ES2331657T3 - Metodos para el diagnostico de tumores. - Google Patents
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Abstract
Método in vitro de diagnóstico de tumores de pulmón o colon en una muestra de un mamífero, comprendiendo dicho método: (i) detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido PRO06018 que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2, en el que la identidad en la secuencia se calcula usando el programa ALIGN-2, (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) en una muestra de control de células de tejido normales conocidas del mismo tipo de célula, en el que un nivel de expresión mayor en la muestra de prueba, comparado con la muestra de control, es indicativo de la presencia de un tumor en el mamífero del cual se ha obtenido las células de tejido de prueba, (ii) (a) poner en contacto un anticuerpo anti-PRO6018 que se une a un polipéptido PRO06018 que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 2 con una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b) detectar la formación de un complejo entre dicho anticuerpo y un polipéptido PRO6018 que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2, en el que la identidad en la secuencia se calcula usando el programa ALIGN-2, en la muestra de prueba, en el que la formación de un complejo es indicativa de la presencia de un tumor en dicho mamífero, o (iii) detectar la amplificación de un gen que codifica un polipéptido PRO6018 que tiene por lo menos un 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2, en el que la identidad en la secuencia se calcula usando el programa ALIGN-2, en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, en el que la amplificación es indicativa de la presencia de un tumor en dicho mamífero.
Description
Métodos para el diagnóstico de tumores.
La presente invención se refiere a métodos para
el diagnóstico de tumores.
Los tumores malignos (cánceres) son la segunda
causa principal de muerte en los Estados Unidos, después de las
enfermedades cardíacas (Boring et al., CA Cancel J. Clin.,
43:7 [1993]).
El cáncer está caracterizado por un incremento
de células anormales, o neoplásticas, derivadas de un tejido normal
que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de los
tejidos adyacentes por estas células de tumor neoplásticas, y la
generación de células malignas que eventualmente se dispersan a
través de la sangre o el sistema linfático a los nodos linfáticos
regionales y a sitios distantes (metástasis). En un estado
canceroso, una célula prolifera bajo condiciones en las que células
normales no crecerían. El cáncer se manifiesta en una amplia
variedad de formas, caracterizadas por diferentes grados de
invasividad y de agresividad.
La alteración de la expresión de los genes está
íntimamente relacionada con el crecimiento celular incontrolado y
desdiferenciación que son una característica común de todos los
cánceres. Los genomas de ciertos tumores bien estudiados han
encontrado que muestran una expresión disminuida de genes recesivos,
usualmente referidos como genes de supresión de tumor, que
normalmente funcionarían para evitar el crecimiento celular maligno,
y/o sobreexpresión de ciertos genes dominantes, tales como
oncogenes, que actúan para promover el crecimiento maligno. Cada uno
de estos cambios genéticos aparece como responsable de importar
algunos de los rasgos que, agregados, representan el fenotipo
neoplásico completo (Hunter, Cell, 64:1129 [1991] and Bishop, Cell,
64:235-248 [1991]).
Un mecanismo bien conocido de la sobreexpresión
de genes (por ejemplo, oncogenes) en células de cáncer es la
amplificación de genes. Este es un proceso donde en el cromosoma de
una célula ancestral se producen copias múltiples de un gen
particular. El proceso implica la replicación imprevista de la
región del cromosoma que comprende el gen, seguida por la
recombinación de los segmentos replicados nuevamente en el cromosoma
(Alitalo et al., Adv. Cancer Res.,
47:235-281 [1986]). Se cree que la sobreexpresión de
los genes es paralela con la amplificación de genes, es
decir, es proporcional al número de copias hechas.
Se han identificado protooncogenes que
codifican factores de crecimiento y receptores de factores de
crecimiento que juegan roles importantes en la patogénesis de
varias malignidades humanas, incluyendo cáncer de mama. Por ejemplo,
se ha encontrado que el gen ErbB2 humano (erbB2, también
conocido como her2, o c-erbB-2), que
codifica un receptor glicoproteína transmembrana que codifica un
185-kd (p 185^{HER2}; HER2) relacionado con el
receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR), es
sobreexpresado en aproximadamente 25% al 30% del cáncer de mama
humano (Slamon et al., Science, 235:177-182
[1987]; Slamon et al., Science, 244:707-712
[1989]).
Se ha informado que la amplificación de un
protooncogen es un evento típicamente implicado en las formas más
malignas del cáncer, y puede actuar como un predictor de resultado
clínico (Schwab et al., Genes Chromosomes Cancer,
1:181-193 [1990]; Alitalo et al.,
supra). Por lo tanto, la sobreexpresión de erbB2 es
comúnmente referido como un predictor de un pronóstico pobre,
especialmente en pacientes con enfermedad primaria que implica
nodos linfáticos axilares (Slamon et al., [1987] y [1989],
supra; Ravdin y Chamness, Gene, 159: 19-27
[1995]; y Hynes y Stern, Biochim, Biophys, Acta,
1198:165-184 [1994]), y ha sido vinculado a la
sensibilidad y/o resistencia a la terapia hormonal y regímenes de
quimioterapia, incluyendo CMF (ciclofosfamida, metotrexato, y
fluoruracil) y antraciclinas (Baselga et al., Oncology, 11 (3
Suppl 1):43-48 [1997]). Sin embargo, a pesar de la
asociación de sobreexpresión erbB2 con pronóstico pobre, las
posibilidades de pacientes HER2-positivos que
responden clínicamente al tratamiento con taxanos fue mayor de tres
veces aquellos de pacientes HER2-negativos
(Ibid). Un anticuerpo monoclonal anti-ErbB2
(anti-HER2) humanizado recombinante (una versión
humanizada del anticuerpo 4D5 anti-ErbB2 murina,
referido como rhuMAb HER2 o Herceptin^{TM}) ha sido clínicamente
activo en pacientes con cánceres de mama metastásicos que
sobreexpresan ErbB2 que habían recibido terapia anticáncer previa
extensiva. (Baselga et al., J. Clin, Oncol.,
14:737-744 [1996]).
A la vista de lo anterior, hay un interés obvio
en identificar nuevos métodos y composiciones que son útiles para
diagnosticar y tratar tumores que están asociados con la
amplificación de genes.
La presente invención se refiere a métodos para
el diagnóstico de crecimiento y proliferación celular neoplásicos
en mamíferos, incluyendo humanos. La presente invención se basa en
la identificación de genes que son amplificados en el genoma de
células tumorales. Dicha amplificación de genes se espera que esté
con la sobreexpresión del producto del gen y contribuye a la
génesis del tumor. Por consiguiente, las proteínas codificadas
mediante los genes amplificados se cree que son objetivos útiles
para el diagnóstico y/o tratamiento (incluyendo la prevención) de
ciertos cánceres, y pueden actuar como predictores del pronóstico
del tratamiento del tumor.
En una realización, la presente invención
concierne a un método in vitro de diagnóstico de tumor de
pulmón o colon en una muestra de un mamífero, que comprende:
i) detectar el nivel de expresión de un gen que
codifica un poli péptido PRO6018 que tiene al menos 90% de
identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 2, en donde la identidad en la
secuencia se calcula utilizando el programa ALIGN-2,
(a) en una muestra de prueba de células del tejido obtenidas del
mamífero, y (b) en una muestra de control de células del tejido
normal conocidas del mismo tipo de células, en donde un nivel de
expresión más alto en la muestra de prueba en comparación con la
muestra de control es indicativo de la presencia de un tumor en el
mamífero del cual tuvieron las células del tejido de prueba,
ii) (a) contactar un anticuerpo
anti-PRO6018 con una muestra de prueba de células de
tejido obtenidas a partir de un mamífero y (b) detectar la
formación de un complejo entre el anticuerpo
anti-PRO6018 y un poli péptido PRO6018 que tiene al
menos 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la
secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2, en donde la
identidad en la secuencia se calculó utilizando el programa
ALIGN-2, en la muestra de prueba, en donde la
formación de un complejo es indicativo de la presencia de un tumor
en dicho mamífero, o
iii) detectar la amplificación de un gen que
codifica un poli péptido PRO6018 que tiene al menos 90% de identidad
en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos
mostrada en la figura 2, en donde la identidad en la secuencia se
calculó utilizando el programa ALIGN-2, en una
muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, en
donde la amplificación es indicativa de la presencia de un tumor en
dicho mamífero.
La detección puede ser cualitativa o
cuantitativa, y puede realizarse en comparación con la
monitorización de la formación del complejo en una muestra de
control de células de tejido conocido del mismo tipo de célula. Una
gran cantidad de complejos formados en la muestra de prueba indica
la presencia de un tumor en el mamífero a partir del cual se
obtuvieron las células de tejido de prueba. El anticuerpo
preferentemente lleva una marcador detectable. La formación del
complejo puede ser monitorizada, por ejemplo, mediante microscopio
de luz, citometría de flujo, fluorimetría, u otras técnicas
conocidas en la técnica.
La muestra de prueba usualmente se obtienen a
partir de un individuo sospechado de tener un crecimiento o
proliferación celular neoplásicos (es decir, células
cancerosas).
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO:7) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos
que codifica la secuencia nativa PRO6018, donde la secuencia de
nucleótidos (SEQ ID NO:7) es un clon designado aquí como
DNA98565-2701. También presentadas en caracteres en
negrita y subrayadas están las posiciones de los respectivos
codones de inicio y parada.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEQ ID NO:8) de un polipéptido de una secuencia nativa PRO6018
derivado a partir de la secuencia de codificación SEQ ID NO:7
mostrado en la figura 7.
Las frases "amplificación de genes" y
"duplicación de genes" se utilizan de forma intercambiable y
se refieren en a un proceso en el cual múltiples copias de un gen o
fragmento de gen se forman en una célula o línea celular
particular. La región duplicada (un alargamiento de ADN amplificado)
con frecuencia es referida como "amplímero". Usualmente, la
cantidad de ARN mensajero (ARNm) producido, es decir, el
nivel de la expresión del gen, también se incrementa en la
proporción del número de copias hechas del gen particular
expresado.
"Tumor", como se emplea aquí, se refiere a
todo crecimiento celular neoplásico y proliferación, tanto maligna
o benigna, y todas las células y tejidos precancerosos y
cancerosos.
Los términos "cáncer" y "canceroso"
se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que
está típicamente caracterizada por un crecimiento celular no
regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a,
carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más
particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de mama, cáncer de
próstata, cáncer de colon, cáncer de células famosas, cáncer de
pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón no de células
pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma,
cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de
vejiga, hepatoma, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial,
carcinoma de la glándula salival, cáncer de riñón, cáncer de hígado,
cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios
tipos de cáncer de cabeza y cuello.
"Tratamiento" es una intervención realizada
con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología
de un desorden. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere
tanto a un tratamiento terapéutico y profiláctico o a medidas
preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen a
aquellos que ya tienen el desorden así como aquellos en los cuales
debe prevenirse el desorden. En el tratamiento del tumor (por
ejemplo, cáncer), un agente terapéutico puede disminuir
directamente la patología de las células tumorales, o volver las
células tumorales más susceptibles al tratamiento mediante otros
agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o
quimioterapia.
La "patología" del cáncer incluye todos
los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente. Esto
incluye, sin limitación, crecimiento celular anormal o
incontrolable, metástasis, interferencia con funcionamiento normal
de células vecinas, liberación de citocinas u otros productos de
secreción en niveles anormales, supresión o agravamiento de la
respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.
"Mamífero" para los propósitos de
tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un
mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y
animales de zoológico, de deporte, mascotas, tales como perros,
caballos, gatos, ganado, cerdos, ovejas, etc. Preferentemente, el
mamífero es humano.
"Portadores" como se utiliza aquí incluye
portadores, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente
aceptables que son no tóxicos para la célula o mamífero que se
expone al mismo a la dosis y concentraciones empleadas. Con
frecuencia el portador fisiológicamente aceptable es una solución
acuosa de pH tamponado. Ejemplos de portadores fisiológicamente
aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros
ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; poli
pérfidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o
inmunoglobulinas: polímeros hidrofílicos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros
carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o
sorbitol: contraiones formadores de sale tales como sodio: y/o
surfactantes no iónicos tales como TWEEN^{TM}, polietilen glicol
(PEG), y PLURONICS^{TM}.
Administración "en combinación con" uno o
más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración
simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
El término "agente citotóxico" como se
emplea aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la
función de células y/o causa destrucción de células. El término se
indica para incluir isótopos radiactivos (por ejemplo,
I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes
quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente
activas de bacterias, hongos, plantas u origen animal, o fragmentos
de las mismas.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de
agentes quimioterapéutico incluyen adriamicina, doxorubicina,
epirubicina, 5-fluorouracil, citosina arabinosido
("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfan,
citoxina, taxoides, por ejemplo, paclitaxel (Taxol.
Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), y
doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer. Antony,
Rnace), toxotero, metotrexato, cisplatino, melfalan, vinblastine,
bleomicina, etoposido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona,
vincristina, vinorelbina, carboplatino, teniposida, daunomicina,
carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas,
esperamicinas (see, U.S. Pat. No. 4.675.187),
5-FU. 6-tioguanina,
6-mercaptopurina, actinomicina D,
VP-16, clorambucil, melfalan, y otras mostazas de
nitrógeno relacionadas. También incluidas en esta definición están
los agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción
hormonal sobre los tumores tales como tamoxifen y onapristona.
Un "agente inhibidor del crecimiento"
cuando se utiliza aquí se refiere a un compuesto o composición que
inhibe el crecimiento de una célula, especialmente células de cáncer
que sobreexpresan cualquiera de los genes aquí identificados, tanto
in vitro o in vivo. Por lo tanto, el agente inhibidor
del crecimiento es uno que reduce significativamente el porcentaje
de células que sobreexpresan dichos genes en la fase S. Ejemplos de
agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la
progresión del ciclo cleular (en un lugar distinto de la fase S),
tales como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de
la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las
vincas (vincristina y vinblastina), taxol, e inhibidores topo II
tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y
bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también afectan la
detención de la fase S, for ejemplo, agentes alquilantes ADN tales
como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino,
metotrexato, 5-fluorouracil, y
ara-C. Puede encontrarse información adicional en
The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds.,
Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogens, and
antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders:
Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.
"Doxorubicina" es un antibiótico
antraciclina. El nombre químico completo de la doxorubicina es
(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-\alpha-L-lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1-metoxi-5,
12-naftacenediona.
12-naftacenediona.
\global\parskip0.850000\baselineskip
El término "citoquina" es un término
genérico para proteínas liberadas por una población de células que
actúan sobre otra célula como mediadoras intercelulares. Ejemplos de
dichas citoquinas son linfoquinas, monoquinas, y hormonas
polipéptido tradicionales. Incluídos entre las citoquinas están la
hormona de crecimiento tal como la hormona de crecimiento humana,
hormona de crecimiento humana N-metionil, y hormona
de crecimiento bovina; hormona paratiroide; tiroxina; insulina;
proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glicoproteínas tales
como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de
la tiroides (TSH), y hormona luteinizante (LH); factor de
crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto;
prolactina; lactógeno placentario; factor-\alpha
y -\beta de necrosis tumor; sustancia inhibidora del útero;
péptido asociado a la gonadotropina de ratón: inhibina: activina;
factor de crecimiento endotelial vascular; integrina: trombopoietina
(TPO); factores de crecimiento nervioso tales como
NGF-\beta; factor de crecimiento de plaquetas;
factores de crecimiento que transforman (TGFs) tales como
TGF-\alpha y TGF-\beta; factor
de crecimiento a modo de insulina -I y -II; eritropoietina (EPO):
factores osteoinductivos: interferones tales como interferón
-\alpha, -\beta, y -\gamma; factores estimuladores de
colonias (CSFs) tal como macrófago-CSF
(M-CSF);
granulocito-macrófago-CSF
(GM-CSF); y granulocito-CSF
(G-CSF); interleuquinas (ILs) tales como
IL-1, IL- 1a, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9. IL-11, IL-12;
un factor de necrosis de tumor tal como TNF-\alpha
o TNF-\beta; y otros factores polipéptido
incluyendo LIF y conjunto ligando (KL). Como se emplea aquí, el
término citoquina incluye proteínas a partir de fuentes naturales o
a partir de cultivo de células recombinantes y equivalentes
biológicamente activos de citoquinas de secuencia nativa.
El término "profármaco" como se utiliza en
esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una
sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las
células del tumor comparada con el fármaco original y es capaz de
ser enzimáticamente activada o convocada en la forma original más
activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer
Chemotherapy", Biochemical Society Transactions,
14:375-382, 615th Meeting, Belfast (1986), y Stella
et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug
Delivery", Directed Drue Delivery, Borchardt et al.,
(ed.), pp. 147-267, Humana Press (1985). Los
profármacos de esta invención incluyen, pero no está limitado a,
profármacos que contienen fosfatos, profármacos que contienen
tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que
contienen péptido, profármacos ácido modificados
D-amino, profármacos glisocilados, profármacos que
contienen \beta-lactama, profármacos que
contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que
contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida,
5-fluorocitosina y otros profármacos
5-fluorouridina que puede ser convertidos en el
fármaco libre activo más citotóxico. Ejemplos de fármacos
citotóxicos que pueden derivarse en una forma de profármaco para
utilizar en esta invención incluyen, pero no están limitados a,
aquellos agentes quimioterapéuticos antes descritos.
Una "cantidad efectiva" de un polipéptido
aquí descrito o un antagonista del mismo, en referencia a la
inhibición del crecimiento celular neoplásico, crecimiento del tumor
o crecimiento celular del cáncer, es una cantidad capaz de inhibir,
hasta algún punto, el crecimiento de las células objetivo. El
término incluye una cantidad capaz de invocar un efecto inhibidor
del crecimiento, citostático y/o citotóxico y/o apoptosis de las
células objetivo. Una "cantidad efectiva" de un PRO antagonista
polipéptido con propósitos de inhibir el crecimiento celular
neoplásico, crecimiento del tumor o crecimiento de células de
cáncer, pueden ser determinada empíricamente y en una forma
rutinaria.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva",
en referencia al tratamiento del tumor, se refiere a una cantidad
capaz de invocar uno o más de los siguientes efectos: (1)
inhibición, hasta algún punto, del crecimiento del tumor,
incluyendo, desaceleración y detención completa del crecimiento;
(2) reducción en el número de células tumorales; (3) reducción en el
tamaño del tumor; (4) inhibición (por ejemplo, reducción,
desaceleración o detención completa) de la infiltración de células
del tumor dentro de órganos periféricos; (5) inhibición (por
ejemplo, reducción, desaceleración o detención completa) de
metástasis: (6) mejora de la respuesta inmune antitumoral, que
puede, pero no tiene que, resultar en la regresión o rechazo del
tumor; y/o (7) alivio, hasta algún punto, de uno o más síntomas
asociados con el desorden. Una "cantidad terapéuticamente
efectiva" de un antagonista polipéptido PRO con propósito de
tratamiento del tumor puede ser determinado empíricamente y en una
forma rutinaria.
Una "cantidad inhibidora del crecimiento"
de un antagonista PRO es una cantidad capaz de inhibir el
crecimiento de una célula, especialmente un tumor. por
ejemplo, célula de cáncer, tanto in vitro o in
vivo. Una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un
antagonista PRO con propósito de inhibir el crecimiento celular
neoplásico puede ser determinado empíricamente y en una forma
rutinaria.
Una "cantidad citotóxica" de un antagonista
PRO es una cantidad capaz de causar la destrucción de una célula,
especialmente de tumor, por ejemplo, célula de cáncer, tanto
in vitro o in vivo. Una "cantidad citotóxica" de
un antagonista PRO con propósitos de inhibir el crecimiento celular
neoplásico puede ser determinado empíricamente y en una forma
rutinaria.
Los términos "polipéptido PRO" y "PRO"
como se utiliza aquí y cuando es inmediatamente seguido por una
designación numérica se refiere a varios polipéptidos, donde la
designación completa (por ejemplo, PRO/número) se refiere a
secuencias específicas de polipéptidos como se describen aquí. Los
términos "PRO/número polipéptido" and "PRO/número" donde
el término "número" se proporciona como una designación
numérica real como se utiliza aquí abarca secuencia de polipéptidos
nativas y variantes de polipéptido (que son definidas aquí
adicionalmente). Los polipéptidos PRO aquí descritos pueden ser
aislados a partir de una variedad de fuentes, tales como a partir de
tipos de tejido humano o a partir de otra fuente, o preparados
mediante métodos recombinantes o sintético.
Un "polipéptido PRO de secuencia nativa"
comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos
que el correspondiente polipéptido PRO derivado de la naturaleza.
Dichos polipéptidos PRO de secuencia nativa pueden ser aislados a
partir de la naturaleza o pueden ser producidos a través de medios
recombinantes o sintéticos. El término "polipéptido PRO de
secuencia nativa" específicamente abarca formas producidas
naturalmente truncadas o secretadas del polipéptido PRO específico
(por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas
variantes producidas naturalmente (por ejemplo, formas
empalmadas alternativamente) y variantes alélicas producidas
naturalmente del polipéptido. En varias realizaciones de la
invención, los polipéptidos PRO de secuencia nativa aquí descritos
son polipéptidos de secuencia nativa maduros o de longitud completa
que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las
figuras adjuntas. Los codones de inicio y terminación se muestran en
fuente en negrita y subrayados en las figuras. Sin embargo,
mientras que el polipéptido PRO descrito en las figuras adjuntas se
muestran que comienzan con residuos metionina designados aquí como
aminoácido de posición I en las figuras, es concebible y posible
que otros residuos metionina ubicados tanto antes o después del
aminoácido de posición 1 en las figuras puede emplearse como el
residuo aminoácido de inicio para los polipéptidos PRO.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El "dominio extracelular" o "ECD" del
polipéptido PRO se refiere a una forma del polipéptido PRO que es
esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplásmico.
Ordinariamente, un polipéptido PRO ECD tendrá menos del 1% de
dichos dominios transmembrana y/o citoplásmico y preferentemente,
tendrá menos del 0,5% de dichos dominios. Se entenderá que
cualquier dominio transmembrana identificado por los polipéptidos
PRO de la presente invención es identificado de conformidad con
criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar
ese tipo de dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio
transmembrana puede variar pero muy probablemente en no más de
aproximadamente 5 aminoácidos en cada extremo del dominio como se
identificó aquí inicialmente. Opcionalmente, por lo tanto, un
dominio extracelular de un polipéptido PRO puede contener desde
aproximadamente 5 o menos aminoácidos en ambos lados del límite
dominio transmembrana/dominio extracelular como se identificó en
los Ejemplos o especificación y dichos polipéptidos, con o sin el
péptido señal asociado, y ácido nucleico codificándolos, son
contemplados por la presente invención.
La ubicación aproximada de los "péptidos
diana" de los distintos polipéptidos PRO aquí descritos se
muestran en la presente especificación y/o las figuras adjuntas. Se
observa, sin embargo, que el límite C-terminal de un
péptido señal puede variar, pero más probablemente no más de
aproximadamente 5 aminoácidos a ambos lados del péptido señal límite
C-terminal como se identificó aquí inicialmente,
donde el límite C-terminal del péptido señal puede
ser identificado de conformidad con criterios rutinariamente
empleados en la técnica para identificar el tipo de elemento de
secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al.,
Prot. Eng., 10:1-6 (1997) y von Heinje et
al., Nucl. Acids Res., 14:4683-4690 (1986)).
Además, también se reconoce que, en algunos casos, la división de
una secuencia señal de un polipéptido secretado no es completamente
uniforme, resultando en más de una especie secretada. Estos
polipéptidos maduros, donde el péptido señal es dividido entre no
más de aproximadamente 5 aminoácidos a ambos lados del límite
C-terminal del péptido señal como se identifica
aquí, y los polinucleótidos que los codifican, son contemplados por
la presente invención.
"Variante de polipéptido PRO" significa un
polipéptido PRO activo como de definió anteriormente o a
continuación teniendo al menos aproximadamente 80% de la identidad
en la secuencia de aminoácidos con una secuencia nativa de longitud
completa de secuencia de polipéptido PRO como es aquí descrito, una
secuencia de polipéptido PRO que carece del péptido señal como es
aquí descrito, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o
sin el péptido señal, como es aquí descrito o cualquier otro
fragmento de una secuencia de longitud completa de polipéptido PRO
como es aquí descrito. Dichas variantes de polipéptido PRO
incluyen, por ejemplo, polipéptidos PRO donde uno o más residuos
aminoácido se añaden, o se eliminan, en el término N- o C- de la
secuencia nativa de aminoácidos de longitud completa.
Ordinariamente, una variante de polipéptido PRO tendrá al menos
aproximadamente 80% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente al menos aproximadamente 81% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente
82% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente
al menos aproximadamente 83% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 84% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos
aproximadamente 85% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente
87% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente
al menos aproximadamente 88% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 89% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos
aproximadamente 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente
92% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente
al menos aproximadamente 93% de identidad en la secuencia de
aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 94% de
identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos
aproximadamente 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos,
alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad en la
secuencia de aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente
97% de identidad en la secuencia de aminoácidos, alternativamente al
menos aproximadamente 98% de identidad en la secuencia de
aminoácidos y alternativamente al menos aproximadamente 99% de
identidad en la secuencia de aminoácidos a una secuencia nativa de
polipéptido PRO de longitud completa como es aquí descrito, una
secuencia polipéptido PRO que carece de péptido señal como es aquí
descrito, un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin
el péptido señal, como es aquí descrito o cualquier otro fragmento
específicamente definido de una secuencia polipéptido PRO de
longitud completa como es aquí descrito. Ordinariamente, variantes
de polipéptidos PRO son al menos aproximadamente 10 aminoácidos de
longitud, alternativamente al menos aproximadamente 20 aminoácidos
de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 30
aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente
40 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos
aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, alternativamente al
menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, alternativamente
al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud,
alternativamente al menos aproximadamente 80 aminoácidos de
longitud, alternativamente al menos aproximadamente 90 aminoácidos
de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 100
aminoácidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente
150 aminoácidos de longitud, alternativamente al menos
aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, alternativamente al
menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más.
"Porcentaje (%) de identidad en la secuencia
de aminoácidos" respecto a las secuencias polipéptido PRO aquí
identificadas es definido como el porcentaje de residuos aminoácidos
en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos
aminoácidos en una secuencia PRO, después de alinear las secuencias
e introducir separaciones, si fuera necesario, para lograr el
máximo porcentaje de identidad en la secuencia, y no considerando
ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad en la
secuencia. La alineación con propósito de determinar el porcentaje
de identidad en la secuencia de aminoácidos puede lograrse en
diferentes formas que están dentro de las habilidades de la
técnica, por ejemplo, utilizando software para ordenador
públicamente disponible tal como software BLAST,
BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign
(DNASTAR). Aquellos entendidos en la técnica pueden determinar los
parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier
algoritmo necesario para lograr una alineación máxima sobre la
longitud completa de las secuencias que se comparan. Para los
presentes propósitos, sin embargo, valores% de identidad en la
secuencia de aminoácidos son obtenidos como se describe a
continuación utilizando el programa de ordenador de comparación de
secuencia ALIGN-2, donde el código fuente completo
para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla
1. El programa de ordenador de comparación de secuencia
ALIGN-2 cuyo autor es Genentech, Inc., y el código
fuente mostrado en la Tabla 1 se han presentado con documentación
de usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559,
donde está registrado bajo U.S. Copyright Registration No.
TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente
disponible a través de Genentech, Inc., South San Francisco,
California o puede ser compilado a partir del código fuente
proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2
debe ser compilado para el uso en un sistema operativo UNIX,
preferentemente UNIX digital V4.0D. El arco de parámetros de
secuencia es fijado por el programa ALIGN-2 y no
varía.
Para los propósitos aquí presentados, el % de
identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de
aminoácidos dada A respecto a, con, o contra una secuencia de
aminoácidos dada B (que alternativamente puede ser expresados como
una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto
% de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a, con, o
contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como
sigue:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos apuntados como coincidencias idénticas por el programa
de alineación de secuencia ALIGN-2 en la alineación
del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de
aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de la
secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de
aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de aminoácidos de
A respecto B no será igual que el % de identidad en la secuencia de
aminoácidos de B respecto A. Como ejemplos de cálculos de % de
identidad en la secuencia de aminoácidos. Las Tablas
2A-2B demuestran cómo calcular el % de identidad en
la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
designada como "Proteína de comparación" respecto a la
secuencia de aminoácidos designada como
"PRO".
A menos que específicamente se indique otra
cosa, todos los valores de % de identidad en la secuencia de
aminoácidos utilizados aquí son obtenidos como se describió
anteriormente utilizando el programa de ordenador de comparación de
secuencia ALIGN-2. Sin embargo, el % de identidad
en la secuencia de aminoácidos también puede determinarse
utilizando el programa de comparación de secuencia
NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids
Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa de
comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede ser
descargado desde http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
NCBI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de búsqueda,
donde todos aquellos parámetros de búsqueda se ajustan a valores
por defecto incluyendo, por ejemplo, descubierto = sí, cadena =
todo, incidencias esperadas = 10, longitud de baja complejida mínima
= 15/5, valor-e multipase = 0,01, constante para
multipase = 25, caída para alineación separada final = 25 y matriz
de puntuación = BLOSUM62.
En situaciones donde NCBI-BLAST2
se emplea para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de
identidad en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de
aminoácidos dada A respecto a, con, o contra una secuencia de
aminoácidos dada B (que pueden alternativamente expresarse como una
secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto %
de identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a, con, o
contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como
sigue:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos apuntados como coincidencias idénticas mediante el
programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2
donde la alineación del programa de A y B, y donde Y es el número
total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la
longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de
secuencia de aminoácidos B, el % de identidad en la secuencia de
aminoácidos de A respecto a B no será igual al % de identidad en la
secuencia de aminoácidos de B a
A.
Además, % de identidad en la secuencia de
aminoácidos puede también ser determinado utilizando el programa de
ordenador WU-BLAST-2 (Altschul et
al., Methods in Enzymology, 266:460-480
(1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de
WU-BLAST-2 se ajustan a los valores
por defecto. Aquellos no ajustados a los valores por defecto.
por ejemplo, los parámetros ajustables, se ajustan con los
siguientes valores: separación de solapado = 1, fracción de
solapado = 0,125, límite de palabras (T) = 11, y matriz de
puntuación = BLOSUM62. Para los presentes propósitos, un valor % de
identidad en la secuencia de aminoácidos se determina dividiendo
(a) el número de residuos aminoácidos coincidentes idénticos entre
la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés que
tienen una secuencia derivada a partir del polipéptido PRO nativo y
la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (por
ejemplo, la secuencia contra la cual el polipéptido PRO de
interés se compara con el que puede ser una variante de polipéptido
PRO) como se determinó mediante
WU-BLAST-2 por (b) el número total
de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por
ejemplo, en la declaración "un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos A que tiene o teniendo al menos 80% de
identidad en la secuencia de aminoácidos respecto a la secuencia de
aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia
de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de
aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO
de interés.
"Polinucleótido variante PRO" o
"secuencia de ácido nucleico variante PRO" significa una
molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO activo
como se definió a continuación y que tiene al menos aproximadamente
80% de identidad en la secuencia de ácido nucleico con una
secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia nativa de
longitud completa secuencia polipéptido PRO como es aquí
descrita, una secuencia nativa de longitud completa de secuencia de
polipéptido PRO que carece del péptido señal como es aquí descrito,
un dominio extracelular de un polipéptido PRO, con o sin el péptido
señal, como es aquí descrito o cualquier otro fragmento de una
secuencia de polipéptido PRO de longitud completa como es aquí
descrito. Ordinariamente, un polinucleótido variante PRO tendrá al
menos aproximadamente 80% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 81% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 82% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 83% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 84% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 85% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 86% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 87% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 88% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 89% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 90% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 91% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 92% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 93% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 94% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 95% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 96% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos, alternativamente al menos aproximadamente 97% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos, alternativamente al
menos aproximadamente 98% de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos y alternativamente al menos aproximadamente 99% de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de
ácido nucleico que codifica una secuencia nativa de polipéptido
PRO secuencia longitud completa como es aquí descrito, una
secuencia nativa de longitud completa secuencia polipéptido PRO que
carece del péptido señal como es aquí descrito, un dominio
extracelular de un polipéptido PRO, con o sin la secuencia de
señal, como es aquí descrito o cualquier otro fragmento de una
secuencia de longitud completa polipéptido PRO como es aquí
descrito. Las variantes no abarcar la secuencia nativa de
nucleótidos.
nucleótidos.
Normalmente, los polinucleótidos variantes PRO
son de al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud,
alternativamente al menos aproximadamente 60 nucleótidos de
longitud, alternativamente al menos aproximadamente 90 nucleótidos
de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 120
nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente
150 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos
aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, alternativamente al
menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, alternativamente
al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud,
alternativamente al menos aproximadamente 270 nucleótidos de
longitud, alternativamente al menos aproximadamente 300 nucleótidos
de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 450
nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente
600 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos
aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más.
"Por ciento (%) de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos" respecto al polipéptido PRO que codifica las
secuencias de ácido nucleico aquí identificadas se define como el
porcentaje de nucleótidos en una secuencia candidata que son
idénticos con los nucleótidos en un polipéptido PRO que codifica la
secuencia de ácido nucleico, después de alinear las secuencias e
introducir separaciones, si fuera necesario, para lograr el máximo
porcentaje de identidad en la secuencia. La alineación con
propósitos de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos puede lograrse de diferentes maneras que están
dentro de la habilidad de la técnica, por ejemplo, utilizando
software para ordenador públicamente disponible tal come BLAST,
BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o software
Megalign (DNASTAR). Aquellos entendidos en la técnica pueden
determinar los parámetros apropiados para medir la alineación,
incluyendo cualquier algortimo necesario para lograr la máxima
alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se
comparan. Para los presentes propósitos, sin embargo, los valores
de % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos se obtienen
como se describe a continuación utilizando el programa de ordenador
de comparación de secuencia ALIGN-2, donde el código
fuente completo para el programa ALIGN-2 se
proporciona en la Tabla 1. El programa de ordenador de comparación
de secuencia ALIGN-2 cuyo autor es Genentech, Inc.,
y el código fuente mostrado en la Tabla 1 han sido presentadas con
documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington
D.C., 20559, donde está registrado bajo U.S. Copyright Registration
No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está públicamente
disponible a través de Genentech, Inc., South San Francisco,
California o puede compilarse a partir del código fuente
proporcionado en la Tabla 1. El programa ALIGN-2
debe ser compilado para utilizar sobre un sistema operativo UNIX,
preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de
comparación de secuencia son fijados por el programa
ALIGN-2 y no varían.
Para los presentes propósitos, el % de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia dada C de
ácido nucleico respecto a, con, o contra una secuencia dada de ácido
nucleico D (que puede alternativamente ser expresada como una
secuencia ácido nucleico dada C que tiene o comprende un cierto %
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos respecto a, con, o
contra una secuencia de ácido nucleico dada D) se calcula como
sigue:
100 veces la fracción de
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
apuntados como coincidencias idénticas mediante el programa de
comparación de secuencia ALIGN-2 en esta alineación
del programa de C y D, y donde Z es el número total de nucleótidos
en D. Se apreciará que donde la longitud de la secuencia de ácido
nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido
nucleico D, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos
de C respecto a D no será igual que el % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos de D respecto a C. Como ejemplos de
cálculos de % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos. Las
Tablas 2C-2D demuestran cómo calcular el % de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de
ácido nucleico designada "Comparación de ADN" con la secuencia
de ácido nucleico designada
"PRO-ADN".
A menos que se indique específicamente otra
cosa, todos los valores de % de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos utilizados aquí son obtenidos como se describió
anteriormente utilizando el programa de ordenador de comparación de
secuencia ALIGN-2. Sin embargo, % de identidad en la
secuencia de ácidos nucleicos puede también ser determinado
utilizando el programa de comparación de secuencia
NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids
Res., 25:3389-3402 (1997)). El programa de
comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede ser
descargado desde http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda,
donde todos éstos parámetros son fijados como valores por defecto
incluyendo, por ejemplo, descubierto = sí, cadena = todas,
incidencias esperadas = 10, longitud de baja complejidad mínima =
15/5, valor-e multipase = 0,01, constante para
multipase = 25, caída para alineación separada final = 25 y matriz
de puntuación = BLOSUM62.
En situaciones donde
NCBI-BLAST2 se emplea para comparaciones de
secuencias, el % de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos
de una secuencia ácido nucleico dada C respecto a, con, o contra
una secuencia de ácido nucleico dada D (que puede alternativamente
ser expresada como una secuencia de ácido nucleico dada C que tiene
o comprende un cierto % de identidad en la secuencia de ácidos
nucleicos respecto a, con, o contra una secuencia de ácido nucleico
dada D) se calcula como sigue:
100 veces la fracción de
W/Z
donde W es el número de nucleótidos
apuntados como coincidencias idénticas mediante el programa de
alineación de secuencia NCBI-BLAST2 en donde la
alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total de
nucleótidos en D. Se apreciará que donde la longitud de la
secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la
secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad en la secuencia de
ácidos nucleicos de C respecto a D no será igual a la identidad zoo
de secuencia de ácidos nucleicos de D respecto a
C.
Además. Valores 9c de identidad en la secuencia
de ácidos nucleicos también pueden ser generados utilizando el
programa de ordenador WU-BLAST-2
(Altschul et al., Methods in Enzymolosy,
266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de
búsqueda de WU-BLAST-2 se fijan a
los valores por defecto. Aquellos no fijados a los valores por
defecto, por ejemplo, los parámetros ajustables, se fijan
con los siguientes valores: separación de solapado = 1, fracción de
solapado = 0,125, límite de palabras (T) = 11, y matriz de
puntuación = BLOSUM62. Para los presentes propósitos, un valor de %
de identidad en la secuencia de ácidos nucleicos es determinado
dividiendo (a) el número de nucleótidos coincidentes idénticos
entre la secuencia de ácido nucleico del polipéptido PRO que
codifica la molécula de ácido nucleico de interés que tiene una
secuencia derivada a partir de la secuencia nativa del polipéptido
PRO que codifica el ácido nucleico y la comparación de la molécula
de ácido nucleico de interés (por ejemplo, la secuencia
contra la cual el polipéptido PRO que codifica molécula de ácido
nucleico de interés está siendo comparada que puede ser una
variante de polinucleótido PRO) según se determinó mediante
WU-BLAST-2 a través de (b) el número
total de nucleótidos del polipéptido PRO que codifica la molécula
de ácido nucleico de interés. Por ejemplo, en la declaración "una
molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de
ácido nucleico A que tiene o teniendo al menos 80% de identidad
en la secuencia de ácidos nucleicos respecto a la secuencia de
ácido nucleico B", la secuencia de ácido nucleico A es la
molécula de comparación de ácido nucleico de interés y la secuencia
de ácido nucleico B es la secuencia de ácido nucleico del
polipéptido PRO que codifica la molécula de ácido nucleico de
interés.
En otras realizaciones, polinucleótidos
variantes PRO son moléculas de ácido nucleico que codifican un
polipéptido PRO activo y que son capaces de hibridar,
preferentemente bajo condiciones de hibridación y lavado rigurosas,
a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido PRO de
longitud completa mostrado en las figuras adjuntas. Polipéptidos
variantes PRO pueden ser aquellos que son codificados por un
polinucleótido variante PRO.
El término "positivos", en el contexto de
las comparaciones de identidad en la secuencia de aminoácidos
realizada como se describió anteriormente, incluye residuos de
aminoácidos en las secuencias comparadas que no son sólo idénticas,
sino también aquellas que tienen propiedades similares. Los
residuos de aminoácidos que puntúan un valor positivo para un
residuo de aminoácido de interés son aquellos que ya sean idénticos
al residuo aminoácido de interés o son una sustitución preferida
(como se define en la Tabla 3 a continuación) del residuo aminoácido
de interés.
Para los presentes propósitos, el valor % de
positivos de una secuencia de aminoácidos dada A respecto a, con, o
contra una secuencia de aminoácidos dada B (que puede
alternativamente ser expresada como una secuencia de aminoácidos
dada A que tiene o comprende un cierto % de positivos respecto a,
con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como
sigue:
100 veces la fracción de
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos que puntúa un valor positivo como se definió con
anterioridad mediante el programa de alineación de secuencia
ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y
donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se
apreciará que donde la longitud de secuencia de aminoácidos A no es
igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el % de
positivos de A respecto a B no será igual al % de positivos de B
respecto a
A.
"Aislado," cuando se utiliza para describir
los distintos polipéptidos aquí descritos, significa un polipéptido
que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un
componente de su ambiente natural. Preferentemente, el polipéptido
aislado está libre de asociación con todos los componentes con los
cuales está naturalmente asociado. Los componentes contaminantes
de su ambiente natural son materiales que típicamente interferirían
con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y
puede incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no
proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido será
purificado (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15
residuos de N-terminal o secuencia interna de
aminoácidos mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o
(2) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo
condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul Coomassie o,
preferentemente, coloración plata. El polipéptido aislado incluye
el polipéptido in situ dentro de células recombinantes, ya
que al menos un componente del ambiente natural de PRO no estará
presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado será
preparado al menos mediante una etapa de purificación.
Una molécula "aislada" de ácido nucleico
que codifica un polipéptido PRO o un ácido nucleico "aislado"
que codifica un anticuerpo anti-PRO, es una molécula
de ácido nucleico que es identificada y separada de al menos una
molécula contaminante de ácido nucleico con la cual está
ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que
codifica PRO o el ácido nucleico que codifica
anti-PRO. Preferentemente, el ácido nucleico
aislado está libre de asociación con todos los componentes con los
cuales está naturalmente asociado. Una molécula de ácido nucleico
aislada que codifica PRO o una molécula de ácido nucleico que
codifica anti-PRO es otro diferente en la forma o
ajuste en el cual esta se encuentra en la naturaleza. Moléculas
aisladas de ácido nucleico por lo tanto son distinguidas de la
molécula de ácido nucleico que codifica PRO o la molécula de ácido
nucleico que codifica anti-PRO como existe en
células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico
aislada que codifica un polipéptido PRO o una molécula de ácido
nucleico aislada que codifica un anticuerpo
anti-PRO incluye moléculas de PRO-ácido nucleico o
moléculas anti-PRO-ácido nucleico contenidas en
células que ordinariamente expresa polipéptidos PRO o expresa
anticuerpos anti-PRO donde, por ejemplo, la
molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica
diferente de aquella de las células naturales.
El término "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia de codificación operativamente ligada en un organismo
huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas
para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente
una secuencia operador, y un sitio de unión de ribosoma. Se conoce
que las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación, y mejoradores.
Un ácido nucleico está "operativamente
ligado" cuando es colocado en una relación funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o guía secretoria está operativamente ligado al ADN
para un polipéptido si está expresado como una preproteína que
participa en la secreción del polipéptido: un promotor o mejorador
está operativamente ligado a una secuencia de codificación si esta
afecta la transcripción de la secuencia: o un sitio de unión del
ribosoma está operativamente ligado a una secuencia de codificación
se está posicionado de forma de facilitar la traducción.
Generalmente, "operativamente ligado" significa que las
secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de una
guía de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los
mejoradores no tienen que ser contiguos. La unión se consigue
mediante el ligado en sitios de restricción convenientes. Si dichos
sitios no existen, los oligonucleotidos adaptores o enlazadores
sintéticos se utilizan según la práctica convencional.
El término "anticuerpo" se utiliza en el
sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales individuales anti-PRO (incluyendo
antagonista, y anticuerpos neutralizantes), composiciones de
anticuerpo anti-PRO con especificidad
poliepitópica, anticuerpos anti-PRO de cadena única,
y fragmentos de anticuerpos anti-PRO (ver a
continuación). El término "monoclonal anticuerpo" como se
utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una
población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por
ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la
población son idénticos excepto por posibles mutaciones producidas
naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores.
"Rigurosidad" de las reacciones de
hibridación es fácilmente determinable por un experto en la materia,
y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de
la sonda, temperatura de lavado, y concentración de sal. En general,
sondas más largas requieren temperaturas más altas para un recocido
adecuado, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más
bajas. La hibridación generalmente depende de la habilidad del ADN
desnaturalizado para re-recocer cuando están
presentes filamentos complementarios en un ambiente por debajo de su
temperatura de fusión. A más alto el grado de homología deseado
entre la sonda y la secuencia hibridable, más alta la temperatura
relativa que puede ser utilizada. Como resultado, sigue que
temperaturas relativas más altas tenderían a hacer las condiciones
de la reacción más rigurosas, mientras temperaturas menores serían
menos. Para detalles adicionales y explicación de la rigurosidad de
las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,
(1995).
"Condiciones rigurosas" o "condiciones
de alta rigurosidad", como se definen aquí, pueden ser
identificadas mediante aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica
y alta temperatura para lavar, por ejemplo 0,015 M cloruro de
sodio/0,001 5 M citrato de sodio /0,1% sodio dodecil sulfato a
50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante,
tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) formamida con 0,1%
albúmina de suero bovino/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM
tampón sodio fosfato a pH 6,5 con 750 mM cloruro de sodio, 75 mM
sodio citrato a 42ºC; o (3) emplean 50% formamida, 5 x SSC (0,75 M
NaCl, 0,075 M sodio citrato), 50 mM sodio fosfato (pH 6,8), 0,1%
sodio pirofosfato. 5 x solucion de Denhardt, ADN sonicado de
esperma de salmón (50 \mug/ml), 0,1% SDS, y 10% dextrano sulfato a
42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (sodio cloruro/sodio citrato)
y 50% formamida a 55ºC, seguido por un lavado de alta rigurosidad
consistente en 0,1 x SSC que contienen EDTA a 55ºC.
"Condiciones moderadamente rigurosas"
pueden ser identificadas como se describe en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring
Harbor Press. 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y
condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza
iónica y% SDS) menos rigurosas que aquellas descritas anteriormente.
Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es incubación
durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: 20%
formamida, 5 x SSC (150 mM NuCl. 15 mM trisodiumcitrato), 50 mM
sodio fosfato (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, 10% sulfato de
dextrano, y 20 mg/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado
separado, seguido por lavado de los filtros en I x SSC a
aproximadamente 35ºC-50ºC. El operario entendido
reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc. según
sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sonda y
similares.
El término "marcar con marcador de epítope"
cuando se utiliza aquí se refiere a un polipéptido quimérico que
comprende un polipéptido PRO fusionado a un "polipéptido
marcador". El polipéptido marcador tiene suficientes residuos
para proporcionar un epítope contra el cual puede hacerse un
anticuerpo, aunque es suficientemente corto para que no interfiera
con la actividad del polipéptido al cual se fusiona. El polipéptido
marcador también preferentemente es bastante único de forma tal que
el anticuerpo sustancialmente no tiene una reacción cruzada con
otros epítopes. Los polipéptidos marcador adecuados generalmente
tienen al menos seis residuos de aminoácidos y usualmente entre
aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferentemente,
entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos).
"Activo" o "actividad" para los
presentes propósitos se refiere a forma(s) de polipéptidos
PRO que retienen una actividad/propiedad biológica y/o
inmunológica de un polipéptido PRO nativo o naturalmente producido,
donde actividad "biológica" se refiere a una función (tanto
inhibidora o estimuladora) causada por un polipéptido PRO nativo o
producido naturalmente distinta de la habilidad de inducir la
producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por
un polipéptido PRO nativo o producido naturalmente y una actividad
"inmunológica" se refiere a la habilidad de inducir la
producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por
un polipéptido PRO nativo o producido naturalmente.
"Actividad biológica" en el contexto de un
anticuerpo u otra molécula antagonista que puede ser identificada
por los ensayos de investigación aquí descrito (por ejemplo,
una pequeña molécula orgánica o inorgánica, péptido, etc.) se
utiliza para referirse a la habilidad de dichas moléculas a unirse
o acomplejarse con los polipéptidos codificados por los genes
amplificados aquí identificados, o de otra manera interfieren con
la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas
celulares o de otra manera interfieren con la transcripción o
traducción de un polipéptido PRO. Una actividad biológica preferida
es la inhibición del crecimiento de una célula de tumor objetivo.
Otra actividad biológica preferida es la actividad citotóxica que
resulta en la muerte de la célula de tumor objetivo.
El término "actividad biológica" en el
contexto de un polipéptido PRO significa la habilidad de un
polipéptido PRO para inducir el crecimiento celular neoplásico o
crecimiento celular incontrolado.
La frase "actividad inmunológica" significa
reactividad inmunológica cruzada con al menos un epítope de un
polipéptido PRO.
"Reactividad inmunológica cruzada" como se
utiliza aquí significa que el polipéptido candidato es capaz de
inhibir competitivamente la actividad biológica cualitativa de un
polipéptido PRO que tiene esta actividad con antisuero policlonal
elevada contra el Polipéptido PRO activo conocido. Dichos antisueros
son preparados en forma convencional inyectando cabras o conejos,
por ejemplo, subcutáneamente con el análogo activo conocido en
adyuvante de Freund completo, seguido por inyección de refuerzo
intraperitoneal o subcutánea en Freund incompleto. La reactividad
inmunológica cruzada preferentemente es "específica", que
significa que la afinidad de unión de la molécula inmunológicamente
reactivas cruzadas (por ejemplo, anticuerpo) identificada, al
correspondiente polipéptido PRO es significativamente más alta
(preferentemente al menos aproximadamente 2 veces, más
preferentemente al menos aproximadamente 4 veces, aún más
preferentemente al menos aproximadamente 8 veces, más
preferentemente al menos aproximadamente 10 veces más alta) que la
afinidad de unión de aquella molécula a cualquier otro polipéptido
nativo conocido.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido amplio, e incluye cualquier molécula que parcial o
completamente bloquee, inhiba, o neutralice una actividad biológica
de un polipéptido PRO nativo aquí descrito o la transcripción o
traducción del mismo. Moléculas antagonistas específicamente
adecuadas incluyen anticuerpos antagonistas o fragmentos de
anticuerpo, fragmentos, péptidos, pequeñas moléculas orgánicas,
ácido nucleicos antisentido, etc. Se incluyen métodos para
identificar antagonistas de un polipéptido PRO con una molécula
antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más
actividades biológicas normalmente asociada con el polipéptido
PRO.
Una "pequeña molécula" se define aquí como
teniendo un peso molecular por debajo de aproximadamente 500
Daltons.
"Anticuerpos" (Abs) e
"inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tiene las
mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos
exhiben especificidad de unión a un antígeno específico, las
inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas a
modo de anticuerpo que carecen de especificidad de antígeno.
Polipéptidos del último tipo son, por ejemplo, producidos a bajos
niveles mediante el sistema linfático y en niveles incrementados por
los mielomas. El término "anticuerpo" es usado en el sentido
amplio y cubre específicamente, sin limitación, anticuerpos
monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos
multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos)
formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y los
fragmentos de anticuerpo en tanto exhiban la actividad biológica
deseada.
"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas
nativas" son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de
aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas livianas
idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena
liviana está unida a una cadena pesada mediante un enlace covalente
disulfuro, mientras que el número de uniones disulfuro varía entre
las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada
cadena pesada y liviana también tiene puentes disulfuro intracadena
regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un
dominio variable (V_{H}) seguido por un número de dominios
constantes. Cada cadena liviana tiene un dominio variable en un
extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el
dominio constante de la cadena liviana está alineado con el primer
dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la
cadena liviana está alineado con el dominio variable de la cadena
pesada. Se cree que residuos particulares de aminoácidos forman una
interfaz entre los dominios variables de cadena liviana y
pesada.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas porciones de los dominios variables difieren
extensivamente en secuencia entre anticuerpos y son usados en la
unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno
particular. Sin embargo, la variabilidad no está uniformemente
distribuida entre los dominios variables de los anticuerpos. Está
concentrada en tres segmentos llamados regiones determinantes de
complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables tanto en los
dominios variables de cadena liviana y de cadena pesada. Las
porciones más altamente conservadas de los dominios variables son
llamadas las regiones marco (FR). Los dominios variables de cadenas
pesadas y livianas nativas cada una comprende cuatro regiones FR,
en gran parte adoptando una configuración en hoja \beta,
conectada mediante tres CDRs, que forman bucles que conectan, y en
algunos casos forman parte de, la estructura de hoja \beta. Los
CDRs en cada cadena se sostienen juntos en cercana proximidad
mediante las regiones FR y, con los CDRs de la otra cadena,
contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de los
anticuerpos (ver, Kabat et al., NIH Publ.
No.91-3242, Vol. I, páginas
647-669(1991)). Los dominios constantes no
están directamente implicados en unir un anticuerpo a un antígeno,
pero exhiben varias funciones determinantes, tales como
participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del
anticuerpo.
El término "región hipervariable" cuando
se utiliza aquí se refiere a los residuos de aminoácidos de un
anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región
hipervariable comprende residuos de aminoácidos a partir de una
"región determinante de complementariedad" o "CDR" (por
ejemplo, residuos 24-34 (L1),
50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el
dominio variable de cadena liviana y 31-35 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el
dominio variable de cadena pesada; Karat et al., Sequences
of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health
Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. [1991]) y/o
aquellos residuos a partir de un "bucle hipervariable" (por
ejemplo, residuos 26-32 (L1),
50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el
dominio variable de cadena liviana y 26-32 (H1),
53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el
dominio variable de cadena pesada; Clothia and Lesk. J. Mol. Biol.,
196:901-917 [1987]). Residuos "marco" o
"FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los
residuos de la región hipervariable como se definen aquí.
"Fragmentos de anticuerpos" comprenden una
porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de
unión de antígeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de
fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2}, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata
et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062
[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos
multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión con papaína de anticuerpos produce
dos fragmentos idénticos de unión de antígeno, llamados fragmentos
"Fab", cada uno con un único sitio de unión de antígeno, y un
fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su habilidad para
cristalizar rápidamente. El tratamiento con pepsina produce un
fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación
de antígeno y aún es capaz de unión cruzada con el antígeno.
"Fv" son los fragmentos mínimos de
anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión
completo de antígeno. Esta región consiste en un dímero de una
cadena pesada y una cadena liviana de dominio variable en asociación
apretada, no covalente. Es en esta configuración que los tres CDRs
de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión
de antígeno sobre la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. Colectivamente, los seis CDRs
confieren especificidad de unión del antígeno al anticuerpo. Sin
embargo, aún un único dominio variable (o la mitad de un Fv que
comprende sólo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la
habilidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad
menor que el sitio de unión entero.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos
Fab' mediante la adición de unos pocos residuos en el término
carboxi terminus del dominio de la cadena pesada CH I incluyendo una
o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es aquí la designación para Fab' en el que
el residuo(s) cisteína de los dominios constantes soporta un
grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpos F(ab')_{2}
originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab' que
tienen bisagras cisteínas entre ellos. Otros acoplamientos químicos
de fragmentos de anticuerpos también son conocidos.
Las "cadenas livianas" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden ser
asociadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa
(\kappa) y lambda (\lambda), basados en la secuencia de
aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden ser asignadas a diferentes clases. Hay cinco clases
principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, y
varias de éstas pueden ser adicionalmente divididas en subclases
(isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, y
IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a
las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamadas \alpha,
\delta, \varepsilon, \gamma, y \mu, respectivamente. Las
estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de
diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
El término "anticuerpo monoclonal" como se
utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población
de anticuerpos sustancialmente homogéneos, por ejemplo, los
anticuerpos individuales que comprende la población son idénticas
excepto por posibles mutaciones producidas naturalmente que pueden
estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales
son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio
antigénico. Además, en contraste con preparaciones convencionales de
anticuerpos (policlonal) que típicamente incluyen diferentes
anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes),
cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un único determinante
sobre el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos
monoclonales son ventajosos en que son sintetizados mediante el
cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El
modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como
siendo obtenido de una población sustancialmente homogénea de
anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del
anticuerpo mediante cualquier método particular. Por ejemplo, los
anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente
invención pueden hacerse mediante el método del hibridoma primero
descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 [1975], o pueden
hacerse mediante métodos de ADN recombinante (ver, por
ejemplo, Patente U.S. No. 4.816.567). Los "anticuerpos
monoclonales" también pueden ser aislados a partir de
bibliotecas de anticuerpos fagos utilizando las técnicas descritas
en Clackson et al., Nature, 352:624-628 y
Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597
(1991), por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales aquí incluyen
específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en
los que una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica a u
homóloga a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados
a partir de una especie particular o pertenecientes a una clase o
subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la
cadena(s) es idéntica a u homóloga a las correspondientes
secuencias en anticuerpos derivados a partir de otras especies o
pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como
fragmentos de dichos anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad
biológica deseada (Patente U.S. No. 4.816.567: Morrison et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855
[1984]).
Formas "humanizada" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murina) son inmunoglobulinas
quiméricas, cadenas inmunoglobulina o fragmentos de la misma (tales
como Fv. Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de
unión de antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia
mínima derivada a partir de no inmunoglobulina humana. Para la mayor
parte, anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en el cual los residuos de un CDR del receptor
son reemplazados por residuos a partir de un CDR de una especie no
humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tiene
la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos
ejemplos, residuos Fv FR de la inmunoglobulina humana son
reemplazados por correspondientes residuos no humanos. Además, los
anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se
encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR
importado o marco. Estas modificaciones se realizan para refinar y
maximizar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En
general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos
de al menos un, y típicamente dos, dominios variables, en el cual
todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponde a
aquellos de una no inmunoglobulina humana y todas o sustancialmente
todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de
inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente
también comprenderá al menos una porción de una región
inmunoglobulina constante (Fc), típicamente aquella de una
inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver, Jones et
al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et
al., Nature, 332:323-329 [1988]; y Presta, Curr.
Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). El anticuerpo
humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED^{TM} donde la región
del anticuerpo de unión del antígeno es derivada a partir de un
anticuerpo producido mediante la inmunización de monos macacos con
el antígeno de interés.
Fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena
única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del
anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una única
cadena de polipéptido. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende
además un polipéptido de enlace entre los dominios V_{H} y
V_{L} que permite al sFv formar la estructura deseada para la
unión del antígeno. Para una revisión de sFv ver, Pluckthun
en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,, vol. 113, Rosenburg
and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.
269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a
pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión de
antígeno, dichos fragmentos comprenden un dominio variable de
cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena
liviana (V_{L}) en la misma cadena de polipéptido
(V_{H}-V_{L}). Mediante el uso de un enlace que
es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos
dominios sobre la misma cadena, los dominios son forzados a
emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear
dos sitios de unión de antígeno. Los diacuerpos son descritos de
forma más completa en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido
identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de
su ambiente natural. Componentes contaminantes de su ambiente
natural son materiales que interferirían con usos de diagnóstico o
terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas,
hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En
realizaciones preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más
del 95% en peso del anticuerpo como se determinó por el método de
Lowry, y más preferentemente más de 99% en peso, (2) a un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos de
N-terminal o secuencia interna de aminoácidos
mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (3) hasta
homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones
reductoras o no reductoras usando azul Coomassie o, preferentemente,
tinte de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in
situ dentro de células recombinantes dado que al menos un
componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente.
Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado
mediante al menos una etapa de purificación.
La palabra "marcador" cuando se utiliza
aquí se refiere a un compuesto o composición detectable que es
conjugado directamente o indirectamente al anticuerpo de forma de
generar un anticuerpo "marcador". El marcador puede ser
detectable por sí misma (por ejemplo, marcadores
radioisótopo o marcadores fluorescentes) o, en el caso de una
marcador enzimática, puede catalizar la alteración química de un
compuesto o composición substrato que es detectable. Radionucleidos
que pueden servir como marcadores detectables incluyen, por ejemplo,
I-131, I-123, I-125,
Y-90, Re-188,
Re-186, At-21 1,
Cu-67, Bi-212, y
Pd-109. El marcador también puede ser una entidad no
detectable tal como una toxina.
Mediante "fase sólida" se indica una matriz
no acuosa a la cual el anticuerpo de la presente invención puede
adherirse. Ejemplos de fase sólidas abarcadas aquí incluyen aquellas
formadas parcialmente o completamente de vidrio (por
ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por
ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, polistireno, polivinil
alcohol y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del
contexto, la fase sólida puede comprender el pozo de una placa de
ensayo; en otros es una columna de purificación (por
ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término
también incluye una fase sólida discontinua de partículas
discretas, tales como aquellas descritas en la Patente U.S. No.
4.275.149.
Una "liposoma" es una pequeña vesícula
compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes
que es útil para el suministro de un fármaco (tal como un
polipéptido PRO o anticuerpo al mismo y, opcionalmente, un agente
quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma son
comúnmente dispuestos en una formación bicapa, similar a la
disposición de los lípidos en las membranas biológicas.
Como se utiliza aquí, el término
"inmunoadhesina" designa moléculas a modo de anticuerpos que
combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una
"adhesina") con las funciones determinantes de los dominios
constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas
comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la
deseada especificidad de unión que es otra que la del
reconocimiento de antígeno y sitio de unión de un anticuerpo
(por ejemplo, es "heteróloga"), y una secuencia de
inmunoglobulina de dominio constante. La parte adhesina de una
molécula inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos
contigua que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o
un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en
la inmunoadhesina puede ser obtenida de cualquier inmunoglobulina,
tal como IgG-1, IgG-2,
IgG-3, o IgG-4 subtipos, IgA
(incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD
o IgM.
Como se muestra a continuación, la Tabla I
proporciona el código fuente completo para el programa de ordenador
de comparación de secuencia ALIGN-2. Este código
fuente puede ser rutinariamente compilado para el uso sobre un
sistema operativo UNIX para proporcionar el programa de ordenador
de comparación de secuencia ALIGN-2.
Además, las Tablas 2A-2D
muestran hipotéticas ejemplificaciones para utilizar el método
descrito a continuación para determinar % de identidad en la
secuencia de aminoácidos (Tablas 2A-2B) y % de
identidad en la secuencia de ácidos nucleicos (Tablas
2C-2D) usando el programa de ordenador de
comparación de secuencia ALIGN-2, donde "PRO"
representa la secuencia de aminoácidos de un hipotético
polipéptido PRO de interés. "Proteína de comparación"
representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el
cual el polipéptido de interés "PRO" está siendo comparado,
"PRO-ADN" representa un hipotético PRO que
codifica la secuencia de ácido nucleico de interés, "ADN de
comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una
molécula de ácido nucleico contra la cual la molécula de ácido
nucleico "PRO-ADN" de interés está siendo
comparado, "X", "Y", y "Z" representa cada una un
hipotético residuos de aminoácidos diferentes y "N", "L"
y "V" cada uno representa hipotéticos diferentes
nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La presente solicitud describe secuencias de
nucleótidos recientemente identificadas y aisladas que codifican
polipéptidos referidos en la presente solicitud como polipéptidos
PRO. En particular, ADNc que codifica polipéptidos PRO han sido
identificado y aislado, como se describe con detalle adiciona en los
Ejemplos a continuación. Se observa que las proteínas producidas en
vueltas de expresión separadas pueden ser dadas diferentes números
PRO pero el número UNQ es único para cualquier ADN dado y las
proteínas codificadas, y no será cambiado. Sin embargo, por motivos
de simplicidad, en la presente especificación de proteínas
codificadas por las aquí descritas secuencias de ácidos nucleicos
así como todos los homólogos nativos y variantes adicionales
incluidas en la definición precedente de polipéptidos PRO serán
referidas como "PRO" indistintamente de su origen o modo
de
preparación.
preparación.
Como se describe en los Ejemplos a continuación,
clones de ADNc se han depositado en el ATCC. La secuencia de
nucleótidos real de los clones puede ser fácilmente determinada por
el operario entendido mediante el secuenciado del clon depositado
utilizando métodos rutinarios en la técnica. La secuencia de
aminoácidos predicha puede ser determinada a partir de secuencias
de nucleótidos utilizando habilidad de rutina. Para los
polipéptidos PRO y el ácido nucleico que codifica aquí descrita.
Los solicitantes han identificado lo que se cree que son los marcos
de lectura mejor identificables con la información de la secuencia
disponible en el momento.
Además de los polipéptidos PRO de secuencia
nativa de longitud completa aquí descritos, se contempla que puedan
prepararse variantes del polipéptido PRO. Variantes del polipéptido
PRO pueden prepararse introduciendo cambios de nucleótidos
apropiados en el PRO ADN y/o mediante síntesis del polipéptido PRO
deseado. Aquellos entendidos en la técnica apreciarán que cambios
de aminoácidos pueden alterar los procesos posteriores a la
traducción del polipéptido PRO, tal como cambiar el número o
posición de los sitios de glicosilación o alterar las
características de anclaje de la membrana.
Variaciones en la secuencia del polipéptido PRO
nativo de longitud completa o en varios dominios del polipéptido
PRO aquí descrito, pueden hacerse, por ejemplo, usando cualquiera
de las técnicas y pautas para mutaciones conservadoras y no
conservadoras dispuestas, por ejemplo, en la Patente U.S. No.
5.364.934. Variaciones pueden ser una sustitución, supresión o
inserción de uno o más codones que codifican el polipéptido PRO que
resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido
PRO en comparación con la secuencia nativa del polipéptido PRO.
Opcionalmente la variación es mediante sustitución de al menos un
aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los
dominios del polipéptido PRO. La guía para determinar qué residuo
aminoácido puede ser insertado, sustituido o suprimido sin afectar
adversamente la actividad deseada puede encontrarse comparando la
secuencia del polipéptido PRO con aquella de las moléculas de
proteína homóloga conocida y minimizando el número de cambios de
secuencia de aminoácidos hechos en regiones de alta homología.
Sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar
un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades
estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de
una leucina con una serina, por ejemplo, reemplazos de
aminoácido conservadores. Inserciones o supresiones pueden
opcionalmente estar en el rango de aproximadamente 1 a 5
aminoácidos. La variación permitida puede ser determinada mediante
la realización sistemática de inserciones, supresiones o
sustituciones deaminoácidos en la secuencia y probando las variantes
resultantes por su actividad exhibida por la longitud completa o
secuencia nativa madura.
Se proporcionan aquí fragmentos de polipéptido
PRO. Dichos fragmentos pueden ser truncados en el término N o el
término C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo,
cuando se comparan con una proteína nativa de longitud completa.
Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son
esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido
PRO.
Fragmentos del polipéptido PRO pueden ser
preparados por cualquiera de un número de técnicas convencionales.
Fragmentos de péptidos deseados pueden ser químicamente
sintetizados. Una aproximación alternativa implica generar
fragmentos de polipéptido PRO mediante digestión enzimática, por
ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida por
separar proteínas en sitios definidos mediante residuos particulares
de aminoácidos, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción
adecuadas y aislando el fragmento deseado. Otra técnica adecuada
implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un
fragmento de polipéptido deseado, mediante reacción de cadena
polimerasa (PCR). Oligonucleótidos que definen los términos deseados
del fragmento de ADN son empleados en los iniciadores 5' y 3' en el
PCR. Preferentemente, los fragmentos de polipéptido PRO comparten
al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido
PRO nativo.
En realizaciones particulares, son mostradas
sustituciones conservadoras de interés en la Tabla 3 bajo el
encabezado de sustituciones preferidas. Si dichas sustituciones
resultan en un cambio en la actividad biológica, se introducen
entonces cambios más substanciales, denominados sustituciones
ejemplares en la Tabla 3, o como se ha descrito adicionalmente a
continuación en referencia a clases de aminoácido, y los productos
son ensayados.
\vskip1.000000\baselineskip
Modificaciones sustanciales en la función o
identidad inmunológica del polipéptido se consiguen mediante la
selección de sustituciones que difieren significativamente en sus
efectos en mantener (a) la estructura de la estructura central del
polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una
conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de
la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena
lateral. Residuos producidos naturalmente son divididos en grupos
basados en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofóbicos: norleucine, met, ala, val,
leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influencian la orientación de
la cadena: gly, pro: y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán
intercambiar un elemento de una de estas clases por otra clase.
Dichos residuos sustituidos también pueden ser introducidos en los
sitios de sustitución conservadora o, más preferentemente, en los
sitios restantes (no conservados).
Las variaciones pueden hacerse usando métodos
conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por
oligonucleótidos (dirigida al sitio), exploración de alanina, y
mutagénesis PCR. La mutagénesis dirigida al sitio [Carter et
al., Nuct. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al.,
Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis cassette [Wells et
al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección de
restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London
SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden ser
realizadas sobre el ADN clonado para producir el ADN variante
PRO.
El análisis de exploración de aminoácido también
puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos a lo largo
de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración
preferidos están aminoácidos relativamente pequeños, neutros.
Dichos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína.
Alanina es típicamente un aminoácido preferido de exploración entre
este grupo grupo porque elimina la cadena lateral más allá del
carbono beta y es menos probable alterar la conformación de la
cadena principal de la variante [Cunningham and Wells, Science,
244: 1081-1085 (1989)]. Alanina es también
típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además,
es encontrado con frecuencia tanto en posiciones enterradas como
expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.);
Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución por
alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede
utilizarse un aminoácido isotérico.
También aquí son descritas modificaciones
covalentes del polipéptido PRO. Un tipo de modificación covalente
incluye reaccionar residuos objetivos de aminoácidos de un
polipéptido PRO con un agente derivatizador orgánico que es capaz
de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N-
o C- terminal del polipéptido PRO. La derivatización con agentes
bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular el polipéptido
PRO a una matriz de soporte insoluble en agua o superficie para
utilizar en el método para purificar los anticuerpos
anti-PRO, y vice-versa. Los agentes
de reticulación comúnmente utilizados incluyen. por ejemplo,
1.1-bis(diazoaceril)-2-feniletano,
glutaraldehído. ésteres N-hidroxisuccinimida, por
ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicilico,
imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidil
tales como
3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato),
maleimidas bifuncionales tales como
bis-N-maleimido-1,8-octane
y agentes tales como
metil-3-[(p-azidofenil)
ditio]propioimidato.
Otras modificaciones incluyen desamidación de
residuos glutaminil y asparaginil a los correspondientes residuos
glutamil y aspartil, respectivamente, hidroxilación de prolina y
lisina, fosforilación de grupos hidroxil de residuos seril o
treonil, metilación de los grupos \alpha-amino de
cadena laterales de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton.
Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co.
San Francisco. pp. 79-86 (1983)], acetilación de la
amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo
carboxil C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido PRO comprende alterar el patrón nativo de
glicosilación del polipéptido. "Alterar el patrón nativo de
glicosilación" se utiliza para los presentes propósitos
significando suprimir una o más mitades carbohidrato encontradas en
la secuencia nativa de polipéptidos PRO (tanto mediante la
extracción del sitio de glicosilación subyacente o mediante la
supresión de la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos),
y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes
en la secuencia nativa del polipéptido PRO. Además, la frase
incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas
nativas, implicando un cambio en la naturaleza y proporciones de las
diferentes mitades carbohidrato presentes.
La adición de sitios de glicosilación al
polipéptido PRO puede conseguirse alterando la secuencia de
aminoácidos. La alteración puede hacerse, por ejemplo, mediante la
adición de, o sustitución mediante, uno o más residuos serina o
treonina a la secuencia nativa del polipéptido PRO (para sitios de
glicosilación enlazados con O). La secuencia de aminoácidos PRO
puede opcionalmente ser alterada a través de cambios a nivel de
ADN, particularmente mediante mutación del ADN que codifica al
polipéptido PRO en bases preseleccionadas de forma tal que son
generados codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otros medios de incrementar el número de mitades
carbohidrato en el polipéptido PRO es mediante acoplamiento químico
o enzimático de glicósidos al polipéptido. Dichos métodos son
descritos en la técnica, por ejemplo, en WO 87/05330
publicado 11 Septiembre 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev.
Biochem., pp. 259-306(1981).
La extracción de mitades de carbohidrato
presentes en el polipéptido PRO puede conseguirse químicamente o
enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que
codifican los residuos de aminoácidos que sirven como objetivos
para la glicosilación. Técnicas químicas de deglicosilación son
conocidas en la técnica y descritas, por ejemplo, por Hakimuddin,
et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge
et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). División enzimática
de mitades carbohidrato en polipéptidos puede lograrse mediante el
uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como
está descrito por Thotakura et al., Meth, Enzymol., 138:350
(1987).
Otro tipo de modificación covalente de
polipéptidos PRO comprende enlazar el polipéptido PRO a uno de una
variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo,
polietilen glicol (PEG), polipropilen glicol, o polioxialkilenos,
en la forma establecida en las Patentes U.S. Nos. 4.640.835;
4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.
Los polipéptidos PRO también pueden ser
modificados de manera de formar una molécula quimérica que
comprende el polipéptido PRO fusionado a otro, polipéptido
heterólogo o secuencia de aminoácidos.
En una realización, dicha molécula quimérica
comprende una fusión del polipéptido PRO con un polipéptido
marcador que proporciona un epítope al cual puede unirse
selectivamente un anticuerpo anti-marcador. El
epítope marcador generalmente se coloca en el término
amino-o carboxil del polipéptido PRO. La presencia
de dichas formas epítope marcado del polipéptido PRO puede
detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido marcador.
También, la provisión del epítope marcador permite que el
polipéptido PRO sea fácilmente purificado mediante purificación por
afinidad usando un anticuerpo anti-marcador u otro
tipo de matriz de afinidad que se une al epítope marcador. Varios
polipéptidos marcador y sus respectivos anticuerpos son bien
conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen marcadores
poli-histidina (poli-His) o
poli-histidina-glicina
(poli-His-gli); el polipéptido
marcador flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol.
Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; el marcador
c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10. G4, B7 y
9E10 del mismo [Evan et al., Molecular and Cellular Biology,
5:3610-3616 (1985)]: y el marcador glicoproteina D
del virus Herpes Simplex (gD) y su anticuerpo [Paborsky et
al., Protein Engineering, 3(6):547-553
(1990)]. Otros polipéptidos marcador incluyen el péptido Flag
[Hopp et al., BioTechnology,
6:1204-1210(1988)]; el péptido epítope KT3
(Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)];
un péptido epítope \alpha-tubulina [Skinner et
al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y
el péptido marcador gen T7 proteína 10
[Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula
quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina.
Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida
como "inmunoadhesina"), dicha fusión puede ser a la región Fc
de una molécula IgG. Las fusiones Ig preferentemente incluyen la
sustitución de una forma soluble (dominio suprimido transmembrana o
inactivo) de un polipéptido PRO en lugar de al menos una región
variable dentro de una molécula Ig. En una realización
particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye la
bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, CH1, CH2 y CH3 regiones de una
molécula IgG I. Para la producción de fusiones de inmunoglobulina
ver también, Patente U.S. No. 5.428.130 publicada Junio 27,
1995.
La descripción a continuación se refiere
primariamente a la producción de polipéptidos PRO mediante el
cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que
contiene el ácido nucleico PRO. Se contempla, por supuesto, que
métodos alternativos, que son bien conocidos en la técnica, pueden
ser empleados para preparar polipéptidos PRO. Por ejemplo, la
secuencia del polipéptido PRO, o porciones de la misma, pueden ser
producidos mediante síntesis directa de péptido utilizando técnicas
de fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart et al.,
Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San
Francisco. CA (1969): Merrifield. J. Am. Chem. Soc.,
85:2149-2154 (1963)]. La síntesis de proteína in
vitro puede ser realizada utilizando técnicas manuales o
mediante automatización. La síntesis automatizada puede conseguirse,
por ejemplo, utilizando un Applied Biosystems Péptido Synthesizer
(Foster City. CA) utilizando las instrucciones del fabricante.
Varias porciones del polipéptido PRO pueden ser químicamente
sintetizadas separadamente y combinadas utilizando métodos químicos
o enzimáticos para producir el polipéptido PRO de longitud
completa.
El ADN que codifica el polipéptido PRO puede ser
obtenido de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejido que
se cree que posee el ARNm PRO y que lo expresa a un nivel
detectable. Por consiguiente, ADN humano PRO puede ser
convenientemente obtenido de una biblioteca de ADNc preparada a
partir de tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El
gene que codifica PRO también puede ser obtenido de una biblioteca
genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.
Las bibliotecas pueden ser exploradas con sondas
(tal como anticuerpos del polipéptido PRO, u oligonucleótidos de al
menos aproximadamente 20-80 bases) designadas para
identificar el gen de interés o la proteína codificados por él. La
investigación del ADNc o biblioteca genómica con la sonda
seleccionada puede ser realizada utilizando métodos estándar, tales
como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el
polipéptido PRO es utilizar el método PCR [Sambrook et al.,
supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1995)].
Los Ejemplos a continuación describen técnicas
para la investigación de la biblioteca de ADNc. Las oligosecuencias
de nucleótidos seleccionadas como sondas debe ser de longitud
suficiente y suficientemente no ambiguas de forma tal que los
falsos positivos son minimizados. El oligonucleótido es
preferentemente marcador de forma tal que puede ser detectado
mediante hibridación al ADN en la biblioteca que se revisa. Métodos
de marcador son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de
radiomarcadores como ATPmarcadorP, biotinilación o marcador con
enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo rigurosidad
moderada y rigurosidad alta, se proporcionan en Sambrook et
al., supra.
Las secuencias identificadas en dichos métodos
de investigación de biblioteca pueden ser comparadas y alienadas con
otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de
datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de
secuencias privadas. La identidad en la secuencia (tanto al nivel
aminoácido o nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula
o a lo largo de la secuencia de longitud completa puede ser
determinada utilizando métodos conocidos en la técnica y como es
aquí descrito.
El ácido nucleico que tiene la secuencia de
proteína de codificación puede obtenerse mediante investigación de
ADNc seleccionado o bibliotecas genómicas utilizando la secuencia
de aminoácidos deducida aquí descrita para el primer momento, y, si
es necesario, utilizando métodos de extensión de iniciador
convencionales como está descrito en Sambrook et al.,
supra, para detectar precursores y procesar intermediarios
de ARNm que no han sido transcritos de forma reversa en el ADNc.
Las células huésped son transfectadas o
transformadas con vectores de expresión o clonado aquí descritos
para la producción del polipéptido PRO y cultivadas en medio
nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir
promotores, seleccionando transformantes, o amplificando los genes
que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo,
tal como medio, temperatura, pH y similares, pueden ser
seleccionadas por el operario entendido sin experimentación
desproporcionada. En general, principios, protocolos, y técnicas
prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares
puede encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical
Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al.,
supra.
Los métodos de transfección de células
eucarióticas y de transformación de células procarióticas son bien
conocidas para el operario ordinariamente entendido, por ejemplo,
CaCl_{2}, CaPO_{4}, mediado por liposoma y electroporación.
Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se
realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas
células. El tratamiento de calcio empleando calcio cloruro, como se
ha descrito en Sambrook et al., supra, o
electroporación generalmente se utiliza para procariotas. La
infección con Agrobacterium tumefaciens es usada para la
transformación de ciertas células de plantas, como ha descrito Shaw
et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicado 29 Junio
1989. Para células de mamífero sin dichas paredes celulares, puede
emplearse el método de precipitación de calcio fosfato de Graham and
van der Eb, Virologv, 52:456-457 (1978). Aspectos
generales del sistema de transfecciones de célula huésped de
mamífero han sido descritos en la Patente U.S. No. 4.399.216.
Transformaciones en levaduras son típicamente llevadas a cabo según
el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y
Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979).
Sin embargo, otros métodos para introducir ADN dentro de células,
tal como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión
de protoplasto bacteriano con células intactas, o policaciones,
por ejemplo, polibreno, poliornitina, también pueden ser
utilizados. Para distintas técnicas para transformar células de
mamífero, ver, Keown et al., Methods in Enzymology,
185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature,
336:348-352 (1988).
Células huéspedes adecuadas para clonar o
expresar aquí el ADN en los vectores incluyen procariota, levadura,
o células eucariotas mayores. Procariotas adecuadas incluyen pero no
están limitadas a eubacteria, tales como organismos
Gram-negativa o Gram-positiva, por
ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli.
Varias cepas de E. coli están públicamente
disponibles, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC
31,446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli cepa
W3110 (ATCC 27,325) y E. coli cepa K5 772 (ATCC 53,635).
Otras células huéspedes procarioticas adecuadas incluyen
Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por
ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia,
Klebsiella, Proteus, Salmonella, por
ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por
ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como
Bacilli tales como B. subtilis y B.
licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P
descrito en DD 266.710 publicado 12 Abril 1989), Pseudomonas
tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos
ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La Cepa W3110 es un
huésped particularmente preferido o huésped madre porque es una
cepa huésped común para fermentaciones de ADN producto recombinante.
Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de
enzimas proteolíticas. Por ejemplo, cepa W3110 puede ser modificada
para efectuar una mutación genética en los genes que codifican
proteínas endógenas en el huésped, con ejemplos de dichos
huéspedes incluyendo E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el
genotipo completo tonA ; E. coli W3110 cepa 9E4, que
tiene el genotipo completo tonA ptr3: E. coli W3110
cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonA
ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ontpT
kan^{r}; E. coli W3110 cepa 37D6. que tiene el
genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-lac)169 degP ompT rbs 7 i/vG
kan^{r}; E. coli W3110 cepa 40B4, que es la cepa 37D6
con una mutación por supresión no resistente a kanamicina
degP; y una cepa E. coli que tiene proteasa
periplásmica mutante descrita en la Patente U.S. No. 4.946.783
publicada 7 Agosto 1990. Alternativamente, métodos in vitro
de clonación, por ejemplo, PCR u otras reacciones polimerasa
de ácido nucleico, son adecuados.
\newpage
Además para procariotas, microbios eucarióticos
tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados
de clonado o expresión para vectores que codifican PRO.
Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped
eucariota inferior comúnmente utilizado. Otros incluyen
Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140
[1981]: EP 139,383 publicado 2 May 1985); huéspedes
Kluyveromyces (Patente U.S. No. 4.943.529; Fleer et
al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)) tales
como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C.
CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737
[1983]), K. fragilis (ATCC 12,424). K. bulgaricus
(ATCC 16,045). K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii
(ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Vanden Berg
et al., Bio/Technology, 8:135 (990)), K.
thermotolerans, y K. marxianus: yarrowia (EP402,226);
Pichia pastoris (EP 183.070: Sreekrishna et al., J.
Básico Microbiol., 28:265-278[1988]);
Candida: Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora
crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales
como Schwanniomyces occidentalis (EP 394.538 publicado 31
October 1990); y hongos filamentosos tales como, por
ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO
91/00357 publicado 10 Enero 1991), y huéspedes Aspergillus
tales como A. nidulans (Ballance et al.,
Biochem. Biophys, Res. Commun., 112:284-289; Tilbum
et al., Gene, 26:205-221 [1983); Yelton et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474
[1984]) y A. niger (Kelly and Hynes. EMBO J.,
4:475-479 [1985]). Levaduras metilotrópicas son aquí
adecuadas e incluyen, pero no están limitadas a, levadura capaz de
crecer en metanol seleccionada a partir de los géneros consistentes
en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia,
Saccharomyces, Turulopsis, y Rhodotorula. Una
lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de
levaduras puede encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of
Methylotrophs, 269 (1982).
Células huéspedes adecuadas para la expresión de
polipéptidos PRO glicosilados son derivados a partir de organismos
multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen
células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así
como células de plantas. Ejemplos de líneas de células huéspedes
útiles de mamífero incluyen ovario de hámster Chino (CHO) y células
COS. Ejemplos más específicos incluyen líneas CV1 de riñón de mono
transformadas mediante SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651);
línea de riñón embriónica humano (293 o células 293 subclonadas
para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J.
Gen. Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster Chino
/-DHFR (CHO). Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.
Reprod., 23:243-25 (1980)); células humanas de
pulmón (W 138, ATCC CCL 75): células humanas de hígado (Hep G2, HB
8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562. ATCC CCL51). La
selección de la célula huésped apropiadas se considera que está
dentro de las habilidades de la técnica.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o
genómico ADN) que codifica el polipéptido PRO puede ser insertado
en un vector replicable para clonado (amplificación del ADN) o para
expresión. Varios vectores están públicamente disponibles. El
vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido,
cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia apropiada de ácido
nucleico puede ser insertada en el vector mediante una variedad de
métodos. En general, el ADN es insertado dentro de un
sitio(s) endonucleasa de restricción apropiada utilizando
técnicas conocidas en la técnica. Componentes del vector
generalmente incluyen, pero no están limitado a, uno o más de una
secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes
marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de
terminación de la transcripción. La construcción de vectores
adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea
técnicas estándar de ligado que son conocidas para el operario
entendido.
El polipéptido PRO puede ser producido de forma
recombinante no sólo directamente, sino también como un polipéptido
fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia
señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico
en el término N de la proteína madura o polipéptido. En general, la
secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una
parte del ADN que codifica PRO que es insertado dentro del vector.
La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariótica
seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de fosfatasa
alcalina, penicilinasa, lpp, o guías If de enterotoxina estable a
la temperatura. Para la secreción de levadura la secuencia señal
puede ser, por ejemplo, la guía levadura invertasa, guía
factor alfa (incluyendo guías \alpha-factor
Saccharontyces y Kluyveromyces, este último descrito
en la Patente U.S. No. 5.010. 182), o guía fosfatasa ácida, la guía
glucoamilasa C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 de Abril
de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de
Noviembre de 1990. En la expresión de célula de mamífero, señales
de secuencia de mamífero pueden utilizarse para dirigir la
secreción de la proteína, tal como señales de secuencia a partir de
polipéptidos secretado de la misma o de especies relacionadas, así
como guías secretorias virales.
Tanto los vectores de expresión y clonación
contienen una secuencia de ácido nucleico que permite replicarse al
vector en una o más células huéspedes seleccionadas. Dichas
secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias,
levaduras, y virus. El origen de replicación a partir del plásmido
pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias
Gram-negativas, el plásmido origen 2 \mu es
adecuado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma,
adenovirus, VSV o BPV) son útiles para clonar vectores en células
de mamífero.
Los vectores de expresión y clonación
típicamente contendrán un gen de selección, también llamado un
marcador seleccionable. Genes típicos de selección codifican
proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos o otras
toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o
tetraciclina. (b) complementar deficiencias auxotroficas, o (c)
suministrar nutrientes críticos no disponibles a partir del medio
complejo, por ejemplo, el gene que codifica
D-alanina racemasa para Bacilli.
\newpage
Un ejemplo de marcadores adecuados seleccionable
para células de mamífero son aquellos que permiten la
identificación de células competentes para tomar ácido nucleico que
codifica PRO, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped
apropiada cuando se emplea el DHFR de tipo salvaje es la línea
celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como
ha descrito Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4216 (1980). Un gen adecuado de selección para uso en levadura es
el gen trp1 presente en el plásmido levadura YRp7
[Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et
al., Gene, 7:141 (1979): Tschemper et al., Gene, 10: 57
(1980)]. El gen trp1 proporciona un marcador de selección
para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad de
crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o
PEP4-1 [Janes, Genetics, 85:12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonado usualmente
contienen un promotor operativamente ligado a la secuencia de ácido
nucleico que codifica PRO para dirigir la síntesis de ARNm.
Promotores reconocidos por una variedad de células huéspedes
potenciales son bien conocidos. Los promotores adecuados para
utilizar con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas
promotores \beta-lactamasa y lactosa [Chang et
al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature,
281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, a sistema promotor triptofano
(trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,176], y
promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25
(1983)]. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia Shine-Dalgamo
(S.D.) operativamente ligada al ADN que codifica el polipéptido
PRO.
Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas
para usar con huéspedes levadura incluyen los promotores para
3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J.
Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess
et al., J. Adv. Enzime Reg., 7:149 (1968); Holland,
Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y
glucoquinasa.
Otros promotores levadura, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción
controlada mediante las condiciones de crecimiento, son las
regiones promotoras for alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C,
fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo
del nitrógeno, metalotioneina,
gliceraldehide-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de la
maltosa y galactosa. Vectores y promotores adecuados para usar en la
expresión de levadura son descritos adicionalmente en EP
73.657.
La transcripción del polipéptido PRO a partir
de vectores en células huéspedes de mamífero es controlada, por
ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus
tales como virus polioma, virus fowlpox (UK 2.211.504 publicado 5
Julio 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma
bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus,
virus de la hepatitis-B y Virus Simian
40(SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero,
por ejemplo, el promotor actina o un promotor
inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque de calor,
siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de
la célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica el
polipéptido PRO por eucariotas superiores puede ser incrementada
insertando una secuencia mejoradora en el vector. Los mejoradores
son elementos de ADN que actúan en cis, usualmente desde
aproximadamente 10 a 300 bp, que actúan sobre un promotor para
incrementar su transcripción. Muchas secuencias mejoradoras son
ahora conocidas a partir de genes de mamífero (globina, elastasa,
albúmina, \alpha-fetoproteína, e insulina).
Típicamente, sin embargo, se usará un mejorador de un virus de
célula eucariota. Los ejemplos incluyen el SV40 mejorador sobre el
lado tardío del origen de replicación (bp 100-270),
el mejorador promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador
polioma en el lado tardío del del origen de replicación, y
mejoradores adenovirus. El mejorador puede ser empalmado en el
vector en una posición 5' o 3' de la secuencia de codificación PRO,
pero está preferentemente ubicado en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huéspedes eucariota (levadura, hongos, insectos, plantas, animales,
humanas, o células nucleadas de otros organismos multicelulares)
también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la
transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están
comúnmente disponibles a partir de 5' y, ocasionalmente 3',
regiones no traducidas de DNAs o ADNcs eucariota o viral. Estas
regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como
fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que
codifica el polipéptido PRO.
Aún otros métodos, vectores, y células huéspedes
adecuadas para la adaptación de la síntesis de polipéptidos PRO en
cultivo celular recombinante de vertebrados son descritos en Gething
et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei
et al., Nature, 281:40-46 (1979): EP 117.060;
y EP 117.058.
La amplificación y/o expresión del gen puede ser
medida en una muestra directamente, por ejemplo, mediante
transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern
para cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], transferencia
de puntos (análisis ADN), o hibridación in situ, utilizando
una sonda de marcador apropiada, basada en las secuencias aquí
provistas. Alternativamente, pueden ser empleados anticuerpos que
puedan reconocer duplicados específicos, incluyendo duplicados ADN,
duplicados ARN, y duplicados híbridos ADN-ARN o
duplicados ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez
pueden ser marcadores y el ensayo puede llevarse a cabo donde el
duplicado está unido a la superficie, de forma que ante la
formación de duplicado sobre la superficie, la presencia del
anticuerpo unido al duplicado puede ser detectada.
La expresión del gene, alternativamente, puede
ser medida mediante métodos inmunológicos, tales como teñido
inmunohistoquímico de células o secciones de tejido y ensayo del
cultivo de células o fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto del gen. Anticuerpos útiles
para el teñido inmunohistoquímico y/o ensayo de muestra de fluidos
puede ser tanto monoclonal o policlonal, y puede prepararse en
cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden ser
preparados contra una secuencia nativa del polipéptido PRO o contra
un péptido sintético basado en las secuencias de ADN aquí provistas
o contra una secuencia exógena fusionada al ADN PRO y que codifica
un epítope anticuerpo específico.
Formas de polipéptidos PRO pueden ser
recuperadas de medios de cultivo o de lisados de células huésped.
Si están unidos a la membrana, pueden liberarse de la membrana
utilizando una solución de detergente adecuada (por ejemplo,
Triton-X 100) o mediante división enzimática.
Células empleadas en la expresión del polipéptido PRO pueden ser
rotas mediante distintos medios físicos o químicos, tales como ciclo
de congelación-descongelación, sonicación, rotura
mecánica, o agentes de lisado celular.
Puede desearse purificar el polipéptido PRO de
proteínas celulares recombinantes o polipéptidos. Los siguientes
métodos son ejemplares de métodos adecuados de purificación:
mediante fraccionamiento sobre una columna de intercambio de iones:
precipitación con etanol; HPLC de fase reversa; cromatografía sobre
sílice o sobre una resina de intercambio de cationes tal como DEAE;
cromatofocalización; SDS-PAGE: precipitación con
sulfato de amonio; filtración por gel utilizando, por ejemplo,
Sephadex G-75: columnas de proteína A Sefarosa para
retirar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes
metálicas para unir formas marcadoras con epítope del polipéptido
PRO. Varios métodos de purificación de proteínas pueden ser
empleados y dichos métodos son conocidos en la técnica y descritos
por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990):
Scopes, Protein Purification: Principles and Practice,
Springer-Verlag, New York (1982). La
etapa(s) de purificación seleccionadas dependerán, por
ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y el
polipéptido PRO particular producido.
La presente invención se basa en la
identificación y caracterización de genes que son amplificados en
ciertas células de cáncer.
El genoma de organismos procarióticos y
eucarióticos está sometido a dos requerimientos aparentemente
conflictivos. Uno es la preservación y propagación de ADN como la
información genética en su forma original, para garantizar la
herencia estable a través de múltiples generaciones. En la otra
mano, las células u organismos deben ser capaces de adaptarse a
cambios ambientales duraderos. Los mecanismos adaptivos pueden
incluir modificaciones cualitativas o cuantitativas del material
genético. Las modificaciones cualitativas incluyen mutaciones de
ADN, en la cual secuencias de codificaciones son alteradas
resultando en una proteína estructuralmente y/o funcionalmente
diferente. La amplificación de genes es una modificación
cuantitativa, donde el número real de una secuencia completa de
codificación, por ejemplo, un gen, se incrementa,
conduciendo a un número incrementado de matrices disponibles para la
transcripción, un número incrementado de transcripciones
traducibles, y, en última instancia, a una abundancia incrementada
de las proteínas codificadas por el gen amplificado.
El fenómeno de la amplificación de genes y sus
mecanismos subyacentes han sido investigados in vitro en
varios sistemas de cultivo procariota y eucariota. El ejemplo mejor
caracterizado de la amplificación de genes implica el cultivo de
células eucariotas en un medio que contienen concentraciones
variables de fármaco citotóxico metotrexato (MTX). MTX es un ácido
fólico análogo e interfiere con la síntesis de ADN mediante el
bloqueo de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR). Durante la
exposición inicial a bajas concentraciones de MTX la mayoría de
células (>99,9%) morirán. Un pequeño número de células
sobrevive, y son capaces de crecer en concentraciones incrementadas
de MTX mediante la producción de grandes cantidades de
DHFR-ARN y proteína. La base de esta sobreproducción
es la amplificación del único gen DHFR. Las copias adicionales del
gen se encuentran como copias extracromosómicas en forma de
cromosomas pequeños, supernumerarios (dobles) o como copias
cromosómicas integradas.
La amplificación de genes se encuentra más
comúnmente en el desarrollo de resistencia a fármacos citotóxicos
(antibióticos para bacterias y agentes quimioterapéuticos para
células eucariotas) y transformación neoplástica. La transformación
de una célula eucariota como un evento espontáneo o debido a un
ataque viral o química/ambiental es típicamente asociada con
cambios en el material genético de esa célula. Uno de los cambios
genéticos más comunes observados en las malignidades humanas son
mutaciones de la proteína p53. p53 controla la transición de células
desde la fase estacionaria (G1) a la replicativa (S) y evita esta
transición en presencia de daño de ADN. En otras palabras, una de
las consecuencias principales de inhibir las mutaciones p53 es la
acumulación y propagación del daño de ADN. Por ejemplo,
cambios genéticos. Tipos comunes de cambios genéticos en células
neoplásticas son, además de mutaciones puntuales, amplificaciones
y alteraciones grandes, estructurales, tales como
translocaciones.
La amplificación de secuencias de ADN puede
indicar un requerimiento funcional específico como se ilustra en el
sistema experimental DHFR. Por lo tanto, la amplificación de ciertos
oncogenes en puntos de malignidades hacia un rol causativo de estos
genes en el proceso de transformación maligna y mantenimiento de
los fenotipos transformados. Esta hipótesis ha ganado soporte en
estudios recientes. Por ejemplo, la proteína
bcl-2 se encontró que era amplificada en
ciertos tipos de linfomas no Hodgkin. Esta proteína inhibe la
apoptosis y conduce a la acumulación progresiva de células
neoplásticas. Miembros de la familia de genes receptores del factor
de crecimiento se ha encontrado que pueden ser amplificados en
varios tipos de cánceres que sugieren que la sobreexpresión de
estos receptores puede hacer a las células neoplásticas menos
susceptibles a cantidades limitantes de factor de crecimiento
disponibles. Ejemplos incluyen la amplificación del receptor
andrógeno en cáncer próstata recurrente durante la terapia de
privación de andrógeno y la amplificación del receptor homólogo del
factor de crecimiento ERB2 en cáncer de mama. Últimamente, los genes
implicados en señalización intracelular y control de la progresión
del ciclo celular puede experimentar una amplificación durante una
transformación maligna. Esto se ilustra mediante la amplificación de
los genes bcl-l y ras en varios neoplasmas
epiteliales y linfoides.
Estos estudios tempranos ilustran la viabilidad
de identificar secuencias amplificadas de ADN en neoplasmas, porque
esta aproximación puede identificar genes importantes para la
transformación maligna. El caso de ERB2 también demuestra la
viabilidad desde un punto de vista terapéutico, debido a que la
transformación de proteínas puede representar objetivos nuevos y
específicos para la terapia del tumor.
Varias técnicas diferentes pueden utilizarse
para demostrar secuencias genómicas amplificadas. El análisis
citogenético clásico de extensiones de cromosomas preparadas a
partir de células de cáncer es adecuado para identificar grandes
alteraciones estructurales, tales como translocaciones, supresiones
e inversiones. Regiones genómicas amplificadas sólo pueden ser
visualizadas si implican grandes regiones con algo número de copias
o están presentes como material extracromosómico. Mientras que la
citogenética fue la primera técnica para demostrar la asociación
consistente de cambios cromosómicos específicos con neoplasmas
particulares, es inadecuado para la identificación y aislamiento de
secuencias de ADN manejable. La técnica más recientemente
desarrollada de hibridación genómica comparativa (CGH) ha ilustrado
el fenómeno extendido de amplificación genómica en neoplasmas. El
ADN del tumor y normal son hibridados simultáneamente sobre
metafases de células normal y el genoma entero puede ser revisado
mediante análisis de imagen para secuencias de ADN que están
presentes en el tumor a una frecuencia incrementada. (WO 93/18,186;
Gray et al., Radiation Res., 137:275-289
[(1994]). Como un método de investigación, este tipo de análisis ha
revelado un gran número de ampliaciones recurrentes (un
estiramiento de ADN amplificado) en una variedad de neoplasmas
humanos. A pesar de que CGH es más sensible que el análisis
citogenético clásico en identificar estiramientos amplificados de
ADN, no permite una identificación y aislamiento rápidos de
secuencia de codificaciones dentro del amplímero mediante técnicas
genéticas moleculares estándar.
Los métodos más sensibles para detectar la
amplificación de genes son ensayos de la reacción basada en cadena
de polimerasa (PCR). Estos ensayos utilizan cantidad muy pequeño de
ADN de tumor como material inicial, son exquisitamente sensibles,
proporcionan ADN que es favorable para análisis adicional, tales
como secuenciado y son adecuadas para análisis de alto rendimiento
de volumen.
Los ensayos antes mencionados no son mutuamente
exclusivos, pero son frecuentemente utilizados en combinación para
identificar amplificaciones en neoplasmas. Mientras que el análisis
citogenético y CGH representan métodos de investigación para
examinar el genoma completo para regiones amplificadas, los ensayos
basados en PCR son más adecuados para la identificación final de la
secuencia de codificación, por ejemplo, genes en regiones
amplificadas.
Según la presente invención, dichos genes han
sido identificados mediante PCR cuantitativa (S. Gelmini et
al., Clin. Chem., 43:752 [1997]), mediante comparación de ADN a
partir de una variedad de tumores primarios, incluyendo mama,
pulmón, colon, próstata, cerebro, hígado, riñón, páncreas, bazo,
timo, testículo, ovario, úteros, etc., tumor, o líneas de células de
tumor, con ADN reunido a partir de donantes sanos. PCR cuantitativa
se realizó utilizando un instrumento TaqMan^{TM} (ABI).
Iniciadores gen-específico y sondas fluorogénicas
fueron designadas basándose en la secuencia de codificaciones de
los ADNs.
Líneas de células de carcinoma humano de pulmón
incluyen A549 (SRCC768), Calu-1 (SRCC769),
Calu-6(SRCC770), H157 (SRCC771), H441
(SRCC772), H460 (SRCC773), SKMES-1 (SRCC774), SW900
(SRCC775), H522 (SRCC832), y H810 (SRCC833), todas disponibles en
ATCC. Células primarias de tumor humano de pulmón usualmente
derivan a partir de adenocarcinomas, carcinomas de células
escamosas, carcinomas de células grandes, carcinomas de no pequeñas
células, carcinomas de células pequeñas, y carcinomas
broncoalveolares, e incluyen, por ejemplo, SRCC724 (adenocarcinoma,
abreviado como "AdenoCa")(LT1), SRCC725 (carcinoma de células
escamosas, abreviado como "SqCCa")(LT1a), SRCC726
(adenocarcinoma)(LT2), SRCC727 (adenocarcinoma)(LT3), SRCC728
(adenocarcinoma)(LT4), SRCC729 (carcinoma de células
escamosas)(LT6), SRCC730 (adeno/carcinoma de células
escamosas)(LT7), SRCC731 (adenocarcinoma)(LT9), SRCC732 (carcinoma
de células escamosas)(LT10), SRCC733 (carcinoma de células
escamosas)(LT11), SRCC734 (adenocarcinoma)(LT12), SRCC735
(adeno/carcinoma de células escamosas)(LT13), SRCC736 (carcinoma de
células escamosas)(LT15), SRCC737 (carcinoma de células
escamosas)(LT16), SRCC738 (carcinoma de células escamosas)(LT17),
SRCC739 (carcinoma de células escamosas)(LT18), SRCC740 (carcinoma
de células escamosas)(LT19), SRCC741 (carcinoma de células de
pulmón, abreviado como "LCCa")(LT21), SRCC811
(adenocarcinoma)(LT22), SRCC825 (adenocarcinoma)(LT8), SRCC886
(adenocarcinoma)(LT25), SRCC887 (carcinoma de células escamosas)
(LT26), SRCC888 (adeno-BAC carcinoma) (LT27),
SRCC889 (carcinoma de células escamosas) (LT28), SRCC890 (carcinoma
de células escamosas) (LT29), SRCC891 (adenocarcinoma) (LT30),
SRCC892 (carcinoma de células escamosas) (LT31). SRCC894
(adenocarcinoma) (LT33). También están incluidos tumores humanos
de pulmón designados como SRCC 1125 [HF-000631],
SRCC1127 [HF-000641], SRCC1129
[HF-000643], SRCC1133 [HF-000840],
SRCC1135 [HF-000842], SRCC1227
[HF-001291], SRCC1229 [HF-001293],
SRCC1230 [HF-001294], SRCC1231
[HF-001295], SRCC1232 [HF-001296],
SRCC
1233 [HF-001297], SRCC1235 [HF-001299], SRCC1236 [HF-001300]. SRCC1296[HF-001640], SRCC1299 [HF-001643], SRCC1300 [HF001644], SRCC1301 [HF-001645], SRCC1302 [HF-001646], SRCC1303 [HF-001647], y SRCC1304 [HF-001648].
1233 [HF-001297], SRCC1235 [HF-001299], SRCC1236 [HF-001300]. SRCC1296[HF-001640], SRCC1299 [HF-001643], SRCC1300 [HF001644], SRCC1301 [HF-001645], SRCC1302 [HF-001646], SRCC1303 [HF-001647], y SRCC1304 [HF-001648].
Líneas de células de cáncer de colon incluyen,
por ejemplo, ATCC líneas de células de SW480 (adenocarcinoma,
SRCC776), SW620 (metástasis de nodos linfáticos de adenocarcinoma
de colon. SRCC777), Colo320 (carcinoma, SRCC778), HT29
(adenocarcinoma. SRCC779), HM7 (una variante alta productora de
mucina de ATCC línea de células de adenocarcinoma de colon,
SRCC780, obtenido de Dr. Robert Warren. UCSF), CaWiDr
(adenocarcinoma, SRCC781), HCT116 (carcinoma, SRCC782), SKCO1
(adenocarcinoma, SRCC783), SW403 (adenocarcinoma, SRCC784), LS174T
(carcinoma, SRCC785), Colo205 (carcinoma, SRCC828), HCT15
(carcinoma, SRCC829), HCC2998 (carcinoma, SRCC830), y KM12
(carcinoma, SRCC831). Tumores primarios de colon incluyen
adenocarcinomas de colon designados como CT2 (SRCC742), CT3
(SRCC743),CT8 (SRCC744), CT10 (SRCC745), CT12 (SRCC746), CT14
(SRCC747), CT15 (SRCC748), CT16 (SRCC749), CT17 (SRCC750). CT1
(SRCC751), CT4 (SRCC752), CT5 (SRCC753), CT6 (SRCC754), CT7
(SRCC755), CT9 (SRCC756), CT11 (SRCC757), CT18 (SRC
C758), CT19 (adenocarcinoma, SRCC906), CT20 (adenocarcinoma, SRCC907), CT21 (adenocarcinoma, SRCC908), CT22 (adenocarcinoma, SRCC909), CT23 (adenocarcinoma, SRCC910), CT24 (adenocarcinoma. SRCC91 1), CT25 (adenocarcinoma, SRCC912), CT26 (adenocarcinoma, SRCC913), CT27 (adenocarcinoma, SRCC914), CT28 (adenocarcinoma, SRCC915), CT29 (adenocarcinoma, SRCC916), CT30 (adenocarcinoma, SRCC917), CT31 (adenocarcinoma, SRCC918), CT32 (adenocarcinoma. SRCC919), CT33 (adenocarcinoma, SRCC920), CT35 (adenocarcinoma. SRCC921), y CT36 (adenocarcinoma, SRCC922). También están incluidos centros de tumor humano de colon designados como SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054 [HF-000698], SRCC1059 [HF-000755], SRCC1060 [HF-000756], SRCC1142 [HF-000762], SRCC1144 [HF-000789], SRCC1146 [HF-000795] y SRCC1148[HF-000811].
C758), CT19 (adenocarcinoma, SRCC906), CT20 (adenocarcinoma, SRCC907), CT21 (adenocarcinoma, SRCC908), CT22 (adenocarcinoma, SRCC909), CT23 (adenocarcinoma, SRCC910), CT24 (adenocarcinoma. SRCC91 1), CT25 (adenocarcinoma, SRCC912), CT26 (adenocarcinoma, SRCC913), CT27 (adenocarcinoma, SRCC914), CT28 (adenocarcinoma, SRCC915), CT29 (adenocarcinoma, SRCC916), CT30 (adenocarcinoma, SRCC917), CT31 (adenocarcinoma, SRCC918), CT32 (adenocarcinoma. SRCC919), CT33 (adenocarcinoma, SRCC920), CT35 (adenocarcinoma. SRCC921), y CT36 (adenocarcinoma, SRCC922). También están incluidos centros de tumor humano de colon designados como SRCC1051 [HF-000499], SRCC1052 [HF-000539], SRCC1053 [HF-000575], SRCC1054 [HF-000698], SRCC1059 [HF-000755], SRCC1060 [HF-000756], SRCC1142 [HF-000762], SRCC1144 [HF-000789], SRCC1146 [HF-000795] y SRCC1148[HF-000811].
Líneas de células de carcinoma de mama humano
incluyen, por ejemplo, HBL100(SRCC759),
MB435s(SRCC
760), T47D (SRCC761), MB468(SRCC762), MB 175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20(SRCC765), MCF7(SRCC766), y SKBR3 (SRCC767), y el centro de tumor de mama humano designado como SRCC1057 [HF-000545]. También están incluidos tumores de mama humano designados como SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC
1097, SRCC1098, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101, y el de tumor mama humano-met-pulmón-NS designado como SRCC893 [LT 32].
760), T47D (SRCC761), MB468(SRCC762), MB 175 (SRCC763), MB361 (SRCC764), BT20(SRCC765), MCF7(SRCC766), y SKBR3 (SRCC767), y el centro de tumor de mama humano designado como SRCC1057 [HF-000545]. También están incluidos tumores de mama humano designados como SRCC1094, SRCC1095, SRCC1096, SRCC
1097, SRCC1098, SRCC1099, SRCC1100, SRCC1101, y el de tumor mama humano-met-pulmón-NS designado como SRCC893 [LT 32].
Tumores Humanos del recto que incluyen SRCC981
[HF-000550] y SRCC982
[HF-000551].
Centros de tumor humano de riñón que incluyen
SRCC989 [HF-000611] y SRCC1014
[HF-000613].
Centros de tumor humano de testículos que
incluyen SRCC1001 [HF-000733] y tumor de testículos
marginal SRCC999 [HF-000716].
Tumores de paratiroides humana que incluyen
SRCC1002 [HF-000831] y SRCC1003
[HF-000832].
Tumores de nodo linfático humano que incluyen
SRCC1004 [HF-000854], SRCC1005
[HF-000855], y SRCC1006
[HF-000856].
Los resultados de ensayos de la amplificación de
genes pueden ser verificados aquí mediante estudios adicionales,
tales como, determinando la expresión ARNm en varios tejidos
humanos.
Como se indicó antes, la amplificación de genes
y/o expresión de genes en varios tejidos pueden ser medidas mediante
convencional transferencia de Southern, transferencia de Northern
para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), transcripción
dot (análisis ADN), o hibridación in situ, utilizando una
sonda apropiadamente marcador, basada en las secuencias aquí
provistas. Alternativamente, pueden ser empleados anticuerpos que
pueden reconocer duplicados específicos, incluyendo duplicados ADN,
duplicados ARN, y duplicados híbridos ADN-ARN o
duplicados ADN-proteína.
La expresión de genes en varios tejidos,
alternativamente, puede ser medida mediante métodos inmunológicos,
tales como teñido inmunohistoquímico de secciones de tejido y
ensayo de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos
útiles para teñido inmunohistoquímico y/o ensayo de muestras de
fluidos pueden ser tanto monoclonales o policlonales, y pueden ser
preparados en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos
pueden ser preparados contra una secuencia nativa de polipéptido PRO
o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN aquí
provistas o contra secuencias exógenas fusionadas a la secuencia PRO
ADN y que codifica un epítope anticuerpo específico. Técnicas
generales para generar anticuerpos, y protocolos especiales para
transferencia Northern e hibridación in situ son provistas
aquí a continuación.
Si la amplificación de un gen dado es
funcionalmente relevante, entonces dicho gen debe ser amplificado
más que las regiones genómicas vecinas que no son importantes para
la supervivencia del tumor. Para probar esto, el gen puede ser
mapeado a un cromosoma particular, por ejemplo, mediante
análisis radiación-hibrido. El nivel de
amplificación es determinado entonces en la ubicación identificada,
y en la región genómica vecina. La amplificación selectiva o
preferencial en la región genómica a la cual el gen ha sido mapeado
es consistente con la posibilidad de que la amplificación de genes
observada promueve el crecimiento o supervivencia del tumor. El
mapeo del cromosoma incluye tanto el mapeo del marco como del
epicentro. Para mayores detalles ver, por ejemplo,
Stewart et al., Genome Research, 7:422-433
(1997).
Los resultados del estudio de la amplificación
de genes puede ser verificada además mediante estudios de unión de
anticuerpo, en el cual se ensaya la habilidad de anticuerpos
anti-PRO para inhibir la expresión de polipéptidos
PRO sobre células de tumor (cáncer). Anticuerpos ejemplares incluyen
anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos,
y heteroconjugados, la preparación de los cuales será aquí descrita
a continuación.
Los estudios de unión de anticuerpos pueden ser
llevados a cabo en cualquier método de ensayo conocido, tal como
ensayos de unión competitiva, ensayos sándwich directos e
indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal
Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC
Press. Inc., 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la
habilidad de un marcador estándar para competir con el analito de
una muestra de prueba para unirse con una cantidad limitada de
anticuerpo. La cantidad de proteína objetivo (codificadas mediante
un gen amplificado en una célula de tumor) en la muestra de prueba
es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une a
los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de
estándar que se une, los anticuerpos preferentemente son
insolubilizados antes o después de la competición, de forma que el
estándar y analito que son unidos a los anticuerpos pueden
convenientemente ser separados del estándar y el analito que
permanece no unido.
Los ensayos sándwich implican el uso de dos
anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunogénica
diferente, o epítope, de la proteína a ser detectada. En un ensayo
sándwich, el analito de una muestra de prueba está unido por un
primer anticuerpo que es inmovilizado sobre un soporte sólido, y
luego un segundo anticuerpo se une al analito, formando así un
complejo insoluble de tres partes. Ver, por ejemplo, Patente
U.S. No. 4.376.110. El segundo anticuerpo puede el mismo ser
marcador con una mitad detectable (ensayos sándwich directo) o puede
ser medido utilizando un anticuerpo
anti-inmunoglobulina que es marcador con una mitad
detectable (ensayo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de
ensayo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso la mitad detectable
es una enzima.
Para inmunohistoquímica, la muestra del tumor
puede ser fresca o congelada o puede estar impregnada en parafina
y fijada con un preservativo tal como formalina, por ejemplo.
Los ensayos basados en células y modelos
animales para tumores (por ejemplo, cánceres) pueden
utilizarse para verificar los hallazgos del ensayo de la
amplificación de genes, y entender adicionalmente la relación entre
los genes aquí identificados y el desarrollo y patogénesis de
crecimiento celular neoplásico. El rol de productos del gen aquí
identificados en el desarrollo y patología de un tumor o cáncer
pueden ser probados utilizando células primarias de tumor o líneas
de células que han sido identificadas para amplificar aquí los
genes. Dichas células incluyen, por ejemplo, las células de cáncer
de mama, colon y pulmón y líneas de células de listadas con
anterioridad.
En una aproximación diferente, células de un
tipo de célula conocido por estar implicado en un tumor particular
son transfectadas con los ADNcs aquí presentados, y se analiza la
habilidad de estos ADNcs para inducir crecimiento excesivo. Las
células adecuadas incluyen, por ejemplo, líneas de células estables
de tumor tales como, la línea de células
B104-1-1 (NIH-3T3
línea de células estables transfectadas con el protooncogen
neu) y células ras-transfectadas
NIH-3T3, que pueden ser transfectadas con el gen
deseado, y monitorizadas para el crecimiento tumorigénico. Dichas
líneas de células transfectadas pueden utilizarse entonces para
probar la habilidad de anticuerpos poli- o monoclonales o
composiciones de anticuerpos para inhibir crecimiento celular
tumorigénico ejerciendo actividad citostática o citotóxica sobre el
crecimiento de las células transformadas, o mediando la
citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Las
células transfectadas con la secuencia de codificaciones de los
genes aquí identificados pueden además ser utilizados para
identificar fármacos candidatos para el tratamiento del cáncer.
Además, cultivos primarios derivados a partir de
tumores en animales transgénicos (como se describe a continuación)
pueden utilizarse en los presentes ensayos basados en células, a
pesar de que son preferidas líneas de células estables. Las
técnicas para derivar líneas de células continuas a partir de
animales transgénicos son bien conocidas en la técnica (ver, por
ejemplo, Small et al., Mol. Cell. Biol.,
5:642-648 [1985]).
Una variedad de modelos animales bien conocidos
pueden ser utilizados para entender adicionalmente el rol de los
genes aquí identificados en el desarrollo y patogénesis de tumores,
y para probar la eficacia de agentes terapéuticos candidatos,
incluyendo anticuerpos, y otros antagonistas de los polipéptidos
nativos, incluyendo pequeñas moléculas antagonistas. La naturaleza
in vivo de dichos modelos los hace particularmente
predictivos de respuestas en pacientes humanos. Modelos animales de
tumores y cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de
colon, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, etc.) incluyen tanto
animales no recombinantes y recombinantes (transgénicos). Modelos
animales no recombinantes incluyen, por ejemplo, roedores, por
ejemplo, modelos murina. Dichos modelos pueden ser generados
mediante la introducción de células de tumor en ratones
singenésicos utilizando técnicas estándar, por ejemplo,
inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación
en el bazo, implantación intraperitoneal, implantación bajo la
cápsula renal, o implantación de ortopina, por ejemplo,
células de cáncer de colon implantadas en tejido del colon. (Ver,
por ejemplo, publicación PCT No. WO 97/33551, publicada el 18
de Septiembre de 1997).
Probablemente las especies animales más
frecuentemente utilizadas en estudios oncológicos son ratones
inmunodeficientes y, en particular, ratones desnudos. La
observación de que ratones desnudos con hipo/aplasia pueden actuar
exitosamente como un huésped para injertos heterólogos de tumores
humanos ha conducido a la difusión de su uso para este propósito.
El gen recesivo autosómico nu gene ha sido introducido en un
gran número de cepas distintas congénicas de ratones desnudos,
incluyendo, por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c. B10.LP, C17, C3H,
C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW,
P, RIII y SJL. Además, una amplia variedad de otros animales con
defectos inmunológicos heredados distintos de los ratones desnudos
han sido criados y utilizados como recipientes de injertos
heterólogos de tumor. Para más detalles ver, por ejemplo, The
Nude Mouse in Oncology Research. E. Boven and B. Winograd, eds.,
CRC Press, Inc., 1991.
Las células introducidas en dichos animales
pueden ser derivadas a partir de líneas de células de tumor/cáncer
conocidas, tales como, cualquiera de las líneas de células de tumor
listadas con anterioridad, y, por ejemplo, la línea de células B
104-1-1 (línea de células
transfectadas estable NIH-3T3 con el protooncogen
neu); células ras-transfectadas
NIH-3T3; Caco-2 (ATCC
HTB-37); una línea de células moderadamente bien
diferenciadas de adenocarcinoma humano de colon de grado II,
HT-29 (ATCC HTB-38), o de tumores y
cánceres. Muestras de tumor o células de cáncer pueden ser
obtenidas de pacientes sometidos a cirugía, utilizando condiciones
estándar, implicando el congelado y almacenamiento en nitrógeno
liquido (Karmali et al., Br. J. Cancer,
48:689-696 [1983]).
Células de tumor pueden ser introducidas en
animales, tales como ratones desnudos, mediante una variedad de
métodos. El espacio subcutáneo (s.c.) en ratones es muy adecuado
para la implantación del tumor. Los tumores pueden ser
transplantados s.c. como bloques sólidos, como biopsias de aguja
mediante el uso de un trochar, o como suspensiones de células. Para
implantación de bloque sólido o trochar, fragmentos de tejido de
tumor de tamaño adecuado son introducidos en el espacio s.c.. Las
suspensiones de células son preparadas de forma reciente a partir
de tumores primarios o líneas estable de células de tumor, e
inyectadas subcutáneamente. Células de Tumor también pueden ser
inyectadas como implantes subdérmicos. En esta ubicación, el inoculo
es depositado entre la parte inferior del tejido dérmico conectivo
y el tejido s.c.. Boven and Winograd (1991), supra.
Modelos animales de cáncer de mama pueden ser
generados, por ejemplo, mediante la implantación de células
neuroblastoma de rata (a partir de las cuales el neu oncogen
fue inicialmente aislado), o células neu-transformadas
NIH-3T3 en ratones desnudos, esencialmente como ha
descrito Drebin et al., PNAS USA,
83:9129-9133 (1986).
De forma similar, modelos animales de cáncer de
colon pueden ser generados mediante el paso de células de cáncer de
colon en animales, por ejemplo, ratones desnudos, conduciendo
a la aparición de tumores en estos animales. Un modelo ortotópico
de trasplante de cáncer humano de colon en ratones desnudos ha
sido descrito, por ejemplo, por Wang et al., Cancer Research,
54:4726-4728 (1994) y Too et al., Cancer
Research, 55:681-684 (1995). Este modelo está basado
en el llamado "METAMOUSE" vendido por AntiCancer, Inc., (San
Diego, California).
Tumores que aparecen en animales pueden ser
extraídos y cultivados in vitro. Células de los cultivos
in vitro pueden entonces pasarse a animales. Dichos tumores
pueden servir como objetivos para ensayos adicionales o de fármacos.
Alternativamente, los tumores resultantes a partir del pasaje
pueden ser aislados y ARN de células pre-passaee y
células aisladas después de una o más rondas de pasaje analizadas
para expresión diferencial de los genes de interés. Dichas técnicas
de pasaje pueden ser realizadas con cualquier tumor o líneas de
células de cáncer conocidos.
Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMS5. CMS21, and
WEHI-164 son fibrosarcomas químicamente inducidos de
BALB/c ratones femeninos (DeLeo et al., J. Exp. Med.,
146:720 [1977]), que proporciona un sistema de modelo altamente
controlable para estudiar las actividades
anti-tumorales de varios agentes (Palladino et
al., J. Immunol., 138:4023-4032). Brevemente,
las células de tumor son propagadas in vitro en un cultivo
celular. Antes de la inyección en los animales, las líneas de
células son lavadas y suspendidas en tampón, a una densidad celular
de aproximadamente 10x10^{6} a 10x10^{7} células/ml. Los
animales son infectados entonces subcutáneamente con 10 a 100 \mul
de suspensión de células, permitiendo una o tres semanas para que
aparezca el tumor.
Además, el carcinoma de pulmón Lewis (3LL) de
ratones, que es uno de los tumores experimentales más profundamente
estudiados, puede ser utilizado como un modelo de tumor para
investigación. La eficacia en este modelo de tumor ha sido
correlacionada con efectos beneficiosos en el tratamiento de
pacientes humanos diagnosticados con carcinoma de células pequeñas
del pulmón (SCCL). Este tumor puede ser introducido en ratones
normales mediante inyección de fragmentos de tumor a partir de un
ratón afectado o de células mantenidas en cultivo (Zupi et
al., Br. J. Cancer, 41:suppl, 4:309 [1980]), y la evidencia
indica que los tumores pueden iniciarse a partir de la inyección de
hasta una única célula y que una muy alta proporción de células de
tumor infectadas sobrevive. Para más información sobre este modelo
de tumor ver, Zacharski, Haemostasis,
16:300-320 [1986]).
Una forma de evaluar la eficacia de un
compuesto de prueba en un modelo animal de un tumor implantado es
medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento.
Tradicionalmente, el tamaño de tumores implantados ha sido medido
con un calibrador deslizante en dos o tres dimensiones. La medición
limitada a dos dimensiones no refleja de forma precisa el tamaño
del tumor, por lo tanto, es usualmente convertida en el volumen
correspondiente utilizando una fórmula matemática. Sin embargo, la
medición del tamaño del tumor es muy imprecisa. Los efectos de un
fármaco candidato puede ser mejor descritos como el retraso de
crecimiento inducido por el tratamiento y retraso de crecimiento
específico. Otra variable importante en la descripción del
crecimiento del tumor es el tiempo de doblado del volumen del
tumor. Programas de ordenador para el cálculo y descripción del
crecimiento del tumor también están disponibles, tales como el
programa informado por Rygaard and Spang-Thomsen,
Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient
Animals, Wu and Sheng eds., Basel, 1989, 301. Se observa, sin
embargo, que la necrosis y respuestas inflamatorias que siguen al
tratamiento pueden resultar realmente en un incremento en el tamaño
del tumor, al menos inicialmente. Por lo tanto, estos cambios
necesitan ser cuidadosamente monitorizados, mediante una
combinación de un método morfométrico y análisis de flujo
citométrico.
Modelos animales recombinantes (transgénicos)
pueden ser dirigidos mediante la introducción de la porción de
codificación de los genes identificados aquí en el genoma de
animales de interés, utilizando técnicas estándar para producir
animales transgénicos. Animales que pueden servir como un objetivo
para manipulación transgénica incluyen, sin limitación, ratones,
ratas, conejos, conejillos de Indias, ovejas, cabras, cerdos, y
primates no humanos, por ejemplo, babuinos, chimpancés y
monos. Técnicas conocidas en la técnica para introducir un transgen
en dichos animales incluyen microinyección pronucléica (Hoppe and
Wanger, Patente U.S. No. 4.873.191); transferencia de genes mediada
por retrovirus en líneas de germen (por ejemplo, Van der
Putten et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82:6148-615 [1985]); gen diana en células madres
embrionarias (Thompson et al., Cell,
56:313-321) ); electroporación de embriones (Lo,
Mol. Cell Biol., 3:1803-1814 [1983]); transferencia
génica mediada con esperma (Lavitrano et al., Cell,
57:717-73 [1989]). Para el estudio, ver, por
ejemplo, Patente U.S. No. 4.736.866.
Animales transgénicos incluyen aquellos que
portan el transgen sólo en parte de sus células ("animales
mosaico"). El transgen puede ser integrado tanto como un
transgen único, o en concatámeros, por ejemplo, tándems
cabeza-a-cabeza o
cabeza-a-cola, introducción
Selectiva de un transgen en un tipo particular de célula es también
posible siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko et al.,
Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 89:6232-6236
(1992).
La expresión del transgen en animales
transgénicos puede ser monitorizada mediante técnicas estándar. Por
ejemplo, análisis Southern blot o amplificación PCR pueden ser
usados para verificar la integración del transgen. El nivel de
expresión de ARNm puede ser analizado entonces utilizando técnicas
tales como hibridación in situ, análisis Northern blot, PCR,
o inmunocitoquímica. Los animales son además examinados para signos
de tumor o desarrollo de cáncer.
Alternativamente, pueden ser construidos
animales "knock out" que tienen un gen defectuoso o alterado
que codifica un polipéptido PRO aquí identificado como un resultado
de recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el
polipéptido y ADN genómico alterado que codifica el mismo
polipéptido introducido dentro de una célula embrionaria del animal.
Por ejemplo, ADNc que codifica un polipéptido PRO puede ser
utilizado para clonar ADN genómico que codifica ese polipéptido de
acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que
codifica un polipéptido PRO particular puede ser suprimido o
reemplazado con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador
seleccionable que puede ser usado para monitorizar la integración.
Típicamente, varias kilobases de ADN flanqueado inalterado (tanto
en los extremos 5' y 3') son incluidos en el vector [ver, por
ejemplo, Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una
descripción de vectores homólogos de recombinación]. El vector es
introducido en una línea de células madre embrionarias (por
ejemplo, mediante electroporación) y células en las que el ADN
introducido se ha recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno
son seleccionadas [ver, por ejemplo, Li et
al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas se inyectan
entonces en un blastocito de un animal (por ejemplo, un
ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver, por
ejemplo, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:
A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp.
113-152]. Un embrión quimérico puede entonces ser
implantado en un animal hembra adoptiva adecuada pseudo embarazada
y el embrión es llevado a término para crear un animal "knock
out". La progenie que alberga el ADN recombinado de forma
homóloga en sus células germinales puede ser identificada mediante
técnicas estándar y utilizada para criar animales en los que todas
las células del animal contienen el ADN recombinado de forma
homóloga. Los animales "Knockout" puede ser caracterizados por
ejemplo, por su habilidad para defenderse contra ciertas
condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones
patológicas debido a la ausencia del polipéptido PRO.
La eficacia de los anticuerpos que unen
específicamente los polipéptidos aquí identificados y otros
fármacos candidatos, puede ser ensayada también en el tratamiento de
tumores animales espontáneos. Un objetivo adecuado para dichos
estudios es el carcinoma de células escamosas oral felino (SCC). SCC
oral felino es un tumor altamente invasivo, maligno que es el más
común de las malignidades orales de los gatos, explicando más del
60% de los tumores orales informados en esta especie. Raramente se
metastatiza a sitios distantes, a pesar de que su baja incidencia
de metástasis puede simplemente ser un reflejo del corto tiempo de
supervivencia de los gatos con este tumor. Estos tumores usualmente
no son favorables para la cirugía, primariamente por la anatomía de
la cavidad oral felina. En el presente, no hay tratamiento efectivo
para este tumor. Antes de entrar en el estudio, cada gato se somete
a un examen clínico completo, biopsia, y es escaneado mediante
tomografía computada (CT). Gatos diagnosticados con tumores de
células escamosas orales sublinguales son excluidos del estudio. La
lengua puede paralizarse como resultado de dicho tumor, y aunque el
tratamiento mate el tumor, los animales pueden no ser capaces de
alimentarse por sí mismos. Cada gato es tratado repetidamente,
durante un período más largo de tiempo. Se tomarán fotografías de
los tumores diariamente durante el período de tratamiento, y en
cada chequeo subsiguiente. Después del tratamiento, cada gato se
somete a otro escaneado CT. El escaneado CT y los radiogramas
torácicos son evaluados cada 8 semanas después de eso. Los datos
son evaluados por diferencias en supervivencia, respuesta y
toxicidad en comparación con grupos de control. La respuesta
positiva puede requerir evidencia de regresión del tumor,
preferentemente con mejora de la calidad de vida y/o esperanza de
vida incrementada.
Además, otros tumores animales espontáneos,
tales como fibrosarcoma, adenocarcinoma, linfoma, crondroma,
leiomiosarcoma de perros, gatos, y babuinos también pueden ser
probados. De estos, adenocarcinoma mamario en perros y gatos es un
modelo preferido ya que su apariencia y comportamiento son muy
similares a aquellos en humanos. Sin embargo, el uso de este modelo
está limitado por la rara ocurrencia de este tipo de tumor en
animales.
Ensayos de investigación para candidatos
fármacos son diseñados para identificar compuestos que se unen o
acomplejan con los polipéptidos codificados por los genes aquí
identificados, o que de otra manera interfieren con la interacción
de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares.
Dichos ensayos de investigación incluirán ensayos favorables para
una investigación de alto rendimiento de bibliotecas químicas,
haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos
fármacos de molécula pequeña. Moléculas pequeñas contempladas
incluyen compuestos sintéticos orgánicos o inorgánicos, incluyendo
péptidos, preferentemente péptidos solubles, fusiones
(poli)péptido-inmunoglobulina, y, en
particular, anticuerpos incluyendo, sin limitación, poli y
anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de
cadena única, anticuerpos antiidiotípico, y versiones quiméricas o
humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos
humanos y fragmentos de anticuerpos. Los ensayos pueden ser
realizados en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de unión
proteína-proteína, ensayos de investigación
bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están
bien caracterizados en la técnica.
Todos los ensayos son comunes en que llaman a
contactar el candidato fármaco con un polipéptido codificado por un
ácido nucleico aquí identificado bajo condiciones y durante un
tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes
interactúen.
En ensayos de unión, la interacción es la unión
y el complejo formado puede ser aislado o detectado en la mezcla de
reacción. En una realización particular, el polipéptido codificado
por el gen aquí identificado o el candidato fármaco es inmovilizado
sobre una fase sólida. por ejemplo, en una placa de
microtítulo, mediante uniones covalentes o no covalentes. Uniones
no covalentes generalmente son logradas revistiendo la superficie
sólida con una solución del polipéptido y secando. Alternativamente,
un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo
monoclonal, específico para el polipéptido a inmovilizar puede ser
usado para fijarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza
añadiendo el componente no inmovilizado, que puede ser marcador
mediante una marcador detectable, al componente inmovilizado,
por ejemplo, la superficie revestida que contiene el
componente fijado. Cuando la reacción se completa, los componentes
que no reaccionaron son retirados, por ejemplo, mediante
lavado, y los complejos fijados sobre la superficie sólida son
detectados. Cuando el componente originalmente no inmovilizado
lleva una marcador detectable, la detección del marcador
inmovilizada sobre la superficie indica que se ha producido el
complejo. Cuando el componente originalmente no inmovilizado no
lleva una marcador, el complejo puede ser detectado, por ejemplo,
utilizando un anticuerpo marcador uniendo específicamente el
complejo inmovilizado.
Si el compuesto candidato interactúa con pero
no se une a un polipéptido PRO particular codificado por un gen aquí
identificado, su interacción con ese polipéptido puede ser ensayada
mediante métodos bien conocidos para detectar interacciones
proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen
aproximaciones tradicionales, tales como, reticulación,
coinmunoprecipitación, y copurificación a través de gradientes o
columnas cromatográficas. Además, las interacciones
proteína-proteína pueden ser monitorizadas
utilizando un sistema genético basado en levadura descrito por
Fields y colegas [Fields and Song, Nature,
340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991)] como se
describe por Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:5789-5793 (1991)]. Muchos activadores
transcripcionales, tales como levadura GAL4, consisten en dos
dominios modulares físicamente discretos, uno actuando como el
dominio de unión de ADN, mientras que el otro funciona como el
dominio activación transcripción. El sistema de expresión de
levadura descrito en las publicaciones precedentes (generalmente
referidas como el " sistema dos-híbrido") toma
ventaja de esta propiedad, y emplea dos proteínas hibridas, una en
la cual la proteína objetivo está fusionada al dominio de unión de
ADN de GAL4, y otra, en la cual las proteínas de activación del
candidato están fusionadas con el dominio de activación. La
expresión de un gen indicador GAL1-lacZ bajo el control de
un promotor activado GAL4 depende de la reconstitución de la
actividad GAL4 a través de la interacción
proteína-proteína. Colonias que contienen
polipéptidos que interactúan son detectadas con un substrato
cromogénico para \beta-galactosidasa. Un juego
completo (MATCHMAKER^{TM}) para identificar las interacciones
proteína-proteína entre dos proteínas específicas
utilizando la técnica dos-híbrido está disponible
comercialmente en Clontech. Este sistema también puede extenderse a
mapear dominios de proteínas implicados en interacciones proteína
específicas así como a residuos de identificación de aminoácidos
que son cruciales para estas interacciones.
Compuestos que interfieren con la interacción de
un gene que codifica PRO aquí identificados y otros componentes
intra- o extracelulares puede ser probado como sigue: usualmente se
prepara una mezcla de reacción que contienen el producto del gen
amplificado y el componente intra- o extracelular bajo condiciones
y durante un tiempo que permite la interacción y unión de los dos
productos. Para probar la habilidad de un compuesto de prueba para
inhibir la unión, la reacción se ejecuta en ausencia y en presencia
del compuesto de prueba. Además, puede añadirse un placebo a una
tercera mezcla de reacción, para servir como un control positivo.
La unión (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el
componente intra- o extracelular presente en la mezcla es
monitorizada como es aquí descrito con anterioridad. La formación
de un complejo en la reacción(s) de control pero no en la
mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba indica que
compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de
prueba y su socio de reacción.
Para ensayar para antagonistas, el polipéptido
PRO puede ser añadido a una célula junto con el compuesto a ser
revisado para una actividad particular y la habilidad del compuesto
para inhibir la actividad de interés en presencia del polipéptido
PRO indica que el compuesto es un antagonista del polipéptido PRO.
Alternativamente, pueden detectarse antagonistas combinando el
polipéptido PRO y un antagonista potencial con receptores de
polipéptido PRO unidos a la membrana o receptores recombinantes bajo
condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitivo. El
polipéptido PRO puede ser marcador, tal como mediante
radioactividad, de forma que el número de moléculas de polipéptido
PRO unidas al receptor puede ser usado para determinar la
efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el
receptor puede ser identificado mediante numerosos métodos
conocidos para aquellos entendidos en la técnica, por ejemplo,
filtrado de ligandos y clasificación de FACS. Coligan et
al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991).
Preferentemente, se emplea el clonado de expresión donde se prepara
ARN poliadenilado a partir de una célula responsiva al polipéptido
PRO y una biblioteca ADNc creada a partir de este ARN es dividida en
grupos y se utiliza para transfectar células COS u otras células
que no son responsivas al polipéptido PRO. Células transfectadas que
son cultivadas en placas de vidrio son expuestas a polipéptido PRO
marcador. El polipéptido PRO puede ser marcador mediante una
variedad de medios incluyendo yodinación o inclusión de un sito de
reconocimiento para una proteína quinasa de sitio específico.
Siguiendo a la fijación e incubación, las placas son sometidas a
análisis autoradiográfico. Los grupos positivos son identificados y
se preparan sub-grupos y se retransfectan
utilizando un sub-agrupamiento interactivo y un
proceso de re-investigación, eventualmente
produciendo un único clon que codifica el receptor putativo.
Como una aproximación alternativa para la
identificación del receptor, el polipéptido PRO marcador puede ser
unido por fotoafinidad con la membrana celular o preparaciones
extracto que expresan la molécula receptora. El material reticulado
es resuelto mediante PAGE y expuesto a película de rayos X. El
complejo marcador que contiene el receptor puede ser suprimido,
resuelto en fragmentos de péptido, y sometido a
micro-secuenciado de proteínas. La secuencia de
aminoácidos obtenida del micro-secuenciado se
usaría para diseñar un juego de sondas oligonucleótido degeneradas
para revisar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que
codifica el receptor putativo.
En otro ensayo para antagonistas, células de
mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor se
incubaría con el polipéptido PRO marcador en presencia del
compuesto candidato. La habilidad del compuesto para mejorar o
bloquear esta interacción se mediría entonces.
Ejemplos más específicos de antagonistas
potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones
de inmunoglobulina con el polipéptido PRO, y, en particular,
anticuerpos incluyendo, sin limitación, anticuerpos poli- y
monoclonales y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena
única, anticuerpos antiidiotípico, y versiones quiméricas o
humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como
anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos. Alternativamente,
un antagonista potencial puede ser una proteína relacionada
próximamente, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido PRO que
reconoce el receptor pero no imparte efecto, inhibiendo así
competitivamente la acción del polipéptido PRO.
Otro antagonista politécnico potencial de PRO
es un RNA antisentido una construcción DNA preparada utilizando
tecnología antisentido, donde, por ejemplo, un RNA
antisentido o molécula DNA actúa para bloquear directamente la
traducción de ARNm mediante la hibridación de ARNm objetivo y
evitando la producción de la proteína. La tecnología antisentido
puede utilizarse para controlar la expresión de genes a través de la
formación de una triple hélice o DNA o RNA antisentido, ambos de
dichos métodos están basados en reunión de un polinucleótido DNA o
RNA. Por ejemplo, la porción de codificación 5' de la secuencia de
polinucleótido, codifica aquí el polipéptido maduro PRO, se usa
para diseñar un oligonucleótido RNA de desde aproximadamente 10 a 40
pares de bases de longitud. Un oligonucleótido DNA es diseñado para
ser complementario a una región del gen implicado en la
transcripción (triple hélice - ver, Lee et al., Nucl.
Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:
456(1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)),
evitando así la transcripción y la producción del polipéptido PRO.
El oligonucleótido RNA antisentido se hibridiza al ARNm in
vivo y bloquea la traducción de la molécula ARNm en el
polipéptido PRO (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991);
Oligodeoxynucleotides as Antisentido Inhibitors of Gene Expression
(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Los oligonucleótidos antes
descritos también pueden suministrarse a células de forma tal que
el RNA or DNA antisentido puede ser expresado in vivo para
inhibir la producción del polipéptido PRO. Cuando se utiliza DNA
antisentido, son preferidos oligodesoxiribonucleótidos derivados
del sitio de traducción-iniciación, por
ejemplo, entre aproximadamente -10 y +10 posiciones de la
secuencia de nucleótidos del gen
objetivo.
objetivo.
Moléculas de RNA o DNA antisentido son
generalmente de al menos aproximadamente 5 bases de longitud,
aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15 bases de
longitud, aproximadamente 20 bases de longitud, aproximadamente 25
bases de longitud, aproximadamente 30 bases de longitud,
aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40 bases de
longitud, aproximadamente 45 bases de longitud, aproximadamente 50
bases de longitud, aproximadamente 55 bases de longitud,
aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65 bases de
longitud, aproximadamente 70 bases de longitud, aproximadamente 75
bases de longitud, aproximadamente 80 bases de longitud,
aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90 bases de
longitud, aproximadamente 95 bases de longitud, aproximadamente 100
bases de longitud, o más.
Antagonistas potenciales incluyen pequeñas
moléculas que se unen al sitio activo, el sitio de unión del
receptor, o del factor de crecimiento otro sitio de unión relevante
del polipéptido PRO, bloqueando así la actividad biológica normal
del polipéptido PRO. Ejemplos de pequeñas moléculas incluyen, pero
no están limitadas a, pequeñas moléculas de péptidos o a modo de
péptidos, preferentemente péptidos solubles, y compuestos
sintéticos no peptidil orgánicos o inorgánicos.
Ribozimas son moléculas enzimáticas de RNA
capaces de catalizar la división específica de RNA. Las Ribozimas
actúan mediante hibridación específica de secuencia al RNA
complementario objetivo. Seguido por división endonucleolítica. Los
sitios de división específica ribozima dentro de un RNA objetivo
potencial pueden ser identificados mediante técnicas conocidas. Para
mayores detalles ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology,
4:469-471 (1994), y PCT publicación No. WO 97/33551
(publicado Septiembre 18, 1997).
Moléculas de ácido nucleico en formación de
triple hélice utilizados para inhibir la transcripción deben ser
filamento único y compuestos de desoxinucleótidos. La composición
base de estos oligonucleótidos es diseñado de forma tal que
promueve la formación de la triple hélice a través de reglas de
emparejamiento de base de Hoogsteen, que generalmente requieren
estiramientos importantes de purinas o pirimidinas en un filamento
de un dúplex. Para mayores detalles ver, por ejemplo,
PCT publicación No. WO 97/33551, supra.
Estas pequeñas moléculas pueden ser
identificadas por cualquiera de los ensayos de investigación aquí
descritos y/o mediante cualquier otra técnica de investigación bien
conocido por aquellos entendidos en la técnica.
Las composiciones útiles en el tratamiento de
tumores asociados con la amplificación de los genes aquí
identificados incluso en, sin limitación, anticuerpos, pequeñas
moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos,
moléculas antisentido y ribozima, moléculas triple hélice, etc., en
nivel de expresión y/o la actividad del producto del gen
objetivo.
Por ejemplo, moléculas antisentido RNA y RNA
actúan para bloquear directamente la traducción del ARNm mediante
la hibridación del ARNm objetivo y evitando la traducción de la
proteína. Cuando se utiliza DNA antisentido, son preferidos
oligodesoxiribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de la
traducción, por ejemplo, entre aproximadamente -10 y +10
posiciones de la secuencia de nucleótidos del gen objetivo.
Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas
capaces de catalizar la separación específica del ARN. Las
ribozimas actúan mediante hibridación de secuencia específica en el
ARN diana complementario, seguido por separación endonucleolítica.
Los sitios de separación de ribozimas específicos en una diana de
ARN potencial se pueden identificar mediante técnicas conocidas.
Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Rossi, Current Biology,
4:469-41 (1994), y la publicación PCT WO 97/33551
(publicada el 18 septiembre de 1997).
Las moléculas de ácido nucleico en formación de
triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deben ser de
cadena única y compuestas de deoxinucleótidos. La composición de
base de estos oligonucleótidos se diseña de manera que promueve la
formación de triple hélice a través de reglas de emparejado de base
Hoogsteen, que generalmente requieren tramos dimensionables de
purinas o pirimidinas en una cadena de un dúplex. Para detalles
adicionales, por ejemplo, la publicación PCT WO 97/33551,
supra.
Estas moléculas se puede identificar mediante
cualquiera un mediante cualquier combinación de los ensayos de
cribado descritos anteriormente y/o mediante cualquier otra técnica
de cribado bien conocida para los expertos en la materia.
Algunos de los candidatos de fármacos más
prometedores según la presente invención son anticuerpos y
fragmentos anticuerpos que pueden inhibir la producción un producto
génico de genes amplificados identificados aquí y/o reducir la
actividad de los productos génicos.
Los métodos para preparar anticuerpos
policlonales son conocidos por la persona materia. Los anticuerpos
policlonales pueden crecer en un mamífero, por ejemplo, mediante una
o más inyecciones de un agente de inmunización y, si se desea, un
adyuvante. Típicamente, el agente de inmunización y/o el adyuvante
se inyectarán el mamífero mediante múltiples inyecciones
subcutáneas o intraperitoneales. El agente de inmunización puede
incluir el polipéptido PRO o una proteína de fusión del mismo.
Puede ser útil conjugar el agente de inmunización en una proteína
conocida que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza.
Ejemplos de estas proteínas inmunogénicas incluyen pero no están
limitadas a inhibidor de hemocianina de lapa, albúmina de suero,
tiroglobulina bovina, y tripsina de soja. Ejemplos de adyuvantes se
pueden utilizar incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante
MPL-TDM (monofosforil Lípido A, trehalosa
dicorinomicolato sintético). El protocolo de inmunización se puede
seleccionar por parte de un experto en la materia sin
experimentación indebida.
Los anticuerpos anti-PRO pueden,
alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales se pueden preparar utilizando métodos de hibridoma,
tal como los escritos por Kohler and Milstein, Nature, 256:495
(1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal
huésped apropiado, típicamente se inmuniza con un agente de
inmunización para sacar linfocitos que producen son capaces de
producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente de
inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar
in vitro.
El agente de inmunización incluirá típicamente
el polipéptido PRO, incluyendo fragmentos, una proteína de fusión
de esta proteína o un fragmento de la misma. Generalmente, se
utilizan linfocitos de sangre periférica ("PBLs") si se desean
células de origen humano, o se utilizan células del bazo o células
del nódulo linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos.
Los linfocitos se funden a continuación con una línea celular
inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como
polietileno glicol, para formar una célula de hibridoma [Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,
(1986) pp. 59-103]. Las líneas celulares
inmortalizadas son usualmente células de mamíferos transformados,
particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y
humano. Usualmente, se utilizan las líneas celulares de mieloma de
rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un
medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células
inmortalizadas no fundidas. Por ejemplo, si las células parentales
no tiene la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los idiomas incluirá
típicamente hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT
"), cuyo sustancias evitan el crecimiento de células deficientes
de HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son aquellas que se funden de manera eficiente, soportan un nivel
de expresión alto estable del anticuerpo mediante las células que
producen anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal
como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas
son líneas de mieloma de murina, que se pueden obtener, por
ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,
California y la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas,
Virginia. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma
ratón-humano también se han descrito para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J.
Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker,
Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
El medio de cultivo en el cual se cultivan las
células de hibridoma se puede ensayar a continuación para la
presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra polipéptidos
PRO. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos
monoclonales producido por las células de hibridoma se determina
mediante inmunoprecipitación comediante ensayo de unión in vitro,
tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado
con enzimas (ELISA). Estas técnicas y ensayos son conocidos en la
técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por
ejemplo, se puede determinar mediante el análisis Scatchard de
Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridoma
deseadas, los clones se pueden subclonar mediante métodos de
disolución de limitación y crecer mediante métodos estándar [Goding,
supra]. Un medio de cultivo adecuado para este propósito
incluye, por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco y medio
RPMI-1640. Alternativamente, las células de
hibridoma pueden crecer in vico como ascitas en un mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados mediante
los subclones se pueden aislar o purificar a partir del medio de
cultivo concluido de ascitas mediante métodos de purificación de
inmunoglobulina convencionales, tal como, por ejemplo,
cromatografía de proteína A-Sefarosa,
hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis, o por
cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
hacer mediante métodos de ADN recombinante, tal como los descritos
en la patente U.S. 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos
monoclonales de la invención se puede aislar fácilmente y
secuenciar utilizando métodos convencionales (por ejemplo, mediante
la utilización de sondas de oligonucleótidos que son capaces de
unirse específicamente a genes que codifica las cadenas pesadas
ligera de anticuerpos de murina). Las células de hibridoma de la
invención sirven como una fuente preferida de este ADN. Una vez
aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que a
continuación se transfectan en células huésped, tal como células
COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de
mieloma, que de otra manera no producen la proteína de la
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células huésped de recombinantes. El ADN también
se puede modificar, por ejemplo, mediante la sustitución de la
secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada
y ligera humanos en lugar de las secuencias de murina homólogas
[patente U.S. 4.816.567; Morrison et al., supra] o
mediante unión de manera covalente de la secuencia que codifica la
inmunoglobulina en toda o parte de la secuencia de codificación
para un polipéptido de no inmunoglobulina. Este polipéptido de no
inmunoglobulina se puede sustituir a los dominios constantes de un
anticuerpo de la invención, o se puede sustituir por los dominios
variables en un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo
de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
\newpage
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Métodos para preparar anticuerpos monovalentes son
bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método implica la
expresión recombinante de inmunoglobulina de cadena ligera y de
cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en
cualquier punto en la región Fc para evitar la reticulación de
cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes
que sustituyen con otro residuo aminoácido o se eliminan para
evitar la reticulación.
Los métodos in vitro también son
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente
fragmentos Fab, se puede realizar utilizando técnicas de rutina
conocidas en la técnica.
Los anticuerpos anti-PRO también
pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las
formas humanizadas que anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina)
son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o
fragmentos de las mismas (tal como Fv, Fab, Fab',
F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos que se
unen al antígeno) que contienen mínimas secuencias derivadas de
inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en las cuales los
residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del
recipiente se reemplazan mediante residuos de una CDR en especie no
humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene
la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos,
los residuos de marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan
mediante correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos
humanizados también pueden comprender residuos que se encuentran ni
en el anticuerpo recipiente ni en las secuencias de marco o CDR
importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá
sustancialmente todos de por lo menos uno, y típicamente dos,
dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las
regiones FR son la segunda secuencia de consenso de inmunoglobulina
humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá por
lo menos una porción de una región constante (Fc) de
inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones
et al., Nature, 321:522-525 (1986);
Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988);
y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596
(1992)].
Los métodos para humanizar anticuerpos no
humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un
anticuerpo humanizado tiene uno o más más residuos de aminoácidos
introducidos en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos
residuos de aminoácidos no humanos se indican a menudo como residuos
"de importación", que se toman típicamente de un dominio
variable "importación". La humanización se puede erradicar
esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones
et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann
et al., Nature, 332:323-327 (1988);
Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536
(1988)], mediante la sustitución de secuencias CDRs o CDR de roedor
por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En
consecuencia, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos
quiméricos (patente U.S. 4.816.567), donde sustancialmente menos de
un dominio variable humano intacto sea sustituido mediante la
secuencia correspondiente a partir de una especie no humana. En la
práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos
humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos
residuos FR están suscritos por residuos de sitios análogos en
anticuerpos de roedor.
Los anticuerpos humanos en esto de producir
utilizando varias técnicas conocidas en la técnica, incluyendo
librerías de visualización de fago [Hoogenboom and Winter, J. Mol.
Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581
(1991)]. Las técnicas de Cole et al., y Boerner et
al., también están disponibles para la preparación de
anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner
et al., J. Immunol., 147(1):86-95
(1991)]. De una manera similar, los anticuerpos humanos se pueden
hacer mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en
animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes
de inmunoglobulina endógena se han desactivado parcial o
completamente. Bajo cuestión, se observa la producción de
anticuerpos humanos, que se asemeja de manera próxima a lo que se
aprecia en humanos en todos los aspectos, incluyendo la
predisposición de los genes, conjunto y repertorio de anticuerpos.
Esta aproximación se describe, por ejemplo en las patentes U.S.
5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y
en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al.,
Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Lonberg et
al., Nature, 368:856-859 (1994); Morrison,
Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al.,
Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996); Neuberger,
Nature Biotechnology, 14:826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern.
Rev. Immunol., 13:65-93 (1995).
Los anticuerpos también se pueden utilizar en
ADEPT mediante la conjugación del anticuerpo en una enzima de
activación de profármacos que convierte un profármaco (por ejemplo,
un agente de quimioterapia de peptidilo, ver WO 81/01145) en un
fármaco contra el cáncer activo. Ver por ejemplo, WO 88/07378 y
patente U.S. 4.975.278.
El componente de las enzimas del inmunoconjugado
útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un
profármaco de tal manera que se convierte en su forma citotóxica más
activa.
Las enzimas que son útiles en el método
incluyen, pero no están limitadas a glicosidasa, glucosa oxidasa,
lisocima humana, glucuronidasa humana, fosfatasa alcalina útil para
convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres;
arilfulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato
en fármacos libres; citocina deaminasa útil para convertir
5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco contra el
cáncer 5-fluorouracil; proteasas, tales como
proteasa serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas
(por ejemplo, carboxipeptidasa G2 y carboxipeptidasa A) y
catepsinas (tal como catepsinas B y L), que son útiles para
convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres;
D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir
profármacos que contienen sustituyentes de aminoácidos D; enzimas
de carbohidrato-cleavina tales como
\beta-galactosidasa y neuraminidasa útiles para
convertir dientes glicosilados en fármacos libres;
\beta-lactamasa útil para convertir fármacos
derivados con \beta-lactamos en fármacos libres; y
penicilina amidasas, tales como penicilina Vamidasa o penicilina G
amidasa, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos
de amina con grupos de fenoxiacetilo o fenilacetilo,
respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los
anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la
técnica como "abzimas" se pueden utilizar para convertir los
profármacos de la invención en fármacos libres activos (ver, por
ejemplo, Massey, Nature, 328:457-458 (1987)).
Los conjugados anticuerpos-abzima se pueden preparar
tal como se describe aquí para suministro de la abzima a una
población celular tumoral.
Las enzimas se pueden unir de manera covalente a
los anticuerpos anti-PRO mediante técnicas bien
conocidas en la técnica, tal como el uso de agentes de reticulación
heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, se
pueden construir proteínas de fusión que comprenden por lo menos una
región de unión del antígeno del anticuerpo de la invención
enlazado con por lo menos una porción funcionalmente activa de una
enzima de la invención utilizando técnicas de ADN recombinante bien
conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Neuberger et al.,
Nature, 312:604-608 (1984)).
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos
monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen
especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes.
En el presente caso, una de las especificidades de unión es para
polipéptido PRO, otra es para cualquier otro antígeno, y
preferiblemente para una proteína de la superficie de la célula o
un receptor o subunidad receptora.
Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos
son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción
recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión
de los padres de inmunoglobulina de cadena pesada/cadena ligera,
donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades
(Milstein and Cuello, Nature,
305:537-539[1983]). Debido a la distribución
aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de la globulina, estos
hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas
diferentes del anticuerpo, de las cuales solamente una tiene la
estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula
correcta se realiza usualmente mediante etapas de cromatografía de
afinidad. Métodos similares se describen en el documento WO
93/08829, publicado el 13 mayo de 1993, y en Traunecker et
al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Los dominios variables del anticuerpo con las
especificidades de unión deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se pueden fundir consecuencias
de dominio constante de inmunoglobulinas. La fusión preferiblemente
es con un dominio constante de inmunoglobulinas de cadena pesada,
comprende por lo menos parte de las regiones de articulación, CH2,
y CH3. Se prefiere que tenga la primera región constante de cadena
pesada (CHI) que contiene el sitio necesario para la unión de
cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los
ADNs que codifican las fusiones de inmunoglobulinas de cadena pesada
y, si se desea, la inmunoglobulina de cadena ligera, se insertan
vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo
huésped adecuado. Para detalles adicionales de generación de
anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al.,
Methods in Enzymology, 121:210(1986).
Según otra aproximación descrita en la patente
WO 96/27011, la interfaz entre moléculas de anticuerpo se puede
diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros se recuperan a
partir de cultivo celular recombinante. La interfaz preferida
comprende por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio
constante de anticuerpo. En este método, una o más pequeñas cadenas
laterales de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de
anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales mayores (por ejemplo,
tirosina o triptofano). Se crean "cavidades" compensatorias de
tamaño idéntico o similar en las cadenas laterales mayores en la
interfaz de la segunda molécula del anticuerpo mediante el
reemplazo de las cadenas laterales grandes de los aminoácidos con
pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un
mecanismo para aumentar la producción del heterodímero sobre otros
productos finales no deseados tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar
como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las
técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por
ejemplo, se puede preparar anticuerpos biespecíficos utilizando
enlace químico. Brennan et al. Science, 229:81 (1985)
describe un método del cual los anticuerpos intactos se separan de
manera proteolítica para generar fragmentos de F(ab')_{2}.
Estos fragmentos se reducen en presencia del agente del complejo
ditiol de arsenita de sodio para estabilizar ditioles vecinales y
evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab'
generados se transforman a continuación en derivados de
tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados
Fab'-TNB se reconviertan a continuación en el
Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y
se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado
Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los
anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizar como agentes
para la inmovilización selectiva de las enzimas.
Los fragmentos Fab' se pueden recuperar
directamente a partir de E. coli y acoplarse químicamente
para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J.
Exp. Med., 175:217-225 (1992) describe la producción
de una molécula de anticuerpo biespecífico completamente humanizada
F(ab')_{2}. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a
partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico directo
in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El
anticuerpo biespecífico así formado era capaz de unirse a las
células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y las células T humanas
normales, así como el accionamiento de la actividad lítica de los
linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos de tumores de
mamá humanos.
También ser descrito varias técnicas para hacer
y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente
partir de cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han
producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de
leucina. Kostelny et al., J. Immunol.,
148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de
cremalleras de leucina a partir de las proteínas Fos y Jun se
enlazaron con las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes
mediante fusión génica. Los homodímeros el anticuerpo se redujeron
en la región de articulación para formar monómeros en continuación
se volvieron a oxidar para formar los heterodiméros del anticuerpo.
Este método riesgo de utilizar para la producción de homodímeros
del anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por parte
de Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo
alternativo para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los
fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada
(V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L})
mediante un enlace es demasiado corto para permitir el emparejado
entre los dos niños en la misma cadena. En consecuencia, los
dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento son forzados a
emparejarse con los dominios V_{L} and V_{H} complementarios de
otro fragmento, formando así dos sitios de unión con los antígenos.
Otra estrategia para hacer fragmentos anticuerpos biespecíficos
mediante el uso de dímeros de cadena de sinelo Fv (sFv) también se
ha descrito. Ver, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368
(1994).
Los anticuerpos con más de dos valencias se
contemplan. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991).
Anticuerpos biespecíficos de ejemplo se pueden
unir a dos epítopes diferentes en un polipéptido aquí dado.
Alternativamente, un brazo anti-polipéptido se puede
combinar con un brazo que se une a una molécula de activación en un
leucocito tal como una molécula receptora de celular T (por ejemplo,
CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores Fc para IgG (Fc\gammaR), tales
como FcyRI (CD64). También suelen utilizar Fc\gammaRII (CD32) y
Fc\gammaRIII (CD16) para focalizar los mecanismos de defensa
celular en la célula que expresa los anticuerpos biespecíficos de
polipéptido particulares para localizar agentes citotóxicos en
células que expresan un polipéptido particular. Estos anticuerpos
poseen un brazo de una polipéptido y un brazo que se une a un
agente citotóxicos o aún quelador radionucleido, tal como EOTUBE,
DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une
al polipéptido y también se une al factor de tejido (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados están
compuestos de dos anticuerpos unidos de manera covalente. Estos
anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para marcar células
del sistema inmune en células no deseadas [patente U.S. 4.676.980],
y para el tratamiento de impresión VIH [WO 91/00360; WO 92/200373;
EP 03089]. Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar
in vitro utilizando métodos conocidos en química de proteínas
sintéticas, incluyendo los que implican agentes de reticulación.
Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una
relación de intercambio de disulfuro o mediante la formación de una
unión tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito
incluyen iminotiolato y
metil-4-mercaptobutirimidato y los
descritos, por ejemplo, la patente U.S. 4.676.980.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo
respecto a la función efectora, para mejorar la efectividad el
anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo,
se puede introducir residuos de cisteína en la región Fc,
permitiendo así la formación de unión entre cadenas de disulfuro en
esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener
una capacidad de internalización mejorada y/o una capacidad
aumentada de matar células mediadas con camplemento y citotoxicidad
celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver, Caron et
al., J. Exp. Med., 176:1191.1195 (1992) y Shopes, J. Immunol.,
148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos
con actividad antitumoral mejorada también se pueden preparar
utilizando enlaces transversales heterobifuncionales como se
describe en Wolff et al., Cancer Research,
53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede
diseñar un anticuerpo que tenga regions Fc y puede así tener una
lisis de complemento mejorará y capacidades ADCC. Ver,
Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design,
3:19-230 (1989).
La presente solicitud también describe
inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado en un
agente citotóxico como agente de quimioterapia, toxina (por ejemplo,
una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial, fungal,
planta o animal, o fragmentos de las mismas, o una toxina de
molécula pequeña), o un isótopo radiactivo (es decir, un
radioconjugado).
Agentes de quimioterapia útiles en la generación
de estos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las
toxinas de proteínas enzimáticamente activas y fragmentos de las
mismas que se pueden utilizar incluyen cadenas de difteria A,
fragmentos activos de no unión de toxina de difteria, toxina del
cólera, toxina botulímica, cadena de exotoxina A (a partir de
Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricino A, cadena de abrina
A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de
Aleurires fordii, proteínas de diantina, proteínas de
Phytolaca americana (PAPI, PAPII, and
PAP-S), inhibidor de momordica carantia, curcina,
crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, saporina,
mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
Las toxinas de moléculas pequeñas incluyen, por ejemplo,
caliqueamicinas, maitansinoides, palitoxina y CC1065. Una variedad
de radionucleidos están disponibles para la producción de
anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen ^{212}Bi,
^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes de
acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como
N-succinimidil-3-(2-piridildithiol)
propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de
imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos
(tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tal como
glutaraldehído), compuestos bis-acido (tal como bis
(p-acidobenzoil) hexanediamina), derivados
bis-diazonio (tal como
bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina),
diisocianatos (tal como tolieno 2,6-diisocianato),
y compuestos de flúor bis-activos (tal como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino se puede preparar tal como
se describe en Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987).
Ácido
1-isotiocianatohencil-3-metildietileno
triaminepentaacético (MX-DTPA) marcado carbono 14
es un agente quelante de ejemplo para la conjugación del
radionucleótido en el anticuerpo. Ver, WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo se puede
conjugar en un "receptor" (tal como estreptavidina) para su
utilización en el marcador previo de tumores donde el conjugado
anticuerpo-receptor se administra al paciente,
seguido por la retirada del conjugado no unido de la circulación
utilizando un agente de limpieza en continuación la administración
de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga en un
agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).
Los anticuerpos aquí descritos también se pueden
formular como inmunoliposomas. Los liposomas contiene el anticuerpo
se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se
describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA,
82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77:4030 (1980); y en las patentes U.S. 4.485.045 y 4.544,545.
Liposomas con un tiempo de circulación mejorado se describen en la
patente U.S. 5.013.556.
Liposomas particularmente útiles se puede
generar mediante el método de evaporación de fase inversa con una
composición del lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y
fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los
liposomas se extruden a través de filtros de tamaño del poro
definido para producir liposomas con un diámetro deseado.
Fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden
conjugar con los liposomas tal como se describe en Martin et
al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) a través
de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente de
quimioterapia (tal como Doxorubicina) está opcionalmente contenido
en el liposoma. Ver, Gabizon et al., J. National Cancer
Inst., 81(19):1484 (1989).
Los anticuerpos que se unen específicamente al
producto de un gen amplificado aquí identificado, así como otras
moléculas identificadas mediante los ensayos de cribado descritos
anteriormente, se pueden administrar para el tratamiento de
tumores, incluyendo cánceres, en forma de composiciones
farmacéuticas.
Si la proteína codificada mediante el gen
amplificado es intracelular y todos los anticuerpos utilizan como
inhibidores, se prefieren anticuerpos de internalización. Sin
embargo, también se pueden usar lipofecciones liposomas para
suministrar el anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, en las
células. Si se utilizan fragmentos de anticuerpo, el fragmento
inhibitorio más pequeño que se une específicamente al dominio de
unión de la proteína diana se prefiere. Por ejemplo, basado en las
secuencias de región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar
moléculas de péptido que retiene la capacidad de unirse a la
secuencia de proteína diana. Estos péptidos se pueden sintetizar
químicamente y/o producir mediante tecnología de ADN recombinante
(ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90:7R89-7893 [1993]).
Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se
preparan para su almacenamiento mezclando el anticuerpo que tiene
el grado de pureza deseado con portadores opcionales
farmacéuticamente aceptables, incipientes o estabilizadores
(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition. Osol, A. ed.
[1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones
acusas. Los portadores, excipiente es o estabilizadores aceptables
son no tóxicos en los recipientes en las dosis y concentraciones
utilizadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros
ácidos orgánicos: antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y
metionina; preservativos (tales como octadecildimetilbencil cloruro
de amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalcono, cloruro de
benzetonio; alcohol fenol, butilo o bencilo; parabenes alquilo
tales como paraben metilo o propilo: catecol: resorcinol:
ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol);
polipéptidos de bajo peso molecular (menor de aproximadamente 10
residuos); proteínas, tales como albúmina, gelatina o
inmunoglobulinas de suero; polímeros hidrofílicos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos,
disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o
dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como
sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol: sales formadoras de iones
contrarios tales como sodio; complejos de metal (por
ejemplo, complejos de proteína Zn); y/o surfactantes no iónicos
tales como TWEEN^{TM} PLURONICS^{TM} o polyetileno glicol
(PEG).
Compuestos sin anticuerpos identificados
mediante los ensayos de cribado de la presente invención se pueden
formular de una manera análoga, utilizando técnicas estándar bien
conocidas en la técnica.
La formulación aquí también puede contener más
de un compuesto activo tal como sea necesario para la indicación
particular a tratar, preferiblemente aquellas con actividades
complementarias que no son afectadas adversamente entre sí.
Alternativamente, o además, la composición puede comprender un
agente citotóxico, citocina o agente de inhibición del crecimiento.
Estas moléculas están adecuadamente presentes en combinación en
cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos también se pueden
atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas
de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo,
microcápsulas de hidroximetilcelulosa or gelatina y microcápsulas
de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de
suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas,
microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y
nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol. A. ed.
(1980).
Las formulaciones a utilizar para la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue
fácilmente mediante la filtración a través de membranas de
filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación
sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación
sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos
sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices son en forma de
artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.
Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres,
hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente U.S.
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
ethyl-L-glutamato,
etileno-vinil acetato no degradable, copolímeros de
ácido láctico-ácido glicólico degradable tales como LUPRON
DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de
ácido láctico-ácido glicólico y leuprolido acetato), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibuiríco.
Aunque los polímeros tales como etileno-vinil
acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de
moléculas durante unos 100 días, ciertos hidrogeles liberan
proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un largo
período de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado
de la exposición a la humedad a 37ºC, resultando en una pérdida de
actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se
pueden prever estrategias racionales para la estabilización
dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, el mecanismo de
agregación se descubre que es la formación de unión
S-S intermolecular a través del intercambio de
tio-disulfuro, se puede conseguir la estabilización
modificando los residuos sulhidrilo, liofilizando a partir de
soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando
aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matrices de
polímero
específicas.
específicas.
Se contempla que los anticuerpos y otros
compuestos antitumorales de la presente invención se puedan usar
para tratar varias condiciones, incluyendo las caracterizadas por
sobrexpresión y/o activación de los genes amplificados aquí
identificados. Las condiciones o transtornos de ejemplo a tratar con
estos anticuerpos y otros compuestos incluyen, pero no están
limitados a, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos,
moléculas antisentido, etc., incluyendo tumores benignos o malignos
(por ejemplo, carcinomas renales, de bazo, de riñón, de vejiga, de
mama, gástricos, de ovario, colorectales, de próstata, pancreáticos,
de pulmón, vulvales, de tiroides, hepáticos; sarcomas;
glioblastomas; y varios tumores de cabeza y cuello); leucemias y
tumores malignos linfoides; otros transtornos tales como
transtornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y
otrps transtornos glandulares, macrófagos, epiteliales, estromales y
blastocoélicos; y transtornos inflamatorios, angiogénicos e
inmunológicos.
Los agentes antitumorales, por ejemplo,
anticuerpos, se administran a un mamífero, preferiblemente un
humano, según métodos conocidos, tales como administración
intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un
periodo de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperitoneal,
intracerobrospinal, subcutáneas, intra-articular,
intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o inhalación. La
administración intravenosa del anticuerpo se prefiere.
Otros regímenes terapéuticos se pueden combinar
con la administración de agentes contra el cáncer, por ejemplo,
anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a
tratar con estos agentes contra el cáncer puede recibir también
terapia de radiación. Alternativamente, o además, se puede
administrar al paciente un agente quimioterapéutico. La preparación
y las programaciones de dosificación de estos agentes
quimioterapéuticos se pueden usar según las instrucciones del
fabricante o como se determine empíricamente por parte del
practicante experto. La preparación y las programaciones de
dosificación para esta quimioterapia también se describen en
Chemotherapy Service Ed., M.C. Parry, Williams &. Wilkins.
Baltimore, MD (1992). El agente quimioterapéutico puede preceder, o
seguir, la administración del agente antitumoral, por ejemplo,
anticuerpo, o se puede proporcionar simultáneamente con el mismo. El
anticuerpo se puede combinar con un compuesto
anti-estrógenos tal como tamoxifen o un
anti-progesterona tal como onapristona (ver la
patente EP 616 812) en dosis conocidas por estas moléculas.
Puede ser deseable también administrar
anticuerpos contra otros antígenos tumorales asociados, tales como
anticuerpos que se unen al ErbB2, EGFR, ErbB3. ErbB4, o factor
endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o además, dos o más
antígenos que se unen al mismo o a dos o más antígenos diferentes
aquí descritos se pueden coadministrar al paciente. A veces, puede
ser beneficioso también administrar una o más citocinas al paciente.
En una realización preferida, los anticuerpos aquí se coadministran
con un agente de inhibición del crecimiento. Por ejemplo, el agente
de inhibición del crecimiento se puede administrar primero, seguido
por un anticuerpo de la presente invención. Sin embargo, la
administración simultánea o la administración del anticuerpo de la
presente invención primero también se contempla. Las dosis adecuadas
para el agente de inhibición de crecimiento son las actualmente
usadas y se puede bajar debido a la acción combinada (sinergia) del
agente de inhibición del crecimiento y el anticuerpo aquí.
Para la prevención o tratamiento de transtornos,
la dosis apropiada de un agente antitumoral, por ejemplo, un
anticuerpo aquí dependerá del tipo de transtorno a tratar, tal como
se ha definido anteriormente, la severidad y el transcurso del
transtorno, si el agente se administra para propósitos preventivos o
terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y
la respuesta al agente, y la discreción del médico que atiende. El
agente se administra adecuadamente al paciente de una vez o a lo
largo de una serie de tratamientos.
Por ejemplo dependiendo del tipo y severidad del
transtorno, aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por
ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una
dosis candidata inicial para la administración al paciente, sea,
por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o
mediante infusión continua. Una dosis diaria típica podría variar
entre aproximadamente 1 \mug/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de
los factores mencionados anteriormente. Para administraciones
repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el
tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada
de síntomas del transtorno. Sin embargo, otros regímenes de
dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se
monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos
convencionales.
Un artículo de manufactura que contiene
materiales útiles para el diagnóstico o tratamiento de los
transtornos descritos anteriormente también se proporciona. El
artículo de manufactura comprende un contenedor y una marcador. Los
contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales,
jeringuillas, y tubos de prueba. Los contenedores pueden formarse a
partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico.
El contenedor contiene una composición que es efectiva para el
diagnóstico o el tratamiento de la condición y puede tener un
puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una
bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tope que se
puede pinchar mediante una una aguja de inyección hipodérmica). El
agente actrivo en la composición es usualmente un agente
antitumoral capaz de interferir con la actividad de un producto
génico aquí identificado, por ejemplo, un anticuerpo. El marcador
en, o asociada con, el contenedor indica que la composición se usa
para el diagnóstico o el tratamiento de la condición de elección. El
artículo de manufactura también puede comprender un segundo
contenedor que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal
como salino con tampón de fosfato, solución de Ringer y solución de
dextrosa. También puede incluir otros materiales deseables desde un
punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones,
diluyentes, filtros, agujas, jeringuillas, e inserciones de
envasado con instrucciones de uso.
Aunque las proteínas de la superficie de las
células, tales como receptores de crecimiento sobrexpresados en
ciertos tumores son dianas excelentes para candidatos de fármacos o
el tratamiento de tumores (por ejemplo, cáncer), las mismas
proteínas junto con las proteínas secretadas codificadas mediante
los genes amplificados en células tumorales encuentran un uso
adicional en el diagnóstico y prognosis de tumores. Por ejemplo, los
anticuerpos dirigidos contra los productos de las proteínas de
genes amplificados en células tumorales se pueden usar para
diagnóstico o prognosis de tumores.
Por ejemplo, los anticuerpos, incluyendo
fragmentos de anticuerpos, se pueden usar para detectar de manera
cualitativa o cuantitativa la expresión de las proteínas codificadas
mediante los genes amplificados ("productos de genes
marcadores"). El anticuerpo preferiblemente está equipado con una
marca detectable, por ejemplo fluorescente, y la unión se puede
monitorizar mediante microscopio de luz, citometría de flujo,
fluorimetría, y otras técnicas conocidas en la técnica. Estas
técnicas son particularmente adecuadas, si el gen amplificado
codifica una proteína de la superficie de la célula, por ejemplo, un
factor de crecimiento. Estos ensayos de unión se realizan
esencialmente tal como se describe en la sección 5 anterior.
La detección in situ de la unión del
anticuerpo a los productos del gen marcador se puede realizar, por
ejemplo, mediante microscopio de inmunofluorescencia o
inmunoelectrones. Para este propósito, se retira un espécimen
histológico del paciente, y un anticuerpo marcado se aplica al
mismo, preferiblemente colocando el anticuerpo sobre una muestra
biológica. Este método también permite determinar la distribución
del producto del gen marcador en el tejido examinado. Será evidente
para los expertos en la materia que una amplia variedad de métodos
histológicos están fácilmente disponibles para la detección in
situ.
Los siguientes ejemplos se ofrecen solamente por
propósitos ilustrativos, y no están pensados para limitar el
alcance de la presente invención de ninguna manera.
\vskip1.000000\baselineskip
Reactivos comercialmente disponibles indicados
en los ejemplos se utilizaron según las instrucciones del
fabricante, a menos que se indique otra cosa. La fuente de esas
células identificadas en los siguientes ejemplos, y en toda la
memoria, mediante números de acceso ATCC es la American Type Culture
Collection. 10801 University Blvd., Manassas, VA
20110-2209. Todos los depósitos originales indicados
en la presente solicitud se realizaron bajo las provisiones del
Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos para el Propósito de Métodos de
Patentes y sus Reglas (Tratado de Budapest). Esto asegura el
mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años
desde la fecha de depósito. El depósito será disponible por parte
del ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto a un
acuerdo entre Genentech, Inc., y el ATCC, que asegura la
disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del
cultivo del depósito al público bajo la publicación de la pertinente
patente estadounidense o al hacer accesible al público cualquier
solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que se primero,
y asegura la disponibilidad de la progenie al determinado por el
Comisionado estadounidense de Patentes y Marcas que esté capacitado
para ello según el 35 U.S.C. \NAK 122 y las reglas del
comisionado según las mismas (incluyendo 37 C.F.R. \NAK 1.14 con
particular referencia a 886 OG 638).
A menos que se indique otra cosa, la presente
invención usa métodos estándar de tecnología de ADN recombinante,
tales como los descritos anteriormente y en los siguientes libros de
texto: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel et al.,
Current Protocol; in Molecular Biology, Green Publishing Associates
and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis et al., PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press.
Inc., N.Y.. 1990; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait,
Oligonucleotide Synthesis, IRL Press. Oxford. 1984: R.I. Freshney,
Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al,. Current Protocols
in Immunology, 1991.
Las secuencias de dominio extracelular (ECD)
(incluyendo la secuencia de señal de secreción, si la hay) de
aproximadamente 950 proteínas conocidas secretadas de la base de
datos pública Swiss-Prot se usaron para buscar
bases de datos EST. Las bases de datos EST incluyen una base de
datos EST de propiedad (LIFESEQ®. Incyte Pharmaceuticals. Palo
Alto, CA). La búsqueda se realizó usando el programa informático
BLAST o BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology,
266:460-480 (1996)] como comparación de las
secuencias de proteínas ECD en una traducción de 6 marcos de las
secuencias EST. Esas comparaciones que resultaron en una puntuación
BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o mayor que no codificaron
proteínas conocidas se agruparon y juntaron en secuencias de ADN de
consenso con el programa "phrap" (Phil Green. University of
Washington. Seattle. Washington).
Una secuencia de ADN de consenso se juntó con
otras secuencias EST usando phrap tal como se ha descrito
anteriormente. Esta secuencia de consenso se designa aquí ADN
102836. En algunos casos, la secuencia de consenso se deriva de una
secuencia de ADN de consenso intermedia que se extendió usando
ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esa secuencia de
consenso intermedia lo más lejos posible usando las fuentes de
secuencias EST descritas anteriormente.
Basado en la secuencia de consenso ADN102836,
los oligonucleótidos se sintetizaron: 1) para identificar mediante
PCR una librería de ADNc que contenía la secuencia de interés, y 2)
para su uso como sondas para aislar un clon de la secuencia de
codificación de longitud completa para PRO5800. Los prímeros PCR
delantero e inverso generalmente varían entre 20 y 30 nucleótidos y
se designan a menudo para proporcionar un producto PCR de
aproximadamente 100-1000 bp de longitud. Las
secuencias de sonda tienen típicamente una longitud de
40-55 bp. En algunos casos, se sintetizan
oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia de consenso es
mayor de aproximadamente 1-1,5 kbp. Para cribar
varias librerías para un clon de longitud completa, ADN de las
librerías se cribó mediante amplificación PRC, como por Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biology,
supra, con el par de prímeros PCR. A continuación se utilizó
una librería positiva para aislar clones que codifican el gen de
interés usando el oligonucleótido de la sonda y uno de los pares de
prímeros.
Se sintetizaron prímeros PCR (delantero e
inverso):
prímero PCR delantero 1:
| 5'-CAGCGAACCGGGTGCCGGGTC-3' | (SEQ ID NO:21) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR delantero 2:
| 5'-GAGCGACGAGCGCGCAGCGAAC-3' | (SEQ ID NO:22) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR delantero 3:
| 5'-ATACTGCGATCGCTAAACCACCATGCGCCGCCGCCTGTGGCTG-3' | (SEQ ID NO:23) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR inverso 1:
| 5'-GCCGGCCTCTCAGGGCCTCAG-3' | (SEQ ID NO:24) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR inverso 2:
| 5'-CCCACGTGTACAGAGCGGATCTC-3' | (SEQ ID NO:25) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR inverso 3:
| 5-GAGACCAGGACGGGCAGGAAGTG-3' | (SEQ ID NO:26) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR inverso 4:
| 5'-CAGGCACCTTGGGGAGCCGCC-3' | (SEQ ID NO:27) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR inverso 5:
| 5'-CCCACGTGTACAGAGCGGATCTC-3' | (SEQ ID NO:28) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR inverso 6:
| 5'-GAGACCAGGACGGGCAGGAAGTG-3' | (SEQ ID NO:29) |
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se construyó una sonda de hibridación de
oligonucleótidos sintética a partir de la secuencia de ADN 102836
de consenso que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos:
| 5'-CTCTACGGGTACTGCAGGTTCCGGGAGCGCATCGAAGAGAACGG-3' | (SEQ ID NO:30) |
\vskip1.000000\baselineskip
El ARN para la construcción de las librerías de
ADNc se aisló de tejido de hígado fetal humano. Las librerías de
ADNc usadas para aislar los clones de ADNc se construyeron mediante
métodos estándar usando reactivos disponibles comercialmente tales
como los de Invitroeen, San Diego. CA. El ADNc fue cebado con oligo
dT que contiene un sitio NotI, enlazado por extremo romo con
adaptadores con hemiquinasa de Sall, se dividió con NotI, se midió
apropiadamente mediante electroforesis de gel, y se clonó en una
orientación definida en un vector de clonado adecuado (tal como
pRKB o pRKD: pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio
SfiI; sec. Holmes et al., Science,
253:1278-1280(1991)) en los únicos sitios
XhoI y Notl.
El secuenciado de los clones aislados tal como
se ha descrito anteriormente proporcionó la secuencia de ADN de
longitud completa para un polipéptido PRO5800 de longitud completa
(designado aquí como ADN 108912-2680 [Figura 1. SEQ
ID NO: 1]) y la secuencia de proteínas derivadas para ese
polipéptido PRO5800.
El clon de longitud completa identificado
anteriormente contiene un marco único de lectura abierta con un
sitio de iniciación translacional aparente en las posiciones de
nucleótido 7-9 y una señal de terminación en las
posiciones de nucleótido 517-519 (Figura 1: SEQ ID
NO: 1). El precursor de polipéptido predicho tiene una longitud de
170 aminoácidos, tiene un peso molecular de aproximadamente 19,663
daltons y un pI estimado de aproximadamente 11,81. El análisis de
la secuencia de longitud completa PRO5800 mostrada en la figura 2
(SEQ ID NO: 2) evidencia la presencia de una variedad de dominios de
polipéptidos importantes, tal como se muestra en la figura 4, en la
que las posiciones dadas para los dominios de polipéptidos
importantes son aproximadas, tal como se describe anteriormente. El
clon ADN 108912-2680 se depositó con ATCC el 25 de
mayo de 1999 y se le asignó el depósito ATCC No.
PTA-124.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineación de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), evidenció la identidad en
la secuencia entre la secuencia de aminoácidos PRO5800 y las
siguientes secuencias Dayhoff: P_W52595, P_W57313. FGFA_HUMAN,
P_W57264, FGFA_RAT, P_W52597, MMU94517_1, FGFA_MOUSE, P_W57306 y
D86333_1.
\vskip1.000000\baselineskip
Un clon de ADNc (ADN
102880-26891 que codifica un polipéptido PRO6000
humano nativo se identificó usando una criba de levadura, en una
librería de ADNc uterino humano que representa preferentemente los
extremos 5' de los clones de ADNc primario.
\newpage
El clon ADN 102880-2689 contiene
un marco único de lectura abierta con un sitio de iniciación
translacional aparente en las posiciones de nucleótido
28-30 y termina en el codón de terminación en las
posiciones de nucleótido 580-582 (Figura 3: SEQ ID
NO: 3). El precursor de polipéptido predicho tiene una longitud de
184 aminoácidos (Figura 4: SEQ ID NO:4). La proteína de longitud
completa PRO6000 mostrada en la figura 4 tiene un peso molecular
estimado de aproximadamente 21,052 daltons y un pl de
aproximadamente 5,01. El análisis de la secuencia de longitud
completa PRO6000 mostrada en la figura 4 (SEQ ID NO: 4) evidencia la
presencia de una variedad de dominios de polipéptidos importantes,
tal como se muestra en la figura 4, en la que las posiciones dadas
para los dominios de polipéptidos importantes son aproximadas, tal
como se describe anteriormente. El clon
ADN96881-2699 se depositó con ATCC el 20 de julio
de 1999 y se le asignó el depósito ATCC No.
PTA-383.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineación de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), evidenció la identidad en
la secuencia entre la secuencia de aminoácidos PRO6000 y las
siguientes secuencias Dayhoff: SPS_VICFA, ADU85448_1. G64635.
AE001516_3. P_W20328, P_W20747, y SPS_SPIOL.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó ADN96881-2699
mediante la aplicación de un algoritmo de búsqueda de secuencia de
señal de propiedad desarrollado por Genentech. Inc., (South San
Francisco, CA) bajo ESTs, así como la agrupación y unión de
fragmentos EST a partir de bases de datos públicas (por ejemplo,
GenBank) y/o privadas (LIFESEQ®. Incyte Pharmaceuticals. Inc., Palo
Alto. CA). El algoritmo de secuencia de señal computa una puntuación
de señal de secreción basada en el carácter de los nucleótidos de
ADN que rodean el primer y opcionalmente el segundo
codon(es) de metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia
o fragmento de secuencia bajo consideración. Los nucleótidos que
siguen el primer ATG deben codificar al menos 35 aminoácidos no
ambiguos sin ningún codón de terminación. Si el primer ATG tiene
los aminoácidos requeridos, el segundo no se examina. Si ninguno
satisface el requerimiento, la secuencia candidata no se puntúa.
Para determinar si la secuencia EST contiene una secuencia de señal
auténtica, el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes
que rodean el codón ATG se puntúan usando una serie de siete
sensores (parámetros de evaluación) conocidos que se asocian con
señales de secreción.
La utilización del algoritmo de secuencia de
señal descrito anteriormente permitió la identificación de una
secuencia de agrupación EST a partir de la base de datos LIFESEQ®,
Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, designada aquí como 3035248H1.
Esta secuencia de agrupación EST se comparó a continuación con una
variedad de bases de datos de marcas de secuencia expresadas (EST)
que incluían bases de datos EST públicas (por ejemplo, GenBank) y
una base de datos de ADN EST de propiedad (LIFESEQ®. Incyte
Pharmaceuticals, Palo Alto. CA) para identificar las homologías
existentes. La búsqueda de homologías se realizó usando el programa
informático BLAST o BLAST2 (Altshul et al., Methods in
Enzymoloey, 266:460-480 (1996)). Esas comparaciones
resultantes en una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o
mayor que no codificó proteínas conocidas se agruparon y juntaron
en una secuencia de ADN de consenso con el programa "phrap"
(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington). La
secuencia de consenso obtenida a partir de la misma se designa aquí
ADN82389.
A la vista de una homología de secuencia
observada entre la secuencia ADN82389 y una secuencia EST incluida
en el clon no. 3035248H1 de la base de datos LIFESEQ®, Incyte
Pharmaceuticals. Palo Also, CA, se compró el clon no. 3035248H1 y
se obtuvo y secuenció la inserción de ADNc. Se encontró aquí que esa
inserción de ADNc codificó una proteína de longitud completa. La
secuencia de esta inserción de ADNc se muestra en la figura 5 y se
designa aquí como ADN96881-2699.
El clon ADN96881-2699 contiene
un marco único de lectura abierta con un sitio de iniciación
translacional aparente en las posiciones de nucleótido
60-62 y termina en el codón de terminación en las
posiciones de nucleótido 1005-1007 (Figura 5: SEQ
ID NO: 5). El precursor de polipéptido predicho tiene una longitud
de 315 aminoácidos (Figura 5: SEQ ID NO:5). La proteína de longitud
completa PRO6016 mostrada en la figura 6 tiene un peso molecular
estimado de aproximadamente 35,963 daltons y un pl de
aproximadamente 5,38. El análisis de la secuencia de longitud
completa PRO6016 mostrada en la figura 6 (SEQ ID NO: 6) evidencia la
presencia de una variedad de dominios de polipéptidos importantes,
tal como se muestra en la figura 6, en la que las posiciones dadas
para los dominios de polipéptidos importantes son aproximadas, tal
como se describe anteriormente. El clon
ADN96881-2699 se depositó con ATCC el 17 de agosto
de 1999 y se le asignó el depósito ATCC No.
PTA-553.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineación de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la Figura 6 (SEQ ID NO: 6), evidenció la identidad en
la secuencia entre la secuencia de aminoácidos PRO6016 y las
siguientes secuencias Dayhoff: P_W88499: HGS_RE347; P_W88647:
YO87_CAEEL: S44095: P_W03626; P_W03627: IE68_HSVSA: PN0009:
RNU51583_1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó ADN98565-2701
mediante la aplicación de un algoritmo de búsqueda de secuencia de
señal de propiedad desarrollado por Genentech. Inc., (South San
Francisco, CA) bajo ESTs, así como la agrupación y unión de
fragmentos EST a partir de bases de datos públicas (por ejemplo,
GenBank) y/o privadas (LIFESEQ®. Incyte Pharmaceuticals. Inc., Palo
Alto. CA). El algoritmo de secuencia de señal computa una puntuación
de señal de secreción basada en el carácter de los nucleótidos de
ADN que rodean el primer y opcionalmente el segundo
codon(es) de metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia
o fragmento de secuencia bajo consideración. Los nucleótidos que
siguen el primer ATG deben codificar al menos 35 aminoácidos no
ambiguos sin ningún codón de terminación. Si el primer ATG tiene
los aminoácidos requeridos, el segundo no se examina. Si ninguno
satisface el requerimiento, la secuencia candidata no se puntúa.
Para determinar si la secuencia EST contiene una secuencia de señal
auténtica, el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes
que rodean el codón ATG se puntúan usando una serie de siete
sensores (parámetros de evaluación) conocidos que se asocian con
señales de secreción.
La utilización del algoritmo de secuencia de
señal descrito anteriormente permitió la identificación de una
secuencia de agrupación EST a partir de la base de datos LIFESEQ®,
Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, designada aquí como 745575H1.
Esta secuencia de agrupación EST se comparó a continuación con una
variedad de bases de datos de marcas de secuencia expresadas (EST)
que incluían bases de datos EST públicas (por ejemplo, GenBank) y
una base de datos de ADN EST de propiedad (LIFESEQ®. Incyte
Pharmaceuticals, Palo Alto. CA) para identificar las homologías
existentes. La búsqueda de homologías se realizó usando el programa
informático BLAST o BLAST2 (Altshul et al., Methods in
Enzymoloey, 266:460-480 (1996)). Esas comparaciones
resultantes en una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o
mayor que no codificó proteínas conocidas se agruparon y juntaron
en una secuencia de ADN de consenso con el programa "phrap"
(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington). La
secuencia de consenso obtenida a partir de la misma se designa aquí
ADN82411.
A la vista de una homología de secuencia
observada entre la secuencia ADN82411 y una secuencia EST incluida
en el clon no. 745575H1 de la base de datos LIFESEQ®, Incyte
Pharmaceuticals. Palo Also, CA, se compró el clon no. 745575H 1 y
se obtuvo y secuenció la inserción de ADNc. Se encontró aquí que esa
inserción de ADNc codificó una proteína de longitud completa. La
secuencia de esta inserción de ADNc se muestra en la figura 7 y se
designa aquí como ADN98565-2701.
El clon ADN98565-2701 contiene
un marco único de lectura abierta con un sitio de iniciación
translacional aparente en las posiciones de nucleótido
352-357 y termina en el codón de terminación en las
posiciones de nucleótido 3085-3087 (Figura 7: SEQ
ID NO: 7). El precursor de polipéptido predicho tiene una longitud
de 911 aminoácidos(Figura 8: SEQ ID NO:8). La proteína de
longitud completa PRO601 mostrada en la figura 8 tiene un peso
molecular estimado de aproximadamente 99,117 daltons y un pl de
aproximadamente 4,62. El análisis de la secuencia de longitud
completa PRO6018 mostrada en la figura 8 (SEQ ID NO: 8) evidencia la
presencia de una variedad de dominios de polipéptidos importantes,
tal como se muestra en la figura 8, en la que las posiciones dadas
para los dominios de polipéptidos importantes son aproximadas, tal
como se describe anteriormente. El clon
ADN98565-3701 se depositó con ATCC el 3 de agosto de
1999 y se le asignó el depósito ATCC No.
PTA-481.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineación de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la Figura 8 (SEQ ID NO: 8), evidenció la identidad en
la secuencia entre la secuencia de aminoácidos PRO6018 y las
siguientes secuencias Dayhoff: PGCB_BOVIN: P_R85442; P_R77034;
P_R12609; AC003110_2; PGCV_HUMAN; AF116856_1; P_W75099; HGS_A176;
A098
460_1.
460_1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de dominio extracelular (ECD)
(incluyendo la secuencia de señal de secreción, si la hay) de
aproximadamente 950 proteínas conocidas secretadas de la base de
datos pública Swiss-Prot se usaron para buscar
bases de datos EST. Las bases de datos EST incluyen una base de
datos EST de propiedad (LIFESEQ®. Incyte Pharmaceuticals. Palo
Alto, CA). La búsqueda se realizó usando el programa informático
BLAST o BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology,
266:460-480 (1996)] como comparación de las
secuencias de proteínas ECD en una traducción de 6 marcos de las
secuencias EST. Esas comparaciones que resultaron en una puntuación
BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o mayor que no codificaron
proteínas conocidas se agruparon y juntaron en secuencias de ADN de
consenso con el programa "phrap" (Phil Green. University of
Washington. Seattle. Washington).
Una secuencia de ADN de consenso se juntó con
otras secuencias EST usando phrap tal como se ha descrito
anteriormente. Esta secuencia de consenso se designa aquí ADN43048.
En algunos casos, la secuencia de consenso ADN43048 se deriva de
una secuencia de ADN de consenso intermedia que se extendió usando
ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esa secuencia de
consenso intermedia lo más lejos posible usando las fuentes de
secuencias EST descritas anteriormente.
Basado en la secuencia de consenso DNA43048, y a
la vista de una homología de secuencia observada entre la secuencia
ADN43048 y una secuencia EST incluida en el clon no. 1636952 de la
base de datos LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto. CA, se
compró el clon no. 1636952 y se obtuvo y secuenció la inserción de
ADNc. Se encontró aquí que esa inserción de ADNc codificó una
proteína de longitud completa. La secuencia de esta inserción de
ADNc se muestra en la figura 9 y se designa aquí como ADN
119302-2737.
El clon de longitud completa identificado
anteriormente contenía un marco único de lectura abierta con un
sitio de iniciación translacional aparente en las posiciones de
nucleótido 63-65 y una señal de terminación en las
posiciones de nucleótido 2328-2330 (Figura 9. SEQ ID
NO: 9). El precursor de polipéptido predicho tiene una longitud de
755 aminoácidos, tiene un peso molecular calculado de
aproximadamente 82,785 daltons y un pI estimado de aproximadamente
8,71. El análisis de la secuencia de longitud completa PRO6496
mostrada en la figura 10 (SEQ ID NO: 10) evidencia la presencia de
una variedad de dominios de polipéptidos importantes, tal como se
muestra en la figura 10, en la que las posiciones dadas para los
dominios de polipéptidos importantes son aproximadas, tal como se
describe anteriormente. El clon ADN 119302-2737 se
depositó con ATCC el 10 de agosto de 1999 y se le asignó el
depósito ATCC No. PTA-520.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineación de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la Figura 10 (SEQ ID NO: 10), evidenció la identidad en
la secuencia entre la secuencia de aminoácidos PRO6496 y las
siguientes secuencias Dayhoff: P_W81365: NEC3_MOUSE; MUSPRCON14_1:
FURI_HUMAN: P_R77540: S71340: P_W73932; DROFURIISO_I; GEN126
60: y P_R59784.
60: y P_R59784.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de dominio extracelular (ECD)
(incluyendo la secuencia de señal de secreción, si la hay) de
aproximadamente 950 proteínas conocidas secretadas de la base de
datos pública Swiss-Prot se usaron para buscar
bases de datos EST. Las bases de datos EST incluyen (I) bases de
datos EST públicas (por ejemplo, Merck/Washineton
University), y (2) una base de datos EST de propiedad (LIFESEQ®.
Incyte Pharmaceuticals. Palo Alto, CA). La búsqueda se realizó
usando el programa informático BLAST o BLAST2 [Altschul et
al., Methods in Enzymology, 266:460-80 (1996)]
como comparación de las secuencias de proteínas ECD en una
traducción de 6 marcos de las secuencias EST. Esas comparaciones
que resultaron en una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos
90) o mayor que no codificaron proteínas conocidas se agruparon y
juntaron en secuencias de ADN de consenso con el programa
"phrap" (Phil Green. University of Washington. Seattle.
Washington).
Una secuencia de ADN de consenso se juntó con
otras secuencias EST usando phrap tal como se ha descrito
anteriormente. Esta secuencia de consenso se designa aquí ADN38237.
En algunos casos, la secuencia de consenso ADN38237 se deriva de
una secuencia de ADN de consenso intermedia que se extendió usando
ciclos repetidos de BLAST y phrap para extender esa secuencia de
consenso intermedia lo más lejos posible usando las fuentes de
secuencias EST descritas anteriormente.
Basado en la secuencia de consenso DNA38237, y a
la vista de una homología de secuencia observada entre la secuencia
ADN38237 y una secuencia EST incluida en el clon no. 1855755 de la
base de datos LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto. CA, se
compró el clon no. 1855755 y se obtuvo y secuenció la inserción de
ADNc. Se encontró aquí que esa inserción de ADNc codificó una
proteína de longitud completa. La secuencia de esta inserción de
ADNc se muestra en la figura 11 y se designa aquí como ADN
108760-2740.
El clon de longitud completa identificado
anteriormente contenía un marco único de lectura abierta con un
sitio de iniciación translacional aparente en las posiciones de
nucleótido 102-104 y una señal de terminación en
las posiciones de nucleótido 1083-1085 (Figura 11.
SEQ ID NO: 11). El precursor de polipéptido predicho tiene una
longitud de 327 aminoácidos, tiene un peso molecular calculado de
aproximadamente 34,348 daltons y un pI estimado de aproximadamente
7,88. El análisis de la secuencia de longitud completa PRO7154
mostrada en la figura 12 (SEQ ID NO: 12) evidencia la presencia de
una variedad de dominios de polipéptidos importantes, tal como se
muestra en la figura 12, en la que las posiciones dadas para los
dominios de polipéptidos importantes son aproximadas, tal como se
describe anteriormente. El clon ADN 108760-2740 se
depositó con ATCC el 17 de agosto de 1999 y se le asignó el
depósito ATCC No. PTA-548.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineación de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la Figura 12 (SEQ ID NO: 12), evidenció la identidad en
la secuencia entre la secuencia de aminoácidos PRO7154 y las
siguientes secuencias Dayhoff: AF061022_1; AF061024_1; HS889N15_1;
GGY14064_1: GGYI4063_1: AF061023_1; XLU43330_1; Glen14531; MMCARH_1:
y MMU90715_1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó ADN 108722-2743
mediante la aplicación de un algoritmo de búsqueda de secuencia de
señal de propiedad desarrollado por Genentech. Inc., (South San
Francisco, CA) bajo ESTs, así como la agrupación y unión de
fragmentos EST a partir de bases de datos públicas (por ejemplo,
GenBank) y/o privadas (LIFESEQ®. Incyte Pharmaceuticals. Inc., Palo
Alto. CA). El algoritmo de secuencia de señal computa una puntuación
de señal de secreción basada en el carácter de los nucleótidos de
ADN que rodean el primer y opcionalmente el segundo
codon(es) de metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia
o fragmento de secuencia bajo consideración. Los nucleótidos que
siguen el primer ATG deben codificar al menos 35 aminoácidos no
ambiguos sin ningún codón de terminación. Si el primer ATG tiene
los aminoácidos requeridos, el segundo no se examina. Si ninguno
satisface el requerimiento, la secuencia candidata no se puntúa.
Para determinar si la secuencia EST contiene una secuencia de señal
auténtica, el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes
que rodean el codón ATG se puntúan usando una serie de siete
sensores (parámetros de evaluación) conocidos que se asocian con
señales de secreción.
La utilización del algoritmo de secuencia de
señal descrito anteriormente permitió la identificación de una
secuencia de agrupación EST a partir de la base de datos LIFESEQ®,
Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, designada aquí como CLU57836.
Esta secuencia de agrupación EST se comparó a continuación con una
variedad de bases de datos de marcas de secuencia expresadas (EST)
que incluían bases de datos EST públicas (por ejemplo, GenBank) y
una base de datos de ADN EST de propiedad (LIFESEQ®. Incyte
Pharmaceuticals, Palo Alto. CA) para identificar las homologías
existentes. La búsqueda de homologías se realizó usando el programa
informático BLAST o BLAST2 (Altshul et al., Methods in
Enzymoloey, 266:460-480 (1996)). Esas comparaciones
resultantes en una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o
mayor que no codificó proteínas conocidas se agruparon y juntaron
en una secuencia de ADN de consenso con el programa "phrap"
(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington). La
secuencia de consenso obtenida a partir de la misma se designa aquí
ADN58756.
A la vista de una homología de secuencia
observada entre la secuencia ADN58756 y una secuencia EST incluida
en el clon no. 2251462 de la base de datos LIFESEQ®, Incyte
Pharmaceuticals. Palo Also, CA, se compró el clon no. 2251462 y se
obtuvo y secuenció la inserción de ADNc. Se encontró aquí que esa
inserción de ADNc codificó una proteína de longitud completa. La
secuencia de esta inserción de ADNc se muestra en la figura 13 y se
designa aquí como ADN108722-2743.
El clon ADN108723-2743 un único
marco de lectura abierta con un sitio de iniciación translacional en
las posiciones de los nucleótidos 60-62 y que
termina en el codón de terminación en las posiciones de los
nucleótidos 1506-1508 (Figura 13: SEQ ID NO:13). El
precursor del polipéptido predicho tiene una longitud de 482
aminoácidos (Figura 14: SEQ ID NO: 14). La proteína PRO7170 de
longitud completa mostrada en la figura 14 tiene un peso molecular
estimado de aproximadamente 49,060 daltons y un pI de
aproximadamente 4,74. El análisis de la secuencia PRO7170 de
longitud completa mostrada en la Figura 14 (SEQ ID NO: 14) evidencia
la presencia de una variedad de dominios de polipéptidos
importantes, tal como se muestra en la figura 14, en donde las
posiciones dadas para esos dominios de polipéptidos importantes son
aproximadas, tal como se describe anteriormente. El clon
ADN108722-2743 fue depositado con ATCC el 17 de
agosto de 1999 y se asignó el depósito ATCC No.
PTA-552.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineación de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la Figura 14 (SEQ ID NO: 14), evidenció la identidad en
la secuencia entre la secuencia de aminoácidos PRO7170 y las
siguientes secuencias Dayhoff: P_Y12291, 147141. D88733_1.
DMC56G7_1, P_Y11606. HWPI_CANAL. HSMUC5BEX_1, HSU78550_1, HSU70136_
1, y SGS3_DROME.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó ADN119536-2752
mediante la aplicación de un algoritmo de búsqueda de secuencia de
señal de propiedad desarrollado por Genentech. Inc., (South San
Francisco, CA) bajo ESTs, así como la agrupación y unión de
fragmentos EST a partir de bases de datos públicas (por ejemplo,
GenBank) y/o privadas (LIFESEQ®. Incyte Pharmaceuticals. Inc., Palo
Alto. CA). El algoritmo de secuencia de señal computa una puntuación
de señal de secreción basada en el carácter de los nucleótidos de
ADN que rodean el primer y opcionalmente el segundo
codon(es) de metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia
o fragmento de secuencia bajo consideración. Los nucleótidos que
siguen el primer ATG deben codificar al menos 35 aminoácidos no
ambiguos sin ningún codón de terminación. Si el primer ATG tiene
los aminoácidos requeridos, el segundo no se examina. Si ninguno
satisface el requerimiento, la secuencia candidata no se puntúa.
Para determinar si la secuencia EST contiene una secuencia de señal
auténtica, el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes
que rodean el codón ATG se puntúan usando una serie de siete
sensores (parámetros de evaluación) conocidos que se asocian con
señales de secreción.
La utilización del algoritmo de secuencia de
señal descrito anteriormente permitió la identificación de una
secuencia de agrupación EST en la base Incyte, designada aquí como
81575. Esta secuencia de agrupación EST se comparó a continuación
con una variedad de bases de datos de marca de secuencia expresada
(EST) que incluían bases de datos EST públicas (por ejemplo,
GenBank) y una base de datos de ADN EST de propiedad (LIFESEQ®.
Incyte Pharmaceuticals. Palo Alto, CA) para identificar las
homologías existentes. La búsqueda de homologías se realizó usando
el programa informático BLAST or BLAST2 (Altshul et al.,
Methods in Enzymoloey, 266:460-480 (1996)). Esas
comparaciones resultantes en una puntuación BLAST de 70 (o en
algunos casos 90) o mayor que no codificó proteínas conocidas se
agruparon y juntaron en una secuencia de ADN de consenso con el
programa "phrap" (Phil Green, University of Washington,
Seattle, Washington). La secuencia de consenso obtenida a partir de
la misma se designa aquí ADN104391.
En vista de una homología de secuencia observada
entre la secuencia de ADN 104391 y una secuencia EST incluida en el
clon no. 1922888 de la base de datos Incyte, el compró el clon no.
1922888 y se obtuvo y se secuenció la inserción de ADNc. Se
encontró aquí que esa inserción de ADNc codificó una proteína de
longitud completa. La secuencia de esta inserción de ADNc se
muestra en la figura 15 y se designa aquí como
ADN119536-2752.
El clon ADN119536-2753 contiene
un único marco de lectura abierta con un sitio de iniciación
translacional aparente en las posiciones de los nucleótidos
47-49 y que termina en el codón de terminación en
las posiciones de los nucleótidos 311-313 (Figura
15; SEQ ID NO:15). El precursor del polipéptido predicho tiene una
longitud de 88 aminoácidos (figura 16). La proteína PRO7422 de
longitud completa mostrada en la figura 16 tiene un peso molecular
estimado de aproximadamente 9,645 daltons y un pl de aproximadamente
5,45. El análisis de la secuencia PRO07422 de longitud completa
mostrada en la figura 16 (SEQ ID NO:16) evidencia la presencia de
una variedad de importantes dominios de polipéptidos tal como se
muestra en la figura 16, en donde las posiciones dadas por esos
importantes dominios de polipéptidos son aproximadas, tal como se
describe anteriormente. El clon ADN DNA 119536-2753
se ha depositado con ATCC el 17 de agosto de 1999 y se asignó el
depósito ATCC no. PTA-551.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó ADN119542-2754
mediante la aplicación de un algoritmo de búsqueda de secuencias de
señal de propiedad desarrollado por Genentech. Inc.. (South San
Francisco. CA) bajo ESTs, así como agrupando y juntando fragmentos
EST de bases de datos públicas (por ejemplo, GenBank) y/o
privadas (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals. Inc.. Palo Alto. CA).
El algoritmo de secuencia de señal computa una puntuación de señal
de secreción basada en el carácter de los nucleótidos de ADN que
rodean el primer y opcionalmente el segundo codon(es) de
metionina (ATG) en el extremo 5' de la secuencia o fragmento de
secuencia bajo consideración. Los nucleótidos que siguen el primer
ATG deben codificar para por lo menos 35 aminoácidos no ambiguos sin
ningún codón de terminación. Si el primer ATG tiene los aminoácidos
requeridos, el segundo no se examina. Si ninguno satisface el
requerimiento, la secuencia candidata no se puntúa. Para determinar
si la secuencia EST contiene una secuencia de señal auténtica, el
ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes que rodean el
codón ATG se puntúan usando una serie de siete sensores (parámetros
de evaluación) conocidos que se asocian con señales de
secreción.
La utilización del algoritmo de secuencia de
señal descrito anteriormente permitió la identificación de una
secuencia EST a partir de la base de datos LIFESEQ®, Incyte
Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA, designada aquí como el clon
No. 2201182. Esta secuencia EST se comparó con una variedad de bases
de datos de marcas de secuencias expresadas (EST) que incluyen
bases de datos EST públicas (por ejemplo, GenBank) y una base de
datos de ADN EST de de propiedad (LIFESEQ®. Incyte Pharmaceuticals.
Palo Alto, CA) para identificar las homologías existentes. La
búsqueda de homologías se realizó usando el programa informático
BLAST o BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology,
266:460-480 (1996)). Las comparaciones resultantes
en una puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos, 90) o mayor que
no codificaban proteínas conocidas se agruparon y juntaron en una
secuencia de ADN de consenso con el programa "phrap" (Phil
Green, University of Washington, Seattle, Washington). La secuencia
de consenso obtenida a partir de la misma se designa aquí como ADN
104392.
En vista de una homología de secuencia observada
entre la secuencia ADN104392 y una secuencia EST incluida en el
clon no. 2201182 de la base de datos Incyte, se compró el clon no.
2201182 y la inserción de ADNc se obtuvo y secuenció. Se encontró
aquí que esa inserción de ADNc codificó una proteína de longitud
completa. La secuencia de esta inserción de ADNc se designa aquí
como ADN119542-2754.
El clon ADN119542-2754 contiene
un único marco de lectura abierta con un sitio de iniciación
translacional aparente en las posiciones de los nucleótidos
247-249 y que finaliza en el codón de terminación en
las posiciones de los nucleótidos 838-840 (Figura
17: SEQ ID NO:17). El precursor del polipéptido predicho tiene una
longitud de 197 aminoácidos (figura 18). La proteína PRO7431 de
longitud completa que se muestra en la figura 18 tiene un peso
molecular estimado de aproximadamente 21,992 daltons y un pl de
aproximadamente 12,18. El análisis de la secuencia PRO7431 de
longitud completa mostrada en la figura 18 (SEQ ID NO:18) evidencia
la presencia de una variedad de importantes dominios de
polipéptidos, tal como se muestra en la figura 18, en la que las
posiciones dadas para los dominios de polipéptidos importantes son
aproximadas, tal como se ha descrito anteriormente. El clon
ADN119542-2754 se depositó con ATCC el 31 de agosto
de 1999 y se asignó el depósito ATCC no.
PTA-619.
\newpage
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la Figura 18 (SEQ ID NO: 18), evidenció la identidad en
la secuencia entre la secuencia de aminoácidos PRO7431 y las
siguientes secuencias Dayhoff: AF061943_1; RNU08136_1; MAV011838_1:
HXAA_HUMAN: Y653_HUMAN; P_R51263: P_R74041: AF101057_1; AF101058;
AF101059_1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una búsqueda usando el programa
informático BLAST o BLAST2 [Altschul et al., Methods in
Enzymology, 266:460-480 (1996)] de homólogos de
factor de citocina/crecimiento. Se encontró una pieza 94:5 KB que
contenía exones que codifican homólogos del factor de crecimiento,
sin embargo, esta pieza se rompió mediante grandes intrones. Los
intrones se retiraron mediante un algoritmo informático. Basado en
la secuencia de consenso ADN102863, los oligonucleótidos se
sintetizaron: 1) para identificar mediante PCR una librería de ADNc
que contenía la secuencia de interés, y 2) para su uso como sondas
para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud
completa para PRO7476. Los prímeros PCR delantero e inverso
generalmente varían entre 20 y 30 nucleótidos y se designan a
menudo para proporcionar un producto PCR de aproximadamente
100-1000 bp de longitud. Las secuencias de sonda
tienen típicamente una longitud de 40-55. En algunos
casos, se sintetizan oligonucleótidos adicionales cuando la
secuencia de consenso es mayor de aproximadamente
1-1,5 kbp. Para cribar varias librerías para un
clon de longitud completa, ADN de las librerías se cribó mediante
amplificación PRC, como por Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, supra, con el par de
prímeros PCR. A continuación se utilizó una librería positiva para
aislar clones que codifican el gen de interés usando el
oligonucleótido de la sonda y uno de los pares de
prímeros.
prímeros.
Se sintetizaron prímeros PCR (delantero e
inverso):
prímero PCR delantero:
| 5'-ATGCAGCTCCCACTGGCCCTG-3' | (SEQ ID NO: 31) |
\vskip1.000000\baselineskip
prímero PCR inverso:
| 5'-CTAGTAGGCGTTCTCCAGCTCGGCCTG-3' | (SEQ ID NO:32) |
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se construyó una sonda de hibridación de
oligonucleótidos sintética a partir de la secuencia de consenso
ADN102863, que tenía la siguiente secuencia de nucleótidos:
| 5'-CTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTG-3' | (SEQ ID NO: 33) |
\vskip1.000000\baselineskip
El secuenciado de ADN de los clones aislados tal
como se ha descrito anteriormente proporcionó la secuencia de ADN
de longitud completa para un polipéptido PRO7476 de longitud
completa (designado aquí como ADN115253-2757
[Figura 19, SEQ ID NO: 19]) y la secuencia de proteína derivada para
ese polipéptido PRO7476.
El clon de longitud completa identificado
anteriormente contenía un marco único de lectura abierta con un
sitio de iniciación translacional aparente en las posiciones de
nucleótido 62-64 y una señal de terminación en las
posiciones de nucleótido 701-703 (Figura 19. SEQ ID
NO: 19). El precursor de polipéptido predicho tiene una longitud de
213 aminoácidos, tiene un peso molecular calculado de
aproximadamente 24,031 daltons y un pI estimado de aproximadamente
9,59. El análisis de la secuencia de longitud completa PRO7476
mostrada en la figura 20 (SEQ ID NO: 20) evidencia la presencia de
una variedad de dominios de polipéptidos importantes, tal como se
muestra en la figura 20, en la que las posiciones dadas para los
dominios de polipéptidos importantes son aproximadas, tal como se
describe anteriormente. El clon ADN15253-2757 se
depositó con ATCC el 31 de agosto de 1999 y se el asignó el
depósito ATCC No. PTA-612.
Un análisis de la base de datos Dayhoff (versión
35.45 SwissProt 35), usando el análisis de alineación de secuencia
ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa
mostrada en la figura Figure 20 (SEQ ID NO: 20), evidenció la
identidad en la secuencia entre la secuencia de aminoácido PRO7476 y
las siguientes secuencias Dayhoff: P_W58704; P_W95711; P_W09408:
P_Y12009: T08710; P_W4490; P_W27654; P_Y03225; LSHB_MELGA:
AB011030_1.
\newpage
Este ejemplo muestra que los genes que codifican
PRO5800-, PRO6000-, PRO6016-, PRO6018-, PRO6496-, PRO7154-,
PRO7170-, PRO7422-, PRO7431- o PRO7476- se amplifican en el genoma
de ciertos cánceres de pulmón, colon y/o mama humanos y/o líneas
celulares. La amplificación está asociada con la sobreexpresión del
producto del gen, indicando que los polipéptidos son dianas útiles
para la intervención terapéutica en ciertos cánceres tales como
colon, pulmón, mama y otros cánceres. Los agentes terapéuticos
pueden tomar la forma de antagonistas de polipéptidos PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO07154, PRO07170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476, por ejemplo, anticuerpos quiméricos humanos de
murina, humanizados o humanos contra un polipéptido PRO5800,
PRO6000. PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476.
El material inicial para el tamiz era ADN
genómico aislado a partir de una variedad de cánceres. El ADN se
cuantifica e manera precisa, por ejemplo, de manera fluorométrica.
Como control negativo, se aisló ADN de las células de diez
individuos sanos normales que se separó y usó como controles de
ensayo para la copia de los genes en individuos sanos (no
representados). El ensayo de nucleasa 5' (por ejemplo,
TaqMan^{TM}) y PCR cuantitativo en tiempo real (por ejemplo, ABI
Prizm 7700 Sequence Detection System^{TM} (Perkin Elmer, Applied
Biosystems Division, Foster City, CA)), se utilizó para encontrar
genes potencialmente amplificados en ciertos cánceres. Los
resultados se usaron para determinar si el ADN que codifica PRO5800,
PRO6000. PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476 está sobre-representado en
cualquiera de los cánceres de pulmón o colon primario o las líneas
celulares cancerígenas o líneas celulares de cáncer de mama que se
cribaron. Los cánceres de pulmón primarios se obtuvieron a partir de
individuos con tumores del tipo y etapa como se indica en la tabla
4. Una explicación de las abreviaciones usadas para la designación
de los tumores primarios listados en la tabla 4 y los tumores
primarios y líneas celulares indicadas a lo largo de este ejemplo
se ha proporcionado anteriormente.
Los resultados del TaqMan^{TM} se indican en
unidades delta (\Delta) Ct. Una unidad corresponde a un ciclo PCR
o aproximadamente a una amplificación 2 veces respecto al normal,
sus unidades corresponden a 4 veces. 3 unidades a una amplificación
de 8 veces, etc. la cuantificación se obtuvo utilizando prímeros y
una sonda fluorescente TaqMan^{TM} derivada de los genes que
codifican PRO5800-, PRO6000-. PRO6016-, PRO6018-, PRO6496-,
PRO7154-, PRO7170-, PRO7422-, PRO7431- o PRO7476-. Las regiones de
PRO5800, PRO6000. PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170,
PRO7422 PRO7431 o PRO7476 que son más propensas a contener
secuencias de ácido nucleico único y que por lo menos son propensas
a separar intrones se prefieren para el prímero y la derivación de
la sombra, por ejemplo, regiones 3' no trasladadas. Las secuencias
para los prímeros y las ondas (adelante, inversa y sonda)
utilizadas para el análisis de amplificación de genes PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018. PRO6496, PRO07154, PRO7170. PRO07422,
PRO7431 o PRO7476 fueron como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
PRO5800 (ADN
108912-2680):
108912.tm.f1:
| 5'-GCGTCGTGGTCATCAAAG-3' | (SEQ ID NO:34.) |
108912.tm.r1:
| 5'-TGCAGTCCACGGTGTAGAG-3' | (SEQ ID NO:35) |
108912.tm.p1:
| 5'-CTTCTACGTGGCCATGAACCGC-3' | (SEQ ID NO:36) |
108912.tm.f2:
| 5'-CCTGGAGATCCGCTCTGTA-3' | (SEQ ID NO:37) |
108912.tm.p2;
| 5'-CTTGATGACCACGACGCCCA-3' | (SEQ ID NO:38) |
108912.tm.r2:
| 5'-ACGTAGAAGCCTGAGGACACT-3' | (SEQ ID NO:39) |
\newpage
PRO6000 (ADN
102880-2689):
102880.tm.f1:
| 5'-GATGCTCCAGCTGAAATCC-3' | (SEQ ID NO:40) |
102880.tm.r1:
| 5'-CACATGGCTGGAAATGATG-3' | (SEQ ID NO:41) |
102880.tm.p1:
| 5'-AAGCTAAGCTCCCAACTGACAGCCA-3' | (SEQ ID NO:42) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PRO6016
(ADN96891-2699):
96881.tm.f1:
| 5'-TGGCCTACATGTGTCTTCATC-3' | (SEQ ID NO:43) |
96881.tm.r1:
| 5'-CACAACTTTCTGGTCATATTCCAT-3' | (SEQ ID NO:44) |
96881.tm.p1:
| 5'-CCTGCCCCAAGACGGCATTAG-3' | (SEQ ID NO:45) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PRO6018
(ADN98565-2701):
98565.tm.f1:
| 5'-CCTGGGCACCAGATCTTC-3* | (SEQ ID NO:46) |
98565.tm.r1:
| 5;-AGGGCAGTTGAGGCACTT-3' | (SEQ ID NO:47) |
98S65.tm.p1:
| 5'-CATCAGGGCCGGAGTAAATCCCT-3' | (SEQ ID NO:48) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PRo6496
(ADN119302-2737):
119302.tm.f1:
| 5'-TCCATGGACCTCCCACTATAC-3' | (SEQ ID NO:49) |
I 19302.tm.r1:
| 5'-GCTGACAACTTCAGGTTCCA-3' | (SEQ ID NO:50) |
119302.tm.p1:
| 5'-ACCCCCACCAAACCCCAGGT-3' | (SEQ IDNO:51) |
\newpage
PRo7154 (ADN
108760-2740):
108760.tm.f1:
| 5'-GATCTCTGAGCACACTTGTATGAG-3' | (SEQ ID NO:52) |
108760.tm.r1:
| 5'-GGCAGACGAGGGTCTTTC-3' | (SEQ ID NO:53) |
108760.tm.p1:
| 5'-CAGGAACCCCTTGCTAGAATCAGCC-3' | (SEQ ID NO:54) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PRO7170
(ADN108722-2743):
108722.tm.f1:
| 5'-CCCAGAAGGTTCCCATGA-3' | (SEQ ID NO:55) |
108722.tm.r1:
| 5'-GGGTCCTGTTGCCACATC-3' | (SEQ ID NO:56) |
108122.tm.p1:
| 5'-CAGCATGTCCAAGCCCCTAACCC-3' | (SEQ ID NO:57) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PRO7422
(ADN119536-2752):
119536.tm.f1:
| 5'-TCTCCCCGATTCTCATCTG-3' | (SEQ ID NO:58) |
119536.tm.r1:
| 5'-CCCTGAGAGTCCTGCACAT-3' | (SEQ ID NO:59) |
119536.tm.p1:
| 5'-CCCATAATCATGGACACAGCCCC-3' | (SEQ ID NO:60) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PRO7431
(ADN119542-2754):
119542.tm.f1:
| 5'-AGTGAAGTTTCTCCAGTCCCTAG'T-3' | (SEQ ID NO:61) |
119542.tm.r1:
| 5'-CCTGGGGTAAGTGAGCAAA-3' | (SEQ ID NO:62) |
1199542.tm.p1:
| 5'-CCTCTCTTTTCACCCACCTTCCTCAG-3' | (SEQ ID NO:63) |
\newpage
PRO07476
(ADN115353-2757):
115253.tm.f1:
| 5'-GGGACTGGTTAAGAAAGTTGGAT-3' | (SEQ ID NO:64) |
115253.tm.r1:
| 5'-CGCCTCAGGCTTTCTGAT-3' | (SEQ ID NO:65) |
115253.tm.p1:
| 5'-AGATTCCCCCTTGCACCTCGC-3' | (SEQ ID NO:66) |
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de ensayos de nucleasa 5' es una
técnica basada en PCR fluorescente que hace uso de la actividad de
la exonucleasa 5' de la enzima de polimerasa de ADN Taq para
monitorizar la amplificación en tiempo real. Se utilizan dos
prímeros oligonucleótidos para generar una ampliación típica de una
reducción PCR. Un tercer oligonucleótido, o sonda, se diseña para
detectar la secuencia de nucleótidos situada entre los dos prímeros
PCR. La sonda es no extensible mediante encima de polimerasa de ADN
Taq, y se marca con una tinta fluorescente reportera y una tinta
fluorescente de apagado. Cualquier emisión inducida con láser desde
la quinta reportera se apaga mediante la tinta de apagado cuando las
dos cintas están situadas cercanas entre sí cuando están sobre la
sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima de polimerasa
de ADN Taq separa la sonda de una manera dependiente de la
plantilla. Los fragmentos de la sonda resultante se disocian en
solución, y la señal de la quinta reportera liberada está libre del
efecto de apagado del segundo fluoróforo. Una molécula de la quinta
reportera se libera para cada nueva molécula sintetizada,
y la detección de la tinta reportera no apagada proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.
y la detección de la tinta reportera no apagada proporciona la base para la interpretación cuantitativa de los datos.
El método de nucleasa 5' se realiza en un
dispositivo PCR cuantitativo en tiempo real, tal como la secuencia
detección ABI Prism 7700TM. El sistema consiste en un termociclo,
láser, dispositivo acoplado de carga (CCD), cámara y ordenador. El
sistema amplifica las muestras en un formato de 96 pozos en un
termociclo. Durante la amplificación la señal fluorescente inducida
con láser se recoge en tiempo real a través de cables de fibra
óptica para todos los 96 pozos,
y se detectan en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.
y se detectan en el CCD. El sistema incluye software para hacer funcionar el instrumento y para analizar los datos.
Los datos del ensayo de nuclease 5' se
expresaron inicialmente como Ct, o el ciclo límite. Esto se define
como el ciclo en el cual la señal reportera se acumula por encima
del nivel del fondo de fluorescencia. Los valores \DeltaCt se
utilizan como medición cuantitativa del número relativo de copias
iniciales de una secuencia diana particular en una muestra de ácido
nucleico cuando se compara resultados de ADN canceroso con
resultados de ADN humano normal.
La tabla 4 describe la etapa, la etapa T y la
etapa N de varios tumores primarios que se utilizaron para cribar
los compuestos PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154,
PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 de la invención.
Se preparó ADN a partir de líneas celulares
cultivadas, tumores primarios y sangre humana normal. El
aislamiento se realizó utilizando un equipo de purificación, un
ajuste de tampón y proteasa y todos de Qiagen, según las
instrucciones del fabricante y la descripción a continuación.
Las células se lavaron y tripsinaron a una
concentración de 7,5 x 10^{8} por punta y se formaron en cuentas
mediante centrifugación a 1000 rpm durante cinco minutos a 4ºC,
seguido por un lavado adicional con 1/2 volumen de PBS y
recentrifugación. Las cuentas se lavaron una tercera vez, las
células suspendidas se recogieron y se lavaron dos veces con PBS.
Las células se suspendieron a continuación en 10 ml de PBS. Se
equilibró tampón de Cl a 4ºC. Se diluyó proteasa Qiagen #19155 en
6,25 ml de ddH_{2}0 frío en una concentración final de 20 mg/ml y
se equilibró a 4ºC. 10 ml de tampón G2 se preparó mediante la
disolución de stock de Qiagen RNAse A (100 mg/ml) en una
concentración final de 200 \mug/ml.
Se añadieron a continuación tampón C1 (10 ml,
4ºC) y ddH2O (40 ml, 4ºC) a los 10 ml de suspensión celular, se
mezclaron mediante inversión y se incubaron sobre hielo durante 10
minutos. Los núcleos de las células se formaron en cuentas mediante
centrifugación en un rotor de cubeta giratoria Beckman a 2500 rpm a
4ºC durante 15 minutos. El supernatante se descartó los núcleos se
suspendieron con un vórtice en 2 ml de tampón C1 (a 4ºC) y 6 ml
ddH2O, seguido por una segunda centrifugación a 4ºC a 2500 rpm
durante 15 minutos. Los núcleos se resuspendieron a continuación en
el tampón residual usando 200 \mul por punta. Se añadió tampón G2
(10 ml) a los núcleos suspendidos mientras aplicó centrifugación
con vórtice suave. Después de la finalización de la división de
tampón, se aplicó una centrifugación con vórtice vigorosa durante 30
segundos. Se añadió proteasa Qiagen (200 \mul, preparada como se
indicó anteriormente) y se incubó a 50ºC durante 60 minutos. La
incubación y la centrifugación se repitieron hasta que los lisatos
estaban depurados (por ejemplo, incubando 30-60
minutos adicionales, formando cuentas a 3000 x g durante 10 min.,
4ºC).
Las muestras de los tumores se pesaron y
colocaron en tubos cónicos de 50 ml y se mantuvieron sobre hielo.
El procesamiento se limitó a no más de 250 mg de tejido por
preparación (1 punta/preparación). La solución de proteasa se
preparó de nuevo mediante disolución en 6,25 ml de ddH_{2}O frío
en una concentración final de 20 mg/ml y se almacenó a 4ºC. Se
preparó tampón G2 (20 ml) mediante la disolución de DNAse A en una
concentración final de 200 mg/ml (a partir de stock de 100 mg/ml
stock). El tejido del tumor se homogeneizó en 19 ml de tampón G2
durante 60 usando la gran punta del polytron en una madera TC de
flujo laminar para evitar la inhalación de aerosoles y se mantuvo a
temperatura ambiente. Entre las muestras, el polytron se depuró
mediante rotación a 2 x 30 cada uno 2L EN de ddH_{2}0, seguido
por tampón G2 buffer (50 ml). Si el tejido estaba todavía presente
la punta del generador, el aparato se desmontó y limpió.
Se añadió proteasa Qiagen (preparada como se
indicó anteriormente, 1,0 ml), seguido mediante centrifugación con
vórtice e incubación a 50ºC durante tres horas. La incubación y la
centrifugación se repitieron hasta que los lisatos estaban
purificados (por ejemplo, incubando durante 30-60
minutos adicionales, formando cuentas a 3000 x g durante 10 min.,
4ºC).
Se retiró sangre de voluntarios sanos utilizando
protocolos de agente infeccioso estándar y se trataron con citrato
en muestras de 10 ml por punta. Se preparó de nuevo proteasa Qiagen
mediante disolución en 6,25 ml de ddH_{2}O frío con una
concentración final de 20 mg/ml y se almacenó a 4ºC. Se preparó
tampón G2 mediante la disolución de RNAse A con una concentración
final de 200 \mug/ml a partir de stock de 100 mg/ml. La sangre
(10 ml) se colocó en un tubo cónico de 50 ml y se añadieron 10 ml de
tampón C1 y 30 ml de ddH_{2}O (ambos previamente equilibrados a
4ºC), y los componentes se mezclaron mediante inversión y se
mantuvieron sobre hielo durante 10 minutos. Los núcleos se hicieron
cuentas con un rotor de cubeta giratoria Beckman a 2500 rpm, 4ºC
durante 15 minutos y el supernatante se descartó. Con un vórtice,
los núcleos se suspendieron en 2 ml de tampón C1 (4ºC) y 6 ml de
ddH_{2}O (4ºC). La centrifugación con vórtice se repitió hasta que
la cuenta era blanca. Los núcleos se suspendieron a continuación en
el tampón residual utilizando una punta de 200 \mul. Se añadió
tampón G2 (10 ml) a los núcleos suspendidos mientras se
centrifugaron con vórtice suavemente seguido por la centrifugación
con vórtice vigorosa durante 30 segundos. Se añadió proteasa Qiagen
(200 \mul) y se incubaron a 50ºC durante 60 minutos. La
incubación y la centrifugación se repitieron hasta que los lisatos
estaban depurados (por ejemplo, incubando 30-60
minutos adicionales, formando cuentas a 3000 x g durante 10 min.,
4ºC).
El ADN genómico se equilibró (una muestra por
preparación de punta máxima) con 10 ml de tampón QBT. El tampón de
elución QF se equilibró a 50ºC. Las muestras se centrifugaron en
vórtice durante 30 segundos, a continuación se cargaron sobre
puntas equilibradas y se drenaron por gravedad. Las puntas se
lavaron con 2 x 15 ml de tampón QC. El ADN se eluyó en tubos Corex
de 30 ml silanizados y cn autoclave con 15 ml de tampón QF (59ºC).
Se añadió isopropanol (10,5 ml) a cada muestra, los grupos se
cubrieron con parafina y se mezclaron mediante inversión repetida
hasta que el ADN precipitó. Las muestras se formaron en cuentas
mediante centrifugación en el rotor SS-34 a 15.000
revoluciones por minuto durante 10 minutos a 4ºC. Se marcó la
situación de las cuentas, los supernatantes se descartaron, y se
añadieron 10 ml de 70% etanol (4ºC). Las muestras se formaron en
cuentas otra vez mediante centrifugación en el rotor
SS-34 a 10.000 revoluciones por minuto durante 10
minutos a 4ºC. Se marcó la situación de las cuentas y se descartó el
supernatante. Los tubos se colocaron a continuación sobre su lado
en una pista de secado y se secaron 10 minutos a 37ºC, teniendo
cuidado de no secar excesivamente las muestras.
Después del secado, las cuentas se disolvieron
en 1,0 ml TE (pH 8,5) y se colocaron a 50ºC durante
1-2 horas. Las muestras se mantuvieron durante la
noche a 4ºC como disolución continuada. La solución de ADN se
transfirió a continuación a tubos de 1,5 ml con una aguja calibrada
26 en una jeringuilla de tuberculina. La transferencia se repitió
cinco veces para cortar el ADN. Las muestras se colocaron a
continuación a 50ºC durante 1-2 horas.
Los niveles de vez en cada tubo se cuantificaron
mediante espectrofotometría A_{260}/A_{280} estándar en una
disolución 1:20 (5 \mul DNA + 95 \mul ddH_{2}O) utilizando las
cubetas de cuarzo de 0,1 ml en el espectrofotómetro Beckman DU640.
Las relaciones A_{260}/A_{280} estaban en el rango de
1,8-1,9. Cada muestra de ADN se diluyó a
continuación de manera adicional a aproximadamente 200 ng/ml en TE
(pH 8,5). El material original estaba muy concentrado
(aproximadamente 700 ng/\mul), en antes de se colocó a 50ºC
durante varias horas hasta que se resuspendió.
La cuantificación de AND fluorométrica se
realiza continuación sobre material diluido (20-600
ng/ml) utilizando las directrices del fabricante tal como se
modificó a continuación. Esto se realizó dejando que un fluorómetro
Hoeffer DyNA Quant 200 se calentara durante aproximadamente 15
minutos. La solución de trabajo de tinta Hoechst (#H33258, 10
\mul, preparada en 12 horas de uso) se diluyó en 100 ml de tampón
1 x TNE. Una cubeta de 2 ml se llenó con la solución del
fluorómetro, se colocó en la máquina, y la máquina se puso a cero,
se añadió pGEM 3Zf(+) (2 \mul, lot #360851026) a 2 ml de solución
de fluorómetro y se calibró en 200 unidades 200. 2 \mul
adicionales de ADN pGEM 3of(+) DNA se probaron a continuación y la
lectura se confirmó en 400 +/- 10 unidades. Cada muestra se leyó a
continuación por lo menos por triplicado. Cuando se encontró que
tres muestras estaban dentro del 10% entre sí, se tomó su promedio y
este valor se tomó como el valor de cuantificación.
La concentración determinada de manera
flurométrica utilizó a continuación para diluir cada muestra a 10
ng/\mul en ddH_{2}O. Esto se realizó simultáneamente en todas
las muestras de la plantilla para un único ensayo de placa
TaqMan^{TM}, y con suficiente material para realizar
500-1000 ensayos. Las muestras se probaron por
triplicado con prímeros Taqman^{TM} y se sondaron con
B-actina y GAPDH en una única placa con ADN humano
normal y sin controles de plantilla. Las muestras diluidas se
utilizaron previendo que el valor CT de ADN humano normal restado
el ADN de prueba era de +/- 1 Ct. El ADN genómico cualificado por
lotes diluido se almacenó en alícuotas de 1,0 ml a -80ºC. Las
alícuotas que se utilizaron posteriormente en el ensayo de
amplificación de genes se almacenaron a 4ºC. Cada alícuota de 1 ml
suficiente para 8-9 placas o 64 pruebas.
Los compuestos PRO5800, PRO6000. PRO6016.
PRO6018. PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 de
la invención se cribaron en los siguientes tumores primarios de los
valores resultantes ACt se indican en la tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
PRO5800 (ADN
108912-2680):
Los valores \DeltaCt para ADN
108912-2680 en una variedad de tumores se indican en
la Tabla 5. Un \DeltaCt de >1 se usó típicamente como valor
límite para marcador de amplificación, ya que representa el doble
de la copia del gen. La tabla 5 indica que la amplificación
significativa de ácido nucleico de ADN 108912-2680
que codifica PRO5800 se produjo en tumores de pulmón primarios:
HF-001644 y HF-001647.
Como la amplificación de ADN
108912-2680 se produce en varios tumores de pulmón,
es muy probable que juegue un papel significativo en la formación o
crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que los agonistas
(por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteína codificada
mediante ADN 108912-2680 (PRO5800) tengan utilidad
en la terapia contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
PRO6000 (ADN
102880-2689):
Los valores \DeltaCr para
ADN102880-2689 en una variedad de tumores se indican
en la Tabla 5. Un \DeltaCt de >1 se usó típicamente como el
valor límite para el marcador de aplicación, ya que representa un
doble de la copia del gen. La tabla 5 indica que se produjo una
amplificación significativa de ácido nucleico de ADN
102880-2689 que codifica PRO6000 en el tumor de
pulmón primario HF-001295.
Como la amplificación del ADN
102880-2689 se produce en tumor de pulmón, es muy
probable que juegue un papel significativo en la formación o el
crecimiento del tumor. Como resultado, se espera que los
antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la
proteína codificada mediante ADN 102880-2689
(PRO6000) tengan utilizad en la terapia contra el cáncer.
\newpage
PRO6016
(ADN96881-2699):
Los valores \DeltaCt para
ADN96881-2699 en una variedad de tumores se indican
en la Tabla 5. Un ACt de >1 se usó típicamente como valor límite
para el marcador de amplificación, ya que este representa el doble
de la copia del gen. La tabla 5 indica que se produjo una
amplificación significativa del ácido nucleico de
ADN96881-3699 que codifica PRO6016: (1) en el tumor
de pulmón primario HF-000641: y (2) en centros de
tumor de colon primario: HF-000762,
HF-000789 y HF-000811.
Como la amplificación del
ADN96881-2699 se produce en varios tumores, es muy
probable que juegue un papel significativo en la formación o
crecimiento de tumores. Como resultado, se esperan que los
antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la
proteína codificada mediante ADN96881-2699 (PRO6016)
tenga utilidad en la terapia contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
PRO6018
(ADN98565-2701):
Los valores \DeltaCt para
ADN98565-2701 en una variedad de tumores se indican
en la Tabla 5. Un ACt de >1 se usó típicamente como el valor
límite para el marcador de amplificación, ya que representa el doble
de la copia del gen. La tabla 5 indica que se produjo una
amplificación significativa de ácido nucleico de
ADN98565-2701 que codifica PRO6018: (1) en el tumor
de pulmón primario HF-000840: y (2) en el centro del
tumor de colon primario HF-000811.
Como la amplificación del
ADN98565-3701 se produce en varios tumores, es muy
probable que juegue un papel significativo en la formación y el
crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que los
antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la
proteína codificada mediante ADN98565-2701 (PRO6018)
tengan utilidad en la terapia contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
PRO6496
(ADN119302-2737):
Los valores \DeltaCt para
ADN119302-2737 en una variedad de tumores se indican
en la Tabla 5. Un \DeltaCt de >1 se usó típicamente como el
valor límite para el marcador de amplificación, ya que representa
un doble de la copia del gen. La tabla 5 indica que se produjo una
amplificación significativa de ácido nucleico de
ADN119302-2737 que codifica PRO6496 en tumores de
pulmón primarios: HF-000840,
HF-000842, HF-001294 y
HF-001296.
Como la amplificación del
ADN119302-2737 se produce en varios tumores de
pulmón, es muy probable que juegue un papel significativo en la
formación o crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que
los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la
proteína codificada mediante ADN119302-2737
(PRO6496) tenga utilidad en la terapia contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
PRO7154
(ADN108760-2740):
Los valores ACt para
ADN108760-2740 en una variedad de tumores se indican
en la Tabla 5. Un \DeltaCt de >1 se usó típicamente como el
valor límite para el marcador de amplificación, ya que representa un
doble de la copia del gen. La tabla 5 indica que se produjo una
amplificación significativa de ácido nucleico de ADN
108760-2740 que codifica PRO7154 en tumores de
pulmón primarios: HF-001296 y
HF-001299.
Como la amplificación del
ADN108760-2740 se produce en varios tumores de
pulmón, es muy probable que juegue un papel significativo en la
formación o crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que
los antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la
proteína codificada mediante ADN 108760-2740
(PRO7154) tengan utilidad en la terapia contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
PRO7170 (ADN
108722-2743):
Los valores \DeltaCt para
ADN108722-2743 en una variedad de tumores se indican
en la Tabla 5. Un \DeltaCt de >1 se usó típicamente como el
valor límite para el marcador de amplificación, ya que representa
un doble de la copia del gen. La tabla 5 indica que se produjo una
amplificación significativa de ácido nucleico de ADN
108722-2743 que codifica PRO7170 en el tumor de
pulmón primario HF-001296.
Como la amplificación del
ADN108722-2743 se produce en tumores de pulmón, es
muy probable que juegue un papel significativo en la formación o
crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que los
antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la
proteína codificada mediante ADN108722-2743
(PRO7170) tengan utilidad en la terapia contra el cáncer.
\newpage
PRO7422
(ADN119536-2752):
Los valores \DeltaCt para
ADN119536-2752 en una variedad de tumores se indican
en la Tabla 5. Un ACt de >1 se usó típicamente como el valor
límite para el marcador de amplificación, ya que representa un
doble de la copia del gen. La tabla 5 indica que se produjo una
amplificación significativa de ácido nucleico de
ADN119536-2752 que codifica PRO7422 en el tumor de
pulmón primario HF-001647.
Como la amplificación de
ADN119536-2752 se produce en tumor de pulmón, es muy
probable que juegue un papel significativo en la formación o
crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que los
antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la
proteína codificada mediante ADN119536-2752
(PRO7422) tenga utilidad en la terapia contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
PRO7431
(ADN119542-2754):
Los valores ACt para
ADNA119542-2754 en una variedad de tumores se
indican en la tabla 5. Un \DeltaCt de >1 se usó típicamente
como el valor límite para el marcador de amplificación, ya que
representa un doble de la copia del gen. La tabla 5 indica que se
produjo una amplificación significativa de ácido nucleico de
ADN119542-2754 que codifica PRO7431: (1) en tumor
central de testículos HF-000733: (2) en tumor
central de colon primario: HF-000539: y (3) en
tumores primarios de pulmón: HF-000842 y
HF-001296.
Como la amplificación de
ADN119542-2754 se produce en varios tumores, es muy
probable que juegue un papel significativo en la formación o
crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que los
antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la
proteína codificada mediante ADN119542-2754
(PRO7431) sean útiles en la terapia contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
PRO7476
(ADN115253-2757):
Los valores ACt para
DNA115253-2757 en una variedad de tumores indican en
la tabla 5. Un \DeltaCt de >1 se usó típicamente como el valor
límite para el marcador de amplificación, ya que representa un doble
de la copia del gen. La tabla 5 indica que se produjo una
amplificación significativa de ácido nucleico de
ADN115253-2757 que codifica PRO7476: (1) en tumor
central de testículos HF-000733: (2) en tumor
central de colon primario: HF-000539 y
HF-000575: y (3) en tumores de pulmón primarios
HF-001294 y HF-001296.
Como la amplificación del
DNA115253-2757 se produce en varios tumores, es muy
probable que juegue un papel significativo en la formación o
crecimiento de tumores. Como resultado, se espera que los agonistas
(por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la proteína codificada
mediante ADN115253-2757 (PRO7476) tengan utilidad
en la terapia contra el cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente método describe la utilización de
una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476 como sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia de
codificación de un polipéptido de longitud completa o maduro
"PRO5800", "PRO6000", "PRO6016", "PRO6018",
"PRO6496", "PRO7154", "PRO7170", "PRO7422",
"PRO7431" o "PRO7476" tal como se describe aquí y/o
fragmentos de los mismos se pueden utilizar como una sonda para
cribar ADNs homólogos (tal como aquellos que codifican variantes
que se produce naturalmente de PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018,
PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476) en librerías
de ADNc de tejido humano o librerías genómicas de tejido
humano.
La hibridación y lavado de filtros que contienen
cualquier ADN de librería se realiza bajo las siguientes
condiciones de alta estrigencia. La indicación de sonda radiomarcada
derivada de PRO5800-, PRO6000-, PRO6016-, PRO6018-, PRO6496-,
PRO7154-, PRO7170-, PRO7422-. PRO7431- o PRO7476- se realiza en una
solución de 50% formamida, 5x SSC. 0,1% SDS, 0,1% pirofosfato de
sodio. 50 mM fosfato de sodio, pH 6,8, 2x solución de Denhardt, y
10% sulfato de dextrano a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los
filtros se realizó en una solución acuosa de 0,1 x SSC y 0,1% SDS a
42ºC.
Los ADN que tiene una identidad es secuencia
deseada con el ADN que codifica la secuencia nativa de longitud
completa PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018. PRO6496, PRO7154.
PRO7170. PRO7422, PRO7431 o PRO7476 se puede identificar utilizando
técnicas estándar conocidas en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
no glicosilada de PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496,
PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 mediante expresión
recombinante en E. coli.
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido
PRO de interés se amplifica inicialmente utilizando prímeros PCR
seleccionados. Los prímeros deben contener sitios de enzimas de
restricción que corresponden con los sitios de enzimas de
restricción en el vector de expresión seleccionado. Se puede
utilizar una variedad de rectores de expresión. Un ejemplo de un
vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli: ver Bolivar
et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para la
resistencia a ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con
enzimas de restricción y se desfosforila. Las secuencias
amplificadas PCR se ligan a continuación en el vector. El vector
incluirá preferiblemente secuencias que codifican un gen de
resistencia a los antibióticos, un promotor trp, un líder
poli-His (incluyendo los primeros seis codones STII,
secuencia poli-His, y sitios de separación de
enteroquinasa), la región de codificación PRO5800, PRO6000, PRO6016,
PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476, el
terminador transcripcional lambda, y un gen argU.
La mezcla de ligado se usa a continuación para
transformar una cadena E. coli seleccionada usando los
métodos descritos en Sambrook et al., supra. Los
transformantes se identifican por su capacidad de crecer en placas
LB y a continuación se seleccionan colonias resistentes a
antibióticos. El ADN del plásmido se puede aislar y confirmar
mediante análisis de restricción y secuenciado de ADN.
Los clones seleccionados pueden crecer durante
la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado
con antibióticos. El cultivo en toda la noche se puede usar
posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. Las células
crecen a continuación en una densidad óptica deseada, durante la
cual se activa el promotor de expresión.
Después del cultivo de las células durante
varias horas más, las células se pueden cultivar mediante
centrifugación. La cuenta de células obtenida mediante la
centrifugación se puede solubilizar usando varios agentes conocidos
en la técnica, y las proteínas PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018,
PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476
solubilizadas se pueden purificar a continuación usando una columna
de quelación de metal bajo condiciones que permiten la unión
correcta de la proteína.
Los PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496,
PRO7154, PRO7170. PRO7422, PRO7431 o PRO7476 se pueden expresar en
E. coli en una forma marcada poli-His usando
el siguiente método. El ADN que codifica PRO5800, PRO6000, PRO6016,
PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 se
amplifica inicialmente usando prímeros PCR seleccionados. Los
prímeros contienen sitios de enzimas de restricción que corresponden
con los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión
seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio
de la traslación eficiente y fiable, una rápida purificación en una
columna de quelación de metal, y la retirada proteolítica con
enteroquinasa. Las secuencias marcadas poli-His
amplificadas con PCR se ligan a continuación en un vector de
expresión, que se usa para transformar un huésped E. coli
basado en la cadena 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE
rpoHis(htpRis) clpP(lacIq). Los transformantes crecen
primero en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con
agitación hasta que se alcanza un O.D. de 3-5 a 600
nm. Los cultivos se diluyen a continuación 50-100
veces en medio CRAP (preparado mediante la mezcla de 3,57 g
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g citrate de
sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g KCl, 5,36 g extracto de levadura
Difco, 5,36 g Sheffield hycase SF en 500 ml de agua, así como 110 mM
MPOS, pH 7,3, 0,55% (w/v) glucosa y 7 mM MgSO_{4}) y crecen
durante aproximadamente 20-30 horas a 30ºC con
agitación. Las muestras se retiran para verificar la expresión
mediante análisis SDS-PAGE, y el cultivo a granel se
centrifuga para formar las células en cuentas. Las cuentas de
células se congelan hasta la purificación y el replegado.
Se resuspende pasta de E. coli de
fermentaciones de 0,5 a 1 L (6-10 g de cuentras) en
10 volúmenes (w/v) en tampón 7 M guanidina, 20 mM Tris, pH 8. Se
añaden sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio para hacer
concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la
solución de agita durante la noche a 4ºC. Esta etapa resulta en una
proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína
bloqueados mediante sulfitolización. La solución se centrifuga a
40.000 rpm en un Beckman Ultracentifuge durante 30 min. El
supernatante se diluye con 3-5 volúmenes de tampón
de columna de quelato de metal (6 M guanidina, 20 mM Tris, pH 7,4) y
se filtra a través de filtros de 0,22 micrones para clarificar. El
extracto clarificado se carga en una columna de quelato de metal de
5 ml Qiagen Ni ^{2+}-NTA equilibrada en el tampón
de columna de quelato. La columna se lava con tampón adicional que
contiene 50 mM imidazol (Calbiochem, Utrol grade), pH 7,4. Las
proteínas se eluyen con tampón que contiene 250 mM imidazol. Las
fracciones que contienen la proteína deseada se combinan y
almacenan a 4ºC. La concentración de proteínas se estima mediante su
absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado
basado en su secuencia de aminoácidos.
La proteína se vuelve a plegar diluyendo la
muestra lentamente en también de replegado preparado de nuevo que
consiste en: 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M urea, 5 mM
cisteína, 20 mM glicina y 1 mM EDTA. Los volúmenes de replegado se
eligen de manera que la concentración final de proteína están entre
50 y 100 microgramos/ml. La solución de replegado se agita
suavemente a 4ºC durante 12-36 horas. La reacción de
replegado se apaga mediante la adición de TFA en una concentración
final del 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación
adicional de la proteína, la solución se filtra a través de un
filtro de 0,22 micrones y se añade acetonitrilo en una
concentración final del 2-10%. La proteína replegada
se cromatografía sobre una columna de fase inversa Poros R1/H
usando un tampón móvil de 0,1% TFA con elución con un gradiente de
acetonitrilo desde 10 a 80%. Alícuotas de fracciones con
absorbancia A_{280} se analizan sobre geles de poliacrilamida SDS
y se combinan fracciones que contienen proteína replegada homogénea.
Generalmente, las especies replegadas adecuadamente de la mayoría
de proteínas se eluyen en las concentraciones de acetonitrilo más
bajas, ya que esas especies son las más compactas con sus
interiores hidrofóbicos protegidos de la interacción con la resina
de fase inversa. Las especies agregadas se eluyen usualmente en
concentraciones de acetonitrilo mayores. Además de resolver las
formas de proteínas no plegadas de la forma deseada, la etapa de
fase inversa también retira endotoxinas de las muestras.
Fracciones que contienen la proteína plegada
deseada PRO5800, PRO6000, PRO6016. PRO6018, PRO6496, PRO
7154, PRO7170, PRO7422. PRO7431 o PRO7476 se combinan y se retira el acetonitrilo usando una suave corriente de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con 0,14 M cloruro de sodio y 4% manitol mediante diálisis o mediante filtración de gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtradas estériles.
7154, PRO7170, PRO7422. PRO7431 o PRO7476 se combinan y se retira el acetonitrilo usando una suave corriente de nitrógeno dirigida a la solución. Las proteínas se formulan en 20 mM Hepes, pH 6,8 con 0,14 M cloruro de sodio y 4% manitol mediante diálisis o mediante filtración de gel usando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el tampón de formulación y filtradas estériles.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
potencialmente glicosilada de PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018,
PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 mediante
expresión recombinante en células de mamífero.
El vector, pRK5 (ver EP 307 247,
publicada el 15 de Marzo de 1989), se utiliza como vector de
expresión. Opcionalmente, el ADN PRO5800, PRO6000, PRO6016,
PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170. PRO7422, PRO7431 o PRO7476 se
liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir
la inserción del ADN PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496,
PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 usando métodos de
ligado tal como se describe en Sambrook et al.,
supra. El vector resultante se llama pRK5-[PRO5800, PRO6000,
PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o
PRO7476].
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser 293 células. 293 células humanas (ATCC CCL
1573) crecen en confluencia en places de cultivo de tejido en medio
tal como DMEM suplementado con suero de ternero fetal y
opcionalmente, componentes de nutrientes y/o antibióticos.
Aproximadamente 10 \mug de ADN pRK5-[PRO5800, PRO6000, PRO6016,
PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476] se
mezclan con aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica gen de ARN
VA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y se disuelve
en 500 \mul de 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M
CaCl_{2}. A esta mezcla se añaden, gota a gota, 500 \mul of 50
mM HEPES (pH 7,35),280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO_{4}, y se deja formar
un precipitado durante 10 minutos a 25ºC. El precipitado se
suspende y añade a las 293 células y se deja asentar durante
aproximadamente cuatro horas a 37ºC. El medio de cultivo se aspira y
se añaden 2 ml de 20% glicerol en PBS durante 30 segundos. Las 293
células se lavan a continuación con medio libre de suero, se añade
medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente 5
días.
Aproximadamente 24 horas después de las
transfecciones, el medio de cultivo se retira y reemplaza con medio
de cultivo (en solitario) o medio de cultivo que contiene 200
\muCi/ml ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml
^{35}S-metionina. Después de una incubación de 12
horas, el medio acondicionado se recoge, se concentra sobre un
filtro giratorio, y se carga sobre un gel 15% SDS. El gel procesado
se puede secar y exponer a película durante un periodo de tiempo
seleccionado para revelar la presencia del polipéptido PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476. Los cultivos que contienen células transfectadas
pueden sufrir incubación adicional (en medio libre de suero) y el
medio se prueba en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, ADN PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476 se puede introducir en 293 células de manera
transiente usando el método de sulfato de dextrano descrito por
Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981).
293 células crecen a la máxima densidad en un frasco de
centrifugador y se añaden 700 \mug de ADN pRK5-[PRO5800, PRO6000,
PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o
PRO7476]. Las células se concentran primero desde el frasco del
centrifugador mediante centrifugación y se lavan con PBS. El
precipitado de dextrano de ADN se incuba sobre los gránulos de
células durante cuatro horas. Las células se tratan con 20% glicerol
durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo de tejido, y se
reintroducen en el frasco del centrifugador que contiene el medio de
cultivo del tejido, 5 \mug/ml de insulina bovina y 0,1 \mug/ml
de transferrina bovina. Después de cuatro días aproximadamente, el
medio acondicionado se centrifuga y se filtra para retirar células y
suciedad. La muestra que contiene PRO5800, PRO6000, PRO6016.
PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476
expresados se pueden concentrar a continuación y purificar mediante
cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía
de columna.
\newpage
En otra realización, los PRO5800, PRO6000.
PRO6016, PRO6018. PRO6496, PRO7154. PRO7170, PRO7422, PRO7431 o
PRO7476 se pueden expresar en células CHO. El vector pRK5-[PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO
6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476] se puede transfectar en células CHO usando reactivos conocidos tales como CaPO o DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares se pueden incubar, y el medio reemplazar con medio de cultivo (en solitario) o medio que contiene una radiomarca tal como ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476, el medio de cultivo se puede reemplazar con medio libre de suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y a continuación el medio acondicionado se recoge. El medio que contiene los PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 expresados se pueden concentrar y purificar a continuación mediante cualquier método seleccionado.
6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476] se puede transfectar en células CHO usando reactivos conocidos tales como CaPO o DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares se pueden incubar, y el medio reemplazar con medio de cultivo (en solitario) o medio que contiene una radiomarca tal como ^{35}S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476, el medio de cultivo se puede reemplazar con medio libre de suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y a continuación el medio acondicionado se recoge. El medio que contiene los PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 expresados se pueden concentrar y purificar a continuación mediante cualquier método seleccionado.
Los PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496,
PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 marcados con epítope
también se pueden expresar en células CHO huésped. Los PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476 se pueden subclonar fuera del vector pRK5. La
inserción del subclon puede sufrir PCR para fundirse en marco con
una marca de epítope seleccionada tal como una marca
poli-His en un vector de expresión de baculovirus.
La inserción PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154,
PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 marcada poli-His
se puede subclonar a continuación en un vector activado SV40 que
contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de
clones estables. Finalmente, las células CHO se pueden transfectar
(tal como se ha descrito anteriormente) con el vector activado SV40.
El marcado se puede realizar, tal como se ha descrito
anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que
contiene los PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154,
PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 marcados
poli-His expresados se pueden concentrar y purificar
a continuación mediante cualquier método seleccionado, tal como
mediante cromatografía de afinidad de quelatos Ni^{2+}. La
expresión en células de CHO y/o COS también se puede realizar
mediante un método de expresión transiente.
Los PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496,
PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 se pueden expresar en
células CHO mediante método transiente. La expresión estable en
células CHO se puede realizar usando el siguiente método. Las
proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina), en
las que las secuencias de codificación para las formas solubles
(por ejemplo, dominios extracelulares) de las respectivas proteínas
se funden con una secuencia de región constante IgG1 que contiene la
articulación, dominios CH2 y CH2 y/o en una forma marcada
poli-His.
Después de la amplificación PCR amplificación,
los respectivos ADNs se subclonan en vector de expresión CHO usando
técnicas estándar tal como se describen en Ausubel et al.,
Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16. John Wiley and
Sons (1997). Los vectores de expresión CHO se construyen para tener
sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para
permitir el lanzamiento conveniente de ADNc. El vector usado para
la expresión en células CHO es como se describe en Lucas et
al., Nucl. Acids Res., 24:9 (1774-1779 (1996),
y utiliza el promotor/mejorador temprano SV40 para activar la
expresión del ADNc de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR). La
expresión DHFR permite la selección de un mantenimiento estable del
plásmido después de la transfección.
Doce microgramos del ADN de plásmido deseado se
introducen en aproximadamente 10 millones de células CHO usando
reactivos de transfección disponibles Superfect® (Qiagen), Dosper® o
Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células crecen tal como se
describe en Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x
10^{7} células se congelan en una ampolla para un crecimiento y
producción adicionales tal como se describe a continuación.
Las ampollas que contienen el ADN de plásmido se
descongelan mediante colocación en un baño de agua y se mezclan
mediante agitación de vórtice. Los contenidos se pipetan en un tubo
centrífugo que contiene 10 ml de medio y se centrifugan a 1000 rpm
durante 5 minutos. El supernatante se aspira y las células se
resuspenden en 10 ml de medio selectivo (suero bobino fetal
filtrado 0,2 \mum PS20 con 5% 0,2 \mum diafiltrado). Las
células se separan a continuación en alícuotas en un centrifugador
de 100 ml que contiene 90 ml de medio selectivo. Después de
1-2 días, las células se transfieren a un
centrifugador de 250 ml lleno con 150 ml de medio de crecimiento
selectivo y se incuban a 37ºC. Después de otros 2-3
días, centrifugadores de 250 ml, 500 ml y 2000 ml son alimentados
con 3 x 10^{5} células/ml. El medio celular se cambia con medio
fresco mediante centrifugación y resuspensión en medio de
producción. Aunque se puede utilizar cualquier medio CHO adecuado,
realmente se usa un medio de producción descrito en la patente US
5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. El centrifugador de
producción de 3L se alimenta con 1,2 x 10^{6} células/ml. En el
día 0, se determina el número de células y el pH. El día 1, el
centrifugador se muestrea y el repuesto con aire filtrado se inicia.
El día 2, el centrifugador se muestrea, la temperatura cambia a
33ºC, y se añaden 30 ml de 500 g/L glucosa y 0,6 ml de 10%
antiespuma (por ejemplo, 35% emulsión de polidimetilsiloxano,
Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion). A lo largo de toda la
producción, el pH se ajusta como sea necesario para mantenerse
alrededor de 7,2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad
caiga por debajo del 70%, el cultivo celular se recoge mediante
centrifugación y se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum. El
filtrado se almacena a 4ºC o se carga inmediatamente sobre columnas
para su purificación.
Para las construcciones marcadas
poli-His, las proteínas se purifican usando una
columna Ni ^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de la
purificación, se añade imidazol al medio acondicionado en una
concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea sobre una
columna de 6 ml Ni ^{2+}-NTA equilibrada en 20 mM
Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol con
un índice de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de
la carga, la columna se lava con tampón de equilibrado adicional y
la proteína se eluye con tampón de equilibrado que contiene 0,25 M
imidazole. La proteína muy purificada se desala posteriormente en un
tampón de almacenamiento que contienen 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl y
4% manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml G25 Superfine
(Pharmacia) y se almacena
a -80ºC.
a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) se purifican a partir del medio acondicionado como
sigue. El medio acondicionado se bombea sobre una columna Protein A
de 5 ml (Pharmacia) que se ha equilibrado en tampón de fosfato de
Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la columna se lava
extensivamente con tampón de equilibrado antes de la elución con
ácido cítrico 10 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutraliza
inmediatamente mediante la recogida de fracciones de 1 ml en tubos
que contienen 275 \mul de tampón 1 M Tris, pH 9. La proteína muy
purificada se desala posteriormente en tampón de almacenamiento tal
como se ha descrito anteriormente para las proteínas marcadas
poli-His. La homogeneidad se determina geles de
poliacrilamida SDS y mediante secuenciado de aminoácidos de
terminal N mediante degradación Edman.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente método describe la expresión
recombinante de PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496,
PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 en levadura.
Primero, los vectores de expresión de levadura
se construyen para producción o secreción intracelular de PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que
codifica PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154.
PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 y el promotor se insertan en
sitios de enzimas de restricción adecuados en el plásmido
seleccionado para dirigir la expresión intracelular de PRO5800,
PRO6000. PRO6016, PRO6018, PRO6496. PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476. Para la secreción, el ADN que codifica PRO5800,
PRO6000. PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154. PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476 se pueden clonar en el plásmido seleccionado,
junto con ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170 nativo. Señal
de péptido PRO7422, PRO7431 o PRO7476 u otro péptido de señal de
mamífero, o, por ejemplo, un factor alfa de levadura o secuencia de
señal/líder secretoria de invertasa, y secuencias de enlace (si son
necesarias) para expresión de PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018,
PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476.
Las células de levadura, tal como cepa de
levadura AB110, se pueden transformar entonces con plásmidos de
expresión descritos anteriormente y cultivados en medio de
fermentación seleccionado. Los supernatantes de levadura
transformados se pueden analizar mediante precipitación con 10%
ácido tricloroacético y separación mediante
SDS-PAGE, seguido por teñido de los geles con tinte
azul Coomassie.
Los PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496,
PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 recombinantes se
pueden aislar posteriormente y purificar retirando las células de
levadura del medio de fermentación mediante centrifugación y a
continuación concentrando el medio usando filtros de cartucho
seleccionados. El concentrado que contiene PRO5800, PRO6000,
PRO6016. PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o
PRO7476 también se puede purificar usando resinas de cromatografía
de columna seleccionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente método describe la expresión
recombinante en células de insectos infectadas con baculovirus.
La secuencia que codifica para PRO5800. PRO6000,
PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO
7422, PRO7431 o PRO7476 se funde antes de una marca de epítope contenida en un vector de expresión de baculovirus. Estas marcas de epítope incluyen marcas poli-His y marcas de inmunoglobulina (como regiones Fc de IgG). Se pueden usar una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 o la porción deseada de la secuencia de codificación de PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422. PRO7431 o PRO7476 [tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular] se amplifica mediante PCR con prímeros complementarios a las regiones 5' y 3'. El prímero 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción de flanqueo (seleccionadas). El producto se digiere a continuación con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y se subclonan en el vector de
expresión.
7422, PRO7431 o PRO7476 se funde antes de una marca de epítope contenida en un vector de expresión de baculovirus. Estas marcas de epítope incluyen marcas poli-His y marcas de inmunoglobulina (como regiones Fc de IgG). Se pueden usar una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 o la porción deseada de la secuencia de codificación de PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422. PRO7431 o PRO7476 [tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular] se amplifica mediante PCR con prímeros complementarios a las regiones 5' y 3'. El prímero 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción de flanqueo (seleccionadas). El producto se digiere a continuación con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y se subclonan en el vector de
expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
cotransfección del plásmido anterior y ADN de virus Baculo
Gold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (comercialmente disponible por parte de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cultivan y usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe por parte de O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
Gold^{TM} (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (comercialmente disponible por parte de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28ºC, los virus liberados se cultivan y usan para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de proteínas se realizan tal como se describe por parte de O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
Los PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496,
PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 expresados marcados
poli-His se pueden purificar a continuación, por
ejemplo, mediante cromatografía de afinidad quelada Ni^{2+} como
sigue. Los extractos se preparan a partir de células Sf9 infectadas
con virus recombinantes tal como se describe en Rupert et
al., Nature, 362:175-179 (1993). Brevemente, las
células Sf9 se lavan, resuspenden en tampón de sonicación (25 ml
Hepes, pH 7,9; 12.5 mM MgCl_{2}; 0,1 mM EDTA; 10% glicerol: 0,1%
NP-40: 0,4 M KCl), y se sonica dos veces durante 20
segundos sobre hielos. Los sonicados se aclaran mediante
centrifugación, y el supernatante se diluye 50 veces en tampón de
carga (50 mM fosfato. 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 7,8) y se
filtra a través de un filtro de 0,45 \mum. Se prepara una columna
de agarosa Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible
por parte de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25
ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto
de célula filtrado se carga sobre la columna a 0,5 ml por minuto.
La columna se lava a la línea de base A_{280} con tampon de carga,
en cuyo punto se inicia la recogida de fracciones. A continuación,
la columna se lava con un tampón de lavado secundario (50 mM
fosfato; 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH 6,0), el cual eluye proteína
no específicamente unida. Después de alcanzar la línea de base
A_{280} otra vez, la columna se desarrolla con gradiente de 0 a
500 mM imidazol en el tampón de lavado secundario. Se recogen
fracciones de 1 ml y se analizan mediante SDS-PAGE y
teñido de plata o Western blot con
Ni^{2+}-NTA-conjugado a alcalina
fosfatasa (Qiagen). Las fracciones que contienen los PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476 marcados His_{10}, respectivamente, se mezclan y
dializan contra tampón
de carga.
de carga.
Alternativamente, la purificación del PRO5800,
PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422,
PRO7431 o PRO7476 marcado IgG (o marcado Fc) se puede realizar
usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo,
cromatografía de columna de proteína A o proteína G.
Aunque la expresión se realiza realmente en una
escala 0,5-2 L, se puede escalar fácilmente hasta
preparaciones mayores (por ejemplo, 8 L). Las proteínas se expresan
como una construcción IgG (inmunoadhesina), en la que la región
extracelular de la proteína se funde con una secuencia de región
constante IgG1 que contiene la articulación, dominios CH2 y CH3 y/o
en formas marcadas poli-His.
Después de la amplificación PCR, las respectivas
secuencias de codificación se subclonan en un vector de expresión
de baculovirus (pb.PH.IgG para fusiones IgG y pb.PH.His.c para
proteínas marcadas poli-His), y el vector y el AND
de baculovirus Baculogold® (Pharmingen) se
co-transfectan en 105 células Spodoprera
frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711), usando Lipofectin
(Gibco BRL), pb.PH.IgG y pb.PH.His son modificaciones del vector de
expresión de baculovirus comercialmente disponible pVL1393
(Pharmingen), con regiones de polienlace modificadas para incluir
las ecuencias de marca His o Fc. Las células crecen en medio de Hink
TNM-FH suplementado con 10% FBS (Hyclonel). Las
células se incuban durante 5 días a 28ºC. El supernatante se cultiva
y posteriormente se usa para la primera amplificación viral
mediante la infección de células Sf9 en medio de Hink
TNM-FH suplementado con 10% FBS en una
multiplicidad aproximada de infección (MOI) de 10. Las células se
incuban durante 3 días a 28ºC. El supernatante se cultiva y la
expresión de las construcciones en el vector de expresión de
baculovirus se determina mediante unión de lote de 1 ml de
supernatante en 25 ml de cuentas de Ni^{2+}-NTA
(QIAGEN) para proteínas marcadas de histidina o cuentas de
Protein-A Sepharose CL-4B
(Pharmacia) para proteínas marcadas IgG seguido por análisis
SDS-PAGE comparando con una concentración conocida
de estándar de proteína mediante teñido azul
Coomassie.
Coomassie.
El primer supernatante de amplificación viral se
usa para infectar un cultivo rotativo (500 ml) de células Sf9
crecidas en medio ESF-921 (Expression Systems LLC) a
un MOI aproximado de 0,1. Las células se incubaron durante 3 días a
28ºC. El supernatante se cultiva y fitra. La unión de lote y el
análisis SDS-PAGE se repiten, como sea necesario,
hasta que se confirma la expresión del cultivo rotativo.
El medio acondicionado a partir de las células
transfectadas (0,5 a 3 L) se cultiva mediante centrifugación para
retirar las células y se filtran a través de filtros de 0,22
micrones. Para las construcciones marcadas
poli-His, la construcción de proteínas se purifica
usando una columna Ni ^{2+}-NTA (Qiagen). Antes de
la purificación, el amidazol se añade al medio acondicionado en una
concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea sobre una
columna de 6 ml Ni^{2+}-NTA equilibrada en 20 mM
Hepes, pH 7,4, tampón que contiene 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol con
un índice de flujo de 4-5 ml/min, a 4ºC. Después de
la carga, la columna se lava con tampón de equilibrado adicional y
la proteína se eluye con tampón de equilibrado que contiene 0,25 M
imidazol. La proteína muy purificada se desala posteriormente en un
tampón de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl y 4%
manitol, pH 6,8, con una columna de 25 ml G25 Superfine (Pharmacia)
y se almacenó a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) de proteínas se purifican a partir de medio
acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombea sobre una
columna Protein A de 5 ml (Pharmacia) que se ha equilibrado en un
tampón de fostato de sodio 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, la
columna se lava extensivamente con tampón de equilibrado antes de
la elución con 100 mM ácido cítrico, pH 3,5. La proteína eluída se
neutraliza inmediatamente mediante la recogida de fracciones de 1 ml
en tubos que contienen 275 ml de tampón 1 M Tris, pH 9. La proteína
muy purificada se desala posteriormente en tampón de almacenamiento
tal como se ha descrito anteriormente para las proteínas marcadas
poli-His. La homogeneidad de las proteínas se
verifica mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (PEG)
y secuenciado de aminoácidos de terminal N mediante degradación
Edman.
Alternativamente, se puede usar un método de
baculovirus modificado que incorpora células high 5. En este
método, el ADN que codifica la secuencia deseada se amplifica con
sistemas adecuados, tal como Pfu (Stratagene), o fusión anterior
(5'-of) de una marca de epítope contenida con un
vector de expresión de baculovirus. Estas marcas de epítope
incluyen marcas poli-His y marcas de inmunoglobulina
(como regiones Fc de IgG). Se pueden usar una variedad de
plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos
comercialmente disponibles tales como pIE1-1
(Novagen). Los vectores pIEI1-1 y
pIE1-2 están diseñados para la expresión
constitutiva de proteínas recombinantes a partir del promotor de
baculovirus ie1 en células de insecto transformadas de manera
estable. Los plásmidos difieren solamente en la orientación de los
múltiples sitios de clonado y contienen todas las secuencias del
promotor conocidas que son importantes para la expresión génica
mediada con ie1 en células de insecto no infectadas, así como el
elemento de mejora hr5, pIE1-1 y
pIE1-2 incluyen el sitio de inicio de traducción y
se pueden usar para producir proteínas de fusión. Brevemente, la
secuencia deseada o la porción deseada de la secuencia (tal como la
secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína
transmembrana) se amplifica mediante PCR con prímeros
complementarios con las regiones 5' y 3'. El prímero 5' puede
incorporar sitios de enzimas de restricción de flanqueo
(seleccionados). El producto se digiere con las enzimas de
restricción seleccionadas y se subclonan en el vector de expresión.
Por ejemplo, los derivados de pIE1-1 pueden incluir
la región Fc de IgG humano (pb.PH.IgG) o una una marca de 8
histidine (pb.PH.His) después (3'-of) de la
secuencia deseada. Preferiblemente, la construcción del vector se
secuencia para confirmación.
Las células high 5 crecen a una fluencia con del
50% bajo las condiciones de 27ºC, no CO_{2}, NO pen/strep. Para
cada placa de 150 mm, se mezcla 30 \mug de vector basado en pIE
que contiene la secuencia con 1 ml de medio Ex-Cell
(Media: Ex-Cell 401 + 1/100 L-Glu
JRH Biosciences #14401-78P (nota: este medio es
sensible a la luz)), y en un tubo separado, se mezclan 100 \mul de
CellFectin (CellFECTIN (GibcoBRL#10362-010)
(sometido a agitación vorticial hasta mezclarse)) con 1 ml de medio
Ex-Cell. Las dos soluciones se combinan y se dejan
incubar a temperatra ambiente durante 15 minutos. Se añaden 8 ml de
medio Ex-Cell a la mezcla de 2 ml de ADN/CellFECTIN
y se coloca por capas sobre células high 5 que se han lavado una vez
con medio Ex-Cell. La placa se incuba a
continuación en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. La
mezcla de ADN/CellFECTIN se aspira a continuación, y las células se
lavan una vez con Ex-Cell para retirar el exceso de
CellFECTIN, se añaden 30 ml de medio Ex-Cell nuevo
y las células se incuban durante 3 días a 28ºC. El supernatante se
recoge ya la expresión de la secuencia en el vector de expresión
baculovirus se determina mediante unión del lote de 1 ml de
supernatante con 25 ml de cuentas de Ni^{2+}-NTA
(QIAGEN) para proteínas marcadas de histidina o cuentas
Protein-A Sepharose CL-4B beads
(Pharmacia) para proteínas marcadas IgG seguido por análisis
SDS-PAGE que se compara con una concentración
conocida de proteína estándar mediante teñido azul Coomassie.
El medio acondicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 L) se recoge mediante centrifugación para
retirar las células y se filtra a través de filtros de 0,22
micrones. Para las construcciones marcadas poli-His,
la proteína que comprende la secuencia se purifica usando una
columna Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Después de la
purificación, se añade imidazol al medio acondicionado a una
concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea sobre un
tampón de columna de 6 ml Ni ^{2+}-NTA equilibrada
en 20 mM Hepes, pH 7,4, que contiene 0,3 M NaCl y 5 mM imidazol con
un índice de flujo de 4-5 ml/min, a 48ºC. Después de
la carga, la columna se lava con tampón de equilibrado adicional y
la proteína se eluye con tampón de equilibrado que contiene 0,25 M
imidazol. La proteína muy purificada se desala posteriormente en un
tampón de almacenamiento que contiene 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl y 4%
manitol, pH 6,8, con una columna 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) y
se almacena a -80ºC.
Las construcciones de proteínas de
inmunoadhesina (que contienen Fc) se purifican a partir del medio
acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombea sobre una
columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada
en 20 mM de tampón de fosfato de Na, pH 6,8. Después de la carga, la
columna se lava extensivamente con tampón de equilibrado antes de
la elución con 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. La proteína eluída
se neutraliza inmediatamente mediante la recogida de fracciones de 1
ml en tubos que contienen 275 ml de tampón 1 M Tris, pH 9. Esta
proteína muy purificada se desala posteriormente en tampón de
almacenamiento tal como se ha descrito anteriormente para las
proteínas marcadas poli-His. La homogeneidad de la
secuencia se determina mediante geles de poliacrilamida SDS y
mediante secuenciado de aminoácido N-terminal
mediante degradación Edman y otros métodos analíticos tal como se
describe o es necesario.
PRO6018, PRO7154, PRO7170 y PRO7476 se
expresaron satisfactoriamente mediante el método de baculovirus
modificado anterior incorporando células high 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que se pueden unir específicamente a
PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018. PRO6496, PRO7154, PRO7170,
PRO7422, PRO7431 o PRO7476.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales son conocidas en la técnica y se describen, por
ejemplo, en Goding, supra. Los inmunogenes que se pueden
utilizar incluyen proteínas de fusión PRO5800, PRO6000, PRO6016,
PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476
purificadas que contienen PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018,
PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 y células que
expresan PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154,
PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 recombinante en la superficie
celular. La selección del inmunogén se puede realizar por parte del
expert en la materia sin experimentación indebida.
Los ratones, tales como Balb/c, están
inmunizados con el inmunogén PRO5800. PRO6000, PRO6016, PRO6018,
PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 emulsionado en
adyuvante de Freund completo y se inyecta de manera subcutánea o
intraperitoneal en una cantidad entre 1-100
microgramos. Alternativamente, el inmunogén se emulsiona en
adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research,
Hamilton, MT) y se inyectó en las almohadillas de las patas
traseras del animal. Los ratones inmunizados a continuación fueron
reforzados 10 a 12 días después con inmunogén adicional emulsionado
en el adyuvante seleccionado. A continuación, durante varias
semanas, los ratones también fueron reforzados con inyecciones de
inmunización adicionales. Se pueden obtener periódicamente muestras
de suero de los ratones mediante extracción de sangre
retro-orbital para probarlas en ensayos ELISA para
detectar anticuerpos anti-PRO5800,
anti-PRO6000, anti-PRO6016,
anti-PRO6018, anti-PRO6496,
anti-PRO7154, anti-PRO7170,
anti-PRO7422, anti-PRO7431 o
anti-PRO7476.
Después de que se haya detectado un título de
anticuerpo adecuado, los animales "positivos" para anticuerpos
pueden ser inyectados con una inyección intravenosa final de
PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170,
PRO7422, PRO7431 o PRO7476. Tres a cuatro días después, los ratones
se sacrificaron y las células del bazo se recogieron. Las células
del bazo se fundieron a continuación (usando 35% polietileno glicol)
a una línea celular de mieloma de murina seleccionada tal como
P3X63AgU.1, disponible por parte de ATCC. No. CRL 1597. Las
fusiones generaron células de hibridoma que se colocaron a
continuación en placas de cultivo de tejido de 96 pozos conteniendo
medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) para inhibir la
proliferación de células no fundidas, híbridos de mieloma, e
híbridos de células del bazo.
Las células de hibridoma se filtrarán en un
ELISA para reactividad contra PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO
6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 está dentro de los conocimientos de la técnica.
6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476. La determinación de células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra PRO5800, PRO6000, PRO6016, PRO6018, PRO6496, PRO7154, PRO7170, PRO7422, PRO7431 o PRO7476 está dentro de los conocimientos de la técnica.
Las células de hibridoma positivas se pueden
inyectar de manera intraperitoneal en ratones singénicos Balb/c
para producir ascitas que contienen los anticuerpos monoclonales
anti-PRO5800, anti-PRO6000,
anti-PRO6016, anti-PRO6018,
anti-PRO6496. anti-PRO7154,
anti-PRO7170, anti-PRO7422,
anti-PRO7431 o anti-PRO7476.
Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecer en frascos
o botellas rotativas de cultivo de tejido. La purificación de los
anticuerpos monoclonales producidos en las ascitas se puede realizar
usando precipitación de sulfato de amonio, seguida por
cromatografía de exclusión de gel. Alternativamente, se puede
utilizar la cromatografía de afinidad basada en la unión del
anticuerpo a proteína A o proteína G.
Los siguientes materiales se han depositado con
el American Type Culture Collection. 10801 University Blvd.,
Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
Estos depósitos se realizaron bajo las
provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de
Métodos de Patentes y sus Reglas (Tratado de Budapest). Esto
asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante
30 años desde la fecha de depósito. El depósito será disponible por
parte del ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sujeto
a un acuerdo entre Genentech, Inc., y el ATCC, que asegura la
disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del
cultivo del depósito al público bajo la publicación de la pertinente
patente estadounidense o al hacer accesible al público cualquier
solicitud de patente estadounidense o extranjera, lo que sea
primero, y asegura la disponibilidad de la progenie al determinado
por el Comisionado estadounidense de Patentes y Marcas que esté
capacitado para ello según el 35 U.S.C. \NAK 122 y las reglas del
comisionado según las mismas (incluyendo 37 C.F.R. \NAK 1.14 con
particular referencia a 886 OG 638).
El titular de la presente solicitud ha acordado
que si un cultivo de los materiales bajo depósito debe morir o
perderse o destruirse cuando se cultive bajo condiciones adecuadas,
el material se reemplazará con prontitud bajo notificación con otro
del mismo. La disponibilidad del material depositado no debe
construirse como una licencia para poner en práctica la invención
en contra de los derechos garantizados bajo la autoridad de
cualquier gobierno según sus leyes de patentes.
La memoria escrita anterior se considera que es
suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en
práctica la invención. La presente invención no se limita en alcance
mediante la construcción depositada, ya que la realización
depositada está pensada con una simple ilustración de ciertos
aspectos de la invención. El depósito de material aquí no
constituye una admisión que la descripción escrita aquí contenida es
inadecuada para permitir la puesta en práctica de cualquier aspecto
de la invención, incluyendo su mejor modo, ni debe construirse como
que limita el alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones
específicas que representa. Incluso, varias modificaciones de la
invención además de las aquí mostradas y descritas serán evidentes
para los expertos en la materia a partir de la descripción
anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
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\bullet US 4816567 A [0078] [0079] [0211]
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Claims (7)
1. Método in vitro de diagnóstico de
tumores de pulmón o colon en una muestra de un mamífero,
comprendiendo dicho método:
(i) detectar el nivel de expresión de un gen que
codifica un polipéptido PRO06018 que tiene por lo menos un 90% de
identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 2, en el que la identidad en la
secuencia se calcula usando el programa ALIGN-2, (a)
en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del
mamífero, y (b) en una muestra de control de células de tejido
normales conocidas del mismo tipo de célula, en el que un nivel de
expresión mayor en la muestra de prueba, comparado con la muestra
de control, es indicativo de la presencia de un tumor en el mamífero
del cual se ha obtenido las células de tejido de prueba,
(ii) (a) poner en contacto un anticuerpo
anti-PRO6018 que se une a un polipéptido PRO06018
que tiene la secuencia de aminoácidos de la figura 2 con una
muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero, y (b)
detectar la formación de un complejo entre dicho anticuerpo y un
polipéptido PRO6018 que tiene por lo menos un 90% de identidad en
la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada
en la figura 2, en el que la identidad en la secuencia se calcula
usando el programa ALIGN-2, en la muestra de prueba,
en el que la formación de un complejo es indicativa de la presencia
de un tumor en dicho mamífero, o
(iii) detectar la amplificación de un gen que
codifica un polipéptido PRO6018 que tiene por lo menos un 90% de
identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos mostrada en la figura 2, en el que la identidad en la
secuencia se calcula usando el programa ALIGN-2, en
una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero,
en el que la amplificación es indicativa de la presencia de un tumor
en dicho mamífero.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
3. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el anticuerpo comprende una región
determinante de la complementariedad (CDR) no humana o una región
de armazón (FR) humana.
4. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo está marcado.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo es un fragmento de
anticuerpo o un anticuerpo de cadena simple.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el nivel de identidad en la
secuencia es del 95%.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el nivel de identidad en la
secuencia es del 99%.
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