ES2290737T3 - Poli(esteres de beta-amino) y sus usos. - Google Patents

Poli(esteres de beta-amino) y sus usos. Download PDF

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Abstract

Un compuesto de la fórmula: en donde cada R¿ está independientemente seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de cadena corta C1-C6, alcoxi de cadena corta C1-C6, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril, fenil, heterociclo, carbociclo, y halógeno; n es un número entero ente 3 y 10.000; x es un número entero entre 1 y 10; y cuando X es metil o NR2; y R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril; o cuando X es OR; y R se selecciona del grupo que consiste en alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril; y es un número entero entre 1 y 10; o cuando X es OR; y R es hidrógeno, y es 5 o un número entero entre 1 y 2 o 6 y 10 y derivados y sales del mismo.

Description

Poli(ésteres de \beta-amino) y sus usos.
Ayuda del gobierno
El trabajo descrito aquí fue financiado, en parte, por becas de la Nacional Science Foundation (Acuerdo de cooperación #ECC9843342 para el MIT Biotechnology Process Engineering Center), el Nacional Institutes of Health (GM26698; NRSA Beca #1F32 GM20227-01), y el Department of the Army (Acuerdo de cooperación #DAMD 17-99-2-9-001 para el Center for Innovative Minimally Invasive Therapy). El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre la invención.
Antecedentes de la invención
El tratamiento de enfermedades humanas a través de la aplicación de fármacos basados en nucleótidos tales como ADN y ARN tiene el potencial de revolucionar el campo médico (Anderson Nature 392 (Suppl.): 25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2:144-147, 1996; Cristal Science 270:404-410, 1995; Mulligan Science 260:926-932, 1993. Hasta ahora, el empleo de virus modificados como vectores de transferencia de genes ha representado generalmente la aproximación clínicamente más exitosa de la terapia génica. Mientras que los vectores virales son actualmente los agentes de transferencia de genes más eficientes, las preocupaciones acerca de la seguridad total de los vectores virales, que incluye el potencial de respuestas inmunes no deseadas, han producido esfuerzos paralelos para desarrollar alternativas no virales (para referencias principales, véase: Luo et al. Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993). Las alternativas actuales para los vectores virales incluyen sistemas de trasporte poliméricos (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113,1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995), formulaciones de liposomas (Miller Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768-1785, 1998; Hope et al. Molecular Membrane Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh et al. New J. Chem. 21:113-124, 1997; y protocolos de inyección de ADN "desnudo" (Sanford Trends Biotechnol 6:288-302, 1988). Mientras que estas estrategias tienen todavía que alcanzar la eficacia clínica de los vectores virales, la seguridad potencial, el procesamiento, y los beneficios económicos ofrecidos por estos métodos (Anderson Nature 392 (suplemento): 25-30, 1996) han despertado el interés por el desarrollo continuado de aproximaciones no virales para terapia génica (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Putnam et al. Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al J. AM. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999; Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al. Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993).
Los polímeros catiónicos se han usados ampliamente como vectores de transfección debidos a la facilidad con que se condensan y protegen las hebras de ADN cargadas negativamente. Los polímeros que contienen amina tales como poli(lisina) (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995), poli(etilenimina) (PE) (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995), y dendrímeros de poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al. Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993) están cargados positivamente al pH fisiológico, forman pares de iones con los ácidos nucleicos, y median la transfección en una variedad de líneas celulares. A pesar de su uso común, sin embargo, los polímeros catiónicos tales como poli(lisina) y PEI pueden ser significativamente citotóxicos (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Deshmukh et al. New J. Chem. 21:113-124, 1997; Choksakulnimitr et al. Controlled Release 34:233-241, 1995; Brazeau et al. Pharm. Res. 15:680-684, 1998). Corno resultado, la elección del polímero catiónico para una aplicación de transferencia de genes generalmente requiere un compromiso entre la transfección eficiente y la toxicidad a corto y largo plazo. Adicionalmente, la biocompatibilidad a largo plazo de estos polímeros permanece como un problema importante para el uso en aplicaciones terapéuticas in vivo, ya que varios de estos polímeros no son fácilmente biodegradables (Uhrich Trends Polym. Sci. 5:388-393, 1997; Roberts et al. J. Biomed. Mater.Res. 30:53-65, 1996).
Para desarrollar alternativas seguras a los vectores poliméricos existentes y otros biomateriales funcionalizados, han sido desarrollados poliésteres degradables que portan cadenas laterales catiónicas (Putnam et al. Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Barrera et al. J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon et al. Macromolecules 22:3250-3255, 1989; Lim et al J.Am: Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Zhou et al. Macromolecules 23:3399-3406, 1990). Ejemplos de estos poliésteres incluyen poli(L-lactida-co-L-lisina) (Barrera et al J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993), poli(éster de serina) (Zhou et al. Macromolecules 23:3399-3406, 1990),poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al. Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al. J. AM. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999), y más recientemente, poli[ácido de \alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico]. El poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina; y poli[ácido de \alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico se demostró recientemente que condensan el ADN plasmídico a través de interacciones electrostáticas, y que median la transferencia de genes (Putnam et al. Macromolécules 32:3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999). Es importante que estos nuevos polímeros son significativamente menos tóxicos que poli(lisina) y PEI, y se degradan como metabolitos no tóxicos. Está claro por estas investigaciones que el diseño racional de poliésteres que contienen amina pueden ser una ruta productiva para el desarrollo de vectores de transfección eficaces, seguros. Desgraciadamente, sin embargo, la síntesis actual de estos polímeros requiere o la preparación independiente de los monómeros especializados (Barrera et al. J. AM. Chem. Soc, 115:11010-11011, 1993), o el uso de cantidades estequiométricas de reactivos de acoplamiento caros (Putnam et al. Macromolecules 32:3658-3662, 1999). Adicionalmente, las funcionalidades de amina en los monómeros deben estar protegidas antes de la polimerización (Putnam et al Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al J. Am. Chem. Soc 121:5633-5639, 1999; Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074, 1999; Barrera et al. J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon et al Macromolecules 22:3250-3255, 1989), necesitando etapas adicionales de desprotección posteriores a la polimerización antes de que los polímeros puedan usarse como agentes de transfección.
El documento de patente de los Estados Unidos 2002/0131951 describe poli(ésteres de \beta-amino) preparados por la adición de conjugados de bis(aminas secundarias) o aminas primarias a un bis(éster de acrilato) y su uso en sistemas de dispensación de fármacos.
Hay una necesidad continuada de polímeros biocompatibles, biodegradables, no tóxicos que puedan usarse para transfectar ácidos nucleicos y que sean preparados fácil eficiente y económicamente. Tales polímeros tendrían varios usos, incluyendo la dispensación de ácidos nucleicos en terapia génica así como en el empaquetado y/o dispensación de agentes de diagnóstico, terapéuticos, y profilácticos.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona polímeros útiles en la preparación de dispositivos para la dispensación de fármacos y composiciones farmacéuticas de los mismos. La invención también proporciona métodos de preparar los polímeros y métodos de preparar microesferas y otras composiciones farmacéuticas que contienen los polímeros de la invención.
Los polímeros de la presente invención son poli(ésteres de \beta-amino) y sales y derivados de los mismos. Los polímeros preferidos son biodegradables y biocompatibles. Típicamente, los polímeros tienen una o más aminas terciarias en el esqueleto del polímero. Los polímeros preferidos tienen una o dos aminas terciarias por unidad repetida del esqueleto. Los polímeros pueden también ser copolímeros en los que uno de los componentes es un poli(éster de Í3-amino). Los polímeros de la invención pueden fácilmente prepararse condensando bis(aminas secundarias) o aminas primarias con bis(ésteres de acrilato). Un polímero de la presente invención se define generalmente como sigue:
1
en donde
X se selecciona del grupo que consiste en alquilo de cadena corta C_{1}-C_{6}, alcoxi de cadena corta C_{1}-C_{6}, halógeno, OR y NR_{2}; más preferiblemente, metil, OH, o NH_{2};
R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril;
Cada R' está independientemente seleccionada del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de cadena corta C_{1}-C_{6}, alcoxi de cadena corta C_{1}-C_{6}, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril, fenil, heterociclo, carbociclo, y halógeno; preferiblemente, R' es hidrógeno, metil, etil, propil, isopropil, butil, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, hidroxi, amino, fluoro, cloro, o bromo; más preferiblemente, R'' es fluoro, hidrógeno, o metil;
n es un número entero ente 3 y 10.000;
x es un número entero entre 1 y 10; preferiblemente, x es un número entero entre 2 y 6;
y es un número entero entre 1 y 10; preferiblemente, x es un número entero entre 2 y 6;
y
derivados y sales del mismos. Polímeros alternativos que no son parte de la invención se representan por cualquiera de las fórmulas a continuación:
2
3
donde A y B son enlazadores que pueden ser cualquier cadena sustituida o no sustituida, lineal o ramificada de átomos de carbono o heteroátomos. Los pesos moleculares de los polímeros pueden estar en el intervalo desde 1000 g/mol a 20.000 g/mol, preferiblemente de 5.000 g/mol a 15.000 g/mol. B puede ser una cadena alquílica de uno a doce átomos de carbono. B puede ser una cadena heteroalifática que contiene un total de uno a doce átomos de carbono y heteroátomos. Los grupos R_{1} y R_{2} pueden ser cualquiera de una amplia variedad de sustituyentes. R_{1} y R_{2} pueden contener aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, grupos hidroxi, y grupos alcoxi. Los polímeros pueden ser terminados en amina; y los polímeros pueden estar terminados en acrilato. Los grupos R_{1} y/o R_{2} pueden formar estructuras cíclicas con el enlazador A (véase la sección Descripción detallada más tarde). Los polímeros que contienen tales restos cíclicos tienen la característica de ser más solubles a pH bajo. Específicamente los polímeros preferidos son aquellos que son insolubles en soluciones acuosas a pH fisiológico (pH 7,2-7,4) y son solubles en soluciones acuosas por debajo de pH fisiológico (pH<7,2). Otros polímeros preferidos son aquellos que son solubles en solución acuosa a pH fisiológico (pH 7,2-7,4) y por debajo. Los polímeros preferidos son útiles en la transfección de polinucleótidos dentro de las células.
Se proporciona un método de preparar los polímeros de la invención. Monómeros comercialmente disponibles o monómeros fácilmente disponibles, bis(aminas secundarias), aminas primarias, y bis(ésteres de acrilato) pueden ser sometidos a condiciones que conduzcan a la adición del conjugado de la amina a el bis(éster de acrilato). En una realización particularmente preferida, cada uno ,je los monómeros se disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, DMSO, DMF, THF, éter dietílico, cloruro de metileno, hexanos, etc), y las soluciones obtenidas se combinan y calientan por un tiempo suficiente para conducir a la polimerización de los monómeros. En otras realizaciones, la polimerización se lleva a cabo en la ausenoia de disolvente. El polímero obtenido puede después purificarse y opcionalmente caracterizarse usando las técnicas conocidas en la técnica.
En todavía otro aspecto de la invención, los polímeros se usan para formar complejos de escala nanométrica con los ácidos nucleicos. Los complejos de polinucleótido/polímero pueden formarse añadiendo una solución de polinucleótido a una solución agitada (con vortex) del polímero a una concentración ADN/polímero deseada. La relación peso a peso del polinucleótido al polímero puede estar en el intervalo de 1:0,1 a 1:200, preferiblemente de 1:10 a 1:150, más preferiblemente de 1:50 a 1:150. La relación de monómero de amina a fosfato de polinucleótido puede ser aproximadamente 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 14C:1, 150;1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1, y 200:1. Los polímeros catiónicos condensan el polinucleótido en partículas solubles típicamente de 50-500 nm de tamaño. Estos complejos polinucleótido/polímero pueden usarse en la dispensación de polinucleótidos a las células. En una realización particularmente preferida, estos complejos se combinan con excipientes farmacéuticos para formar composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a animales incluyendo humanos. En ciertas realizaciones, se usa un polímero con una relación peso molecular a átomos de nitrógeno alta (por ejemplo, polilisina, polietilenimina) para aumentar la eficiencia de la transfección.
En otro aspecto de la invención, los polímeros se usan para encapsular agentes terapéuticos, para diagnosis, y/o profiláticos incluyendo polinucleótidos para formar micropartículas. Típicamente estas micropartículas son de un orden de magnitud mayor que los complejos polinucleótido/polímero. Las micropartículas están en el intervalo de desde 1 micrómetro a 500 micrómetros. En una realización particularmente preferida, estas micropartículas permiten la administración de moléculas pequeñas lábiles, proteínas, péptidos, y/o polinucleótidos a un individuo. Las micropartículas pueden prepararse usando cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica de hacer micropartículas, tales como, por ejemplo, doble emulsión, inversión de fase, y secado por pulverización. En una realización particularmente preferida, las micropartículas pueden usarse para la administración dirigida por el pH de los contenidos encapsulados debido a la naturaleza de la respuesta de los polímeros al pH (por ejemplo, siendo más solubles a pH bajo).
En todavía otro aspecto, se proporciona un sistema pira sintetizar y cribar una colección de polímeros. En ciertas realizaciones, el sistema aprovecha la ventaja de técnicas conocidas en la técnica automática de manejo de líquidos y la robótica. El sistema de sintetizar y cribar puede usarse con poli(ésteres de beta-amino) así como otros tipos de polímeros que incluyen poliamidas, poliésteres, poliéteres, policarbamatos, policarbonatos, poliureas, poliaminas, etc. La colección de polímeros puede ser una colección de un tipo de polímero por ejemplo, todos poli(ésteres de beta-amino) o puede ser una colección diversa de polímeros. Miles de polímeros pueden sintetizarse y cribarse en paralelo usando el sistema de la invención. En ciertas realizaciones, los polímeros se criban por propiedades útiles en el campo de dispensación de genes, transfección, o terapia génica. Algunas de estas propiedades incluyen la solubilidad a varios pHs, habilidad para complejar polinucleótidos, habilidad para transfectar un polinucleótido dentro de una célula, etc. Ciertos poli(ésteres de beta-amino) encontrados útiles para transfectar células incluyen M17, KK89, C32, C36, JJ28, JJ32, JJ36, LL6, y D94 como se describe en los ejemplos 4 y 5.
Definiciones
Lo que sigue son términos químicos usados en la solicitud y reivindicaciones:
El término acil como se usa aquí se refiere a un grupo que tiene la fórmula general C(=O)R, donde R es alquil, alquenil, alquinil, aril, carbociclo, heterociclo, o heterociclo aromático. Un ejemplo de un grupo acil es acetil.
El término alquil como se usa aquí se refiere a radicales de hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada derivada de un resto de hidrocarburo que contiene entre uno y veinte átomos de carbono por eliminación de un átomo de hidrógeno único. En algunas realizaciones, el grupo alquil empleado en la invención contiene 1-10 átomos de carbono. En otra realización, el grupo alquil empleado contiene 1-8 átomos de carbono. En todavía otras realizaciones, el grupo alquil contiene 1-6 átomos de carbono. En todavía otras realizaciones, el grupo alquil contiene 1-4 carbonos. Ejemplos de radicales alquil incluyen, pero no están limitados a, metil, etil, n-propil, isopropil, n-butil, iso-butil, sec-butil, sec-pentil, iso-pentil, terc-butil, n-pentil, neopentil, n-hexil, sec-hexil, n-heptil, n-octil, n-decil, n-undecil, dodecil, y semejantes, que pueden llevar uno o más sustituyentes.
El término alcoxi como se usa aquí se refiere a un grupo saturado (por ejemplo, alquil-O-) o insaturado (por ejemplo, alquenil-O- y alquinil-O-) unido al resto molecular de origen a través de un átomo de oxígeno. En ciertas realizaciones, el grupo alquil contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras realizaciones, los grupos alquil, alquenil, y alquinil empleados en la invención contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquil contiene 1-6 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquíl contiene 1-4 átomos de carbono alifáticos. Los ejemplos incluyen pero no están limitados a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, terc-butoxi, i-butoxi, sec-butoxi, neopentoxi, n-hexoxy, y semejantes.
El término alquenil denota un grupo monovalente derivado de un resto hidrocarburo que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono por la eliminación de un único átomo de hidrógeno. En ciertas realizaciones, el grupo alquenil empleado en la invención contiene 1-20 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo alquenil empleado en la invención contiene 1-10 átomos de carbono. En otra realización, el grupo alquenil empleado contiene 1-8 átomos de carbono. En todavía otras realizaciones, el grupo alquenil contiene 1-6 átomos de carbono. En todavía otras realizaciones, el grupo alquenil contiene 1-4 carbonos. Los grupos alquenil incluyen, por ejemplo, etenil, propenil, butenil, 1-metil-2-buten-1-il, y semejantes.
El término alquinil como se usa aquí se refiere a un grupo monovalente derivado de un hidrocarburo que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono por la eliminación de un único átomo de hidrógeno. En ciertas realizaciones, el grupo alquinil empleado en la invención contiene 1-20 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo alquinil empleado en la invención contiene 1-10 átomos de carbono. En otra realización, el grupo alquinil empleado contiene 1-8 átomos de carbono. En todavía otras realizaciones, el grupo alquinil contiene 1-6 átomos de carbono. Grupos alquinil representativos incluyen, pero no están limitados a, etinil, 2-propinil (propargil), 1-propinil, y
semejantes.
Los términos alquilamino, dialquilamino, y trialquilamino como se usan aquí se refieren a uno, dos, tres, grupos alquil, respectivamente, como se ha definido previamente, unidos al resto molecular de origen a través de un átomo de nitrógeno. El término alquilamino se refiere a un grupo que tiene la estructura –NHR' en donde R' es un grupo alquil, como se definió previamente; y el término dialquilamino se refiere a un grupo que tiene la estructura –NR'R'', en donde R'y R'' se seleccionan cada una independientemente del grupo que consiste en grupos alquil. El término trialquilamino se refiere a un grupo que tiene la estructura –NR'R''R''', en donde R', R'', y R''' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste en grupos alquil. En ciertas realizaciones, el grupo alquil contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras realizaciones, el grupo alquil contiene 1-10 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquil contiene 1-8 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquil contiene 1-6 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquil contiene 1-4 átomos de carbono alifáticos. Adicionalmente, R', R'', y/o R''' tomados juntos pueden opcionalmente ser -(CH_{2})_{k}- donde k es un número entero de 2 a 6. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, metilamino, dimetilamino, etilamino, dietilamino, dietilaminocarbonil, metiletilamino, iso-propilamino, piperidino, trimetilamino, y propilamino.
Los términos alquiltioéter y tioalcoxi se refieren a un grupo saturado (por ejemplo, alquil-S-) o insaturado (por ejemplo, alquenil-S- y alquinil-S-) unidos al resto molecular de origen a través de un átomo de azufre. En ciertas realizaciones, el grupo alquil contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras realizaciones, el grupo alquil contiene 1-10 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos alquil, alquenil, y alquinil contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos alquil, alquenil, y alquinil contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos alquil, alquenil, y alquinil contienen 1-4 átomos de carbono alifáticos. Ejemplos de restos tioalcoxi incluyen, pero no están limitados a, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, n-buliltio, y semejantes.
El término aril como se usa aquí se refiere a un resto insaturado cíclico que comprende al menos un anillo aromático. En ciertas realizaciones, el grupo aril se refiere a un sistema de anillo carbocíclico mono o bicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos que incluyen, pero no están limitados a, fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, indenil, y semejantes. Los grupos aril pueden estar sustituidos o no sustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquil, alquenil, alquinil, haloalquil, alcoxi, tioalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, acilamino, ciano, hidroxi, halo, mercapto, nitro, carboxialdehído, carboxi, alcoxicarbonilo, y carboxamida, lineales o ramificados. Además, los grupos aril sustituidos incluyen tetrafluorofenil y pentafluorofenil.
El término ácido carboxílico como se usa aquí se refiere a grupos de fórmula -CO_{2}H.
Los términos halo y halógeno como se usan aquí se refieren a un átomo seleccionado de fluoro, cloro, bromo, y yodo.
El término heterocíclico, como se usa aquí, se refiere a un sistemas de anillo de 3 a 10 miembros, aromático o no aromático, parcialmente insaturado o totalmente saturado, que incluye anillos sencillos de 3 a 8 átomos de tamaño y sistemas de anillos bi- y tri-cíclicos que pueden incluir arilos de cinco o seis miembros aromáticos o grupos aromáticos heterocíclicos fusionados a anillos no aromáticos. Estos anillos heterocíclicos incluyen aquellos que tienen de uno a tres heteroátomos, independientemente seleccionados de oxígeno, azufre, y nitrógeno, en los que los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden opcionalmente estar oxidados y el heteroátomo nitrógeno puede opcionalmente estar cuaternizado. En ciertas realizaciones, el término heterocíclico se refiere a anillos de 5, 6, o 7 miembros no aromáticos o un grupo policíclico en donde al menos un átomo del anillo es un heteroátomo seleccionado de O, S, y N (en donde los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados), incluyendo, pero no limitado a, un grupo bi o tricíclico, que comprende anillos de seis miembros fusionados que tienen entre uno y tres heteroátomos independientemente seleccionados de oxígeno, azufre, y nitrógeno, en donde (i) cada anillo de 5 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, cada anillo de 6 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, y cada anillo de 7 miembros tiene de 0 a 3 dobles enlaces, (ii) los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, (iii) el heteroátomo nitrógeno puede opcionalmente estar cuaternizado, y (iv) cualquiera de los anillas heterocíclicos anteriores puede estar fusionado a un anillo arito o heteroarilo.
El término heterocíclico aromático, como se usa aquí, se refiere a un radical cíclico aromático que tiene de cinco a diez átomos en el anillo de los cuales un átomo de anillo se selecciona de azufre, oxígeno, y nitrógeno; cero, uno, o dos átomos del anillo son heteroátomos adicionales independientemente seleccionados de azufre, oxígeno y nitrógeno; y los átomos del anillo restantes son carbono, el radical se une al resto de la molécula vía cualquiera de los átomos del anillo, tales son, por ejemplo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolonilo, y semejantes. Los grupos aromáticos heterocíclicos pueden ser no sustituidos o sustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consisten en alquil, alquenil, alquinil, haloalquil, alcoxi, tioalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, acilamino, ciano, hidroxi, halo, mercapto, nitro, carboxialdehido, carboxi, alcoxicarbonil, y carboxamida lineales o
ramificados.
Los grupos heterocíclicos y aromáticos heterocíclicos específicos que pueden estar incluidos en los compuestos de la invención incluyen: 3-metil-4-(3-metilfenil)piperazina, 3 metilpiperidina, 4-(bis-(4-fluorofenil)metil)piperazina, 4-(difenilmetil)piperazina, 4-(etoxicarbonil)piperazina, 4-(etoxicarbonilmetil)piperazina, 4-(fenilmetil)piperazina, 4-(1-feniletil)piperazina, 4-(1,1-dimetiletoxicarbonil)piperazina, 4-(2-(bis-(2-propenil)amino)etil)piperazina, 4-(2-(dietilamino;etil)piperazina, 4-(2-clorofenil)piperazina, 4-(2-cianofenil)piperazina, 4-(2-etoxifenil)piperazina, 4-(2-etilfenil)piperazina, 4-(2-fluorofenil)piperazina, 4-(2-hidroxietil)piperazina, 4-(2-metoxietil)piperazina, 4-(2-metoxifenil)piperazina, 4-(2-metilfenil)piperazina, 4(2-metiltiofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-feniletil)piperazina, 4-(2-piridil)piperazina, 4-(2-pirímidinil)piperazina, 4-(2,3-dimetilfenilpiperazina, 4-(2,4-difluorofenil)piperazina, 4-(2,4-dirnetoxifenil)piperazina, 4-(2,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,5-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,6-dimetilfenil)piperazina, 4-(3-clorofenil)piperazina, 4-(3-metilfenil)piperazina, 4-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(3,4-diclorofenil)piperazina, 4-(3,4-dimetoxifenil)piperazina, 4-(3,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(3,4-metillenodioxifenil)piperazina, 4-(3,4,5-trimetoxifenil)piperazina, 4-(3,5-diclorofenil)piperazina, 4-(3,5-dimetoxifenil)piperazina, 4-(4-(fenilmetoxi)fenil)piperazina, 4-(4-(3,1-dimetiletil)fenilmetil)piperazina, 4-(4-cloro-3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)-3-metilpiperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenilmetil)piperazina, 4-(4-fluorofenil)piperazina, 4-(4-metoxifenil)piperazina, 4-(4-melilfenil)piperazina, 4-(4-nitrofenil)piperazina, 4-(4-trifluorometilfenil)piperazina, 4-ciclohexilpiperazina, 4-etilpiperazina, 4-hidroxi-4-(4-clorofenil)metilpiperidina, 4-hidroxi-4-fenilpiperidina, 4-hidroxipirrolidina, 4-metilpiperazina, 4-fenilpiperazina, 4-piperidinilpiperazina, 4-(2-furanil)carbonil)piperazina, 4-((1,3-dioxolan-5-il)metil)piperazina, 6-fluoro-1,2,
3,4-tetrahidro-2-metilquinolina, 1,4-diazacicloheptano,2,3-dihidroindolil,3,3-dimetilpiperidina, 4,4-etilenodioxipiperidina, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, azaciclooctano, decahidroquinolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, tiomorfolina, y triazol.
El término carbamoil, como se usa aquí, se refiere a un grupo amida de la fórmula -CONH_{2}.
El término carbonildioxil, como se usa aquí, se refiere .a un grupo carbonato de la fórmula -O-CO-OR.
El término hidrocarburo, como se usa aquí, se refiere a cualquier grupo químico que comprende hidrógeno y carbono. El hidrocarburo puede estar sustituido o no sustituido. El hidrocarburo puede ser no saturado, saturado, lineal. ramificado, cíclico, policíclico, o heterocíclico. Hidrocarburos ilustrativos incluyen, por ejemplo, metil, etil, n-propil, iso-propil, ciclopropil, alil, vinil, n-butil, terc-butil, etinil, ciclohexil, metoxi, dietilamino, y semejantes. Como sería conocido para una persona conocedora de esta técnica, todas las valencias tienen que estar satisfechas haciendo cualquiera de las sustituciones.
Los términos sustituido, cuando está precedido del término "opcionalmente" o no, y sustituyente, como se usa aquí, se refiere a la habilidad, como puede ser apreciado por una persona conocedora de la técnica, para cambiar un grupo funcional por otro grupo funcional siempre que la valencia de todos los átomos se mantenga. Cuando más de una posición en una estructura dada puede ser sustituida con más de un sustituyente seleccionado de un grupo específico, el sustituyente puede ser o el mismo o diferente en cada posición. Los sustituyentes pueden también posteriormente sustituirse (por ejemplo, un sustituyente del grupo arilo puede tener otro sustituyente tal como otro grupo arilo, que está además sustituido con fluora en una o más posiciones).
El término tiohidroxi o tiol, como se usa aquí, se refiere a un grupo de la fórmula SH.
El término ureido, como se usa aquí, se refiere a un grupo urea de la fórmula: -NH-CO-NH_{2}.
Lo que sigue son los términos más generales usados a lo largo de la presente solicitud:
"Animal": el término animal, como se usa aquí, se refiere a seres humanos así como a animales, incluyendo, por ejemplo, mamíferos, pájaros, reptiles, anfibios, y peces. Preferiblemente, los animales son mamíferos (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, un primate. o un cerdo). Un animal puede ser un animal doméstico. Un animal puede ser un animal transgénico.
"Asociado con": cuando dos entidades están "asociadas con" una con otra como se describe aquí, están unidas por una interacción covalente o no covalente directa o indirecta. Preferiblemente, la asociación es covalente. Interacciones deseables no covalentes incluyen enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones hidrofóbas, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, etc.
"Biocompatible": el término "biocompatible", como se usa aquí se intenta que describa compuestos que no son tóxicos para las células. Los compuestos son "biocompatibles" si su adición a células in vitro producen resultados de menos o igual al 20% de muerte célular, y su administración in vivo no induce inflamación u otros de tales efectos adversos.
"Biodegradable": como se usa aquí, compuestos "biodegradables" son aquellos que, cuando se introducen dentro de las células, se rompen mediante la maquinaria celular o por hidrólisis en componentes que las células pueden o reusar o deshechar sin efecto tóxico significativo sobre las células (o sea, menos de alrededor del 20% de las células se mueren cuando los componentes se añaden a las células in vitro). Los componentes preferiblemente no inducen inflamación u otros efectos adversos in vivo. En ciertas aplicaciones preferidas, las reacciones químicas en las que se confía para romper los compuestos biodegradables no están catalizadas.
"Cantidad eficaz": en general, la "cantidad eficaz" de un agente activo o aparato de dispensación de fármacos se refiere a la cantidad necesaria para elicitar la respuesta biológica deseada. Como se apreciará por aquellos con conocimiento de la técnica, la cantidad eficaz de un agente o aparato puede variar dependiendo de factores tales como el punto final biológico deseado, el agente que se va a dispensar, la composición de la matriz de encapsulamiento, el tejido diana, etc. Por ejemplo, la cantidad eficaz de micropartículas que contienen un antígeno para ser dispensado para inmunizar a un individuo es la cantidad que produce una respuesta inmune suficiente para prevenir la infección con un organismo que tiene el antígeno administrado.
"Péptido" o "proteína": según la presente invención, un "péptido" o "proteína" comprende una cadena de al menos tres aminoácidos unidos juntos por enlaces peptídicos. El término "proteína" y "péptido" puede ser usado indistintamente. Péptido puede referirse a un péptido individual o a una colección de péptidos. Los péptidos de la invención preferiblemente contienen solamente aminoácidos naturales, aunque aminoácidos no naturales (por ejemplo, compuestos que no ocurren en la naturaleza pero que pueden ser incorporados en una cadena polipeptídica) y/o análogos de aminoácidos que se conocen en la técnica pueden emplearse alternativamente. También, uno o más de los aminoácidos en un péptido de la invención puede ser modificado, por ejemplo, por la adición de una entidad química tal como un grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo farnesil, un grupo isofarnesil, un grupo de ácido graso, un grupo enlazador por conjugación, funcionalización, u otra modificación, etc. En una realización preferida, las modificaciones del compuesto peptídico conducen a un péptido más estable (por ejemplo de semivida más larga in vivo). Estas modificaciones pueden incluir ciclación del péptido, la incorporación de D-aminoácidos, etc. Ninguna de las modificaciones debería interferir sustancialmente con la actividad biológica deseada del péptido.
"Polinucleótido" u "oligonucleótido": polinucleótido u oligonucleótido se refiere a un polímero de nucleótidos. Típicamente, un polinucleótido comprende al menos tres nucleótidos. El polímero puede incluir nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, deoxiadenosina, deoxitirnidina, deoxiguanosina y deoxicitidina), análogos de nucleósido (por ejemplo, 2-aminaadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, C5-propinilcitidina, C5-propiniluridina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-metilcitidina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, y 2-tiocitidina), bases modificadas químicamente, bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas), bases intercaladas, azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-deoxiribosa, arabinosa, y hexosa), o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fósforotioatos y uniones de 5'-N-fosforoamidita).
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"Molécula pequeña": como se usa aquí, el término "molécula pequeña" se refiere a compuestos orgánicos, tanto creados naturalmente como artificialmente (por ejemplo, vía síntesis química) que tienen un peso molecular relativamente bajo y que no son proteínas, polipéptidos, o ácidos nucleicos. Típicamente, las pequeñas moléculas tienen un peso molecular de menos de alrededor de 1500 g/mol. También, las moléculas pequeñas tienen típicamente enlaces múltiples carbono-carbono. Moléculas pequeñas conocidas de origen natural incluyen, pero no están limitadas a, la penicilina, eritromicina, taxol, ciclosporina, y rapamicina. Pequeñas moléculas sintéticas conocidas incluyen, pero no están limitadas a, la ampicilina, meticilina, sufametoxazol, y sulfonamidas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 comparativa muestra el perfil del tiempo para la degradación de los polímeros 1-3 a 37ºC a pH 5,1 y pH 7,4. La degradación se expresa como degradación en porcentaje en el tiempo basado en datos de cromatografía por permeabilidad a través de gel.
La figura 2 comparativa muestra los perfiles de toxicidad de los polímeros 1-3 y PEI. La viabilidad de las células NIH 3T3 se expresa como una función de la concentración del polímero. Los pesos moleculares de los polímeros 1, 2 y 3 fueron 5800, 11300, y 22500, respectivamente. El peso molecular del PEI empleado fue 25000.
La figura 3 comparativa muestra la ralentización del ADN de pCMV-Luc por el polímero 1 en la electroforesis de gel de agarosa. Cada calle corresponde a una relación diferente de ADN/peso de polímero. Las relaciones son como siguen: 1) 1:0 (ADN solamente); 2) 1:0,5; 3) 1:1; 4) 1:2; 5) 1:3; 6) 1:4; 7) 1:5; 8) 1:6; 9) 1:7; y 10) 1:8.
La figura 4 comparativa muestra los diámetros efectivos medios de los complejos ADN/polímero formados a partir del plásmido pCMV-Luc: y el polímero 3 (Pm = 31.000) como una función de la concentración del polímero.
La figura 5 comparativa muestra los potenciales-\zeta medios de los complejos ADN/polímero formados a partir del plásmido pCMV-Luc y el polímero 3 (Pm = 31.000) como una función de la concentración del polímero. Los números de cada complejo corresponden a los números de los complejos en la figura 4.
La figura 6 comparativa es una imagen SEM de microesferas cargadas de rodamina/dextrano fabricadas con el polímero 1.
La figura 7 comparativa muestra los perfiles de liberación de rodamina/dextrano del polímero 1 y las microesferas de PLGA a varios valores de, pH. Las flechas indican los puntos a los que el tampón de HEPES (pH 7,4) se intercambió con el tampón de acetato (pH 5,1).
La figura 8 comparativa muestra a) una imagen de microscopio de fluorescencia representativa de microesferas del polímero 1 cargado de rodamina/dextrano suspendidas en tampón de HEPES (pH 7,4). La figura 8b muestra una muestra de microesferas del polímero 1 cargado a pH 7,4 después de la adición de tampón de acetato (pH 5,1). La dirección de la difusión del ácido es desde el extremo superior derecho al extremo inferior izquierdo de la imagen (tiempo transcurrido \approx 5 segundos).
La figura 9 muestra el ensayo de electroforesis de gel usado para identificar los polímeros complejantes de ADN. Las anotaciones de la calle corresponden a los 70 miembros solubles en agua de la biblioteca de cribado. Por cada polímero, los ensayos se llevaron a cabo en las relaciones ADN/polímero de 1:5 (pocillo izquierdo) y 1:20 (pocillo derecho). Las calles marcadas C* contienen ADN solo (sin polímero) y se usaron como control.
La figura 10 muestra los datos de transfección en función de la estructura para un ensayo que empleó pCMV-Luc (600 ng/pocillo, ADN/polímero = 1:20). Las unidades de luz son arbitrarias y no están normalizadas para la proteína total de la célula; los experimentos se llevaron a cabo por triplicado (las barras de error no se muestran). Los cuadrados negros representan polímeros insolubles en agua, los cuadrados en blanco representan polímeros solubles en agua que no complejaron ADN en la Figura 9. La columna derecha (marcada "\bullet" muestra valores de los experimentos de control siguientes: ningún polímero (verde), PEI (rojo), y Lipofectamina (azul pálido).
La figura 11 comparativa muestra una síntesis de poli¡ésteres de beta-amino). Los poli(ésteres de beta-amino) pueden sintetizarse por la adición del conjugado de las aminas primarias (ecuación 1) o bis(aminas secundarias) (ecuación 2) a diacrilatos.
La figura 12 muestra una variedad de monómeros de amina (A) y diacrilato (B) usados en la síntesis de la biblioteca de polímeros.
La figura 13 es un histograma de las eficiencias de transfección de los polímeros. En el primer cribado todos los 2350 polímeros se probaron por su habilidad para dispensar pCMV-luc ADN en relaciones N:P de 40:1, 20:1, y 10:1 a células COS-7. La eficiencia de transfección se presenta en ng de Lucíferasa popocillo. Para referencia, se muestra la eficiencia de la transfección de PEI. Las células COS-7 fácilmente captan el ADN desnudo, yen nuestras condiciones producen 0,15 \pm 0,05 ng por pocillo, y el reactivo lípidico, Lipofectamina 2000, produce 13,5 \pm 1,9 ng por
pocillo.
La figura 14. A) La eficiencia de la transfección optimizada de los primeros 50 polímeros con relación a PEI y lipofectamina 2000. Los polímeros fueron comprobados como se describe en los métodos. En el primer cribado amplio se probaron las relaciones N:P de 40:1, 20:1, y 10:1 con un n de 1. Los primeros 93 fueron recribados a seis relaciones N:P diferentes = (N:P óptimo del primer cribado) x 1,75, 1,5, 1,25, 1,0, 0,75, y 0,5, por triplicado. Las reacciones de control se marcaron en rojo, y los polímeros que no se unieron a ADN en el ensayo de electroforesis de gel se muestran en negro. B) Los polímeros que se unieron a ADN se determinaron por electroforesis de gel de agarosa. Los datos se tabularon de la forma siguiente: 1) ADN totalmente desplazado se representa por (+), 2) ADN parcialmente desplazado se representa por (+/-), 3) ADN no unido se representa por (-).
La figura 15 muestra la transfección de células COS-7 usando plásmido de proteína verde fluorescente mejorado. Las células se transfectaron en una relación N:P de (N:P óptima del cribado amplio) x 1,25 con 600 ng de ADN. Las regiones del pocillo que muestran transfección alta se muestran para los polímeros siguientes: a) C36, b) D94.
La figura 16 muestra cómo el peso molecular de los polímeros y el grupo del final de la cadena está afectado por variación de la relación amina/diacrilato en la mezcla de reacción. Los pesos moleculares (Pm) (relativo a los estándares de poliestireno) se determinaron por GPC en fase orgánica. Los polímeros sintetizados con relaciones amina/diacrilato>1 tienen los grupos finales de amina y los polímeros sintetizados con relaciones amina/diacrilato <1 tienen los grupos finales de acrilato.
La figura 17 muestra los resultados de la transfección de luciferasa para Poli-1 como una función del peso molecular del polímero, la relación polímero/ADN (p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran.)
La figura 18 muestra los resultados de la transfección de luciferasa para Poli-2 como una función del peso molecular del polímero, la relación polímero/ADN (p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran.)
La figura 19 muestra la citotoxicidad de los complejos poli-1/ADN como una función del peso molecular del polímero, la relación polímero/ADN (p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran.)
La figura 20 muestra la citotoxicidad de los complejos poli-2(ADN) como una función de los pesos moleculares del polímero, la relación polímero/ADN (p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas de amina; (B) cadenas terminadas de acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran.)
La figura 21 muestra el nivel relativo de recaptación celular de los complejos poli-1/ADN como una función de los pesos moleculares del polímero, la relación polímero/ADN (p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas de amina; (B) cadenas terminadas de acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran.)
La figura 22 muestra el nivel relativo de recaptación celular de los complejos poli-2/ADN como una función de los pesos moleculares del polímero, la relación polímero/ADN (p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas de amina (los cuadrados en blanco representan las condiciones donde la toxicidad de los complejos impidieron una medida fiable de la recaptación celular) (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se
muestran.)
La figura 23 muestra el aumento de la actividad de la transfección de los vectores de dispensación basados en poli-1 (cadenas terminadas en amina, Pm = 13.100) a través del uso de los agentes cocomplejantes. (A) Polilisina (PLL); (B) polietilenimina (PEI). (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 24 muestra el aumento de la actividad de la transfección de los vectores de dispensación basados en poli-2 (cadenas terminadas en amina, Pm = 13.400) a través del uso de los agentes cocomplejantes. (A) Polilisina (PLL); (B) polietilenimina (PEI). (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 25 es una comparación de la transferencia del gen GFP dentro de las células COS-7 usando Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 (p/p/p)), Poli-2/PLL (Poli-2:PLL:ADN = 15:0,4:1 (p/p/p)), Lipofectamina 2000 (\mul reactivo:\mug ADN = 1:1), PEI (PEI:ADN 1:1 (p/p), N/P\sim8), y ADN desnudo. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se crecieron hasta nueva confluencia. Las células se incubaron con complejos (5 \mug ADN/pocillo) durante 1 hora, después de este tiempo los complejos se retiraron y se añadió medio de crecimiento nuevo. Dos días más tarde la expresión de GFP se ensayó por citometría de flujo. (n=3, las barras de error indican una desviación estándar).
La figura 26 muestra la expresión GFP en células COS-7 transfectadas usando Poli-1/PLL.
La figura 27 muestra la transfeccion del gen GFP dentro de diferentes líneas celulares usando Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 (p/p/p). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se crecieron hasta cerca de la confluencia. Las células se incubaron después con los complejos (5 \mug ADN/pocillo) durante 1 hora, después de este tiempo los complejos se retiraron y se añadió medio de crecimiento nuevo. Dos días más tarde la expresión de GFP se ensayó por citometría de flujo. (n=5, las barras de error indican una desviación estándar).
La figura comparativa 28 muestra los pesos moleculares (Pm y Mn) del polímero G5 como una función de la relación molar de los monómeros de amina:monómeros de diacrilato en la síntesis.
La figura comparativa 29 muestra los pesos moleculares (Pm y Mn) del polímero B14 como una función de la relación molar de los monómeros de amina:monómeros de diacrilato en la síntesis del polímero.
La figura 30 comparativa es una comparación de la función del peso molecular a la relación molar amina:diacrilato para los polímeros B14 y G5.
Descripción detallada de ciertas realizaciones preferidas de la invención
La presente invención proporciona encapsulación polimérica y sistemas de dispensación mejorados basados en el uso de polímeros de ésteres de \beta-amino. Los sistemas pueden usarse en las técnicas de dispensación de medicinas/fármacos para dispensar polinucleótidos, proteínas, pequeñas moléculas, péptidos, antígenos, fármacos etc a un paciente, tejido, órgano, célula, etc. La presente invención también proporciona la preparación y cribado de grandes colecciones de polímeros para "cabezas de serie" que son útiles en las técnicas de dispensación de medicinas y fármacos.
Los polímeros de éster de 6-amino de la presente invención proporcionan varios usos diferentes en la técnica de la dispensación de fármacos. Los polímeros con sus esqueletos que contienen aminas terciarias pueden usarse para complejar polinucleótidos y por tanto mejorar la dispensación de polinucleótidos y prevenir su degradación. Los polímeros pueden también usarse en la formación de nanopartículas o micropartículas que contienen agentes encapsulados. Debido a las propiedades de los polímeros de ser biocompatibles y biodegradables, estas partículas formadas son también biodegradables y biocompatibles y pueden usarse para proporcionar liberación sostenida controlada del agente encapsulado. Estas partículas pueden también ser susceptibles a cambios de pH dado el hecho de que estos polímeros son típicamente substancialmente insolubles en solución acuosa a pH fisiológicos pero más solubles a pH más bajos.
Polímeros
Los polímeros de la presente invención son poli(ésteres de \beta-amino) que contienen aminas terciarias en sus esqueletos y sales de los mismos. Los pesos moleculares de los polímeros de la invención pueden estar en el intervalo de desde 5.000 g/mol a más de 100.000 g/mol, más preferiblemente de 4.000 g/mol a 50.000 g/mol. En una realización particularmente preferida, los polímeros de la invención son relativamente no citotóxicos. En otra realización particularmente preferida, los polímeros de la invención, son biocompatibles y biodegradables. En una realización particularmente preferida, los polímeros de la presente invención tienen pKas en el intervalo de 5,5 a 7,5, más preferiblemente entre 6,0 y 7,0. En otra realización particularmente preferida, el polímero puede diseñarse para tener un pKa deseado entre 3,0 y 9,0, más preferiblemente entre 5,0 y 8,0. Los polímeros de la invención son particularmente atractivos para la dispensación de fármacos por varias razones: 1) contienen grupos aminos para interaccionar con ADN y otros agentes cargados negativamente, para tamponar el pH, para causar endosomolisis, etc.; 2) contienen uniones de poliéster degradables; 3) pueden sintetizarse de materiales de partida comercialmente disponibles; y 4) son susceptibles al pH y generaciones futuras podrían ser diseñadas con un pKa deseado. En la investigación de la eficiencia de la transfección, los polímeros que se comportaron mejor fueron hidrófobos o los monómeros de diacrilato fueron hidrófobos, y muchos tenían grupos laterales mono o dihidroxílicos, y/o bis(aminas secundarias) lineales como parte de su estructura.
Los polímeros de la presente invención se definen generalmente como sigue:
4
en donde
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilC_{1}-C_{6} de cadena corta, alcoxiC_{1}-C_{6} de cadena corta, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril, fenil, heterociclo, carbociclo y halógeno;
n es un número entero entre 3 y 10.000;
x en un número entero entre 1 y 10; y
cuando X es metil o NR_{2}; y
R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril; o cuando X es OR; y R se selecciona del grupo que consiste en alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril y heteroaril;
y es un número entero entre 1 y 10;
o cuando X es OR, y R es hidrógeno, y es 5 o un número entero entre 1 y 2 o 6 y 10
y
derivados y sales de los mismos.
y es un número entero entre 1 y 10; preferiblemente, x es un número entero entre 2 y 6.
En ciertas realizaciones, los polímeros de la presente invención se definen generalmente como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
5
en donde
X se selecciona del grupo que consiste en alquilC,-C6 de cadena corta, alcoxiC_{1}-C_{6} de cadena corta, halógeno, OR y NR_{2}; más preferiblemente, metil, OH, o NH_{2};
R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril;
cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilC_{1}-C_{6} de cadena corta, alcoxiC_{1}-C_{6} de cadena corta, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril, fenil, heterociclo, carbociclo, y halógeno; preferiblemente R' es hidrógeno, metil, etil, propil, isopropil, butil, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, hidroxi, amino, fluoro, cloro, o bromo; más preferiblemente, R' es fluoro, hidrógeno, o metil;
n es un número entero entre 3 y 10.000;
x en un número entero entre 1 y 10; preferiblemente, x es un número entero entre 2 y 6;
y es un número entero entre 1 y 10; preferiblemente, y es un número entero entre 2 y 6;
z en un número entero entre 1 y 10; preferiblemente, z es un número entero entre 2 y 6;
y
derivados y sales de los mismos.
En otra realización, la unidad bis(éster de acrilato) en el polímero de la invención se elige del grupo que sigue de unidades de bis(éster de acrilato)
6
Los bis(ésteres de acrilato) particularmente preferidos en este grupo incluyen B, C, E, F, II, JJ, KK, y LL.
En otra realización, la amina en el polímero de la invención se elige del grupo de aminas siguiente (1'-20'):
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, el polímero comprende la amina 5'.
En otra realización la amina en el polímero de la invención se elige del grupo siguiente de aminas (1-94):
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, los polímeros incluyen las aminas 6, 8, 20, 24, 25, 28, 32, 36, 75 o 80.
\newpage
Ejemplos particulares de la presente invención incluyen:
9
Otros poli(ésteres de beta-amino) particularmente útiles incluyen F32, F28, JJ36, JJ32, LL8, E36, E32, C80, JJ28, C28, C36, E28.
En una realización particularmente preferida, uno o ambos de los grupos enlazadores A y B son polímeros de polietileno. En otra realización particularmente preferida, uno o ambos de los grupos enlazadores A y B son polímeros de polietilenglicol. Otros polímeros biodegradables biocompatibles pueden usarse como uno o ambos de los grupos enlazadores A y B.
Los polímeros que siguen no son parte de la presente invención y pueden definirse generalmente por la fórmula (I):
10
Los grupos enlazadores A y B son cada uno una cadena de átomos uniendo covalentemente los grupos amino y los grupos éster, respectivamente. Estos grupos enlazadores pueden contener átomos de carbono o heteroátomos (por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre, etc).Típicamente, estos grupos enlazadores son de 1 a 30 átomos de longitud, más preferiblemente de 1-15 átomos de longitud. Los grupos enlazadores pueden estar sustituidos con varios sustituyentes que incluyen, pero no limitan a, átomos de hidrógeno, grupos alquil, alquenil, aminoalquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxi, alcoxi, halógeno, aril, heterociclo, heterociclo aromático, ciano, amida, carbamoil, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, y ureido. Como se apreciaría por una persona con conocimiento de la técnica, cada uno de estos grupos puede a su vez estar sustituido. Estos grupos R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, R_{7} y R_{8} pueden ser cualquier grupo químico que incluye, pero no está limitado a, átomos de hidrógeno, grupos alquil, alquenil, alquinil, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxi, alcoxi, halógeno, aril, heterociclo, heterociclo aromático, ciano, amida, carbamoil, ácido carboxílico, éster, alquiltioéter, tiol, y ureido. En los polímeros de la invención, n es un número entero que está en el intervalo de 5 a 10.000, más preferiblemente de 10 a 500.
En una realización particularmente preferida, la bis(amina secundaria) es una estructura cíclica, y el polímero se representa generalmente por la fórmula II:
11
En esta realización, R_{1} y R_{2} están directamente unidos juntos como se muestra en la fórmula II.
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Ejemplos de los polímeros de la invención en esta realización incluyen, pero no están limitados a las fórmulas III y IV:
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13
Como se describió anteriormente en el párrafo precedente, cualquier grupo químico que satisface la valencia de cada átomo puede sustituirse por un átomo de hidrógeno.
En otra realización particularmente preferida, los grupos R_{1} y/o R_{2} están covalentemente unidos al grupo enlazador A para formar una o dos estructuras cíclicas. Los polímeros de la presente realización están generalmente representados por la fórmula V en la que ambos R_{1} y R_{2} están unidos al grupo enlazador A para formar dos estructuras cíclicas:
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Las estructuras cíclicas pueden ser anillos de 3, 4, 5, 6, 7, o 8- miembros o mayores. Los anillos pueden contener heteroátomos y ser insaturados. Ejemplos de polímeros de la fórmula V incluyen las fórmulas VI, VII, y VIII:
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17
Como se describió anteriormente, cualquier grupo químico que satisface la valencia de cada átomo en la molécula puede ser sustituido por cualquier átomo de hidrógeno.
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En otra realización, los polímeros pueden generalmente definirse por la fórmula (IX):
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El grupo enlazador B es una cadena de átomos uniendo covalentemente los grupos éster. El grupo enlazador puede contener átomos de carbono o heteroátomos (por ejemplo, nitrógeno, oxígeno, azufre, etc). Típicamente, el grupo enlazador es de 1 a 30 átomos de longitud, preferiblemente de 1-15 átomos de longitud, y más preferiblemente de 2-10 átomos de longitud. En ciertas realizaciones, el grupo enlazador B es una cadena de alquil ramificada o lineal sustituida o no sustituida, preferiblemente con 3-10 átomos de carbono, más preferiblemente con 3, 4, 5, 6, o 7 átomos de carbono. En otras realizaciones, el grupo enlazador B es una cadena heteroalifática ramificada o lineal sustituida o no sustituida, preferiblemente con 3-10 átomos, más preferiblemente con 3, 4, 5, 6, o 7 átomos. En ciertas realizaciones, el grupo enlazador B está comprendido de unidades repetidas de átomos de oxígeno y carbono. El grupo enlazador puede estar sustituido con varios sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a, átomos de hidrógeno, grupos de alquil, alquenil, alquinil, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxi, alcoxi, halógeno, aril, heterociclo, heterociclo aromático, ciano, amida, carbamoil, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, acil, acetil, y ureido. Como se apreciaría por alguien con conocimiento de la técnica, cada uno de estos grupos puede a su vez estar sustituido. Cada uno de R1, R3, R4, R5, R6, R7, y R8 pueden ser independientemente cualquier grupo químico que incluye, pero no está limitado a un átomo de hidrógeno, grupos de alquil, alquenil, alquinil, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxi, alcoxi, halógeno, ad, heterociclo, heterociclo aromático, ciano, amida, carbamoil, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, acil, acetil, y ureido. En ciertas realizaciones, R_{1} incluye grupos hidroxi. En otras realizaciones, R_{1} incluye grupos amino, alquilamino, o dialquilamino. En el polímero de la invención, n es un número entero que está en el intervalo de 5 a 10.000, más preferiblemente de 10 a 500.
En otra realización, la unidad bis(éster de acrilato) en el polímero de la invención se elige del siguiente grupo de unidades de bis(éster de acrilato) (A'-G'):
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En ciertas realizaciones, el polímero comprende el bis(éster de acrilato)G'.
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En otra realización, la unidad bis(éster de acrilato) en el polímero se elige del siguiente grupo de unidades de bis(éster de acrilato) (A-PP):
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20 
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Los bis(ésteres de acrilato) particularmente preferidos en este grupo incluyen B, C, D, E, F, M, O, U, AA, II, JJ, KK, y LL.
En otra realización, la amina en el polímero se elige del siguiente grupo de aminas (1'-20'):
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21 
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En ciertas realizaciones, el polímero comprende la amina 5'. En otras realizaciones, el polímero comprende la amina 14'.
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En otra realización, la amina en el polímero se elige del siguiente grupo de aminas (1-94):
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En ciertas realizaciones, los polímeros incluyen las aminas 6, 3, 17, 20, 24, 25, 28, 32, 36, 60, 61, 70, 75, 80, 86, 87, 89, 93, o 94.
Ejemplos particulares de los polímeros incluyen:
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500
501 
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502 
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24 
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503 
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504 
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Otros poli(ésteres de beta-amino) particularmente útiles incluyen:
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505 
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Otros poli(ésteres de beta-amino) particularmente útiles incluyen: C86, D60, D61, U94, F32, F28, JJ36, JJ32, LL6, LL8, U28, E28, U36, E36, U32, E32, C94, F94, JJ94, U28, JJ86, C86, U86, E86, C80, E80, JJ80, U80, D24, E24, JJ24, B17, 1128, 1136, 1132, C20, JJ20, E20, C25, U25, D25, D70, D28, D32, D36, D93, U87, D87, C75, U75, 020, 028, C94, AA20, AA28, D86, F86, AA36, AA24, AA94, 024, AA60, A61, C32, JJ28, C28, JJ20, D94, U32, D24, C36, E28, D36, U94, E24, E32, D28, U36, E80, E36, JJ80, E94, D93, B17, M17, AA61, U93, y C25.
En una realización particularmente preferida, uno o ambos de los grupos enlazadores A y B son polímeros de polietileno. En otra realización particularmente preferida, uno o ambos de los grupos enlazadores A y B son polírneros de polietilenglicol. Otros polímeros biodegradables, biocompatibles pueden usarse como uno o ambos grupos enlazadores A y B.
En ciertas realizaciones preferidas, los polímeros de la presente invención están terminados en amina. En otras realizaciones, los polímeros de la presente invención están terminados en acrilato. En gran parte, la unidad de terminación del polímero está determinada por la relación de la amina frente al acrilato en la reacción de síntesis del polímero. Un exceso de monómero de amina produce un polímero terminado en amina. Y un exceso de monómero de acrilato produce un polímero terminado en acrilato.
En ciertas realizaciones, el peso molecular medio de los polímeros de la presente invención está en el intervalo de 1.000 g/mol a 50.000 g/mol, preferiblemente de 2.000 g/mol a 40.000 g/mol, más preferiblemente de 5.000 g/mol a 20.000 g/mol, y aún más preferiblemente de 10.000 g/mol a 17.000 g/mol. Puesto que los polímeros de la presente invención están preparados por una etapa de polimerización, se obtiene típicamente una distribución estadística amplia de longitudes de la cadena. En ciertas realizaciones, la distribución de los pesos moleculares en una muestra de polímero se estrecha por etapas de purificación y aislamiento conocidas en la técnica. El peso molecular del polímero puede también variarse por la síntesis del polímero, por ejemplo, cuando la cantidad de los monómeros de amina aumenta, el peso molecular del polímero obtenido disminuye. En otras realizaciones, la mezcla de polímero puede ser una mezcla de polímeros de diferentes pesos moleculares.
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En otra realización particularmente preferida, el polímero de la presente invención es un copolímero en donde una de las unidades repetidas es un poli(éster de \beta amino) de la presente invención. Otras unidades repetidas que se usan en el co-polímero incluyen, pero no están limitada a, polietileno, poli(ácido láctico co-glicólico) (PLGA), ácido poliglicólico, polimetacrilato, etc.
Síntesis de polímeros
Los polímeros de la invención pueden prepararse por cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente los polímeros se preparan de materiales de partida comercialmente disponibles. En otra realización preferida, los polímeros se preparan de materiales de partida fácilmente preparados y/o baratos.
En una realización particularmente preferida, el polímero de la invención se prepara vía la adición del conjugado de bis(aminas secundarias) a bis (ésteres de acrilato). Este esquema de reacción se muestra a continuación:
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Los monómeros de bis(amina secundaria) que son útiles en el método presente incluyen, pero no están limitados a, N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina, 2-metilpiperazina, 1,2-bis(N-etilamino)etileno, y 4,4'-trimetilendi Diperidina. Los monómeros de diacrilato que son útiles incluyen, pero no están limitados a, diacrilato de 1,4-butanodiol, dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de 1,2 etanodiol, diacrilato de 1,6-hexanodiol, diacrilato de 1,5-pentanodiol, diacrilato de 2,5-hexanodiol, y diacrilato de 1,3-propanodiol. Cada uno de los monómeros se disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, THF, CH_{2}Cl_{2}, MeOH, EtOH, CHCl_{3}, hexanos, tolueno, benceno, CCl_{4}, glime, éter dietílico, DMSO, DMF, etc), preferiblemente DMSC. Las soluciones obtenidas se combinan, y la mezcla de reacción se calienta para producir el polímero deseado. En otras realizaciones, la reacción se lleva a cabo sin el uso de un disolvente (o sea, neto) por tanto obviando la necesidad de eliminar el disolvente después de la síntesis. La mezcla de reacción se calienta después a una temperatura en el intervalo de 30ºC a 200ºC, preferiblemente de 40ºC a 150ºC, más preferiblemente 50ºC a 100ºC. En una realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 40ºC, 50ºC, 60ºC, 70ºC, 80ºC, o 90ºC. En otra realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 75ºC. En otra realización, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 100ºC. La reacción de polimerización puede también estar catalizada. El tiempo de reacción puede estar en el intervalo de horas a días dependiendo de la reacción de polimerización y las condiciones de reacción. Como sería apreciado por alguien con conocimiento de la técnica, la calefacción de la reacción tiende a acelerar la velocidad de la reacción requiriendo un tiempo más corto de reacción. En ciertas realizaciones, la síntesis del polímero se lleva a cabo en DMSO a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 2 días. En otras realizaciones, la síntesis del polímero se lleva a cabo sin disolvente a 95ºC durante 8-16 horas. Como sería apreciado por alguien con conocimiento de la técnica, el peso molecular del polímero sintetizado puede determinarse por las condiciones de reacción (por ejemplo, temperatura, materiales de partida, concentración, catalizador, disolvente, tiempo de reacción, etc) usadas en la síntesis.
En otra realización particularmente preferida, los polímeros se preparan por la adición del conjugado de una amina primaria a un bis(éster de acrilato). El uso de las aminas primarias más que la bis(aminas secundarias) permite una variedad mucho más amplia de materiales de partida comercialmente disponibles. El esquema de reacción usando aminas primarias en vez de aminas secundarias se muestra debajo:
27
Las aminas primarias útiles en este método incluyen, pero no están limitadas a, metilamina, etilamina, isopropilamina, anilina, anilinas sustituidas, y etanolamina. Los bis(ésteres de acrilato) útiles en este método incluyen, pero no están limitados a, diacrilato de 1,4-butanodiol, dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de 1,2-etanodiol, diacrilato de 1,6-hexanodiol, diacrilato de 1,5-pentanodiol, diacrilato de 2,5-hexanodiol, y diacrilato de 1,3-propanodiol. Cada uno de los monómeros se disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, THF, DMSO, DMF, CH_{2}Cl_{2}, MeOH, EtOH, CHCl_{3}, hexanos, CCl_{4}, glime, éter dietílico, etc). Los disolventes orgánicos se prefieren debido a la susceptibilidad de los poliésteres a la hidrólisis. Preferiblemente el disolvente orgánico usado es relativamente no tóxico para los organismos vivos. En ciertas realizaciones, DMSO se usa como disolvente orgánido debido a que es relativamente no tóxico y se usa frecuentemente como disolvente en cultivo celular y en depósitos congelados de células. Otros disolventes preferidos incluyen aquellos miscibles con agua tales como DMSO, etanol, y metanol. Las soluciones obtenidas de monómeros que están preferiblemente a concentraciones entre 0,01 M y 5 M, entre aproximadamente 0,1 M y 2 M, más preferiblemente entre 0,5 M y 2 M, y lo más preferido entre 1,3 M y 1,8 M, se combinan, y la mezcla de reacción se calienta para producir el polímero deseado. En ciertas realizaciones, la reacción se lleva a cabo sin disolvente. El llevar a cabo la polimerización sin disolvente puede disminuir la cantidad de productos de ciclación resultantes de las reacciones intramoleculares de adición del conjugado. La polimerización puede llevarse a cabo a una temperatura que en el intervalo de 20ºC a 200ºC, preferiblemente de 40ºC a 100ºC, más preferiblemente de 50ºC a 75ºC, aún más preferiblemente de 50ºC a 60ºC. En una realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se mantiene a 20ºC. En otra realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se calienta a aproximadamente 50ºC. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción se calienta a aproximadamente 56ºC. En todavía otra realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se calienta a aproximadamente 75ºC. La mezcla de reacción puede también enfriarse a aproximadamente 0ºC. La reacción de polimerización puede también catalizarse tal como con un catalizador organometálico, ácido o base. En otra realización preferida, uno o más tipos de monómeros de amina y/o monómeros de diacrilato pueden usarse en la reacción de polimerización. Por ejemplo, una combinación de etanolamina y etilamina puede usarse para preparar un polímero más hidrófilo que uno preparado usando etilamina sola, y también más hidrófobo que uno preparado usando etanolamina sola.
En la preparación de los polímeros de la presente invención, los monómeros en la mezcla de reacción pueden combinarse en relaciones diferentes para afectar el peso molecular, rendimiento, terminación del extremo, etc del polímero obtenido. La relación de monómeros de amina a monómeros de diacrilato puede estar en el intervalo de 1,6 a 0,4, preferiblemente de 1,4 a 0,6, más preferiblemente:e de 1,2 a 0,8, aún más preferiblemente de 1,1 a 0,9. En ciertas realizaciones, la relación de los monómeros de amina a monómeros de diacrilato es aproximadamente 1,4, 1, 3, 1,2, 1,1, 1,050, 1,025, 1,0, 0,975, 0,950, 0,900, 0,800, y 0,600. Por ejemplo, combinando los monómeros en una relación de 1:1 típicamente se obtiene polímeros de peso molecular mayor y rendimientos totales más altos. También, proporcionando un exceso de monómero de amina (por ejemplo, relación amina a acrilato >1) produce cadenas terminadas en amina mientras que proporcionando un exceso de monómero de acrilato por ejemplo, (relación amina a acrilato <1) produce cadenas terminadas en acrilato. La relación de monómeros de amina a monómeros de acrilato en la síntesis del polímero puede afectar cómo las cadenas del polímero se terminan, el peso molecular de los polímeros producidos, la distribución de los pesos moleculares, y la extensión del entrecruzamiento.
El polímero sintetizado puede purificarse por cualquier técnica conocida en la técnica incluyendo, pero no limitado a, precipitación, cristalización, extracción, cromatografía, etc. En una realización particularmente preferida, el polímero se purifica a través de precipitaciones repetidas en disolventes orgánicos (por ejemplo, éter dietílico, hexano, etc). En una realización particularmente preferida, el polímero se aísla como hidrocloruro, fosfato, acetato, u otra sal. Preferiblemente la sal es farmacéuticamente aceptable, en ciertas realizaciones. El polímero obtenido puede también usarse como es sin más purificaciones y aislamiento; por tanto haciendo ventajoso el uso de un disolvente compatible con los ensayos que se usen para evaluar los polímeros. Por ejemplo, los polímeros pueden prepararse en un disolvente no tóxico tal como DMSO, y la solución de polímero obtenida puede usarse después en los ensayos de cultivo celular que envuelven la transfección de un ácido nucleico dentro de una célula. Como sería apreciado por una persona con conocimiento de la técnica, el peso molecular del polímero sintetizado y la extensión del entrecruzado puede determinarse por las condiciones de reacción (por ejemplo, temperatura, materiales de partida, concentración, equivalentes de amina, equivalentes de acrilato, orden de adición, disolvente, etc) usados en la síntesis (Odian Principies of Polymerization 3ª Ed., Nueva York: John Wiley & Sons, 1991; Stevens Polymer Chemistry: An Introduction 2nd Ed., Nueva York: Oxford University Press, (1990). La extensión del entrecruzamiento del polímero preparado puede minimizarse a entre 1-20%, preferiblemente entre 1-10%, más preferiblemente entre 1-5%, y más preferiblemente menos del 2%. Como sería apreciado por aquellos con conocimiento de la técnica, las aminas o bis(ésteres de acrilato) con grupos nucleófilos son más susceptibles al entrecruzamiento, y puede necesitarse tomar medidas para reducir el entrecruzamiento tal como bajar la temperatura o cambiar la concentración de los materiales de partida en la mezcla de reacción. Los acrilatos y otros restos con insaturación o halógenos son también susceptibles de polimerización por radicales que puede conducir a entrecruzamiento. La extensión de la polimerización por radicales y el entrecruzamiento puede reducirse reduciendo la temperatura de la mezcla de reacción o por otros medios conocidas en la técnica.
En otra realización se prepara una biblioteca de polímeros diferentes en paralelo. La síntesis de una biblioteca de polímeros puede llevarse a cabo usando cualquiera de las enseñanzas conocidas en la técnica o descritas aquí con relación a la síntesis de los polímeros de la invención. En una realización, una amina diferente y/o bis(éster de acrilato) en una relación particular amina a acrilato se añade a cada vial en una colección de viales usados para preparar la biblioteca o a cada pocillo en una placa de múltiples pocillos (por ejemplo placa de 96 pocillos). En una realización, los monómeros se diluyen a entre 0,1 M y 5 M, más preferiblemente de 0,5 M a 2 M, y más preferiblemente a aproximadamente 1,6 M, en un disolvente orgánico tal como DMSO. Los monómeros pueden combinarse en diferentes relaciones para afectar al peso molecular, rendimiento, terminación del extremo, etc. Por ejemplo, combinando los monómeros en una relación 1:1 típicamente produce monómeros de mayor peso molecular y rendimientos totales más altos. Proporcionando un exceso de monómero de amina se produce cadenas terminadas en amina mientras que proporcionando un exceso de monómero de acrilato se produce cadenas terminadas en acrilato. En algunas realizaciones, no se usa disolvente en la síntesis del polímero. El conjunto de los viales o de la placa multipocillo se incuba a una temperatura y longitud de tiempo suficientes para permitir que ocurra la polimerización de los monómeros corno se describe aquí. En ciertas realizaciones preferidas, el tiempo y la temperatura se eligen para lograr casi la incorporación completa (por ejemplo, 50% de conversión, 75% de conversión, 80% de conversión, 90% de conversión, 95% de conversión, >95% de conversión, 98% de conversión, 99% de conversión, o >99% de conversión) de todo el monómero en polímero. La reacción de polimerización puede llevarse a cabo a cualquier temperatura en el intervalo de 0ºC y 200ºC. En una realización, las mezclas de reacción se incuban a aproximadamente 45ºC por aproximadamente 5 días. En otra realización, las mezclas de reacción se incuban a aproximadamente 56ºC por aproximadamente 5 días En otra realización, las mezclas de reacción se incuban a aproximadamente 100ºC por aproximadamente 5 horas. Los polímeros pueden aislarse después y purificarse siguiendo técnicas conocidas en la técnica o las soluciones obtenidas de los polímeros pueden usarse sin más aislamiento o purificación. En ciertas realizaciones, se preparan más de 1000 polímeros diferentes en paralelo. En ciertas realizaciones, se preparan más de 2000 polímeros diferentes en paralelo. En otras realizaciones, se preparan más de 3000 polímeros en paralelo. Los polímeros se pueden después cribar usando técnicas de alto rendimiento para identificar los polímeros con una característica deseada (por ejemplo, solubilidad en agua, solubilidad a diferentes pHs, solubilidad en varios disolventes orgánicos, la habilidad para unirse a polinucleótidos, la habilidad para unir heparina, habilidad para unirse a pequeñas moléculas, la habilidad para formar micropartículas, la habilidad para aumentar la eficiencia de la transfección, etc). Los polímeros de la invención pueden cribarse o usarse después de la síntesis sin más precipitación, purificación, o aislamiento del polímero. El uso de un disolvente no tóxico tal como DMSO en la síntesis de los polímeros permite el fácil manejo y uso de los polímeros después de la síntesis del polímero. Por ejemplo, la solución del polímero en DMSO puede añadirse a un cultivo celular u otro sistema vivo sin efectos tóxicos sobre las células. En ciertas realizaciones los polímeros pueden cribarse por propiedades o características útiles en la terapia génica (por ejemplo, la habilidad para unir polinucleótidos, aumento en la eficiencia de la transfección, etc). En otras realizaciones los polímeros pueden cribarse por propiedades o características útiles en la técnica de ingeniería de tejidos (por ejemplo, la habilidad para mantener el crecimiento de tejidos o células, habilidad para promover la unión celular). En ciertas realizaciones, los polímeros se sintetizan y ensayan usando técnicas semi-automáticas y/o sistemas de manejo de fluidos robotizados.
Complejos de polinucleótidos
Es bien conocida la habilidad de compuestos catiónicos para interaccionar con polinucleótidos negativamente cargados a través de las integraciones electroestáticas. Los polímeros catiónicos tales como poli(lisina) se han preparado y estudiado por su habilidad para complejar polinucleósidos. Sin embargo, los polímeros estudiados hasta hoy han incorporado aminas en los extremos de cadenas laterales cortas conformacionalmente flexibles (por ejemplo, poli(lisina)) o aminas accesibles en la superficie de poliaminas globulares o esféricas (por ejemplo, dendrímeros PEI y PAMAM). Se piensa que la interación del polímero con el polinucleótido previere al menos parcialmente la degradación del polinucleótido. Por la neutralización de la carga en el esqueleto del polinucleótido, el complejo neutro o cargado ligeramente positivo puede también más fácilmente atravesar las membranas hidrófobas (por ejemplo, la citoplásmica, lisosomal, endosomal, nuclear) de la célula. En una realización particularmente preferida el complejo está ligeramente cargado positivamente. En otra realización particularmente preferida, el complejo tiene un potencial-\zeta positivo, más preferiblemente el potencial-\zeta está entre +1 y +30. En ciertas realizaciones, agentes tales como el ácido poliacrílico (pAA), ácido poliaspártico, ácido poliglutámico, o ácido polimaleico pueden usarse para prevenir la inhibición del suero de los complejos polinucleótidos/polímero en las células cultivadas en medios con suero (Trubetskoy et al "Recharging cationic DNA complexes with highly charged polianions for in vitro and in vivo gene delivery" Gene Therapy 10:261-271, 2003; incorporado aquí como referencia. Los poli(ésteres de \beta-amino) de la presente invención poseen aminas terciarias en el esqueleto del polímero. Aunque estas aminas están más impedidas, están disponibles para interaccionar con un polinucleótido. Los polinucleótidos o derivados de los mismos se ponen en contacto con los polímeros de la invención en condiciones adecuadas para formar complejos polinucleótido/polímero. En ciertas realizaciones, la relación de nitrógeno en el polímero (N) a fosfato en el polinucleótido es 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, o 120:1. En ciertas realizaciones, la relación polímero a ADN (p/p) es 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1. 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, o 200:1. El polímero está preferiblemente al menos parcialmente protonado así como para formar un complejo con el polinucleótido cargado negativamente. En una realización preferida, los complejos polinucleótido/polímero forman nanopartículas que son útiles en la dispensación de los polinucleótidos a las células. En una realización particularmente preferida, el diámetro de las nanopartículas está en el intervalo de 50-500 nm, más preferiblemente el diámetro de las nanopartículas está en el intervalo de 50-200 nm, y más preferiblemente de 90-150 nm. Las nanopartículas pueden estar asociadas con un agente diana coma se describe a continuación.
En ciertas realizaciones, pueden añadirse otros agentes a los complejos de polinucleótido:poli(éster de beta-amino). En ciertas realizaciones, se usa un agente cocomplejante. Se sabe que los agentes cocomplejantes se unen a polinucleótidos y/o aumentan la eficiencia de la transfección. Los agentes cocomplejantes usualmente tienen una densidad de nitrógeno alta. Polilisina (PLL) y polietilenimina (PEI) son dos ejemplos de agentes poliméricos cocomplejantes. PLL tiene una relación de peso molecular a átomo de nitrógeno de 65, y PEI tiene una relación de peso molecular a átomos de nitrógeno de 43. Cualquier polímero con una relación peso molecular a átomos de nitrógeno en el intervalo de 10-100, preferiblemente 25-75, más preferiblemente 40-70, puede ser útil como un agente cocomplejante. La inclusión de un agente cocomplejante en un complejo puede permitir reducir la cantidad de poli(éster de beta-amino) en el complejo. Esto es particularmente importante si el poli(éster de beta-amino) es citotóxico a altas concentraciones. En los complejos obtenidos con los agentes cocomplejantes, la relación de agente cocomplejante a polinucleótido (p/p) puede estar en el intervalo de 0 a 2,0, preferiblemente de 0,1 a 1,2, más preferiblemente de 0,1 a 0,6, y aún más preferiblemente de 0,1 a 0,4.
Las propiedades de transfección de varios complejos de la invención pueden determinarse por estudios de transfección in vitro (por ejemplo, transfección de GFP en células cultivadas) o en modelos animales. En ciertas realizaciones, el complejo usado para la transfección se optimiza para un tipo determinado de célula, polinucleótido para ser dispensado, poli(éster de beta-amino), agente cocomplejante (si se usa uno), proceso de enfermedad, método de administración (por ejemplo, inhalación, oral, parenteral, intravenoso, intratecal, etc),régimen de dosificación, etc.
Polinucleótidos
Los nucleótidos para ser complejados o encapsulados por los polímeros de la invención pueden ser cualquier ácido nucleico incluyendo pero no limitado a ARN y ADN. Los polinucleótidos pueden ser de cualquier tamaño o secuencia, y pueden ser de hebra única o doble. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido es mayor de 100 pares de bases de longitud. En ciertas otras realizaciones preferidas, el polinucleótido es mayor de 1000 pares de bases de longitud y puede ser mayor de 10.000 pares de bases de longitud. El polinucleótido es preferiblemente purificado y sustancialmente puro. Preferiblemente, el polinucleótido es mayor de 50%, más preferiblemente mayor de 75% puro, y lo más preferido mayor de 95% puro. El polinucleótido puede ser proporcionado por cualquiera de los medios conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido ha sido realizado usando técnicas recombinantes (para una descripción más detallada de estas técnicas, véase por favor Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999); Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., editado por Sambrook, Fritsch, y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia). Los polinucleótidos pueden también obtenerse de fuentes naturales y purificarse de compuestos contaminantes encontrados normalmente en la naturaleza. Los polinucleótidos pueden también ser sintetizados químicamente en un laboratorio. En una realización preferida, el polinucleótido se sintetiza usando química de fase sólida estándar.
Los polinucleótidos pueden modificarse por medios químicos y biológicos. En ciertas realizaciones preferidas, estas modificaciones conducen a mayor estabilidad del polinucleótido. Las modificaciones incluyen metilación, fosforilación, protección del extremo, etc.
Los derivados de los polinucleótidos pueden usarse también en la presente invención. Estos derivados incluyen modificaciones en las bases, azúcares, y/o uniones fosfato de los polinucleótidos. Las bases modificadas incluyen, pero no están limitadas a, aquellas encontradas en los siguientes análogos de nucleósidos: 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, y 2-tiociticina. Los azúcares modificados incluyen, pero no están limitados a, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, 3'-azido-2',3'-didesoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, arabinosa (el epímero 2 de ribosa), azúcares acíclicos, y hexosas. Los nucleóxidos pueden estar unidos juntos por enlaces diferentes a los enlaces fosfodiéster encontrados en ADN y ARN encontrados en la naturaleza. Las uniones modificadas incluyen, pero no están limitadas a, uniones de fósforotioato y uniones de 5'-N-fosforamidita. Las combinaciones de las varias modificaciones pueden usarse en un polinucleótido único. Estos polinucleótidos modificados pueden ser proporcionados por cualquier medio conocido en la técnica; sin embargo, como se apreciará por aquellos con conocimientos de la técnica, los polinucleótidos modificados se preparan preferiblemente usando química sintética in vitro.
Los polinucleótidos para ser dispensados pueden estar en cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un plásmido circular, un plásmido lineal, un cósmido, un genoma viral, un genoma viral modificado, un cromosoma artificial, etc.
El polinucleótido puede ser de cualquier secuencia. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido codifica una proteína o un péptido. Las proteínas codificadas pueden ser enzimas, proteínas estructurales, receptores, receptores solubles, canales iónicos, proteínas farmacéuticamente activas, citoquinas, interleuquinas, anti-cuerpos, fragmentos de anticuerpos, antígenos, factores de coagulación, albúmina, factores de crecimiento, hormonas, insulina, etc. El polinucleótido puede también comprender regiones regulatorias para controlar la expresión de un gen. Estas regiones regulatorias pueden incluir, pero no están limitadas a, promotores, elementos potenciadores, elementos represores, cajas TATA, lugares de unión de ribosomas, lugares de parada para la transcripción, etc. En otras realizaciones particularmente preferidas, no se pretende que el polinucleótido codifique una proteína. Por ejemplo, el polinucleótido puede usarse para fijar un error en el genoma de la célula que se va a transfectar. El polinucleótido puede también proporcionarse como un agente antisentido o como interferencia de ARN (ARNi) (FIRE et al. Nature 391:806-811. 1998; incorporado aquí como referencia). La terapia antisentido significa que incluye, por ejemplo, administración o provisión in situ de oligonucleótidos de hebra única o doble o sus derivados que específicamente se hibridan, o sea, se unen, en las condiciones celulares, con mARN celular y/o ADN genómico, o mutaciones de los mismos, para así inhibir la expresión de la proteína codificada, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y /o translación (Crooque "Molecular mecanisms of action of antisense drugs" Biochim Biophis, Acta 1489(1): 31-44, 1999; Crooque "Evaluating the mechanism of action of antiproliferative antisense drugs" Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10(2):123-126, discusión 127, 2000; Method in Enzymology volúmenes 313-314, 1999). La unión puede ser por complementariedad convencional de los pares de bases, o, por ejemplo, en el caso de unión de los dupletes de ADN, a través de interaciones específicas en el surco mayor de la doble hélice (por ejemplo formación de triple hélice) (Chan et al. J. Mol. Med. 75(4):267-282,1997).
En una realización particularmente preferida, el polinucleótido que se dispensa comprende una secuencia que codifica un péptido antigénico o proteína. Las nanopartículas que contienen estos polinucleótidos pueden dispensarse a un individuo para inducir una respuesta inmunológica suficiente para disminuir la posibilidad de una infección posterior y/o disminuir los síntomas asociados con tal infección. El polinucleótido de estas vacunas pueden combinarse con interleuquinas, interferón, citoquinas, y adyuvantes tales como la toxina del cólera, alumbre, adyuvante de Freund, etc. Se conoce un gran número de compuestos adyuvantes; un compendio útil de muchos de tales compuestos ha sido preparado por los Nacional Institutes of Health y pueden encontrase en la red (http:/www.niaid.nih.gov/daids/vacine/pdf/
compendium.pdf, véase también Allison Dev. Biol. Stand. 92:3-11, 1998; Unkeless et al. Annu. Rev. Immunol. 6:251-281, 1998; y Phillips et al. Vaccine 10:151-158, 1992).
La proteína antigénica o los péptidos codificados por el nucleótido pueden derivarse de organismos bacterianos tales como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes. Corynebacterium diphtheriae. Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis. Clostridium tetani. Clostridium botulinum., Clostridium perfringens, Neisseria. meningitidis, Neisseria gonorrhoeae. Streptococcus mutans. Pseudomonas aeruginosa, Salmonellel typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestís, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogaos, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter jejuni, y semejantes; antígenos de virus tales como viruela, gripe A y B, el virus sincicial respiratorio, parainfluenza, sarampión, VIH, varicela-zoster, herpes simplex 1 y 2, citomegalovirus, el virus de Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, ;adenovirus, virus del papiloma, virus de la polio, paperas, rabia, rubeola, virus de coxsackie, encefalitis equina, encefalitis japonesa, fiebre amarilla, fiebre del valle de Rift, hepatitis A, B, C, D y E y semejantes; y de hongos, protozoos y organismos parasitarios tales como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Tricomonas vaginalis, Schistosoma mansoni, y semejantes.
Micropartículas
Los poli(ésteres de \beta-amino) de la presente invención pueden también usarse para formar aparatos de dispensación de fármacos. Los polímeros de la invención pueden usarse para encapsular agentes que incluyen polinucleótidos, pequeñas moléculas, proteínas, péptidos, metales, compuestos organometálicos etc. Los polímeros de la invención tienen varias propiedades que los hacen particularmente adecuados para la preparación de aparatos de dispensación de fármacos. Estas incluyen 1) la habilidad del polímero para complejar y "proteger" agentes lábiles; 2) la habilidad para tamponar el pH en el endosoma; 3) la habilidad para actuar como "esponja de protones" y causar endosomolisis; y 4) la habilidad para neutralizar la carga de agentes cargados negativamente. En una realización preferida, los polímeros se usan para formar micropartículas que contienen el agente que se va a dispensar. En una realización particularmente preferida, el diámetro de las micropartículas está en el intervalo desde entre 500 nm a 50 micrómetros, más preferiblemente desde 1 micrómetro a 20 micrómetros, y más preferiblemente desde 1 micrómetro a 10 micrómetros. En otra realización particularmente preferida, las micropartículas están en el intervalo de 1-5 micrómetros. El polímero de la invención encapsulante puede combinarse con otros polímeros (por ejemplo, PEG, PLGA) para formar las microesferas.
Métodos de preparar micropartículas
Las micropartículas de la invención pueden prepararse usando cualquier método conocido en la técnica. Estos incluyen, pero no están limitados a, secado por pulverización, evaporación del disolvente de emulsión sencilla o doble, extracción del disolvente, separación de la fase, coacervación simple y compleja, y otros métodos bien conocidos para aquellos conocedores de la técnica. Los métodos de preparar las micropatículas particularmente preferidos son el proceso de emulsión doble y secado por pulverización. Las condiciones usadas para preparar las micropartículas pueden alterarse para producir partículas de un tamaño o propiedad deseada (por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, morfología externa, "pegajosidad", forma, etc.). El método de preparar las partículas y las condiciones (por ejemplo, disolvente, temperatura, concentración, velocidad de la corriente de aire, etc) usados, puede también depender del agente que se encapsula y lo la composición de la matriz del polímero.
Los métodos desarrollados para hacer micropartículas para dispensación de los agentes encapsulados se describen en la bibliografía (por favor véase Doubrow, M., Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC Press, Boca Ratón, 1992; Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release 5:13-22, 1987; Mathiowitz et al. Reactive Polymers 6:275-283, 1987; Mathiowitz et al. J. Appl. Polymer Sci. 35:755-774, 1988; cada uno de las cuales se incorpora aquí para referencia).
Si las partículas preparadas por cualquiera de los métodos anteriores tienen un intervalo de tamaños fuera del intervalo deseado, las partículas pueden separarse por tamaño, por ejemplo, usando una criba.
Agente
Los agentes para dispensarse mediante el sistema de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos, diagnósticos, o profilácticos. Cualquier compuesto químico que se va a administrar a un individuo puede dispensarse usando las micropartículas de la invención. El agente puede ser una molécula pequeña, compuesto organometálico, ácido nucleico, proteína, péptido, polinucleótido, metal, un compuesto químico marcado isotópicamente, fármaco, vacuna, agente inmunológico, etc.
En una realización preferida, los agentes son compuestos orgánicos con actividad farmacéutica. En otra realización de la invención, el agente es un fármaco usado clínicamente. En una realización particularmente preferida, el fármaco es un antibiótico, agente antiviral, anestésico, agente esteroídico, agente antiinflamatorio, agente antineoplásico, antígeno, vacuna, anticuerpo, descongestivo, antihipertensivo, sedante, agente contraceptivo, agente progestágeno, anticolinérgico, analgésico, antidepresivo, antipsicótico, agente bloqueante \beta-adrenérgico, diurético, agente activo cardiovascular, agente vasoactivo, agente antiinflamatorio no esteroídico, agente nutricional, etc.
En una realización preferida de la presente invención, el agente que se va a dispensar puede ser una mezcla de agentes. Por ejemplo, un anestésico local puede dispensarse en combinación con un agente antiinflamatorio tal como un esteroide. Los anestésicos locales pueden también administrarse con agentes vasoactivos tales como epinefrina. Para dar otro ejemplo, un antibiótico puede combinarse con un inhibidor del enzima comúnmente producido por bacterias para inactivar el antibiótico (por ejemplo, penicilina y ácido clavulánico).
Los agentes de diagnóstico incluyen gases; metales; agentes de imagen comercialmente disponibles usados en la tomografía de emisiones de positrones (PET), tomografía asistida por ordenador (CAT), tomografía computarizada de emisión de fotón único, rayos X, fluoroscopía, e imagen de resonancia magnética (MRI); y agentes de contraste. Ejemplos de materiales adecuados para usar como agentes de contraste en MRI incluyen quelatos de gadolineo, asi como hierro, magnesio, manganeso, cobre, y cromo. Ejemplos de materiales útiles para CAT e imagen de rayos X incluye materiales basados en yodo.
Los agentes profilácticos incluyen pero no están limitados a, antibióticos, suplementos nutricionales, y vacunas. Las vacunas pueden comprender proteínas o péptidos aislados, organismos y virus inactivados, organismos y virus muertos, organismos o virus genéticamente alterados, y extractos celulares. Los agentes profilácticos pueden combinarse con interleuquinas, interferón, citoquinas, y adyuvantes tales como toxina del cólera, alumbre, adyuvante de Freund, etc. Los agentes profilácticos incluyen antígenos de organismos bacterianos tales como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes. Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis. Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria. meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans. Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi. Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella turarensis, Yersinia pestís, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter jejuni, y semejantes; los antígenos de virus tales como viruela, gripe A y B, virus sincicial respiratorio, parainfluenza, sarampión, VIH, varicela zoster, herpes simplex 1 y 2, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, rotavirus, rirovirus, adenovirus, virus del papiloma, virus de la polio, paperas, rabia, rubeola, virus de coxsackie, encefalitis equina, encefalitis japonesa, fiebre amarilla, fiebre del valle del Riff, virus de la hepatitis A, B, C, D, y E, y semejantes; antígenos de hongos, protozoos, y organismos parasitarios tales como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicales, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachornatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolítica, Toxoplasma gondii, Tricomonas vaginales, Schistosoma mansoni, y semejantes. Estos antígenos pueden estar en la forma de organismos completos muertos, péptidos, proteínas, glicoproteínas, carbohidratos, o combinaciones de los mismos.
Agentes diana
Las micro y nanopartículas de la invención pueden modificarse para incluir agentes diana ya que a menudo es deseable dirigirse a la célula particular, colección de células, o tejidos. Una variedad de agentes diana que dirigen las composiciones farmacéuticas a células determinadas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Cotten et al. Methods Enzym. 217:618, 1993; incorporada aquí como referencia). Los agentes diana pueden incluirse en toda la partícula o pueden estar solamente sobre la superficie. El agente diana puede ser una proteína, péptido, carbohidrato, glicoproteína, lípido, pequeña molécula, etc. El agente diana puede usarse para alcanzar células específicas o tejidos o puede usarse para promover la endocitosis o fagocitosis de la partícula. Ejemplos de agentes diana incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, lipoproteínas de baja densidad (LDLs), tranferrina, sialiproteinas, proteínas de sobre gp 120 del virus de la inmunodeficiencia (VIH), carbohidratos, ligandos del receptor, ácido siálico, etc. Si el agente diana se incluye en toda la partícula, el agente diana puede incluirse en una mezcla que se usa para formar partículas. Si el agente diana está solamente sobre la superficie, el agente diana puede estar asociado con (por ejemplo enlace covalente, hidrófobo, enlace de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, u otras interaciones) las partículas formarlas usando técnicas químicas estándar.
Composiciones farmacéuticas
Una vez que las micropartículas o nanopartículas (polímero complejado con polinucleótido) han sido preparadas, pueden combinarse con uno o más excipientes farmacéuticos para formar la composición farmacéutica que es adecuada para ser administrada a animales incluyendo el ser humano. Como se apreciaría por una persona con conocimiento de la técnica, los excipientes pueden elegirse basados en la ruta de administración como se describe más tarde, el agente que se va a administrar, la pauta de administración del agente, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención y para uso según la presente invención pueden incluir un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un sólido inerte, semisólido o fluido líquido, diluyente, material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo no tóxico. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como lactosa, glucosa, y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de girasol; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; detergentes tales como Tween 80; agentes tamponantes tales como hidróxido magnésico e hidróxido alumínico; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; y soluciones tamponadas de fosfato; así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como laurilsulfato sódico y estearato magnésico, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes savorizantes y aromatizantes, preservantes y antioxidantes pueden estar presentes también en la composición, según el juicio del formulador. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse a seres humanos y/o animales, por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intranasal, intraperitoneal, por vía tópica (como polvos, cremas, ungüentos, o gotas), por boca, o como un pulverizado oral o nasal.
Las formas de dosificación líquidas para la administración oral incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y elixires. En adición a los ingredientes activos (por ejemplo, micropartículas, nanopartículas, complejos de polinucleótido/polímero), las formas de dosificación líquida pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y agentes emulsificantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, de semilla de algodón, nuez molida, maíz, germen, oliva, ricino, y sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo, glicoles de polietileno y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales pueden también incluir adyuvantes tales como agentes de humectación, agentes emulsificantes dispersantes, agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosos u oleaginosas estériles inyectables pueden formularse según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión. Las preparaciones inyectables estériles pueden ser también soluciones inyectable: estériles, suspensiones, o emulsiones en un disolvente o eluyente aceptable parenteral no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer, solución de cloruro sódico isotónica U.S.P. Además, los aceites de fijación estériles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite de fijación insípido puede emplearse incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico se usan en la preparación de inyectables. En una realización particularmente preferida, las partículas se suspenden en un vehículo fluido que comprende 1% (p/v) carboximetilcelulosa sódica y 0,1% (v/v) Tween 80.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o por incorporación de agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio estéril inyectable antes de usar.
Las composiciones para la administración vaginal o rectal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse mezclando las partículas con excipientes o vehículos no irritantes adecuados tales como la manteca de cacao, el polietilenglicol, o la cera de supositorios que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y por tanto funden en el recto o en la cavidad vaginal y liberan las micropartículas.
Las formas de dosificación sólida para la administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, las partículas se mezclan con al menos un excipiente inerte, farmacéuticamente aceptable o vehículo tal como citrato sódico o fosfato dicálcico y/o a) rellerios o aumentadores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa, y acacia, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato sódico e) agentes retardantes de solución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato cálcico, estearato magnésico, glicoles de polietileno sólidos, laurelsulfato sódico, y mezclas de los mismos. En el caso de
cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación pueden también comprender agentes de tamponamiento.
Las composiciones sólidas de un tipo similar pueden también emplearse como rellenos en cápsulas de gelatina blandas y duras usando excipientes tales como la lactosa o el azúcar de la leche así como glicoles polietilénicos de alto peso molecular y semejantes.
Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, pastillas, cápsulas, píldoras, y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y capas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Pueden opcionalmente contener agentes de opacidad y pueden también ser de una composición que libere el ingrediente(s) activo(s) solamente, o preferiblemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente en forma retardada. Ejemplos de composiciones embebidas que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las composiciones sólidas de un tipo similar pueden también emplearse como rellenos en cápsulas de gelatina blanda y dura usando excipientes como la lactosa o el azúcar de la leche así como glicoles polietilénicos de altos pesos moleculares y semejantes.
Las formas de dosificación para la administración transdémica o tópica de una composición farmacéutica de la invención incluyen ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizadores, inhaladores, o parches. Las partículas se mezclan en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier preservante o tampón necesario que se precise. La formulación oftálmica, gotas para los oídos, gotas para los ojos se contemplan también como que están dentro del alcance de la invención.
Los ungüentos, pastas, cremas, y geles pueden contener, además de las partículas de la invención, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, glicoles polietilénicos, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco, y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y pulverizados pueden contener, además de las partículas de la invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos cálcicos, y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los pulverizados pueden contener además propelentes habituales tales como clorofluorohidrocarbonos.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar dispensación controlada de un compuesto en el cuerpo. Tales formas de dosificación pueden hacerse disolviendo o dispensando las micropartículas o nanopartículas en un medio apropiado. Los potenciadores de la absorción pueden también usarse para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse o proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando las partículas en una matriz del polímero o gel.
Estos y otros aspectos de la presente invención serán apreciados más tarde considerando los ejemplos a continuación, los cuales están para ilustrar ciertas realizaciones particulares de la invención pero no intentan limitar su alcance, como se define en las reivindicaciones.
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Ejemplos Ejemplo 1 Poli(\betaamino ésteres) degradables: Síntesis, caracterización, y autoensamblaje con ADN plasmídico Sección experimental
Consideraciones generales. Todas las manipulaciones que envolvían células vivas o materiales estériles se realizaron en una vitrina de flujo laminar usando técnicas estándares estériles. Los espectros de ^{1}H RMN (300,100 MHz) y ^{13}C RMN (75,467 MHz) se realizaron con un espectrómetro Varian Mercury. Todos los valores de desplazamiento químico se dan en ppm y están referenciados en relación al protón residual o señal de carbono del disolvente. La cromatografía de permeabilidad de gel en fase orgánica (GPC) se realizó usando una bomba de Hewlett Packard serie 1100 isocrática, un inyector de Rheodyne modelo 7125 con un bucle inyector de 100 \muI, y dos columnas PL-Gel D-mezcladas en serie (5 \mum, 300 x 7,5 mm, Polymer Laboratorios, Amherst, MA). Se usó THF/piperidina 0,1 M como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Los datos se recogieron usando un refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) y se procesaron con el paquete de software TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y polidispersidades de los polímeros se describen en relación a estándares monodispersos de poliestireno. La cromatografía GPC en fase acuosa se realizó con American Polymer Standards (Mentor, OH) usando las columnas Ultrahidrogel L y 120A en serie (Waters Corporation, Milford, MA). Se usó agua (con ácido acético al 1%, y NaCl 0,3 M) como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Los datos se recogieron usando un refractómetro diferencial de Knauer y se procesaron con el paquete de software IBM/PC GPC PRO 3,13 (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y polidispersidades de los polímeros se dan en relación a estándares de poli(2-vinilpiridina). En los ensayos de citotoxicidad, se midió la absorbancia usando un lector de microplaca de Dynatech Laboratories MR5000 a 560 nm.
Materiales. La N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina y 4,4'-trimetilendipiperidina se obtuvieron comercialmente de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). El diacrilato de 1,4-butanodiol se obtuvo cae Alfa Aesar Organics (Ward Hill, MA). El bromuro de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se obtuvo de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). El ADN plasmídico (pCMV-Luc) se produjo con E. coli (DH5\alpha, un amable regalo de Zycos, Inc., Cambridge, MA), fue aislado con un kit de Qiagen, y se purificó por precipitación coro etanol. Las células NIH 3T3 se obtuvieron comercialmente de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron a 37ºC, en 5% de CO_{2} en 90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco; 10% de suero bovino fetal; 100 unidades/ml de penicilina; 100 \mug/ml de estreptomicina. Todos los demás materiales y disolventes se usaron como se recibieron sin purificación adicional.
Procedimiento general de polimerización. En un experimento típico, se pesaron el diacrilato de 1,4-butanodiol (0,750 g, 0,714 ml, 3,78 mmoles) y la diamina (3,78 mmoles) en dos viales separados y se disolvieron en -i HF (5 ml). Se añadió la solución que contenía la diamina a la solución de diacrilato con una pipeta. Se añadió una barra giratoria magnética recubierta de Teflón, se tapó el vial con una tapa de rosca recubierta de Teflón, y se calentó la reacción a 50ºC. Después de 48 horas, se enfrió la reacción a temperatura ambiente y se dejó gotear lentamente en éter dietílico o hexanos con agitación fuerte. Se recogió el polímero y se secó al vacío antes del análisis.
Síntesis del polímero comparativo 1. Se preparó 1 polímero 1 según el procedimiento general descrito anteriormente. ^{1}H RMN \delta (CDCl_{3}, 300 MHz) 4,11 (t ancho, 4H), 2,75 (t ancho, J = 7,05 Hz, 41-1), 2,53 (s ancho, 4H), 2,50 (t ancho, (solapado), J = 7,20 Hz, 4H), 2,28 (s ancho, 6H), 1,71 (m ancho, 4H), ^{13}C RMN \delta (CDCl_{3}, 75,47 MHz) 172, 55, 64,14, 55, 31, 53, 39, 42, 47, 32, 54, 25, 53.
Síntesis del polímero comparativo 2. Se preparó el polímero 2 según el procedimiento general descrito anteriormente. ^{1}H RMN \delta (CDCl_{3}, 330 MHz) 4,11 (t ancho, 4H), 2,74 (t ancho, J = 7,35, 4H), 2,56 (m ancho, 12H), 1,71 (t ancho, 4H). ^{13}C RMN 5 (CDCl_{3}, 75,47 MHz) 172,24, 64,19, 53,55, 52,75, 32,27, 25,52. Síntesis del polímero comparativo 3. Se preparó el polímero 3 según el procedimiento general descrito anteriormente. 5 (CDCl_{3}, 300 MHz) 4,11 (t ancho, 4H), 3,00 (m ancho, 4H), 2,79 (m ancho, 4H), 2,65 (m ancho, 4H), 2,11 (m ancho, 4H), 1,70 (m ancho, 8H), 1,25 (m ancho, 12H). ^{13}C RMN 5 (CDCl_{3}, 75,47 MHz) 172,37, 64,13, 53,89 (ancho), 36,74, 35,58, 32,11 (ancho), 25,45, 24,05.
Estudios de degradación de polímeros. Las sales de hidrocloruro de los polímeros 1-3 se disolvieron en tampón de acetato (1 M, pH = 5,1) o tampón de HEPES (1 M, pH = 7,4) a una concentración de 5 mg/ml (el uso de concentraciones milimolares del tampón produjo una reducción sustancial del pH durante la degradación debido a la producción de productos de degradación ácidos). Se incubaron las muestras a 37ºC con un agitador mecánico, y se tomaron alícuotas (1 ml) a intervalos de tiempo adecuados. Se congelaron las alícuotas inmediatamente en nitrógeno líquido y se liofilizaron. Se extrajeron los polímeros de las sales de tampón secas usando THF/piperidina 0,1 M (1 ml), y se analizaron las muestras directamente por GPC.
Formación de los complejos ADN/polímero y pruebas de ralentización en el gel de agarosa. Se formaron los complejos ADN/polímero añadiendo 50 \mul de una solución de ADN plasmídico (pCMV Luc, 2 \mug/50 \mul en agua) a una solución agitada por vórtex suave de las sales de hidrocloruro de los polímeros 1-3 (50 \mul en MES 25 mM, pH = 6,0, las concentraciones se ajustaron para dar las relaciones de peso de ADN/polímero deseadas). Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos, después de lo cual se cargaron 20 \mul en un gel de agarosa de 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 65 V, 30 minutos). Se cargaron las muestras en el gel en un tampón de carga que consistía en Ficoll 400 al 10% (Anersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en HEPES (25 mM, pH = 7,2). No se incluyó el azul de bromofenol como indicador visual en el tampón de carga, puesto que este tinte cargado parecía interferir con el complejamiento del polímero y el ADN. Se visualizaron las bandas de ADN con luz ultravioleta por mancha con bromuro de etidio.
Medidas de dispersión de rayo de láser casi elástico (QELS) y medidas de los potenciales \xi. Los experimentos de QELS y medidas de los potenciales \xi se realizaron usando un detector ZetaPals dinámico de dispersión de la luz (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, láser de 15 mW, rayo incidente = 676 nm). Los complejos ADN/polímero se formaron como se describió anteriormente en las pruebas de ralentización de gel de agarosa. Se diluyeron las muestras con 900 \mul de HEPES (20 mM, pH=7,0), se añadieron a una muestra en agitación de vórtex suave del complejo ADN/polímero (volumen total = 1 ml, pH = 7,0). Se determinaron los tamaños medios de las partículas y los potenciales \xi a 25ºC. Las funciones de correlación se tomaron a un ángulo de dispersión de 90ºC, y se calculó el tamaño de las partículas usando la opción de MAS del software de tamaño de partícula BIC (versión 2.30) usando la viscosidad y el índice de refracción del agua pura a 25ºC. Los tamaños de partícula se expresan como los diámetros efectivos asumiendo una distribución logarítmica normal. Las movilidades electroforéticas medias se midieron a 25ºC usando el software de análisis de potencial zeta BIC PALS y los potenciales zeta se calcularon usando el modelo de Smoluchowsky para suspensiones acuosas. Se realizaron tres medidas de cada muestra, y se presentaron los resultados como diámetros medios y potenciales zeta medios.
Ensayos de citotoxicidad. Se cultivaron células NIH 3T3 inmortalizadas en placas de 96 pocillos con una densidad inicial de 10.000 células/pocillo en 200 \mul de medio de crecimiento (90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco; 10% de suero bovino fetal; 100 unidades/ml de penicilina; 100 \mug/ml de estreptomicina). Se cultivaron las células durante 24 horas, después de lo cual se eliminó el medio de cultivo y se reemplazó con 180 \mul de medio sin suero. Se añadieron las cantidades adecuadas de polímero en alícuotas de 20 \mul. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 5 horas y se determinó la actividad metabólica de cada pocillo usando un ensayo de tinte azul MTT/azul de tiazolilo: se añadió a cada pocillo 25 \mul de una solución de 5 mg/ml de solución madre de MTT en tampón de PBS estéril. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 2 horas, y se añadió a cada pocillo 100 \mul de tampón de extracción (20% p/v de SDS en DMF/agua (1:1), pH = 4,7). Se incubaron las muestras a 37ºC durante 24 horas. Se midió la absorbancia óptica a 560 nm con un lector de microplaca y se expresó como el porcentaje en relación a las células de control.
Resultados y discusión Síntesis y caracterización de los polímeros
La síntesis de poli(amidoiminas) lineales que contienen aminas terciarias en sus esqueletos se ha descrito por Ferruti et al. en 1970 vía la adición de aminas bifuncionales a bisacrilamidas (Anderson Nature 392 (Suppl.): 25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2:144-147, 1996; Cristal Science 270:404-410, 1995; Muligan Science 260:926-932, 1993). Se investigaron inicialmente poli(amidoiminas) lineales como la heparina y biomateriales complejantes de iones (Ferruti et al Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti et al. Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Ferruti et al Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti et al. Biomaterials 15:1235-1241, 1994). Las poli(amidoiminas) dendríticas (PAMAMs) se han usado cada vez más en aplicaciones de transferencia de genes debido a su habilidad de complejar el ADN (Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al. Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993), y una publicación reciente describe la aplicación de una familia de poli(amidoiminas) lineales a los estudios de transfección celular y de citotoxicidad (Hill et al. Biochim. Biophys. Acta 1427:161-174, 1999). Por el contrario, poliéster aminas) análogas formadas por la adición tipo Michael de aminas bifuncionales a ésteres de diacrilato han recibido menos atención (Danusso et al. Polymer 11:88-113, 1970; Ferruti et al. Polymer 26:1336, 1985; Ferruti et al Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti et al Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Ferruti et al Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti et al Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Kargina et al. Vysokomol. Soedin. Seriya A 28:1139-1144, 1986; Rao et al. J. Bioactive and Compatible Polymers 14:54-63, 1999).
La aproximación de poli(amino éster) presenta una base particularmente atractiva para el desarrollo de vectores de transfección nuevos poliméricos por varias razones: 1) los polímeros contienen las aminas requeridas y uniones fácilmente degradables, 2) potencialmente podrían sintetizarse análogos múltiplas directamente con materiales de partida comercializados, y 3) si los polímeros obtenidos fueran útiles como agentes de condensación del ADN, podrían fácilmente entramarse generaciones futuras de polímeros que poseyeran valores de pKa de amina cubriendo el intervalo de pH fisiológicamente relevante. Este último punto era particularmente intrigante, ya que la capacidad de tampón de las poliaminas se ha implicado recientemente como un factor que influye en la fuga del ADN de los endosomas celulares después de la endocitosis (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993; Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et al., en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., editores), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, páginas 146-151; Kabanov et al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clínical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998). Mientras que el complejamiento del ADN con un polímero catiónico es requerido para compactar y proteger el ADN durante los eventos iniciales en el proceso de transfección, el ADN y el polímero deben últimamente descomplejarse en el núcleo para permitir una transcripción eficiente (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000). En vista de este requerimiento, las policaciones degradables podrían jugar un papel importante en los eventos de "deshacer el paquete del vector" en el núcleo (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Schaffer et al. Biotechnol. Bioeng. 67:598-606, 2000; Kabanov Pharm. Sci. Technol. Today 2:365-372, 1999). Finalmente, se propuso la hipótesis que los polímeros de esta estructura general, y los derivados de \beta-aminoácidos a los que presumiblemente se degradan, serían significativamente menos tóxicos que la poli(lisina) y PEI. Como se describió anteriormente, las policaciones degradables (Putnam et al. Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000) y los polímeros lineales que contienen aminas relativamente impedidas situadas cerca del esqueleto del polímero (Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999) son menos tóxicos que la poli(lisina) y PEI.
Se investigó la síntesis de los polímeros 1-3 vía la adición de las bis(aminas secundarias), N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina, y 4,4'-trimetilendipiperidina al diacrilato de 1,4-butanodiol (Danusso et al. Polymer 11:88-113, 1970; Kargina et al. Vysokomol. Soedin. Seriya A 28:1139-1144, 1986). La polimerización de estos monómeros procedió en THF y CH_{2}Cl_{2} a 50ºC para dar los polímeros correspondientes en rendimientos de hasta 86% (Tabla 1). Se purificaron los polímeros por medio de precipitaciones repetidas en éter dietílico o hexano. El polímero 1 se aisló como un líquido transparente viscoso; los polímeros 2 y 3 se obtuvieron como sólidos blancos después de secar a alto vacío. Alternativamente, los polímeros 1-3 pueden aislarse como sales sólidas de hidrocloruro después de la adición de éter dietílico/HCl a una solución del polímero en THF o CH_{2}Cl_{2}. Los tres polímeros fueron solubles en disolventes orgánicos tales como THF, CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3} y MeOH y fueron también solubles en agua a pH reducido. El polímero 1 y las sales de hidrocloruro de los polímeros 1-3 fueron totalmente solubles en agua.
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Los pesos moleculares de los polímeros 1-3 y de sus sales de hidrocloruro correspondientes se determinaron por cromatografía de permeabilidad de gel (GPC) tanto en fase orgánica como en fase acuosa. Los pesos moleculares de los polímeros (Mn) estuvieron en el intervalo de hasta 5.800 para el polímero 1 hasta 32.000 para el polímero 3, en relación a estándares de poliestireno. La distribución de peso molecular en estos polímeros fue monomodal con índices de polidispersidad (PDIs) en el intervalo de 1,55 a 2,55. Los datos representativos de peso molecular se presentan en la tabla 1. Mientras que la síntesis de poli(amidoiminas) lineales generalmente se realiza usando alcoholes o agua como disolventes (Danusso et al. Polymer 11:88-113, 1970; Ferruti et al. Polymer 26:1336, 1985; Ferruti et al Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti et al Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Ferruti et al Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti et al Biomaterials 15:1235-1241, 1994), se usaron THF anhidro y CH_{2}Cl_{2} en la síntesis de los poli(\beta-aminoésteres) para minimizar las reacciones de hidrólisis durante la síntesis. Los rendimientos y pesos moleculares de los polímeros sintetizados empleando CH_{2}Cl_{2} como disolvente fueron generalmente más altos que los de los polímeros sintetizados en THF (Tabla 1) (el polímero 1 no pudo sintetizarse en CH_{2}Cl_{2}. El color de la solución de reacción progresó desde incoloro a un color rosa intenso casi inmediatamente después de la introducción de una solución de N,N'-dimetiletilendiamina en CH_{2}Cl_{2} a una solución de diacrilato de 1,4-butanodiol en CH_{2}Cl_{2} (véase la sección experimental anterior). El color progresó a naranja ligero en el curso de la reacción, y se aisló un polímero naranja después de precipitación con hexano. El polímero aislado fue insoluble en CH_{2}Cl_{2}, THF y agua a pH reducido y no fue caracterizado estructuralmente. No se encontró este problema en la reacción análoga con THF).
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TABLA 1 Datos representativos de peso molecular para los polímeros 1-3 
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Las estructuras de los polímeros 1-3 se confirmaron por espectroscopia de RMN de ^{1}H y ^{13}C. Estos datos indican que los polímeros se formaron por la adición del conjugado de las aminas secundarias a los restos de acrilato del diacrilato de 1,4-butanodiol y no por la formación de enlaces de amida en nuestras condiciones de reacción. Adicionalmente, las aminas terciarias nuevamente formadas en los esqueletos poliméricos no participan en las reacciones de adición subsiguientes con el monómero de diacrilato, lo que conduciría a la ramificación o el entrecruzamiento polimérico. Este resultado afortunado parece ser único para los polímeros de este tipo producidos de monómeros de bis(aminas secundarias). La síntesis de polímeros análogos empleando aminas primarias difuncionales como monómeros (tales como 1,4-diaminobutano) puede conducir a la ramificación del polímero y a la formación de redes de polímeros entrecruzados insolubles si las condiciones no son controladas explícitamente.
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Vista la yuxtaposición de aminas y ésteres en los esqueletos de los polímeros 1-3, inicialmente estábamos preocupados de que la hidrólisis, pudiera ocurrir demasiado rápidamente en los polímeros para ser de uso práctico. Por ejemplo, el poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y el poli[\alpha-(4-aminobutil)-L-ácido glicólico] se degradan bastante rápidamente cerca de pH neutro, teniendo semividas de aproximadamente 2 horas (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999) y 30 minutos (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000), respectivamente (dichos tiempos de degradación rápida no impiden la aplicación de estos polímeros para la dispensación de genes (véase las referencias, Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000). Sin embargo, las velocidades de degradación extremadamente rápidas introducen generalmente preocupaciones adicionales relacionadas con la manipulación, almacenaje, y aplicación de los polímeros degradables). Sin embargo, el análisis de los polímeros 1 y 2 por GPC acuosa usando 1% ácido acético/agua como eluyente, reveló que la degradación era lo suficientemente lenta en medio ácido. Por ejemplo, las muestras de GPC de los polímeros 1 y 2 muestreados en estas condiciones en un periodo de 4-5 horas mostraron que no hubo cambios en los pesos moleculares o polidispersidades (el polímero 3 no pudo ser analizado por GPC acuosa). Estábamos también preocupados de que pudiera ocurrir hidrólisis significativa del esqueleto durante el aislamiento de las sales de hidrocloruro de los polímeros 1 y 3. Para prevenir la hidrólisis durante la protonación y aislamiento de estos polímeros, se emplearon disolventes anhidros y se realizaron las reacciones en atmósfera de argón. Análisis de los polímeros antes y después de la protonación no reveló hidrólisis observable. Por ejemplo, el trazado por GPC de una muestra del polímero 3 después de la precipitación con CH_{2}Cl_{2} con éter dietílico 1,0 M/HCl (M_{n} = 15.300; PDI = 1,90) fue virtualmente idéntico al peso molecular del polímero antes de la protonación (M_{n} = 15.700; PDI = 1,92) y ninguna especie de peso molecular más bajo fue evidente (los datos de GPC comparativos se obtuvieron empleando THF/piperidina 0,1 M como eluyente (véase la sección experimental anterior). Las sales de hidrocloruro de los polímeros eran insolubles en THF, pero eran solubles en THF/piperidina 0,1 M formando al mismo tiempo un precipitado fino blanco que se filtró antes de la inyección). Las muestras sólidas de los polímeros 1-3 pudieron ser almacenadas durante varios meses sin disminución apreciable de los pesos
moleculares.
Los polímeros 1-3 fueron específicamente diseñados para degradarse vía hidrólisis de los enlaces éster en los esqueletos de los polímeros. Sin embargo, una preocupación adicional relacionada con la estabilidad total y biocompatibilidad de estos polímeros es el potencial de que ocurra una degradación no deseada por una reacción retro-Michael en condiciones fisológicas. Puesto que estos polímeros fueron sintetizados vía la reacción tipo Michael de una amina secundaria con un éster de acrilato, es posible que los polímeros pudieran sufrir una reacción retro-Michael para regenerar los grupos acrilatos libres, particularmente en condiciones ácidas. Los ésteres de acrilato son agentes potenciales de alquilación del ADN y se sospecha por lo tanto que puedan ser carcinógenos (para ejemplos recientes, véase: Schweikl et al. Mutat. Res. 438:P71-P78, 1999; Yang et al. Carcinogenesis 19:P1117-P1125, 1998). Ya que se espera que estos polímeros se encuentren con un medio de pH reducido en las vesículas endosomiales de las células (pH = 5,0 - 5,5) durante la transfección, estudiamos el potencial de que ocurriera la degradación de estos polímeros a través de la vía retro-Michael.
Los polímeros 1-3 se degradaron rápidamente en condiciones extremadamente ácidas (pH < 3) o básicas (pH > 12), polímeros 1-3 se degradaron rápidamente y exclusivamente a 1,4-butanodiol y los productos secundarios bis (13-aminoácido) esperados 4a-6a como se determinó por espectroscopia de ^{1}H RMN. No se encontró ninguna evidencia de espectroscopia para la adición retro-Michael en estas condiciones. Vale la pena mencionar que sería menos probable que a los productos bis(\beta-aminoácido) de degradación 4a-6a les ocurriera una reacción retro Michael, ya que los ácidos acrílicos son en general partes menos activadas de una adición de Michael (Perlmutter, P., en Conjugate Addition Reactions in Organic Síntesis, Pergarion Press, Nueva York, 1992). No se observó ninguna degradación adicional de los compuestos 4a-6a en estas condiciones.
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Se investigó la cinética de degradación de los polímeros en el intervalo de las condiciones probables que se encuentren los polímeros durante la transfección. La degradación se monitorizó a 37ºC a valores de pH tamponados de 5,1 y 7,4 para acercarse al pH del medio dentro de las vesículas endosomales y el citoplasma, respectivamente. Se añadieron las sales de hidrocloruro de los polímeros 1-3 al tampón apropiado, se incubaron a 37ºC, y se tomaron alícuotas en los tiempos apropiados. Se congelaron las alícuotas inmediatamente, se liofilizaron, y se extrajo el polímero con THF/piperidina 0,1 M para el análisis por GPC. La figura 1 muestra los perfiles de degradación de los polímeros 1-3 en función del tiempo. Los polímeros se degradaron más lentamente a pH 5,1 que a pH 7,4. Los polímeros 1-3 mostraron perfiles de degradación similares a pH 5,1, cada polímero tuvo una semivida de aproximadamente 7-8 horas. Por el contrario, los polímeros 1-3 fueron completamente degradados en menos de 5 horas a pH 7,4. Estos resultados son consistentes con los perfiles de degradación de pH de otros poliésteres que contienen aminas, tales como poli(4-hidroxi-L-éster de prolina), en los que se piensa que las funciones amina colgantes actúan como catalizadores nucleófilos intramoleculares y contribuyen a la degradación más rápida a pH más alto (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000). Mientras que no puede eliminarse la posibilidad de una asistencia intramolecular, es menos probable para los polímeros 1-3 ya que las aminas terciarias de estos polímeros deberían ser menos nucleófilas. La de- gradación del polímero 2 ocurrió más lentamente a pH 7,4 que a pH 5,1 (figura 1). Lo más probable es que este comportamiento anómalo se deba a la total insolublilidad del polímero 2 a pH 7,4 y la naturaleza heterogénea resultante en el medio de degradación (los polímero 2 y 3 no son completamente solubles en agua a pH 7,4. Mientras que el polímero 3 se disolvió relativamente rápidamente durante el experimento de degradación, partículas sólidas del polímero 2 fueron visibles durante varios días.
Ensayos de citotoxicidad
La poli(lisina) y el PEI se han investigado ampliamente como agentes de condensación del ADN y vectores de transfección de ADN (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993; Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et al., en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., editores), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996 páginas 146-151; Kabanov et al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998) y son los estándares con los que a menudo se comparan los vectores poliméricos nuevos (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). Desgraciadamente, como se ha descrito anteriormente, estos polímeros están también asociados con niveles significativos de citotoxicidad y los niveles altos de expresión genética se realizan corrientemente sólo con un coste sustancial de la viabilidad celular. Para determinar el perfil de toxicidad de los polímeros 1-3, se realizó como indicador inicial una prueba de reducción del tinte azul MTT/tiazolilo usando la línea celular NIH 3T3 y las sales de hidrocloruro de los polímeros 1-3. La línea celular 3T3 se usa corrientemente como población de primer nivel de cribado de los nuevos vectores de transfección, y la prueba de MTT se usa generalmente como indicador inicial de citotoxicidad, puesto que determina la influencia de sustancias añadidas en el crecimiento celular y metabolismo (Hansen et al. Immunol. Methods 119:203-210,
1989).
Se incubaron las células con el polímero 1 (M_{n} = 5.800), el polímero 2 (M_{n} = 11.300) y el polímero 3 (M_{n} = 22.500), como se describe en la sección experimental. Como se muestra en la figura 2, las células incubadas con estos polímeros permanecieron viables en un 100% comparadas con los controles, a concentraciones de los polímeros de hasta 100 \mug/ml. Estos resultados se comparan impresionantemente con los datos obtenidos con poblaciones celulares tratadas con PEI (Mn = 25.000), incluidas como controles positivos en nuestra prueba así como para facilitar la comparación con este agente de transfección bien conocido. Menos del 30% de las células tratadas con PEI permanecieron viables a una concentración del polímero de 25 \mug/ml, y la viabilidad celular fue tan baja como el 10% a concentraciones mayores de PEI en condiciones por lo demás idénticas. Se realizó un ensayo de MTT análogo usando bis(\beta-aminoácido)s 4a-6a para cribar la citotoxicidad de los productos de degradación hidrolítica de estos polímeros. (Los bis(\beta-aminoácido)s 4a-6a deberían ser o biológicamente inertes o poseer una toxicidad ligera o una toxicidad aguda que sea menor que la de los vectores de transfección policatiónicos tradicionales. En cualquier caso, la degradación de estos materiales debería facilitar la eliminación metabólica rápida). Los compuestos 4a-6a y el 1,4-butanodiol no perturbaron el crecimiento celular o metabolismo en esta prueba inicial de cribado (no se muestran los datos). No puede hacerse una comparación más directa basada en estructura/función entre los polímeros 1-3 y PEI debido a las diferencias en la estructura de los polímeros y el peso molecular, ambos de los cuales contribuyen a la toxicidad de policación. A pesar de todo, solo los perfiles de toxicidad excelentes de los polímeros 1-3 sugirieron que eran candidatos muy interesantes para estudios adicionales como agentes de condensación de ADN.
Autoensamblaje de los polímeros 1-3 con el ADN plasmídico
Es bien conocida la tendencia de las poliaminas catiónicas a interaccionar electrostáticamente con el esqueleto polianiónico del ADN en solución acuosa. Siempre que los polímeros tengan los protones suficientes a pH fisiológico, y que las aminas sean accesibles estéricamente, dichas interacciones pueden producir un proceso de autoensamblaje en el que los polímeros positiva y negativamente cargados forman conjugados bien definidos (Kabanov et al. en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998). La mayoría de las poliaminas investigadas como agentes complejantes del ADN y vectores de transfección del ADN tienen aminas incorporadas en los extremos de cadenas laterales cortas, flexibles desde un punto de vista conformacional (por ejemplo, poli(lisina) y polímeros de metacrilato/metacrilamida) (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; van de Wetering et al. Bioconjugate Chem. 10:589-597, 1999), o aminas accesibles en las superficies de poliaminas esféricas o globulares (por ejemplo, PEI y dendrímeros de PAMAM) (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al., Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993). Ya que los polímeros 1-3 contienen aminas terciarias, y esas aminas terciarias están situadas en un entorno abarrotado estéricamente (flanqueado en dos lados por los esqueletos del polímero), inicialmente estábamos preocupados de que las aminas protonadas pudieran no ser suficientemente capaces de interaccionar íntimamente con el ADN.
Se demostró la habilidad de los polímeros 1-3 para complejar el ADN plasmídico con una prueba de desplazamiento en gel de agarosa. La electroforesis en gel de agarosa separa las macromoléculas tanto en base a su carga como a su tamaño. Por lo tanto, la inmovilización del ADN en el gel de agarosa en presencia de concentraciones cada vez mayores de una policación se ha usado ampliamente como una prueba para determinar el punto en el que se consigue la completa neutralización de la carga de ADN (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). Como se ha mencionado anteriormente, las sales de hidrocloruro de los polímeros 1-3 son solubles en agua. Sin embargo, los polímeros 2 y 3 no son totalmente solubles en agua a pH 7,2 en el intervalo completo de concentraciones poliméricas deseado. Por lo tanto, se prepararon los complejos ADN/polímero en tampón MES (25 mM, pH = 6,0;1. Se prepararon los complejos ADN/polímero añadiendo una solución acuosa de ADN a soluciones del polímero en MES agitado con vortex en las concentraciones ADN/polímero deseadas (véase la sección experimental). Los complejos ADN/polímero obtenidos permanecieron solubles después de su dilución con el tampón de la electroforesis (HEPES 20 mM, pH = 7,2) y se obtuvieron los datos a pH fisiológico. Como un ejemplo representativo, la figura 3 describe la migración de un ADN plasmídico (pCMV-Luc) en gel de agarosa en presencia de concentraciones en aumento del polímero 1.
Como se muestra en la figura 3, la ralentización de la migración del ADN empieza en relaciones ADN/1 tan bajas como 1:0,5 (p/p) y la migración está completamente ralentizada a relaciones ADN/polímero por encima de 1:1,0 (p/p) (aquí se refiere a proporciones ADN/peso de polímero más que a relaciones ADN/carga de polímero. Aunque se usan ambas formas en la bibliografía, encontramos que las relaciones en peso son más prácticas y universales, ya que la carga total de una poliamina está sujeta a variaciones del entorno de pH y la temperatura. Mientras que las relaciones ADN/carga de polímero son descriptivas para polímeros tales como la poli(lisina), tienen menos significado para los polímeros tales como el PEI y los polímeros 1-3 que incorporan aminas menos básicas). Los polímeros 2 y 3 inhiben completamente la migración del ADN plasmídico a relaciones ADN/polímero (p/p) mayores de 1:10 y 1:1,5, respectivamente (datos no mostrados). Estos resultados varían marcadamente de los experimentos de ralentización en gel conducidos usando "monómeros" modélicos. Puesto que los monómeros verdaderos y los productos de degradación de los polímeros 1-3 no representan adecuadamente las unidades de repetición de los polímeros, usamos los bis(éster(es) metílico)s 4b-6b para examinar la extensión necesaria de polivalencia y unión cooperativa de las policaciones 1-3 para conseguir la inmovilización del ADN. Los "monómeros" 4b-6b no inhibieron la migración del ADN en relaciones ADN/"monómero" (p/p) hasta de 1:30 (datos no mostrados).
Lo más probable es que las razones para el complejamiento menos eficiente empleando el polímero 2 en los ensayos anteriores de electroforesis sean las diferencias en los valores de pK_{a} de las aminas en estos polímeros. La medida directa de los valores de pK_{a} de los polímeros 1-3 está complicada por su capacidad de degradación. Sin embargo, predecimos que el intervalo de valores de pK_{a} de las aminas en los polímeros 1 y 2 se extiende desde aproximadamente 4,5 a 8,0 en el polímero 1, y de 3,0 a 7,0 en el polímero 2, basado en comparaciones con poli(\beta-amino imidas) relacionadas estructuralmente. (Se han publicado los valores de pK_{a} de las poli(\beta-amino amidas) relacionadas estructuralmente que contienen unidades de piperazina y dimetiletilendiamina en sus esqueletos. Barbucci et al. Polymer 21:81-85, 1980; Barbucci et al. Polymer 19:1329-1334, 1978; Barbucci et al. Macromolecules 14:1203-1209, 1981).
Como resultado, el polímero 2 debería estar menos protonado que el polímero 1 a pH fisiológico o casi neutro, y sería por lo tanto un agente de condensación del ADN menos eficaz. El intervalo de valores de pK_{a} del polímero 3 debería ser mayor que el intervalo de los polímeros 1 y 2 debido a la mayor distancia entre los átomos de nitrógeno. Según esto, el polímero 3 forma complejos con el ADN a concentraciones sustancialmente reducidas en relación al polímero 2.
Las pruebas de ralentización en el gel de agarosa son útiles para determinar la extensión a la que la policaciones interacionan con el ADN. Sin embargo, para que sean útiles como agentes de transfección, las policaciones deben ser también capaces de autoensamblar el ADN plasmídico como complejos polímero/ADN lo suficientemente pequeños para penetrar una célula por endocitosis. En la mayor parte de los tipos de células, este requerimiento de tamaño está en el orden de 200 nm o menor (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998), aunque pueden también acomodarse partículas más grandes (Demeneix et al. en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., editores), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, páginas 146-151; Kabanov et al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998).
La habilidad de los polímeros 1-3 para comprimir ADN plasmídico en estructuras con tamaño de nanómetros se determinó por dispersión de rayo láser casi elástico (QELS), y las cargas superficiales relativas de los complejos obtenidos se cuantificaron con medidas de potencial 1. Las partículas de ADN/polímeros usadas para calcular el tamaño de las partículas y las medidas de potencial \xi se formaron como se describió anteriormente para las pruebas de electroforesis en el gel de agarosa y se diluyeron en tampón de HEPES 20 mM (pH = 7,0) para el análisis como se describió en la sección experimental.
El polímero 1 formó complejos con diámetros en el intervalo de 90-150 nm a relaciones ADN/polímero por encima de 1:2 (p/p), y el polímero 2 condensó el ADN en partículas de tamaño de 60-125 nm a relaciones ADN/polímero por encima de 1:10. Estos resultados son consistentes con los datos obtenidos en los experimentos de electroforesis anteriores en el gel de agarosa. Sin embargo, las partículas en estos experimentos se agregaron durante un periodo de horas para producir grandes complejos de diámetros en el intervalo de 1-2 micras. La tendencia de estas partículas para agregarse puede racionalizarse por los potenciales \xi bajos de las partículas ADN/polímero observados en estas condiciones. Por ejemplo, los complejos formados con el polímero 1 en relaciones ADN/polímero por encima de 1:10 tuvieron potenciales \xi; medios de 4,51 (\pm0,50) mV. Los potenciales \xi de los complejos formados con el polímero 2 en relaciones ADN/polímero por encima de 1:20 fueron más bajos, alcanzando un valor límite de 1,04 (\pm0,57) mV. Estas diferencias se correlacionan con los valores pK_{a} estimados para estos polímeros, ya que se esperaría que las superficies de las partículas formadas con el polímero 1 estuvieran ligeramente más protonadas que las partículas formadas con el polímero 2 a pH = 7,0.
El polímero 3 formó complejos con diámetros en el intervalo de 50-150 nm en relaciones ADN/polímero por encima de 1:2. La figura 4 muestra, como ejemplo representativo, el diámetro eficaz medio de las partículas formadas con el polímero 3 en función de la concentración del polímero. Los diámetros de las partículas variaron dentro del intervalo anterior de experimento a experimento en condiciones por lo demás idénticas, posiblemente debido a diferencias sutiles durante la agitación o adición de las soluciones de ADN durante la formación de los complejos. (El orden de adición del polímero y las soluciones de ADN tuvo un impacto considerable en la naturaleza de los complejos ADN/polímeros. Para formar partículas pequeñas, por ejemplo, fue necesario añadir la solución de ADN a una solución de polímero agitado con vórtex. En los casos en que se añadieron las soluciones de polímeros al ADN, solo se observaron agregados grandes de tamaño micra. Así, es posible que diferencias sutiles en la agitación o ritmo de adición pudieran ser responsables de la variación en el tamaño de la partícula). Los potenciales \xi de los complejos formados con el polímero 3 fueron del orden de +10 a +15 mV en relaciones ADN/polímero por encima de 1:1, y los complejos no se agregaron mucho durante un periodo de 18 horas (pH = 7, 25ºC). Los potenciales \xi positivos de estos complejos pueden ser significativos más allá del contexto de estabilidad de la partícula, ya que cargas positivas netas en las superficies de las partículas podrían jugar un papel en precipitar la endocitosis (Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et al., en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., editores), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, páginas 146-151; Kabanov et al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998).
Las partículas formadas con el polímero 3 fueron también relativamente estables a 37ºC. Por ejemplo, se incubó una muestra de ADN/3 (ADN/3 = 1:5, diámetro medio = 83 nm) a 37ºC durante 4 horas. Después de 4 horas, se observó una distribución bimodal que consistía en una fracción de 78 nm de media (>98% en número, 70% en volumen) y una fracción de agregados mayores con diámetros medios de aproximadamente 2,6 micras. Estos resultados sugieren que la degradación de complejos formados por el polímero 3 ocurrió más lentamente que la degradación del polímero en solución, o que la degradación parcial no afectó significativamente la estabilidad de las partículas. La aparentemente mayor estabilidad de los complejos ADN/polímero formados por policaciones degradables en relación a la degradación de los polímeros en solución se ha observado también en complejos ADN/polímero formados con poliéster de 4-hidroxi-L-prolina) (Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999).
Los datos de tamaño de partícula y potencial \xi de las figuras 4 y 5 son consistentes con los modelos de condensación de ADN observados con otras policaciones (Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). A concentraciones de polímero muy bajas el ADN se compacta como partículas pequeñas negativamente cargadas y los tamaños de partícula aumentan con concentraciones de polímero mayores. (Datos de dispersión de luz exactos no pudieron obtenerse para el ADN solo o para las especies asociadas con ADN/polímero a relaciones de ADN/polímero menores de 1:0,5, puesto que el ADN flexible, no condensado no dispersa la luz tan extensivamente como el ADN compactado (Kabanov et al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clínical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998). Los complejos alcanzan un diámetro máximo a medida que se consigue la neutralización de la carga y ocurre la agregación. El tamaño de partícula disminuye rápidamente a relaciones ADN/polímero por encima de la neutralización de las cargas hasta las relaciones en las que más polímero no contribuye a una reducción en el diámetro de la partícula. Este modelo se confirma con medidas de potencial \xi realizadas en complejos formados con estos polímeros. Como se muestra en la figura 5, los potenciales \xi de las partículas polímero/ADN formadas con el polímero 3 fueron negativos a concentraciones bajas del polímero y se consiguió la neutralización de la carga cerca de relaciones de ADN/polímero de 1:0,75, lo que resultó en una agregación grande. Los potenciales \xi de las partículas alcanzaron un valor límite en el intervalo de +10 a +15 mV a relaciones ADN/polímero por encima
de 1:2.
Los diámetros medios de los complejos descritos anteriormente están dentro de los requerimientos de tamaño generales para la endocitosis celular. Hemos iniciado experimentos de transfección empleando la línea celular NIH 3T3 y el gen reportero de la luciferasa (pCMV-Luc). Hasta ahora, los polímeros 1 y 2 no han mostrado actividad de transfección en pruebas de cribado iniciales. Por contraste, el polímero 3 ha demostrado eficiencias de transfección mayores que las de PEI en ciertas condiciones. Se realizaron los experimentos de transfección según el protocolo general siguiente: se cultivaron las células en placas de 6 pocillos con una densidad inicial de semilla de 100.000 células/pocillo en 2 ml de medio de crecimiento. Se cultivaron las células durante 24 horas después de lo cual se eliminó el medio de cultivo y se reemplazó con 2 ml de medio libre de suero. Se formaron complejos ADN/polímero como se describió en la sección experimental (2 \mug de ADN, ADN/3 = 1:2 (p/p), 100 \mul en MES (pH = 6,0) y se añadieron a cada pocillo. Los complejos ADN/PEI se formaron en una relación de peso de 1:0,75, una relación que generalmente se ha encontrado en nuestro laboratorio que es óptima para las transfecciones de PEI. Se realizaron las transfecciones en medio libre de suero durante 4 horas, después de lo cual el medio se reemplazó con medio de cultivo durante 20 horas adicionales. Se determinaron las eficiencias relativas de transfección usando kits de luciferasa (Promega) y kits de ensayo de proteínas celulares (Pierce). Los resultados se expresan como unidades luminosas relativas (RLU) por mg de proteína celular total; para los complejos de polímero 3, 1,07 (\pm0,43) x 10^{6} RLU/mg; para los complejos de PEI, 8,07 (\pm0,16) x 10^{5} RLU/mg). No se detectó la expresión de luciferasa en los experimentos de control empleando ADN desnudo o realizados en la ausencia de ADN. Estos datos de transfección son los resultados de experimentos de cribado iniciales. Estos datos sugieren que IDs polímeros de esta estructura general son prometedores como vectores sintéticos para la dispensación de genes y son candidatos interesantes de estudios adicionales. La eficacia relativa del polímero 3 en relación con PEI es interesante, ya que nuestros experimentos de cribado iniciales se realizaron sin la cloroquina y el polímero 3 no incorpora actualmente ninguna forma obvia de facilitar la fuga endosomal. Debería apreciarse, sin embargo, que los valores de pK_{a} de las aminas en estos polímeros pueden ser "afinados" para que estén mas directamente dentro del intervalo de pH fisológicamente relevante usando esta aproximación sintética modular. Por lo tanto, será posible estructurar adicionalmente el carácter de "esponja protónica" de estos polímeros, (Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et al., en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., editores), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, páginas 146-151; Kabanov et al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998) y así aumentar su eficacia de transfección, directamente por medio de la incorporación o copolimerización con monómeros de diaminas diferentes.
Compendio
Se describe una estrategia general para la preparación de nuevos vectores de transfección de ADN poliméricos degradables. Se sintetizaron poli(ésteres de \beta-amino) 1-3 via la adición de conjugados de N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina, y 4,4'-trimetilendipiperidina a diacrilato de 1,4-butanodiol. Las aminas en los monómeros de bis(amina secundaria) participan activamente en los procesos de formación de enlaces durante la polimerización, eliminando la necesidad de procesos de protección/desprotección de aminas que caracterizan la síntesis de otros poli(ésteres de amino). De esta forma, esta aproximación permite la generación de una variedad de poliésteres estructuralmente diversos que contienen aminas terciarias en sus esqueletos en una sola etapa a partir de materiales de partida comercializados. Los polímeros 1-3 se degradaron de forma hidrolítica en medios ácidos y alcalinos para dar 1,4- butanodiol y aminoácidos \beta 4a-6a y se investigó la cinética de las degradaciones a pH 5,1 y 7,4. Los polímeros se degradaron más rápidamente a pH 7,4 que a pH 5,1, lo que es consistente con los perfiles de pH/degradación descritos para otros poli(ésteres de amino). Una prueba inicial de cribado diseñada para determinar los efectos de los polímeros 1-3 en el crecimiento celular y metabolismo sugirió que estos polímeros y sus productos de degradación hidrolítica no eran citotóxicos comparados con PEI, un polímero catiónico no degradable empleado convencionalmente como vector de transfección.
Los polímeros 1-3 interaccionaron electrostáticamente con ADN plasmídico a pH fisiológico, iniciando procesos de autoensamblaje que produjeron complejos ADN/polímero en la escala de nanómetros. Se usaron las mediciones de electroforesis en gel de agarosa, dispersión de rayo láser casi elástico (QELS) y potencial zeta para determinar la extensión de las interacciones entre los polielectrolitos cargados de forma opuesta. Se encontró que los tres polímeros condensaban el ADN a partículas ADN/polímero solubles del orden de 50-200 nm. Las partículas formadas por los polímeros 1 y 2 se agregaron mucho, mientras que las partículas formada por el polímero 3 mostraron potenciales \xi positivos (esto es, +10 a +15 mV) y no se agregaron durante un máximo de 18 horas. Las dimensiones tamaño nanómetros y toxicidades reducidas de estos complejos de ADN/polímero sugieren que los polímeros 1-3 puedan ser útiles como vectores de transfección de genes poliméricos degradables. Un conocimiento completo de las relaciones estructura/actividad existentes en esta clase de polímeros facilitaría el diseño de alternativas basadas en polímeros más seguros que los vectores virales de transfección de la terapia génica.
Ejemplo 2 Liberación rápida inducida por el pH de microesferas biodegradables de poli(éster de \beta-amina) en el intervalo de pH intracelular Sección experimental
Fabricación de microesferas. El procedimiento optimizado para la fabricación de microesteras se realizó de la forma generalizada siguiente: se suspendió una solución acuosa de dextrano conjugado con rodamina (200 \mul de una solución de 10 \mug/\mul, M_{n} \approx 70 kD) en una solución de poli-1 en CH_{2}Cl_{2} (200 mg de poli-1 en 4 ml de CH_{2}Cl_{2}, M_{n} \approx 10 kD), y se sonicó la mezcla durante 10 segundos para formar una emulsión primaria. Se añadió la emulsión rosa opaca directamente a una solución de poli(alcohol vinílico) homogeneizada rápidamente (5.000 rpm) [50 ml, PVA al 1% (p/p)] para formar la emulsión secundaria. Se homogenizó la emulsión secundaria durante 30 segundos antes de añadirla a una segunda solución de PVA [100 ml, PVA al 0,5% (p/p)]. El análisis directo de la suspensión de microesferas usando un analizador de micropartículas de Coulter reveló un tamaño medio de partícula de aproximadamente 5 micrómetros. La emulsión secundaria se agitó durante 2,5 horas a temperatura ambiente, se transfirió a una nevera (4ºC), y se agitó durante 30 minutos adicionales. Se aislaron las microesferas a 4ºC por centrifugación, se resuspendieron en agua fría, y se centrifugaron de nuevo para eliminar el exceso de PVA. Se resuspendieron las esferas en agua (15 ml) y se liofilizaron para dar un polvo rosa ligero. La caracterización de las microesferas liofilizadas se realizó por microscopía óptica, de fluorescencia y de escaneo por electrones como se describió anteriormente. El potencial zeta se determinó usando un analizador Zeta PALS de Brookhaven Instruments.
Discusión
Las micropartículas formadas con polímeros biodegradables son atractivas para uso como aparatos de dispensación, y se han empleado una variedad de microesferas basadas en polímeros para la liberación sostenida de compuestos terapéuticos (Anderson Nature 392 (Suppl.): 25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2:144-147, 1996; Cristal Science 270:404-410, 1995; Mulligan Science 260:9'26-932, 1993; Luo et al. Nat. Biotechnol. 18:33-37,2000; Behr Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993). Sin embargo, para la terapia con moléculas pequeñas, terapia basada en proteínas y terapia basada en ADN que requieren la administración intracelular y el tráfico al citoplasma, hay una demanda en aumento de nuevos materiales que faciliten la liberación inducida como respuesta a estímulos medioambientales tales como el pH (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998). Después de la endocitosis, el pH en los compartimentos endosómicos celulares baja, y el material extraño se degrada por fusión con las vesículas lisosomales (Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995). Los nuevos materiales que liberan sus cargas moleculares con cambios de pH dentro del intervalo intracelular y facilitan la fuga de medios hostiles intracelulares podrían tener un impacto fundamental y de amplio alcance en la administración de fármacos lábiles hidrolíticamente y/o enzimáticamente (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; (Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995). Se describe aquí la fabricación de microesferas poliméricas sensibles al pH que liberan contenidos encapsulados cuantitativamente y esencialmente instantáneamente con los cambios de pH dentro del intervalo intracelular.
La síntesis del poli(éster de \beta-amino) 1 se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1 (Miller Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768-1785, 1998; Hope et al. Molecular Membrane Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh et al. New J. Chem. 21:113-124, 1997). El poli-1 es degradable hidrolíticamente, no fue citotóxico en las pruebas de criba iniciales, y se está investigando actualmente como un vector sintético para la dispensación de ADN en las aplicaciones de terapia génica. La solubilidad del polímero en medio acuoso está directamente influida por el pH de la solución. Específicamente, el polímero sólido, no protonado es insoluble en un medio acuoso en el intervalo de pH de 7,0 a 7,4, y la transición entre la solubilidad e insolubilidad ocurre a un pH alrededor de 6,5. Basado en las diferencias entre el pH extracelular y endosómico (7,4 y 5,0-6,5, respectivamente), establecimos la hipótesis que las microesferas formadas con el poli-1 podrían ser útiles en la encapsulación y liberación inducida de compuestos en el intervalo de pH
intracelular.
La encapsulación de compuestos terapéuticos en las microesferas poliméricas se consigue a menudo empleando un proceso de emulsión doble (O'Donnell et al. Adv. Drug Delivery Rev. 28:25-42, 1997). El proceso de emulsión doble está bien establecido en la fabricación de microesferas de polímeros hidrófobos tales como poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), un polímero biodegradable empleado convencionalmente en el desarrollo de aparatos de dispensación de fármacos (Anderson et al. Adv. Drug Delivery Rev. 28:5-24, 1997; Okada Adv. Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997). Los experimentos preliminares demostraron la viabilidad del proceso de emulsión doble en la encapsulación de compuestos solubles en agua usando el poli-1. Se escogió el dextrano conjugado con rodamina como modelo para la encapsulación subsiguiente y estudios de liberación por varias razones: 1) la rodamina es fluorescente, lo que permite determinar los perfiles de carga y liberación por espectroscopia de fluorescencia, 2) las microesferas cargadas pueden ser captadas directamente con espectroscopia de fluorescencia, y 3) la intensidad de fluorescencia de la rodamina no es relativamente afectada por el pH dentro del intervalo fisiológico (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6ª edición, Molecular Probes, Inc., 1996, p.29).
Se fabricaron microesferas que encapsulaban dextrano marcado con poli-1 y se compararon con controles formados con PLGA. Hubo una buena correlación entre la distribución de tamaño de las microesferas formadas con poli-1 y las distribuciones de las microesferas de PLGA dentro del intervalo de 5-30 \mum. Los tamaños medios de las partículas podrían controlarse con variaciones en los parámetros experimentales tales como la velocidad de homogeneización y las proporciones de disolventes acuosos/orgánicos (O'Donnell et al. Adv. Drug Delivery Rev. 28:25-42, 1997). En contraste con las microesferas de PLGA, sin embargo, las esferas formadas de poli-1 se agregaron mucho durante las etapas de centrifugación y lavado (véase la sección experimental anterior). Las microesferas resuspendidas a pH 7,4 consistían primariamente de agregados grandes, y las imágenes de microscopia de escaneo por electrones (SEM) revelaron grupos de esferas que parecían estar unidas físicamente o "soldadas" (no se muestran los
datos).
Se encontró que podía eliminarse la agregación si la centrifugación y el lavado se conducían a temperaturas bajas (4ºC), presumiblemente debido al endurecimiento de las esferas poliméricas a esta temperatura más baja. Las imágenes de SEM de microesferas de poli-1 cargadas de dextrano preparadas en el intervalo de 8-10 \mum mostraron una fracturación significativa y la formación de grandes agujeros en sus superficies. Las microesferas de tamaño dirigido al intervalo de 4-6 \mum, sin embargo, estaban esencialmente libres de rajas, agujeros y otros defectos (figura 6). Las microesferas formuladas para experimentos de liberación subsiguientes se fabricaron en el intervalo más pequeño (< 6 \mum). Las eficiencias de encapsulación de microesferas de poli-1 cargadas, determinadas disolviendo las esferas a pH 5,1 y midiendo la intensidad de la fluorescencia, fueron tan altas como 53%.
Las suspensiones de microesferas de poli-1 secas a pH = 7,4 consistían primariamente de microesferas únicas, aisladas como se determinó por microscopia óptica y de fluorescencia (figura 8a). El potencial zeta (\xi) de las suspensiones de micropartículas de microesferas de poli-1 a pH 7 fue +3,75 (\pm 0,62) mV, sugiriendo que las superficies de las microesferas llevan una carga total positiva a pH fisiológico. Esto podría ser relevante cuando se intente usar estas microesferas para la incorporación celular, ya que las cargas positivas netas en las superficies de las partículas pueden tener un papel en la inducción de la endocitosis (Zauner et al. Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113, 1998).
Las microesferas de poli-1 suspendidas a pH 7,4 permanecieron estables en cuanto a la agregación y degradación durante varias semanas (inspección visual), pero las microesferas se disolvieron instantáneamente cuando se disminuyó el pH del medio de suspensión entre 5,1 y 6,5.
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Se determinó cuantitativamente la liberación del dextrano marcado de las microesferas de poli-1 por microscopia de fluorescencia (figura 7). El perfil de liberación a pH 7,4 se caracterizó por una pequeña ráfaga inicial de fluorescencia (7-8%) que alcanzó un valor límite de alrededor de 15% después de 48 horas. Este experimento demostró que la degradación de poli-1 fue relativamente lenta en estas condiciones y que más del 90% del material encapsulado podía ser retenido en la matriz polimérica durante períodos de tiempo adecuadamente largos a pH fisiológico.
Para examinar la aplicación de las microesferas de poli-1 a la liberación inducida de fármacos encapsulados en el intervalo de pH endosornal, se realizó un experimento similar en el que el pH del medio de suspensión se cambió de 7,4 a 5,1 durante el curso del experimento. Como se muestra en la figura 7, las microesferas se disolvieron rápidamente cuando se cambió el tampón de suspensión con tampón de acetato (0,1 M, pH = 5,1), produciendo la liberación esencialmente instantánea y cuantitativa del dextrano marcado que quedaba en las matrices poliméricas. En marcado contraste, la liberación de las microesferas de PLGA cargadas de dextrano no aumentó durante las 24 horas posteriores después de que se disminuyera el pH del medio de suspensión (figura 7). La figura 8 muestra las imágenes de espectroscopia de fluorescencia de (a) una muestra de microesferas cargadas de dextrano a pH 7,4; y (b) una muestra a la que se añadió una gota del tampón de acetato en el borde superior derecho del cubreobjetos de microscopio. Se visualizó la rápida liberación del dextrano conjugado con rodamina como una raya que se extendía desde las microesferas disolviéndose en la dirección de la difusión del ácido añadido y un aumento en la fluorescencia total base (tiempo pasado 5 segundos).
Cuando se dirigen los compuestos terapéuticos para dispensación intracelular vía la endocitosis o fagocitosis, no es sólo importante considerar los medios por los que el fármaco puede ser liberado de su transportador, sino también los medios por los que el fármaco puede escapar de los compartimentos endosomales antes de ser enviado a las vesículas lisosomales (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Zauner et al. Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113,
1998).
Una estrategia para facilitar el escape endosomal es la incorporación de bases débiles, o "esponjas protónicas", que se cree tamponan el medio ácido en el endosoma y alteran las membranas endosomales aumentando la presión osmótica interna dentro de la vesícula (Demeneix et al., en Artificial Self-Asserrbling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., editores), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, páginas 146-151). Las microesferas de poli-1 son capaces de liberar el material encapsulado en el intervalo de pH endosomal vía un mecanismo (disolución) que envuelve la protonación de las aminas en la matriz polimérica. Así, además de la rápida liberación del fármaco, las microesferas de poli-1 pueden también proporcionar medios de escape endosomal por alteración de las membranas, aumentando la eficacia por medio de la prolongación de las vidas de los fármacos hidrolíticamente inestables contenidos en la matriz polimérica.
Las microesferas fabricadas con poli-1 podrían representar una importante adición al arsenal de materiales sensibles al pH aplicados a la dispensación intracelular de fármacos, tales como formulaciones de polímeros/liposomas sensibles al pH (Gerasimov et al. Adv. Drug Delivery Rev. 38:317-338, 1999; Linhait et al. Langmuir 16:122-127, 2000; Linhardt et al. Macromolecules 32:4457-4459, 1999). Al contrario de lo que sucede con muchas formulaciones de liposomas, las microesferas poliméricas son físicamente estables y pueden ser almacenadas secas durante largos periodos de tiempo sin deformación, descomposición o degradación (Okada Adv. Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997; incorporado aquí como referencia), una consideración importante en la formulación y empaquetado de nuevos sistemas de administración terapéuticos. Las microesferas investigadas en este estudio actual están dentro del intervalo de tamaño de partículas que se usan corrientemente para dirigir la dispensación a los macrófagos (Hanes et al. Adv. Drug Delivery Rev. 28:97-119, 1997). Los perfiles de liberación rápida por el pH de las microesferas de poli-1 descritos anteriormente pueden por lo tanto ser útiles en el diseño de nuevas vacunas basadas en ADN que actualmente emplean PLGA como material encapsulador (Singh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:811-816, 2000; Ando et al. J. Pharm. Sci. 88:126-130, 1999; Hedley et al. Nat. Med. 4:365-368, 1998).
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Ejemplo 3 Descubrimiento acelerado de vectores de transfección sintéticos: Síntesis paralelas y cribado de una biblioteca de polímeros degradables Introducción
La dispensación segura y eficiente de ADN terapéutico a las células representa un obstáculo fundamental para el éxito clínico de la terapia génica (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Anderson Nature 392 Suppl.:25-30, 1996; cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia). Los retos con que se enfrentan los vectores sintéticos de dispensación están particularmente claros, puesto que tanto los polímeros catiónicos como los liposomas son menos eficaces para mediar la transferencia de genes que los vectores virales. La incorporación de nuevos criterios de diseño ha conducido a avances recientes hacia sistemas de dispensación funcionales (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 123:2460-2461, 2001; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Hwang et al. Bioconjugate Chem. 12:280-290, 2001; Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999). Sin embargo, el paradigma para el desarrollo de vectores poliméricos de dispensación de genes sigue siendo la incorporación de estos elementos de diseño en materiales como parte de un proceso iterativo lineal, una aproximación eficaz, si bien lenta, para el descubrimiento de nuevos vectores. Aquí describimos una aproximación paralela adecuada para la síntesis de grandes bibliotecas de polímeros catiónicos degradables y de oligómeros catiónicos degradables y el descubrimiento de nuevas familias de vectores sintéticos por medio de ensayos de cribado rápidos basados en células (como publicación para la síntesis paralela y cribado de polímeros degradables para la ingeniería de tejidos, véase: Brocchini et al. J. Am. Chem. Soc. 119:4553-4554,
1997).
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Sección experimental
Consideraciones generales. Todas las manipulaciones que envolvían células vivas o materiales estériles se realizaron en una vitrina de flujo laminar usando técnicas estériles estándares. La cromatografía de permeabilidad de gel (GPC) se realizó usando una bomba de Hewlett Packard serie 1100 isocrática, un inyector de Rheodyne modelo 7125 con un bucle inyector de 100 \mul, y dos columnas PL-Gel mezcladas-D en serie (5 \mum, 300 x 7,5 mm, Polymer Laboratorios, Amherst, MA). Se usó THF/piperidina 0,1 M como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Los datos se recogieron usando un refractómetro interferométrico Optila b DSP (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) y se procesaron con el paquete de software TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y polidispersidades de los polímeros se describen en relación a estándares monodispersos de poliestireno.
Materiales. Se obtuvieron comercialmente los monómeros de aminas primarias y secundarias 1-20 de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Lancaster (Lancashire, UK), Alfa Aesar Organics (Ward Hill, MA), y Fluka (Milwaukee, WI). Los monómeros de diacrilato A-G se obtuvieron comercialmente de Polysciences, Inc. (Warrington, PA), Alfa Aesar y Scientific Polymer Products, Inc. (Ontario, NY). Todos los monómeros se obtuvieron con la mayor pureza posible (de 97% a más de 99%) y se usaron como se recibieron sin purificación adicional. El ADN plasmídico que contenía el gen reportero de luciferasa de la luciérnaga (pCMV-Luc) se obtuvo comercialmente de Elim. Biopharmaceuticals, Inc. (San Francisco, CA) y se usó sin purificación adicional. El bromuro de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolo (MTT) se obtuvo comercialmente de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Los fibroblastos de riñón de mono (células COS-7) usados en los ensayos de transfección se obtuvieron comercialmente de American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron a 37ºC, en 5% de CO_{2} en 90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco; 10% de suero bovino fetal; 100 unidades/ml de penicilina; 100 \mug/ml de estreptomicina. Los kits para la detección de la luciferasa usados en las pruebas de transfección de alto rendimiento se obtuvieron comercialmente de Tropix (Bedford, MA). Todos los demás materiales y disolventes se usaron como se recibieron sin purificación adicional.
Síntesis de la biblioteca de polímeros. Se condujeron todas las 140 reacciones de polimerización simultáneamente con un conjunto de viales etiquetados individualmente según el protocolo general siguiente. Las excepciones individuales se describen cuando es apropiado. Los monómeros de amina 1-20 (2,52 mmoles) se cargaron en los viales adecuadamente etiquetados (como se muestra a continuación): se midieron los monómeros líquidos y se transfirieron cuantitativamente usando pipetas de microlitro; los monómeros sólidos se pesaron directamente en cada vial. Se añadió CH_{2}Cl_{2} anhidro (1 ml) a cada vial. Se añadió un equivalente de diacrilatos líquidos A-F (2,52 mmoles) a cada vial de reacción adecuado usando una pipeta de microlitro, y se tapó el vial fuertemente con una tapa recubierta de Teflón. Se añadió un equivalente de diacrilato G semisólido a los viales adecuados como una solución en CH_{2}Cl_{2} (2,52 mmoles, 1 ml de una solución 2,52 M en CH_{2}Cl_{2}) y se taparon fuertemente los viales. Se añadió una alícuota adicional (2 ml) de CH_{2}Cl_{2} a los viales de reacción que contenían 19 y 20 para facilitar la solubilidad de estos monómeros. Los viales fuertemente tapados se colocaron en dos gradillas de tubos de ensayo de plástico y se ataron a un agitador orbital en un horno a 45ºC. (PRECAUCIÓN: el calentamiento de viales cerrados presenta un peligro posible de explosión. Se monitorizó periódicamente la temperatura del horno durante una semana antes del experimento para asegurar la estabilidad termal segura. Se encontró que las temperaturas variaban +/- 1ºC durante este periodo de tiempo. Se monitorizaron varios viales de prueba antes de conducir el experimento importante). Los viales de reacción se agitaron vigorosamente a 45ºC durante 5 días y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Se colocaron los viales en un secador grande y se colocaron bajo un aspirador a vacío durante 1 día y a alto vacío durante 5 días adicionales para asegurar la eliminación completa del disolvente. Se analizaron las muestras obtenidas por GPC (55% de la biblioteca total, véase la tabla 2) y se usaron directamente en todos los experimentos de cribado
subsiguientes.
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TABLA 2 Examen por GPC del 55% de la biblioteca de cribado que muestra pesos moleculares (P_{M}) y polidispersidades (mostradas en paréntesis)
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Determinación de la solubilidad en agua. Se determinó las solubilidades de todas las muestras simultáneamente a una concentración de 2 mg/ml de la forma general siguiente. Cada muestra de polímero (5 mg) se pesó en un vial de centelleo de 12 ml y se añadió 2,5 ml de tampón de acetato (25 mM, pH = 5,0) a cada muestra usando un aparato de pipetear. Se agitaron las muestras vigorosamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Para determinar la solubilidad se observó visualmente cada muestra.
Ensayo de la electroforesis en gel de agarosa. El ensayo de la electroforesis en gel de agarosa usada para determinar la habilidad de los polímeros para formar complejos con el ADN se realizó de la forma siguiente. Usando las soluciones preparadas en la prueba de solubilidad anterior (2 mg/ml en tampón de acetato, 25 mM, pH = 5,0), soluciones madres de los 70 polímeros solubles en agua se colocaron en una placa de cultivo de 96 pocillos. Se formaron los complejos AUN/polímero en una relación de 1:5 (p/p) transfiriendo 10 \mul de cada solución de polímero de la placa madre a una nueva placa usando un aparato de pipetear multicanal. Se diluyó cada polímero adicionalmente con 90 \mul de tampón de acetato (25 mM, pH = 5,0, volumen total 100 \mul) y se agitó la placa durante 30 segundos en un agitador mecánico. Se añadió a cada pocillo de la placa una solución acuosa de ADN plasmídico (100 \mul de una solución de 0,04 \mug/\mul) y se mezclaron vigorosamente las soluciones usando un aparato de pipetear multicanal y un agitador mecánico. Se formaron los complejos ADN/polímero en una relación de 1:20 (p/p) de la misma manera con las siguientes excepciones: se transfirieron 40 \mul de solución madre de polímero a una nueva placa y se diluyó con 60 \mul de tampón de acetato (volumen total 100 \mul) antes de añadir la solución acuosa de ADN (100 \mul). Se incubaron los complejos ADN/polímero a temperatura ambiente durante 30 minutos, después de lo cual se cargaron muestras de cada solución (15 \mul) en un gel de agarosa al 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 500 ng/ml de bromuro de etidio) usando un aparato de pipetear multicanal. NOTA: se cargaron las muestras en el gel con un tampón de cargar que consistía en Ficoll 400 al 10% (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en HEPES (25 mM, pH = 7,2). No se incluyó el azul de bromofenol como indicador visual en el tampón de carga, puesto que este tinte parecía interferir con la formación del complejo de polímero y ADN. Se cargaron las muestras según el patrón mostrado en la figura 9, de manera que las muestras que correspondían a una relación ADN/polímero de 1:5 y 1:20 se ensayaron en posiciones adyacentes del gel. Se mantuvo el gel a 90 V durante 30 minutos y se visualizaron las bandas de ADN manchando con bromuro de etidio.
Protocolo general para los ensayos de transfección de células. Se realizaron los ensayos de transfección en triplicado de la forma general siguiente. Se cultivaron células COS-7 en placas de 96 pocillos con una densidad inicial de semilla de 15.000 células/pocillo en 200 \mul de medio de crecimiento sin rojo de fenol (90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco; 10% de suero bovino fetal; 100 unidades/ml de penicilina; 100 \mug/ml de estreptomicina). Se cultivaron las células durante 24 horas en un incubador, después de lo cual se eliminó el medio de cultivo y se reemplazó con 200 \mul de medio de Optimem (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), suplementado con HEPES (concentración total = 25 mM). Se prepararon los complejos polímero/ADN con los 56 polímeros complejantes del ADN solubles en agua identificados previamente como se describió anteriormente a una proporción de 1:20 (p/p) usando un plásmido comercializado que contiene el gen reportero de luciferasa de la luciérnaga (pCMV-Luc). Se añadió un volumen apropiado de cada muestra a las células usando un aparato de pipetear multicanal (esto es, 15 \mul dieron 300 ng de ADN/pocillo; 30 \mul dieron 600 ng de ADN/pocillo). Se prepararon controles empleando poli(etilenimina) (PEI) y polilisina, preparados en relaciones de ADN/polímero de 1:1, de forma similar y se incluyeron con los controles con ADN y sin ADN. Se realizaron controles que empleaban Lipofectamina 2000 (Invitrogen Corp.) a varias concentraciones (0,1, 0,2, 0,4 y 0,6 \mul) como se describe en el manual técnico de este producto (http://lifetechnologies.com). Se incubaron las células durante 4 horas, después de lo cual se eliminó el medio de cultivo libre de suero y se reemplazó con 100 \mul de medio de cultivo sin rojo de fenol. Se incubaron las células durante un periodo de tiempo adicional (típicamente variaba de 36 a 60 horas) y se determinó a expresión de luciferasa usando un kit de ensayo comercializado (Tropix, Inc., Bedford, MA). Se cuantificó la fluorescencia en placas blancas de fondo sólido de polipropileno de 96 pocillos usando un lector de placa de bioluminiscencia de 96 pocillos. Se expresó la luminiscencia en unidades relativas de luz y no se normalizó a la proteína total de la célula en este ensayo.
Resultados y discusión
Los poli(ésteres de \beta-amino) son hidrolíticamente degradables, condensan el ADN plasmídico a pH fisiológico y son fácilmente sintetizados vía la adición del conjugado de aminas primarias o secundarias a los diacrilatos (Ecuación 1 y 2) (Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 2000). Un cribado inicial de polímeros modelo identificó estos materiales como vehículos de genes potenciales y demostró que las variaciones estructurales podrían tener un impacto significativo en la eficacia de unión al ADN y en la eficacia de transfección (Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 2000). Nosotros razonamos que esta aproximación proporcionaba un entramado atractivo para la elaboración de bibliotecas grandes de polímeros estructuralmente únicos por varias razones: 1) los monómeros de diamina y diacrilato son materiales de partida baratos comercializados, 2) la polimerización puede llevarse a cabo directamente en una etapa única de síntesis, y 3) las etapas de purificación son generalmente innecesarias puesto que no se generan productos secundarios durante la polimerización.
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La escasez de bis(aminas secundarias) comercializadas limita el grado de diversidad estructural que puede conseguirse usando la aproximación sintética anterior. Sin embargo, el conjunto de monómeros disponibles se expande significativamente cuando se considera a las aminas primarias como bloques de construcción potenciales de la biblioteca. Ya que la adición conjugada de aminas a los grupos acrilato es generalmente tolerante de funcionalidades tales como alcoholes, éteres, y aminas terciarias (Ferruti et al. Adv. Polym. Sci. 58:55-92, 1984), pensamos que la incorporación de monómeros de aminas primarias funcionalizadas a nuestra estrategia sintética serviría para ampliar la diversidad estructural. Los monómeros de diacrilato A-G y los monómeros de amina 1-20 se seleccionaron para la síntesis de una biblioteca de cribado inicial
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El tamaño de la biblioteca construida con este conjunto de monómeros (7 diacrilatos x 20 aminas = 140 polímeros estructuralmente únicos) se escogió por ser lo suficientemente grande para incorporar diversidad suficiente, sin embargo lo suficientemente pequeña para ser práctica sin la necesidad de automatización en nuestros estudios iniciales. No estaba claro al principio si un polímero tal como G16 (formado por los monómeros hidrófobos y estéricamente grandes G y 16) sería soluble en agua a pH fisiológico o sería capaz de suficiente condensación con el ADN. Sin embargo, se incorporaron deliberadamente monómeros de este tipo para explorar totalmente el espacio de diversidad, y anticipando que esta biblioteca podría últimamente ser útil como una población de cribado en el descubrimiento de materiales para aplicaciones distintas que la dispensación de genes (para un informe sobre la síntesis paralela y el cribado de polímeros degradables en la ingeniería de tejidos, véase: Brocchini et al. J. Am. Chem. Soc. 119:4553-4554, 1997, Lynn et al. Angew Chem. Int. Ed. 40:1707-1710, 2001).
Las reacciones de polimerización se condujeron simultáneamente con un conjunto de viales etiquetados individualmente. Se realizaron las reacciones en cloruro de metileno a 45ºC durante 5 días, y se aislaron los polímeros eliminando el disolvente para dar 600-800 mg de cada material. Las reacciones se realizaron a esta escala siempre que rindieran cantidades de material suficientes para análisis rutinario por GPC y todas los ensayos subsiguientes de unión al ADN, toxicidad, y de transfección. Un examen del 55% de la biblioteca por GPC indicó pesos moleculares en el intervalo de 2.000 a 50.000 (en relación a estándares de poliestireno). Puesto que no se requieren pesos moleculares elevados para la formación de complejos con ADN y para la transfección (como se muestra a continuación) (Kabanov et al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998), esta biblioteca proporcionó una colección de polímeros y oligómeros adecuados para las pruebas de cribado subsiguientes.
De los 140 miembros de la biblioteca de cribado, 70 muestras eran lo suficientemente solubles en agua (2 mg/ml, tampón de acetato 25 mM, pH = 5,0) para ser incluidos en un ensayo electroforético de unión a ADN (figura 9). Para realizar este ensayo tan rápida y eficientemente como fuera posible, se mezclaron las muestras con ADN plasmídico en relaciones de 1:5 y 1:20 (ADN/polímero, p/p) en placas de 96 pocillos y se cargaron en una lámina de gel de agarosa capaz de ensayar hasta 500 muestras usando un aparato pipeteador multicanal. Se ensayaron todas las 70 muestras de polímero solubles en agua simultáneamente a dos relaciones ADN/polímero diferentes en menos de 30 minutos. Como se muestra en la figura 9, 56 de las 70 muestras de polímero solubles en agua interaccionaron lo suficiente con ADN para ralentizar la migración a través del gel de la matriz (por ejemplo, A4 o A5), empleando la relación ADN/polímero 1:20 como criterio de exclusión. Catorce polímeros se eliminaron de consideraciones posteriores (por ejemplo, A7 y A8), ya que estos polímeros no complejaron el ADN lo suficientemente.
Los materiales de complejamiento del ADN identificados en el ensayo anterior se investigaron adicionalmente en ensayos de transfección usando ADN plasmídico y la línea celular COS-7. Todos los ensayos se realizaron simultáneamente con el gen reportero de luciferasa de la luciérnaga (pCMV-Luc) y se determinaron las concentraciones de la proteína expresada usando un kit de ensayo comercializado y un lector de placas de luminiscencia de 96 pocillos. La figura 10 muestra los datos generados en un ensayo empleando pCMV-Luc (600 ng/pocillo) con relaciones de ADN/polímero de 1:20 (p/p). La mayor parte de los polímeros cribados no medió la transfección por encima de un nivel típico de controles de ADN "desnudo" (sin polímero) en estas condiciones. Sin embargo, varios pocillos expresaron niveles más altos de proteínas y los polímeros correspondientes se identificaron como "cabezas de serie" en este ensayo. Los polímeros B14 (P_{m} = 3.180) y G5 (P_{m} = 9.170), por ejemplo, dieron niveles de transfección 4-8 veces más altos que los experimentos de control empleando poli(etilenimina) (PEI), un polímero usado convencionalmente como vector sintético de transfección (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995), y los niveles de transfección dentro de o mayores del intervalo de proteína expresada usando Lipofectamina 2000 (comercializada por Invitrogen Corp. (Carlbad, CA)), un sistema de vector de transfección comercializado muy usado basado en lípidos. Los polímeros A14, C5, G7, G10 y G12 fueron también identificados como "cabezas de serie" positivas en el experimento anterior, pero los niveles de expresión génica fueron más bajos que para B14 y G5.
Las diferencias estructurales entre polímeros sintéticos impiden típicamente un conjunto de condiciones de transfección óptimas. Por ejemplo, los polímeros C5, C14 y G14 fueron tóxicos a las concentraciones más altas empleadas anteriormente (toxicidad determinada por la ausencia de células en los pocillos fue contenían estos polímeros como se observó por inspección visual. Estos polímeros eran menos tóxicos y mediaron transfección a concentración más baja), pero mediaron la transfección a concentraciones de ADN y polímero más bajas (no se muestran los datos). El sistema de ensayo descrito anteriormente puede modificarse fácilmente para evaluar los polímeros en función a la concentración de ADN, relación de ADN/polímero, densidad celular de semilla, o tiempos de incubación. Se requerirán investigaciones adicionales para evaluar más completamente el potencial de esta biblioteca de cribado, y los experimentos para este fin se están realizando actualmente.
Los ensayos anteriores se realizaron en ausencia de la cloroquina, una base débil añadida corrientemente para aumentar la transfección in vitro (Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sic. USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999; Kabanov et al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998), y por lo tanto los resultados reflejan las habilidades intrínsicas de estos materiales para mediar la transfección. Los polímeros que contienen el monómero 14 son estructuralmente similares a otros polímeros de "esponja de protones" que contienen histidina (Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sic. USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999), y se podría aumentar la transfección tamponando los compartamentos ácidos intracelulares y mediando la fuga endosomal (Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sic. USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999; Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995). La eficacia de los polímeros que contienen el monómero 5 es sorprendente en este contexto, ya que estos materiales no incorporan una forma obvia de facilitar la fuga endosomal. Mientras que aún no se entiende la eficacia de estos últimos polímeros, su descubrimiento ayuda a validar nuestra aproximación paralela y remarca el valor de incorporar diversidad estructural, puesto que estos polímeros podrían no haber sido descubiertos en bases ad hoc. Los polímeros que incorporan los diacrilatos hidrófilos D y E no han producido "cabezas de serie" en ningunas condiciones hasta ahora, proporcionando una base posible para el desarrollo de bibliotecas más centradas útiles en la elucidación de las relaciones estructura/
actividad.
Hemos generado una biblioteca de 140 polímeros degradables y oligómeros degradables útil en el descubrimiento de nuevos materiales que complejan el ADN y de vectores de dispensación génica. Varios de estos materiales son capaces de condensar el ADN en estructuras lo bastante pequeñas para ser internalizadas por las células y liberar el ADN de forma activa transcripcionalmente. El tiempo total requerido actualmente para el diseño de la biblioteca, síntesis y pruebas de cribado iniciales es aproximadamente dos semanas. Sin embargo, la incorporación de la robótica y de monómeros adicionales podría acelerar significativamente el paso al que se identifican nuevos materiales complejantes del ADN y al que se identifican vectores competentes de transfección.
Ejemplo 4 Síntesis semiautomática y cribado de una biblioteca grande de polímeros catiónicos degradables para dispensación de penes
Una de las mayores barreras para el éxito de la terapia génica en la medicina clínica es la falta de métodos seguros y eficientes para la dispensación de ácidos nucleicos. Actualmente, la mayor parte de los ensayos clínicas usan virus modificados como vehículos de dispensación, que aunque son eficaces para transferir el ADN a las células, tienen toxicidad potencial seria y problemas de producción (Somia et al. Nat Rev Genet. 1:91 (2000)). Por el contrario, los sistemas no víricos frecen un número de ventajas potenciales, incluyendo la facilidad de producción, estabilidad, baja inmunogenicidad y toxicidad, y las limitaciones de tamaño reducido del vector (Ledley Human Gene Therapy 6:1129 (1995)). A pesar de estas ventajas, sin embargo, los sistemas de dispensación no víricos son mucho menos eficientes que los vectores virales (Luo et al. Nature Biotechnology 18:33 (2000)).
Un grupo prometedor de compuestos de dispensación no víricos son los polímeros catiónicos, que espontáneamente se unen a y condensan el ADN. Se ha caracterizado una amplia variedad de polímeros catiónicos que transfeccionan in vitro, tanto naturales como proteínas (Fominaya et al. Journal of Biological Chemistry 271:10560 (1996)) y sistemas de péptidos (Schwartz et al. Curr Opin Mol Ther. 2:162 (2000)), como polímeros sintéticos tales como poli(etilenimina) (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995)) y dendrímeros (Kabanov et al., Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: from Laboratory to Clínical Trial, Wiley, Chichester; Nueva York, 1998). Avances recientes en la dispensación polimérica de genes se han centrado en parte en hacer los polímeros más biodegradables para disminuir la toxicidad. Típicamente, estos polímeros contienen ambos grupos amino susceptibles de carga, lo que permite las interacciones iónicas con el esqueleto de fosfato cargado negativamente de los ácidos nucleicos, y una unión biodegradable tal como una unión éster hidrolizable. Varios ejemplos de éstos incluyen poli(alfa-(4-aminobutil)-L-ácido glicólico) (Lim et al. Journal of the American Chemical Society 122:6524 (2000)), la red de poli(éster de amino) (Lim et al. Bioconjugate Chemistry 13:952 (2002)), y poli(esteres de \beta-amino) (Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001)). Los poli(ésteres de \beta-amino) son particularmente interesantes ya que muestran poca toxicidad y son fácilmente sintetizados vía la adición del conjugado de una amina primaria o bis(amina secundaria) a un diacrilato (figura 11) (Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 122:10761 (2000); Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001)).
El desarrollo tradicional de polímeros biomédicos nuevos ha sido un procedimiento iterativo. Los polímeros se diseñaban típicamente de uno en uno y después se probaban individualmente para ver sus propiedades. Más recientemente, se ha centrado la atención en el desarrollo de aproximaciones paralelas, combinatorias, que facilitan la generación de bibliotecas estructuralmente diversas de biomateriales poliméricos (Brocchini Advanced Drug Delivery Reviews 53:123 (2001)). Esta aproximación combinatoria se ha aplicado también al descubrimiento de polímeros de dispensación de genes. Por ejemplo, Murphy et al. generaron una biblioteca combinatoria dirigida de 67 peptoides vía síntesis en fase sólida y la cribaron para identificar nuevos agentes de dispensación de genes (Murphy et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95:1517 (1998)).
En este ejemplo se describen nuevas herramientas para una síntesis paralela, combinatoria de alto rendimiento y un cribado basada en células de una gran biblioteca de 2.350 poli(ésteres de \beta-amino) estructuralmente diversos. Esta aproximación permite la criba de polímeros en ensayos basados en células sin que los polímeros abandonen nunca la fase de solución después de la síntesis. Esta aproximación combinada con el uso de sistemas robóticos de manejo de fluidos permite la generación y prueba de miles de polímeros sintéticos en ensayos basados en células en una cantidad de tiempo relativamente corta. Usando esta aproximación, se han identificado 46 polímeros nuevos que funcionan tan bien o mejor que los sistemas de dispensación no víricos tales como la poli(etilenimina).
Resultados y discusión
Síntesis de polímeros de alto rendimiento. Los factores primarios que limitan el rendimiento y automación de la síntesis de poli(ésteres de \beta-amino) y su ensayo son la viscosidad de las soluciones de monómeros y polímeros, y a dificultad de manipulación de los productos poliméricos sólidos. Mientras que la automación del manejo de líquidos es sencilla usando robótica convencional, la manipulación de sólidos y líquidos viscosos a pequeña escala no lo es. Por lo tanto, se desarrolló un sistema en el que podían sintetizarse y cribarse los polímeros en ensayos basadas en células sin que abandonaran la fase de solución. Puesto que esto requeriría la presencia de disolvente residual en las pruebas celulares, se escogió el disolvente relativamente no tóxico dimetilsulfóxido (DMSO). El DMSO es un disolvente usado corrientemente en cultivos celulares y se usa rutinariamente para el almacenaje de células congeladas. El DMSO es miscible con el agua y es generalmente bien tolerado en sistemas vivos.
La primera etapa para preparar la síntesis de alto rendimiento fue identificar las condiciones que permitieran la producción de los polímero:3 que todavía poseyeran una viscosidad manejable. Experimentos piloto a pequeña escala mostraron que la polimerización podía realizarse eficazmente a 1,6 M en DMSD a 56ºC durante 5 días. Basada en estos experimentos, se desarrolló una estrategia general para la síntesis y prueba de los polímeros. Se diluyeron todos los monómeros (figura 12) a 1,6 M en DMSO, y después usando ambos, un robot para el manejo de fluidos y una micropipeta de 12 canales, añadimos 150 microlitros de cada monómero de amina y diacrilato a un pozo profundo de una placa de polipropileno que después se selló con papel de aluminio. Se pusieron las placas en un agitador orbital y se incubaron a 56ºC durante 5 días. Para compensar la mayor viscosidad de las soluciones poliméricas, se añadió 1 ml de DMSO a cada pocillo de la placa, y se almacenaron entonces las placas a 4ºC hasta más uso. Estos métodos permiten 2.350 reacciones en un día. Además, la producción y almacenaje de los polímeros en un formato de 96 pocillos per-
mitió una transición fácil a un formato de 96 pocillos para la prueba de eficiencia de transfección basada en
células.
Ensayo de alto rendimiento de polímeros. Una vez sintetizados, se probaron todos los polímeros en cuanto a su habilidad para dispensar el plásmido que expresa la luciferasa, pCMV-luc en la línea celular COS-7 de fibroblastos renales de mono. Debido al gran tamaño de la biblioteca de polímeros, se desarrolló un método de alto rendimiento para el cribado de la eficiencia de la transfección basado en células. Puesto que los polímeros eran almacenados en placas de 96 pocillos, todas las diluciones de polímeros, complejamiento de ADN, y transfecciones celulares se realizaron en paralelo por transferencia directa de los polímeros de placa a placa usando un robot de manejo de líquidos. Se sintetizaron todos los polímeros usando la misma concentración de monómero de amina, así que la comparación entre polímeros en una relación monómero de amina:fosfato de ADN fija (relación N:P) fue sencilla. Mientras que los monómeros de amina contenían uno, dos, o tres aminas por monómero, los cribados amplios iniciales de las eficiencias de transfección se simplificaron enormemente manteniendo una concentración constante de monómero en todos los pocillos de una placa determinada, y por lo tanto un volumen constante de solución de polímero por reacción (véase métodos a continuación).
La eficiencia de la transfección in vitro usando polímeros catiónicos tales como la poli(etilenimina) es muy sensible a la relación de polímero a ADN presente durante la formación del complejo (Gebhart et al. Journal of Controlled Release 73:401 (2001)). Se seleccionaron relaciones de N:P de 10:1, 20:1, y 40:1 para nuestros cribados iniciales basado en experiencias anteriores con estos tipos de polímeros. Usando nuestro sistema de alto rendimiento, cribamos los 2.350 polímeros en estas tres proporciones. Se tabularon los valores de transfección con las mejores condiciones para cada polímero en un histograma (figura 13). Estos resultados se compararon con tres controles: ADN desnudo (sin agente de transfección), poli(etilenimina) (PEI), y Lipofectamina 2000. Las bajas concentraciones residuales de DMSO presentes en las soluciones de transfección no afectaron la eficiencia de transfección ni del ADN desnudo ni del PEI. Se encontró que 33 de los 2.350 polímeros eran tan buenos o mejores que el PEI en este sistema no
optimizado.
Puesto que las transfecciones de polímeros catiónicos tienden a ser sensibles a las relaciones polímero:ADN, decidimos optimizar las condiciones de transfección con los mejores polímeros de nuestro cribado preliminar. Usando los resultados anteriores como guía inicial, se optimizaron las condiciones de transfección para los 93 polímeros mejores probándoles a proporciones N:P por encima y por debajo de las condiciones de transfección óptimas identificadas en el cribado de base amplia. Para desarrollar un sistema de optimización de alto rendimiento, estos se probaron usando un sistema multiplicador de las proporciones N:P para simplificar el ensayo simultáneo y las transferencias placa a placa. Empezando con la mejor proporción N:P identificada en el cribado preliminar, se probaron de nuevo los polímeros en seis relaciones N:P iguales a las mejores relaciones de 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, y 1,75, en triplicado. Por ejemplo, si la relación óptima identificada en el cribado para un polímero dado era 20:1, entonces se cribó de nuevo el polímero en triplicado en relaciones N:P de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, y 35:1. En la figura 14 se muestran las medias con la desviación estándar de las eficiencias de transfección de las mejores condiciones para los 50 polímeros mejores, junto con los datos de los controles. En este experimento, se identificaron 46 polímeros que se transfecctaron tan bien o mejor que PEI. Todos estos 93 polímeros se probaron también en cuanto a su habilidad de unión con el ADN usando la electroforesis en gel de agarosa (figura 15). Interesantemente, mientras que casi todos los polímeros se unen al ADN como se esperaba, dos polímeros que transfectan a niveles altos no lo hacen: M17 y KK89
(figura 14).
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Para examinar adicionalmente las propiedades de transfección de estos polímeros, se probaron diez polímeros de transfección alta en cuanto a su habilidad para dispensación del plásmido de la proteína fluorescente verde, pCMV-eGFP. Al contrario que pCMV-luc, pCMV-eGFP proporciona información que concierne el porcentaje de células que se transfecta. Se observaron altos niveles de transfección para todos los 10 polímeros, y dos de los mejores se muestran en la figura 16.
Los "cabezas de serie" identificados en el ensayo anterior revelan una colección de polímeros sorprendentemente diversa e inesperada. Particularmente sorprendente es la gran colección de polímeros hidrófobos, basados en el monómero D. De hecho, los monómeros de diacrilato usados para hacer los 50 polímeros con mejores resultados son casi siempre hidrófobos. Análisis adicionales revelan dos características más comunes a los polímeros eficaces: 1) doce de los 26 polímeros que son mejores que el reactivo convencional mejor, Lipofectamina 2000, tienen grupos laterales de mono- y di-alcohol, y 2) las bis(aminas secundarias) lineales son también prevalentes en las estructuras cabeza de serie. También fue sorprendente la identificación de dos polímeros que transfectan a altos niveles pero no parecen unirse al ADN (KK89 y M17). Ambos son también insolubles a pH 5 y pH 7. Su habilidad para facilitar la incorporación de ADN puede ser debida a la permeabilización de la membrana celular.
También es importante en la función de los polímeros de dispensación de genes la longitud (Remy et al. Advanced Drug Delivery Reviews 30:85 (1998); Schaffer et al. Biotechnol Bioeng 67:598 (2000)). Usando estos resultados como base, puede prepararse un intervalo de longitudes de polímeros para cada polímero diana cambiando cuidadosamente las concentraciones relativas de los monómeros. La evidencia muestra que (1) como con PEI, la longitud de poli(éster beta-amino) es importante en la habilidad de dispensación de genes de estos polímeros, y (2) que los cabezas de serie identificados aquí pueden sintetizarse de nuevo usando métodos convencionales y seguir dispensando el ADN eficazmente.
Protocolos experimentales
Síntesis de polímeros. Se obtuvieron los monómeros de Aldrich (Milwaukee, WI), TCI (Portland, OR), Pfaltz & Bauer (Waterbury, CT), Matrix Scientific (Columbia, SC), Acros-Fisher (Pittsburg, PA), Scientific Polymer (Ontario, NY), Polysciences (Warrington, PA), y Dajac monomer-polymer (Feasterville, PA). Estos se disolvieron en DMSO (Aldrich) hasta una concentración final de 1,6 M. Se añadieron todas las combinaciones por pares posibles de monómeros de amina y diacrilato en alícuotas de 150 \mul a cada pocillo de placas de 96 pocillos de pocillos profundos de 2 ml de bloques maestros de polipropileno (Griener America, Longwood, FL). Se sellaron las placas con papel de aluminio, y se incubaron a 56ºC mientras que giraban en un agitador orbital. Después de 5 días, se añadió 1 ml de DMSO a cada pocillo y se sellaron de nuevo las placas y se almacenaron congeladas a 4ºC hasta su uso.
Experimentos de transfección. Se sembraron 14.000 células cos-7 (ATCC, Manassas, VA) en cada pocillo de una placa blanca sólida de 96 pocillos (Corning-Costar, Kennebunk, ME) y se dejó que se asentaran durante la noche en medio de crecimiento, compuesto de; 500 ml de fenol rojo menos DMEM, 50 ml de suero fetal bovino inactivado por el calor, 5 ml de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se llenó cada pocillo de una placa de bloques maestros de 96 pocillos con 1 ml de acetato sódico 25 mM pH 5. A esto se añadió 40 \mul, 20 \mul o 10 \mul de la solución polímero/DMSO. Se añadió 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul de ADN pCMV-luc a 60 \mug/ml (Promega, Madison, WI) o pEGFP-NI (Invitrogen) en una place de 96 pocillos de mitad de volumen. Se incubaron estos durante 10 minutos, y a continuación se añadieron 30 \mul de la solución polímero-ADN a 200 \mul de Optimem con bicarbonato sódico (Invitrogen) en placas de 96 pocillos de poliestireno. Se eliminó el medio de las células usando una varilla de 12 canales (V & P Scientific, San Diego, CA) después de lo cual se añadió inmediatamente 150 \mul de la solución optimem-polímero-ADN. Se incubaron los complejos con las células durante 1 hora y después se eliminaron usando la varilla de 12 canales y se reemplazaron con 105 \mul de medio de cultivo. Se dejó a las células crecer durante tres días a 37ºC, CO_{2} al 5% y después se analizó por la luminiscencia (pCMV-luc) o fluorescencia (pEGFP-N1). Se realizaron los experimentos de control como se describió anteriormente, pero usando poli(etilenimina) Pm 25.000 (Aldrich) como reemplazamiento del polímero sintetizado, y a relaciones en peso de polímero:ADN de 0,5:1, 0,75:1, 1:1, 1,25:1, 1,5:1, y 2:1. Las transfecciones de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) se realizaron como se describe por el vendedor, excepto que se eliminaron los complejos después de 1 hora.
Se analizó la luminiscencia usando kits de ensayo de bright-glo (Promega). Brevemente, se añadieron 100 \mul de solución de bright-glo a cada pocillo de la placa de microtítulo que contenía el medio y las células. Se midió la luminiscencia usando un Luminómetro de Mithras (Berthold, Oak Ridge, TN). En algunos casos se usó un filtro de densidad neutral (Chroma, Brattleboro, VT) para prevenir la saturación del luminómetro. Se generó una curva estándar para la Luciferasa por titración del enzima de Luciferasa (Promega) en medio de crecimiento en placas blancas de microtítulo. Se examinó la expresión de eGFP usando un microscopio invertido Zeiss Aciovert.
Se realizaron las pruebas de electroforesis en gel de agarosa-unión al ADN a una proporción N:P 40:1, como se ha descrito previamente (Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001)). Todo el manejo de los líquidos se realizó usando un robot EDR384S/96S (Labcyte, Union City, CA) o un micropipeteador de 12 canales (Termo Labsystems, Vantaa, Finland) en una vitrina de flujo laminar.
Ejemplo 5 Síntesis de poli(ésteres de beta-amino) optimizados para una dispensación de penes muy eficaz
Se determinó el efecto del peso molecular, relación polímero/ADN, y grupo final de la cadena en las propiedades de transfección de dos estructuras únicas de poli(ésteres de beta-amino). Estos factores pueden tener un efecto dramático en la función de dispensación de genes. Usando métodos de cribado de alto rendimiento, se han descubierto ésteres de poli(beta-amino) que transfectan mejor que PEI y Lipofectamina 2000 (dos de los mejores agentes de transfección comercializados).
Métodos y materiales
Síntesis de polímeros. Se sintetizaron los polímeros Poli-1 y Poli-2 añadiendo diacrilato de 1,4-butanodiol (+99%) y diacrilato de 1,6-hexanodiol (99%), respectivamente, a 1-aminobutanol (98%). Estos monómeros se obtuvieron de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Se generaron doce versiones de cada uno de Poli-1 y Poli-2 variando la relación estequiométrica de amina/diacrilato. Para sintetizar cada uno de los 24 polímeros únicos, se pesaron 400 mg de 1-aminobutanol en un vial de muestra de 8 ml con un tapón de rosca recubierto de Teflón. A continuación, se añadió la cantidad adecuada de diacrilato al vial para dar una relación estequiométrica entre 1,4 y 0,6. Se puso entonces una pequeña barra de agitación magnética recubierta de Teflón en cada vial. Los viales se taparon fuertemente y se colocaron en una placa magnética de multiposición que estaba en un horno mantenido a 100ºC. Después de un tiempo de reacción de 5 horas, se sacaron los viales del horno y se almacenaron a 4ºC. Se analizaron todos los polímeros por GPC.
Cromatografía por permeabilidad en gel (GPC). Se realizó GPC usando una bomba de Hewlett Packard serie 1100 isocrática, un inyector de Rheodyne modelo 7125 con un bucle inyector de 100 \mul, y una columna de Phenogel MXL (5 \mum mezclada, 300 x 7,5 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Se usó 70% de THF/30% de DMSO (v/v) + piperidina 0,1 M como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Los datos se recogieron usando un refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) y se procesaron con el paquete de software TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y polidispersidades de los polímeros se determinaron en relación a estándares monodispersos de poliestireno.
Ensayos de transfección de la luciferasa. Se sembraron células COS-7 (ATCC, Manassas, VA) (14.000 células/pocillo) en cada pocillo de una placa blanca opaca de 96 pocillos (Corning-Costar, Kennebunk, ME) y se dejó que se agarraran durante la noche en medio de crecimiento. El medio de crecimiento estaba compuesto de 90% de DMEM sin rojo fenol, 10% de suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para facilitar el manejo, se prepararon soluciones madre de polímero (100 mg/ml) en disolvente DMSO. Una pequeña cantidad residual de DMSO en la mezcla de transfección no afecta la eficiencia de transfección y no produce ninguna citotoxicidad observable. Se prepararon diluciones de trabajo de cada polímero (en concentraciones necesarias para dar las distintas proporciones en peso polímero/ADN) en tampón de acetato sódico 25 mM (pH 5). Se añadió 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul de ADN pCMV-Luc a 60 \mug/ml (Elim. Biopharmaceuticals, South San Francisco, CA) en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Se incubaron las mezclas durante 10 minutos para permitir la formación del complejo, y a continuación se añadieron 30 \mul de cada una de las soluciones polímero-ADN a 200 \mul de Opti-MEM con bicarbonato sódico (Invitrogen) en placas de 96 pocillos de poliestireno. Se eliminó el medio de las células usando una varilla de aspiración de 12 canales (V & P Scientific, San Diego, CA) después de lo cual se añadió inmediatamente 150 \mul de la solución opti-MEM-polímero-ADN. Se incubaron los complejos con las células durante 1 hora y después se eliminaron usando la varilla de 12 canales y se reemplazaron con 105 \mul de medio de cultivo. Se dejó a las células crecer durante tres días a 37ºC, CO_{2} al 5% y después se analizó en cuanto a la expresión de la luciferasa. Se realizaron también experimentos de control con PEI (Pm 25.000, Sigma-Aldrich) y Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Las transfecciones de PEI se realizaron como se describió anteriormente pero usando relaciones en peso polímero/ADN de 1:1. Las transfecciones de Lipofectamina 2000 se realizaron como se describe por el vendedor, excepto que se eliminaron los complejos después de 1 hora.
Se analizó la expresión de luciferasa usando kits de ensayo de Bright-Glo (Promega). Brevemente, se añadieron 100 \mul de solución de Bright-Glo a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenía el medio y las células. Se midió la luminiscencia usando un luminómetro de Mithras (Berthold, Oak Ridge, TN). Se usó un filtro de densidad neutral al 1% (Chroma, Brattleboro, VT) para prevenir la saturación del luminómetro. Se generó una curva estándar para la Luciferasa por valoración de la enzima de Luciferasa (Promega) en medio de cultivo en placas blancas opacas de 96 pocillos.
Medida de la citotoxicidad. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron de la misma manera que los experimentos de transfección de luciferasa con la siguiente excepción. En vez de ensayar la expresión de la luciferasa después de 3 días, se ensayaron las células en cuanto a su actividad metabólica usando el kit de ensayo de MTT de proliferación celular (ATCC) después de 1 día. Se añadieron 10 \mul de reactivo de MTT a cada pocillo. Después de 2 horas de incubación a 37ºC, se añadieron 100 \mul de reactivo detergente a cada pocillo. Se dejó entonces la placa en la habitación sin luz a temperatura ambiente durante 4 horas. Se midió la absorbancia óptica a 570 nm usando un lector de microplaca SpectaMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se convirtió en % de viabilidad en relación con las células de control (no tratadas).
Experimentos de captación celular. Se realizaron los experimentos de captación como se describió anteriormente con la excepción que se usó un formato de placa de 12 pocillos en lugar de un formato de placa de 6 pocillos (Akinc, A., et al. Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc., 2003). Se sembraron las células COS-7 a una concentración de 1,5 x 10^{5} células/pocillo y se cultivaron durante 24 horas antes de realizar los experimentos de captación. Se realizó la preparación de los complejos polímero/ADN de la misma manera que en los experimentos de transfección de la luciferasa, la única diferencia fue un aumento en la escala (2,5 \mug de ADN por pocillo en la placa de 12 pocillos en lugar de 600 ng de ADN por pocillo en la placa de 96 pocillos) y el uso de un plásmido marcado con Cy5 en lugar de pCMV-Luc (Akinc, A. y R. Langer, Measuring the pH environment of DNA delivered using nonviral vectors: Implications for lysosomal trafficking. Biotechnol. Bioeng., 2002. 78(5): páginas 503-8). Se incubaron los complejos con las células durante 1 hora como en los experimentos de transfección para permitir la captación celular por endocitosis. Se cuantificó el nivel relativo de captación celular usando un citómetro de flujo para medir la fluorescencia de las células cargadas con el plásmido marcado con Cy5.
Transfecciones de GFP. Se llevaron a cabo las transfecciones de GFP en las líneas celulares COS-7 (riñón de mono verde), NIH 3T3 (fibroblastos murinos), HepG2 (hepatocarcinoma humano), y CHO (ovario del hamster chino). Se obtuvieron todas las líneas celulares de ATCC (Manassas, VA) y se mantuvieron en DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 10D \mug/ml de estreptomicina a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2}. Se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta aproximadamente 80-90% de confluencia antes de realizar los experimentos de transfección. Se prepararon los complejos polímero/ADN como se describió anteriormente usando el plásmido pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) (5 \mug/pocillo). Se diluyeron los complejos en 1 ml de Opti-MEM y se añadieron a los pocillos durante 1 hora. Se eliminaron entonces los complejos y se añadió medio de cultivo nuevo a los pocillos. Después de 2 días, se recogieron las células y se analizaron en cuanto a expresión de GFP por citometría de flujo. Se usó la mancha de yoduro de propidio para excluir las células muertas del
análisis.
Citometría de flujo. La citometría de flujo se realizó con un FACSCalibur (Becton Dickinson) equipado con un láser de ión de argón capaz de excitar GFP (excitación a 488 nm) y un láser de diodo rojo capaz de excitar Cy5 (excitación a 635 nm). La emisión de GFP se filtró usando un filtro de paso de banda de 530 nm y la emisión de Cy5 se filtró usando un filtro de paso largo de 650. Las células fueron adecuadamente dirigidas por medio de dispersión hacia delante y lateral y se recogieron 30.000 eventos por muestra.
Resultados y discusión
Síntesis de polímeros. Como se ha descrito anteriormente (Lynn, D.M. y R. Langer, Degradable poly(\beta-amino esters): síntesis, characterization and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc., 2000. 122(44): páginas 10761-10768), la síntesis de los ésteres poli(\beta-amino) procede vía la adición del conjugado de aminas a grupos acrilatos. Puesto que la reacción es una polimerización de paso a paso, se obtiene una distribución estadística amplia de longitudes de cadena, los pesos moleculares medios y los grupos finales de cadena están controlados por la estequiometría de los monómeros (Flory, P., en Principies of Polymer Chemistry. 1953, Cornell University Press: Ithaca, NY. páginas 40-46, 318-323; Odian, G., Step Polymerization, en Principies of Polymerization. 1991, John Wiley & Sons, Inc.: Nueva York. páginas 73-89). El peso molecular aumenta a medida que la proporción de monómeros alcance la equivalencia estequiométrica, y un exceso de monómero de amina o monómero de diacrilato produce cadenas acabadas en amina o acrilato, respectivamente. En esta clase de polímeros, un control preciso de la estequiometría es esencial para controlar el peso molecular del polímero. Mientras que la estequiometría de los monómeros es el factor más importante que afecta la longitud de la cadena, debería también considerarse las reacciones laterales competidoras que pueden impactar el peso molecular y la estructura de los productos poliméricos. En particular, las reacciones de ciclación intramoleculares, donde una amina en un extremo de la cadena polimérica que está creciendo reacciona con un acrilato en el otro extremo, pueden limitar los pesos moleculares obtenidos (Odian, G., Step Polymerization, en Principies of Polymerization. 1991, John Wiley & Sons, Inc.: Nueva York. páginas 73-89). Estas cadenas cíclicas pueden también tener propiedades que son diferentes a las de sus congéneres lineales.
En este trabajo, hemos modificado el procedimiento de polimerización descrito anteriormente para controlar mejor la estequiometría de los monómeros y minimizar las reacciones de ciclación. Primero, se aumentó la escala de la síntesis de aproximadamente 0,5 g a 1 g para permitir el control de la estequiometría en un 1%. Mejoras adicionales de la exactitud están limitadas por la pureza (98.-99%) de los monómeros comercializados usados. Segundo, se pesaron todos los monómeros en los viales en lugar de ser dispensados volumétricamente. Se encontró que las discrepancias entre las densidades de monómeros actuales y las descritas no eran negligibles en algunos casos conduciendo a inexactitudes de la masa dispensada. Tercero, se realizaron las polimerizaciones en ausencia de disolvente para maximizar la concentración de los monómeros, favoreciendo así la reacción de adición intermolecular sobre la reacción de ciclación intramolecular. Eliminar el disolvente proporciona también los beneficios añadidos de aumentar la velocidad de reacción y obviar la etapa de eliminación del disolvente. Finalmente, puesto que no se usó el disolvente fe cloruro de metileno previamente usado, la temperatura de la reacción pudo aumentarse de 45ºC a 100ºC. El aumentar la temperatura produjo una mayor velocidad de la reacción y una disminución de la viscosidad de la mezcla reaccionante, ayudando a compensar la mayor viscosidad del sistema libre de disolvente. El efecto combinado de aumentar la concentración de los monómeros y la temperatura de la reacción produjo una disminución del tiempo de reacción de aproximadamente 5 días a 5 horas.
Sintetizamos los polímeros Poli-1 y Poli-2 añadiendo diacrilato de 1,4- butanodiol y diacrilato de 1,6-hexanodiol, respectivamente, a 1-aminobutanol. Se sintetizaron doce versiones únicas de cada polímero variando las relaciones molares de amina/diacrilato entre 0,6 y 1,4.
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En ambos conjuntos de polímeros (Poli-1 y Poli-2), 7 de los 12 tenían relaciones amina/diacrilato > 1, obteniéndose polímeros acabados en amina, y 5 de los 12 tenían relaciones amina/diacrilato < 1, obteniéndose polímeros acabados en acrilato. Después de 5 horas de reacción a 100ºC, se obtuvieron los polímeros como líquidos viscosos transparentes, ligeramente amarillentos. Los polímeros tenían diferencias observables de viscosidad, que correspondían a diferencias en el peso molecular. Los polímeros se analizaron por cromatografía de permeabilidad en gel (GPC) en fase orgánica empleando 70% de THF/30% de DMSO (v/v) + pipericina 0,1 M como eluyente. Los pesos moleculares (PM) de los polímeros estuvieron en el intervalo de 3.350 (Poli-1, amina/diacrilato = 1,38) a 18.000 (Poli-1, amina/diacrilato = 0,95) en relación a estándares de poliestireno (figura 16). Las distribuciones de peso molecular fueron monomodales con índices de polidispersidad (PDls) en el intervalo de 1,55 a 2,20.
Resultados de la transfección de la luciferasa. Se realizaron los experimentos de transfección con todos los 24 polímeros sintetizados (12 cada uno de Poli-1 y Poli-2) en 9 relaciones polímero/ADN diferentes para determinar el impacto del peso molecular, relación polímero/ADN, y grupo final de la cadena en la eficiencia de la transfección (figuras 17 y 18). Como sistema modelo, usamos la línea celular COS-7 y un plásmido que codifica el gen reportero de luciferasa de la luciérnaga (pCMV-Luc) (600 ng/pocillo). Para facilitar la ejecución de las cerca de 1.000 transfecciones (datos obtenidos por cuadruplicado), se realizaron los experimentos en un formato de placa de 96 pocillos. Los niveles de expresión de la proteína reportera se determinaron usando un kit de ensayo comercializado de luciferasa y un lector de placa de luminiscencia de 96 pocillos.
Los datos mostrados en las figuras 17 y 18 demuestran que el peso molecular del polímero, la relación polímero/ADN, y el grupo al final de la cadena tienen un impacto en las propiedades de transfección de ambos polímeros Poli-1 y Poli-2. Un resultado llamativo, y en cierto modo inesperado, fue que ninguno de los polímeros acabados en acrilato mediara niveles apreciables de transfección en ninguna de las condiciones evaluadas. Este resultado puede ser aplicable de forma más amplia para los ésteres de poli(\beta-amino), puesto que todavía no hemos conseguido sintetizar un polímero, usando un exceso de monómero de diacrilato, que medie la expresión apreciable del gen reportero con ninguna de las relaciones polímero/ADN que hemos empleado. Estos resultados sugieren que quizás solo los ésteres de poli(\beta-amino) terminados en amina son adecuados para uso como vehículos de dispensación de genes. Por el contrario, hubo valores diferentes de actividad de transfección según los diferentes valores de Pm del polímero/ADN con las versiones terminadas en amina de ambos Poli-1 y Poli-2 (figuras 17-A y 18-A). Se consiguieron niveles máximos de 60 ng luc/pocillo y 26 ng luc/pocillo de expresión del gen reportero usando Poli-1 (P_{M} = 13.100) y Poli-2 (P_{M} = 13.400), respectivamente. Estos resultados son bastante favorablemente comparación los de PEI (polímero/ADN = 1:1 p/p), que mediaron un nivel de expresión de 6 ng luc/pocillo (datos no mostrados) en las mismas condiciones.
Mientras que los niveles más altos de transfección ocurrieron usando las versiones de peso molecular más alto de ambas estructuras poliméricas, las relaciones polímero/ADN óptimas para estos polímeros fueron marcadamente diferentes (polímero/ADN = 150 para el poli-1, polímero/ADN = 30 para el poli-2). Los resultados de transfección que hemos obtenido para Poli-1 y Poli-2 remarcan la importancia de optimizar el peso molecular del polímero y la relación polímero/ADN, y la importancia de controlar los grupos al final de la cadena. Además, el hecho de que dos estructuras poliméricas tan similares, que se diferencian solo en dos carbonos en la unidad de repetición, tengan parámetros de transfección óptimos tan diferentes da énfasis a la necesidad de realizar estas optimizaciones para cada estructura polimérica única. Para mejorar nuestra comprensión de los resultados de transfección obtenidos, elegimos estudiar dos características importantes de la dispensación que tienen un impacto directo en la expresión transgénica, la citotoxicidad y la habilidad de entrar en las células vía la endocitosis (Wiethoff, C.M. y C.R. Middaugh, Barriers to nonviral gene delivery. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2003. 92(2): páginas 203-217).
Citotoxicidad: evaluamos las citotoxicidades de varios complejos polímero/ADN usando un ensayo estándar de reducción de MTT/tinte azul de tiazolilo. Los experimentos se realizaron exactamente como los experimentos de transfección descritos anteriormente, excepto que en lugar de ensayar la expresión del gen reportero en el día 3, se realizó el ensayo de MTT después del día 1 (véase Materiales y Métodos). Inicialmente formulamos la hipótesis que la falta de actividad de transfección observada en los polímeros terminados en acrilato podría haberse debido a la citotoxicidad de los grupos terminales de acrilato. Las figuras 19-B y 20-B indican que las concentraciones altas de acrilato son citotóxicas, puesto que se ve que la viabilidad disminuye a relaciones mayores de polímero/ADN y Pm más bajo del polímero (el Pm más bajo se corresponde con una concentración más alta de grupos terminales). Sin embargo, la toxicidad de los acrilatos no explica suficientemente la falta de actividad de transfección a relaciones menores de polímero/ADN o pesos moleculares más altos. Los datos mostrados en la figura 19-A demuestran que la citotoxicidad no es un factor limitante para los vectores de poli-1, puesto que las células permanecen viables incluso a las relaciones más altas de polímero/ADN. Por otro lado, los datos mostrados en la figura 20-A sugieren que la citotoxicidad es un factor importante que limita la eficiencia de la transfección de los vectores de poli-2, especialmente en los polímeros de bajo peso molecular. Este resultado puede explicar por qué la actividad de transfección no existe o disminuye en los vectores de poli-2 a polímero/ADN > 30 (véase la figura 18-A).
Captación celular. Se evaluó la habilidad de los complejos de polímero/ADN para ser captados por las células usando una técnica basada en citometría de flujo descrita anteriormente para medir la fluorescencia del ADN dispensado por el vector (Akinc, A., et al. Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc., 2003). Brevemente, se prepararon los complejos polímero/ADN usando ADN plasmídico marcado covalentemente con el tinte fluorescente Cy5. Para permitir la comparación de los datos de captación celular con los datos de expresión de genes descritos anteriormente, se formaron los complejos con las mismas relaciones polímero/ADN y de la misma forma que en los experimentos de transfección. Los complejos marcados se incubaron con células COS-7 durante 1 hora a 37ºC para permitir la captación. Se cuantificó el nivel relativo de captación celular midiendo la fluorescencia de las células cargadas con el ADN marcado con Cy5. Los resultados de estos experimentos de captación se resumen en las figuras 21 y 22. Los datos mostrados en las figuras 21-B y 22-B sugieren que la falta de actividad de transfección en los polímeros acabados en acrilato no se debe a la citotoxicidad, como se pensó inicialmente, sino más bien a una inhabilidad para penetrar en la célula. De forma similar, los complejos de poli-1 están severamente limitados en cuanto a captación en todas las relaciones polímero/ADN excepto las más altas (figura 21-A). Mientras que estos datos no se correlacionan exactamente con los resultados de transfección obtenidos para el poli-1, es consistente con el hecho de que la actividad de transfección no se observa hasta que se emplean relaciones polímero/ADN muy altas. Los complejos de poli-2 no muestran captación celular apreciable en relaciones polímero/ADN < 30 y mayores niveles de captación a medida que las relaciones polímero/ADN aumentan más allá de 30 (figura 22-A). Este resultado, combinado con los resultados anteriores de citotoxicidad, ayuda a explicar la actividad de transfección de los complejos de poli-2. En relaciones polímero/ADN menores de 30, los complejos no penetran eficazmente la célula, pero a medida que las relaciones polímero/ADN aumentan mucho más allá de 30, la citoxicidad empieza a limitar la eficiencia de la transfección, lo que produce una actividad de transfección óptima cerca de polímero/ADN = 30.
Cuando la endocitosis es la principal ruta de entrada celular, la formación eficaz de complejos polímero/ADN en la escala de nanómetros es un requerimiento para conseguir niveles altos de captación celular (De Smedt, S.C., J. Demester, y W.E. Henninink, Cationic polimer based gene delivery systems. Pharmaceutical Research, 2000. 17(2): páginas 113-126; Prabha, S., et al., Size-dependency of nanoparticlemediated gene transfection: studies with fractionated nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, 2002. 244(1-2): páginas 105-115). Los niveles de captación bajos observados con muchos de los complejos polímero/ADN pueden ser atribuibles a la falta de éxito para formar complejos estables a nanoescala. Desgraciadamente, la mala solubilidad a pH neutro de los polímeros previnió tomar medidas dinámicas de dispersión de la luz de tamaño complejo usando el medio de transfección (Opti-MEM medio de suero reducido, pH 7,2) como diluyente. Las lecturas obtenidas fueron atribuibles a precipitados poliméricos, que eran en algunos casos visibles como una turbidez en las soluciones de polímero en Opti-MEM. Sin embargo, pudimos medir los diámetros efectivo de los complejos usando acetato sódico 25 mM (pH 5) como diluyente de la muestra. Mientras que estos datos no iluminan la cuestión del tamaño o estabilidad de los complejos en el medio de transfección, si pueden indicar si hubo éxito en la formación de los complejos antes de añadir el medio de transfección. Específicamente, descubrimos que las versiones de poli-1 de peso molecular más bajo (P_{M} < 10.700) fueron incapaces de formar complejos a nanoescala, incluso en tampón de acetato. En todos los demás casos encontramos que se formaron complejos polímero/ADN de tamaño de nanómetro. Mientras que estos resultados pueden explicar los niveles bajos de captación asociados con las versiones de poli-1 de peso molecular más bajo, no explican satisfactoriamente la baja actividad de captación de los polímeros terminados con acrilato o la dependencia de la relación polímero/ADN en la captación celular. Aunque el tamaño de partícula y la estabilidad son factores importantes que tienen un impacto en la captación celular, es probable que otros factores, todavía no identificados, deban ser considerados también para proporcionar una explicación más completa de los resultados de captación celular obtenidos.
Aumento de la transfección usando un agente co-complejante. Tanto el poli-1 como el poli-2 requieren relaciones polímero/ADN en peso relativamente altas para conseguir niveles altos de transferencia de genes. Una explicación podría ser que, comparados con otros polímeros usados a menudo para compactar el ADN (por ejemplo, polilisina (PLL) y PEI), estos polímeros tienen densidades de nitrógeno relativamente bajas. El poli-1 tiene un peso molecular por átomo de nitrógeno (Pm/N) de 301, y poli-2 tiene un Pm/N de 329. En comparación, para PLL y PEI, estos números son aproximadamente 65 y 43, respectivamente. Podría ser posible reducir la cantidad de poli-1 o poli-2 necesaria para conseguir niveles altos de transfección incorporando una pequeña cantidad de un agente co-complejante. Esta aproximación podría ser especialmente beneficiosa para los vectores de poli-2, puesto que la citotoxicidad parece ser una importante limitación de estos vectores. Para probar esta hipótesis, se usaron PLL y PEI como agentes co-complejantes modelo. Centramos nuestra atención en el miembro más prometedor en cada uno de los conjuntos de polímeros de poli-1 (terminados en amina, P_{M} = 13.100) y poli-2 (terminados en amina, P_{M} = 13.400). Los datos mostrados en las figuras 23 y 24 indican que se pudo conseguir una reducción significativa en polímero, mientras que se mantienen los altos niveles de eficiencia de transfección, con el uso de PLL o PEI como agentes co-complejanles. En algunos casos, se realizó un aumento significativo de la actividad de transfección. Como se esperaba, esta aproximación de co-complejamiento fue particularmente beneficiosa para los vectores poli-2. Este trabajo, y trabajos anteriores (Wagner, E., et al., Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferring-polilysine-DNA complexes: toward a synthetic virus-like gene-transfer vehicle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1992. 89(17): páginas 7934-8; Fritz, JD., et al., Gene transfer finto mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA. Hum Gene Ther, 1996. 7(12): páginas 1395-1404; Pack, D.W., D. Putnam, y R. Langer, Design of imidazolecontaining endosomolytic biopolymers for gene delivety. Biotechnol. Bioeng., 2000. 67(2): páginas 217-23; Lim, Y.B., et al., Self-Assembled Ternary Complex of Cationic Dendrimer, Cucurbituril, and DNA: Noncovalent Strategy in Developing a Gene Delivery Carrier. Bioconjug Chem, 2002. 13(6): páginas 1181-5), demuestran que la mezcla de polímeros con características de transferencia de genes complementarias puede en algunos casos producir reactivos de dispensar genes más eficaces.
Transfecciones de GFP
Para evaluar adicionalmente las propiedades de transfección de reactivos mezclados Poli-1/PLL y Poli-2/PLL, realizamos experimentos de transfección usando un plásmido reportero que codifica la proteína verde fluorescente (pCMV-EGFP). Aunque tanto las pruebas de transfección de luciferasa como las de transfección de GFP miden la actividad de transfección, proporcionan distintos tipos de información. El sistema de luciferasa cuantifica la cantidad total de proteína exógena de luciferasa producida por todas las células en un pocillo dado, proporcionando una medida de actividad de transfección cumulativa. Por el contrario, el sistema GFP puede usarse para cuantificar el porcentaje de células que han sido transfectadas, proporcionando una medida célula por célula de actividad de transfección. Ambos sistemas son útiles y ofrecen información complementaria en cuanto a las propiedades de transfección de un sistema dado de dispensar genes.
Se realizaron las transfecciones de GFP de forma similar a los experimentos de luciferasa, pero se escalaron a un formato de placa de 6 pocillos (5 \mug de plásmido/pocillo). Se realizó la transfección de células COS-7 usando Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) y Poli-2/PLL (Poli-2:PLL:ADN = 5:0,4:1 p/p/p). Se usaron la Lipofectamina 2000 (\mul de reactivo: \mug de ADN = 1:1), PEI (PEI: ADN = 1:1 p/p, N/P \sim8), y ADN desnudo como controles en el experimento. Después de 1 hora de incubación con las células, se eliminaron los vectores y se añadió medio de cultivo nuevo. Dos días más tarde se probó la expresión de GFP usando un citómetro de flujo. Casi todas las células que se habían transfectado con Poli-1/PLL fueron positivas para la expresión de GFP (figuras 25 y 26). Los experimentos indicaron que los vectores Poli-2/PLL fueron menos eficaces, produciendo aproximadamente 25% de células positivas. Los controles positivos Lipofectamina 2000 y PEI fueron también capaces de mediar transfecciones eficaces de células COS-7 en las condiciones empleadas. Aunque las transfecciones de Lipofectamina 2000 y PEI produjeron cerca del mismo porcentaje de células GFP positivas que el Poli-1/PLL, el nivel de fluorescencia de las células GFP positivas fue mayor en el caso de Poli-1/PLL (fluorescencia media = 6033) que en el caso tanto de Lipofectamina 2000 (fluorescencia media = 5453) como de PEI (fluorescencia media = 2882). La multiplicación del porcentaje de células positivas por el nivel medio de fluorescencia de las células positivas proporciona una medida de la expresión agregada de la muestra y debería, en teoría, correlacionarse mejor con los resultados de los experimentos de expresión del gen de luciferasa. La cuantificación de la expresión de GFP total de esta manera indica que el nivel de expresión más alto se consigue con poli-1/PLL, seguido de Lipofectamina 2000 y PEI. Este resultado está en general de acuerdo con los resultados de expresión de luciferasa.
Los experimentos han mostrado que poli-1/PLL (poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) es un vector altamente eficaz en la transfección de células COS-7. La habilidad de este vector para mediar la transfección en tres otras líneas celulares comúnmente usadas (CHO, NIH 3T3, y HepG2) se investigó también. Es -muy probable que cada una de estas líneas celulares tenga condiciones óptimas de transfección que son diferentes de las usadas en la transfección de células COS-7; sin embargo, como evaluación preliminar de la habilidad de transfectar líneas celulares múltiples, se realizaron transfecciones de la misma manera y en las mismas condiciones que las transfecciones de COS-7. Los resultados indican que poli-1/PLL (poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) es capaz de transfectar con éxito las células CHO, NIH 3T3, y HepG2, aunque no tan eficazmente como las células COS-7 (figura 27). Esto no es demasiado sorprendente puesto que el vector usado se optimizó por cribado de transferencia de genes en células COS-7. Se esperaría que la optimización de la composición del vector y de las condiciones específicas de transfección para cada tipo de célula produjera incluso niveles de transfección más altos.
Compendio
En este estudio, se ha investigado el papel del peso molecular polimérico, el grupo terminal del polímero, y la relación polímero/ADN en un número de propiedades importantes de transferencia de genes. Se encontó que los tres factores tenían un impacto significativo en la transferencia de genes, remarcando el beneficio de controlar cuidadosamente y optimizar cuidadosamente estos parámetros. Además, la incorporación de una pequeña cantidad de PLL, usado para ayudar el complejamiento, aumenta adicionalmente la transferencia de genes. Con estas aproximaciones los vectores basados en ésteres degradables de poli(beta-amino) rivalizan con algunos de los mejores vectores no virales obtenibles en la transferencia de genes in vitro.
Ejemplo 6 Estudios adicionales de ésteres de polil[beta-amino) seleccionados
Para caracterizar adicionalmente y sintetizar algunos de los ésteres de poli(beta-amino) identificados en los cribados anteriores, se sintetizaron de nuevo veintiún polímeros con varas relaciones de monómero de amina a monómero de acrilato. Los polímeros obtenidos se caracterizaron por cromatografía de permeabilidad de gel para determinar el peso molecular y la polidispersidad de cada polímero. Cada uno de los polímeros se probó en cuanto a su habilidad para transfectar células.
Síntesis de los polímeros. Se sintetizaron los polímeros como se describió en el ejemplo 5. Se crearon varias versiones de cada polímero variando la relación estequiométrica amina/diacrilato. Por ejemplo, C36-1 corresponde a la relación estequiométrica de 1,4, y C36-12 a 0,6, con todos los intermediarios dados en la tabla a continuación:
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41 
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Los polímeros se prepararon típicamente en viales de cristal sin disolvente a 100ºC durante 5 horas. En algunas síntesis, la polimerización a 100ºC dio polímeros de alto entrecruzamiento cuando se usaron ciertos monómeros como la amina 94; por lo tanto, se repitieron las reacciones de polimerización a 50ºC con 2 ml de DMSO añadidos para evitar el entrecruzamiento.
Los polímeros obtenidos se analizaron por GPC como se describió en el ejemplo 5. Los pesos moleculares y polidispersidades de cada uno de los polímeros se muestran en la tabla a continuación:
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50 
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Ensayo de la transfección de la luciferasa. Como se describió en el ejemplo 5, células COS-7 se transfectaron con ADN p CMV-Luc usando cada uno de los polímeros con relaciones polímero a ADN en el intervalo de 10:1 a 100:1 (peso:peso). Se analizó la expresión de luciferasa usando los kits de Bright-Glo (Promega). Se midió la luminiscencia de cada transfección, y se usó la luminiscencias para calcular los nanogramos de la enzima luciferasa como se describió en el ejemplo 5. Se realizaron los experimentos por cuadruplicado, y los valores mostrados en las tablas a continuación son los valores medios de los cuatro experimentos. Estos da.:os se muestran a continuación para cada polímero sintetizado.
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51 
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La siguiente tabla muestra la síntesis de los polímeros listados a la izquierda usando relaciones de monómero de amina a monómero de acrilato en el intervalo de 1,4 a 0,6 como se describió anteriormente. Cada síntesis de polímero se ensayó a continuación en cuanto a la transfección de Luciferasa usando seis relaciones distintas de polímero a ADN (se realizó cada experimento por cuadruplicado). Los datos de la tabla representan la actividad de la Luciferasa en la mejor relación polímero a ADN.
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(Tabla pasa a página siguiente)
507
508
509
510
511
512

Claims (15)

1. Un compuesto de la fórmula:
79
en donde
cada R' está independientemente seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de cadena corta C_{1}-C_{6}, alcoxi de cadena corta C_{1}-C_{6}, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril, fenil, heterociclo, carbociclo, y halógeno;
n es un número entero ente 3 y 10.000;
x es un número entero entre 1 y 10; y
cuando X es metil o NR_{2}; y
R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril; o cuando X es OR; y R se selecciona del grupo que consiste en alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril;
y es un número entero entre 1 y 10;
o cuando X es OR; y R es hidrógeno, y es 5 o un número entero entre 1 y 2 o 6 y 10
y
derivados y sales del mismo.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto acaba con amina, o en donde el compuesto acaba con acrilato.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde x es un número entero entre 2 y 7, preferiblemente en donde x es 4, 5 o 6.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde y es un número entero entre 2 y 7, preferiblemente en donde y es 4, 5 o 6.
5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R es hidrógeno, metil, etil, propil, butil, pentil y hexil.
6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde la estructura del compuesto es
80
en donde R es hidrógeno, x es 4, e y es 4;
o
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81 
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en donde R es hidrógeno, x es 6, e y es 4;
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o
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82 
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en donde R es hidrógeno, x es 4, e y es 5;
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o
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83 
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en donde R es hidrógeno, x es 5, e y es 4;
\newpage
o
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84 
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en donde R es hidrógeno, x es 5, e y es 5;
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o
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85 
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en donde R es hidrógeno, x es 5, e y es 6.
7. Un compuesto como se ha reivindicado en la reivindicación 1, de la fórmula
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86 
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en donde n es un número entero ente 3 y 10,1000; y derivados y sales del mismo.
\newpage
8. Un compuesto de la reivindicación 1, que comprende acrilatos de la fórmula:
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87 
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y
aminas de la fórmula
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88 
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89 
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90
9. Un compuesto según la reivindicación 8, seleccionado del grupo que comprende:
C80, E32, E36, F28, F32 y LL8.
10. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene un peso molecular entre 1.000 y 100.000 g/mol, preferiblemente en donde el compuesto tiene un peso molecular entre 2.000 y 40.000 g/mol.
11. Una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido y un compuesto de la reivindicación 1.
12. Una composición farmacéutica que comprende nanopartículas que contienen un polinucleótido o un agente farmacéutico y un compuesto de la reivindicación 1.
13. Una composición farmacéutica que comprende micropartículas que contienen un agente encapsulado en una matriz de un compuesto de la reivindicación 1.
14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en donde las micropartículas tienen un diámetro medio de 1-10 micrómetros, o en donde las micropartículas tienen un diámetro medio menor de 5 micrómetros, preferiblemente en donde las micropartículas tienen un diámetro medio menor de 1 micrómetro.
15. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en donde el agente es una molécula pequeña, péptido, proteína o polinucleótido, preferiblemente en donde el polinucleótido es ADN, ARN o siARN.
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