ES2326061B1 - Mezcla de colorantes fluorescentes y procedimientos para teñir el nucleo y el citoplasma celular que permite estudiar la morfologia de las celulas en cultivo sobre cualquier tipo de soporte. - Google Patents
Mezcla de colorantes fluorescentes y procedimientos para teñir el nucleo y el citoplasma celular que permite estudiar la morfologia de las celulas en cultivo sobre cualquier tipo de soporte. Download PDFInfo
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Abstract
Mezcla de colorantes fluorescentes y
procedimientos para teñir el núcleo y el citoplasma celular que
permite estudiar la morfología de las células en cultivo sobre
cualquier tipo de soporte.
El procedimiento consiste en utilizar una mezcla
de colorantes fluorescentes que contiene un colorante para el
núcleo celular y otro para el citoplasma de forma que, entre otras
aplicaciones, sea posible la observación, con microscopia de
epifluorescencia, de cultivos celulares realizados sobre soportes
opacos y transparentes.
Description
Mezcla de colorantes fluorescentes y
procedimientos para teñir el núcleo y el citoplasma celular que
permite estudiar la morfología de las células en cultivo sobre
cualquier tipo de soporte.
La presente invención se encuadra en el sector
de los colorantes, en relación con las Ciencias Biológicas, Médicas
y Veterinarias. Concretamente es un procedimiento sencillo que
utiliza mezclas de colorantes para el estudio, mediante microscopia
de fluorescencia, de la morfología general de las células en cultivo
en diferentes tipos de soporte incluyendo los soportes opacos.
La microscopia de fluorescencia es una de las
metodologías fundamentales en Biología Celular permitiendo el
estudio de organelas y moléculas celulares mediante, por ejemplo,
los métodos inmunocitoquímicos o la detección de secuencias
concretas de ácidos nucleicos mediante la hibridación "in
situ" fluorescente. El desarrollo de la terapia celular y de
la ingeniería tisular ha favorecido la utilización de una gran
variedad de andamiajes y soportes sobre los que se cultivan
diferentes tipos celulares. Algunos de estos soportes son opacos,
por ejemplo, láminas de fibrina (Brown R.A., Phillips J.B., 2007.
Int Rev Cytol 262, 75-150), polímeros
biocompatibles (Sun T., Norton D., Ryan A.J., MacNeil S., Haycock
J.W., 2007. J Mater Sci Mater Med 18, 321-328),
materiales cerámicos (Marcacci M., Kon E., Moukhachev V., Lavroukov
A., Kutepov S., Quarto R., Mastrogia como M., Cancedda R., 2007.
Tissue Eng 13, 947-955) e incluso metales como el
titanio (Maeda M., Hirose M., Ohgushi H., Kirita T., 2007. J
Biochem (Tokyo) 141, 729-736).
Independientemente del estudio concreto que se
realice suele ser necesario un estudio morfológico general de las
células en cultivo. Cuando los soportes sobre los que se cultivan
las células son transparentes, este estudio se realiza con luz
transmitida y microscopia de contraste de fase, contraste
interferencial o con microscopia de campo claro. En este último
caso, previamente las células se tiñen con métodos generales tales
como hematoxilina–eosina, Giemsa, etc. Cuando los soportes no son
transparentes es necesario utilizar epi- iluminación, como
generalmente se hace en microscopia de fluorescencia, por lo que
sería muy útil disponer de un método sencillo de coloración general,
que permitiera el estudio de la morfología citoplásmica y nuclear
en estos cultivos celulares mediante tinciones flourescentes.
El núcleo celular se tiñe tanto para citometría
de flujo como para microscopia de fluorescencia con sustancias que
se unen a las cadenas de DNA como, entre otras, el
4'-6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI) (Krishan A., Dandekar P.D., 2005. J Histochem Cytochem, 53;
1033-1036) y algunos derivados de la cianina (TOTO,
YOYO) , del benzimidazol (Hoechst 33258, Hoechst 33342) (Adhikary
A., Buschmann V., Muller C., Sauer M., 2003. Nucleic Acids Res 31,
2178-2186), naranja de acridina o bromuro de
etidio.
Para el estudio de los citoplasmas celulares
suelen utilizarse métodos inmunocitoquímicos específicos, mediante
inmunofluorescencia indirecta, para detectar elementos
citoplásmicos muy abundantes como son los componentes del
citoesqueleto, por ejemplo, tubulina o actina. Estos métodos de
inmunofluorescencia son laboriosos y costosos.
Sería conveniente poseer un método sencillo y
económico que permitiera el estudio morfológico general del núcleo
y citoplasma de células en cultivo que pueda utilizarse para todo
tipo de soportes incluyendo los soportes opacos.
La presente invención consiste en una mezcla de
colorantes fluorescentes que tiñen de forma rápida y simple de
manera el núcleo y el citoplasma celular permitiendo el estudio con
microscopia de fluorescencia de cultivos celulares realizados tanto
sobre soportes transparentes como sobre soportes opacos.
La mezcla de colorantes consiste:
- Un colorante para el núcleo.
- Un colorante para el citoplasma
- Un solvente
- Un estabilizador de la mezcla.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla puede prepararse concentrada y
diluirse en el momento de su utilización.
Consideramos conveniente disponer de una mezcla
colorante que de forma sencilla y eficaz permita el estudio de la
morfología general del núcleo y del citoplasma de las células en
cultivo, sobre todo de las células cultivadas sobre soportes opacos
que no permiten los estudios microscópicos con luz transmitida.
La presente invención es una mezcla que contiene
dos colorantes fluorescentes, uno para el núcleo y otro para el
citoplasma, un solvente y un estabilizador.
Como colorante nuclear pueden ser utilizados
colorantes fluorescentes tales como los derivados del fenilindol
(DAPI), algunos derivados de la cianina (TOTO,
YO-PRO, TO-PRO) o del benzimidazol
(Hoechst 33258, Hoechst 33342) o el yoduro de propidio,bromuro de
etidio o naranja de acridina.
Como colorante citoplásmico podemos utilizar
derivados de la fluoresceína como la eosina amarilla, la eosina
azulada, el diacetato de fluoresceína, derivados del triarilmetano
(fucsina ácida, verde luz), o derivados azoicos (azul de Evans).
Como solvente, además de agua destilada o
purificada utilizamos preferentemente alcohol metílico o etílico,
que también tienen capacidad de preservar la disolución.
Como ejemplo de realización podemos preparar la
siguiente disolución concentrada:
- Disolver en 50 ml de agua destilada:
- 1 mg de DAPI
- 0.25 g de glicina
- 0.1 g de eosina amarilla
- Añadir 50 ml de etanol absoluto.
\vskip1.000000\baselineskip
Para obtener a disolución de trabajo se diluye
la disolución concentrada 1 a 10 con agua destilada.
Este tipo de mezclas colorantes fluorescentes,
además de ser específicamente útiles en cultivos celulares sobre
soportes opacos son también utilizables en cultivos celulares sobre
soportes transparentes y pueden serlo también en secciones
histológicas de órganos y tejidos.
En los equipos, tanto de microscopia láser
confocal como de fluorescencia convencional, que dispongan de luz
ultravioleta, los citoplasmas celulares teñidos con eosina (máximo
de absorción a 542 nm) muestran fluorescencia roja (545 nm)y
los núcleos teñidos con DAPI (máximo de de absorción a 359 nm)
muestran color azul (461 nm). En los equipos que carezcan de luz
ultravioleta los núcleos se observan de color rojo.
Aunque la mayor sencillez y utilidad se puede
obtener con la mezclas colorantes descritas pueden obtenerse
resultados similares mediante tinción secuencial primero con el
colorante citoplásmico y luego con el colorante nuclear.
Un experto en la materia podría introducir
cambios o modificaciones en los ejemplos de realización descritos
sin salirse de esta invención según está definido en las
reivindicaciones adjuntas.
Claims (4)
1. Mezcla de colorantes fluorescentes para teñir
el núcleo y el citoplasma celular que permite estudiar la
morfología de las células en cultivo sobre cualquier tipo de
soporte caracterizado porque contiene:
- a)
- Un colorante para el núcleo seleccionado entre los del grupo constituido por DAPI, TOTO, YO-PRO, TO-PRO, Hoechst 33258, Hoechst 33342 o yoduro de propidio, naranja de acridina, bromuro de etidio.
- b)
- Un colorante para el citoplasma seleccionado entre los del grupo constituido por eosina amarilla, eosina azulada, diacetato de fluoresceína, fucsina ácida, verde luz, azul de Evans.
- c)
- Un solvente constituido por agua destilada o purificada y un alcohol de 1 a 6 carbonos
- d)
- Un estabilizador de la mezcla elegido dentro del grupo formado por dimetilsulfóxido, cloroformo, cloruro de dietilamina, cloruro de dimetilamina, glicina o cloruro de lisina.
2. Mezcla de colorantes fluorescentes, según
reivindicación 1 caracterizada porque es válida para teñir
células cultivadas sobre soportes opacos, transparentes y secciones
histológicas de órganos y tejidos.
3. Mezcla de colorantes según la reivindicación
1 que contiene como colorante nuclear DAPI disuelto en agua
destilada, en una concentración superior a 0,1 mg/l; un colorante
citoplásmico, eosina amarilla disuelta en agua destilada en una
concentración superior a 10 mg/l; un estabilizante, glicina disuelta
en agua destilada y un preservante, etanol.
4. Procedimiento para teñir el núcleo y el
citoplasma celular que permite estudiar la morfología de las
células en cultivo sobre cualquier tipo de soporte
caracterizado porque se realiza de forma secuencial tiñéndose
primero el citoplasma de las células y después el núcleo.
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|---|---|---|---|
| ES200703132A ES2326061B1 (es) | 2007-11-20 | 2007-11-20 | Mezcla de colorantes fluorescentes y procedimientos para teñir el nucleo y el citoplasma celular que permite estudiar la morfologia de las celulas en cultivo sobre cualquier tipo de soporte. |
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| ES200703132A ES2326061B1 (es) | 2007-11-20 | 2007-11-20 | Mezcla de colorantes fluorescentes y procedimientos para teñir el nucleo y el citoplasma celular que permite estudiar la morfologia de las celulas en cultivo sobre cualquier tipo de soporte. |
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