ES2259330T3 - Procedimiento para la deteccion de microorganismos. - Google Patents
Procedimiento para la deteccion de microorganismos.Info
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Abstract
Procedimiento de detección de los elementos constitutivos de una flora bacteriana de la que por lo menos una parte de los elementos presenta un operón en común, caracterizado porque: a) se prepara el ADN genómico de dicha flora o los ARNm, b)se amplifica por lo menos una parte de las secuencias intergénicas no codificantes situadas en el operón conservado en por lo menos una parte de los elementos de la flora, y c) se identifican las diferentes secuencias intergénicas amplificadas con el fin de determinar los elementos de dicha flora, siendo dicho operón un operón rpoBC.
Description
Procedimiento para la detección de
microorganismos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de los elementos constitutivos de
una flora bacteriana de la que por lo menos una parte de los
elementos presenta un operón en común, caracterizado porque se
identifican los elementos de dicha flora mediante el estudio de la
secuencia intergénica de dicho operón.
El sistema digestivo humano alberga un número
considerable de microorganismos que constituyen una flora microbiana
de una complejidad extrema. Aunque dichas bacterias están
repartidas a lo largo del tracto digestivo, el colon presenta la
parte esencial de dicha flora tanto desde un punto de vista
cuantitativo como cualitativo. Se estima que la flora cólica de un
individuo está constituida por 10^{13} a 10^{15} bacterias,
esencialmente anaerobias, representadas por al menos 400 especies
pertenecientes a aproximadamente 30 géneros diferentes. Dichas
bacterias colonizan los diferentes estadios del colon de forma
relativamente heterogénea. Se describe clásicamente una flora
denominada de fermentación a nivel del intestino ciego (caecum) así
como una flora denominada de putrefacción a nivel del colon
izquierdo. Por otra parte, se distingue una flora residente de una
flora de paso. Dicha flora residente se escinde por sí misma en
flora dominante y flora sub-dominante. Las
bacterias dominantes, esencialmente anaerobias, están representadas
mayoritariamente por el género Bacteroides, bacilos gram
negativos, pero también por los géneros Bifidobacterium,
Lactobacillus o Clostridium, bacilos gram positivos. La
flora sub-dominante incluye unas bacterias
aero-anaerobias y microaerófilas. Se destaca sobre
todo la presencia de enterobacterias y de estreptococos. Tanto el
régimen alimenticio, las infecciones, el aporte de pre- y
probióticos como los tratamientos antibióticos, son susceptibles de
provocar unas modificaciones drásticas de la composición de la
flora cólica. Al tener dichas variaciones un impacto directo sobre
la salud, es importante conocerlas y comprenderlas, tanto para
evitarlas como para activarlas con un fin terapéutico. Hasta el
momento, el estudio de las bacterias cólicas ha permitido
caracterizar aproximadamente 200 especies. Sin embargo, dicho tipo
de investigación choca con diversos problemas asociados
esencialmente a la pesadez de las técnicas. Los resultados obtenidos
así como las conclusiones que de ellos se derivan son todavía
fragmentarios.
La identificación de las bacterias se realiza
según diferentes procedimientos que recurren o bien a la utilización
de caracteres fenotípicos o bioquímicos específicos, o bien a la
utilización y al reconocimiento de zonas específicas heterólogas
presentes en el genoma.
Un principio de identificación se podrá efectuar
describiendo la morfología del organismo estudiado y buscando por
ejemplo la presencia de endosporas, de envolventes, de quistes, de
granos, de cuerpos fructíferos... La forma de las colonias, la
pigmentación, el origen de la extracción son asimismo unas
informaciones útiles. Se podrán asimismo realizar unos estudios
preliminares utilizando unos colorantes específicos de la cápsula,
de los flagelos, de los gránulos, de la pared... Sin embargo, una
identificación más avanzada y precisa pasa obligatoriamente por
unas técnicas de aislamiento en unos medios selectivos. Tales medios
se desarrollan o se mejoran con el fin de aumentar la especificidad
de dicha selección. Sin embargo, es difícil excluir completamente
la presencia de eventuales contaminantes que podrían por lo tanto
interferir en los ensayos de reconocimiento utilizados
posteriormente.
Dichos ensayos recurren a los caracteres
bioquímicos específicos de una especie. Existen unos sistemas de
multiensayos. Son unas galerías de identificación que se presentan
en forma de equipos, de microplacas, de bandas cuya utilización es
a veces automatizada. Sin embargo, existe un cierto grado de
heterogeneidad de origen cromosómico o plasmídico en el seno de
muchas especies. De este modo uno o varios caracteres estarán
ausentes en el momento de la identificación. También no se dará, en
la mayoría de las veces, más que la probabilidad de pertenencia a
una especie. Una similitud el 80% o más con una bacteria de
referencia se considerará como aceptable. Asimismo se han
desarrollado unos sistemas monoensayo. Se utilizan unos sustratos
sintéticos fluorescentes que permiten poner en evidencia la
presencia de una enzima específica de un microorganismo. Permiten un
análisis rápido pero están limitados en su utilización. En efecto,
debe desarrollarse un ensayo específico para cada especie.
Asimismo se han desarrollado unos ensayos
inmunológicos a partir de unos anticuerpos poli- o monoclonales.
Fuera de la limitación evidente inherente a los anticuerpos
policlonales, dichos ensayos se emplean mayoritariamente para la
caracterización de serotipos pero raramente para la identificación
de especies. Aunque normalmente se utilizan en el diagnóstico
hospitalario, permanecen poco empleados en bacteriología. En cuanto
a la preparación de anticuerpos monoclonales, queda todavía mucho
trabajo, laborioso y oneroso. Éstos se dirigen por ejemplo contra
unos lipopolisacáridos, la membrana, los pilis ..... pero sin
embargo son raramente específicos para una especie.
El desarrollo de las técnicas de biología
molecular ha permitido desarrollar unos nuevos ensayos de
identificación. Dichas técnicas se basan en unas reacciones de
hibridación o de amplificación en cadena por polimerasa (PCR).
La hibridación genoma/genoma debe ser superior o
igual al 70% para identificar una especie de bacteria desconocida
como siendo la bacteria de referencia conocida de la que se utiliza
el ADN genómico para realizar el diagnóstico. Otros ensayos hacen
intervenir unas zonas heterólogas en el ADN específico de una
especie. Se puede de este modo utilizar la técnica de hibridación
que consiste en depositar sobre una membrana de nylon o de
nitrocelulosa el producto a analizar y después en incubar con una
sonda marcada (sonda fría o sonda caliente) específica {1}.
Se pueden asimismo utilizar unos cebadores
específicos que permiten amplificar un fragmento de un tamaño
determinado mediante la técnica de PCR {2, 3}. En dicho caso, los
amplificados obtenidos por PCR pueden ser ellos mismos analizados
por otras técnicas tales como la RFLP (polimorfismo de tamaño de los
fragmentos de restricción) {4} o el TGGE (gel de electroforesis en
gradiente de temperatura) {5}, afinando el diagnóstico.
A pesar de su gran capacidad de discriminación,
dichas técnicas resultan limitadas en la medida en que no permiten
analizar más que una especie a la vez, o bien consisten en aislar
una mezcla de especies que no se pueden identificar entonces sin
conocer exactamente el patrón de análisis de los amplificados
mediante una técnica determinada sobre un biotipo determinado.
El desarrollo de los chips de ADN (biochips)
permite prever un diagnóstico rápido desarrollado sobre diversos
centenares de especies. Dicha técnica consiste en colocar sobre una
superficie de algunos milímetros cuadrados varios centenares de
secuencias de ADN específicas de un organismo determinado. Dichas
sondas se hibridan con unos fragmentos de ADN, generalmente
obtenidos por RT-PCR. La hibridación eventual de
dichos fragmentos se observa después, e indica la presencia o la
ausencia del gen expresado, o del organismo estudiado.
Las dianas nucleicas estudiadas estos últimos
años son esencialmente el ARN ribosómico 16S (con más de 7000
secuencias disponibles) {1,2, 4, 5}, la región que separan los locus
genéticos 16S y 23S {3} y los factores de elongación {6, 7}. De
este modo, basándose en los ARN 16S, se han podido detectar diversas
especies nuevas, que pertenecen a los grupos Bacteroides y
Clostridium, pero no Bifidobacterium {8}. Por otra
parte, y a pesar de que los ARN 16S permiten detectar e
identificar numerosas bacterias al grado de especie, son incapaces
de discriminar las diferentes especies de Staphylococos {2, 3}. De
este modo, una región variable del gen que codifica para HSP 60 ha
sido propuesta para el estudio de los microorganismos de la flora
intestinal {9}.
Se sabe también {11} que la amplificación de una
secuencia nucleotídica variable del gen que codifica para la
proteína HSP60 conservada, con la ayuda de los cebadores diseñados
en las regiones flanqueantes muy conservadas, permite la detección
de bacterias, en particular de estafilococos, a nivel de las
especies.
Por otra parte, asimismo se sabe {12} detectar
la presencia de tres géneros de espiroquetas por amplificación por
PCR del gen que codifica la sub-unidad \beta del
ARN polimerasa (gen rpoB) con la ayuda de unos cebadores diseñados
en las secuencias conservadas. La amplificación del gen codificante
rpoB no permite sin embargo amplificar unas secuencias de
bacterias pertenecientes a otros géneros, tales como Escherichia
coli y Staphylococcus aureus.
La presente invención tiene por objeto un
procedimiento de detección y de identificación de los elementos
constitutivos de una flora bacteriana, en particular la flora
intestinal, según el cual se detecta y se estudia una diana incluso
más discriminatoria y universal que las ya estudiadas.
El procedimiento según la presente invención
comprende la caracterización de las secuencias de dicha diana en los
organismos presentes en la flora bacteriana estudiada, y permite de
este modo concebir un ensayo de diagnóstico.
De este modo, la diana estudiada en el
procedimiento de la invención presenta una fuerte heterogeneidad
interespecie, lo que permite la discriminación entre los
microorganismos.
La presente invención se refiere por lo tanto a
un procedimiento de detección de los elementos constitutivos de una
flora bacteriana en la que por lo menos una parte de los elementos
presenta un operón en común, caracterizado porque:
- a)
- se prepara el ADN genómico de dicha flora o los ARNm,
- b)
- se amplifica por lo menos una parte de las secuencias intergénicas no codificantes situadas en el operón conservado en por lo menos una parte de los elementos de la flora, y
- c)
- se identifican las diferentes secuencias intergénicas amplificadas con el fin de determinar los elementos de dicha flora, siendo dicho operón un operón rpoBC.
En efecto, de forma sorprendente, se ha
destacado que las regiones intergénicas en el operón rpoBC
conservado entre diferentes especies, presentan una determinada
heterogeneidad, mientras que las zonas codificantes que flanquean
dichas regiones en 5' y/o en 3' son generalmente muy conservadas. Es
posible que dicho hecho sea debido a una presión de selección poco
fuerte en las regiones no codificantes a lo largo de la evolución
{10}.
La amplificación se realiza preferentemente por
la amplificación en cadena por polimerasa (PCR), pero se pueden
utilizar otros métodos (similar a la PCR), que utilizan una pareja
de cebadores de secuencias nucleotídicas que permiten la utilización
del procedimiento según la invención.
Por similar a PCR se entiende que se designan
todos los métodos que utilizan unas reproducciones directas o
indirectas de las secuencias de ácidos nucleicos, o bien en las que
se han amplificado los sistemas de marcaje, dichas técnicas son por
supuesto conocidas. En general se trata de la amplificación del ADN
mediante una polimerasa; cuando la muestra de origen es un ARN
conviene efectuar previamente una transcripción inversa. Existen
actualmente numerosos procedimientos que permiten dicha
amplificación, como por ejemplo la técnica SDA (Strand Displacement
Amplification) o la técnica de amplificación por desplazamiento de
hebra, la técnica TAS (Transcription-based
Amplification System), la técnica 3SR
(Self-sustained Sequence Replication), la técnica
NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), la técnica TMA
(Transcription Mediated Amplification), la técnica LCR (Ligase
Chain Reaction), la técnica de RCR (Repair Chain Reaction), la
técnica de CPR (Cycling Probe Reaction), la técnica de amplificación
con la Q-beta-replicasa. Algunas de
dichas técnicas se han perfeccionado desde entonces.
El análisis de las secuencias amplificadas se ha
efectuado ventajosamente sobre un chip de ADN que presenta unas
secuencias complementarias de las secuencias susceptibles de ser
amplificadas a partir de los elementos de dicha flora. El
conocimiento de los microorganismos que pueden estar presentes en la
muestra biológica estudiada es por lo tanto importante con el fin
de seleccionar el chip de ADN a utilizar. De este modo, es
necesario que el chip de ADN presente, en su superficie, unas sondas
para cada uno de los organismos que se quieren estudiar. Dicho chip
de ADN es asimismo un objeto de la invención.
De este modo, la presente invención se refiere
más particularmente a un chip de ADN que comprende, en su
superficie, unas secuencias complementarias de las secuencias
intergénicas no codificantes situadas en un operón conservado entre
diferentes especies, siendo dicho operón un operón rpoBC. Por chip
de ADN, se entiende un soporte sólido sobre el que se fijan unos
fragmentos de ácidos nucleicos en unas condiciones que permiten su
hibridación con los oligonucleótidos complementarios y la detección
de los híbridos así formados. De este modo, un chip de ADN según la
invención se refiere asimismo a las membranas tales como las
utilizadas para efectuar transferencias Southern.
Los oligonucleótidos fijados sobre el chip de
ADN según la presente invención lo son mediante cualquier método
clásico conocido por el experto en la materia, y presentan una
longitud de aproximadamente 50 bases. Se entiende que los
oligonucleótidos pueden asimismo ser más cortos, o más largos. De
este modo, está al alcance del experto en la materia determinar la
longitud de los olignucleótidos fijados sobre el chip según la
invención, para cada secuencia.
De forma preferida, los oligonucleótidos fijados
sobre el chip de ADN se seleccionan de tal manera que su secuencia
comprenda una parte de la región hipervariable identificada según la
presente invención. Los oligonuleótidos fijados sobre el chip según
la invención pueden asimismo contener unas secuencias
correspondientes a las secuencias variables a un grado mínimo,
situados dentro o cerca del extremo de los genes del operón.
En un caso particular y preferido de utilización
de la invención, el chip de ADN según la invención presenta una
pluralidad (un número superior o igual a 2, preferentemente 3, de
forma más preferida 5, de la forma más preferida 10) de
oligonucleótidos de tamaño superior a 30 bases. Preferentemente,
dichos oligonucleótidos comprenden un fragmento de por lo menos 40
ó 50, de forma más preferida 75, de la forma más preferida 100
bases consecutivas, unas secuencias SEC ID nº 63 a SEC ID nº 138,
correspondientes a las secuencias intergénicas de las diferentes
especies (rpoBC para la SEC ID nº 63 y SEC ID nº 138).
De este modo, la puesta de manifiesto de las
eventuales hibridaciones de las secuencias amplificadas permite
identificar los elementos presentes en la flora microbiana
estudiada.
El operón adaptado a la utilización del
procedimiento según la invención es el operón rpoBC de las
bacterias. Dicho operón bacteriano contiene unas secuencias
codificantes relativamente homólogas entre géneros. Es por lo tanto
posible determinar unos cebadores degenerados para amplificar una
zona heteróloga entre especies que corresponde a la zona intergénica
transcrita (ZIG). El operón rpoBC codifica en las bacterias para las
sub-unidades beta y beta prima de la
"DNA-directed RNA polimerase" (ARN polimerasa)
así como los genes homólogos conservados o no en forma de operón
en las mitocondrias y otros orgánulos eucariotas (cloroplastos), y
así como la ARN polimerasa II eucariota nuclear (que sintetiza los
ARN mensajeros). El estudio de dicho operón permite no sólo detectar
las bacterias sino también otros microorganismos eucariotas
(levaduras, protozoos, u otros).
De este modo, se utiliza el procedimiento según
la invención, utilizando unos cebadores degenerados situados en las
secuencias codificantes del operón rpoBC, principalmente por lo
menos un cebador seleccionado de entre las secuencias SEC ID nº 1 a
la SEC ID nº 31, y la SEC ID nº 5 a la SEC ID nº 6, objeto a su vez
de la invención. Las proteínas ARN polimerasas están en efecto
extremadamente conservadas según las especies, lo que permite
encontrar unas secuencias de aminoácidos alineándose entre ellas, y
de este modo seleccionar unos oligonucleótidos degenerados para
efectuar la amplificación de las secuencias intergénicas.
Se utilizan las parejas de cebadores descritas
por las secuencias; (una secuencia seleccionada de entre las
secuencias SEC ID nº 1 a SEC ID nº 8)/(una secuencia seleccionada de
entre las secuencias SEC ID nº 9 a SEC ID nº 11) para amplificar
una primera vez la región intergénica ZIG de las bacterias. Una
segunda amplificación más específica puede por lo tanto emplearse
utilizando unas parejas de cebadores que hibridan en el interior
de la primera región amplificada y descritas por las secuencias,
(una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 12 a
SEC ID nº 15)/(una secuencia seleccionada de entre las secuencias
SEC ID nº 16 a SEC ID nº 31).
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Se utilizan las parejas de cebadores descritas
por las secuencias, una secuencia seleccionada de entre las
secuencias SEC ID nº 53 y SEC ID nº 54 para amplificar la región
intergénica ZIG de las bacterias.
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\newpage
Dichos cebadores se han diseñado a partir del
estudio de la degeneración de grupos proteicos conservados
correspondientes a rpoB y/o codificados para el gen rpoB:
Para las secuencias inversas, determinadas a
partir de la degeneración de los grupos proteicos conservados que
corresponden a rpoC y/o codificados por el gen rpoC:
Dichos cebadores también forman parte de la
invención.
La invención tiene asimismo por objeto las
secuencias genómicas de microorganismos que pueden ser amplificados
por los cebadores según la invención, en particular las parejas de
cebadores (una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC
ID nº 1 a SEC ID nº 8)/(una secuencia seleccionada de entre las
secuencias SEC ID nº 9 a SEC ID nº 11) y las parejas de cebadores
(una secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 12 a
SEC ID nº 15)/(una secuencia seleccionada de entre las secuencias
SEC ID nº 16 a SEC ID nº 31). Se prevé también la amplificación con
unas parejas de cebadores (una secuencia seleccionada de entre las
secuencias SEC ID nº 53, SEC ID nº 55 a SEC ID nº 58)/(una
secuencia seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 54, SEC ID
nº 59 a SEC ID nº 61).
De este modo, la invención tiene también
particularmente por objeto una secuencia de entre la SED ID Nº 63 y
SEC ID nº 138, que corresponde a las regiones intergénicas
hipervariables del operón rpoB de diferentes organismos. La
invención tiene asimismo por objeto cualquier fragmento de un mínimo
de 30 bases, preferentemente 30 bases, de forma más preferida 50
bases, de forma incluso más preferida 75 bases, de la más preferida
100 bases de una de las secuencias SEC ID nº 63 a SEC ID nº 138 o
sus secuencias complementarias, dicho fragmento se puede utilizar
para definir unos cebadores específicos de los organismos, o para la
identificación de organismos particularmente para la
hibridación.
De este modo, el chip de ADN según la invención
presenta preferentemente en su superficie una pluralidad de
oligonucleótidos (como mínimo dos) que comprenden unos fragmentos
seleccionados de entre los fragmentos de las secuencias SEC ID nº
63 y SEC ID nº 138 definidos anteriormente, permitiendo de este modo
la identificación de los microorganismos. El tamaño de dichos
oligonucleótidos se puede determinar por el experto en la materia,
en función de las condiciones de hibridación que se pretenden
utilizar. Se prevén de este modo unos oligonucleótidos de un tamaño
de aproximadamente 50 bases.
La presente invención tiene asimismo por objeto
unos estuches de diagnóstico para la utilización del procedimiento
según la invención. Dichos estuches de diagnóstico contienen unos
cebadores degenerados que permiten la amplificación de una o varias
regiones intergénicas del operón rpoBC conservado de entre las
especies. Pueden asimismo contener los reactivos necesarios para la
reacción de amplificación. Por otra parte, se puede incluir en los
estuches de diagnóstico según la invención ADN que representa unos
controles positivos o negativos.
Un estuche de diagnóstico según la invención
contiene también ventajosamente los elementos necesarios para el
análisis de los productos amplificados. En particular, un estuche de
diagnostico según la invención contiene un chip de ADN según la
invención, que presenta, en su superficie, las secuencias
correspondientes a los diferentes microorganismos.
Según la especie que se desea detectar, el
estuche de diagnóstico según la invención contiene la pareja de
cebadores y los elementos de análisis adecuados. Por otra parte, un
estuche según la invención puede asimismo comprender las
instrucciones para la utilización del procedimiento según la
invención.
Un estuche de diagnóstico según la invención
también puede contener solo un chip de ADN según la invención, así
como eventualmente unas instrucciones que permiten la utilización
del análisis de fragmentos situados en la región intergénica del
operón rpoBC conservado entre las especies.
El acoplamiento de los cebadores y de las sondas
específicas permite de este modo una identificación rápida y precisa
de la flora de un sujeto determinado. Se permite por lo tanto
establecer el o los perfiles de poblaciones características de
individuos sanos. Se pueden también establecer los perfiles tipos de
diferentes patologías.
El procedimiento según la invención ofrece
asimismo la posibilidad de un seguimiento fácil de la evolución de
la flora en función de la alimentación. Más específicamente, se
pueden seguir los efectos, a nivel cólico, de un alimento particular
tal como un pre o probiótico o de un tratamiento medicamentoso tal
como una antibioticoterapia.
Se puede por lo tanto prever la puesta a punto
de alimentos o medicamentos con el objetivo de un "efecto sobre
la flora" permitiendo un restablecimiento y un retorno a un
perfil normal después de un desequilibrio como consecuencia de una
patología o una agresión cualquiera. Se pueden asimismo utilizar
unos cebadores y unas sondas correspondientes a unas cepas
patógenas con el fin de establecer eventualmente los umbrales
críticos de poblaciones precedentes a una patología. Se puede por
lo tanto determinar cuáles son las otras poblaciones susceptibles de
ejercer un efecto de barrera sobre dichos patógenos.
Las herramientas para el diagnóstico de la flora
intestinal desarrolladas y basadas en el procedimiento según la
invención (que constituyen asimismo unos objetos de la invención)
interesan en un primer momento a los industriales
agro-alimentarios y farmacéuticos con el fin de
poner a punto sus productos y de observar el impacto de los mismos
sobre la flora intestinal. En efecto, unos regímenes particulares
son susceptibles a largo plazo de modificar de forma importante la
composición de la flora y de tener por consiguiente unos efectos
nefastos o beneficiosos según los tipos de poblaciones que aparecen
o desaparecen. De la misma forma, unos tratamientos medicamentosos
y en particular los tratamientos antibióticos conllevan unos
desequilibrios en el seno de la microflora. La caracterización de
las poblaciones tocadas según el tipo de medicamento permitiría
llevar a cabo un tratamiento paralelo o posterior capaz de impedir
dichas modificaciones o de restablecer una flora correcta lo más
rápidamente posible.
Dichas herramientas interesan también a los
profesionales de la salud para la caracterización de la flora
intestinal de pacientes, lo que puede permitir, por ejemplo,
orientar un tratamiento. En efecto, los
gastro-enterólogos estiman en el 70% la parte de la
población de los países industrializados aquejada de trastornos
digestivos diversos que se denominan colopatías funcionales, que
varían desde simples trastornos digestivos como la hinchazón, las
flatulencias a unos trastornos más importantes como el
estreñimiento, o la diarrea.... La mayor parte de sus consultas se
refieren a dichas colopatías funcionales.
Se han aportado pocas soluciones para curar
dichos trastornos ya que para determinadas colopatías su causa
permanece todavía poco conocida y para otras no se dispone de
tratamientos eficaces. A todo ello hay que añadir el problema del
diagnóstico médico porque los pacientes que presentan dichos
síntomas de colopatías funcionales generalmente no presentan
ninguna lesión física a nivel del colon. Solo un cuestionario
permite al gastro-enterólogo dirigirse hacia un
tipo de tratamiento que se revela poco eficaz en la mayoría de los
casos. El mercado de los productos que pueden aliviar dichos
trastornos es por lo tanto importante, así como el del diagnóstico.
En efecto, un diagnóstico de la flora de los pacientes podría
informar al médico sobre las causas de sus trastornos y el
tratamiento a llevar a cabo.
Para seleccionar una diana genómica de interés,
ya sea una diana que esté conservada en todos los genomas, se ha
estudiado la conservación de los operones más conservados a lo largo
de la evolución a partir de unos genomas de las 51 bacterias
enteramente secuenciadas y disponibles en el servidor NCBI. Dichas
secuencias se han posicionado en relación a la del rpoB/C (operón
beta).
Se desprende de este primer análisis que las
dianas más largas y más conservadas son en efecto los operones
groESL (que codifican para el Hsp_{10} (groES) y Ilsp60 (groBL) y
una parte del operón beta correspondiente a los genes rpoB y rpoC
(que codifica para las sub-unidades beta y beta' de
la DNA-directed-RNA plymerase).
Además, ha sido posible identificar unos grupos proteicos
conservados suficientemente largos para permitir la definición y
después la síntesis de cebadores degenerados universales
(ubiquitarios) o casi.
De este modo, el operón rpoBC ha sido
seleccionado con el fin de ejemplificar el principio del método
según la invención.
Por último, se ha amplificado la zona de interés
del operón beta, es decir la región amplificable por PCR utilizando
los dos cebadores degenerados correspondientes (FO y RP: SEC ID nº
53 y SEC ID nº 54) para una selección de las bacterias con el fin
de establecer la secuencia y de ensayarlas por hibridación sobre una
membrana de nylon para validar su especificidad. Dichas secuencias
se han alineado asimismo con sus homólogas disponibles en el
GenBank con el fin de observar dicha especificidad por
bioinformática.
Los ejemplos siguientes están destinados a
ilustrar la invención, y no deben ser considerados como limitativos
de la invención.
En la solicitud, las abreviaciones para las
bacterias son las siguientes:
Bacillus subtilis (BS) CIP
52-65T; Bacteroides vulgatus (BV) DSM 1447;
Bifidobacterium longum (BL) DSM 20219; Clostridium
leptum (CL) DSM 753; Clostridium nexile (CN) DSM 1787;
Clostridium spiroforme (CS) DSM 1552; Clostridium
glycolycum (CG) DSM 1288; Lactobacillus gaseri (LG) DSM
20077; Lactobacillus helveticus (LH) CIP 103146;
Lactobacillus paracasei (LP) DSM 8741; Lactobacillus
reuteri (LR) DSM 20053; Pseudomonas aeroginosa (PA) CIP
100720; Ruminococcus hydrogenotrophicus (RH) DSM 10507;
Citrobacter freundii (CF); Serratia liquefaciens (SL);
Serratia marcescens (SM); Enterobacter cloacae (EnC);
Escherichia coli (EsC); Morganella morganii (MM);
Proteus mirabilis (PM); Klebsiella oxytoca (KO);
Klebsiella pneumoniae (KP)
Figura 1: Esquema del operón rpoBC de
E.coli. Los cebadores universales (ubiquitarios) se utilizan
para la amplificación de la secuencia intergénica.
Figura 2: Esquema del operón groESL de E.
coli. Los cebadores universales se utilizan para la
amplificación de la secuencia intergénica.
Figura 3: Principio de un chip de ADN. Unas
secuencias específicas se fijan sobre un soporte sólido. La
hibridación eventual de las secuencias complementarias permite
determinar su presencia en una muestra.
Figura 4: Hibridación de depósitos de 10 ng de
ADN amplificado mediante PCR con unos cebadores rpoBC (i) y de ADN
genómico (II) con una sonda Serratia marcescens,
(\sim 0,25 ng/ml (A) o Klebsiella oxytoca, \sim 1 ng/ml
(B) durante 18 horas a una temperatura de 60ºC y un revelado de 30
minutos a una temperatura de 37ºC. Se puede observar una hibridación
cruzada de CF, SM, SL, EC y KP con la sonda KO-DIG
(\sim 1 ng/ml) y de SL con la sonda SM-DIG (\sim
0,25 ng/ml).
Figura 5: Hibridación de depósitos i (ADN
genómico, a: 10 a 20 \mug, b: 5 a 10 \mug, c: 0,5 a 1 \mug,
d: 50 a 100 ng, e: 5 a 10 ng, f: 0,5 a 1 ng) i ii (ADN amplificado
mediante PCR con unos cebadores GroESL. a: 50 a 100 ng, b: 5 a 10
ng, c: 0,5 a 1 ng, d: 50 a 100 pg, e: 5 a 10 pg, f: 0,5 a 1 pg) con
una sonda PA-DIG (\sim 10 ng/ml) durante 18 horas
a una temperatura de 42ºC y un revelado de 30 minutos a una
temperatura de 37ºC.
Figura 6: Hibridación de depósitos i (ADN
amplificado mediante PCR con unos cebadores rpoBC: 10 ng/1 ng/100
pg) y ii (ADN genómico, 1 \mug/100 ng/10 ng) con una sonda
LR-DIG (\sim 1 ng/ml) durante 18 horas a una
temperatura de 50, 55, 60 y 65ºC y un revelado de 30 minutos a una
temperatura de 37ºC.
Con el fin de disponer de una muestra grande y
representativa de la flora cólica humana, es necesario aislar nuevas
cepas bacterianas, todavía denominadas no cultivables (y por lo
tanto desconocidas), que constituyen un gran porcentaje de las
bacterias de la flora cólica humana.
Para llevar a cabo dichos aislamientos, se
recoge una gran cantidad de heces humanas y se esterilizan mediante
unas radiaciones de tipo gamma o por calor, con vistas a sembrar en
ellas unas muestras de las mismas heces humanas y de cultivarlas en
aerobiosis y anaerobiosis, en medio líquido y medio sólido.
En función de las condiciones de cultivo
utilizadas, se pueden asimismo aislar nuevos géneros, especies o
cepas de bacterias cólicas u otros microorganismos eucariotas.
Se trata de efectuar una caracterización
molecular de las secuencias, idealmente de ARNm para efectuar una
cuantificación y si no de ADN genómico, de unos aislados de
microorganismos bacterianos o eucariotas.
Se lleva a cabo el estudio de las secuencias
correspondiente a unas porciones del operón bacteriano rpoBC. Los
genes de dicho operón son en efecto relativamente homólogos entre
géneros.
Un análisis informático (alineamiento de las
secuencias) permite de este modo definir unos cebadores degenerados
para la amplificación de la zona heteróloga entre especies que
corresponde a la zona intergénica transcrita.
De este modo, los cebadores SEC ID nº 1 y SEC ID
nº 31 así como los otros cebadores se han definido después del
alineamiento de las secuencias correspondiente a más de 50 especies
de organismos vivos (procariotas y eucariotas, no mostrada)
utilizando la redundancia del código genético. Se prefieren
principalmente las secuencias SEC ID nº 53 y SEC ID nº 54.
Las regiones amplificadas por PCR o
RT-PCR con los cebadores citados anteriormente se
pueden clonar evidentemente en diferentes vectores, con el fin de
ser utilizados para afinar el análisis (en particular para
secuenciarlos).
Se efectúa el estudio de las secuencias
correspondientes a unas porciones del operón bacteriano bicistrónico
GroESL. Los genes de dicho operón son en efecto relativamente
homólogos entre géneros.
El análisis informático (alineamiento de las
secuencias) permite de este modo definir unos cebadores degenerados
para la amplificación de la zona heteróloga entre especies que
corresponde a la zona intergénica transcrita.
De este modo, se han definido los cebadores SEC
ID nº 34 y SEC ID nº 35 después del alineamiento de las secuencias
correspondiente a más de 100 especies de organismos vivos
(procariotas y eucariotas, no mostrado).
Las secuencias SEC ID nº 36 a SEC ID nº 52 y en
particular la SEC ID Nº 139 corresponden a unas secuencias
complementarias que se pueden utilizar para la amplificación de
microorganismos de diversos géneros y/o familias.
En cuanto a los cebadores SEC ID nº 32 y SEC ID
nº 33, éstos se han definido a partir de las secuencias conservadas
de los genes GroES y GroEL de E.coli, utilizando la
degeneración del código genético.
Las reacciones de PCR se efectúan según el
protocolo siguiente:
Se concentran por centrifugación y resuspensión
del precipitado bacteriano en 30 \mul de agua destilada,
2 ml de caldo de cultivo agitados a una temperatura de 37ºC durante
18h, y después se utiliza como matriz para las reacciones de PCR una
dilución al 1/10º de dicho concentrado tratada a una temperatura de
100ºC durante 10 minutos. Las condiciones de reacción son 94ºC/5
minutos, y después 25 ciclos de (94ºC/30 seg., 60ºC/45 seg., 72ºC/30
seg.), seguidos de una etapa de elongación a una temperatura de 72ºC
durante 7 minutos.
El análisis de los amplificados permite mostrar
que se pueden amplificar, utilizando los cebadores SEC ID nº 32 y
SEC ID nº 33, la zona intergénica de las diferentes Enterobacterias,
tales como Escherichia coli, Enterobacter clocae, Morganella
morganii, Serratia licquefasciens, Proteus mirabilis, Serratia
marcescens, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Klebsiella
oxytoca. La región amplificada varía en longitud, según las
especies, de 400 a 500 pares de bases (pb). La utilización de la
pareja de SEC ID nº 34 y SEC ID nº 36 proporciona unos amplificados
de tamaño comprendido entre 550 y 650 pb.
La utilización de las parejas (SEC ID nº 34, SEC
ID nº 35, o SEC ID Nº 39)/(una secuencia seleccionada de entre
las secuencias SEC ID nº 36 a SEC ID nº 38 o SEC ID nº 40 a SEC ID
nº 52, o SEC ID nº 139) permite la amplificación de secuencias
específicas de determinadoas familias y especies, y la
identificación de los organismos de dichas familias o especies.
Para las reacciones de amplificación, se utiliza
preferentemente un cebador marcado "A" con un cebador marcado
"B".
Las regiones amplificadas por PCR o
RT-PCR con los cebadores citados anteriormente se
pueden evidentemente clonar con diferentes vectores, con el fin de
ser utilizados para afinar el análisis (en particular para
secuenciarlos).
Con vistas a demostrar que la utilización de la
zona intergénica de los dos operones de interés como sonda nucleica
puede permitir discriminar diversas especies bacterianas, se ha
amplificado, por PCR directa sobre unas suspensiones bacterianas,
dicha ZIG para cada diana. Para las reacciones de amplificación, se
utiliza preferentemente un cebador marcado "A" con un cebador
marcado "B".
Se concentran por centrifugación y resuspensión
del precipitado bacteriano en 30 \mul de agua
destilada, 2 ml del caldo de cultivo agitado a una temperatura de
37ºC durante 18 horas, y después se utiliza como matriz para las
reacciones de PCR una dilución al 1/10º de dicho concentrado tratado
a una temperatura de 100ºC durante 10 minutos.
Las reacciones de PCR, para dicha diana, se
efectúan, a una Tm que varía entre 59ºC y 60ºC. Las condiciones de
la reacción son de 94ºC/5 minutos, y después 25 ciclos de (94ºC/30
seg., 60ºC/45 seg., 72ºC/30 seg.), seguidos de una etapa de
elongación a una temperatura de 72ºC durante 7 minutos. Las regiones
intergénicas amplificadas se observan a continuación mediante una
electroforesis en gel de agarosa utilizando una escala 1 Kb + (Gibco
BRL).
El análisis de los amplificados permite mostrar
que se puede amplificar, utilizando los cebadores SEC ID nº 32 y SEC
ID nº 33, la zona intergénica de diferentes Enterobacterias, tales
como Escherichia coli, Enterobacter clocae, Morganella morganii,
Serratia licquefasciens, Proteus mirabilis, Serratia marcescens,
Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca.
La región amplificada varía en longitud, según las especies, de 400
a 500 pares de bases (pb). La utilización de la pareja de SEC ID nº
34 y SEC ID nº 36 proporciona unos amplificados de tamaño
comprendido entre 550 y 650 pb.
Las reacciones de PCR, para dicha diana, se
efectúan, a una Tm que varía entre 63ºC y 64ºC. Las condiciones de
la reacción son de 94ºC/4 minutos, y después 30 ciclos de (94ºC/30
seg., 64ºC/30 seg., 72ºC/3 min.), seguidos de una etapa de
elongación a una temperatura de 72ºC durante 12 minutos. Las
regiones intergénicas amplificadas se observan a continuación
mediante una electroforesis en gel de agarosa utilizando una escala
de ADN molecular weight marker III (Ref: nº 528552; Boehringer
Mannheim).
El análisis de los amplificados permite mostrar
que se puede amplificar, utilizando la pareja de cebadores SEC ID
nº 53 y SEC ID nº 54, la zona intergénica de diferentes bacterias,
tales como Escherichia coli, Clostridium leptum, Klebsiella
oxytoca, Lactobacillus lactis, Citrobacter freundii, Serratia
marcescens, Proteus mirabilis, Serratia liquefasciens, Morganella
morganii, Enterobacter clocae, Ruminooccus
hydrogenotrophicus.
Se han reamplificado unos fragmentos de ADN
correspondientes a las regiones intergénicas del operón rpo B/C en
diferentes especies y se han analizado a partir de unas bandas
extraídas de una preparación de gel de agarosa. Dichos fragmentos
se han purificado anteriormente con un equipo de extracción
Qiagen.
Las regiones amplificadas por PCR o
RT-PCR con los cebadores citados anteriormente se
pueden evidentemente clonar con diferentes vectores, con el fin de
ser utilizados para afinar el análisis (en particular para
secuenciarlos).
Con vistas a ensayar la especificidad de los
productos de PCR, para las especies seleccionadas para el presente
estudio, se han realizado unos depósitos de dichos ADN sobre una
membrana de nylon siguiendo un protocolo de fijación de la sonda
(NaOH). Las concentraciones de ADN, para dichos depósitos, se
indican en las figuras correspondientes. Dichas membranas se han
hibridado siguiendo el protocolo de PCR. DIG Probe Synthesis Kit
(Roche) Cat. Nº 1636090. La concentración de la sonda utilizada,
sintetizada siguiendo el mismo protocolo, se indica también en las
figuras así como la temperatura de hidridación realizada "over
night" (18 h). La temperatura de pre-hibridación
es de 65ºC para cada experimento y ésta dura 45 minutos.
La detección de dicho tipo de hibridación con
dicho tipo de marcaje (DIG) se denomina colorimétrica (marcaje
"frío" diferente de radioactivo).
Las figuras 4 a 6 muestran una especificidad de
detección en función de los organismos, aunque puedan existir
algunas reacciones de hibridación cruzada. Dichas reacciones se
pueden reducir seleccionando unas sondas que sean más cortas y
situadas entre las secuencias intergénicas hipervariables, tales
como las definidas por la SEC ID nº 63 a SEC ID nº 138 (rpoN).
De este modo, un chip de ADN con diferentes
sondas situadas en la zona intergénica permitirá reconocer sin
dudar la presencia o la ausencia de un microorganismo, incluso en el
caso en el que exista hibridación cruzada. En efecto, la presencia
de un microorganismo se deducirá de la hibridación para cada una de
las sondas.
Por lo tanto, puede resultar ventajoso definir
unos chips de ADN que presentan unas sondas específicas
correspondientes a la región intergénica de cada microorganismo,
pero asimismo colocar varias sondas diferentes para cada
microorganismo.
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CNRS UPRES-A 6020, Facultad de Medicina, 27 enero
2000.
<110> UNIVERSIDAD DE AUVERGNE/DIGESTAR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN DE
MICROORGANISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> D18287
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 00/09600
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-07-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 00/12524
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-10-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 189
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: CEBADOR QUE PERMITE LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN
INTERGÉNICA DEL OPERÓN rpoBC DE MICROORGANISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipggngayaary tngcnggnag ncaygg
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artificial: CEBADOR QUE PERMITE LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN
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artificial: CEBADOR QUE PERMITE LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: CEBADOR QUE PERMITE LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN
INTERGÉNICA DEL OPERÓN rpoBC DE MICROORGANISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggnaarcgng tngayttytc ngcnmg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: CEBADOR QUE PERMITE LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN
INTERGÉNICA DEL OPERÓN rpoBC DE MICROORGANISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggnaarcgng tngayttyag ngcnmg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: CEBADOR QUE PERMITE LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN
INTERGÉNICA DEL OPERÓN rpoBC DE MICROORGANISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggnaaragng tngayttytc ngcnmg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: CEBADOR QUE PERMITE LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN
INTERGÉNICA DEL OPERÓN rpoBC DE MICROORGANISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggnaaragng tngayttyag ngcnmg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador correspondiente a un grupo proteico de HSP10 de
Escherichia Coli.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaygtka arrtnggyga yatygt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador correspondiente a un grupo proteico de HSP10 de
Escherichia Coli.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipannacngtng crgtrgtggt rccgtc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador consenso (UNI-ADEG 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggngayggna cnacnacngc nacnnt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador consenso (UNI-ADEG 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggngayggna cnacnacntg ntcnnt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de las
enterobacterias (ENT-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaanmttcgtc cnytrcanga ycgngt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los clostridios
(CLO-BNEW2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatnarrccay twggwgaymg ngtwgt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de las
bifidobacterias (BIF-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaarccrctcg aggacmrnrt nstsgt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los Lactococos
(UNI-A3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggngayggna cnaanacngc nacnnt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los
Bifidobacterium y Mycobacterium (BIF-BNEW2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcaagccnc tmgrrgacmr srtnst
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los Helicobacter
(HEL-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntncanccnt tnggnganag ngtntt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los
Campylobacter (CAM-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntncanccnt tnggnaancg ngtnct
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los bacteroides
(BACT-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntnaanccnt tngcngancg ngtnct
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de las Chlamidia
(CHLA-BNEW).
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntnaanccnt tnggnganag natntt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los Mycoplasma
(MYCP-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntnaaaccnn tnggnaancg ngtnat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los
Staphylococcus (STA-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntnaaaccnn tnggnaancg ngtnat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los Lactococcus
y Streptococcus (LACC-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgaaaccnt tagngraycg ygtrst
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los
Lactobacillus y Bacillus (LACB-BNEW).
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttamarccaw tmggngatcg ngtnrt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de los Clostridium
(CLO-BNEW3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatnanaccan tnggngacag ngtngt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de las
Enterobacteriaceae, Pasteurella, Haemophilus
(ENT-BNEW2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntncgnccnt tncangancg ngtnat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de las Neisseria,
Legionella (LEG-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntncgnccnt tncangancg ngtngt
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia consenso para la detección de las Aeromonas y
Bordetella (AER-BNEW).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipntncgnccnc tncangancg ngtnat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n significa a, g, c o t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggnggncann snttyggnga ratgga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n significa a, g, c o t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaygcngayt tygayggnga ysarat
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Cebador
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<220>
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<223> n significa a, g, c o t/u
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador
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<220>
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador
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<220>
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<223> n significa a, g, c o t/u
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus reuteri
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<212> ADN
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<213> Bacillus subtilis
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus gaseri
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<400> 65
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus paracasei
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<213> Lactococcus lactis
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<212> ADN
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<213> STREPTOCOCCUS PYOGENES
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<212> ADN
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<213> Lactobacillus helveticus
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<400> 69
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<210> 70
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<211> 318
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<212> ADN
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<213> BACILLUS SUBTILIS
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<400> 70
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<210> 71
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<211> 304
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> BACILLUS HALODURANS
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<400> 71
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<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> STAPHYLOCOCCUS AUREUS
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<400> 72
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 352
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<212> ADN
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<213> Clostridium spiroforme
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
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<211> 358
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium leptum
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<400> 74
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 376
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium nexile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Ruminococcus
hydrogenotrophicus
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<400> 76
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 77
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<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> CHLAMYDIA MURIDARUM
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<400> 77
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 78
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<211> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> CHLAMYDIA TRACHOMATIS
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<400> 78
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 79
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<211> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> CHLAMYDOPHILIA PNEUMONIAE
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<210> 80
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<211> 181
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<212> ADN
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<213> CHLAMYDOPHILIA PNEUMONIAE
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<210> 81
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<211> 181
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<212> ADN
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<213> CHLAMYDOPHILIA PNEUMONIAE
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<400> 81
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<210> 82
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<211> 225
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<212> ADN
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<213> Klebsiella pneumoniae
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<400> 82
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<210> 83
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<211> 225
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<212> ADN
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<213> ESCHERICHIA COLI
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<400> 83
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<211> 225
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ESCHERICHIA COLI
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
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<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ESCHERICHIA COLI
\newpage
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<400> 85
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 86
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<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
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<400> 86
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SALMONELLA TYPHIMURIUM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter cloacae
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Citrobacter freundii
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 89
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Klebsiella oxytoca
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<400> 90
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 91
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<211> 267
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Serratia liquefaciens
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<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 267
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Serratia marescens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Morganella Morganii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteus mirabilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 95
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<211> 253
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<212> ADN
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<213> VIBRIO CHOLERAE
\newpage
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<400> 95
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<210> 96
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<211> 214
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<212> ADN
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<213> Pseudomonas aeroginosa
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<400> 96
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<210> 97
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<211> 214
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<212> ADN
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<213> PSEUDOMONAS AEROGINOSA
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<400> 97
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<210> 98
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<211> 212
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<212> ADN
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<213> PSEUDOMONAS PUTIDA
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<400> 98
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<210> 99
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<211> 228
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<212> ADN
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<213> SCHEWANELLA VIOLACEA
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<400> 99
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<210> 100
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<211> 393
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<212> ADN
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<213> HAEMOPHILUS INFLUENZAE
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<400> 100
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<210> 101
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<211> 262
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<212> ADN
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<213> PASTEURELLA MULTOCIDA
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<400> 101
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<210> 102
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<211> 306
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<212> ADN
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<213> NEISSERIA MENINGITIDIS
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<400> 102
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<210> 103
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<211> 311
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<212> ADN
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<213> NEISSERIA MENINGITIDIS
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<400> 103
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<210> 104
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<211> 226
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<212> ADN
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<213> BUCHNERA SP
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<400> 104
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<210> 105
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<211> 247
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<212> ADN
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<213> XYLELLA FASTIDIOSA
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<400> 105
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<210> 106
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<211> 265
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<212> ADN
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<213> CAULOBACTER CRESCENTUS
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<400> 106
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<210> 107
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<211> 325
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<212> ADN
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<213> MEZORHIZOBIUM LOTI
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<400> 107
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<210> 108
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<211> 311
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<212> ADN
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<213> RICKETTSIA PROWASEKII
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<400> 108
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<210> 109
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<211> 188
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<212> ADN
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<213> BORRELIA BURGDORFERI
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<400> 109
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<210> 110
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<211> 197
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<212> ADN
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<213> TREPONEMA PALLIDUM
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<400> 110
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<210> 111
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<211> 159
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<212> ADN
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<213> CAMPYLOBACTER JEJUNI
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<210> 112
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<211> 161
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<212> ADN
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<213> HELICOBACTER PYLORI
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<210> 113
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<211> 161
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<212> ADN
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<213> HELICOBACTER PILORI
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<400> 113
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<210> 114
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<211> 175
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<212> ADN
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<213> AQUIFEX AEOLICUS
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<210> 115
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<211> 175
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<212> ADN
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<213> AQUIFEX PYROPHILUS
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<400> 115
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<210> 116
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<211> 293
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<212> ADN
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<213> DEINOCOCCUS RADIODURANS
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<400> 116
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<210> 117
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<211> 177
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<212> ADN
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<213> THERMUS AQUATICUS
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<210> 118
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<211> 174
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<212> ADN
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<213> THERMOTOGA MARITIMA
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<400> 118
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<210> 119
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<211> 324
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<212> ADN
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<213> STREPTOMICES COELICOLOR
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<400> 119
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<210> 120
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<211> 281
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<212> ADN
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<213> MYCOBACTERIUM LEPRAE
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<400> 120
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<210> 121
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<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS
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<400> 121
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<210> 122
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<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS
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<400> 122
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<210> 123
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<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> PORPHYROMONAS
CANGINGIVALIS
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<400> 123
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<210> 124
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<211> 257
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<212> ADN
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<213> MYCOPLASMA GENITALIUM
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<400> 124
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<210> 125
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<211> 245
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<212> ADN
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<213> MYCOPLASMA PNEUMONIAE
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<400> 125
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<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 305
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<212> ADN
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<213> UREAPLASMA UREALYTICUM
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<400> 126
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<210> 127
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<211> 244
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<212> ADN
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<213> MYCOPLASMA PULMONIS
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<400> 127
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<210> 128
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<211> 202
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<212> ADN
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<213> PLASMODIUM FALCIPARUM
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<400> 128
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<210> 129
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<211> 136
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<212> ADN
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<213> ARCHAEOGLOBUS FULGIDUS
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<400> 129
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<210> 130
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<211> 169
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<212> ADN
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<213> METHANOTHERMOBACTER
THERMOAUTOTROPHICUS
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<400> 130
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<210> 131
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<211> 136
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<212> ADN
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<213> HALOBACTERIUM SP
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<210> 132
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<211> 127
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<212> ADN
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<213> THERMOPLASMA VOLCANIUM
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<400> 132
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<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 127
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<212> ADN
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<213> THERMOPLASMA ACIDOPHILUM
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<400> 133
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<210> 134
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> SULFOLOBUS ACIDOCALDARIUS
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<400> 134
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<210> 135
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<211> 145
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<212> ADN
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<213> SULFOLOBUS SULFATARICUS
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<400> 135
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<210> 136
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<211> 134
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<212> ADN
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<213> PYROCOCCUS ABYSSI
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<400> 136
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<210> 137
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<211> 134
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<212> ADN
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<213> PYROCOCCUS HORIKOSHII
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<400> 137
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<210> 138
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<211> 224
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<212> ADN
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<213> AEROPYRUM PERNIX
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<400> 138
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<210> 139
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n significa a, g, c o t/u
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
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\hfill26
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<210> 140
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<211> 186
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<212> ADN
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<213> PASTEURELLA MULTOCIDA
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<400> 140
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<211> 113
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<212> ADN
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<213> HAEMOPHILUS INFLUENZAE
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<400> 141
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<210> 142
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<211> 113
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<222> ADN
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<213> HAEMOPHILUS DUCREYI
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<400> 142
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<210> 143
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<211> 137
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<212> ADN
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<213> BUCHNERA APHIDICOLA
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<400> 143
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<211> 139
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<212> ADN
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<213> MYZUS PERSICA
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<400> 144
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<211> 144
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<212> ADN
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<213> VIBRIO CHOLERAE
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<400> 145
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<212> ADN
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<213> ESCHERICHIA COLI
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<211> 137
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<212> ADN
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<213> ESCHERICHIA COLI
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<211> 137
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<212> ADN
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<213> ESCHERICHIA COLI
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<211> 142
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<212> ADN
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<213> PSEUDOMONAS PUTIDA
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<212> ADN
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<213> PSEUDOMONAS AERUGINOSA
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<212> ADN
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<213> NEISSERIA MENINGITIDIS
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<210> 152
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<211> 186
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<212> ADN
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<213> NEISSERIA MENINGITIDIS
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<400> 152
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<210> 153
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<211> 185
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<212> ADN
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<213> Neisseria gonorrhoeae
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<240> 153
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<210> 154
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<211> 201
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<212> ADN
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<213> XYLELLA FASTIDIOSA
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<400> 154
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<211> 224
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<212> ADN
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<213> STREPTOMYCES COELICOLOR
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<400> 155
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<210> 156
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<211> 185
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<212> ADN
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<213> MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS
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<211> 185
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<212> ADN
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<213> MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS
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<400> 157
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<211> 169
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<212> ADN
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<213> MYCOBACTERIUM LEPRAE
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<400> 158
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<210> 159
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<211> 103
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<212> ADN
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<213> THERMUS AQUATICUS
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<400> 159
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<210> 160
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<211> 100
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<212> ADN
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<213> THERMUS THERMOPHILUS
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<400> 160
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<210> 161
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<212> 100
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<213> ADN
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<214> THERMUS THERMOPHILUS
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<400> 161
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<211> 162
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<212> ADN
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<213> DEINOCOCCUS RADIODURANS
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<400> 162
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<210> 163
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<211> 121
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<212> ADN
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<213> PORPHYROMONAS GINGIVALIS
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<400> 163
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<211> 134
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<212> ADN
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<213> BACILLUS SUBTILIS
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<400> 164
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<210> 165
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<211> 180
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<212> ADN
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<213> BACILLUS HALODURANS
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<400> 165
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<210> 166
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<211> 121
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<212> ADN
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<213> LACTOBACILLUS ZEAE
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<400> 166
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<210> 167
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<211> 142
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<212> ADN
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<213> Clostridium perfringens
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<400> 167
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<210> 168
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<211> 120
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<212> ADN
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<213> CLOSTRIDIUM DIFFICILE
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<400> 168
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<210> 169
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<211> 129
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<212> ADN
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<213> CLOSTRIDIUM
ACETOBUTYLICUM
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<400> 169
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<210> 170
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> LACTOBACILLUS HELVETICUS
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<400> 170
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<210> 171
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<211> 118
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<212> ADN
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<213> LACTOBACILLUS JOHNSONII
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<210> 172
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<211> 143
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<212> ADN
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<213> STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIS
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<400> 172
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<210> 173
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<211> 163
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<212> ADN
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<213> STAPHYLOCOCCUS AUREUS
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<400> 173
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<210> 174
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<211> 106
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<212> ADN
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<213> STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
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<210> 175
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<211> 175
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<212> ADN
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<213> LACTOCOCCUS LACTIS
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<400> 175
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<210> 176
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<211> 111
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<212> ADN
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<213> RICKETTSIA PROWASEKII
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<400> 176
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<210> 177
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<211> 129
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<212> ADN
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<213> CHLAMYDIA MURIDARUM
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<210> 178
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<211> 128
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<212> ADN
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<213> CHLAMYDIA TRACHOMATIS
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<400> 178
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<210> 179
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<211> 132
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<212> ADN
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<213> CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE
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<210> 180
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<211> 132
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<212> ADN
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<213> CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE
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<400> 180
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<210> 181
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<211> 132
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<212> ADN
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<213> CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE
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<400> 181
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<210> 182
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<211> 141
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<212> ADN
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<213> CHLAMYDOPHILA CAVIAE
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<400> 182
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<210> 183
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<211> 160
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<212> ADN
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<213> HELICOBACTER PYLORI
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<400> 183
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<210> 184
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<211> 160
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<212> ADN
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<213> HELICOBACTER PYLORI
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<400> 184
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> CAMPYLOBACTER JEJUNI
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<400> 185
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<210> 186
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<211> 136
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<212> ADN
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<213> CLOSTRIDIUM THERMOCELLUM
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<210> 187
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<211> 127
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<212> ADN
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<213> MYCOPLASMA GENITALIUM
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<400> 187
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<210> 188
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<211> 138
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<212> ADN
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<213> MYCOPLASMA PNEUMONIAE
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<400> 188
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<210> 189
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<211> 120
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<212> ADN
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<213> AQUIFEX AEOLICUS
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<400> 189
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Claims (10)
1. Procedimiento de detección de los
elementos constitutivos de una flora bacteriana de la que por lo
menos una parte de los elementos presenta un operón en común,
caracterizado porque:
- a)
- se prepara el ADN genómico de dicha flora o los ARNm,
- b)
- se amplifica por lo menos una parte de las secuencias intergénicas no codificantes situadas en el operón conservado en por lo menos una parte de los elementos de la flora, y
- c)
- se identifican las diferentes secuencias intergénicas amplificadas con el fin de determinar los elementos de dicha flora,
siendo dicho operón un operón rpoBC.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la identificación de las secuencias
amplificadas se realiza en un chip de ADN que presenta unas
secuencias complementarias de las secuencias susceptibles de ser
amplificadas a partir de los elementos conocidos de dicha flora y la
puesta en evidencia de eventuales hibridaciones que permiten
identificar los elementos presentes en la flora.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque los cebadores
destinados a amplificar la secuencia intergénica se sitúan en las
secuencias codificantes para los genes flanqueantes.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las secuencias
intergénicas por lo menos parcialmente amplificadas son la zona
intergénica transcrita entre los genes rpoBC y rpoC (u
homólogos).
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque por lo menos un
cebador se selecciona de entre las secuencias SEC ID ID Nº 1 a SEC
ID nº 31.
6. Chip de ADN, caracterizado porque
presenta, en su superficie, unas secuencias complementarias a las
secuencias intergénicas no codificantes situadas en un operón
conservado entre diferentes especies, siendo dicho operón un operón
rpoBC.
7. Chip de ADN según la reivindicación 6,
caracterizado porque las secuencias de varios organismos,
complementarias a las secuencias intergénicas no codificantes
situadas en dicho operón conservado están presentes en la superficie
de dicho chip.
8. Estuche de diagnóstico para la utilización
de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque contiene unos cebadores degenerados que
permiten la amplificación de una o varias regiones intergénicas de
un operón conservado de entre las especies, y de forma opcional, un
chip de ADN según una de las reivindicaciones 6 ó 7.
9. Cebador para la utilización de un
procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque se selecciona de entre las secuencias
SEC ID nº 1 a SEC ID nº 31 y SEC ID nº 53 a SEC ID nº 61.
10. Chip de ADN según la reivindicación 6 ó 7,
que presenta en su superficie una pluralidad de oligonucleótidos
que comprenden unos fragmentos de tamaño superior a 30 bases
seleccionados de entre los fragmentos de las secuencias SEC ID nº 63
a SEC ID nº 138.
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