ES2269150T3 - Anticuerpos especificos anti gonadotropina corionica humana y su uso en terapia y diagnostico. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con un fragmento N-terminal de 21mer de beta-hCG- CTP37, denominado dicho fragmento beta-hCG-CTP21 y expuesto en la SEQ ID Nº: 4.

Description

Anticuerpos específicos anti gonadotropina coriónica humana y su uso en terapia y diagnóstico.

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-\beta-hCG humanos para inmunoterapia in vivo de cánceres asociados con la producción de gonadotropina coriónica humana (hCG). La invención se refiere adicionalmente a métodos y dispositivos para monitorizar y ajustar el régimen de tratamiento de pacientes, basándose en los resultados de una evaluación de la respuesta inmunitaria frente al fragmento C terminal de 37mer de \beta-hCG (\beta-hCG-CTP37) y fragmentos inmunogénicos del mismo.

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La vacunación es un medio para preparar el sistema inmunitario para reducir los síntomas de la enfermedad, evitar la transmisión horizontal de agentes infecciosos y reducir la mortalidad de la enfermedad. Se sabe bien que el sistema inmunitario de un sujeto generará una repuesta inmunitaria frente a xenoantígenos. También se sabe conferir inmunidad en un animal administrando un anticuerpo formado en otro lugar (es decir, inmunización pasiva).

Las vacunas habituales incluyen la administración de hidratos de carbono, péptidos, polipéptidos y polipéptidos glucosilados frente a los que se desea una respuesta inmunitaria (inmunización activa). Las alternativas a la administración de vacunas incluyen la administración de anticuerpos formados previamente frente a uno o más péptidos o polipéptidos (inmunización pasiva). Aunque los anticuerpos policlonales y monoclonales se producen fácilmente mediante técnicas habituales, hasta hace poco, la producción y purificación de composiciones de anticuerpos seguras ha sido relativamente cara y requería demasiado tiempo.

Históricamente, ha habido serias limitaciones al uso de procedimientos de inmunización pasiva para el tratamiento humano. Estas limitaciones son lo más evidentes en el tratamiento de enfermedades crónicas tales como el cáncer debido al coste de la producción de anticuerpos y al requisito de la administración prolongada de estos anticuerpos. Se encuentran dificultades adicionales cuando el inmunógeno es una proteína soluble o una proteína endógena que no se reconoce normalmente por el sistema inmunitario del sujeto.

Ciertos cánceres son sumamente resistentes al ataque por el sistema inmunitario de un huésped, incluso aunque en teoría el huésped debería preparar una respuesta inmunitaria frente al cáncer. Se cree que esta resistencia se debe a la capacidad del cáncer para interferir con la respuesta inmunitaria normal frente a las células cancerígenas, permitiéndolas así crecer y proliferar.

Normalmente, la gonadotropina coriónica (CG), por ejemplo, gonadotropina coriónica humana (hCG), se secreta por células de la placenta humana y blastocitos. Sin embargo, muchos cánceres humanos producen y retienen y/o secretan hCG en algún punto durante la carcinogénesis. Se ha detectado hCG en las membranas de una variedad de líneas celulares de cáncer humano (Acevedo, et al., 1992) y en el suero de pacientes con cáncer (Braunstein, 1990). De hecho, el péptido C-terminal de la subunidad beta de hCG (CTP) se expresa sumamente por una variedad de cánceres, y la inmunización con este constructo ha demostrado una actividad antitumoral en estudios preclínicos (Acevedo, et al., 1992; Acevedo et al., 1987).

Por ejemplo, se ha demostrado que hCG y/o sus subunidades están constituidas por células de cáncer de pulmón humano y que el polipéptido de hCG o partes de éste actúan como promotores del crecimiento autocrino para las células de los tumores. (Véase, por ejemplo, Rivera et al., 1989). Referencias adicionales también describen que la producción activa de anticuerpos anti-hCG en animales que llevan tumores puede resultar de la administración de una vacuna frente a hCG. (Véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.762.931 y la patente de los EE.UU. número 4.780.312).

Se han atribuido varias actividades biológicas asociadas con la capacidad de las células cancerígenas para proliferar a hCG, incluyendo; (1) una unión a la anergia tumoral (carencia de las respuestas inmunitarias frente a los tumores), (2) mejora del suministro de sangre tumoral, y (3) la observación de que la hCG actúa como factor estimulante del crecimiento para muchas células cancerígenas.

Los estudios epidemiológicos indican que los cánceres de pulmón humanos a menudo se asocian con la síntesis de hormonas, predominantemente gonadotropina coriónica humana (hCG). Los niveles circulantes aumentados de hCG y sus subunidades se utilizan a menudo como marcadores bioquímicos para el cáncer, y los niveles disminuidos de hCG se utilizan como marcadores para una intervención quirúrgica con éxito en tumores de pulmón humanos. Se ha detectado \beta-hCG libre y/o asociada al tumor en cánceres de vejiga, páncreas, cervicales, colorrectales, de pulmón, páncreas, esófago, mama, gástrico, de próstata, ovarios, útero, cervicales y endometriales, además de una mayoría de pacientes con tumores de células germinales. (Véase, por ejemplo, Dirnhofer, et al., 1998; Triozzi PL y Stevens VC, 1999). La hCG y otras hormonas gonadotrópicas también se han asociado con el sarcoma de Kaposi (KS, Fife, K y Bower, M, 1996).

El cáncer colorrectal es una enfermedad que mata a casi la mitad de los afectados en un plazo de 5 años desde el diagnóstico inicial y aproximadamente uno de cada 17 americanos desarrolla cáncer colorrectal durante su vida. La intervención quirúrgica no es una opción para la mayoría de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico avanzado. La quimioterapia inicial con fluorouracilo (5-FU) y leucovorina se ha vuelto el patrón para pacientes con cáncer de colon en fase III (NIH Consensus Conference. Adjuvant therapy for patients with colon and rectal cancer. JAMA 264 < 1444-1450, 1990; Glodberg RM y Erlichman C., Oncology 12: 59-63, 1998). El tratamiento para pacientes con cáncer colorrectal avanzado que no responde a 5-FU es actualmente irinotecan (Van Custem E y Bkijham GH. Semin Oncol 26: 13-20, 1999 y Cunningahm D et al. Lancet 352: 1413-1418, 1998). Múltiples nuevos enfoques al tratamiento de cáncer colorrectal avanzado incluyen: (a) nuevos fármacos tales como oxaplatino, capecitabina, uracilo/tegafur (UFT), (Punt CJ, Cancer 1998; 15: 679-689, 1998); (b) inmunoterapia pasiva usando un anticuerpo monoclonal, 17-1A (Punt CJ, 1998); y (c) varios enfoques a la inmunoterapia específica pasiva (ASI) con uno o más antígenos asociados a cáncer (Goydos JS et al, J Sur Res 1996; 63: 298-304 y Vermorken, JB et al. Lancet 1999; 353:
345-350).

Varias patentes del estado de Ohio concedidas a Stevens, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. números 4.767.842, 4.855.285, 5.817.753 y 5.698.201, incorporadas expresamente como referencia en el presente documento, describen el uso de un péptido modificado de beta-hCG/toxoide tetánico como una estrategia anticancerígena basada en una producción de anticuerpos frente a hCG por el huésped.

Aunque varios esfuerzos de investigación se han dirigido a mejorar métodos para el tratamiento de cánceres que expresan hCG, sigue habiendo una necesidad de un método eficaz y seguro para reducir o eliminar el nivel de CG circulante y CG asociado a células en pacientes con cáncer con tumores que expresan CG.

Por tanto, es un objeto general de la invención proporcionar agentes para la inmunoterapia de cánceres que expresan gonadotropina coriónica humana (hCG), o un epítopo inmunogénico de la misma.

La invención se refiere a una composición de anticuerpos monoclonales humanos específicamente inmunorreactivos con un fragmento N-terminal de 21mer de hCG-CTP37, denominado dicho fragmento \beta-hCG-CTP21 y expuesto en la SEQ ID Nº 4, sólo, o en combinación con un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con un fragmento C-terminal de 16mer de hCG-CTP37, denominado dicho fragmento \beta-hCG-CTP16 y expuesto en la SEQ ID Nº 6.

Tales composiciones de anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse en una disolución adecuada para inyección en un paciente humano y encontrar utilidad en inmunoterapia pasiva, particularmente inmunoterapia de cáncer.

En otra realización, la invención proporciona un método para clasificar la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG en un paciente, midiendo in vitro los niveles de anticuerpos anti-hCG del paciente específicos frente a \beta-hCG-CTP16, expuesto en la SEQ ID Nº 6; \beta-hCG-CTP21, expuesto en la SEQ ID Nº4; y \beta-hCG-CTP37, expuesto en la SEQ ID Nº 2, respectivamente, y clasificar al paciente dentro de uno de los siguientes cuatro grupos, dependiendo de los niveles de anticuerpos relativos, tal como sigue, (1) pacientes en los que no pueden detectarse ni los anticuerpos anti-CTP16 ni anti-CTP21, ni los anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 totales, denominados dichos pacientes pacientes que no responden con anticuerpos; (2) pacientes en los que pueden detectarse los anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 totales mientras que no pueden detectarse ni los anticuerpos primero ni segundo, denominados dichos pacientes pacientes que responden mal al tratamiento con anticuerpos; (3) pacientes que tienen un nivel detectable de primeros anticuerpos, pero niveles no detectables de segundos anticuerpos, denominados dichos pacientes pacientes que sólo responden con anticuerpo frente a CTP16; y (4) pacientes que tienen niveles detectables de anticuerpos tanto primeros como segundos, denominados dichos pacientes pacientes que responden con anticuerpos frente a CTP16 y CTP21.

Además, la invención proporciona un dispositivo de diagnóstico y método para monitorizar la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG, que incluye un péptido de \beta-hCG-CTP16, un péptido de \beta-hCG-CTP21, y un péptido de \beta-hCG-CTP37 junto con un medio de reactivos para marcar anticuerpos humanos que son inmunorreactivos con los péptidos y un notificador detectable.

Éstos y otros objetos y características de la invención se apreciarán más completamente cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención junto con los dibujos adjuntos.

La figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana (hCG) tal como se proporciona en GenBank con el número de registro 180437, denominada SEQ ID Nº 1.

La figura 2A representa los residuos 124-165 de la subunidad beta de hCG (péptido C-terminal, CTP, SEQ ID Nº 2).

La figura 2B representa el péptido C-terminal (CTP, SEQ ID Nº 3) de \beta-hCG, con una metionina N-terminal añadida.

La figura 2C representa los residuos 130-150 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de la hCG (epítopo C-terminal, CTP-21, SEQ ID Nº 4).

La figura 2D representa los residuos 131-138 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de la hCG (epítopo dentro de CTP-21, SEQ ID Nº 5).

La figura 2E representa los residuos 150-165 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de la hCG (epítopo N-terminal, CTP-16, SEQ ID Nº 6).

La figura 2F representa los residuos 150-165 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de la hCG (epítopo N-terminal con un C en N-terminal añadido, CTP-17, SEQ ID Nº 7).

La figura 2G representa los residuos 153-165 de la secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de la hCG (epítopo dentro de CTP-16, SEQ ID Nº 8).

La figura 2H representa los aminoácidos 58-77 de la subunidad beta, el péptido "bucle" ("loop") (SEQ ID Nº 9).

La figura 3 representa el nivel promedio de anticuerpos anti-\beta-hCG detectados en el suero de pacientes con cáncer colorrectal en un ensayo clínico de fase II durante de 0 a 24 semanas tras el inicio de la vacunación con el péptido C-terminal de \beta-hCG. Los pacientes recibieron una dosis o bien "alta" o bien "baja" de hCG. El grupo de dosis alta (círculos blancos) recibió una inyección inicial de 2,0 mg de CTP37-CT, con una inyección de refuerzo de 1,0 mg de CTP37-DT o bien a las 3 semanas o bien a las 4, seguido de una inyección de refuerzo de 1,0 mg de CTP37-DT cada 3 meses después de esto, y el grupo de dosis baja (círculos negros) recibió una inyección inicial de 0,5 mg de CTP37-DT, con una inyección de refuerzo de 0,5 mg de CTP37-DT o bien a las 3 semanas o bien a las 4, seguido de una inyección de refuerzo de CTP37-DT cada 3 meses después de esto.

La figura 4 representa el mayor área (cm^{2}) del tumor a lo largo de 0 a 24 semanas tras el inicio de la vacunación con CTP37, para pacientes con cáncer colorrectal en el grupo de dosis baja (círculos negros) y el grupo de dosis alta (círculos blancos), de un ensayo clínico de fase II, tal como se describió anteriormente para la figura 3.

La figura 5 representa la relación entre el nivel de anticuerpos anti-CTP37 séricos y el área (cm^{2}) del tumor para pacientes con cáncer colorrectal en un ensayo clínico de fase II a lo largo de 0 a 24 semanas tras el inicio de la vacunación con CTP37, tal como se describió para la figura 3.

La figura 6 representa la respuesta inmunitaria mediada por células de dos pacientes con cáncer colorrectal inmunizados con CTP37 (en un protocolo extendido del ensayo clínico de fase II, descrito anteriormente para la figura 3), con respecto a un sujeto no inmunizado normal. Se muestra la respuesta de proliferación de CMSP frente a varios antígenos (PHA, CTP-37, CTP-37-KI, DT y \beta-hCG).

La figura 7 representa la proporción de pacientes que sobreviven frente al tiempo de supervivencia para pacientes con cáncer colorrectal inmunizados con CTP37 (en un protocolo extendido del ensayo clínico de fase II, descrito anteriormente para la figura 3), y se caracteriza tal como sigue: (1) pacientes sin anticuerpo anti-CTP37 detectable en su plasma (diamantes negros); (2) pacientes con un nivel bajo de anticuerpo anti-CTP37 detectable en su plasma, tal que no pudo determinarse un nivel relativo de anticuerpos frente a CTP16 frente a CTP21 (triángulo blanco); (3) pacientes con anticuerpos anti-CTP37 y anticuerpos anti-CTP16 detectables, pero sin anticuerpos anti-CTP21 detectables en su plasma (cuadrados negros); y (4) pacientes que tienen anticuerpos anti-CTP37, anti-CTP16 y anti-CTP21 detectables en su plasma (círculos blancos).

I. Definiciones

El término "péptido de hCG", "péptido inmunogénico de hCG" o "epítopo de hCG" se refiere a un péptido de hCG que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que parte de, pero no toda, la secuencia de aminoácidos de la proteína hCG entera, y que conserva al menos una función o actividad biológica de la proteína hCG entera, por ejemplo, un fragmento que conserva una actividad inmunológica de la proteína hCG completa.

El término "péptido inmunogénico de hCG" o "péptido de la subunidad beta inmunogénica de hCG" o fragmentos del mismo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de aminoácidos derivadas de hCG o de la subunidad beta de hCG, respectivamente, que pueden provocar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular cuando se administran a un sujeto.

Los términos "precursor antigénico" o "precursor" con respecto a péptidos inmunogénicos de hCG, tal como se usan en el presente documento, se refieren a péptidos de hCG que pueden tratarse para dar péptidos inmunogénicos de hCG por el sujeto.

El término "péptido C-terminal de hCG" o "hCG CTP37" tal como se usa en el presente documento se refiere a los 37 aminoácidos C-terminales de la subunidad beta de hCG ("CTP 37mer", figura 2A, SEQ ID Nº: 2), presentados como la secuencia nativa, o una variante o análogo de la misma, que tiene una actividad biológica equivalente.

En algunos casos, el hCG CTP tiene metionina añadida en el extremo N-terminal (denominado "CTP 38mer", figura 2B, SEQ ID Nº: 3).

El término péptido "bucle", tal como se usa en el presente documento con respecto a hCG se refiere a los aminoácidos 58 a 77 de la subunidad beta de hCG (figura 2H, SEQ ID Nº: 9), en los que los aminoácidos 58 y 77 están unidos mediante un puente de disulfuro, en forma de la secuencia nativa, o una variante o análogo de la misma, que tiene una actividad biológica equivalente.

El término "16mer" o "epítopo C-terminal", tal como se usa en el presente documento con respecto a hCG se refiere a los aminoácidos 150-165 de la subunidad beta de hCG (figura 2E, SEQ ID Nº: 6), presentados como la secuencia nativa, o una variante o análogo de la misma, que tiene una actividad biológica equivalente.

El término "17mer", tal como se usa en el presente documento con respecto a hCG se refiere a los aminoácidos 150-165 de la subunidad beta de hCG (figura 2F, SEQ ID Nº: 7), con una cisteína C-terminal añadida para fines de derivatización con una proteína vehículo.

El término "21mer" o "epítopo N-terminal", tal como se usa en el presente documento con respecto a hCG se refiere a los aminoácidos 130-150 de la subunidad beta de hCG (figura 2C, SEQ ID Nº: 4), presentados como la secuencia nativa, o una variante o análogo de la misma, que tiene una actividad biológica equivalente.

El término "no nativo" tal como se usa en el presente documento con respecto a un epítopo o péptido inmunogénico de hCG, significa que la secuencia de aminoácidos del epítopo difiere en uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos del mismo epítopo inmunogénico de hCG tal como se encuentra en la naturaleza.

El término secuencia de aminoácidos "no nativa" puede comprender un epítopo inmunogénico de hCG que tiene una secuencia de aminoácidos variante que contiene una o más deleciones, inserciones de aminoácidos o sustituciones de aminoácidos "conservativa" o "no conservativa", o en algunos casos puede tener aminoácidos adicionales en el extremo N o C-terminal del péptido. Un péptido inmunogénico de hCG "no nativo" de este tipo conserva la actividad biológica (inmunogenicidad) del péptido nativo a partir del cual se deriva.

El término "conjugado de proteína vehículo y péptido" se usa de manera intercambiable con el término "péptido derivatizado con una proteína vehículo" y se refiere a un péptido inmunogénico de hCG que se ha unido a una proteína vehículo para potenciar su inmunogenicidad.

El término "vacuna de péptido inmunogénico de hCG" o "vacuna de péptido de hCG", tal como se usa en el presente documento se refiere a un péptido inmunogénico de hCG derivatizado con una molécula vehículo adecuada, tal como se muestra como ejemplo en el presente documento mediante \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) y \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4).

El término "vacuna frente a hCG" o "vacuna", tal como se usa en el presente documento se refiere a un péptido inmunogénico de hCG derivatizado con una molécula vehículo adecuada, hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2), y/o uno o más anticuerpos monoclonales anti-\beta-hCG humana administrados de modo pasivo.

El término "respuesta inmunitaria" tal como se usa en el presente documento se refiere a una respuesta inmunitaria humoral tal como la producción de anticuerpos frente a un epítopo inmunogénico de hCG o una respuesta inmunitaria celular tal como una respuesta de célula T citotóxica.

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El término "sujeto inmunocompetente", tal como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto que tiene células de respuesta inmunitaria que, con la exposición a un epítopo inmunogénico, puede preparar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular frente al epítopo inmunogénico.

El término "determinante antigénico" o "epítopo" inmunogénico, tal como se usa en el presente documento con respecto a un péptido de hCG se refiere a una parte de la secuencia de aminoácidos de hCG que generará una respuesta inmunitaria mediada por células B y/o T frente a hCG. Se prefiere que el epítopo sea único, es decir, una respuesta inmunitaria generada frente al epítopo de hCG específico muestra poca o ninguna reactividad cruzada con otros antígenos.

Por "equivalente funcional" se quiere decir una secuencia de aminoácidos para un péptido inmunogénico de hCG que tiene una actividad biológica equivalente frente a la de los péptidos inmunogénicos de hCG de secuencia nativa descritos en el presente documento y presentados como SEQ ID Nº: 2, 4, 6 y 9. La actividad biológica relevante es actividad inmunológica, es decir, la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se administra la vacuna de péptido inmunogénico de hCG.

En el presente documento se hace referencia a los residuos de aminoácidos mediante sus notaciones de letras únicas habituales: A, alanina; C, cisteína; D, ácido aspártico; E, ácido glutámico; F, fenilanalina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptofano; Y, tirosina.

El término "inmunización activa", tal como se usa en el presente documento se refiere al uso de vacunas de péptido de hCG para inducir una respuesta inmunitaria mediante las células de respuesta inmunitaria del sujeto.

El término "administrar", tal como se usa en el presente documento se refiere a poner las células de respuesta inmunitaria del sujeto en contacto con una vacuna de péptido inmunogénico de hCG. En la mayoría de los casos, tal "administración" tiene lugar mediante inyección o bien subcutánea o bien intramuscular de la composición de vacuna de péptido inmunogénico de hCG dentro del sujeto.

El término "inmunización pasiva", tal como se usa en el presente documento se refiere a la administración directa de anticuerpos a un sujeto como enfoque de inmunización.

El término "adyuvante" se usa en el presente documento para referirse a una sustancia que puede elevar la respuesta inmunitaria total del sujeto al que se administra una vacuna, es decir, actuando como estimulante inmunitario no específico. Un adyuvante también puede usarse para provocar una respuesta inmunitaria más rápidamente.

El término "administraciones separadas sucesivamente" tal como se usa en el presente documento se refiere a regímenes de tratamiento de vacunas de péptidos inmunogénicos de hCG que comprenden una administración inicial, seguida de una o más administraciones de refuerzo en diversos intervalos de tiempo tras la administración inicial. Las administraciones de refuerzo pueden o no administrarse a intervalos separados regularmente.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "disolución adecuada para inyección en un paciente humano", "en una forma adecuada para inyección en un paciente humano" y "farmacéuticamente aceptable", pueden usarse de manera intercambiable y se refieren a una composición que comprende vehículos, diluyentes y reactivos, que puede administrarse a un sujeto humano sin la producción de efectos fisiológicos adversos.

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" tal como se usan en el presente documento se refieren a tratamiento curativo, tratamiento profiláctico y tratamiento preventivo.

El término "dosis" tal como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de anticuerpo monoclonal humano anti-hCG o vacuna de péptido inmunogénico de hCG administrada a un paciente. La cantidad varía con el sujeto, el inmunógeno y la presencia de adyuvante, tal como se describe a continuación.

El término "potencial de eficacia del tratamiento", tal como se usa en el presente documento con respecto al tratamiento del cáncer se refiere a la eficacia potencial de una estrategia de tratamiento dada tal como se determina mediante evaluación de diversos criterios de valoración clínicos incluyendo la respuesta inmunitaria frente a péptidos inmunogénicos de hCG, tamaño del tumor y tiempo de supervivencia del paciente.

Tal como se usa en el presente documento, el término "no consigue responder a la vacuna" significa generalmente que el paciente no tiene respuesta inmunitaria detectada frente a \beta-hCG-CTP37 ni epítopos inmunogénicos del mismo.

El término "líquido corporal" tal como se usa en el presente documento se refiere a una variedad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto incluyendo orina, saliva, plasma, sangre, líquido cefalorraquídeo y otras muestras de origen biológico.

Tal como se usa en el presente documento, el término "análisis", con respecto al inmunoensayo de la respuesta inmunitaria frente a péptidos inmunogénicos de hCG, puede ser una evaluación que es o bien cualitativa (positiva/negativa) o bien cuantitativa.

II. Cáncer y hCG

Aunque los tumores malignos pueden expresar antígenos de proteínas que se reconocen como extraños por el sujeto, y la vigilancia inmunitaria puede limitar el crecimiento y propagación de algunos tipos de tumores, el sistema inmunitario no protege eficazmente al sujeto de los cánceres humanos letales.

Tales tumores pueden derrotar al sistema inmunitario debido al rápido crecimiento y propagación y/o las células tumorales pueden escapar de la destrucción inmunitaria. Los mecanismos propuestos para tal escape incluyen, pero no se limitan a, (1) regulación por disminución de antígenos de CMH de clase I sobre la superficie de células tumorales dando como resultado poca o ninguna complejación de antígenos de péptido tumoral tratados con CMH de clase I tal como se requiere para el reconocimiento por los linfocitos T citotóxicos (CTL), (2) carencia de la activación de CTL debido a la poca o ninguna expresión de moléculas de CMH de clase II por células tumorales de manera que no pueden activar directamente las células T cooperadoras CD4+ específicas del tumor (que producen señales que pueden necesitarse par la actividad de CTL), (3) carencia de marcadores de superficie celular de estimulación conjunta que proporcionan señales secundarias para la activación de células T cooperadoras CD4+, y (4) factores producidos por células tumorales que suprimen las respuestas anti-tumor, tales como ligando fas. (Abbas, AK, et al., 1997).

Los investigadores también han determinado que ciertos polipéptidos son factores de apoyo para, y/o se secretan por, células neoplásicas tanto en el hombre como en otros mamíferos. Tales factores de apoyo tienen similitud bioquímica, biológica e inmunológica con hormonas, particularmente la gonadotropina coriónica (CG). Ciertos carcinomas emanan CG o un material inmunológicamente similar sobre sus superficies, presentando así al sistema inmunitario del sujeto una superficie que, superficialmente, parece estar formada por material endógeno al sujeto y que por tanto es relativamente no inmunogénico.

Se ha detectado \beta-hCG libre (más de 100 \mug/ml) en pacientes con cáncer de vejiga (47%), de páncreas (32%) y cervical (30%), además de una mayoría de pacientes con tumores de células germinales. Se ha detectado \beta-hCG asociada a tumores en cánceres colorrectal (52%), de pulmón (34%), de páncreas (31%), de esófago (28%), de mama (24%) y de vejiga (21%) (Braunstein, 1990). Además, se ha notificado la detección inmunohistoquímica en aproximadamente del 8 al 19% de los cánceres gástrico, de próstata, de ovario, de útero, cervical y endometrial. (Braunstein, 1990).

Un tratamiento eficaz de cánceres malignos debe evitar la propagación adicional de células neoplásicas y reducir la mortalidad, es decir, aumentar el tiempo de supervivencia para pacientes que tienen la enfermedad. Los métodos de tratamiento actuales incluyen la estimulación no específica del sistema inmunitario, la inmunoterapia pasiva, y la vacunación con células tumorales muertas o antígenos de células tumorales, polipéptidos o fragmentos de los mismos, solos o en combinación con quimioterapia y/o terapia de radiación.

Los estudios de inmunización activa han indicado que el polipéptido modificado de beta-hCG/toxoide tetánico confiere a las ratas protección frente a una inyección de células tumorales del adenocarcinoma de mama de rata virulento R 3230 AC, que está asociado con material similar a CG. La inmunización pasiva también ha dado como resultado protección frente a tumores de carcinoma de pulmón de Lewis, leucemia inducida por virus y tumor de sarcoma en ratones (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. número 5.698.201).

El péptido C-terminal de hCG, solo o en combinación con el péptido "bucle" de hCG, inyectado por vía intramuscular, junto con CRL 1005 (Optivax; Vaxcel Inc., Norcross, GA) como adyuvante, se ha evaluado en ensayos clínicos en fase temprana en pacientes con cáncer metastásico.

En los estudios resultó una producción de anticuerpo anti-hCG medible, sin embargo, la evaluación de la actividad anticancerígena no fue un componente de los estudios. [Véase, Triozzi PL y Stevens VC, Oncol Rep 6 (1): 7-17, 1999; Triozzi PL et al., Clin Cancer Res 3 (12Pt1): 2355-62, 1997].

III. Anticuerpos monoclonales humanos para inmunoterapia pasiva A. Producción de anticuerpos monoclonales humanos

El valor y potencial de anticuerpos para el tratamiento in vitro se ha reconocido desde hace mucho en la técnica. Un enfoque ha sido desarrollar anticuerpos monoclonales humanos o "humanizados", que no se "reconocen" fácilmente como extraños por el paciente con el fin de evitar una respuesta inmunitaria anti-anticuerpos. En algunos casos, el uso de anticuerpos monoclonales producidos por hibridoma de célula B humanas tiene potencial en el tratamiento de diversos estados de enfermedad. Sin embargo, muchos antígenos tumorales humanos nativos no son inmunógenos en los seres humanos y por tanto puede ser difícil aislar células B humanas que producen anticuerpos frente a antígenos humanos.

Los anticuerpos quiméricos o "humanizados" se diseñan mediante ingeniería genética y se montan a partir de partes de fragmentos de genes de anticuerpos humanos o de ratón. Tales anticuerpos quiméricos o humanizados todavía conservan una cantidad variante de secuencia de proteína de anticuerpo de ratón y, en consecuencia, pueden activar una respuesta inmunitaria humana anti-ratón cuando se administran a un paciente.

Un enfoque de ADN recombinante se ha centrado en la producción de anticuerpos quiméricos que tienen una región humana C[H] y regiones de combinación (variable) de antígenos no humanos (por ejemplo, murinos). Estos anticuerpos quiméricos se producen generalmente mediante clonación de la región variable y/o región constante del anticuerpo deseado, combinado las secuencias clonadas en un único constructo que codifica para todo o una parte de un anticuerpo quimérico funcional que tiene las regiones constante y variable deseadas, introduciendo el constructo dentro de una célula que puede expresar anticuerpos, y seleccionando las células que expresan de manera estable el anticuerpo quimérico.

Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras regiones de secuencias de unión a antígeno). Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos humanos en los que se sustituyen residuos de una región determinante complementaria (CDR) del anticuerpo humano por residuos de una CDR de una especie no humana tal como ratón, rata o conejo. En la mayoría de los casos, el anticuerpo humanizado comprende dominios de región variable, en los que todas o sustancialmente todas las regiones de CDR son de origen no humano. En algunos casos, se sustituyen residuos de la región de estructura (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988). Con el fin de encontrar utilidad en los métodos de la invención, los anticuerpos humanizados deben mantener una alta afinidad por el antígeno del péptido y otras propiedades biológicas favorables.

Los anticuerpos humanos también pueden producirse usando bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom y Winter, 1991; Marks et al., 1991).

Se ha mostrado repetidamente que los vectores de presentación de fagos filamentosos o "fagómidos" permiten la preparación eficaz de grandes bibliotecas de anticuerpos monoclonales que tienen especificidades inmunológicas diversas y novedosas. El dominio de anclaje de membrana de proteína de recubrimiento del fago filamentoso sirve para unir un producto génico y un gen durante la fase de montaje de la replicación del fago, y se ha usado para la clonación y expresión de anticuerpos a partir de bibliotecas combinatorias. (Véase, por ejemplo, Kang et al., 1991). Esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen residuos de estructura ni de CDR de origen roedor, tal como se encuentran en los anticuerpos "humanizados".

El método para producir un anticuerpo monoclonal humano implica generalmente (1) clonar genes del dominio V del anticuerpo dentro del marco en un gen de proteína de recubrimiento o bien principal o bien secundario de un bacteriófago filamentoso, (2) expresar la molécula de anticuerpo heterodimérico montada, de tal manera que los fragmentos de anticuerpo funcionales se presentan sobre la superficie de la partícula de fago, (3) aislar la partícula de fago expresada en la superficie usando técnicas de inmunoafinidad, dando como resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que muestra esas propiedades. (Véase, por ejemplo, Hoogenboom, HR et al., 1998; patente de los EE.UU. número 5.804.440).

Puede construirse un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y aislarse anticuerpos frente a una serie diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) usando presentación de fagos (Marks et al., 1991; Griffiths et al., 1993).

La afinidad de los anticuerpos humanos obtenidos mediante presentación de fago puede mejorarse sustituyendo secuencialmente los genes de la región V de cadena pesada y ligera con repertorios de variantes que se producen en la naturaleza de genes de dominio V obtenidos a partir de donantes no inmunizados con el fin de seleccionar anticuerpos de afinidad superior. (Véase, por ejemplo, Griffiths y Duncan, 1998; Aujame et al., 1997). La diversidad de anticuerpos humanos obtenidos mediante presentación de fagos también puede aumentarse reorganizando los genes de cadena pesada y ligera (Kang et al., 1991), alterando las regiones de CDR3 de los genes de cadena pesada clonados (Barbas, et al., 1992), e introduciendo mutaciones aleatorias dentro de la biblioteca mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) (Gram et al., 1992).

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, xenoratones) que pueden, al inmunizarse, producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. En este enfoque, se han insertado grandes fragmentos de genes de Ig tanto de cadena pesada como ligera humanos dentro de la línea germinal del ratón para crear una cepa de ratón que puede producir un amplio repertorio de anticuerpos completamente humanos, específicos de antígeno.

El xenoratón produce células B que expresan cadena pesada humana (h mu) y cadena ligera K humana (h K), o h mu y cadena ligera lambda de ratón (m lambda). Estos ratones producen niveles significativos de anticuerpos completamente humanos con un repertorio similar al adulto diverso y, al inmunizarse con antígenos, generan anticuerpos monoclonales completamente humanos específicos de antígeno. (Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., 1995; Jakobovits, 1995).

Tales anticuerpos monoclonales humanos derivados de ratón xenogénico pueden no tener la cadena pesada de Ig correcta para fijaciones de complementos en seres humanos, por ejemplo, IgG1. En tales casos, el ARNm que codifica para el anticuerpo del hibridoma del ratón xenogénico puede usarse para obtener ADNc dentro del cual se inserta el ADNc para la cadena pesada de IgG1. Este casete puede insertarse entonces dentro de un vector de expresión utilizando procedimientos empleados de manera rutinaria por los expertos en la técnica, y posteriormente para usarse en la producción de cabras transgénicas. Se han desarrollado cabras transgénicas en las que los promotores inducibles pueden activar la expresión de la proteína codificada en los mismos de manera que se secreta en la leche de las cabras. Este procedimiento permite una producción de coste relativamente bajo de grandes cantidades de anticuerpos monoclonales humanos.

En un enfoque preferido, los anticuerpos anti-péptido inmunogénico de hCG de la invención comprenden anticuerpos humanos, producidos usando tecnología de ratón xenogénico, seguido por sustitución de cadena pesada, clonados y expresados en cabras transgénicas, tal como se describió anteriormente.

B. Composiciones terapéuticas que comprenden anticuerpos monoclonales humanos

Por tanto, la presente invención contempla composiciones terapéuticas útiles para practicar la inmunoterapia del cáncer.

Las composiciones terapéuticas que contienen uno o más anticuerpos monoclonales humanos diferentes específicamente inmunorreactivos con un epítopo de \beta-hCG-CTP37 y el uso de los mismos para la inmunoterapia se describen en el presente documento. Anticuerpos monoclonales humanos preferidos incluyen anti-\beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) y anti-\beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4).

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal humano es una cantidad calculada para lograr el efecto deseado, es decir, neutralizar la \beta-hCG presente en el suero o en las células tumorales del paciente, y disminuir así la cantidad de hCG detectable o hCG libre en el suero o en las células tumorales del paciente. Tal disminución se correlaciona con un aumento del tiempo de supervivencia para el paciente.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable junto con al menos una especie de anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con un epítopo de \beta-hCG-CTP37, disuelto o dispersado en el mismo como un principio activo, formulado según la práctica convencional.

Las composiciones terapéuticas para la inyección o infusión pueden tener formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones del anticuerpo en vehículos acuosos o aceitosos, y pueden contener componentes tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispensadores. Alternativamente, la composición puede estar en una forma seca, para su reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden administrarse por vía parenteral mediante inyección o mediante infusión gradual con el tiempo. En la mayoría de los casos, las composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos monoclonales humanos de la invención se administran por vía intravenosa, sin embargo, se contemplan otros medios de administración. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden inyectarse por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intratumoral, o administrarse por vía transdérmica o mediante medios peristálticos.

Los regímenes adecuados para la administración de anticuerpos son variables, pero son normalmente mediante una administración inicial seguida de dosis repetidas en uno o más intervalos mediante administración posterior. Los anticuerpos anti-\beta-hCG pueden administrarse junto con, o de manera secuencial con, vacunas de péptidos inmunogénicos de hCG.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo para su uso en esta invención es normalmente una cantidad de anticuerpo en una composición farmacéuticamente aceptable que es suficiente para disminuir la cantidad de \beta-hCG detectable en el paciente.

La dosis puede variar desde aproximadamente 25 mg hasta aproximadamente 500 mg por paciente por administración, en la que un paciente medio tiene 70 kg. En general, los anticuerpos anti-hCG se administran de 1 a 2 veces por semana durante un periodo de 4 a 6 semanas. Sin embargo, en algunos casos, tal administración de anticuerpos puede continuarse durante un periodo de tiempo indefinido. La duración del tratamiento con anticuerpos se evalúa junto con la administración de vacuna de péptido inmunogénico de hCG basándose en la respuesta inmunitaria del paciente a hCG-CTP16, hCG-CTP21 y hCG-CTP37, tal como se describe adicionalmente a continuación.

Se entenderá que cuando la inmunoterapia comprende la administración de un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con hCG junto con una vacuna de péptido inmunogénico de hCG, la dosis de anticuerpo monoclonal humano puede ajustarse basándose en los resultados de un inmunoensayo para péptido inmunogénico de hCG, que se realiza comenzando aproximadamente de 9 a 15 semanas tras la administración de vacuna frente a hCG inicial.

Más específicamente, los niveles de anticuerpos del paciente frente a fragmento C-terminal de 16mer de \beta-hCG-CTP37 (\beta-hCG-CTP16, SEQ ID Nº: 6), fragmento N-terminal de 21mer de \beta-hCG-CTP37 (\beta-hCG-CTP21, SEQ ID Nº: 4) y el péptido de \beta-hCG-CTP37 entero (SEQ ID Nº: 2), se monitorizan en diversos momentos. El régimen de dosificación para la administración de anticuerpo monoclonal humano frente a \beta-hCG-CTP37 pasiva se ajusta en combinación con el régimen de dosificación de la vacuna de péptido de hCG, según se necesite, para dar como resultado anticuerpos detectados frente a tanto \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) como a \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4) en un líquido corporal del paciente.

Preferiblemente, la administración de una vacuna frente a hCG da como resultado un nivel de anticuerpos detectados frente a \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2), \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) y \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4). Aún más preferiblemente, la administración de vacuna de péptido de hCG da como resultado un nivel de anticuerpos detectados frente a tanto \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) como a \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4), en el que la respuesta inmunitaria frente a ambos péptidos es similar en magnitud.

IV. Péptidos inmunogénicos de hCG como vacunas A. Epítopos inmunogénicos de hCG

Un "epítopo inmunogénico de hCG" o "epítopo antigénico de hCG" es cualquier secuencia de aminoácidos, o combinación de secuencias de aminoácidos que provoca una respuesta inmunitaria frente a hCG.

Una vacuna frente a hCG comprende el péptido C-terminal (CTP37, SEQ ID Nº: 2), de la subunidad beta de hCG, administrado a un sujeto solo o en combinación con uno o más péptidos de hCG inmunogénicos adicionales y/o junto con la administración pasiva de uno o más anticuerpos anti-hCG.

Epítopos inmunogénicos preferidos son los 37 aminoácidos C-terminales de la subunidad beta de hCG (CTP37), y péptidos derivados de los mismos, solos o en combinación con los aminoácidos de 38 a 57 de la subunidad beta de hCG (el péptido "bucle").

El péptido "bucle" de la subunidad beta de hCG es sustancialmente similar a la región correspondiente de la hormona leutinizante humana (LH), hormona estimulante del folículo (FSH) y hormona estimulante de la tiroides (TSH). En consecuencia, el péptido "bucle" o un análogo del mismo se administra junto con el péptido CTP37 o análogo del mismo, o péptidos derivados del mismo.

La administración combinada de los péptidos "bucle" y CTP37 puede conseguirse tal como sigue: (1) pueden unirse químicamente o sintetizarse en serie los dos péptidos antes de la derivatización con una proteína vehículo adecuada; (2) ambos péptidos pueden derivatizarse químicamente con el mismo vehículo sin haberse unido en primer lugar químicamente entre sí; (3) los dos péptidos pueden derivatizarse con vehículos separados y administrarse una mezcla de los dos conjugados al sujeto que va a tratarse; o (4) los dos péptidos pueden derivatizarse con vehículos separados y administrarse los dos conjugados por separado al sujeto que va a tratarse.

Las vacunas frente a hCG descritas en el presente documento son representativas de los tipos de vacunas frente a hCG que pueden usarse para generar una respuesta inmunitaria frente a dos o más epítopos de \beta-hCG-CTP37. En general, el tamaño del antígeno de péptido debe ser al menos lo suficientemente grande como para abarcar uno o más epítopos inmunogénicos de hCG. El epítopo inmunogénico útil más pequeño o fragmento anticipado en la presente descripción será generalmente del orden de aproximadamente 8 residuos de aminoácidos contiguos de longitud, prefiriéndose secuencias del orden de aproximadamente 8 a aproximadamente 40 o más aminoácidos.

Hay dos epítopos principales dentro de los 37 aminoácidos carboxi-terminales de hCG, un epítopo de 21 aminoácidos N-terminal (CTP21) y un epítopo de 16 aminoácidos C-terminal (CTP16; Berger P et al. Mol and Cell Endocrinol., 125: 33-43, 1996). Las figuras 2A, 2C y 2E muestran las secuencias de aminoácidos de CTP37, CTP21 y CTP16, respectivamente. Una estrategia de vacunación frente a hCG puede comprender la administración de uno o más de CTP37, CTP21 y CTP16. Sin embargo, estudios han mostrado que la respuesta inmunitaria frente al epítopo CTP16 es inmunodominante y en consecuencia se prefiere la administración de CTP37 solo o en combinación con CTP21.

En general, la administración inicial de una vacuna de péptido inmunogénico de hCG consiste en al menos 1 mg de \beta-hCG-CTP37. Las administraciones de seguimiento o refuerzo de vacunas de péptido inmunogénico de hCG o anticuerpos anti-\beta-hCG administrados pasivamente, se proporcionan normalmente a un paciente con cáncer en administraciones sucesivas, separadas de uno o más de los siguientes: (i) una dosis de la vacuna frente a CTP37 (SEQ ID Nº: 2) que es superior a la proporcionada en la administración inicial; (ii) una dosis de la vacuna correspondiente a menos de 1,0 mg de péptido CTP37 por paciente por administración; (iii) una vacuna de promotor compuesta por el péptido bucle de hCG (SEQ ID Nº: 9),derivatizado con un vehículo adecuado, en combinación con la vacuna frente a \beta-hCG-CTP37; (iv) una vacuna de promotor compuesta por el péptido bucle de hCG (SEQ ID Nº: 9), derivatizado con un vehículo adecuado, seguido de administraciones sucesivas separadas de la vacuna frente a \beta-hCG-CTP37, con una dosis de la última vacuna inferior a 1,0 mg de péptido CTP37 por paciente por administración; (v) una vacuna de péptido compuesta por \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4), derivatizado con una proteína vehículo adecuada; (vi) administración pasiva de al menos una dosis cada de 1 a 2 semanas de un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con un fragmento N-terminal de 21mer de \beta-hCG-CTP37 (hCG-CTP21, SEQ ID Nº: 4); (vii) administración pasiva de al menos una dosis cada de 1 a 2 semanas de un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4) en combinación con un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6); y (viii) administraciones sucesivas separadas de una vacuna frente a \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2) en combinación con un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4).

En un enfoque, la cantidad del componente CTP37 de la vacuna frente a hCG es inferior a 1,0 mg, preferiblemente 0,5 mg. En un aspecto relacionado, cuando la vacuna de CTP37 se administra a un paciente junto con la vacuna de "bucle", la cantidad del componente CTP37 de la vacuna frente a hCG es inferior a 1,0 mg, preferiblemente 0,5 mg, y la cantidad de la vacuna de "bucle" es igual a, o superior a la del péptido CTP37.

En todos los casos, el péptido inmunogénico de hCG está conjugado con una molécula vehículo, por ejemplo, una proteína. En general, cada péptido inmunogénico de hCG está conjugado por separado con una proteína vehículo. Cuando se incluye más de un péptido inmunogénico de hCG en el régimen de tratamiento para un paciente dado, las vacunas de péptido de hCG pueden administrarse al paciente al mismo tiempo, o en tiempos diferentes. En la mayoría de los casos, se administran péptidos inmunogénicos de hCG conjugados juntos, en administraciones separadas sucesivamente.

B. Preparación de una vacuna de péptido de hCG

Se han expresado diversas cadenas de polipéptido de hCG, mediante tecnología de ADN recombinante, en células huésped tales como bacterias, levaduras, y células de mamífero cultivadas. (Véase, por ejemplo, Fiddes, J. C. y Goodman, H. M., 1979) y (Fiddes, J. C. y Goodman, H. M., 1980) que describen la clonación de, respectivamente, las subunidades alfa y beta de la gonadotropina coriónica humana (hCG).

La secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de hCG, disponible en GenBank con el número de registro 180437, y presentada en el presente documento como SEQ ID Nº: 1, se usó para seleccionar péptidos para su uso en los métodos de la invención.

Se sintetizaron químicamente péptido inmunogénico de hCG usando o bien química de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo), esencialmente tal como se describe por D. Hudson, 1988, o bien química de Boc (terc-butiloxicarbonilo). Las técnicas para la síntesis de aminoácidos se emplean rutinariamente por los expertos en la técnica usando equipo de laboratorio disponible actualmente (por ejemplo, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Tras la síntesis, los péptidos se purifican generalmente mediante HPLC, y se determina la integridad y autenticidad de los péptidos mediante degradación de Edman seguido por secuenciación tradicional o análisis de espectrofotometría de masas, por ejemplo, análisis de RMN del péptido intacto. La inmunogenicidad de cada péptido sintético se determina individualmente, a través de diversos inmunoensayos in vitro para determinar la inmunorreactividad con anticuerpos en los líquidos corporales, por ejemplo, suero o plasma, tomados de un sujeto que se sabe que tiene anticuerpos anti-hCG
CTP37.

C. Péptidos inmunogénicos de hCG modificados o variantes

En la mayoría de los casos, los péptidos inmunogénicos de hCG tienen la misma secuencia que los péptidos inmunogénicos de hCG nativos. Sin embargo, en algunos casos, los péptidos inmunogénicos de hCG son péptidos de hCG variantes.

Es posible alguna sustitución de aminoácidos sin afectar al carácter inmunogénico del fragmento.

Las clases de sustitución habituales son las seis clases basadas en propiedades de cadena lateral comunes y la mayor frecuencia de sustitución en proteínas homólogas en la naturaleza, tal como se determina, por ejemplo, mediante una matriz de intercambio de frecuencia Dayhoff habitual (Dayhoff). Estas clases son clase I: Cys; clase II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala, y Gly, representando cadenas laterales alifáticas pequeñas y cadenas laterales con grupo OH; clase III: Asn, Asp, Glu, y Gln, representando cadenas laterales cargadas negativamente y neutras que pueden formar enlaces de hidrógeno; clase IV: His, Arg, y Lys, representando cadenas laterales polares básicas; clase V: Ile, Val, y Leu, representando cadenas laterales alifáticas ramificadas, y Met; y clase VI: Phe, Tyr, y Trp, representando cadenas laterales aromáticas. Además, cada grupo puede incluir análogos de aminoácidos relacionados, tales como omitina, homoarginina, N-metil-lisina, dimetil-lisina, o trimetil-lisina en la clase IV, y tirosina halogenada en el grupo VI. Además, las clases pueden incluir los estereoisómeros tanto L como D, aunque se prefieren los aminoácidos L para las sustituciones.

Una vez realizada una sustitución o modificación de aminoácidos, se examina el péptido inmunogénico de hCG variante para determinar su inmunogenicidad, en un inmunoensayo in vitro.

Las secuencias de aminoácidos de los péptidos inmunogénicos de hCG descritas en el presente documento pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N o C-terminales adicionales y aún así todavía ser esencialmente las mismas que una de las secuencias descritas en el presente documento, siempre que el péptido o polipéptido conserve la actividad biológica apropiada, por ejemplo, inmunogenicidad.

Los aminoácidos de un péptido inmunogénico de hCG pueden cambiarse de manera que se cree un equivalente, o incluso una molécula mejorada. Es la inmunogenicidad del péptido de hCG la que define su actividad biológica. Ciertas sustituciones de secuencia de aminoácidos pueden realizarse en la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácidos nucleicos que la codifica, dando como resultado la expresión de un péptido de hCG con mayor actividad o utilidad biológica (inmunogenicidad). En algún caso tales cambios pueden proporcionar otros beneficios, por ejemplo, estabilidad o propiedades farmacológicas más deseables con la conservación de actividad y utilidad biológica equivalente.

Al realizar tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía obtener una proteína funcionalmente equivalente biológica. (Kyte y Doolittle, 1982). Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +/-2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de +/-1, y se prefieren incluso más particularmente aquellos que están dentro de +/- 0,5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente basándose en la hidrofilicidad. Patente de los EE.UU. número 4.554.101. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +/- 2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de +/-1, y se prefieren incluso más particularmente aquellos que están dentro de +/- 0,5.

Los péptidos de hCG variantes pueden tener propiedades mejoradas para la administración a pacientes, sin embargo, tales péptidos conservan la inmunogenicidad de los péptidos inmunogénicos de hCG de secuencia nativa descritos en el presente documento.

V. Regímenes de tratamiento para generar una respuesta inmunitaria anti-hCG A. Administración in vivo

La administración in vivo de vacunas frente a hCG puede lograrse mediante inoculación en presencia de adyuvantes u otras sustancias que tienen capacidad para incorporar células del sistema inmunitario al sitio de la inoculación. Una vacuna de péptido inmunogénico de hCG puede administrarse sola o en combinación con anticuerpos monoclonales humanos administrados pasivamente que son específicamente inmunorreactivos con un fragmento C-terminal de 16mero de \beta-hCG-CTP37, por ejemplo, \beta-hCG-CTP16, SEQ ID Nº: 6 y/o \beta-hCG-CTP21, SEQ ID Nº: 4.

Las células de respuesta inmunitaria de un sujeto en el que se desea una inmunización protectora se exponen a una vacuna de péptido inmunogénico de hCG solo o en combinación con uno o más anticuerpos monoclonales humanos que son específicamente inmunorreactivos con un epítopo de \beta-hCG CTP37. La inmunización protectora puede lograrse tras una exposición de este tipo realizando una reducción de la cantidad de hCG circulante o hCG asociada al tumor en el sujeto. Las respuestas inmunitarias mediadas tanto por anticuerpos como por células pueden contribuir a la actividad anticancerígena de las vacunas frente a hCG.

Una vacuna de péptido inmunogénico de hCG y/o de anticuerpos monoclonales humanos de la invención se administra de manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad que es inmunogénica y terapéuticamente eficaz. La cantidad que debe administrarse depende del sujeto que debe tratarse, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para responder a una vacuna de péptido.

En general, los métodos inmunoterapéuticos tal como se describen en la presente invención son aplicables a un sujeto que ya tiene cáncer. Esto significa que se ha diagnosticado que el sujeto tiene cáncer mediante uno o más criterios empleados por los expertos en la técnica para diagnosticar el tipo relevante de cáncer. Uno de tales criterios es que el cáncer se caracteriza por la expresión de hCG en la superficie de las células cancerígenas y en algunos casos se caracteriza adicionalmente por la presencia de hCG circulante en el plasma y/u otros líquidos corporales del paciente. Tipos a modo de ejemplo de cánceres incluyen cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, y cáncer de testículos que es refringente al tratamiento con cisplatino.

En algunos casos, los métodos inmunoterapéuticos tal como se describen en la invención son aplicables a un sujeto que tiene un alto riesgo de desarrollar cáncer, o para el que uno o más criterios de diagnóstico indican que el cáncer puede estar desarrollándose.

La cirugía, terapia de radiación, y quimioterapia son actualmente los métodos primarios para el tratamiento de cáncer. Se contempla que la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales humanos anti-\beta-hCG-CTP37 y/o tratamiento basado en vacuna de péptido de hCG puede combinarse con tales otros tratamientos del cáncer. Se apreciará que los métodos descritos en el presente documento pueden interaccionar de manera sinérgica o aditiva con cualquiera de cirugía, terapia de radiación y quimioterapia, dando como resultado un mayor efecto terapéutico. En algunos casos, los métodos mejorados para tratar el cáncer combinarán tratamientos de cáncer convencionales, por ejemplo, quimioterapia o terapia de radiación, junto con inmunización pasiva mediante la administración de anticuerpos monoclonales humanos anti-\beta-hCG-CTP37 y/o administración de vacunas de péptido de hCG.

B. Composiciones de vacuna de péptido de hCG

La invención describe un método para inducir una respuesta inmunitaria frente al péptido C-terminal de la subunidad beta de hCG, un péptido que es en sí mismo sustancialmente no inmunogénico. Esto se consigue conjugando el péptido con una molécula vehículo antes de la administración al sujeto.

En los métodos descritos en la invención, se administra una cantidad inmunológicamente eficaz de uno o más péptidos inmunogénicos de hCG derivatizados con una molécula vehículo adecuada, por ejemplo, una proteína, a un paciente con cáncer mediante administraciones sucesivas, separadas, de una vacuna compuesta por un péptido inmunogénico de hCG o péptidos conjugados con una molécula vehículo, de una manera eficaz para dar como resultado una mejora en el estado del paciente.

En una realización preferida, los péptidos inmunogénicos de hCG se acoplan a una de una variedad de moléculas vehículo, conocidas por los expertos en la técnica. Una proteína vehículo debe tener tamaño suficiente para que el sistema inmunitario del sujeto al que se administra reconozca su naturaleza extraña y desarrolle anticuerpos frente a ella.

En algunos casos, la molécula vehículo se acopla directamente al péptido inmunogénico de hCG. En otros casos, se inserta una molécula de unión entre la molécula vehículo y el péptido inmunogénico de hCG.

En una realización a modo de ejemplo, la reacción de acoplamiento requiere un grupo sulfhidrilo libre en el péptido. En tales casos, se añade un residuo de cisteína N-terminal al péptido cuando se sintetiza el péptido. Por ejemplo, CTP17 (SEQ ID Nº: 7) tiene la misma secuencia que el péptido de subunidad beta de hCG, CTP16 (SEQ ID Nº: 6), más un residuo de cisteína N-terminal añadido que facilita el acoplamiento de CTP16 a una molécula vehículo.

En una realización a modo de ejemplo, se utiliza química de succinimida tradicional para unir el péptido a una proteína vehículo. Los métodos para preparar tales conjugados de péptido:proteína vehículo se conocen generalmente por los expertos en la técnica y los reactivos para tales métodos están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Sigma Chemical Co.). Generalmente se conjugan aproximadamente 5-30 moléculas de péptido por molécula de proteína vehículo.

Moléculas vehículo a modo de ejemplo incluyen proteínas tales como la hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina sérica bovina (BSA), flagelina, proteínas de la subunidad de influenza, toxoide tetánico (TT), toxoide diftérico (DT), toxoide del cólera (CT), una variedad de proteínas de choque térmico bacterianas, glutatión reductasa (GST), o proteínas naturales tales como tiroglobulina, y similares. Un experto en la técnica puede fácilmente seleccionar una molécula vehículo apropiada.

En una realización preferida, se conjuga un péptido inmunogénico de hCG con toxina diftérica (DT).

En algunos casos, la molécula vehículo no es una proteína, tal como Ficoll 79 o Ficoll 400 (un copolímer sintético de sacarosa y epiflorohidrina), una poliglucosa, tal como Dextran T 70.

El grado de conjugación debe adecuarse para inducir una respuesta inmunitaria por un paciente con cáncer a un nivel suficiente como para neutralizar alguno o todos los efectos de hCG asociados con el estado del paciente. Se apreciará que esto variará dependiendo del péptido, la molécula vehículo y el paciente.

La invención describe composiciones de vacuna frente a hCG tal como se describió anteriormente en las que cada péptido inmunogénico de hCG se acopla a la misma proteína vehículo o a una diferente.

Una composición de vacuna frente a hCG puede comprender una única o múltiples copias del mismo o diferentes péptidos inmunogénicos de hCG, acoplados a una molécula vehículo seleccionada. En un aspecto de esta realización, la composición de vacuna frente a hCG puede contener diferentes péptidos inmunogénicos de hCG con o sin secuencias flanqueantes, combinados secuencialmente en un polipéptido y acoplados al mismo vehículo. Alternativamente, los péptidos inmunogénicos de hCG pueden acoplarse individualmente como péptidos al mismo vehículo o a uno diferente, y los conjugados péptido inmunogénico de hCG-vehículo resultantes combinarse juntos para formar una única composición, o administrarse individualmente al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

Por ejemplo, los péptidos inmunogénicos de hCG pueden acoplarse covalentemente a la proteína vehículo de toxoide diftérico (DT) mediante la cadena lateral de cisteinilo mediante el método de Lee A. C. J. et al., 1980, usando aproximadamente 15-20 moléculas de péptido por molécula de toxoide diftérico (DT).

En general, las composiciones de vacuna de péptido de hCG derivatizado se administran con un vehículo. El fin del vehículo es emulsionar la preparación de vacuna. Se conocen varios vehículos por los expertos en la técnica, y cualquier vehículo que funcione como agente emulsionante eficaz encuentra utilidad en los métodos de la invención. Un vehículo preferido para la administración comprende una mezcla de monooleato de manida (monooleato de dianhidromanitol) con escualano y/o escualeno. Se prefiere escualeno al escualano para su uso en las vacunas de la invención, y preferiblemente la razón de escualeno y/o escualano por partes en volumen de monooleato de manida es de desde aproximadamente 4:1 hasta aproximadamente 20:1.

Para aumentar adicionalmente la magnitud de la respuesta inmunitaria que resulta de la administración de la vacuna frente a hCG, se incluye un adyuvante inmunológico en la formulación de vacuna. Los adyuvantes a modo de ejemplo conocidos por los expertos en la técnica incluyen emulsiones de agua/aceite, adyuvantes copoliméricos no iónicos, por ejemplo, CRL 1005 (Optivax, Vaxcel Inc., Norcross, CA), fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, suspensiones acuosas de hidróxidos de aluminio y de magnesio, endotoxinas bacterianas, polinucleótidos, polielectrolitos, adyuvantes lipófilos y análogos de dipéptido muramilo sintético (norMDP). Adyuvantes preferidos para su inclusión en una composición de vacuna frente a hCG para la administración a un paciente son análogos de norMDP, tales como N-acetil-nor-muranil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetil-muranil-(6-0-estearoil)-L-alanil-D-isoglutamina, y N-glicol-muranil-L-alfaAbu-D-isoglutamina (Ciba-Geigy Ltd.). En la mayoría de los casos, la razón en masa del adyuvante con respecto al conjugado de péptido es de aproximadamente 1:2 a 1:20. En una realización preferida, la razón en masa del adyuvante con respecto al conjugado de péptido es de aproximadamente 1:10. Se apreciará que el componente adyuvante de la vacuna frente a hCG puede variarse con el fin de optimizar la respuesta inmunitaria frente a los epítopos inmunogénicos de hCG en la misma.

Justo antes de la administración, se disuelven el conjugado de péptido inmunogénico de hCG-proteína vehículo y el adyuvante en un disolvente adecuado y se añade un vehículo o agente emulsionante. Por ejemplo, una composición de conjugado de péptido inmunogénico de hCG-proteína vehículo puede incluir el péptido CTP37 conjugado con DT disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) junto con norMDP, que contiene adicionalmente un agente emulsionante de escualeno/monooleato de manida.

Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para su uso en una composición proteínica inmunogénica de la invención se conocen bien por los expertos en la técnica. Tales vehículos incluyen, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, o cualquier medio fisiológicamente compatible, adecuado para introducir la vacuna frente a hCG en un sujeto.

Pueden emplearse varios mecanismos de administración del fármaco conocidos por los expertos en la técnica para administrar los péptidos inmunogénicos de hCG descritos en la invención. Las preparaciones de liberación controlada pueden lograrse mediante el uso de polímeros para complejar o absorber los péptidos o anticuerpos en los métodos de la presente invención. La administración controlada puede lograrse usando macromoléculas tales como poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, acetato de etilenvinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, o sulfato de protamina, cuyas concentraciones pueden alterar la velocidad de liberación de la vacuna de péptido.

En algunos casos, los péptidos de hCG pueden incorporarse dentro de partículas poliméricas compuestas por, por ejemplo, poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico), o copolímeros de etileno-acetato de vinilo. Alternativamente, se atrapa la vacuna de péptido de hCG en microcápsulas, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas, o macroemulsiones, utilizando métodos conocidos generalmente por los expertos en la técnica.

C. Regímenes de tratamiento

Las vacunas frente a hCG descritas en la invención pueden administrarse mediante vías que incluyen, pero no se limitan a, inyección intradérmica (i.d.), inyección intramuscular (i.m.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intravenosa (i.v.), inyección intraperitoneal (i.p.), e inyección peritumoral. La vía de administración preferida es la inyección subcutánea (s.c.).

En los métodos de tratamiento del cáncer descritos en la invención, se facilita a un paciente una administración inicial de menos de 2,0 mg de hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2) y preferiblemente de menos de 1,0 mg de hCG-CTP37 derivatizado con una molécula vehículo adecuada, en una composición farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la vacuna inicial comprende la combinación de menos de 2,0 mg de hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2), junto con menos de 2,0 mg de hCG-péptido "bucle" (SEQ ID Nº: 9), en la que cada péptido inmunogénico de hCG se derivatiza por separado con una molécula vehículo adecuada. En una realización preferida, se facilita a un paciente una vacuna inicial compuesta por la combinación de 0,5 mg de hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2), junto con 0,5 mg de hCG-péptido "bucle" (SEQ ID Nº: 9).

Tras un periodo de entre 9 a 15 semanas tras la vacunación inicial, se evalúan en un inmunoensayo el nivel de anticuerpos frente a un fragmento C-terminal de 16mer de hCG-CTP37, un fragmento N-terminal de 21mer de hCG-CTP37 y hCG-CTP37. El inmunoensayo puede repetirse a intervalos regulares antes, durante y después del tratamiento anticancerígeno.

Dependiendo del resultado del inmunoensayo, el régimen de tratamiento de vacuna frente a hCG puede ajustarse con el fin de optimizar la respuesta inmunitaria frente a hCG. Un régimen de dosificación preferido dará como resultado una respuesta inmunitaria del paciente frente a tanto el fragmento de péptido C-terminal de 16mer como el fragmento de péptido N-terminal de 21mer de hCG-CTP37, con una magnitud similar de respuesta inmunitaria frente a ambos péptidos, que es detectable a partir de 9 a 15 semanas tras la administración de vacuna inicial.

Se prefiere que la respuesta inmunitaria frente a CTP21 (SEQ ID Nº: 4) sea detectable, y más preferiblemente que la respuesta inmunitaria detectada frente a CTP21 sea de magnitud similar a la respuesta inmunitaria frente a CTP16 (SEQ ID Nº: 6). Por "magnitud similar" se refiere a que la respuesta inmunitaria detectada frente a CTP21 y CTP16 no difiere en más del 50%, preferiblemente en no más del 20%. En otras palabras, la respuesta inmunitaria frente a CTP21 (SEQ ID Nº: 4) no es sustancialmente inferior a la respuesta inmunitaria frente a CTP16 (SEQ ID
Nº: 6).

\newpage

La respuesta inmunitaria de un paciente frente a hCG puede agruparse tal como sigue:

(1) pacientes sin anticuerpo anti-CTP37 detectable en su plasma (pacientes que no responden con anticuerpos); (2) pacientes en los cuales los anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 son detectables, mientras que ni los anticuerpos anti-CTP16 ni anti-CTP21 son detectables (pacientes que responden mal al tratamiento con anticuerpos); (3) pacientes con anticuerpos anti-CTP37 y anticuerpos anti-CTP16 detectables, pero sin anticuerpos anti-CTP21 detectables en su plasma (pacientes que sólo responden con anticuerpos frente a CTP16); y (4) pacientes con anticuerpos anti-CTP37, anti-CTP16 y anti-CTP21 detectables en su plasma (pacientes que responden con anticuerpos frente a CTP16 y CTP21).

Tras el inmunoensayo, los pacientes en los grupos (1), (2), (3), y pacientes en el grupo (4) en el que el nivel de anticuerpos específicos frente al fragmento N-terminal CTP21 es sustancialmente inferior al nivel de anticuerpos específicos frente al fragmento C-terminal CTP16 de hCG-CTP37, pueden tratarse con un régimen de vacunación seleccionado de uno o más de los siguientes: (i) administraciones sucesivas, separadas de la vacuna frente a hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2) con una dosis que es superior a la proporcionada en la administración inicial; (ii) administraciones sucesivas, separadas de la vacuna frente a hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2) con una dosis que corresponde a de 1 mg de péptido CTP37/paciente/administración; (iii) administraciones sucesivas, separadas de una vacuna de promotor compuesta por el péptido bucle de hCG (SEQ ID Nº: 9) derivatizado con un vehículo adecuado, en combinación con la vacuna frente a hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2); (iv) administraciones sucesivas, separadas de una vacuna de promotor compuesta por el péptido bucle de hCG (SEQ ID Nº: 9), derivatizado con un vehículo adecuado, seguido de administraciones sucesivas separadas de la vacuna frente a hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2), con una dosis de la última vacuna inferior a 1 mg de péptido CTP37/paciente/administración; (v) administraciones sucesivas, separadas de una vacuna de péptido N-terminal CTP37 compuesta por \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4), derivatizado con una proteína vehículo adecuada; (vi) administraciones sucesivas, separadas de un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4) al menos una vez cada de 1 a 2 semanas; (vii) administraciones sucesivas, separadas de un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4) junto con un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) al menos una vez cada de 1 a 2 semanas; y (viii) administraciones sucesivas separadas de una vacuna frente a \beta-hCG-CTP37 en combinación con un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4).

Tras el inmunoensayo, los pacientes en el grupo (4), en el que el nivel de anticuerpo específico frente al fragmento N-terminal CTP21 es similar en magnitud al nivel de anticuerpo específico frente al fragmento C-terminal CTP16 de \beta-hCG-CTP37, también pueden tratarse con un régimen de vacunación seleccionado de uno o más de (i) hasta (viii), detallados anteriormente.

Preferiblemente, la administración de una vacuna frente a hCG da como resultado un nivel de anticuerpos frente a \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2), \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) y \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4) detectados. Aún más preferiblemente, la administración de vacuna de péptido de hCG da como resultado un nivel de anticuerpos tanto frente a \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) como \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4) detectados, en el que la respuesta inmunitaria frente a ambos péptidos es similar en magnitud.

Se entenderá que los regímenes de tratamiento descritos anteriormente se presentan para fines a modo de ejemplo y que el régimen de tratamiento puede ajustarse según se necesite, dependiendo de la respuesta inmunitaria del paciente frente a hCG, tal como se detalló anteriormente. Un aspecto de la presente invención se refiere a la monitorización intermitente de la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG-CTP37, \beta-hCG-CTP21 y \beta-hCG-CTP16, y a un ajuste correspondiente en el régimen de tratamiento basándose en los resultados de tal monitorización.

D. Intervalos de dosis

Antes de la presente invención, las administraciones iniciales de conjugados de péptido inmunogénico de hCG para el tratamiento del cáncer contenían generalmente al menos 1,0 mg de péptido inmunogénico de hCG derivatizado con una proteína vehículo adecuada. Los resultados del estudio presentados en el ejemplo 1 sugieren que tales dosis no dan como resultado una respuesta inmunitaria tanto frente al epítopo C-terminal (CTP16, SEQ ID Nº: 6) como al epítopo N-terminal (CTP21, SEQ ID Nº: 4) de hCG-CTP37 en la mayoría de los pacientes con tratamiento y por tanto puede no ser un régimen de tratamiento eficaz para el cáncer colorrectal.

Tal como se muestra adicionalmente en el ejemplo 1, los pacientes en un ensayo clínico de fase II que demostraron una respuesta inmunitaria tanto frente al epítopo C-terminal (CTP16, SEQ ID Nº: 6) como al epítopo N-terminal (CTP21, SEQ ID Nº: 4) de hCG-CTP37 tenían tiempos de supervivencia significativamente aumentados.

La presente invención describe métodos para el tratamiento del cáncer que dan como resultado una respuesta inmunitaria tanto frente al epítopo C-terminal (CTP16, SEQ ID Nº: 6) como al epítopo N-terminal (CTP21, SEQ ID Nº: 4) de CTP37. Esto puede conseguirse mediante administración de uno o más de (1) menos de 1,0 mg de \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2) de péptido/paciente/administración, solo o en combinación con una cantidad de péptido "bucle" (SEQ ID Nº: 9), cada uno derivatizado con una molécula vehículo adecuada; (2) un péptido bucle de hCG (SEQ ID Nº: 9) derivatizado con una molécula vehículo adecuada, seguido de la administración de menos de 1,0 mg de \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2) de péptido/paciente/administración; (3) vacuna de péptido \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4), derivatizada con una proteína vehículo adecuada; (4) un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4), administrado al menos una vez cada de 1 a 2 semanas; (5) anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4) junto con un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6), administrados al menos una vez cada de 1 a 2 semanas; y (5) una vacuna frente a \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2) en combinación con un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4).

En una realización preferida, se administran 0,5 mg de CTP37 (SEQ ID Nº: 2), derivatizado con una molécula vehículo adecuada, solo o en combinación con una cantidad del péptido "bucle" (SEQ ID Nº: 9). Normalmente, la cantidad del péptido "bucle" (SEQ ID Nº: 9) administrado a un paciente dado es igual o superior a la cantidad de CTP37 (SEQ ID Nº: 2). Por ejemplo, cuando se administra la vacuna frente a CTP37 junto con la vacuna de "bucle", la cantidad del componente CTP37 de la vacuna es generalmente inferior a 1,0 mg, preferiblemente de 0,5 mg, y la cantidad de la vacuna de "bucle" en el paciente es igual, o superior, a la cantidad de CTP37 (SEQ ID Nº: 2). En un aspecto adicional de esta realización, también se administran desde 25 hasta 500 mg de un anticuerpo monoclonal humano anti-\beta-hCG-CTP21 y/o anti-\beta-hCG-CTP16 al paciente, preferiblemente de 1 a 2 veces por semana.

La cantidad de CTP37 (SEQ ID Nº: 2) con o sin péptido "bucle" (SEQ ID Nº: 9), en el régimen de tratamiento y/o la cantidad de anticuerpo monoclonal humano anti-\beta-hCG-CTP21 y/o anti-\beta-hCG-CTP16 pueden modificarse antes de administraciones sucesivas, basándose en los resultados de un inmunoensayo para determinar los anticuerpos anti-CTP37, anti-CTP16 y anti-CTP21 en un líquido corporal del paciente en tratamiento.

Regímenes de tratamiento preferidos dan como resultado una respuesta inmunitaria detectable frente a CTP37, CTP16 y CTP21, que se ha correlacionado con un tiempo de supervivencia aumentado en pacientes con cáncer colorrectal, tal como se detalla adicionalmente en el ejemplo 1.

VI. Evaluación de la respuesta inmunitaria frente a hCG

Los criterios de valoración útiles en una determinación de la eficacia de la administración de la vacuna frente a hCG incluyen una evaluación de la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2), \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6), \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4), una determinación del tamaño del tumor y del tiempo de supervivencia del paciente (por ejemplo, en semanas).

En un aspecto, la invención proporciona un medio para clasificar la respuesta inmunitaria frente a hCG en un paciente con cáncer, por ejemplo, de 9 a 15 semanas tras la administración de una vacuna frente a hCG, midiendo el nivel de anticuerpos frente al fragmento C-terminal de CTP37, \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6), el fragmento N-terminal de CTP37, \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4), y CTP37, seguido de la clasificación del paciente en uno de los siguientes cuatro grupos, basándose en su respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG-CTP16, \beta-hCG-CTP21 y \beta-hCG-CTP37: (1) pacientes sin anticuerpos anti-CTP37 detectables en su plasma (pacientes que no responden con anticuerpos); (2) pacientes en los que los anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 totales son detectables mientras que ni los anticuerpos anti-CTP16 ni anti-CTP21 son detectables (pacientes que responden mal al tratamiento con anticuerpos); (3) pacientes con anticuerpos anti-CTP37 y anticuerpos anti-CTP16 detectables, pero sin anticuerpos anti-CTP21 detectables en su plasma (pacientes que sólo responden con anticuerpo frente a CTP16); y (4) pacientes con anticuerpos anti-CTP37, anti-CTP16 y anti-CTP21 detectables en su plasma (pacientes que responden con anticuerpos frente a CTP16 y CTP21).

La presente invención incluye un dispositivo de diagnóstico para monitorizar la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG. El dispositivo incluye un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos del fragmento C-terminal de \beta-hCG-CTP37 (\beta-hCG-CTP16, SEQ ID Nº: 6), un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos del fragmento N-terminal de \beta-hCG-CTP37 (\beta-hCG-CTP21, SEQ ID Nº: 4) y un reactivo eficaz para marcar anticuerpos humanos, tal como un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado con notificador; con el fin de detectar anticuerpos humanos que son inmunorreactivos con los péptidos.

Tales dispositivos diagnósticos se conocen generalmente por los expertos en la técnica de la inmunología y se utilizan de manera rutinaria para analizar anticuerpos en los líquidos corporales de diversos sujetos.

En algunos casos, el dispositivo incluye un sustrato en fase sólida al que están unidos los péptidos de \beta-hCG.

La invención incluye además un método de monitorización de la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG llevando a cabo las etapas de hacer reaccionar una muestra de líquido corporal con un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de (1) el fragmento C-terminal de \beta-hCG-CTP37 (\beta-hCG-CTP16, SEQ ID Nº: 6), (2) el fragmento N-terminal de \beta-hCG-CTP37 (\beta-hCG-CTP21, SEQ ID Nº: 4), y (3) \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2); y detectar anticuerpos en la muestra que son inmunorreactivos con cada péptido. Se prefiere que el ensayo sea cuantitativo y en consecuencia se use para comparar el nivel de cada anticuerpo con el fin de determinar la magnitud relativa de la respuesta inmunitaria frente a cada péptido.

Los métodos de la invención son generalmente aplicables a inmunoensayos, tales como ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIE), inmunoprecipitación, inmunotransferencia de tipo Western, inmunotransferencia de puntos, análisis FACS y otros métodos conocidos en la técnica.

En una realización preferida, el inmunoensayo incluye un antígeno del péptido de hCG inmovilizado sobre un soporte sólido, por ejemplo, un ensayo ELISA.

Se apreciará que el inmunoensayo puede adaptarse fácilmente a un formato de kit mostrado como ejemplo por un kit que comprende: (A) uno o más péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de (1) el fragmento C-terminal de \beta-hCG-CTP37 (\beta-hCG-CTP16, SEQ ID Nº: 6), (2) el fragmento N-terminal de \beta-hCG-CTP37 (\beta-hCG-CTP21, SEQ ID Nº: 4), y (3) \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2) unidos a un soporte sólido; (B) medios para tomar una muestra de un sujeto; y (C) un vaso de reacción en el que se lleva a cabo el ensayo. El kit también puede comprender medios de marcación, enzimas de reacción indicadoras y sustratos, y cualquier disolución, tampón u otros componentes necesarios para el inmunoensayo.

Ejemplo 1

En un ensayo clínico de fase II aleatorizado, se asignaron 77 pacientes a regímenes de vacunas de dosis o bien alta o bien baja. Los pacientes elegibles se habían sometido a resección curativa del tumor primario, eran de cualquier raza, sexo, mayores de 18 años de edad y tenían un diagnóstico histológico de adenocarcinoma del colon o el recto que era metastásico. El diseño del estudio excluyó la quimioterapia concomitante. El protocolo requirió una prueba positiva para la hipersensibilidad de tipo retardado a uno o más antígenos de recuerdo comunes (toxoide tetánico, toxoide diftérico, estreptocinasa, tuberculina, Candida, Trichophyton) según se mide mediante pruebas cutáneas intradérmicas. Todos los pacientes dieron negativo en la prueba para la hipersensibilidad de tipo inmediato al antígeno de recuerdo del toxoide diftérico mediante una prueba cutánea intradérmica antes de la vacunación. Todos los pacientes tenían puntuaciones de rendimiento de SWOG ("Southwest Oncology Group", Grupo de Oncología del Sudoeste) de 0, 1 ó 2.

Se preparó la vacuna como una emulsión hecha a mano de vehículo de escualeno oleato de manida en una razón de 4:1 (v:v) formulado con una razón de conjugado de CTP37-toxoide diftérico (25 moléculas de péptido CTP37 sintético/10^{5} Da de DT) con respecto a adyuvante de dipéptido nor-muramilo de 20:1 (p:p) disuelto en solución salina estéril. El volumen de inoculación fue de 0,4 ml para la dosis de 0,5 mg, de 0,8 ml para la dosis de 1,0 mg y de 1,6 ml para una dosis de 2,0 mg (basado en el peso del conjugado). Se incluyeron treinta y seis pacientes en el régimen de dosis baja que consistía en 0,5 mg de vacuna en el día 0, día 28, día 70 y semana 16. Los cuarenta y un pacientes en el régimen de dosis alta recibieron 2 mg de vacuna en el día 0 seguido por 1,0 mg en el día 28, día 70 y semana 16. La vacuna se administró por vía intramuscular.

Se sabe que \beta-hCG-CTP37 (SEQ ID Nº: 2, figura 2A) contiene al menos dos epítopos, una región N-terminal (CTP21, SEQ ID Nº: 4, figura 2C), que contiene un epítopo (SEQ ID Nº: 5, figura 2D) y una región C-terminal (CTP16, SEQ ID Nº: 6, figura 2E), que contiene un epítopo (SEQ ID Nº: 8, figura 2G).

Los criterios de valoración clínicos que se evaluaron incluyeron la respuesta inmunitaria frente al fragmento N-terminal de \beta-hCG-CTP37, \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4); el fragmento C-terminal de \beta-hCG-CTP37, \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6); y el péptido CTP37 completo (SEQ ID Nº: 2), una determinación del tamaño del tumor y el tiempo de supervivencia del paciente.

Se midió el nivel de anticuerpos anti-hCG determinando la unión de hCG marcado con ^{125}I a diluciones variables de sueros recogidos a intervalos tras la inmunización, tal como se describió previamente (Jones W et al. Lancet 1:1295-1298, 1998). Los resultados se notifican como la cantidad de \beta-hCG unida en nmol por litro de suero sin diluir.

Se usó un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) indirecto, en fase sólida habitual para el análisis de los antisueros de los pacientes para detectar anticuerpos anti-DT. Brevemente, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos con DT purificado (Pasteur Merieux Connaught, Toronto, Ontario, Canadá) a una concentración de 1 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadieron diluciones de dos veces en serie de los antisueros de los pacientes a los pocillos en PBS/1% de albúmina sérica bovina (BSA) y un 0,1% de Tween-20 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos con PBS/0,1% de Tween-20 seguido por la adición de conjugado de peroxidasa del rábano-IgM, IgG, IgA de cabra anti-humana (conjugado HRP, Kierkegaard and Perry Laboratories, Gaithesburg, MD) durante 45 minutos. Tras lavar los pocillos con PBS/0,1% de Tween-20 (dos veces) y agua destilada (dos veces), se revelaron las placas mediante la adición de cromógeno (ABTS, Kierkegaard and Perry Laboratories, Gaithesburg, MD) durante 15 minutos y se analizaron posteriormente para determinar la absorbancia a 405 nm. Los resultados de las muestras de todos los pacientes se notificaron como la densidad óptica a una dilución seleccionada (1/32.000) que se produjo en un intervalo de valoración lineal.

Se sintetizaron \beta-hCG-CTP16 (SEQ ID Nº: 6) y \beta-hCG-CTP21 (SEQ ID Nº: 4) y se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución hasta > 95% de pureza (Peptide Express, Universidad del Estado de Colorado, Fort Collins, CO, EE.UU.) Se obtuvo \beta-hCG-CTP37 mediante producción con BPF (Peninsula Laboratories, Inc. Belmont, CA, EE.UU.). Se sometieron a ensayo los antisueros de los pacientes con suficiente título de anticuerpos anti-\beta-hCG para determinar la unión a CTP37, CTP21 y CTP16 usando un ensayo ELISA de competición. Antes del ensayo ELISA de competición, se determinaron la concentración óptima de recubrimiento de antígeno y la dilución óptima del antisuero para el ensayo ELISA de competición para cada antisuero mediante ensayo ELISA indirecto. Se bloqueó una placa de ELISA recubierta con CTP37 a 1,0, 0,50, 0,25 y 0,10 \mug/ml con BSA al 1% en PBS. Se añadieron a la placa varias diluciones de antisuero que oscilaban desde 1/1.000 hasta 1/60.000. Se detectaron los anticuerpos unidos con un conjugado HRP anti-humano. Se usaron las concentraciones de recubrimiento de antígeno que produjeron respuestas lineales de las densidades ópticas con respecto a las concentraciones de antisuero en el ensayo ELISA de competición. El ensayo ELISA de competición se realizó según el método descrito en otra parte con modificaciones (Chang SP et al., J. Immunol. 128: 702-705, 1982). Brevemente, se incubaron las placas con CTP37 durante la noche en PBS a una concentración predeterminada para cada antisuero y luego se bloquearon con BSA al 1%/PBS. A continuación, se preincubó el antisuero a la dilución predeterminada con diversas concentraciones de CTP37, CTP21 o CTP16 y luego se añadieron 60 \mul de cada una de las mezclas de antisuero-péptido a cada pocillo de la placa recubierta con CTP37. Se usó inmunoglobulina humana conjugada con HRP para determinar la cantidad de anticuerpos libres (que no compiten) unidos a la placa. Se calcularon los porcentajes de unión comparando las densidades ópticas de las muestras a 405 nm con la serie patrón de antisuero (sin péptidos que compiten) en la misma placa. Se promediaron valores por duplicado para cada concentración de péptido y se representaron gráficamente como % de unión frente a log_{10}[competidor peptídico] y se ajustaron con la ecuación de competición por un sitio usando el software GraphPad PRISM^{TM} (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA). Se usaron los software Microsoft Excel y GraphPad PRISM^{TM} para los análisis estadísticos incluyendo curvas de Kaplan-Meier para representar la supervivencia y pruebas de rangos logarítmicos para comparar la supervivencia. Los valores de P de 0,05 o inferiores se consideraron significativos.

Se midió la respuesta inmunitaria frente a hCG en el suero de los pacientes desde 0 hasta 24 semanas tras el inicio de la vacunación. Se observó una producción de anticuerpos frente a hCG significativa en la semana 12 del protocolo de vacunación (figura 3).

El título de anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 era dependiente de la dosis, ya que la dosis inicial de 2,0 mg de vacuna dio como resultado un mayor título de anticuerpos que el régimen de dosificación de 0,5 mg (figura 3). Aunque la mayor área del tumor no aumentó significativamente en los pacientes que recibieron la dosis baja, se observó crecimiento del tumor en el régimen de dosis alta y la mayor área promedio del tumor fue significativamente diferente entre los dos regímenes de dosis (p < 0,05, figura 4). Por tanto, la respuesta inmunitaria frente a CTP-37 no se correlacionó con la mayor área promedio del tumor. Además, el tiempo de supervivencia medio del paciente fue de 39,9 semanas para el grupo de dosis baja y de 32,4 semanas para el grupo de dosis alta. La razón de anticuerpo/mayor área del tumor aumentó exponencialmente con el tiempo (figura 5).

También se mostró que la vacuna también generaba una respuesta inmunitaria mediada por células según se determinó mediante la respuesta de proliferación de CMSP frente a varios antígenos (PHA, CTP-37, CTP-37-KI, DT y \beta-hCG). Se añadió el mitógeno a 1, 0,1 ó 0,01 \mug/pocillo (los datos presentados en la figura 6 son de la concentración de 1 \mug/ml). El índice de estimulación con PHA era superior a 4, por tanto, la figura 6 no es correcta para esos puntos de datos. Los valores correctos para PHA son 79 para lo normal; 147 para el paciente 1 y 2819 para el paciente 2. El método se describe además en Triozzi, et al, 1997.

La respuesta de anticuerpos frente a CTP-37 se correlacionó con la supervivencia del paciente; sin embargo, el título de anticuerpos frente a DT no se correlacionó con la supervivencia del paciente para ninguno de los grupos de dosis alta o baja.

Aunque el mecanismo subyacente al descubrimiento no es parte de la invención reivindicada, los resultados sugieren que la respuesta de anticuerpos frente a epítopos particulares de la subunidad beta de hCG puede actuar a través de mecanismos farmacocinéticos (aclaramiento aumentado de hCG) y/o farmacodinámicos (interferencia con la unión de hCG a receptores). La evaluación de muestras de suero extraídas de pacientes inmunizados con CTP37 en un ensayo de competición con cualquiera de los péptidos CTP16 o CTP21 de CTP37, indicó una mayor respuesta inmunitaria frente a CTP16 en relación con la respuesta inmunitaria frente a CTP21, lo que sugiere que CTP16 es inmunodominante en seres humanos.

La respuesta inmunitaria de los pacientes que recibieron una inyección intramuscular de CTP37-DT se clasificaron en 4 grupos, tal como sigue: (1) pacientes en los que no son detectables ni anticuerpos primeros ni segundos, ni anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 totales (pacientes que no responden con anticuerpos); (2) pacientes en los que son detectables anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 totales mientras que no son detectables ni anticuerpos primeros ni segundos (pacientes que responden mal con anticuerpos); (3) pacientes que tienen un nivel detectable de primeros anticuerpos, pero niveles indetectables de segundos anticuerpos (pacientes que sólo responden con anticuerpos frente a CTP16); y (4) pacientes que tienen niveles detectables de anticuerpos tanto primeros como segundos (pacientes que responden con anticuerpos frente a CTP16 y CTP21) (tabla 1).

TABLA 1 Características de los pacientes de cuatro subpoblaciones de respuesta de anticuerpos

1

Las curvas de supervivencia para los pacientes en cada uno de los cuatro grupos de respuesta de anticuerpos se muestran en la figura 7. Se encontró que estas curvas de supervivencia eran significativamente diferentes entre sí (p = 0,0019). Los tiempos de supervivencia medios eran de 16,4 semanas para los 21 pacientes sin anticuerpos anti-hCG, 29,6 semanas en los 20 pacientes que comprenden el grupo de mala respuesta de título de anticuerpos, 34,8 semanas en los 20 pacientes sólo con reconocimiento del epítopo CTP16 y 64,6 semanas en los 15 pacientes que montaron una respuesta tanto frente a CTP16 como a CTP21, según se resume en la tabla 2, a continuación.

TABLA 2 Respuesta inmunitaria frente a CTP37 en el ensayo clínico de fase II

3

Además, el aumento del tiempo de supervivencia para los pacientes con una respuesta inmunitaria detectada tanto frente a CTP16 como a CTP21 pronosticaba un aumento del tiempo de supervivencia para los grupos de tratamiento de dosis tanto alta como baja.

El beneficio en la supervivencia para los pacientes con reconocimiento de anticuerpos de ambos epítopos CTP16 y CTP21 en la vacuna de CTP37 ("respuesta de doble epítopo") no se relacionó con una medición general del estado inmunitario global del paciente. Tal como se muestra en la tabla 1, no hubo diferencias significativas entre los cuatro grupos en los niveles de IgG sérica promedio. Además, no hubo diferencia en el número de antígenos de recuerdo frente a los que respondieron, ni en la magnitud de la respuesta frente a antígenos de recuerdo en una prueba cutánea antes de la administración de la vacuna de péptido CTP37. Además, no se observó diferencia significativa en el título medio de anticuerpos anti-hCG al comparar los grupos que responden frente a CTP16 sólo, y CTP16 y CTP21.

Los resultados presentados en el presente documento demuestran un aumento del tiempo de supervivencia según desarrollaron los pacientes una respuesta de doble epítopo. El tiempo de supervivencia medio de los pacientes que responden a doble epítopo fue de 65 semanas, lo que representa una duración de la supervivencia más prolongada comparado con los pacientes tratados con irinotecán. El título de anti-hCG medio global en los pacientes que fueron capaces de desarrollar anticuerpos frente a ambos epítopos de CTP37 no fue diferente significativamente comparado con aquellos pacientes sólo capaces de desarrollar una respuesta frente al epítopo CTP16 (tabla 1). Sin embargo, el tiempo de supervivencia medio fue casi el doble de prolongado en el grupo que responde a doble epítopo comparado con el grupo de epítopo único. Estos resultados indican que la naturaleza cualitativa de la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG puede desempeñar un papel en la determinación de la eficacia de la vacuna y, además, los resultados respaldan la hipótesis de que la respuesta de anticuerpos frente a \beta-hCG se asocia directamente con la supervivencia del paciente.

Ejemplo 2

Se inmunizaron conejos con CTP37 y se midió la respuesta inmunitaria frente a CTP16 y CTP21. Se detectó una mayor respuesta inmunitaria frente a CTP16 con respecto a la respuesta inmunitaria frente a CTP21 en un inmunoensayo de competición, lo que indica que, de manera similar a los seres humanos, CTP16 es inmunodominante en conejos (tabla 3).

Cuando se inmunizaron conejos con el péptido "bucle" hCG solo, se detectó una respuesta inmunitaria frente a CTP16 en un ensayo de competición, mientras que no se detectó respuesta frente a CTP21, y cuando se inmunizaron conejos con CTP37 y el péptido bucle, se detectó una respuesta inmunitaria tanto frente a CTP16 como a CTP21 en el ensayo de competición. Tras la administración combinada de vacunas de CTP37 y péptido "bucle" hCG, la respuesta inmunitaria frente a CTP16 no pareció ser inmunodominante.

TABLA 3 Mapeo de epítopos y bioneutralización^{1}

4

	^{1} + = DE 50 > 1.000 ng; ++ = DE 50 < 250 ng; +++ = DE 50 < 10 ng.
	^{2} Efecto pro = respuesta frente a hCG superior que la del control sin antiduero.
	^{3} N.R. = no realizado.

Los resultados de estos estudios de inmunización sobre la administración combinada de la vacuna de péptido CTP37 y la vacuna de "bucle" hCG indican que la coadministración de los péptidos CTP37 y "bucle" da como resultado un aumento de la respuesta inmunitaria frente a CTP21 y una magnitud similar de la respuesta inmunitaria tanto frente a CTP16 como a CTP21, lo que sugiere que el péptido "bucle" puede ser eficaz como vacuna de refuerzo, dando como resultado una respuesta inmunitaria más equilibrada frente a \beta-hCG-CTP16 y \beta-hCG-CTP21, que la administración de CTP37 solo.

TABLA 4 Tabla de secuencias

6

<110> AVI BioPharma, Inc.

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<120> Anticuerpos específicos anti gonadotropina corionica humana y su uso en terapia y diagnóstico

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<130> 0450-0027.41

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<140> PCT/US00/13392

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<141> 2000-05-15

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/134.419

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 199-05-17

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/134.432

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 199-05-17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 165

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 37

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro}

\sac{Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr}

\sac{Pro Ile Leu Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido C-terminal de hCG con metionina N-terminal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala}

\sac{Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp}

\sac{Thr Pro Ile Leu Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro}

\sac{Pro Ser Leu Pro Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Residuos 150-165 de la subunidad beta de hCG con C N-terminal añadido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro}

\sac{Gln Val Val Cys}

Claims (8)

1. Un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con un fragmento N-terminal de 21mer de \beta-hCG-CTP37, denominado dicho fragmento \beta-hCG-CTP21 y expuesto en la SEQ ID Nº: 4.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, contenido en una solución en una forma adecuada para inyección en un paciente humano.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, en combinación con un anticuerpo monoclonal humano específicamente inmunorreactivo con un fragmento C-terminal de 16mer de \beta-hCG-CTP37, denominado dicho fragmento \beta-hCG-CTP16 y expuesto en la SEQ ID Nº: 6, y contenido en una solución adecuada para inyección en un paciente humano.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, atrapado en liposomas recubiertos con una carcasa de polietilenglicol eficaz para aumentar el tiempo de circulación en la sangre de los liposomas lo suficiente como para permitir el secuestro de los liposomas en un sitio de tumor sólido, cuando se administra por vía intravenosa.

5. Método para clasificar al respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG, que comprende:

(a)

medir in vitro los niveles de anticuerpos primeros, segundos y totales de \beta-hCG del paciente frente a \beta-hCG-CTP16, expuesto en la SEQ ID Nº: 6, \beta-hCG-CTP21, expuesto en la SEQ ID Nº: 4; y \beta-hCG-CTP37, expuesto en la SEQ ID Nº: 2, respectivamente, y

(b)

clasificar al paciente en uno de los siguientes cuatro grupos, dependiendo de los niveles medidos de anticuerpos primero y segundo:

(i)

pacientes en los que no son detectables ni los anticuerpos primeros ni segundos, ni los anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 totales, denominados dichos pacientes pacientes que no responden con anticuerpos;

(ii)

pacientes en los que pueden detectarse los anticuerpos anti-\beta-hCG-CTP37 totales mientras que no pueden detectarse los anticuerpos ni primeros ni segundos, denominados dichos pacientes pacientes que responden mal al tratamiento con anticuerpos;

(iii)

pacientes que tienen un nivel detectable de primeros anticuerpos, pero niveles no detectables de segundos anticuerpos, denominados dichos pacientes pacientes que sólo responden con anticuerpo frente a CTP16; y

(iv)

pacientes que tienen niveles detectables de anticuerpos tanto primeros como segundos, denominados dichos pacientes pacientes que responden con anticuerpos frente a CTP16 y CTP21.

6. Dispositivo de diagnóstico para monitorizar la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG, que comprende:

(a)

un fragmento C-terminal de 16mer de \beta-hCG-CTP37, denominado dicho fragmento \beta-hCG-CTP16 y expuesto en la SEQ ID Nº: 6;

(b)

un fragmento N-terminal de 21mer de \beta-hCG-CTP37, denominado dicho fragmento \beta-hCG-CTP21 y expuesto en la SEQ ID Nº: 4;

(c)

el péptido \beta-hCG-CTP37, expuesto en la SEQ ID Nº 2; y

(d)

medio de reactivos para marcar anticuerpos humanos que son inmunorreactivos con fragmentos (a), (b) y (c) con un notificador detectable.

7. Dispositivo según la reivindicación 6, que además incluye un sustrato en fase sólida al que están unidos los fragmentos (a), (b), y (c), y dicho medios de reactivos incluyen anticuerpos anti-inmunoglobulina humana marcados con notificador.

8. Método para monitorizar la respuesta inmunitaria frente a \beta-hCG, que comprende:

(a)

hacer reaccionar una muestra de líquido corporal con un reactivo en fase sólida que tiene unido al mismo, un fragmento C-terminal de 16mer de \beta-hCG-CTP37, denominado \beta-hCG-CTP16 y expuesto en la SEQ ID Nº: 6, un fragmento N-terminal de 21mer de \beta-hCG-CTP37, denominado \beta-hCG-CTP21 y expuesto en la SEQ ID Nº: 4, y \beta-hCG-CTP37, expuesto en la SEQ ID Nº: 2, en presencia de anticuerpos marcados con notificador específicamente inmunorreactivos con los tres péptidos; y

(b)

determinar el nivel de los tres anticuerpos del líquido corporal a partir de la cantidad de anticuerpos marcados con notificador unidos al soporte sólido.