte de alanina. El producto resultante no era MP52 solo sino una mezcla de MP52, una proteína de 121 residuos de aminoácidos que tenía la metionina N-terminal y una proteína de 119 residuos de aminoácidos que tenía la alanina N-terminal separada y partiendo de prolina. Resultó extremadamente difícil aislar MP pura al menos con la región madura a partir de la mezcla.

Las autores de la invención han encontrado que una proteína representada en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias partiendo de prolina en el término N puede conducirse selectivamente con un rendimiento extremadamente alto por construcción de un plásmido en el cual un codón que codifica metionina estaba conectado a la secuencia de DNA codificante de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias constituida por 119 residuos de aminoácidos con eliminación de la alanina N-terminal de MP52, y utilización del E. coli introducido por el plásmido obtenido para expresión. Además, se ha confirmado que el homodímero de la proteína descrita en SEQ ID No.: 1 en el Listado de Secuencias tiene actividad morfogenética de cartílago y hueso, y de este modo se completó la invención.

Un objeto de la invención es proporcionar una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias. La proteína está constituida por 119 residuos de aminoácidos, y corresponde a una en la cual la alanina N-terminal se elimina de la MP52 humana que se considera como una región madura constituida por 120 residuos de aminoácidos. La proteína de acuerdo con la invención es soluble en agua. Además, la proteína es escasamente tóxica en sí misma dado que procede de origen humano.

Otro objeto de la invención es proporcionar una composición farmacéutica para tratar enfermedades de cartílago y/o hueso, que comprende como ingrediente activo un homodímero de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias. Más detalladamente, la invención se refiere a una composición farmacéutica para prevención y tratamiento de osteoporosis, osteoartritis tal como gonartritis deformante y artritis coxal deformante, o artrosteítis, lesión cartilaginosa tal como lesión articular de menisco, reconstrucción en las partes defectuosas de huesos y cartílagos causadas por lesión y oncoectomía, defecto de hueso y cartílago, fractura ósea, enfermedades congénitas de cartílagos y huesos tales condrodisplasia, condrohipoplasia, acondrogénesis, palatosquisis y osteodisplasia, y adicionalmente defectos radiculares y arveculares, dado que la proteína homodímera de acuerdo con la invención tiene una actividad morfogenética en cartílagos y huesos. Adicionalmente, la proteína homodímera puede aplicarse a un tratamiento de injerto óseo en cirugía cosmética. Estos tratamientos incluyen también los correspondientes al área de la cirugía veterinaria.

Un objeto adicional de la invención es proporcionar un proceso para preparar una proteína constituida por 119 residuos de aminoácidos derivada de MP52 humana que se muestra en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias utilizando E. coli.

En particular, la invención se refiere a la construcción de un plásmido que contiene una secuencia de DNA que codifica la secuencia de aminoácidos constituida por 119 residuos de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias con una metionina adicional en el término N. Únicamente la región madura de cDNA de MP52 se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (método PCR) utilizando, como DNA molde, un vector plasmídico que contenía cDNA descrito en el documento WO 93/16099. El método PC al que se hace referencia en esta memoria significa generalmente multiplicar una cantidad muy pequeña de fragmentos de DNA o RNA por el método descrito en la Patente U.S. 4.683.195.

Para preparar la proteína de la invención es necesario construir vectores de expresión apropiados que contienen DNA codificante de la proteína, que se introducen luego en cepas hospedadoras de E. coli deseables por tecnología de ingeniería genética. Los dos procesos mejorados siguientes se aplicaron para producción de la proteína en gran escala:

1) Un proceso para aumentar la productividad de proteínas diana por aumento de la eficiencia de traducción como ha sido consignado por M. Nobuhara et al. (Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1331-1338, 1988), a saber, el método de aumentar el contenido de AT alrededor del codón de iniciación ATG, y

2) un proceso para aumentar un número medio de copias de plásmidos por célula, a saber el método de reemplazamiento de la región ori para el origen de replicación del vector pBR por la del vector pUC. Adicionalmente, el vector de expresión (pKOT245) de la invención se construyó por ligación directa de la región promotora con la secuencia de DNA que codifica la secuencia de aminoácidos en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias con una metionina adicional en su término N. El E. coli que contiene dicho vector se depositó (No. de Acceso BIKOKEN-KI P-14895) en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, localizado en 1-3, Higashi 1-chome, Yatake-cho, Tsukuba-shi, Hibaraki-ken, 305 Japón en fecha 14 de abril de 1995 y ha sido transferido a un depósito (No. de Acceso BIKOKEN-KI BP-5499) en fecha 10 de abril de 1996 de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos.

Esta invención se refiere a un proceso para preparar proteínas monómeras que comprende los pasos de:

construir un plásmido que contiene DNA que codifica la secuencia de aminoácidos en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias con una metionina en su término N,

: introducir el plásmido en E. coli para transformación, cultivar el E. coli para obtener cuerpos de inclusión, solubilizar y purificar dichos cuerpos de inclusión para obtener proteínas monómeras, y

a un proceso para preparar proteínas homodímeras de la proteína indicada en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias por replegamiento y purificación de las proteínas monómeras obtenidas en el apartado anterior. Resumidamente, las proteínas de la invención se prepararon por solubilización de los cuerpos de inclusión de E. coli seguida por carga en una columna SP-Sepharose FF y una columna Sephacryl S-200 para obtener monómeros de MP52 sulfonada purificados, que se sometieron a replegamiento y precipitación isoeléctrica, y a continuación a una columna RESOURCE RPC de HPLC en fase inversa para obtener las fracciones dímeras purificadas de las proteínas. Las propiedades físico-químicas de las proteínas se analizaron sobre la base de la secuencia de aminoácidos N-terminal y la composición de aminoácidos y por electroforesis.

Esta invención se refiere adicionalmente a un proceso para cultivar E. coli que se introdujeron con los vectores de expresión de la invención en las condiciones del medio de cultivo a 28-34ºC, pH 6-8 y una concentración de oxígeno disuelto de 20-50%.

Esta invención se refiere adicionalmente a un método para el tratamiento de enfermedades de cartílagos y huesos, que comprende administrar a un humano una composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, una cantidad eficaz de la proteína homodímera.

Las actividades biológicas de la proteína homodímera se determinaron por análisis de radiografías con rayos X blandos, análisis de tinción de tejidos y análisis de evolución temporal de la formación ectópica de cartílago/hueso. Adicionalmente, a partir de los resultados del efecto sobre la osificación intramembranosa, el efecto sobre la regeneración de cartílago articular y el efecto sobre la curación de fracturas y defectos óseos, se demuestra que la proteína homodímera de la presente invención es beneficiosa para las terapias de regeneración de cartílago y/o hueso.

La proteína homodímera de la invención puede administrarse de manera sistémica por inyección intravenosa, intramuscular o intra-peritoneal. En el caso de la administración intravenosa, puede utilizarse también una infusión intravenosa de goteo, además de las inyecciones intravenosas convencionales.

Pueden formularse, por ejemplo, preparaciones inyectables en forma de polvos inyectables. En tal caso, los polvos se pueden preparar por adición de uno o más excipientes adecuados solubles en agua tales como manitol, sacarosa, lactosa, maltosa, glucosa, fructosa y análogos, a un ingrediente activo, disolución de la mezcla en agua, y división de la misma en viales o ampollas, seguido por liofilización y sellado hermético.

En el caso de la administración local, la proteína homodímera puede aplicarse como recubrimiento en la superficie de un cartílago, hueso o diente a tratar con pasta de colágeno, cola de fibrina u otros materiales adherentes. En el caso de injerto óseo, puede utilizarse tanto hueso natural como hueso artificial convencional. Hueso artificial significa el hueso hecho de metal, cerámica, vidrio, y otras sustancias inorgánicas naturales o artificiales. Como sustancia artificial preferible se cita el hidroxiapatito. Por ejemplo, puede construirse hueso artificial por medio de acero como material denso en la parte interna e hidroxiapatito como material poroso en la parte externa. Además, es beneficioso aplicar la proteína homodímera a la parte de la cual se elimina tejido óseo canceroso a fin de acelerar la reconstrucción del hueso. Esto mismo puede aplicarse también al injerto de cartílago.

La dosis puede variar dependiendo de diversos factores que influyen en la actividad de la proteína tales como peso de hueso y cartílago a reconstruir, sitio de hueso y cartílago lesionado y los síntomas, edad y sexo de los pacientes, gravedad de la infección, intervalos de administración y otros factores clínicos. La dosis puede variarse también dependiendo de los tipos de vehículos a utilizar para reestructuración con la proteína dímera. En general, la dosis está comprendida en el intervalo de aproximadamente 10-10^{6} ng de la proteína homodímera referido a peso húmedo del hueso y cartílago deseados cuando se administra como una composición que contiene un vehículo. En el caso de administración local y sistémica por inyección, es preferible administrar 0,1-10^{4} \mug con una frecuencia comprendida entre una sola vez a la semana y una vez al día.

Puede esperarse un efecto sinérgico por administración de la proteína homodímera simultáneamente con factores de crecimiento conocidos, por ejemplo, el factor de crecimiento I semejante a la insulina para regeneración de hueso y cartílago.

No se ha informado nunca acerca de un proceso para preparar la proteína de la invención en escala industrial y en forma purificada como se ha expuesto anteriormente, y la proteína homodímera es útil como composición médica para el tratamiento de enfermedades de cartílago y hueso, dado que la misma tiene una actividad morfogenética de cartílago y hueso. Adicionalmente, el proceso de preparación de la proteína de la presente invención puede ser aplicable para la preparación de otras proteínas de los miembros de la superfamilia TGF-\beta arriba descritos, todos los cuales se preparaban hasta ahora satisfactoriamente solo utilizando líneas de células de mamífero.

Esta invención se ilustra adicionalmente por los ejemplos que siguen. Sin embargo, no debe interpretarse que la invención esté limitada a estos ejemplos específicos.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción del vector de expresión (1) Aislamiento de una región madura de MP52

Una región madura de cDNA de MP52 humano se amplificó por PCR utilizando el vector plasmídico (pSK52s) que contenía cDNA descrito en el documento WO 93/16099 como DNA molde.

De acuerdo con el proceso para aumentar la productividad de las proteínas diana consignado por M. Nobuhara, et al. (Agric. Biol. Chem., 52 (6), 1331-1338, 1988), una parte del DNA de la región madura del gen MP52 se sustituyó para aumentar el contenido de AT alrededor del codón de iniciación ATG.

La mutagénesis se introdujo por el método PCR utilizando el iniciador PCR diseñado aguas arriba que abarca la mutación de SEQ ID No.: 2 del Listado de Secuencias. Para la secuencia de DNA de los iniciadores PCR se utilizaron el DNA de SEQ ID No.: 2 como iniciador de aguas arriba, y el DNA de SEQ ID No.: 3 del Listado de Secuencias como iniciador de aguas abajo.

La PCR se realizó por adición del DNA molde (10 ng), 50 pmoles de cada uno de los iniciadores PCR en una dirección ordenada y en dirección inversa, dNTP (0,2 mmoles) y MgCl_{2} (1,5 mmoles) en el mismo tubo de ensayo, junto con DNA-polimerasa Taq (5 U).

Se realizaron treinta ciclos de PCR; las condiciones de cada ciclo eran 94ºC durante 1 minuto para desnaturalización, 55ºC durante 1 minuto para reasociación de los iniciadores, y 72ºC durante 2 minutos para extensión de los iniciadores.

Los productos obtenidos de la PCR se aislaron por electroforesis en agarosa de punto de fusión bajo al 1,5% (adquirida de FMC), y se aislaron los fragmentos de aproximadamente 360 pb (Fragmento 1).

(2) Construcción del vector de expresión de E. coli para la proteína de la invención

A fin de aumentar un número de copias del plásmido por bacterias, la región ori para origen de replicación se cambió de la de pBR al vector pUC. Se utilizó el vector de expresión de E. coli pKK223-3 disponible en el mercado (adquirido de Pharmacia Biotech) para aislar la región promotora tac por digestión con las endonucleasas de restricción SspI y EcoRI, y también para aislar la región del terminador rrnBt_{1}t_{2} utilizando SalI y SspI. Un fragmento de DNA de la región del promotor taq que se había tratado con Nucleasa de Haba Mung (Takara Shuzo Co., Ltd.) se ligó por medio de DNA-ligasa T4 con el Fragmento 1 que se había obtenido anteriormente. En el fragmento de DNA resultante se digirió con SalI y se religó con la región rrnBt_{1}t_{2}. El fragmento de DNA se ligó en el sitio SmaI del vector pUC18 para construir el vector de expresión (pKOT245 (No. de Acceso BIKOKEN-KI P-14895)) (Fig. 1) para la producción de la proteína. La longitud del DNA de pKOT245 es 3,7 kb. La secuencia de nucleótidos del vector de expresión construido para la proteína se analizó por el secuenciador de DNA Pharmacia ALF.

(3) Transformación

La transformación se llevó a cabo de acuerdo con el método de transformación con cloruro de rubidio por Kushner et al. (Genetic Engineering, p. 17, Elsevier, 1978). Resumidamente, se utilizó pKOT245 para transformar la cepa hospedadora E. coli W3110M de acuerdo con el método descrito arriba para producir transformantes de E. coli para la producción de la proteína.

Ejemplo 2 Cultivo (1) Cultivo

El E. coli que expresaba la proteína de la invención se precultivó en el medio SOC modificado (triptona Bacto 20 g/l, extracto de levadura Bacto 5 g/l, NaCl 0,5 g/l, MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 2,03 g/l, glucosa 3,6 g/l). Se utilizaron 100 ml de la suspensión de bacterias para inocular 5 l del medio de producción (triptona Bacto 5 g/l, ácido cítrico 4,3 g/l, K_{2}HPO_{4} 4,675 g/l, KH_{2}PO_{4} 1,275 g/l, NaCl 0,865 g/l, FeSO_{4}\cdot7H_{2}O 100 mg/l, CuSO_{4}\cdot5H_{2}O 1 mg/l, MnSO_{4}\cdotnH_{2}O 0,5 mg/l, CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 2 mg/l, Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O 0,225 mg/l, (NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O (0,1 mg/l, ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O 2,25 mg/l, CoCl_{2}\cdot6H_{2}O 6 mg/l, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 2,2 g/l, tiamina\cdotHCl 5,0 mg/l, glucosa 3 g/l), que se cultivó en un fermentador de 10 litros con aireación-agitación, y luego, después de alcanzar la etapa inicial de la fase de crecimiento logarítmico (DO_{550} = 5,0), se añadió isopropil-\beta-D-tio-galactopiranosido a una concentración final de 1 mM y se continuó el cultivo hasta que se alcanzó DO_{550} = 150. Durante el cultivo, la temperatura se mantuvo a 32ºC, y un valor de pH de 7,15 por adición de amoniaco. A fin de prevenir la disminución de una concentración de oxígeno disuelto se aceleró la agitación para mantener la concentración de oxígeno disuelto al 50% de la saturación del aire. Se continuó el cultivo por adición de solución de glucosa al 50% a un nivel de 0,2% para obtener una alta densidad de células, con indicación del aumento brusco de la concentración de oxígeno disuelto.

(2) Preparación de cuerpos de inclusión de E. coli

El caldo de cultivo obtenido por el método arriba descrito se centrifugó para recoger las células, que se suspendieron luego en tampón Tris-HCl 25 mM que contenía ácido etilenodiamina-tetraacético 10 mM (pH 7,3). Las células se fragmentaron haciéndolas pasar a través de un homogeneizador (fabricado por APV Gaulin Inc.) y se centrifugaron de nuevo para recoger el precipitado que contenía los cuerpos de inclusión.

Ejemplo 3 Purificación (1) Solubilización de los cuerpos de inclusión de E. coli

Después de lavar 3 veces con Triton X-100 al 1%, los cuerpos de inclusión de E. coli se centrifugaron a 3000 x g durante 30 minutos a 4ºC, y a continuación el precipitado resultante se solubilizó por sonicación en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,3, urea 8M, DTT 10 mM, y EDTA 1 mM.

(2) Preparación de los monómeros

La solución solubilizada se centrifugó a 20.000 x g durante 30 minutos a 4ºC y se recogió el sobrenadante resultante. El sobrenadante obtenido se sometió a SP-Sepharose FF (Pharmacia AB) equilibrada con tampón Tris-HCl 20 mM de pH 8,3, urea 6M, y EDTA 1 mM, y a continuación, después de lavado con la misma solución, se eluyó con la misma solución que contenía NaCl 0,5M. La proteína contenida en el material eluido se sulfonó por adición de Na_{2}SO_{3} y Na_{2}SO_{4}O_{6} para leer la concentración final respectivamente a 111 mM y 13 mM y por incubación a 4ºC durante 15 horas. La solución sulfonada se filtró a través de gel sobre Sephacryl S-200 HR (Pharmacia AB) equilibrado con tampón Tris-HCl 20 mM, de pH 8,3, urea 6M, NaCl 0,2M, y EDTA 1 mM para obtener monómeros sulfonados purificados de la proteína de la invención.

(3) Replegamiento

La solución de los monómeros sulfonados se añadió a un volumen nueve veces mayor de tampón Na-glicina 50 mM de pH 9,8, NaCl 0,2M, CHAPS 16 mM, EDTA 5 mM, GSH (glutatión de tipo reducción) 2 mM, y GSSG (glutatión de tipo oxidación) 1 mM con agitación, y se incubó luego durante 24 horas a 4ºC para oxidar y replegar la proteína de la invención.

(4) Preparación de homodímeros

La solución de replegamiento se diluyó con el mismo volumen de agua purificada y luego, por adición de NaCl 6N se ajustó el valor de pH a aproximadamente 7,4 y se llevó a precipitación isoeléctrica. Los precipitados recogidos por centrifugación a 3000 x g durante 20 minutos se solubilizaron en una solución con acetonitrilo al 30% que contenía 0,1% de TFA. La solución se diluyó con el mismo volumen de agua purificada y se cargó en una columna RESOURCE RPC (Pharmacia AB) de una HPLC en fase inversa pre-equilibrada con acetonitrilo al 25% que contenía 0,05% de TFA, y se eluyó luego con un gradiente lineal de acetonitrilo al 25-45% que contenía 0,05% de TFA. El material eluido se observó a 280 nm de absorbancia. Las fracciones de proteína homodímera purificadas se recogieron y se liofilizaron por medio de un Concentrador SpeedVac (Servant Co.).

(5) Metilación de las propiedades físico-químicas de la proteína purificada de la invención a) Análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal

El análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal para las proteínas purificadas se realizó utilizando un secuenciador de aminoácidos Modelo 476A (Applied Biosystems Inc.) para confirmar la secuencia de aminoácidos desde el terminal N al aminoácido número 30 como se muestra en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias.

b) Análisis de la composición de aminoácidos

El análisis de la composición de aminoácidos de las proteínas purificadas arriba obtenidas se realizó por un secuenciador de aminoácidos (PICO tag Systems, Waters). El resultado se ha representado en la Tabla 1. El número descrito en la Tabla 1 indica el número de residuos de aminoácido para una proteína monómera.

TABLA

Aminoácido	Número práctico	Número esperado
Asx	11.5	12
Glx	10.9	11
Ser	8.4	9
Gly	4.3	4
His	4.0	4
Arg	7.7	7
Thr	5.4	6
Ala	7.3	7
Pro	10.2	10
Tyr	2.9	3
Val	5.7	7
Met	5.1	4
1/2 Cys	2.6	7
Ile	4.9	6
Leu	10.0	10
Phe	4.0	4
Lys	5.9	6
Typ	-	2

longitud de la secuencia	119
- : indetectable

c) Análisis por electroforesis

Se confirmó que el peso molecular de las proteínas purificadas arriba obtenidas era aproximadamente 28 KDa por SDS-PAGE en condiciones no reductoras.

Por los resultados que se muestran en los apartados a), b) y c) anteriores, se deduce que la proteína de la invención comprende 119 residuos de aminoácidos a partir del N-terminal pro individualmente.

Ejemplo 4 Determinación de las actividades biológicas (1) Actividad en la formación ectópica de hueso en los ratones.

Aproximadamente 500 \mug de la proteína homodímera obtenida en el Ejemplo 3 se disolvieron y diluyeron en 50 \mul de ácido clorhídrico 10 mM, y se prepararon concentraciones de 1 \mug/10 \mul, 10 \mug/10 \mul, y 100 \mug/10 \mul de la solución. Se mezclaron 10 \mul de cada solución con 150 \mul de la solución de colágeno tipo I de tendón de porcino (Koken, 0,5%, pH 3, I-AC), se neutralizaron, se liofilizaron, y la mezcla resultante se implantó en bolsas creadas en los músculos del muslo de ratones macho ICR de 8 semanas. El día 1 después de la implantación, se sacrificaron los animales y se extirparon los muslos. Después de desprender las pieles de los mismos, se evaluó la incidencia de tejidos calcificados por radiografía con rayos X blandos. Como se muestra en la Tabla 2, la implantación de 1 \mug/sitio o más de la proteína dímera inducía tejido calcificado en parte del grupo de los ratones, y 10 y más dosis inducían tejido calcificado en todos los ratones utilizados.

TABLA 2

Dosis de la proteína homodímera	Incidencia de tejido calcificado
Control (colágeno tipo I solo)	0/4
1 \mug/sitio	3/4
10 \mug/sitio	4/4
100 \mug/sitio	4/4

La Figura 2 muestra ejemplos típicos de radiografías con rayos X blandos de tejido calcificado inducido por diferentes dosis de proteína MP52. Las Figuras 2A, 2b y 2C muestran ejemplos de radiografías con rayos X blandos de muslos de ratón implantados con 1 \mug de la proteína homodímera/sitio, 10 \mug/sitio y 100 \mug/sitio, respectivamente. Estas radiografías indican que la proteína homodímera inducía tejido calcificado en el muslo del ratón y aumentaba el mismo de una manera dependiente de la dosis. Con objeto de verificar si los tejidos calcificados formados eran cartílago o hueso, las secciones de los muslos de ratón fijadas en las cuales se implantaron 10 \mug/sitio de la proteína homodímera se tiñeron con von Kossa, azul Alcian o Hematoxilina-eosina.

La Figura 3 muestra fotografías al microscopio óptico de las secciones teñidas con los métodos de tinción respectivos. En la Figura 3A (tinción von Kossa), las áreas indicadas por ct y cc muestran tejido calcificado y condrocitos calcificados, respectivamente. En la Figura 3B (tinción con azul Alcian), un área indicada por rc muestra tejido cartilaginoso remanente. En la Figura 3C (tinción con Hematoxilina-eosina), los elementos indicados por ad, bm, lb, ob y wb son un adipocito, células de la médula ósea, hueso en laminillas, osteoblastos, y hueso tejido, respectivamente. Así pues, es evidente que la implantación de la proteína homodímera con colágeno tipo I en los muslos del ratón induce condrocitos calcificados, osteoblastos, y células de la médula ósea en los sitios.

Así pues, se demostró que la proteína homodímera posee actividad en la formación de cartílago y hueso ectópico.

(2) Análisis de la evolución temporal de la formación de hueso ectópico en los ratones

La proteína dímera (3 \mug) obtenida en el Ejemplo 3 se mezcló con solución de colágeno tipo I y se neutralizó como se describe en el Ejemplo 4 (1), y los materiales liofilizados se implantaron en los muslos de ratones macho ICR. Los días 3, 7, 10, 14, 21, y 28 después de la implantación, se extirparon los muslos y se fijaron en formalina al 10%, después de lo cual se tiñeron secciones con Hematoxilina-eosina o von Kossa. La Figura 4 muestra las fotografías al microscopio óptico de las secciones teñidas.

El día 3 (Figura 4A, tinción con Hematoxilina-eosina), aparecieron células mesenquimáticas (mc) no diferenciadas que incluían células conectivas morfológicamente fibrosas en el espacio comprendido entre las fibras de colágeno (co) implantadas y las células musculares (m). Entre los días 7 y 10 (Figuras 4B y 4C, respectivamente, tinción con Hematoxilina-eosina), el espacio estaba lleno con células mesenquimáticas (mc) no diferenciadas y estas células se hipertrofiaron y se diferenciaron en tejido precartilaginoso. El día 14 (Figura 4D, tinción con Hematoxilina-eosina y Figura 4E, tinción von Kossa), se observaron tejido cartilaginoso calcificado (cc) y tejido óseo (b). El día 21 (Figura 4D, tinción con Hematoxilina-eosina y Figura 4E, tinción von Kossa), no se observó en absoluto tejido de cartílago calcificado, y el tejido observado el día 14 parecía estar reemplazado por hueso (b) con médula ósea (bm). El día 28 (Figura 4H, tinción con Hematoxilina-eosina), había una gran cantidad de células de la médula ósea y parecía que el hueso formado se encontraba en un proceso de resorción.

Así pues, es evidente que la proteína homodímera induce la osificación endocondral por formación de cartílago en sitios ectópicos, como se ha consignado por utilización de otras BMPs.

(3) Efecto sobre la osificación intramembranosa

La proteína homodímera obtenida en el Ejemplo 3 se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (pH 3,4) que contenía 0,01% de sero-albúmina humana, y se prepararon concentraciones de 0,01 \mug/20 \mul, 0,1 \mug/20 \mul, y 1 \mug/20 \mul de soluciones. Se inyectaron porciones de 20 \mul de cada solución 12 veces al día en el periostio del hueso parietal de ratas recién nacidas utilizando una microjeringuilla a partir del día 1 después del nacimiento. Se inyectó el mismo volumen del vehículo en el lado contrario del hueso parietal de cada rata. Se inyectó también el mismo volumen de vehículo en ambos lados de los huesos parietales de ratas de control. El día 1 después de la inyección final, se sacrificaron las ratas y se extirparon y fijaron los dos lados de los huesos parietales, y después de ello se prepararon las secciones descalcificadas teñidas con Hematoxilina-eosina para medir el espesor de los huesos parietales en los sitios inyectados sobre fotografías microscópicas. Se calculó la relación del sitio inyectado con la proteína homodímera/sitio inyectado con vehículo en el espesor del hueso parietal de cada rata. Como se muestra en la Tabla 3, la proteína homodímera aumentaba el espesor de hueso parietal de una manera dependiente de la dosis. Un ejemplo típico de fotografías microscópicas de la sección en un sitio inyectado con 0,1 \mug de proteína homodímera/sitio se muestra en la Figura 5B en comparación con el del lado contrario de sitio inyectado con vehículo (Figura 5A). La inyección de la proteína homodímera inducía la activación y proliferación de células del periostio (p), y se observaron osteoblastos activados (ob) en y sobre el hueso parietal (b). Estos resultados indican que la proteína homodímera estimulaba la osificación intramembranosa cuando se inyectaba localmente, y que la proteína homodímera es beneficiosa para las terapias de osteoporosis, fracturas óseas, y defectos del reborde alveolar y periodontal.

TABLA 3

Dosis de proteína	Espesor del hueso parietal	Relación
homodímera	(\mum)

Proteína	Sitio inyectado	Sitio inyectado	(B/A)
(\mug/sitio/día)	con vehículo (A)	con MP52 (B)
0 (vehículo)	128 \pm 7	141 \pm 20	1,10 \pm 0,16
0,01	134 \pm 9	167 \pm 30	1,27 \pm 0,33
0,1	119 \pm 19	190 \pm 29	1,60 \pm 0,10*
1	132 \pm 9	225 \pm 25	1,70 \pm 0,14**
\begin{minipage}[t]{155mm} Los valores representan valores medios \pm DE (n = 4), * p < 0,05, ** p < 0,01 vs. relación del grupo en el cual se inyectó vehículo en ambos lados (ensayo de Williams)). \end{minipage}

(4) Efecto sobre la regeneración de cartílago articular

Se utilizaron para este estudio 6 conejos blancos macho de Nueva Zelanda de 12 semanas. Se cortaron la piel del codillo derecho y la cápsula articular y se creó un defecto osteocondral de 5 x 5 mm de espesor total en el surco rotuliano utilizando una fresa dental a fin de no dañar los tendones circundantes. Los defectos se rellenaron con esponja de colágeno tipo I liofilizada o con esponja de colágeno tipo I liofilizada que contenía 10 \mug de proteína homodímera, preparada como se describe en el Ejemplo 4 (1), y a continuación, se suturaron la cápsula articular y la piel cortadas. Tres semanas después de la operación, se sacrificaron los conejos y se extirparon las cabezas del fémur y se fijaron en formalina al 10%, después de lo cual se tiñeron con azul Alcian las secciones descalcificadas. Ejemplos típicos de fotografías microscópicas de las secciones se muestran en la Figura 6. Los defectos tratados con proteína dímera (Figuras 6C y 6D) demostraron la regeneración de condrocitos (ch) con matrices extracelulares que se teñían intensamente con azul Alcian, en comparación con los defectos de control implantados con esponja de colágeno tipo I (Figuras 6A y 6B) que se rellenaron con tejido fibroso (F). El tejido cartilaginoso inducido por la proteína dímera exhibía una estructura zonal que incluía condrocitos en reposo, condrocitos en crecimiento y condrocitos hipertrofiados, al igual que el del cartílago articular normal. La condroinducción por la proteína MP52 se observó en los defectos de todos los conejos utilizados (n = 3). Estos resultados indican que la proteína dímera es eficaz para la reparación de tejido cartilaginoso dañado en pacientes de enfermedades tales como osteoartritis.

(5) Efecto sobre la curación de las fracturas y defectos óseos

Se utilizaron para este estudio 30 ratas macho Sprague-Dawley (de aproximadamente 15 semanas). Utilizando una aposición lateral al fémur, la totalidad del músculo y el tejido del periostio se desprendieron de la diáfisis. Se creó un defecto óseo segmental de 5 mm en la región media del eje del fémur derecho utilizando una fresa dental, y a continuación, se fijó una placa de polietileno fabricada especialmente con tornillos de acero inoxidable a lo largo de la corteza del fémur. Se prepararon esponjas de colágeno de tipo I que contenían 0, 1, 10, y 100 \mug de la proteína homodímera como se describe en el Ejemplo 4 (1), y se implantaron en los defectos segmentales óseos, después de lo cual se suturó la herida. Inmediatamente después de la operación y 12 semanas después de la operación, se evaluaron los defectos por radiografía con rayos X blandos. Como se muestra en la Figura 7, 10 y 100 \mug/sitio de la proteína homodímera estimulaban la formación de callo (cs) en los defectos y formaban uniones óseas, pero el efecto para 1 \mug/sitio no estaba claro en comparación con el defecto implantado con colágeno de control en el cual se observaba solamente formación marginal de hueso endosteal. Doce semanas después de la operación, se sacrificaron las ratas, y el fémur con el defecto se extirpó y se midió el contenido de mineral óseo (que acumulaba uno de los tres barridos medios en el defecto) por absorciometría de rayos X con energía dual (Aloka, modelo DCS-600) en un modo con 1 mm de anchura de barrido después de retirar la placa de polietileno. Se fijaron ambos extremos del fémur con la resina, y se midió a continuación la resistencia máxima de torsión a la rotura de la unión de las muestras por un sistema tensor de huesos (Malto, modelo MZ-500D) a una velocidad de encaminamiento con 180º/min (Tabla 4). Se muestra que la proteína homodímera aumenta a la vez el contenido de mineral óseo y la resistencia del hueso en el defecto del fémur de la rata en el que se implanta la proteína, e indica la eficacia de la presente proteína para curación de fracturas y reconstrucción del defecto con hueso.

TABLA 4

Dosis de Proteína	Contenido Mineral Óseo	Resistencia Máxima	Número
Homodímera	en el defecto del fémur	a la Torsión
(\mug/sitio)	de la rata (mg)	(Kgf\cdotcm)
Colágeno solo	120,2 \pm 24,5	2,92 \pm 0,09	6
1	176,9 \pm 36,4	6,24 \pm 1,00	8
10	277,4 \pm 63,9	9,35 \pm 3,14	8
100	374,8 \pm 67,1*	40,34 \pm 7,64*	8
\begin{minipage}[t]{161mm} Los valores representan valores medios \pm DE, * p < 0,05 vs. grupo tratado con colágeno solo (ensayo t de Student). \end{minipage}

Por los resultados obtenidos en el Ejemplo 4, se encontró que la proteína homodímera de la invención tiene actividad morfogenética de cartílago y hueso.

La proteína compuesta de un homodímero de la proteína que tiene una secuencia de aminoácidos en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias tiene una actividad morfogenética de cartílago y hueso y es útil como composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades de cartílagos y huesos. Adicionalmente, la proteína de la invención se puede preparar en escala industrial y en forma pura por un proceso de ingeniería genética cultivando E. coli transformado con un vector de expresión de número de copias más alto para dicha proteína.

Breve explicación de los dibujos

La Fig. 1 muestra un mapa de plásmido del vector de expresión (pKOT245) para la proteína de la invención obtenida en el Ejemplo 1 (2).

La Fig. 2 muestra una radiografía con rayos X blandos del tejido calcificado inducido en el muslo del ratón en el Ejemplo 4 (1).

La Fig. 3 muestra una fotografía al microscopio óptico del tejido calcificado teñido en el muslo del ratón en el Ejemplo 4 (1).

La Fig. 4 muestra una fotografía al microscopio óptico del tejido calcificado después de evolución temporal teñido en el muslo del ratón del Ejemplo 4 (2).

La Fig. 5 muestra una fotografía al microscopio óptico del hueso parietal de la rata teñido en el Ejemplo 4 (3).

La Fig. 6 muestra una fotografía al microscopio óptico de defectos articulares de cartílago teñidos en la cabeza del fémur del conejo en el Ejemplo 4 (4).

La Fig. 7 muestra una radiografía con rayos X blandos de la formación de hueso en los defectos óseos de los fémures de rata en el Ejemplo 4 (5).

SEQ ID No.: 1

Longitud de secuencia: 119

Tipo de secuencia: aminoácido

Topología: lineal

Tipo molecular: péptido

Tipo de fragmento: fragmento N-terminal

Fuente original

\hskip1cm Organismo: Homo sapiens

\hskip1cm Nombre de tejido: feto

Características:

\hskip1cm \begin{minipage}[t]{140mm}Otra información: secuencia desde el aminoácido 383 al 501 de la secuencia de aminoácidos de MP52 \end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de la Secuencia: SEQ ID NO.: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID No.: 2

Longitud de secuencia: 27

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Clase de cadena: simple

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleido

Fuente original: ninguna

\hskip1cm Organismo: ninguno

\hskip1cm Variedad: ninguna

Características: iniciador PCR de aguas arriba de

MP52 tipo maduro

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de la secuencia: SEQ ID NO.: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATAATGCCAC TAGCAACTCG TCAGGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO.: 3

Longitud de secuencia: 26

Tipo de secuencia: ácido nucleico

Clase de cadena: simple

Topología: lineal

Tipo de molécula: otro ácido nucleico

Fuente original: ninguna

\hskip1cm Organismo: ninguno

\hskip1cm Número de tejido: ninguno

Características:

Otra información: iniciador PCR de aguas debajo de

MP52 tipo maduro

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción de la Secuencia: SEQ ID NO.: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCGACTAC CTGCAGCCAC ACGACT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Una preparación de una proteína MP52 de 119 aminoácidos que está constituida por la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias y que está exenta de proteínas de SEQ ID No.: 1 con una alanina adicional o Met y Ala adicionales en el término N.

2. Una preparación de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual la proteína MP52 de 119 aminoácidos es una proteína homodímera.

3. Una composición farmacéutica para tratamiento de enfermedades de cartílago y hueso que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la preparación de acuerdo con la reivindicación 2, y un vehículo farmacéutico.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 en la cual las enfermedades de cartílago y hueso son osteoporosis.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, en la cual las enfermedades de cartílago y hueso son osteoartritis o artrosteítis.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 en la cual las enfermedades de cartílago y hueso son fractura ósea y defecto óseo.

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, en la cual las enfermedades de cartílago y hueso son defectos radiculares y alveolares.

8. Un proceso para preparar la preparación de la reivindicación 1 que comprende cultivar E. coli transformado con un plásmido que contiene una secuencia de DNA que es capaz de expresar dicha proteína.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual el plásmido contiene un DNA que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias con una metionina en el término N.

10. Un proceso para preparar la preparación de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende los pasos de:

construir un plásmido que contiene DNA codificante de la secuencia de aminoácidos en SEQ ID No.: 1 del Listado de Secuencias con una metionina en el término N,

introducir el plásmido en E. coli para transformación,

solubilizar los cuerpos de inclusión obtenidos por cultivo de dicho E. coli,

purificar la proteína monómera a partir de la solución solubilizada,

replegar la proteína monómera en una proteína dímera y codificar la misma.

11. El uso de una preparación de proteínas de acuerdo con la reivindicación 2, para la preparación de un medicamento para tratamiento de enfermedades de cartílago y hueso.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual dicha enfermedad es osteoporosis.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual dicha enfermedad es osteoartritis o artrosteítis.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual dicha enfermedad es fractura ósea y defecto óseo.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual dicha enfermedad son defectos radiculares y alveolares.