ES2259338T3 - Cepas huesped bacterianas. - Google Patents

Abstract

Una cepa de E. coli carente de degP y prc cromosómicos que codifican las proteasas DegP y Prc, respectivamente, y que alberga un mutante del gen spr, el producto de cuyo gen suprime los fenotipos de crecimiento mostrados por las cepas que albergan los mutantes prc.

Description

Cepas huésped bacterianas.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La invención se refiere al uso de cepas huésped bacterianas proteolíticamente deficientes. Más concretamente, la invención se refiere a cepas huésped bacterianas tales que eliminan la degradación de polipéptidos heterólogos y mejoran el rendimiento de tales polipéptidos.

2. Descripción de la técnica relacionada

Las cepas de E. coli carentes de proteasas o los genes que controlan la regulación de las proteasas son conocidos. Ver, por ejemplo, Beckwith y Strauch, WO 88/05821 publicada el 11 de Agosto de 1998; Chaudhury y Smith, J. Bacteriol., 160:788-791 (1984); Elish y col., J. Gen. Microbiol., 134:1355-1364 (1988); Baneyx y Georgiou, "Expression of proteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli", En Stability of Protein Pharmaceuticals, Vol. 3: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation, Ahern y Manning, eds. (Plenum Press, Nueva York, 1992), págs. 69-108.

Algunas de estas cepas han sido utilizadas en intentos para producir eficazmente proteínas proteolíticamente sensibles, concretamente aquellas de potencial importancia médica o comercial. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.508.192 (de Georgiou y col.) se describe la construcción de muchos huéspedes bacterianos carentes de proteasas y/o carentes de proteínas de choque térmico. Entre tales huéspedes se incluyen bacterias carentes de proteasas sencillas, dobles, triples o cuádruples y bacterias con una sola proteasa que también portan una mutación en el gen rpoH. Entre los ejemplos de las cepas carentes de proteasas descritas se incluyen aquellas que omiten degP, ompT, ptr3, y/o prc (tsp), y una cepa degP rpoH referida por producir grandes títulos de proteínas recombinantes en E. coli. Park y col., Biotechnol. Prog., 15:164-167 (1999) también informaron que una cepa (HM114) carente de dos proteasas de la envuelta celular (degP, prc) crecían ligeramente más rápido y producían más proteína de fusión que las otras cepas carentes de más proteasas. Ellos reivindicaron que esta cepa crecía hasta un peso seco celular de 47,86 g/litro en 29 horas utilizando el cultivo por lotes, a pH estacionario. La proteína producida era la proteína de fusión A-\beta-lactamasa, que producía una actividad \beta-lactamasa un 30% superior a la obtenida a partir de su cepa de origen KS272.

La proteína Prc fue aislada primero por Hara y col., J. Bacteriol., 173:4799-4813 (1991) como la proteasa periplásmica que escinde el extremo carboxilo de la proteína 3 de unión a la penicilina periplásmica (PBP3). Con posterioridad, también fue identificada como una proteasa que degrada selectivamente las proteínas con un extremo C no polar y fue re-denominada Tsp (Silber y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)). Se demostró que el gen prc codifica una proteína de 75 kDa, que es requerida para la protección de las células del estrés térmico y osmótico combinado (Hara y col., supra). Se ha confirmado que las secuencias C-terminales determinan la preferencia por el sustrato (Keiler y col., Protein Sci., 4:1507-1515(1995)). La cantidad de escisión es sensible a la identidad de los restos o grupos funcionales del extremo C de la proteína sustrato. La presencia de un grupo \partial-carboxilo libre es importante en la determinación de si los péptidos íntimamente relacionados con secuencias C-terminales no polares son escindidos eficazmente por Prc.

Los homólogos de Prc han sido identificados en un grupo divergente de procariotas, incluyendo diversas cianobacterias (Brand y col., Plant Mol. Bio., 20:481-491 (1992); Shestakov y col., J. Biol. Chem., 269:19354-19359 (1994)), Neisseria gonorrhoeae (Black y col., J. Bacteriol., 177:1952-1958 (1995)), Haemophilus influenzae (Fleischmann y col., Science, 269: 496-512 (1995)), y Bartonella bacilliformis (Núm. de acceso GenBank L37094). Un dominio de la familia de proteínas de Prc es similar a un dominio de las proteínas de unión a retinol, indicando un dominio de plegamiento común que puede formar un bolsillo de unión en estas proteínas para los sustratos hidrófobos (Silber y col., supra, Shestakov y col., supra).

Hara y col., supra, descubrieron que los revertientes termorresistentes de los mutantes \Deltaprc contienen mutaciones supresoras extragénicas (spr). Adicionalmente identificaron que el producto génico de spr de tipo salvaje era una lipoproteína en la fracción de la envuelta. Sospecharon que el gen spr de tipo salvaje podía ser una enzima hidrolizante de peptidoglicano (Hara y col., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)). Cuando el spr no es funcional en un fondo prc más, se identificó que un supresor para la mutación spr era PBP7, otra proteína de unión a penicilina (Hara y col., 1996, supra). La clonación de spr y la preparación de un mutante \Deltaprc en el cual Spr no era degradada por la proteasa también son descritas por Hara y col., Abstract for Tabla Ronde Roussel Uclat núm. 86, Versailles, Mayo de 1997, donde los autores concluían que prc y spr son supresores mutuos.

Estos supresores de prc de múltiples copias también han sido aislados utilizando el fenotipo letal condicional de una cepa nula prc (tsp) de E. coli (Bass y col., J. Bacteriol., 178: 1154-1161 (1996)). Ninguno de ellos se relacionan con el gen spr. Un grupo de estos supresores consiste en dos supuestos genes de proteasa en tándem que se cartografían a los 72,5 min sobre el cromosoma. Estos dos genes son homólogos de htrA, que codifican proteínas que son idénticas en un 58 y un 35%, respectivamente, a la serina proteasa HtrA (DegP). Otro tipo de supresor identificado es el gen dksA (supresor dnak), que también es un supresor de múltiples copias de los defectos en los genes del choque térmico dank, dnaj y grpE. El gen dksA también fue aislado independientemente como un supresor de múltiple copias de una mutación mukB, que se requiere para el reparto cromosómico. El tercer tipo es un gen de una lipoproteína A truncada (rlpA).

El gen degP parece controlar la síntesis de una proteasa de la envuelta celular DegP (HtrA). Un mutante carente de degP fue construido primero y recombinado en un cromosoma de E. coli por Beckwith y Strauch, supra. HtrA tiene una masa molecular elevada de aproximadamente 500 kDa, que es una proteína de choque térmico cuya actividad proteolítica es esencial para la supervivencia de E. coli a temperaturas elevadas, por ejemplo más de 42ºC (Skoroko-Glonek y col., Gene, 163:47-52 (1995)). Numerosas proteínas de la envuelta celular normalmente inestables pueden ser estabilizadas por la mutación degP (Strauch y Beckwith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:1676-1580 (1988)). Recientemente, se ha informado que la proteína HtrA se comporta como un dodecámero que consta de dos pilas de anillos hexaméricos mediante análisis al microscopio electrónico y entrecruzamiento químico (Kim y col., J. Mol. Biol. 294:1363-1374 (1999)). El desplegamiento de los sustratos de las proteínas, por ejemplo mediante la exposición a una temperatura elevada o reducción de los enlaces disulfuro, es esencial para su acceso a la cámara interna de la HtrA en forma de doble anillo, en la que se puede producir la escisión de los enlaces peptídicos (Kim y col., supra).

Muchos polipéptidos heterólogos han sido producidos en diversas cepas carentes de proteasas. No obstante, muchas de las cepas producían un título de producto relativamente bajo y/o escaso crecimiento. Existe la necesidad de proporcionar una cepa bacteriana carente de proteasas que no de como resultado el recorte del producto y proporcione un título de producto relativamente elevado.

Compendio de la invención

Por consiguiente, la presente invención es como se reivindica. En un aspecto la presente invención proporciona cepas de E. coli carentes de degP y prc cromosómicos que codifican la proteasa DegP y Prc, respectivamente, y albergan o comprenden un gen spr mutante cuyo producto suprime los fenotipos de crecimiento mostrados por las cepas que albergan mutantes prc. Preferiblemente la cepa no carece de ptr3 cromosómico que codifica la Proteasa III y/o de ompT cromosómico que codifica la proteasa OmpT. Preferiblemente, la cepa de E. coli está diseñada introduciendo el gen spr mutante en una cepa degP\Delta prc\Delta para la supervivencia en la fase estacionaria de un procedimiento de fermentación de E. coli de elevada densidad celular.

En otra realización, la cepa comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo con respecto a la cepa, preferiblemente un polipéptido proteolíticamente sensible, y más preferiblemente un polipéptido eucariótico.

En una realización adicional, la invención proporciona un método para producir un polipéptido heterólogo, es decir, uno que sea heterólogo con respecto a la cepa. Este método comprende cultivar primero una cepa de E. coli como se define en las reivindicaciones. Esta cepa también comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo. El cultivo es tal que se expresa el ácido nucleico. En una segunda etapa de este método, el polipéptido es recuperado de la cepa, ya sea en forma de citoplasma, periplasma, o medio de cultivo, preferiblemente el periplasma o el medio de cultivo, y muy preferiblemente a partir del caldo completo de fermentación. Preferiblemente, el polipéptido es el ligando Apo2 o un anticuerpo, incluyendo un fragmento de anticuerpo.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1E muestran las secuencias de nucleótidos completas y de aminoácidos codificadas (SEC ID NUMS: 1 y 2, respectivamente) de la casete de expresión para la preparación de pY0317, un plásmido de producción para Fab anti-VEGF. Los restos en negrita indican restos CDR del anticuerpo A.4.6.1 murino original. Los restos en cursiva y subrayados indican los restos del marco murino que eran requeridos para la unión al antígeno.

Las Figuras 2A y 2B muestran un diagrama plasmídico para pY0317 (Fig. 2A) así como la construcción del plásmido pY0317tet20 (Figs. 2A y 2B).

La Figura 3 muestra el diagrama plasmídico para pAPApo2-P2RU.

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del ligando Apo-2 humano (SEC ID NUM: 3) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID NUM: 4). La "N" en la posición del nucleótido 447 (en la SEC ID NUM: 3) se utiliza para indicar que la base nucleotídica puede ser una "T" o una "G".

La Figura 5 representa un diagrama de la derivación de cepas de E. coli 59A7, 49A5, y 43H1.

La Figura 6 representa el gel de 2-D resultado del sedimento celular de la fermentación derivado de la cepa 49A5 (cepa prc más), que expresa la fusión rhuFab'2 anti-CD18-LZ como polipéptido heterólogo. Todas las manchas relacionadas con LC están rodeadas con un círculo.

La Figura 7 representa el gel de 2-D resultado del sedimento celular de la fermentación de la cepa 43H1 (cepa prc menos), que expresa la fusión rhuFab'2 anti-CD18-LZ como polipéptido heterólogo. En este gel los productos de escisión de LC desaparecen.

La Figura 8 muestra los cinco picos resueltos mediante un análisis utilizando columnas AME5®/Fase Reversa y de ese modo proporciona una comparación del reparto de los fragmentos de anticuerpo rhuFab'2 LZ (xCD18) resueltos de este modo. El eje de las y es el área del pico de los picos específicos 1 a 5. El eje de las X muestra las tres cepas de producción de rhuFab'2 LZ (xCD18), 43H1 (prc-), 49A5 (prc+), y 58H2 (43H1 prc-reparada). El color gris con la barra de borde ancho es LC-115; la barra negra es LC, la barra blanca es el dímero de LC, el gris con la barra de borde fino es la molécula de tipo Fab, y la barra con el patrón de tipo ladrillo es Fab'2-LZ. Se puede observar que el pico 1 (LC-115) desaparecía de la cepa de deleción de prc.

La Figura 9 muestra los perfiles de crecimiento de la fermentación de elevada densidad celular normalizada en cepas prc menos sin un gen spr mutante (58D3 transformada con pS1130) (cuadrados) y prc menos con un gen spr mutante (59A7 transformada con pS1130) (rombos), expresadas en forma de DO550 como una función de las horas de fermentación.

La Figura 10 representa la secuencia de LC kappa anti-CD18 humanizada (SEC ID NUM: 5) con valores de pI calculados de los productos de la degradación de LC postulados. Las escisiones destacadas con guiones fueron confirmadas mediante espectrometría de masas. Ver la Tabla 3 más abajo.

La Figura 11 representa un gel con siete calles en las que se utilizan diferentes huéspedes y tres tipos de proteínas. Este gel muestra que el recorte de LC de 20 kD (LC 182) no está presente en las células 43H1 (prc-) que expresan el Fab anti-VEGF y moléculas de fusión Fab'2-LZ anti-factor tisular. La calle 1 es el F(ab')2 LZ 6xHis anti-factor tisular, cepa huésped 33B6, la calle 2 es F(ab')2 LZ 6xHis anti-factor tisular, cepa huésped 43H1, la calle 3 es F(ab')2 LZ 6xHis anti-CD18, cepa huésped 49A5, la calle 4 es F(ab')2 LZ 6xHis anti-CD18, cepa huésped 41H1, la calle 5 es pBR322, cepa huésped 495A, la calle 6 es Fab anti-VEGF, cepa huésped 43H1, y la calle 7 es Fab anti-VEGF, cepa huésped 43E7. Las denominaciones HC y H representan la cadena pesada, y LC y L representan la cadena ligera.

La Figura 12 representa el gel de 2 D resultado del sedimento celular del matraz sacudido derivado de la cepa 59A7 (cepa prc menos) que expresa el Fab anti-VEGF (pY0317tet20) como polipéptido heterólogo. En este gel los productos de escisión de LC y dos fragmentos de escisión de HC encontrados en las células prc más desaparecen. Asimismo se mostraban dos recortes de HC separados detectados solamente en 59A7, que son productos escindidos de OmpT o de Ptr3.

La Figura 13 representa el gel de 2 D resultado del sedimento celular del matraz sacudido de la cepa 60C1 (cepa prc más) que expresa el Fab anti-VEGF (pY0317tet20) como polipéptido heterólogo. En este gel, se detectaron múltiples fragmentos de escisión de LC y dos fragmentos de escisión de HC.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Según se utiliza aquí, "polipéptido" hace referencia generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Los polipéptidos "heterólogos" son aquellos polipéptidos foráneos para la célula huésped que está siendo utilizada, tal como una proteína humana producida por E. coli. Si bien el polipéptido puede ser procariótico o eucariótico, preferiblemente es eucariótico, más preferiblemente es de mamífero.

Entre los ejemplos de los polipéptidos de mamífero se incluyen moléculas tales como, v.g., renina, una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana; la hormona de crecimiento bovina; el factor liberador de la hormona de crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona estimuladora de tiroides; las glicoproteínas; la 1-antitripsina; la cadena A de la insulina; la cadena B de la insulina; la proinsulina; la trombopoyetina; la hormona estimuladora del folículo; la calcitonina; la hormona luteinizante; el glucagón; los factores de coagulación tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular y el factor de von Wilebrands; los factores anti-coagulantes tales como la Proteína C; el factor natrurético atrial, el tensioactivo pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como la uroquinasa o la orina humana o un activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA); la bombesina; la trombina; el factor de crecimiento hematopoyético; el factor de necrosis tumoral alfa y beta; los anticuerpos para los dominios ErbB2 tales como 2C4 (WO 01/00245; hibridoma ATCC HB-12697), que se une a una región en el dominio extracelular de ErbB2 (v.g., uno o más cualesquiera de los restos de la región desde aproximadamente el resto 22 a aproximadamente el resto 584 de ErbB2, inclusive), la encefalinasa; una seralbúmina tal como la seralbúmina humana; una sustancia inhibidora mulleriana; la cadena A de la relaxina; la cadena B de la relaxina; la pro-relaxina; el péptido asociado con la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como la beta-lactamasa; la ADNasa; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); los receptores de hormonas o factores de crecimiento; la integrina; las proteínas A o D; los factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), la neurotrofina-3, 4, 5, o 6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF; las cardiotrofinas (factor de hipertrofia cardiaca) tales como la cardiotropina-1 (CT-1); el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); el factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; el factor de crecimiento epidérmico (EGF); el factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, o THF-5; el factor de crecimiento-I y II de tipo insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)IGF-I (IGF-I cerebral), las proteínas de unión al factor de crecimiento de tipo insulina; las proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8, y CD-19; la eritropoyetina; los factores osteoinductivos; las inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como el interferón alfa, beta, y gamma; la seralbúmina, tal como la seralbúmina humana (HSA) o la seralbúmina bovina (BSA); los factores estimuladores de colonias (CSF), v.g., M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; las interleuquinas (IL), v.g., IL-1 a IL-10; el anticuerpo anti-HER-2; el ligando Apo2; la superóxido dismutasa; los receptores de las células T; las proteínas de la membrana superficiales; el factor acelerador del deterioro; los antígenos virales tales como, por ejemplo, una porción de la envuelta del virus del SIDA; las proteínas transportadoras; los receptores de alojamiento; las adresinas; las proteínas reguladoras; los anticuerpos; y los fragmentos de cualquiera de los péptidos enumerados antes.

Entre los polipéptidos preferidos de interés se incluyen polipéptidos tales como HSA, BSA, anti-IgE, anti-CD20, anti-IgG, t-PA, gp120, anti-CD11a, anti-CD18, 2C4, anti-VEGF, VEGF, TGF-beta, activina, inhibina; anti-HER-2, ADNasa, IGF-I, IGF-II, IGF-I cerebral, hormona del crecimiento, cadenas de relaxina, factor de liberación de hormona del crecimiento, cadenas de insulina o pro-insulina, NGF, NT-3, BDNF, ligando Apo2, y uroquinasa. Los polipéptidos de mamífero particularmente preferidos son los anticuerpos, que incluyen anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos, y ligando Apo2. Más preferiblemente, estos anticuerpos son anticuerpos humanos o humanizados. Entre estos se incluyen, v.g., anti-IgE, anti-IgG, anti-Her-2, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD20, y anti-VEGF, 2C4, BSA, o HSA. Aún más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD18, anti-VEGF, anti-factor tisular, 2C4, anti-Her-2, anti-CD20, anti-CD40, o anti-CD11a. Entre los fragmentos del anticuerpo abarcados en la definición de polipéptido se incluyen, por ejemplo, Fab, Fab', Fab'2, o Fab'2-cremallera de leucina (LZ), y muy preferiblemente son Fab'2-LZ anti-CD18, Fab'2 LZ-6xhis anti-factor tisular, Fab anti-VEGF, Fab'2 LZ marcado con his anti-CD8, y Fab'2LZ marcado con lys anti-CD18.

Según se utiliza aquí, el calificativo "proteolíticamente sensible" para los polipéptidos hace referencia a polipéptidos que son propensos a ser escindidos, susceptibles de escisión, o escindidos por una o más proteasas de E. coli, ya sea en estado natural o durante la secreción.

Fermentación o cultivo de "densidad celular elevada" hace referencia a un procedimiento en el cual típicamente primero se añaden algunos nutrientes por lotes para permitir el crecimiento celular y tomar ventaja de la relación entre el consumo de O_{2} y el consumo de glucosa para utilizar el oxígeno disuelto, que es fácil de medir, para controlar la adición de glucosa. Para alcanzar densidades celulares superiores, se puede añadir continuamente amoníaco, y se pueden añadir nutrientes secundarios adicionales (por ejemplo, P, K, S, y Mg) en ciertas fases de la fermentación para apoyar el crecimiento celular, como se detalla adicionalmente en los Ejemplos más abajo.

Un "gen spr mutante, el producto de cuyo gen suprime los fenotipos de crecimiento mostrados por las cepas que albergan los mutantes prc", hace referencia a un supresor de prc de E. coli (spr) (que codifica Prc^{sup}) con la secuencia referida por Hara y col., 1996, supra, o uno que está mutado, siempre que el producto génico funciones como supresor de los fenotipos de crecimientos de las cepas con mutantes prc. Preferiblemente, la mutación consta de una mutación puntual. La más preferida es la mutación puntual W148R en la cual un codón TGG es cambiado por CGG, lo que da como resultado un cambio de triptófano a arginina en el aminoácido 148.

El término "anticuerpo" aquí se utiliza en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (v.g. anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, con tal que muestren la actividad biológica deseada.

El término "anticuerpo monoclonal" según se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que pueden ser sintetizados sin estar contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que es obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se debe considerar que se requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar según la presente invención pueden ser elaborados mediante el método del hibridoma descrito primero por Koehler y col., Nature, 256:495 (1975), o pueden ser elaborados mediante métodos de recombinación de ADN (ver, v.g., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser aislados de bancos de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas descritas por Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Entre los anticuerpos monoclonales se incluyen aquí anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de una especie concreta o perteneciente a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras el resto de las cadenas es idéntico y homólogo a las correspondientes secuencias de los anticuerpos derivados de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, con tal que muestren la actividad biológica deseada (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Entre los anticuerpos quiméricos de interés aquí se incluyen los anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión al antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (v.g., Monos del Viejo Mundo, Simios, etc.) y secuencias de regiones constantes humanas.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la región de unión al antígeno o variable del mismo. Entre los fragmentos de anticuerpos se incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2}, y Fv; fragmentos bivalentes ("diabodies"); anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Un anticuerpo "intacto" es aquél que comprende una región variable de unión al antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (C_{L}) y dominios constantes de cadena pesada, C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (v.g., dominios constantes de la secuencia natural humana) o variantes de la secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Las "funciones efectoras" de los anticuerpos hacen referencia a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia natural o una región Fc con una variación en la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Entre los ejemplos de las funciones efectoras de los anticuerpos se incluyen la unión a C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento, la unión al receptor Fc, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, la infra-regulación de los receptores de la superficie celular (v.g., receptor de las células B, BCR), etc.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar anticuerpos intactos a diferentes "clases". Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos pueden ser divididos adicionalmente en subclases (isotipos), v.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos son denominados \forall, *, ,, (, y \mu, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tri-dimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

"La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" y la "ADCC" hacen referencia a una reacción mediada por células en la cual las células citotóxicas no específicas que expresan los receptores Fc (FcR) (v.g., las células Asesinas Naturales (NK), los neutrófilos y los macrófagos) reconocen el anticuerpo unido sobre una célula diana y con posterioridad ocasionan la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar en la ADCC, las células NK, expresan FcRIII solamente, mientras los monocitos expresan FcRI, FcRII y FcRIII. La expresión de FcR sobre las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un análisis ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.500.362 o 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para semejantes análisis se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células Asesinas Naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, v.g., en un modelo animal tal como el descrito por Clynes y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:652-656 (1998).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos FcRIII y realizan una función efectora ADCC. Entre los ejemplos de los leucocitos humanos que median la ADCC se incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las células asesinas naturales (NK), los monocitos, las células T citotóxicas, y los neutrófilos, siendo preferidos los PBMC y las células NK. Las células efectoras pueden ser aisladas a partir de una fuente natural de las mismas, v.g., de sangre o PBMC como se describe aquí.

Los "anticuerpos naturales" son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está conectada a una cadena pesada por medio de un enlace disulfuro covalente, mientras el número de conexiones disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene regularmente espaciados puentes disulfuro intracatenarios. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido de numerosos dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos aminoácido concretos forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada.

El término "variable" hace referencia al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo concreto por su antígeno concreto. No obstante, la variabilidad no está uniformemente distribuida en todos los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos denominados regiones hipervariables tanto en los dominios de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables son denominadas regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro FR, adoptando en gran parte una configuración en lámina \beta, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles conectando, y en algunos casos formando parte de, la estructura de lámina \beta. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen juntas en íntima proximidad por medio de los FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

El término "región hipervariable" cuando se utiliza aquí hace referencia a los restos aminoácido de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende generalmente restos aminoácido de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (v.g., restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos restos de un "bucle hipervariable" (v.g., restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) del dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los restos de la "región marco" o "FR" son aquellos restos del dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable definida aquí.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina rinde un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de unión al antígeno y todavía es capaz de presentar reacción cruzada con el antígeno.

"Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento del antígeno completo y un sitio de unión al antígeno. Esta región consta de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de una cadena ligera en íntima asociación, no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión al antígeno sobre la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno; aunque a una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para un Fab' en el cual uno o varios restos cisteína de los dominios constantes portan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} eran producidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (6) y lambda (8), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una única cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende adicionalmente un conector polipeptídico entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, ver Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. (Springer-Verlag, Nueva York, 1994), págs. 269-315. Los fragmentos scFv de anticuerpos anti-ErbB2 se describen en WO 93/16185; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.571, 894; y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.587.458.

El término "fragmentos bivalentes" ("diabodies") hace referencia a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión al antígeno, cuyo fragmento comprende un dominio pesado variable (V_{H}) conectado a un dominio ligero variable (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Al utilizar un conector que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión al antígeno. Los fragmentos bivalentes se describen más completamente, por ejemplo, en EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (v.g., roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados con inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los restos de una región hipervariable del receptor son remplazados por los restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador), tal como ratón, conejo, o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana son remplazados por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá al menos sustancialmente todo un dominio variable, y típicamente dos, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todos o sustancialmente todos los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son sustancias que interferirían en los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo será purificado (1) en más del 95% en peso del anticuerpo determinado mediante el método de Lowry, y muy preferiblemente más del 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. En el anticuerpo aislado se incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Normalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado mediante al menos una etapa de purificación.

La expresión "secuencias de control" hace referencia a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora conectada operablemente en un organismo huésped concreto. Entre las secuencias de control que son adecuadas para los procariotas se incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión al ribosoma.

Un ácido nucleico está "conectado operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está conectado operablemente con el ADN para un polipéptido si éste es expresado en forma de una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor está conectado operablemente a una secuencia codificadora si ésta afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está conectado operablemente a una secuencia codificadora si ésta está situada de manera que facilite la traducción. Generalmente, "conectado operablemente" significa que las secuencias de ADN que están siendo conectadas son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. La conexión se completa mediante ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se pueden utilizar adaptadores oligonucleotídicos sintéticos o conectores según la práctica convencional.

Según se utiliza aquí, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se utilizan indistintamente y todas estas denominaciones incluyen la progenie. De este modo, en las palabras "transformantes" y "células transformadas" se incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos de allí derivados sin tener en cuenta el número de transferencias. Asimismo se debe entender que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido en ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Está incluida la progenie de mutantes que tienen la misma función o actividad biológica que la rastreada en la célula originalmente transformada. Cuando se pretendan designaciones diferentes, quedará claro a partir del contexto.

Modos de llevar a cabo la invención

La presente invención proporciona cepas de E. coli carentes de dgP y prc cromosómico que codifican las proteasas DegP y Prc, respectivamente, y que albergan un gen spr mutante, el producto génico de cuyo gen suprime los fenotipos de crecimiento mostrados por las cepas que albergan los mutantes prc. La cepa es opcionalmente deficiente además en ptr3 cromosómico que codifica la Proteasa III y/o ompT cromosómico que codifica la proteasa OmpT.

En otra realización, la cepa comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo para la cepa. La cepa es preferiblemente transformada con el ácido nucleico, que es preferiblemente ADN (ADNc o ADN genómico), por ejemplo mediante el uso de un vector de expresión recombinante.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir semejante polipéptido heterólogo. En este método la cepa de E. coli anterior, que también comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido, es cultivado de manera que se exprese el ácido nucleico. Después el polipéptido es recuperado de la cepa. La recuperación puede ser a partir del periplasma o del medio de cultivo de la cepa. Preferiblemente, el cultivo tiene lugar en un fermentador, y más preferiblemente en condiciones de fermentación a elevada densidad celular.

Se utilizan los parámetros de cultivo y se lleva a cabo la producción de polipéptidos de una manera convencional, tal como los procedimientos descritos más abajo.

A. Selección de ácido nucleico y modificaciones del mismo

El ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés es adecuadamente ARN, ADNc, o ADN genómico de cualquier fuente, siempre que este codifique el polipéptido o los polipéptidos de interés. Son bien conocidos los métodos para seleccionar el ácido nucleico apropiado para la expresión de polipéptidos heterólogos (incluyendo variantes de los mismos) en E. coli.

Si se están produciendo anticuerpos monoclonales, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado utilizando los procedimientos convencionales (v.g., utilizando sondas oligonucleotídicas que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de semejante ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que después son transformados en células huésped bacterianas aquí para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Entre los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias del ADN que codifica el anticuerpo se incluyen Skerra y col., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Plücktun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos han sido descritos en la técnica. Preferiblemente, un anticuerpo inmunizado tiene uno o más restos aminoácido introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos restos aminoácido no humanos a menudo son referidos como restos "importados", que se toman típicamente de un dominio variable "importado". La humanización puede ser realizada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de la región hipervariable por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567) donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos restos de la región hipervariable y posiblemente algunos restos FR son sustituidos por restos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligero como pesado, que se van a utilizar en la elaboración de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el denominado método "del mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es rastreada frente al banco completo de secuencias del dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que está más próxima a la del roedor es aceptada después como región marco humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). En otro método se utiliza una región marco concreta derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligeras y pesadas. Se puede utilizar el mismo marco para diversos anticuerpos humanizados (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Adicionalmente es importante que los anticuerpos sean humanizados conservando la elevada afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales son comúnmente asequibles y resultan familiares a los expertos en la técnica. Se encuentran disponibles programas de ordenador que ilustran y presentan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De este modo, los restos FR pueden ser seleccionados y combinados a partir de las secuencias receptoras e importadas de manera que se logra la característica del anticuerpo deseada, tal como un incremento de la afinidad por el antígeno o los antígenos diana. En general, los restos de la región hipervariable están directamente y muy sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.

Se contemplan diversas formas del anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad puede ser cualquier fragmento de anticuerpos, tal como un Fab, que esté opcionalmente conjugado con uno o más agentes de redireccionamiento con el fin de generar un producto inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o el anticuerpo madurado por afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.

Los fragmentos Fab'-SH pueden ser recuperados directamente a partir de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter y col., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')_{2} pueden ser aislados directamente del cultivo de las células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el practicante experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) (WO 93/16185; Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.571.894 y 5.587.458). El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", v.g., como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.641.870. Semejantes fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos diferentes de la proteína Dkk-1. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados como anticuerpos completos o como fragmentos de anticuerpos (v.g., anticuerpos biespecíficos de F(ab')_{2}).

Según un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2, y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente al menos en una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados, y son co-transfectados en un organismo huésped bacteriano adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las realizaciones cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales da como resultado elevados rendimientos o cuando las proporciones no tienen una trascendencia concreta.

En una realización preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseada, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona un fácil modo de separación. Este enfoque es descrito en WO 94/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Según otro enfoque descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.731.168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo son remplazadas por cadenas laterales más grandes (v.g., tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de idéntico o similar tamaño para las cadenas laterales grandes en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo remplazando las cadenas laterales de los aminoácidos grandes por otras más pequeñas (v.g., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como los homodímeros.

Entre los anticuerpos biespecíficos se incluyen anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos del producto heteroconjugado puede ser acoplado con avidina, el otro con biotina. Tales anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por el VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser elaborados utilizando cualquiera de los métodos de entrecruzamiento convenientes. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.676.980, junto con numerosas técnicas de entrecruzamiento.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también han sido descritas en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados utilizando el enlace químico. Brennan y col., Sciences, 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente formador de complejos con ditiol-arsenito sódico para estabilizar los ditioles próximos y evitar la formación de disulfuro intramolecular. Los fragmentos Fab' generados son convertidos después en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB es convertido después en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden ser utilizados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Adicionalmente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar anticuerpos biespecíficos (Shalaby y col., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)).

Asimismo se han descrito diversas técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir del cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina (Kostelny y col., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)). Los péptidos con cremalleras de leucina de las proteínas Fos y Jun están conectados a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo son reducidos en la región bisagra para formar monómeros y después re-oxidados para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede ser utilizado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología del fragmento bivalente ("diabody") descrita por Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para elaborar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V_{L}) por medio de un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento están forzados a emparejarse con los dominios V_{H} y V_{L} complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión al antígeno. Se ha informado sobre otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (scFv) (Gruber y col., J. Immunol., 152:5368 (1994)).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos (Tutt y col., J. Immunol., 147:60 (1991)).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes polipeptídicas son preparadas mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Entre estos métodos se incluyen, pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de la secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, mutagénesis de la casete de una variante preparada de antemano o una versión no variante del polipéptido.

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, v.g., con el fin de intensificar la unión al receptor Fc. Esto puede ser logrado introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, se pueden introducir uno o varios restos cisteína en la región Fc, permitiendo de ese modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región.

Para incrementar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor salvaje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de los Estados Unidos 5.739.277, por ejemplo. Según se utiliza aquí, el término "epítopo de unión al receptor salvaje" hace referencia a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (v.g., IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable del incremento de la vida media de la molécula de IgG en suero in vivo.

Aquí se contemplan otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar conectado a una variedad de polímeros proteináceos, v.g., polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol.

B. Inserción de ácido nucleico en un vector replicable

El ácido nucleico heterólogo (v.g., ADNc o ADN genómico) es insertado adecuadamente en un vector replicable para la expresión en la bacteria bajo el control de un promotor adecuado. Se encuentran disponibles muchos vectores para este fin, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico que se vaya a insertar en el vector y de la célula huésped concreta que se vaya a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de la célula huésped concreta con la cual sea compatible. Dependiendo del tipo concreto de huésped, los componentes del vector incluyen generalmente, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

En general, los vectores plasmídicos que contienen un replicón y secuencias de control que están derivadas de especies compatibles con la célula huésped son utilizados en conexión con huéspedes de E. coli. El vector porta normalmente un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli es transformada típicamente utilizando pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli (ver, v.g., Bolivar y col., Gene, 2:95 (1977)). pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y por tanto proporciona medios fáciles para identificar células transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido bacteriano o fago, también contiene generalmente, o se modifica para que contenga, promotores que pueden ser utilizados por el huésped E. coli para la expresión de los genes marcadores seleccionables.

(i) Componente de la secuencia señal

El ADN que codifica el polipéptido de interés aquí puede ser expresado no solo directamente, sino también como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N del polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN polipeptídico que es insertado en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped.

Para las células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan la secuencia señal polipeptídica natural o eucariótica, la secuencia señal es sustituida por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo formado por la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o líderes de la enterotoxina II termoestable.

(ii) Componente origen de replicación

Los vectores de expresión contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de las bacterias Gram negativas tales como E. coli.

(iii) Componente Gen de Selección

Los vectores de expresión contienen generalmente un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de las células huésped transformadas desarrolladas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Este marcador seleccionable se separa de los marcadores genéticos utilizados y definidos por esta invención. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, v.g., ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas distintas de las causadas por la presencia del marcador o los marcadores genéticos, o (c) suminis-
tran nutrientes críticos no asequibles de medios complejos, v.g., el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. En este caso, aquellas células que son transformadas con éxito con el ácido nucleico de interés producen un polipéptido que confiere resistencia a fármacos y de ese modo sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de semejante selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern y col., J. Molec. Appl. Genet., 1:327 (1982)), ácido micofenólico (Mulligan y col., Science, 209: 1442 (1980)) o higromicina (Sugden y col., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)). Los tres ejemplos dados antes emplean genes bacterianos bajo el control eucariótico para conferir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

(iv) Componente promotor

El vector de expresión para producir el polipéptido de interés contiene un promotor adecuado que es reconocido por el organismo huésped y está conectado operablemente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Entre los promotores adecuados para su uso con los huéspedes procarióticos se incluyen sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa (Chang y col., Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281:544 (1979)), el sistema promotor de arabinosa (Guzman y col., J. Bacteriol., 174:7716-7728 (1992)), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) y EP 36.776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). No obstante, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo de ese modo a un trabajador experto ligarlos operablemente al ADN que codifica el polipéptido de interés (Siebenlist y col., Cell, 20:269 (1980)) utilizando conectores o adaptadores para suministrar cualquiera de los sitos de restricción requeridos.

Los promotores para su uso en los sistemas bacterianos también contienen generalmente una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) conectada operablemente al ADN que codifica el polipéptido de interés. El promotor puede ser separado del ADN de fuente bacteriana mediante digestión con enzimas de restricción e insertado en el vector que contienen el ADN deseado.

(v) Construcción y análisis de vectores

En la construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados antes se emplean técnicas de ligadura normalizadas. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN son escindidos, ajustados, y re-ligados en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para que el análisis confirme las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligadura son utilizadas para transformar E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31.446) u otras cepas, y los transformantes exitosos son seleccionados mediante la resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina cuando sea apropiado. Los plásmidos de los transformantes son preparados, analizados mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o secuenciados mediante el método de Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977) o Messing y col., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981), o mediante el método de Maxam y col., Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

Entre los huéspedes de E. coli adecuados como huéspedes parentales para la expresión de plásmidos aquí se incluyen E. coli W3110 (ATCC 27.325), E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, y E. coli X1776 (ATCC 31.537). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Las células mutantes de cualquiera de las cepas anteriormente mencionadas también pueden ser empleadas como huéspedes de partida que después son adicionalmente mutados para que contengan al menos el genotipo mínimo requerido aquí. E. coli cepa W3110 es un huésped parental preferido debido a que es una cepa huésped común para las fermentaciones de producto de ADN recombinante. Los ejemplos de los huéspedes de E. coli de partida que se van a utilizar como huéspedes parentales, junto con sus genotipos, están incluidos en la siguiente tabla:

Cepa	Genotipo
W3110	K-12 lambda^{-}IN(rrnD-rrnE)1
1A2	W3110 \DeltafhuA
9E4	W3110 \DeltafhuA ptr3
27A7	W3110 \DeltafhuA ptr3 phoA\DeltaE15(argF-lac)169
27C6	W3110 \DeltafhuA ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169
27C7	W3110 \DeltafhuA ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 \DeltaompT degP41 (\DeltapstI-kan^{R})
33D3	W3110 \DeltafhuA ptr3 lacIq lacL8 \DeltaompT degP41 (\DeltapstI-kan^{R})
36F8	W3110 \DeltafhuA phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ptr3 degP41 (\DeltapstI-kan^{R}) ilvG2096^{R}

(Continuación)

Cepa	Genotipo
43D3	W3110 \DeltafhuA ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 ompT degP41 (\DeltapstI-kan^{R}) ilvG2096^{R}
43E7	W3110 \DeltafhuA \Delta(argF-lac)169 ompT ptr3 phoA\DeltaE15 degP41 (\DeltapstI-kan^{S}) ilvG2096^{R}
44D6	3110 \DeltafhuA ptr3 \Delta(argF-lac)169 degP41 (\DeltapstI-kan^{S}) \DeltaompT ilvG2096^{R}
45F8	W3110 \DeltafhuA ptr3 \Delta(argF-lac)169 degP41 (\DeltapstI-kan^{S}) \DeltaompT phoS* (T10Y)ilvG2096^{R}
45F9	W3110 \DeltafhuA ptr3 \Delta(argF-lac)169 degP41 (\DeltapstI-kan^{S}) \DeltaompT ilvG2096^{R} phoS*(T10Y)
	\Deltacyo::kan^{R}^{\pm}

También son adecuados los intermedios en la elaboración de la cepa 36F8, es decir 27B4 (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.304.472) y 35E7 (un producto aislado de colonias resistentes a la temperatura espontáneas que crece mejor que 27B4). Una cepa adecuada adicional es la cepa de E. coli que tiene las proteasas periplásmicas mutantes descrita en la Patente de los Estados Unidos 4.946.783 expedida el 7 de Agosto de 1990.

Las cepas de esta invención pueden ser producidas mediante integración cromosómica de la cepa parental u otras técnicas, incluyendo aquellas mostradas en los Ejemplos más abajo.

El ácido nucleico que codifica el polipéptido es insertado en las células huésped. Preferiblemente, esto se logra transformando las células huésped con los vectores de expresión descritos anteriormente y cultivando en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir los diversos promotores.

Transformación significa introducción de ADN en un organismo de manera que el ADN sea replicable, ya sea en forma de elemento extracromosómico ya sea como integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas normalizadas apropiadas para tales células. Generalmente se utiliza el tratamiento con calcio empleando cloruro de calcio, como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva York: Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989), para las células procarióticas u otras células que contengan barreras de pared celular sustanciales. En otro método para la transformación se emplea polietilenglicol/DMSO, como describen Chung y Miller, Nucleic Acids Res., 16:3580 (1988). Otro método más es el uso de la técnica denominada electroporación.

D. Cultivo de las células huésped

Las células procarióticas utilizadas para producir el polipéptido de interés son cultivadas en medios adecuados como describen generalmente Sambrook y col., supra. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH, y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el artesano experto.

Cuando se emplea el promotor de la fosfatasa alcalina, las células de E. coli utilizadas para producir el polipéptido de interés de esta invención son cultivadas en medios adecuados en los que el promotor de la fosfatasa alcalina puede estar parcialmente o completamente inducido como se describe generalmente, v.g., Sambrook y col., supra. Se necesita que el cultivo nunca tenga lugar en ausencia de fosfato inorgánico o a niveles de privación de fosfato. Al principio, el medio contiene fosfato inorgánico en una cantidad superior al nivel de inducción de la síntesis de proteínas y suficiente para el crecimiento de la bacteria. A medida que las células crecen y utilizan el fosfato, disminuye el nivel de fosfato en el medio, ocasionando de ese modo la inducción de la síntesis del polipéptido.

Asimismo se puede incluir cualquier otro ingrediente necesario para el medio además de fuentes de carbono, nitrógeno, y fosfato inorgánico a concentraciones apropiadas introducidas solas o en forma de una mezcla con otro ingrediente o medio tal como una fuente de nitrógeno compleja. El pH del medio puede ser cualquier pH de aproximadamente 5-9, dependiendo principalmente del organismo huésped.

Si el promotor es un promotor inducible, para que se produzca la inducción, típicamente las células son cultivadas hasta lograr cierta densidad óptica, v.g., una A_{550} de aproximadamente 200 utilizando un procedimiento de elevada densidad celular, en cuyo punto se inicia la inducción (v.g. mediante la adición de un inductor, mediante agotamiento de un componente del medio, etc.), para inducir la expresión del gen que codifica el polipéptido de interés.

E. Detección de la expresión

La expresión génica puede ser medida en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional, transferencia northern para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia puntual (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias del polipéptido. Se pueden emplear diversas marcas, muy comúnmente radioisótopos, concretamente P^{32}. No obstante, también se pueden emplear otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina sirve después como sitio para la unión a la avidina o los anticuerpos, que pueden ser marcados con una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos, marcas fluorescentes, enzimas, o similares. Alternativamente, se pueden emplear análisis o geles para la detección de proteínas.

Para la secreción de un producto génico expresado, la célula huésped es cultivada en condiciones suficientes para la secreción del producto génico. Entre tales condiciones se incluyen, v.g., condiciones de temperatura, nutrientes, y densidad celular que permitan la secreción por la célula. Por otra parte, tales condiciones son aquellas en las cuales la célula puede realizar las funciones celulares básicas de transcripción, traducción, y paso de proteínas desde un compartimento celular a otro, como es sabido por los expertos en la técnica.

F. Purificación de polipéptidos

Los siguientes procedimientos, individualmente o combinados, son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados, dependiendo el método o métodos específicos utilizados del tipo de polipéptido: fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico; precipitación en etanol; HPLC en fase reversa; cromatografía de interacción hidrófoba; cromatografía sobre sílice; cromatografía sobre una resina de intercambio iónico tal como S-SEPHAROSE® y DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación en sulfato de amonio; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, SEPHADEX® G-75.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser separados adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

La invención se comprenderá más completamente mediante la referencia a los siguientes ejemplos. No obstante, estos no deben ser considerados limitantes del alcance de la invención. Todas las citas de publicaciones y patentes se incorporan aquí como referencia.

Ejemplo 1

Material y métodos A. Plásmidos de expresión 1. Plásmidos para expresar rhuFab'2 LZ (xCD18) y derivados etiquetados

pS1130

El plásmido pS1130 es un plásmido basado en pBR322 descrito en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 6.180.367 y 6.258.560. La síntesis de rhuFab'2 LZ(xCD18) está regulada por el promotor de la fosfatasa alcalina (AP) de E. coli. Cuando el promotor AP es inducido por el agotamiento de fosfato, forma un ARN mensajero di-cistrónico en el orden de secuencia codificadora de la cadena ligera kappa de la señal STII; secuencia codificadora de la cadena pesada de la señal STII, seguido de una secuencia de cremallera de leucina. Se colocó un terminador de la transcripción lambda cerca del codón de terminación de la traducción.

pcyc34

El plásmido pcyc34 es una contraparte del promotor tacII de pS1130.

pxCD18-7T3

El plásmido promotor dual que contiene dos unidades de traducción separadas, pxCD18-7T3, permite la separación temporal de la transcripción de la cadena ligera de la transcripción de la cadena pesada. Como en pS1130, la cadena ligera permanece bajo el control del promotor phoA. No obstante, en pxCD18-7T3, un terminador transcripcional \lambdat_{0} sigue a la secuencia codificadora de la cadena ligera. Aguas abajo de este terminador, se añadió el promotor tacII para controlar la transcripción del fragmento de cadena pesada/cremallera de leucina C-terminal (DeBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Un segundo terminador transcripcional \lambdat_{0} sigue a esta secuencia codificadora. Se utilizaron variantes con codones silenciosos de la secuencia señal STII para dirigir la secreción de ambas cadenas (Simmons y Yansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996)). Específicamente, los nucleótidos de la secuencia señal STII fueron modificados de manera que la cadena ligera tuviera una resistencia relativa TIR de 7 y la cadena pesada tuviera una resistencia relativa TIR de 3, y que los tres últimos nucleótidos de la secuencia señal que precedieran tanto a las cadenas ligera como pesada fueran GCT. En este sistema de dos promotores la secuencia promotora phoA y el ADN para las cadenas de anticuerpo ligera y pesada son las mismas que en pS1130.

\newpage

pAB3

El plásmido pAB3 se diseña para expresar un F(ab')2 anti-CD18 en el periplasma de E. coli bajo el control del promotor de la fosfatasa alcalina (Kikuchi y col., Nucleic Acids Res., 9(21):5671-5678 (1981)) y tiene una cremallera de leucina y está marcado con His. La secuencia señal de la enterotoxina II termoestable (Picken y col., Infect. Immun., 42:269-275 (1983)) precede a las cadenas ligera y pesada, y sobre el extremo C-terminal de la cadena pesada está fusionada la cremallera de leucina GCN4 seguido de seis restos histidina. Las secuencias codificadoras de la cadena ligera y pesada están en configuración policistrónica con el terminador transcripcional \lambda_{o} (Scholtissek y Grosse, Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987)) después del gen de la cadena pesada.

El plásmido pAB3 fue construido ligando entre sí los tres fragmentos de ADN, el primero de los cuales era el vector pS1130 en el cual se había separado el fragmento KpnI-SphI pequeño. La segunda parte de la ligadura era un fragmento KpnI-HindIII de aproximadamente 645 pares de bases de pS1130. La parte final de la ligadura era un dúplex de ADN sintético con la siguiente secuencia:

	5'-AGCTTGTCGGGGAGCGCCATCACCATCACCATCACTAAGCATG	(SEC ID NUM: 6)
	ACAGCCCCTCGCGGTAGTGGTAGTGGTAGTGATTC-5'	(SEC ID NUM: 7)

pAB21

El plásmido pAB21 es un derivado de pAB3 en el cual los seis restos histidina del extremo C-terminal de la cadena pesada han sido remplazados por seis restos lisina. Este plásmido fue construido de una manera idéntica a pAB3 excepto que el ADN sintético utilizado en la ligadura fue el siguiente:

	5'-AGCTTGTCGGGGAGCGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGTAAGCATG	(SEC ID NUM: 8)
	ACAGCCCCTCGCGTTTTTCTTTTTCTTTTTCATTC-5'	(SEC ID NUM: 9)

2. Plásmido para expresar Fab'2 LZ-6xhis anti-TF

El plásmido D3H44-F(ab')2 (también conocido como pD3h44f2), construido para la producción directa de Fab'2 cremallera de leucina - 6xhis anti-factor tisular, tiene exactamente la misma secuencia de ADN esqueleto que pAB3 excepto que las regiones variables para HC y LC fueron cambiadas de xCD18 VL/VH a xTF VL/VH. La construcción de este plásmido se describe en WO 01/70984 publicada el 27 de Septiembre de 2001.

Específicamente, primero, el plásmido para expresar Fab anti-TF (D3H44-F(ab)) fue preparado como sigue: El plásmido pEMX1 utilizado para la mutagénesis y la expresión de F(ab) en E. coli ha sido descrito por Wether y col., J. Immunol., 157:4986-4995 (1996). Brevemente, el plásmido contiene un fragmento de ADN que codifica una cadena ligera \kappa humana del subgrupo I consenso (VL_{\kappa}I-CL), una cadena pesada del subgrupo III humana consenso (VHIII-CH1) y un promotor de la fosfatasa alcalina. El uso de las secuencias consenso para VL y VH ha sido descrito por Carter y col., Bio/Technology, 10:163-167 (1992); Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992).

Se realizó la mutagénesis dirigida al sitio (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985)) sobre un molde conteniendo desoxiuridina de pEMX1. Las seis CDR fueron cambiadas por la secuencia D3 murina; los restos incluidos en cada CDR eran de las definiciones de CDR basadas en la secuencia (Kabat y col., Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5, Public Health Service (National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)), excepto para CDR-H1, que fue definida utilizando una combinación de las definiciones de CDR-H1 de Kabat y col. supra, y Chothia y col., Nature, 342:877-883 (1989), es decir, CDR-H1 fue definida como una prolongación desde los restos H26-H35 en la cadena pesada. D3H44-F(ab) codificaba por lo tanto un F(ab) que constaba de un marco humano completo (VL_{\kappa} subgrupo I y VH subgrupo III) con las seis secuencias de CDR murinas completas.

D3H44-F(ab')2 fue generado mediante la adición de la bisagra de la cadena pesada (CPPCPAPELLGG; SEC ID NUM: 10) al extremo C del D3H44-F(ab), seguido de la cremallera de leucina GCN4 y una etiqueta (his)6 para la purificación (ver la descripción para pAB3 anterior para la cremallera de leucina y la etiqueta hisx6).

3. Plásmidos para expresar Fab anti-VEGF

pY0317

La proteína Y0317 Fab anti-VEGF madurada por afinidad es descrita por Chen y col., J. Mol. Biol., 293:865-881 (1999). Para construir un plásmido para producirla, pY0317, brevemente, se clonó una casete de expresión en el marco del plásmido de E. coli pBR322 en el sitio EcoRI (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43:77-90 (1978)). La casete de expresión contenía al menos los siguientes componentes básicos: (1) promotor phoA para el control de la transcripción; (2) terminador \lambdat_{0} para finalizar la transcripción; y (3) la secuencia de Shine-Dalgarno de trp de E. coli o del gen de la enterotoxina II termoestable, o una combinación de ambas, para facilitar la traducción. Los componentes básicos de las casetes de expresión bacterianas son conocidos en la técnica y han sido descritos, por ejemplo, por Kikuchi y col., Nucleic Acids Res., 9(21):5671-5678 (1981) (para el promotor phoA); Scholtissek y Grosse, Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987) (para el terminador \lambdat_{0}); Yanofsky y col., Nucleic Acids Res., 9:6647-6668 (1981) (para trp); Picken y col., Infect. Immun., 42:269-275 (1983) (para STII); y Chang y col., Gene, 55:189-196 (1987) (para el uso combinado de trp y la secuencia de Shine-Dalgarno de STII). Adicionalmente, la secuencia señal STII o las variantes con codones silenciosos de la misma precedían a la secuencia codificadora para las cadenas tanto ligera como pesada en pY0317 para producir Fab anti-VEGF y dirigían la secreción de la proteína al periplasma. Picken y col., Infect. Immun., 42:269-275 (1983); Simmons y Yansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para la casete de expresión de 1952 pares de bases insertada en el sitio EcoRI para la producción de la proteína recombinante se muestran en la Figura 1 (SEC ID NUMS: 1 y 2, respectivamente).

RhuFab V2 Y0317 fue creado mediante la humanización del anticuerpo monoclonal A.4.6.1 murino (Presta y col., Cancer Res., 57:4593-4599 (1997) utilizando un procedimiento descrito previamente para otros anticuerpos (Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4995 (1996)). Brevemente, los ADNc que codifican las cadenas ligera variable y pesada variable de muAb A.4.6.1 fueron aislados utilizando una RT-PCR de células de hibridoma productoras de anticuerpo monoclonal murino. Estos ADNc fueron clonados y fusionados a los dominios CL humano y CH1 humano (Werther y col., J. Immunol., 157:4986-4995 (1996)), generando un Fab quimérico de ratón-humano. Las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (indicadas en la Figura 1 en negrita) fueron transplantadas en un vector de anticuerpo previamente humanizado que codificaba una cadena ligera \kappa del subgrupo I humana consenso y una cadena pesada del subgrupo III humana consenso Carter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)). Transfiriendo solamente los restos CDR del marco humano se ocasionaba una reducción de 1.000 veces la unión al antígeno VEGF. También se cambiaron numerosos restos del marco próximos a las CDR (indicados en la Figura 1 en cursiva y subrayados) para mejorar la unión a la diana (Presta y col., Cancer Res., 57:4593-4599 (1997)). En total, se cambiaron siete restos de la cadena pesada y un resto de la cadena ligera fuera de las CDR. Las cadenas pesada y ligera fueron movidas después al vector de presentación en fagos (Baca y col., J. Biol. Chem., 272:10678-10684 (1997)), remplazando el gen hGH de phGHam-g3 (Bass y col., Proteins, 8:309-314 (1990)). Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para cambiar VL Met4Leu para imposibilitar la oxidación de la metionina y VH Thr231Leu para facilitar la clonación de la fusión del gen III. Este vector se denomina Y0101 y fue utilizado como punto de partida para la optimización de las CDR en la unión al antígeno VEGF (Muller y col., Structure, 6:1153-1167 (1998)). Se encontró que solamente las mutaciones de las CDR H1 y H3 mejoraban la afinidad y fueron incorporadas a la versión final pY0317. Los cambios del plásmido pY0101 al plásmido pY0317 son: Thr28Asp, Asn31His, His101Tyr, Ser105Thr. Todos estos cambios están en la región de la cadena pesada variable. El plásmido pY0317 es un vector de presentación en fagos Fab. En la Figura 2A aparece un diagrama de este plásmido.

pY0317tet20

El plásmido pY0317tet20 fue construido para la producción directa del rhuFab V-2 en E. coli. Las Figuras 2A y 2B muestran un diagrama de flujo de la construcción del plásmido, que comienza con pY0317. El plásmido pY0317tet20 es una versión modificada del plásmido bien caracterizado pBR322. El fragmento AvaI-PvuII de 639 pares de bases ha sido separado de la porción pBR322 del plásmido. Esta deleción elimina el gen rop, que está implicado en el control del número de copias (Cesareni y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:6313-6317 (1982)). Por consiguiente el plásmido tiene un número de copias ligeramente elevado en comparación con pBR322. Se ha insertado una casete de expresión de 1.952 pares de bases (Figura 1) en el sitio EcoRI para la producción de la proteína recombinante. El plásmido pY0317tet20 es resistente a los antibióticos tanto de tetraciclina como \beta-lactámicos. La casete de expresión contiene una única copia de la cadena ligera y de la cadena pesada unidas en tándem. La transcripción de cada gen en un ARNm dicistrónico individual está dirigida por el promotor phoA de E. coli (Chang y col., Gene, 44:121-125 (1986)). Las señales de inicio de la traducción para cada cadena son proporcionadas por las secuencias de Shine-Dalgarno de STII (enterotoxina termoestable). La traducción de cada cadena comienza con un péptido señal de STII de 23 restos (Picken y col., Infection and Immunity, 42:269-275 (1983)) que dirige la translocación de los péptidos a través de la membrana citoplásmica al espacio periplásmico. El péptido señal de STII es separado después por la peptidasa líder de E. coli. Las cadenas ligera y pesada se pliegan en sus conformaciones naturales tras la secreción al periplasma y se unen covalentemente por medio de un enlace disulfuro intermolecular.

La resistencia a la tetraciclina fue colocada en el vector final por medio de modificaciones de pY0317 (ver las Figuras 2A y 2B). Un fragmento SapI/ApaI de 3642 pares de bases de pY0317, que incluye el origen de replicación de pBR322, el gen de la \beta-lactamasa, el promotor phoA, la cadena ligera completa, y la mitad amino-terminal de la cadena pesada (VH), fue ligado a un fragmento SapI/ApaI de 2.738 pares de bases de p6G4V11N35A.PEG. Este segundo fragmento contiene la región CH1 de la cadena pesada y el gen de resistencia a la tetraciclina de pBR322. Este fragmento también contiene cuatro aminoácidos extra en el extremo carboxi de la cadena pesada para la modificación específica del sitio de la proteína. La región que contiene los cuatro restos extra y la región CH1 fueron separados con un digesto BssHII/HpaI y remplazados por un fragmento BssHII/XbaI de pY0317, restaurando la secuencia de la cadena pesada original y suprimiendo la región de modificación específica del sitio. El digesto XbaI fue realizado primero y el saliente rellenado con Klenow y desoxinucleótidos. Esto estuvo seguido de purificación en gel del digesto BssHII del fragmento de 433 pares de bases. Se realizó una manipulación final del plásmido remplazando el fragmento NheI-a-NdeI de pBR322 por un fragmento NheI/NdeI de pBR322 conteniendo una deleción AvaI-PvuII de 639 pares de bases. El plásmido final, pY0317tet20, es resistente a la tetraciclina y a los antibióticos \beta-lactámicos, y contiene el promotor phoA y los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de anti-VEGF.

4. Plásmido para expresar Apo2L

pAPApo2-P2RU se describe en WO 01/00832 publicado el 4 de Enero de 2001. Brevemente, este plásmido, cuyo constructo se muestra en la Figura 3, codifica la expresión simultánea de Apo-2L (restos aminoácido 114-281) y los ARNt codificados por pro2 y argU., cuya expresión simultánea está regulada por el promotor de la fosfatasa alcalina. El plásmido basado en pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43:77-90 (1978)) pAPApo2-P2RU fue utilizado para producir la Apo-2L en E. coli. Las secuencias transcripcionales y traduccionales requeridas para la expresión de Apo-2L son proporcionadas por el promotor de la fosfatasa alcalina y la Shine-Dalgarno de trp, como se ha descrito para el plásmido phGH1 (Chang y col., Gene, 55:189-196 (1987)). La secuencia codificadora de Apo-2L (de 114 a 281) está localizada aguas abajo del promotor y las secuencias de Shine-Dalgarno y está precedida por una metionina de iniciación. En la secuencia codificadora se incluyen nucleótidos (mostrados en la Fig. 4) que codifican los restos 114-281 de Apo-2L (Figura 4 (SEC ID NUMS: 3 y 4, respectivamente, para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos)) excepto que el codón que codifica el resto Pro119 se ha cambiado por "CCG" en lugar de por "CCT" con el fin de eliminar la estructura secundaria potencial. La secuencia que codifica el terminador transcripcional lambda t_{o} (Scholtissek y col., Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987)) sigue a la secuencia codificadora de Apo-2L.

Adicionalmente, este plásmido también incluye las secuencias para la expresión de los ARNt pro2 (Komine y col., J. Mol. Biol., 212:579-598 (1990)) y argU/dnaY (García y col., Cell, 45:453-459 (1986)). Estos genes fueron clonados mediante PCR a partir de E. coli W3110 y situados aguas abajo de la secuencia terminadora transcripcional lambda t_{o}. Este plásmido confiere resistencia tanto a la tetraciclina como a la ampicilina al huésped de producción.

B. Transformaciones celulares

Las células competentes de la cepa relevante fueron preparadas y transformadas con el plásmido apropiado utilizando los procedimientos normalizados, y los transformantes exitosos fueron seleccionados y desarrollados en cultivo. Para los plásmidos que eran resistentes a tetraciclina, los transformantes fueron seleccionados de placas LB que contenían 20 \mug/ml de tetraciclina (LB+Tet20), purificados mediante rayado, y desarrollados en caldo LB con 20 \mug/ml de tetraciclina en un agitador/incubador a 30ºC antes de ser almacenados en DMSO a -80ºC.

En el caso de los plásmidos pxCD18-7T3 y pyc34, un plásmido adicional, pMS421, fue transformado simultáneamente junto con pxCD18-7T3 o pyc34. pMS421 es un plásmido basado en pSC101 que sobreexpresa el supresor lacIq, que suprime la inducción del promotor tacII hasta que se añadía IPTG para desuprimirlo, y que también confiere resistencia a la espectomicina y a la estreptomicina. Este plásmido proporciona copias adicionales del gen cromosómico lacIq bajo el control de su propio promotor de una cepa lacI, cuyo gen es colocado en el plásmido compatible pSC101.

C. Extracción de anticuerpo

La fracción soluble de las células de E. coli fue preparada suspendiendo un sedimento con una DO de 20 por ml en 500 \mul de TRIS-HCl 200 mM (pH 8,0) con 20 \mul de EDTA 0,1 M (pH 8,0) y 10 \mul de lisozima (6 mg/ml). Esta mezcla fue sometida a vórtice, sometida a sonicación durante 7-10 pulsos, después centrifugada a 15.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. La fracción sobrenadante tras la centrifugación se denomina extracto con alto contenido de sal (HSE). El sedimento restante fue utilizado para el análisis de la fracción insoluble.

D. Identifcación de proteínas

Se llevó a cabo la electroforesis en gel SDS-PAGE unidimensional en un gradiente de acrilamida lineal al 4-12% de Novex. Específicamente, el sistema utilizado fue Novex® NuPage® System, que constaba de NuPage Bis-TRIS Pre-Cast Gels (para proteínas de peso molecular bajo a medio).

Se llevó a cabo la electroforesis en gel bidimensional como describen Champion y col., Electrophoresis, 20 (4-5):994-1000 (1999)), con gradientes de pH inmovilizados (pH 3-10) en la primera dimensión y un gradiente de acrilamida lineal (9-18%T) en la segunda dimensión, adquirido de Amersham Pharmacia Biotech. La identificación de las proteínas fue determinada utilizando una combinación de plata/tinción de Coomassie, secuenciación NH_{2}-terminal, y análsis de espectrometría de masas. Para los geles analíticos, se combinaron productos lisados celulares de E. coli (\sim40 \mug proteína) con solución de rehidratación como describen Champion y col., supra. Se utilizaron tiras de gel con gradientes de pH inmovilizados no lineales (IPG) a pH 3-10 de 18 cm (Amersham Pharmacia Biotech) para el isoelectroenfoque para un total de 50.000 Vh.

Los geles cargados preparativamente fueron transferidos a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (ProBlott; Applied Biosystems) como describe el fabricante. La secuenciación NH_{2}-terminal fue realizada utilizando un ciclo Edman de 20 minutos y un reactor de flujo horizontal de múltiples muestras para el análisis de la secuencia de proteínas electrotransferidas a PVDF (Henzel y col., Analytical Biochemistry, 267:148-160 (1999)). El peso molecular de las aplicaciones específicas de la cadena ligera fueron estimadas a partir de espectrometría de masas MALDI-TOF y Lc-MS capilar de las muestras eluidas de los geles (Champion y col., supra).

E. Medida de las especies de proteínas diana

Se utilizó el análisis en columna dual AME5®/fase reversa (análisis en columna dual AME5®/RP) para la determinación del título de F(ab')2 LZ anti-CD18, como se describe más abajo.

Análisis columna dual AME5®/RP 1. Instrumental y equipo

Se ajustó una estación de trabajo INTEGRAL® (de PerSeptive Biosystems) en la configuración de gradiente de columna dual. Se utilizó una columna de afinidad que contenía un anticuerpo Fab anti-cadena ligera (kappa) (AME5®) inmovilizado sobre vidrio de poro controlado (CPG) para capturar la proteína diana. Se utilizó una columna en fase reversa, temperatura controlada a 60ºC, para resolver adicionalmente las especies de anticuerpos capturadas. Se obtuvieron una resina de inmunoafinidad de aldehído activado (AL-20), resinas POROS de fase reversa (R220), y dispositivos de empaquetamiento en columna de PerSeptive Biosystems, (Cambridge, MA, USA). Las columnas PEEK de CPG vacías, 30 x 2,1 mm (100 \mul), fueron adquiridas de Upchurch Scientific (Oak Harbor, WA, USA). Las muestras de E. coli fueron filtradas utilizando filtros de 5 micras de jeringa ACRODISC® PF (de Gelman Sciences).

2. Purificación de Fab(his-gly)_{4} his-(lys) anti-kappa humana AME5®

La solución salina tamponada con fosfato, pH 7,2 (PBS) conteniendo fosfato de sodio 9,4 mM, cloruro de sodio 136,9 mM, y cloruro de potasio 2,7 mM es referida aquí como tampón de carga. Los anticuerpos monoclonales fueron obtenidos a partir de un Fab murino, Fab(his-gly)_{4} his-(lys)_{3} anti-kappa humana AME5®, que se había purificado a partir de pasta de E. coli y se denomina Fab hgk AME5® para los presentes fines. La pasta de E. coli fue obtenida a partir de una fermentación de 10 litros en células 27C7. Se utilizó un microfluidificador para homogeneizar las células tras la suspensión en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,25 M, cloruro de magnesio 10 mM, e imidazol 2 mM a pH 7,0. El extracto aclarado fue purificado utilizando una combinación de etapas de cromatografía de intercambio iónico y quelación de iones metálicos inmovilizados (IMAC). Las resinas de quelación SEPHAROSE FAST FLOW® y SP SEPHAROSE FAST FLOW® eran de Amersham Pharmacia).

3. Inmovilización de Fab hgk Ame5® para CPG recubierto con glicerilo

El Fab purificado fue inmovilizado sobre vidrio de poro controlado (CPG) recubierto con glicerilo activado con peryodato para elaborar la resina de afinidad. El anticuerpo Fab hgk AME5® fue inmovilizado sobre CPG recubierto con glicerilo utilizando una modificación del método de Roy y col., J. Chromatography, 303:225-228 (1984).

El CPG seco fue humedecido con agua purificada, empaquetado en una columna de cromatografía, y activado durante 30 minutos mediante recirculación con metaperyodato de sodio al 1% (Sigma S-1878®) a través de la columna. La resina activada fue lavada después en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,15 M, pH 7,2 (tampón de acoplamiento).

El anticuerpo Fab hgk AME5® a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml en tampón de acoplamiento conteniendo 1 \lambdag/ml del agente reductor cianoborohidruro de sodio (Sigma S8628) se hizo recircular a través del lecho de resina activada. El acoplamiento del anticuerpo a la resina fue controlado mediante el descenso de absorción a 280 nm. Cuando no había más descenso de absorción, cualquier anticuerpo restante era lavado con tampón de acoplamiento y recuperado. La densidad del acoplamiento era determinada mediante la diferencia entre la cantidad de partida y la cantidad recuperada una vez completada la reacción y era referida en mg de Fab por ml de resina.

Cualquiera de los sitios activos restantes de la resina se hacían reaccionar después recirculando etanolamina 1 mM, pH 8,0 (ICN, catálogo #151078) en presencia de 1 \lambdag/ml de cianoborohidruro de sodio durante 2 horas. La resina se lavó después en tampón de acoplamiento conteniendo timerosal al 0,01% (GDL International) para el almacenamiento. La resina fue pre-ciclada tres veces entre tampones de equilibrado y elución para ser utilizadas antes de aplicar cualquier proteína.

4. Reactivos y método de análisis

Los reservorios de disolvente eran: Disolvente 1A, tampón de carga de afinidad, Disolvente 1B, tampón acuoso en fase reversa y tampón de elución por afinidad, TFA al 0,1% en agua, Disolvente 2A, agua. Disolvente 2B, tampón de elución orgánico en fase reversa, TFA al 0,09%/acetonitrilo al 80%. Se inyectaron cincuenta \mul de E. coli HSE (diluida 1:2) o el sobrenadante del caldo de fermentación en tampón de carga. Todas las formas de anti-CD18 encontradas en los extractos celulares de fermentación fueron capturados mediante este anticuerpo AME5® determinado mediante la comparación de geles 2-D de una ronda de blancos, una ronda de producción, y una sustancia capturada por afinidad (AM5®) de una ronda de producción. Una vez que la adsorción no específica se huno reducido (lavando con PBS), la columna de afinidad se colocó en línea con una columna en fase reversa y los componentes capturados se transfirieron mediante elución con ácido diluido. Estos componentes fueron resueltos con posterioridad eluyendo la columna en fase reversa con un gradiente de acetonitrilo somero. La detección fue realizada mediante medición de la absorbancia a 280 nm, y el anticuerpo intacto fue cuantificado mediante comparación con las áreas del pico de patrones tratados de un modo similar.

G. Identificación de picos del cromatograma

Este análisis resolvía los fragmentos anti-CD18 en los cinco picos relacionados con el anticuerpo, que representan los siguientes fragmentos de anticuerpo:

Pico 1: LC-115 (producto de degradación de 115 aminoácidos de la cadena ligera kappa)

Pico 2: cadena ligera libre y cadena ligera con glutatión desensambladas

Pico 3: dímero de cadena ligera

Pico 4: fragmento de tipo Fab

Pico 5: fragmento Fab'2-LZ o Fab'2

Se utilizó como patrón una sustancia de liberación de F(ab)'2 anti-CD18 a granel purificada. Un extracto de E. coli derivado de una fermentación de elevada densidad celular de 49A5/pS1130 fue congelado a -70ºC y utilizado como control positivo. La misma masa celular fue cargada para todas las muestras comparadas.

H. Análisis en fase reversa HC/LC POROS® total

Para evaluar la cantidad total de fragmentos de cadena ligera y de cadena pesada producida en las fermentaciones, se utilizó un análisis HPLC en fase reversa alternativo (RP-HPLC). Para la expresión de anticuerpo total se añadieron 100 \mul de caldo completo a 100 \mul de TRIS pH 8,0 0,2 M. Tras someter a sonicación durante 10 pulsos, se añadieron 650 \mul de guanidina-HCl/TRIS 50 mM, pH 9 y 50 \mul de DTT 2 M y se incubaron a la temperatura ambiente durante 15 minutos. Antes de cargar la columna, se añadieron 200 \mul de acetonitrilo y se filtraron a través de una columna de centrifugación de exclusión por tamaños (Pharmacia). Se analizaron 5 \mul de esta suspensión mediante análisis en fase reversa POROS®.

Para la metodología en fase reversa, se utilizó HEWLETT-PACKARD® 1100 HPLC con una columna en fase reversa POROS® R-1. Los análisis se hicieron funcionar con la columna calentada a 60ºC, y se controló la absorbancia de UV a 278 nm. La columna fue equilibrada en una solución de acetonitrilo en agua al 28% con ácido trifluoroacético al 0,1%. A continuación se cargaron 25 \mul de muestra en la columna, y se realizó la elución utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo del 28% al 38% a lo largo de 20 minutos, seguido de un período de regeneración de 17 minutos con acetonitrilo al 95% y re-equilibrado con acetonitrilo al 28%. Los picos para las especies relacionadas con la cadena ligera y la cadena pesada fueron identificados mediante comparación con patrones y análisis utilizando un detector de selección de masas HEWLETT-PACKARD® para la confirmación. De un modo similar se prepararon y analizaron muestras de fermentación de un blanco realizado con el mismo huésped que se había utilizado excepto por un plásmido que no contenía las secuencias para la cadena pesada y la cadena ligera para determinar las líneas base apropiadas para los análisis. La integración de las áreas de los picos fue realizada utilizando el soporte lógico HEWLETT-PACKARD® 1100, y los patrones fueron aplicados en las muestras realizadas con blancos para generar una curva de calibración con el fin de determinar la cantidad relativa de las diversas especies en las muestras.

Para las muestras solubles se prepararon productos lisados como para el análisis de intercambio iónico. Típicamente, se diluyeron 100 \mul de muestra con 650 \mul de guanidina-HCl 6 M, TRIS-HCl 50 mM, pH 9. Después se añadieron 50 \mul de ditiotreitol 2 M (recién descongelado), seguido de 200 \mul de acetonitrilo, seguido de filtración con un filtro de 0,2 \mum antes de cargar en la HPLC.

Las muestras de producto lisado insoluble también fueron analizadas de un modo similar resuspendiendo los sedimentos insolubles, lavados con PBS obtenidos tras la extracción celular en 100 \mul de TRIS pH 8,0 0,2 M y mezclando bien. Después se añadieron 650 \mul de guanidina-HCl 6 M/TRIS-HCl 50 mM, pH 9, 50 \mul de DTT 2 M, y 200 \mul de acetonitrilo. Las muestras fueron filtradas después, y 10 \mul de las muestras filtradas fueron analizados utilizando el mismo método que para las muestras de producto lisado soluble.

I. Análisis CSX

La digestión del Fab'2 LZ anti-CD18 fue analizada mediante cromatografía de intercambio catiónico HPLC. Específicamente, las muestras fueron diluidas al menos 1:1 y 250 \mul fueron cargados sobre una columna de 5 x 4,6 mm de carboxi-sulfona (CsX) BAKERBONDJ® (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) mantenida a 55ºC sobre un sistema de HPLC Hewlett-Packard 1090. Las muestras fueron eluidas utilizando un gradiente de fosfato de sodio de aproximadamente 5 a 50 mM (pH 7,0) a lo largo de 14 minutos, y los picos fueron controlados utilizando una absorbancia de UV a 278 nm. El pico que contenía Fab'2-cremallera de leucina anti-CD18 fue identificado y cuantificado mediante la comparación con patrones purificados.

J. Construcciones de líneas celulares

Los huéspedes utilizados en la fermentación rhuFab'2 LZ (xCD18) son derivados de E. coli W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: Amerizan Society for Microbiology, 1987), págs. 1190-1219), y son denominados como sigue: 49A5, 58D3, 59A7, 43H1, 58H2, 45F8, 41H1, y 33D3. La Figura 5 representa un diagrama de la derivación de las cepas de E. coli 59A7, 49A5, y 43H1.

1. Cepa 49A5

El genotipo completo de 49A5 es \DeltafhuA phoA \DeltaE15\Delta(argF-lac)169 deoC2 degP41(\DeltapstI-Kan^{r})IN(rrD-rrE)I ilvG2096 (Val^{r}) \DeltafucP \DeltamalE. La cepa de partida, E. coli W3110, es un derivado de E. coli K-12 que es F'- y lambda-menos. Se ha demostrado que porta una inversión del cromosoma entre rrnD y rrnE (Bachmann, supra; Hill y Harnish, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7069-7072 (1981)). El gen fhuA (denominado previamente tonA) fue suprimido de W3110 mediante la separación por corte impreciso de Tn10 tras su inserción en el gen fhuA. La cepa resultante, 1A2, es resistente al bacteriófago T1, T5 y o80.

Las dos mutaciones por deleción, phoA \DeltaE15 (Sarthy A. y col., J. Bacteriol. 145:288-292 (1981)) y \Delta(arg-lac)169 (Schweizer y col., Mol. Gen. Genet., 192:293-294 (1983)), fueron introducidas simultáneamente en la cepa 1A2 mediante transducción simultánea con P1 con una inserción Tn5 conectada en el gen proC. La separación por corte precisa del transposón restauraba el gen proC. La mutación phoA \DeltaE15 elimina la expresión de la fosfatasa alcalina, y la mutación \Delta(argF-lac)169 es responsable del fenotipo lac de esta cepa, que se denomina 7C1.

La mutación deoC2, que eliminaba la expresión de la desoxirribosafosfato aldolasa, fue introducida mediante transducción simultánea con P1. El locus deoC está unido genéticamente al locus biosintético de la treonina. Se creó un auxótrofo para la treonina mediante inserción de Tn10 y separación por corte imprecisa. El auxótrofo para la treonina fue transducido después a prototrofia para la treonina para el fago P1, desarrollado sobre un mutante deoC2. La presencia de la mutación deoC2 fue confirmada mediante la incapacidad de la cepa resultante 16C9, para desarrollarse sobre timidina al 0,2% como fuente de carbono.

La mutación degP41(\DeltaPstI-Kan^{r}), una mutación en el gen para la proteasa periplásmica, fue introducida mediante transducción. Esta mutación fue construida in vitro remplazando una sección del gen degP por un gen de resistencia a la kanamicina (Strauch y Beckwith, J. Bacteriol., 171:2689-2696 (1989)). Este no es un transposón, pero permite la selección de la deleción utilizando la resistencia a la kanamicina. La cepa resultante se denomina 23E3.

La mutación ilvG2096 (Val') (Lawther y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 922-925 (1981)) fue introducida mediante homogenotización. Esta mutación repara un desplazamiento del marco que hace que E. coli K-12 de tipo salvaje sea sensible a la valina. La cepa 23E3 fue transformada con el plásmido pAH29 (Lawther y col., supra) conteniendo el marcador ilvG2096 (Val^{r}) y un gen de resistencia a la ampicilina. Una cepa denominada 33B6, que había perdido espontáneamente el plásmido y que había adquirido el alelo deseado, fue identificada rastreando los clones sensibles a ampicilina para la resistencia a valina.

Finalmente, se introdujeron dos mutaciones en la ruta de utilización de carbohidratos para permitir distinguir este huésped de otros huéspedes recombinantes mediante un simple ensayo de utilización de carbohidratos. Las mutaciones por deleción de fucP y malE fueron construidas mediante PCR y fueron incorporadas por separado al vector plasmídico conteniendo beta-lactamasa y sacarosa levan (Bass y col., supra). Cada plásmido completo fue recombinado en el cromosoma de un derivado W3110 que podría no apoyar la replicación independiente del vector plasmídico (Bass y col., supra). La cepa 33B6 fue transducida después para la resistencia a carbenicilina con un fago P1 desarrollado sobre el derivado W3110 que portaba el plásmido de deleción de fucP integrado en su cromosoma. Los derivados que ya no expresaban la sacarosa Levan y por lo tanto resistentes a sacarosa fueron seleccionados y rastreados en cuanto a la pérdida de resistencia a la carbenilicina y la incapacidad para utilizar fucosa. Se confirmó que la cepa resultante, 49B2, portaba la deleción fucP planeada utilizando la PCR.

Estas etapas fueron repetidas para incorporar la deleción malE. La cepa 49B2 fue transducida para la resistencia a la carbenicilina utilizando el fago P1, y desarrollada sobre la cepa que portaba el plásmido de deleción de malE integrado en su cromosoma. Los derivados resistentes a sacarosa fueron seleccionados y rastreados en cuanto a la pérdida de resistencia a la carbenilicina y a la incapacidad para utilizar maltosa, y la presencia de la deleción malE fue confirmada mediante PCR.

Entre las características importantes de la cepa 49A5 se incluyen las siguientes:

\bullet

Es resistente al fago T1.

\bullet

No sobreproduce fosfatasa alcalina, cuando el fosfato se agota (que es la condición utilizada para inducir la síntesis del producto)

\bullet

Carece de proteasa

\bullet

No es susceptible a la toxicidad por valina

\bullet

Se puede distinguir de otros huéspedes mediante un ensayo de utilización de carbohidratos.

2. Cepa 58B3

La cepa 58B3 también derivaba de la cepa 33B6. El genotipo \Deltaprc::pS1080 (Bass y col., supra; Metcalf y col., Gene, 138:1-720 (1994)) fue introducida en un derivado kan^{s} de la cepa 33B6 (56G4) mediante transducción con P1, seleccionando las colonias que no crecían bien sobre LB de fuerza media con bajo contenido de sal a 42ºC. La cepa kan^{s} porta la deleción degP derivada de pKS16 (Strauch y Beckwith, 1989, supra), dando como resultado un fenotipo sensible a la kanamicina. Por lo tanto, la cepa 58B3 es una cepa kan^{s} que porta la deleción degP y prc.

El genotipo completo de la cepa 58B3 es W3110 \DeltafhuA phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)I Kan^{s} ilvG2096 (Val^{r}) \Deltaprc.

3. Cepa 59A7

Esta cepa es construida introduciendo el supresor Prc (mutante Spr) en la cepa 58B3. El producto lisado con el fago P1 de la cepa 51B9 (tonA prc prc sup zeg722::Tn10) fue transducido en la cepa 58B3 seleccionando las colonias resistentes de tet y rastreando el fenotipo supresor Prc (creciendo bien sobre Lb de fuerza media con bajo contenido de sal a 42ºC). La nueva cepa se denomina 58F1. El mutante \Deltaprc no puede sobrevivir a 42ºC. El gen de resistencia a tetraciclina fue separado de 58F1 cultivando en placa sobre placas de Malloy, lo que daba como resultado una cepa sensible a tet^{s}, denominada 59A7. El genoma completo de la cepa 59A7 es W3110 \DeltafhuA phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)I Kan^{s} ilvG2096 (Val^{r}) \Deltaprc sprW148R.

La cepa 51B9 original tiene un supresor Prc Spr, que portaba una mutación puntual W148R, la misma que Spr en las cepas 43H1 y 59A7.

4. Cepa 43H1

El genotipo completo de la cepa 43H1 es muy similar al de 49A5: W3110 \DeltafhuA phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 degP41 (\DeltapstI-Kan^{r}) IN(rrD-rrE)I ilvG2096 (Val^{r}) ptr3 \DeltaompT prc::kanr sprW148R. Esta porta tres marcadores más de proteasa que 49A5, Ptr3 OmpT y Prc. Esta cepa tiene la mutación puntual (W148R) en Spr. Es Kan^{r}.

5. Cepa 58H2

La cepa 43H1 fue transducida a tet^{r} con el fago P1 desarrollado sobre la cepa 42E3. Esta cepa (58F9) fue reparada para la mutación prc::kan^{r}; por lo tanto, se volvió kan^{s}. Esta cepa fue cultivada en placa después sobre medio de ácido glucurónico mínimo para separar el eda::Tn10. La nueva cepa creada, 58H2, es kan^{s} y se vuelve un mutante triple para proteasa con prc de tipo salvaje. El genotipo completo de la cepa 58H2 es W3110 \DeltafhuA phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 degP41(\DeltapstI-Kan^{r}) IN(rrD-rrE)I ilvG2096 (Val^{r}) ptr3 \DeltaompT sprW148R.

6. Cepa 45F8

El genotipo completo de la cepa 45F8 es W3110 \DeltafhuA \Delta(argF-lac)169 degP41 Kan^{s}\DeltaompT ptr3 ilvG2096 (Val^{r})phoS* (T104). Esta es una cepa phoS con marcadores triples de proteasa.

7. Cepa 41H1

El genotipo completo de la cepa 41H1 es W3110 \DeltafhuA phoS* (T104) \Delta(argF-lac)169 degP41 (\DeltapstI-Kan^{r}) ptr3 ilvG2096 (Val^{r}) adaptado a T a 37ºC. Esta es una cepa phoS con marcadores proteasa duales.

8. Cepa 33D3

El genotipo completo de la cepa 33D3 es W3110 \DeltafhuA ptr3 lacIq lacL8 \DeltaompT degP41 (\DeltapstI-kan^{r}). Se puede encontrar una descripción de la construcción, v.g., en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.789.199.

K. Cultivos en matraz con sacudimiento y de fermentación

Para el experimento en matraz con sacudimiento, se utilizaron caldo Luria-Bertani (LB) y medio mínimo C.R.A.P. con 5 \mug/ml de antibiótico AMPICILLINE®. El medio mínimo C.R.A.P. fue preparado como sigue: se mezclaron 3,57 g (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g de NaCitrato-2H_{2}O, 10,7 g KCl, 5,36 g de extracto de levadura, y 5,36 g de HYCASE SF-SHEFFIELD®, el pH se ajustó con KOH a 7,3, y el volumen se ajustó a 872 ml de con agua desionizada. Esta mezcla fue sometida a autoclave y enfriada a 55ºC. Se añadieron 110 ml de tampón MOPS 1 M a pH 7,3, 11 ml de glucosa al 50%, y 7,0 ml de MgSO_{4} 1 M.

El procedimiento de fermentación de E. coli empleado aquí fue un procedimiento de elevada densidad celular como se ha definido antes. Para alcanzar densidades celulares superiores, se añadió amoníaco continuamente, y se añadieron nutrientes secundarios adicionales (P, K, S, y Mg) en ciertas fases de la fermentación para soportar el crecimiento celular. La disminución de la cantidad de nutrientes daba como resultado otro procedimiento que tenía una densidad óptica final inferior del caldo con igual calidad de producto, lo que es referido aquí como procedimiento de baja densidad celular.

Un único vial conteniendo 1,5 ml de cultivo en DMSO al 10-15% fue descongelado en un matraz con sacudimiento de 1 litro conteniendo 500 ml de medio LB suplementado con 0,5 ml de solución de tetraciclina (5 mg/ml) y 2,5 ml de solución de fosfato de sodio 1 M. Este cultivo de siembra fue desarrollado durante aproximadamente 16 horas a 30ºC y después fue utilizado para inocular un fermentador de 10 litros.

El fermentador comenzaba inicialmente con 6,5 litros de medio conteniendo aproximadamente 4,4 g de glucosa, 100 ml de sulfato de magnesio 1 M, 10 mL de una solución de elementos vestigiales (100 ml de ácido clorhídrico, 27 g de cloruro férrico hexahidratado, 8 g de sulfato de cinc heptahidratado, 7 g de cloruro de cobalto hexahidratado, 7 g de molibdato de sodio dihidratado, 8 g de sulfato cúprico pentahidratado, 2 g de ácido bórico, y 5 g de sulfato de manganeso monohidratado, en un volumen final de 1 litro), 20 ml de solución de tetraciclina (5 mg/ml en etanol), 10 ml de FERMAX ADJUVANT 27® (o algún equivalente anti-espuma), 1 bolsa de sales HCD (37,5 g de sulfato de amonio, 19,5 g de fosfato de potasio dibásico, 9,75 g de fosfato de sodio monobásico dihidratado, 7,5 g de citrato de sodio dihidratado, y 11,3 g de fosfato de potasio monobásico), y 200 g de NZ Amine A (un producto hidrolizado de proteína). Las fermentaciones fueron realizadas a 30ºC con 10 slpm de flujo de aire y fueron controladas a un pH de 7,0 \pm 0,2 (aunque en algunos casos se producían excursiones ocasionales más allá de este intervalo). La contrapresión del fermentador y la tasa de agitación fueron variadas para manipular la velocidad de transferencia de oxígeno en el fermentador, y, con posterioridad, para controlar la tasa de respiración
celular.

Tras la inoculación del fermentador con el medio que contenía las células del matraz con sacudimiento, el cultivo se hizo crecer en el fermentador hasta elevadas densidades celulares utilizando un algoritmo basado en el ordenador para introducir una solución de glucosa concentrada en el fermentador. Asimismo se introdujeron en el fermentador hidróxido de amonio (solución al 58%) y ácido sulfúrico (solución al 24%) según fuera necesario para controlar el pH. También se utilizaron nuevas adiciones de agente anti-espuma en algunos casos para controlar la formación de espuma. Cuando el cultivo alcanzaba una densidad celular a DO550 de aproximadamente 40, se añadían 100 ml más de sulfato de magnesio 1 M al fermentador. Adicionalmente, se inició un aprovisionamiento de sal concentrada (que constaba de aproximadamente 10 g de sulfato de amonio, 26 g de fosfato de potasio dibásico, 13 g de fosfato de sodio monobásico dihidratado, 2 g de citrato de sodio dihidratado y 15 g de fosfato de potasio monobásico en 1 litro de agua) en el fermentador a una velocidad de 2,5 ml/minuto cuando el cultivo alcanzaba una DO550 de aproximadamente 20 y continuó hasta que se añadieron aproximadamente 1250 ml a la fermentación. Las fermentaciones continuaron típicamente durante 72-80 horas.

Durante la fermentación, una vez se hubo alcanzado el punto de ajuste de oxígeno disuelto para la fermentación, se introdujo la solución de glucosa concentrada basándose en la señal de la sonda de oxígeno disuelto para controlar la concentración de oxígeno disuelto en el punto de ajuste. Por consiguiente, en este esquema de control, las manipulaciones de los parámetros que operaban en el fermentador tales como la tasa de agitación o la contrapresión, que afectan a la capacidad de transferencia del oxígeno en la fermentación, manejaban correspondientemente la velocidad de absorción de oxígeno o la tasa metabólica de las células.

Se utilizó un espectrómetro de masas para controlar la composición del gas evacuado de la fermentación y permitió el cálculo de las tasas de absorción de oxígeno y de evolución de dióxido de carbono en la fermentación.

Cuando el cultivo alcanzó una densidad celular a una DO550 de aproximadamente 220, se hizo disminuir la agitación desde una tasa inicial de 1000 rpm a aproximadamente 725 rpm a lo largo de aproximadamente 12 horas.

Para la fermentación de las células transformadas con pMS421 y pcyc34 (donde se utilizó el promotor tacII para controlar la expresión de la cadena pesada y ligera), o de las células transformadas con pMS421 y el plásmido promotor dual pxCD18-7T3 (donde se utilizó el promotor tacII para controlar la expresión de la cadena pesada), se añadieron 50 ml de IPTG 200 mM aproximadamente 12 horas después de que el cultivo alcanzara una densidad celular a DO550 de 220 para inducir la síntesis de la cadena pesada y ligera para pcyc34 y la síntesis de la cadena pesada para pxCD18-7T3.

Resultados A. Productos de escisión de la cadena ligera kappa descubiertos e identificados

Los extractos de E. coli solubles (ver HSE en Materiales y Métodos) y los sedimentos restantes, suspendidos en tampón de muestra SDS (un producto comúnmente asequible comercialmente para desarrollar un gel de SDS) fueron analizados mediante SDS-PAGE. Las muestras derivaban de sedimentos con una DO por ml de 20 recogidos durante la fermentación de elevada densidad celular de E. coli (HCD) en la cepa 49A5 que portaba el plásmido pS1130 para la producción de rhuF(ab)' 2LZ (xCD18). En la fracción soluble se identificó el fragmento de escisión LC kappa, de 115 aminoácidos de longitud. En la fracción insoluble se identificó el fragmento de escisión LC kappa, de 182 aminoácidos de longitud. Todos los fragmentos fueron transferidos a una membrana de PVDF y secuenciados. Ambos tenían el extremo N correcto como las formas procesadas de LC kappa. Las masas determinadas mediante análisis espectrométrico de masas fueron 12.488,5 y 19.857,2, respectivamente. Los sitios para la escisión proteolítica estaban entre los restos Val 115 y Phe 116 para LC 115 y entre los restos Ser 182 y Lys 183 para LC 182. Solamente un sitio parecía un sitio de recorte de Prc típico.

Otro sedimento de E. coli con una DO por ml de 20 al final de esta fermentación fue analizado mediante electroforesis bidimensional. El producto lisado celular de E. coli del sedimento (\sim40 \mug de proteína) fue combinado con la solución de rehidratación como describen Champion y col., supra. En el patrón del gel de 2D de las células derivadas de la fermentación 49A5/pS1130, las aplicaciones específicas de la cadena ligera kappa fueron identificadas comparando el gel de producción con un gel de 2D blanco derivado de los sedimentos celulares de una fermentación (49A5/pBR322) en un momento similar. Los sedimentos fueron seleccionados del mismo momento de dos fermentaciones, suponiendo que las células deben estar en estados metabólicos comparables. Todas las aplicaciones LC kappa fueron identificadas mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpo anti LC kappa humana conjugado con fosfato alcalino.

Además de los dos recortes principales identificados mediante análisis en gel de 1D, el gel de 2D mostraba una LC intacta, una isoforma de LC intacta, y al menos 5 recortes más de LC secundarios (Ver la Figura 6). Las correspondientes aplicaciones fueron eluidas y secuenciadas. Todos los péptidos específicos de LC tenían el extremo N correcto, indicando que todos están bien procesados estando escindida la señal STII. Todos estos péptidos fueron analizados mediante espectrometría de masas para medir la masa aproximada. Debido a la cantidad vestigial de recortes secundarios presentes, no se podía obtener una masa correcta para determinar los sitios de recorte de esos fragmentos.

Tres recortes secundarios se agrupaban con el recorte de LC 115 kappa a un valor de pI de alrededor de 9. El cuarto tenía un valor de pI de alrededor de 6,5 y el quinto tenía el mismo valor de pI que el recorte de LC 182 a un pI de aproximadamente 6. Para decidir la solubilidad de estos fragmentos de LC, se cargó una HSE de un sedimento idéntico sobre un gel de 2D. El fragmento LC182 solamente existía en la fracción insoluble.

B. Prc es la única proteasa responsable de la escisión de la cadena ligera kappa

Los geles de SDS-PAGE 1D cargados con la fracción insoluble de células derivadas de diferentes fermentaciones de mutantes de proteasas de E. coli, 49A5, 45F8, 41H1, y 43H1, que expresaban la molécula Fab'2 LZ anti-CD18 fueron comparados. La escisión proteolítica de LC-182 estaba presente en tres de las cuatro muestras (no en la cepa de deleción de prc 43H1), indicando que la proteasa Prc podría estar implicada en la escisión de LC kappa. El pico 1, que corresponde al recorte de LC 115, presente en las muestras derivadas de la cepa 49A5 (prc más), también desaparecía de las muestras derivadas de 43H1 cuando se comparaban los cromatogramas resueltos por el análisis en columna dual AME5®/RP. Este análisis adsorbía selectivamente las especies de anticuerpos que contenían LC kappa y después las resolvía en cinco picos como se ha descrito antes en la sección Materiales y Métodos.

Cuando el gel 2D de los sedimentos celulares derivados de 43H1 era analizado, se encontraba que no solamente los fragmentos LC 115 y LC 182 desaparecían del gel, sino que también desaparecían todas las otras especies secundarias relacionadas con LC (ver la Figura 7). Este resultado sugiere firmemente que Prc es la única enzima responsable de las escisiones de LC kappa. Este sedimento celular 43H1 estaba derivado de una fermentación de baja densidad celular.

C. Construcción de la cepa para confirmar que Prc es la única enzima implicada en la escisión de la cadena ligera kappa 1. Una cepa con deleción de prc para que se vuelva prc más

La prueba de que Prc es la única enzima implicada en la escisión de LC kappa fue obtenida reparando la cepa 43H1 (un huésped prc menos con marcadores proteasa cuádruples) para que se volviera una cepa triple proteasa prc más (58H2). Una cepa 42E3 porta eda-51::Tn10, que es traducible simultáneamente con prc. La cepa 43H1 fue transducida a tet^{r} con el fago P1 desarrollado sobre 42E3. La cepa resultante (58F9) fue reparada para la mutación prc::kan^{r}, por lo tanto, se vuelve kan^{s}. Esta cepa fue cultivada en placa después sobre un medio de ácido glucurónico mínimo para separar eda::Tn10. La nueva cepa creada, 58H2, se volvía un mutante triple proteasa con prc de tipo salvaje. Este producto aislado es o bien un transductante o bien un producto aislado Eda^{+} espontáneo. El genotipo prc más fue confirmado mediante PCR. Esta cepa 58H2 todavía porta el supresor prc (spr^{wt48R}) derivado de 43H1, y es kan^{s}. La reaparición del recorte de LC en esta cepa 58H2 fue detectada mediante análisis en columna dual AME5®/RP (ver la Figura 8).

2. El gen prc fue suprimido de una cepa natural para volverla prc menos

La cepa 49A5 era una cepa de tipo salvaje prc como se ha descrito antes. Cuando se introducía la deleción de prc en este fondo de la cepa para construir la cepa 58B3 y los extractos celulares se analizaban mediante el método en columna dual AME5®/RP, el recorte de LC 115 (Pico 1) desaparecía. La cepa 58B3 derivaba de la cepa 33B6, que porta solamente un marcador proteasa, DegP. Se introdujo \Deltaprc::pS1080 (Bass y col., supra; Metcalf y col., supra) en un derivado kan^{s} de 33B6 (56G4) mediante transducción con P1 para crear una cepa degP \Deltaprc proteasa dual, 59A7.

En la Tabla 1 se muestra un compendio de los resultados de escisión para las siete cepas.

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Huésped E. coli	Marcador Proteasa	Degradación LC
49A5	DegP	+
45F8	DegP Ptr3	+
41H1	DegP Ptr3 OmpT	+
43H1	DegP Ptr3 OmpT \DeltaPrc Spr^{wt48R}	-
58H2	DegP Ptr3 OmpT Spr^{wt48R}	+
58B3	DegP \DeltaPrc	-
59A7	DegP \DeltaPrc Spr^{wt48R}	-

D. Mejora del rendimiento de rhuFab'2 LZ (xCD18) en huéspedes prc menos 1. Resultados del matraz con sacudimiento

Tres cepas (49A5, 43H1, y 58H2) que expresaban rhuFab'2 LZ (xCD18) fueron desarrolladas primero en caldo LB + Amp durante la noche a 30ºC. Después todos los cultivos fueron inoculados igualmente en matraces con sacudimiento que contenían 25 ml del medio mínimo C.R.A.P. + Amp y se continuaron sacudiendo durante la noche a 30ºC. Se recogieron los sedimentos de DO por ml de 20 para elaborar los productos lisados solubles (HSE). Se cargaron 25 \mul de los 530 \mul en columnas AME5®/Fase Reversa.

En la Figura 8 se muestra un diagrama de barras que representa los cinco picos resueltos por medio de este análisis. El eje de las Y es el área del pico específico de los picos 1 a 5 (ver Materiales y Métodos). El eje de las X muestra las cepas de producción de rhuFab'2 LZ (xCD18). Ambas cepas prc+, 49A5 y 58H2, producían cantidades casi iguales de producto, y ambas mostraban cantidades casi iguales de fragmento LC 115 (pico 1), en comparación con casi nada en el pico 1 y más producto en el pico 5 en la cepa \Deltaprc (43H1). Este gráfico mostraba el reparto de fragmentos de anticuerpo. Se observaban cantidades mayores de LC intacto y dímero LC, soluble en la cepa huésped 43H1 que en los huéspedes 49A5 y 58H2. En los matraces con sacudimiento el huésped prc- producía casi 5 veces más de producto rhuFab'2 LZ (xCD18) que las cepas prc naturales.

2. Resultados de la fermentación

El título de rhuFab'2 LZ (xCD18) medio obtenido mediante la fermentación de elevada densidad celular normalizada (HCD) era de 893 mg/litro en el huésped prc de tipo salvaje (49A5, n=6), basándose en el análisis en columna dual AME5®/RP. Se observaba una mejora del título próxima al doble a partir de la fermentación 43H1/pS1130. La diferencia espectacular entre los títulos en el matraz con sacudimiento (5x) y la fermentación (<o igual a 2x) para los huéspedes 43H1 y 49A5, respectivamente, era debida probablemente, sin estar limitado por ninguna teoría, a la diferencia en la eficacia de secreción de los productos. Cuando los productos lisados totales del sedimento del matraz con sacudimiento eran analizados, solamente el 50% de los fragmentos de anticuerpo eran correctamente procesados en el fondo prc-más, mientras el producto lisado derivado de las células del matraz con sacudimiento 43H1 o todas las células derivadas de la fermentación (prc más y menos) mostraban un procesamiento del 100%. Se encontró que el procesamiento de la proteína Prc era dependiente de secY, SecA (Hara y col., 1991, supra). Sin estar limitado a ninguna teoría, se cree que el resultado del matraz con sacudimiento demuestra que la proteína Prc competía con los fragmentos de anticuerpo para la translocación.

3. Se midió la expresión total de los fragmentos de anticuerpo

Se desarrolló un análisis en columna POROS® de muestras de fermentación en caldo completo como se describe en la sección Materiales y Métodos, para evaluar la eficacia del plegamiento y el ensamblaje del anticuerpo. Cuando se comparaban inyecciones iguales de muestras de caldo completo derivado de tres fermentaciones HCD anti-CD18 en diferentes huéspedes, se encontró que la fermentación de 43H1 expresaba una cantidad similar de HC como la fermentación de 49A5, pero una cantidad superior de LC kappa intacta (ver Tabla 2). El título de rhuFab'2 LZ (xCD18) era de 1830 mg/litro para 43H1 en comparación con los 887,8 mg/litro para 49A5. La fermentación de 59A7 no solamente producía fragmentos de anticuerpo extra, también producía el título más elevado de rhuFab'2 LZ (xCD18) a 2403 mg/litro.

TABLA 2 Expresión total de fragmentos de anticuerpo y títulos de Fab'2 LZ de diferentes cepas que expresan rhuFab'2 LZ (xCD18) mediante el procedimiento de fermentación HCD normalizado

Muestras De	Huésped	LC Total	HC Total	HC+LC Total	Fab'2 LZ	Tiempo
Fermentación		(g/l)	(g/l)	(g/l)	(mg/l)
1	49A5	2,23	2,27	4,5		40
2	''	4,75	3,96	8,71	887,8	72
3	43H1	6,57	4	10,57		62
4	''	7,38	4,18	11,56	1830	72
5	59A7	12,49	6,87	19,36		68
6	''	13,76	7,46	21,22	2403	72

E. El supresor Prc es requerido para la supervivencia en fase estacionaria

Se encontró que la cepa 58B3, que portaba las deleciones degP y prc, manifestaba lisis durante el crecimiento en fase estacionaria prolongada de una fermentación HCD que expresaba la molécula Fab'2 LZ anti-CD18. La lisis celular comenzaba a las 50 horas de la inoculación. Esta producía solamente 320 mg/l de rhuFab'2LZ(xCD18), mientras la fermentación 59A7/pS1130 mantenía un buen crecimiento en la fase estacionaria hasta las 72 horas de una fermentación HCD para alcanzar una elevada densidad celular (DO_{550} de aproximadamente 300 ml). La Figura 9 muestra la comparación del crecimiento de estas dos fermentaciones. Asimismo se encontró una expresión extra elevada tanto de los fragmentos HC como LC en este fondo de cepa, que incrementaba el rendimiento de la molécula rhuFab'2LZ (xCD18) a 2403 mg/l. De nuevo no se encontraron recortes en LC kappa en las muestras derivadas de las cepas de deleción de prc tanto de 58B3 como de 59A7.

El supresor prc (spr) (que codificaba Prc^{sup}) fue originalmente aislado de la cepa 40A6 (prc::kan spr) como una mutación espontánea, es decir, un revertiente termorresistente del mutante por deleción de prc. Una vez que el gen fue secuenciado y se hubo cartografiado la conjugación, se encontró que estaba localizado a aproximadamente 48 min sobre el cromosoma de E. coli. La secuencia de nucleótidos de su producto de PCR se emparejaba con el de el gen spr de E. coli¸ referido por Hara y col., 1996, supra, excepto por una mutación puntual en el aminoácido 148, en el cual el codón TGG se había cambiado a CGG, lo que daba como resultado el cambio de un resto triptófano por arginina (W148R). Este supresor prc cuando se introducía en la cepa 59A7 tenía la mutación W148R. Se informó de que el gen spr de tipo salvaje codificaba una lipoproteína en la fracción de la envuelta, que se sospechaba que era una enzima hidrolizadora de peptidoglicano (Hara y col., 1996, supra).

El supresor Prc fue introducido en la cepa 59A7 mediante un Tn10 conectado a este supresor, y se seleccionaron los co-transductantes que eran tanto resistentes a la tetraciclina como capaces de desarrollarse sobre una placa con bajo contenido de sal LB de fuerza media a 42ºC. La nueva mutación puntual se producía en el momento en el que Tn10 era separado mediante las placas de Malloy.

Basándose los resultados de la fermentación de Fab'2 anti-CD18 de las cepas 58B3 frente a 59A7, se demostró que el supresor Prc era requerido para un crecimiento con éxito de un mutante \DeltaPrc, especialmente en la fermentación en E. coli de elevada densidad celular. La cepa, denominada 58B3, porta exactamente el mismo genotipo que 59A7 excepto por spr (W148R), y podría no permanecer viable en una fermentación HCD normalizada después de 50 horas.

F. El mutante por deleción Prc puede incrementar diversos niveles de producción de anticuerpo debido a la localización de los sitios de recorte de Prc

En la Figura 10 se muestra la secuencia LC kappa humanizado (SEC ID NUM: 5). Los valores de pI calculados de los recortes de Prc potenciales se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3 Valores de pI Calculados de los Recortes de Prc Potenciales

Valor pI Calculado	Sitio de escisión	Tipo de proteasa	Recortes LC
5,97	S/K	Específico de serina	LC 182
9,14	V/F	Prc	LC 115
9,14	S/V	Específico de Serina	LC 114
9,14	V/A	Prc	LC 110

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Sin estar limitado a ninguna teoría, basándose en la Figura 10 y en la Tabla 3 se cree que la proteasa Prc comenzaba a recortar la LC kappa desde su extremo C, 9 o 18 aminoácidos en la secuencia de LC, y después gradualmente la masticaba hacia el extremo N para abrir el sitio S/K para que una proteasa específica de serina funcionara. Era posible que otra especie de LC kappa (posiblemente en un estado de plegado diferente) fuera escindida hasta 115 aminoácidos. Muchos productos de escisión potenciales tienen pesos moleculares y valores de pI calculados que están emparejados bastante bien con las aplicaciones de LC kappa encontradas en el gel 2D.

La Figura 11 muestra que la cepa de deleción de prc (43H1) eliminaba el recorte de LC 182 de las células que expresaban las moléculas Fab anti-VEGF Fab'2 LZ anti-CD18, Fab'2-LZ-6xHis anti-CD18 y las moléculas Fab'2-LZ-6xHis anti-factor tisular. Las muestras de fermentación derivadas de cab2826 (33B6/D3H44-F(ab')2) y cab2847 (43H1/D3H44-F(ab')2) eran fermentaciones de elevada densidad celular destinadas a expresar la molécula Fab'2 LZ-6xhis anti-factor tisular. El procedimiento de fermentación era el mismo procedimiento HCD normalizado como se ha descrito antes para las fermentaciones Fab'2 LZ anti-CD18. Cab2793 era la fermentación de 49A5/pAB3 destinada a expresar la molécula Fab'2 LZ-6xHis anti-CD18. Cab 2846 era la fermentación de 41H1/pS1130 destinada a expresar la molécula Fab'2 LZ anti-CD18. Las fermentaciones de JJ81 (43H1/pY0317) y JJ67 (43E7/pY0317) estaban destinadas a elaborar Fab anti-VEGF. Cab 2814 era la fermentación de (49A5/pBR322), blanco, que contiene el esqueleto plasmídico similar sin genes que expresen anticuerpos.

Los sedimentos de fermentación de DO 20 fueron extraídos con TRIS/EDTA/lisozima para separar los HSE solubles. Los sedimentos restantes fueron suspendidos en 400 \mul de tampón de muestra 1x SDS más 20 \mul de beta-mercaptoetanol, y después fueron calentados a 95ºC sobre un bloque térmico durante 5 minutos. Después se cargaron 5 \mul en el gel NUPAGE® al 4-12%. Las cepas 33B6, 41H1, 49A5, y 43E7 son cepas prc más. La cepa 43H1 era una cepa prc menos. Todas las muestras derivadas de la cepa prc natural tienen el producto degradado de LC de 19,8 kD. La muestra de fermentación de cab(33B6/pD3H44TB), que expresaba Fab anti-TF, también podía detectar el fragmento de degradación de LC del mismo tamaño. Se secuenciaron los aminoácidos de todos estos fragmentos y se encontró que tenían sus secuencias LC N-terminales correctas.

G. La cepa 59A7 muestra una expresión superior en los matraces con sacudimiento para Fab'2 LZ marcado con His y Lys anti-CD18 y para la proteína citoplásmica Apo2L

Los datos de los matraces con sacudimiento adicionales mostrados en la Tabla 4 indican que la cepa 59A7 expresaba pAB3 (el Fab'2 LZ marcado con His anti-CD18) mejor de lo que lo hacía la cepa 43H1 y 49A5. La cepa 59A7 expresaba pAB21 (Fab'2 LZ marcado con Lys) mejor de lo que lo hacía la cepa 33B6 en 2,4 veces. Las cepas 59A7 y 43H1 expresaban pS1130 (Fab'2 LZ sin marca) mejor que la cepa 49A5 en 2,9 veces. No obstante, los resultados de la fermentación siempre mostraban que la cepa 59A7 es mejor que la cepa 43H1 en la expresión de pS1130.

Para la proteína citoplásmica Apo2L que no es un anticuerpo, la actividad específica era aproximadamente un 20-30% superior cuando era expresada en la cepa 59A7 que en la cepa 43E7 (en matraces con sacudimiento). Puesto que la cepa 43E7 crecía a una DO550 superior, la expresión total era similar. La cepa 43E7 es una cepa ompT ptr3 degP sin pcr ni spr.

TABLA 4 Los títulos específicos superiores de diversas proteínas expresadas en 59A7 y otras cepas en cultivos en matraz con sacudimiento

Cepa	Marcadores	pS1130	pAB3	pAB21	Apo2L
	Proteasa
		mg/l/DO-ml	mg/l/DO-ml	mg/l/DO-ml	mg/l/DO-ml
33B6	DegP	N.A.	N.A.	0,33	N.A.
49A5	DegP	0,38	0,46	N.A.	N.A.
43H1	DegP Ptr3 OmpT	1,1	0,3	N.A.	N.A.
	Prc Spr^{wt48R}
59A7	DegP Spr^{wt48R}	1,1	0,7	0,8	14,4
					15,2
43E7	DegP Ptr3 OmpT	N.A.	N.A.	N.A.	12,2
					11,4

H. La cepa 59A7 muestra una expresión superior mediante fermentación para Fab'2 LZ anti-CD18

En la Tabla 5 se indica que la cepa 59A7 era superior a 33D3 al expresar Fab'2 LZ anti-CD18 a partir del plásmido promotor dual pxCD18-7T3 y superior a 49A5 al expresar Fab'2 LZ anti-CD18 a partir del plásmido pcyc34.

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TABLA 5 Títulos específicos más elevados de Fab'2 LZ anti-CD18 expresados en 59A7 en comparación con 33D3 y 49A5 utilizando dos plásmidos diferentes mediante fermentación

Cepa	Plásmidos	Título Fab'2 LZ anti-CD18
		mediante análisis CSX
		(mg/l)(Media)
33D3	pxCD18-7T3/pMS421	2.500
59A7	pxCD18-7T3/pMS421	4.000
49A5	pcyc34/pMS421	341,3
59A7	pcyc34/pMS421	2.067,1

Estudio

En este trabajo, se investigó la degradación de LC kappa en células de E. coli que expresaban la molécula Fab'2-LZ anti-CD18. Los estudios previos habían mostrado muchos sustratos de Prc potenciales, pero lo mejor de todo, es que nadie ha informado del descubrimiento de fragmentos de anticuerpo como sustrato de esta proteasa. Aquí se ha demostrado que la Prc es la única proteasa implicada en la escisión de LC kappa en las células de E. coli. La proteína Prc parecía escindir LC kappa selectivamente en sitios discretos, lo que daba como resultado dos recortes principales (LC 115 y LC 182) y cinco productos de escisión secundarios extra, como se observaba en los resultados del gel 2D. Puesto que uno de los recortes principales era un producto de escisión S/K, que no se ajustaba a las características de los sitios de recorte de Prc (Keiler y col., supra), esto fue investigado más detalladamente. Se ha descubierto ahora que la degradación de la cadena ligera kappa en las células de E. coli tiene que ver con una proteasa periplásmica de E. coli (Prc/Tsp). Los productos escindidos de la cadena ligera kappa fueron identificados mediante métodos analíticos (SDS PAGE 1D/2D, espectrometría de masas, y análisis de secuenciación N-terminal) de los extractos de E. coli derivados de diversas cepas proteolíticamente deficientes que expresan la molécula F(ab)'2 cremallera de leucina anti-CD18, para confirmar que Prc/Tsp es la única proteasa responsable de la escisión de la cadena ligera kappa.

Se encontró que la combinación especial de la deleción degP prc con un supresor prc (mutante spr) era una única cepa de E. coli capaz de producir cantidades muy elevadas de proteína recombinante o una actividad específica superior de la proteína, como se ejemplifica mediante el ligando Apo2 y el anticuerpo activo.

La fermentación utilizando la cepa degP prc spr da como resultado aquí un crecimiento de elevada densidad celular (a una DO de 300 o más) y la producción de elevados rendimientos de Fab'2 cremallera de leucina rhuxCD18 en comparación con la expresión de anticuerpos en la cepa de tipo salvaje u otras cepas proteolíticamente deficientes.

El procedimiento de fermentación aquí permite la producción de 100-200 g/l de peso celular seco en 72 horas con un incremento de más del 200% en el anticuerpo activo producido en una cepa 59A7 preferida, que tiene la combinación degP prc spr. El genotipo completo de la cepa 59A7 es W3110 \DeltafhuA phoA \DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 kan^{s} ilvG2096(Val^{r}) \Deltaprc spr^{wt48R}. Su cepa de origen es 58B3, que tiene idénticos marcadores genéticos que la cepa 59A7 excepto que no tiene el supresor prc, spr. La cepa 58B3 era incapaz de sostener el crecimiento en la fase estacionaria de un procedimiento de fermentación de elevada densidad celular de E. coli. Producía menos anticuerpo producto que una cepa prc natural (49A5), que también porta el marcador por deleción degP y otros genotipos idénticos a los de la cepa 59A7, excepto que 49A5 es una cepa natural prc resistente a la kanamicina, mientras 59A7 es una cepa \Deltaprc sensible a la kanamicina.

Por tanto, se ha descubierto en la presente que la presencia del supresor prc (spr) es esencial para el buen crecimiento y para un elevado nivel de producción de anticuerpo en una cepa de deleción degP prc, especialmente en un procedimiento de fermentación de elevada densidad celular, pero también en un procedimiento de fermentación de baja densidad celular.

El mutante de proteasa única DegP\Delta y otras múltiples cepas carentes de mútilples proteasas que incluían degP\Delta no producían un nivel extra elevado de productos recombinantes. Las dos cepas mencionadas antes, degP rpoH y degP prc, expresaban más producto que muchas otras cepas con las cuales se comparaban, pero no tanto como lo hacía la cepa 59A7. Más específicamente, sin el supresor spr, la cepa 58B3 con la combinación degP prc no mostraba ventaja alguna en la producción de fragmentos de anticuerpo, como ejemplifica la molécula Fab'2 LZ anti-CD18.

Los resultados analíticos son proporcionados para demostrar que la escisión de LC kappa en células de E. coli que expresan la molécula F(ab)'2-cremallera de leucina anti-CD18 humanizada tiene que ver con la proteína procesadora C-terminal (Prc). La proteína Prc es la única proteasa responsable de la escisión para la cadena ligera kappa, lo que era demostrado mediante electroforesis en gel bidimensional y mediante manipulación genética de las cepas de producción del anticuerpo. Para confirmar que la proteasa Prc es realmente la única enzima implicada en las escisiones de LC kappa, cuando se reparaba una cepa \Deltaprc a una cepa prc natural, los productos escindidos de LC kappa reaparecían. De un modo similar, cuando el gen prc era suprimido de una cepa prc natural, los productos escindidos de LC desaparecían. Ambas construcciones de cepas se realizaban mediante transducción con P1.

Adicionalmente se proporcionan comparaciones de los títulos de la molécula F(ab)'2-cremallera de leucina anti-CD18 derivada de mutantes proteolíticos de E. coli, con o sin deleción prc. Estos datos demostraron que la cepa 59A7 es un gran productor de expresión de anticuerpo. Se describen diversos ácidos nucleicos construidos para expresar la molécula F(ab)'2-cremallera de leucina anti-CD18; todos los plásmidos de expresión transformados en la cepa 59A7 producían elevadas cantidades de fragmentos de anticuerpo cuando se comparaban con un mutante de una única proteasa degP\Delta o un mutante degP prc sin spr. Otra cepa, 43H1, que tiene el genotipo degP prc spr además de las mutaciones ompP y ptr3, no crecían tan bien como la cepa 59A7, aunque la cepa 43H1 tiene la misma mutación spr que 59A7, en esa posición 520 contiene un cambio de T a C, dando como resultado un cambio del aminoácido W a R en la posición 148. Esto producía un Fab'2 LZ anti-CD18 con un título más elevado que el producido por la cepa degP (49A5), pero no tan alto como el producido por la cepa 59A7 en el fermentador.

Se informó de que la proteasa Prc escinde sus sustratos en un número discreto de sitios pero con una especificidad de secuencia bastante amplia (Keiler y col., supra). Se ha descubierto aquí que los sitios de escisión de Prc en el fragmento LC kappa están localizados en la región constante, que es la secuencia esqueleto comúnmente utilizada para construir diferentes plásmidos de expresión de anticuerpos humanizados. Basándose en los presentes resultados, se espera que el mutante por deleción de Prc mejore el título de diversos fragmentos de anticuerpo, tales como: Fab, Fab', Fab'2 (con o sin cremallera de leucina) incluyendo el anticuerpo completo, expresado en células de E. coli. También se espera que se beneficie el fragmento de anticuerpo flanqueado por una marca His o una marca Lys en el extremo C-terminal de HC.

Se encontró que la cepa 59A7 era superior a la cepa 49A5 al expresar pAB3 y era superior a la cepa 43E7 en la expresión específica de la proteína citoplásmica Apo2L en matraces con sacudimiento y superior a las cepas 43H1 y 49A5 en la expresión de pS1130 y pcyc34 (la contraparte del promotor tacII de pS1130) mediante fermentación. Adicionalmente, era superior a la cepa 33D3 en la expresión del plásmido con el promotor dual pxCD18-7T3.

Ejemplo 2

Materiales y métodos A. Plásmidos de expresión

El plásmido D3H44-F(ab')2 se describe en el Ejemplo 1.

El plásmido pY0317tet20 se describe en el Ejemplo 1.

B. Cepas

La cepa utilizada para la expresión de Fab xVEGF es similar a otras cepas descritas en el Ejemplo 1. Es un derivado de E. coli W3110 y se denomina 60C1. El genotipo completo de la cepa 60C1 es W3110 \DeltafhuA \Delta(argF-lac)169 ptr3 degP41 Kan^{s}\DeltaompT ilvG2096(Val^{r}) \Delta(nmpc-fepE) \DeltassrA. De un modo similar a la cepa 45F8, porta marcadores proteasa triples sin prc.

Las cepas 43H1, 59A7, y 33B6 se describen todas en el Ejemplo 1.

C. Método de cultivo

El cultivo en matraces con sacudimiento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. El crecimiento de los cultivos en matraz con sacudimiento que expresan la molécula Fab'2 LZ-6x his xTF fue ampliado a 42 horas a 30ºC, y se tomaron dos grupos de muestras en diferentes fases de crecimiento para su comparación. En la comparación de la expresión del Fab xVEGF, se desarrollaron cultivos por duplicado, y solamente se tomaron cada 24 horas.

D. Identificación de proteínas

La electroforesis en gel 2D se realizó como se describe en el Ejemplo 1.

Resultados

Los datos de los cultivos en matraces con sacudimiento se muestran en la Tabla 6 más abajo. Como resulta claro en el Ejemplo 1 para la producción de rhuFab'2LZ (xCD18), las cepas Prc- 43H1 y 59A7 eran superiores a las cepas Prc+ 60C1 y 33B6 en las cantidades de productos producidos (Fab' anti-VEGF y Fab'2 LZ-6xhis anti-factor tisular).

La Figura 12 es un gel 2D que muestra que la deleción prc (cepa 59A7, la cepa prc menos) que expresa Fab anti-VEGF (pY0317tet20) elimina toda la LC anti-VEGF degradada y dos fragmentos HC xVEGF (encontrados en la cepa prc más), aunque se descubrieron dos recortes de HC separados en 59A7, que son productos escindidos en OmpT o Ptr3. La Figura 13 es un gel 2D que muestra que la cepa 60C1 (cepa prc más) que expresa el Fab anti-VEGF (pY0317tet20) como polipéptido heterólogo contenía LC anti-VEGF múltiplemente degradada y dos fragmentos HC degradados.

TABLA 6 Datos de los Matraces con Sacudimiento que Comparan Fab xVEGF en Huésped prc+/- y la Expresión de Fab'2 LZ-6x his xTF en Huésped prc+/-

Cepa	Cultivo de 24h	Cultivo de 42h	Estado pst
	Fab anti-VEGF
	(mg/l/DO)
59A7/pY0317tet20	2,44		-
59A7/pY0317tet20	2,53		-
60C1/pY0317tet20	0,82		+
60C1/pY0317tet20	1,03		+
	Fab'2 LZ 6xhis anti-TF
	(mg/L/DO)
33B6/pd3h44f2	0,68	0,54	+
43H1/pd3h44f2	1,60	1,88	-
59A7/pd3h44f2	2,18	3,98	-

<110> Genentech, Inc.

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<120> CEPAS HUESPED BACTERIANAS

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<130> P1894R1 PCT

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<140> PCT/US01/47581

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<141> 2001-12-07

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<150> US 60/256,162

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<151> 200-12-14

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<160> 10

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<210> 1

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<211> 1951

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada.

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<400> 1

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1

2

3

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<210> 2

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<211> 491

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada.

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<400> 2

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4

5

6

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<210> 3

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<211> 1042

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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7

8

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<210> 4

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<211> 281

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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9

10

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<210> 5

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<211> 212

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada.

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<400> 5

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11

12

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<210> 6

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada.

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

agcttgtcgg ggagcgccat caccatcacc atcactaagc atg

\hfill

43

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<210> 7

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada.

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<400> 7

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cttagtgatg gtgatggtga tggcgctccc cgaca

\hfill

35

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<210> 8

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada.

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<400> 8

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agcttgtcgg ggagcgcaa aagaaaaaga aaaagtaagc atg

\hfill

43

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<210> 9

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Secuencia sintetizada.

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<400> 9

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cttacttttt ctttttcttt ttgcgctccc cgaca

\hfill

35

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<210> 10

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Secuencia sintetizada.

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<400> 10

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\sa{Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly}

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Claims (17)

1. Una cepa de E. coli carente de degP y prc cromosómicos que codifican las proteasas DegP y Prc, respectivamente, y que alberga un mutante del gen spr, el producto de cuyo gen suprime los fenotipos de crecimiento mostrados por las cepas que albergan los mutantes prc.

2. La cepa de la reivindicación 1, que no carece de ptr3 cromosómico que codifica la Proteasa III o de ompT cromosómico que codifica la proteasa OmpT.

3. La cepa de la reivindicación 1, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo para la cepa.

4. La cepa de la reivindicación 3, donde el polipéptido es proteolíticamente sensible.

5. La cepa de la reivindicación 3, donde el polipéptido es un polipéptido eucariótico; en particular donde el polipéptido es un polipéptido de mamífero.

6. La cepa de la reivindicación 3, que es transformada con el ácido nucleico.

7. Un método para producir un polipéptido que comprende (a) cultivar una cepa de E. coli carente de degP y prc cromosómicos que codifican las proteasas DegP y Prc, respectivamente, y que alberga un mutante del gen spr, el producto de cuyo gen suprime los fenotipos de crecimiento mostrados por las cepas que albergan los mutantes prc, cuya cepa comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido, que es heterólogo para la cepa, de manera que el ácido nucleico sea expresado, y (b) recuperar el polipéptido heterólogo de la cepa.

8. El método de la reivindicación 7, donde el polipéptido heterólogo es proteolíticamente sensible.

9. El método de la reivindicación 7, donde el cultivo tiene lugar en un fermentador, en particular donde el cultivo tiene lugar en condiciones de fermentación de elevada densidad celular, o donde el cultivo tiene lugar en condiciones de fermentación de baja densidad celular.

10. El método de la reivindicación 7, donde el polipéptido es recuperado del periplasma o el medio de cultivo de la cepa.

11. El método de la reivindicación 7, donde el polipéptido es un anticuerpo o ligando Apo2.

12. El método de la reivindicación 11, donde el polipéptido es un anticuerpo.

13. El método de la reivindicación 12, donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado; en particular donde el anticuerpo es un anticuerpo completo.

14. El método de la reivindicación 12, donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD18, anti-VEGF, anti-factor tisular, 2C4, anti-Her-2, anti-CD20, anti-CD40, o anti-CD11a.

15. El método de la reivindicación 12, donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

16. El método de la reivindicación 15, donde el fragmento de anticuerpo es una cadena ligera; en particular donde la cadena ligera es una cadena ligera kappa.

17. El método de la reivindicación 15, donde el fragmento de anticuerpo es Fab, Fab', Fab'2, o una fusión Fab'2-cremallera de leucina; en particular donde el fragmento de anticuerpo es una fusión Fab'2-cremallera de leucina anti-CD18, una fusión Fab'2-cremallera de leucina anti-factor tisular, o Fab anti-VEGF, con o sin una marca de histidina o lisina; en particular donde el fragmento de anticuerpo es una fusión Fab'2-cremallera de leucina anti-CD18, una fusión Fab'2-cremallera de leucina anti-factor tisular con una marca de 6 histidinas, Fab anti-VEGF, una fusión Fab'2-cremallera de leucina anti-CD18 con una marca de 6 histidinas, o una fusión Fab'2-cremallera de leucina anti-CD18 con una marca de 6 lisinas.