ES2335080T3

ES2335080T3 - Metodo para mejorar las interacciones de union entre miembros de pares de union.

Info

Publication number: ES2335080T3
Application number: ES00905755T
Authority: ES
Inventors: Galla Chandra Rao; Leon W. M. M. Terstappen; Paul A. Liberti
Original assignee: Veridex LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2010-03-22
Anticipated expiration: 2020-01-27
Also published as: AU2738900A; ATE449333T1; EP1151297B1; US6551843B1; JP5442544B2; PT1151297E; WO2000045169A1; DK1151297T3; JP2010261963A; JP2002535677A; DE60043335D1; EP1151297A1; WO2000045169A9; CA2359664A1; EP1151297A4

Abstract

Un método para mejorar las interacciones de unión entre un primer y segundo miembro de un par de unión específico en un medio de soporte que contiene un analito diana, en el que tanto dicho primer como dicho segundo miembro son móviles y en el que dicho primer miembro del par de unión específico está provisto de una partícula magnética coloidal y dicho segundo miembro del par de unión específico es un determinante en los analitos diana, comprendiendo dicho método provocar que dicho primer miembro de dicho par de unión específico se mueva con respecto a dicho segundo miembro de dicho par de unión específico por dicho medio de soporte; y separar dicho par de unión específico de dicho medio de soporte.

Description

Métodos para mejorar las interacciones de unión entre miembros de pares de unión específicos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a los campos de las interacciones de pares de unión específicos, separaciones de bioentidad y al aislamiento de sustancias infrecuentes de líquidos biológicos. Se proporcionan métodos para mejorar tales bioseparaciones, preferiblemente mediante carga magnética mejorada en entidades diana, facilitando de este modo el análisis bioquímico y de diagnóstico de las entidades diana aisladas de este modo.

Antecedentes de la invención

Existen varios procesos y procedimientos sustanciales de fabricación, analíticos y de laboratorio que implican interacciones de pares de unión específicos. Muchos procedimientos de laboratorio y clínicos se basan en tales interacciones, denominadas reacciones de afinidad bio-específicas. Tales reacciones se utilizan de forma común en el ensayo de diagnóstico de muestras biológicas o para la separación de una amplia variedad de sustancias diana, especialmente entidades biológicas tales como células, virus, proteínas, ácidos nucleicos y similares. Es importante en la práctica realizar las interacciones de par de unión específico tan rápida y eficazmente como sea posible. Estas reacciones dependen de consideraciones químicas clásicas tales como temperatura, concentración y afinidad de miembros de pares de unión específicos entre sí. En la situación ideal, se utilizan separaciones que emplean compañeros de unión específicos que forman rápidamente múltiples enlaces no covalentes. El uso de tales compañeros de unión es importante, particularmente cuando la concentración de uno de los miembros del par de unión específico a aislar es extremadamente baja, como es con frecuencia el caso en sistemas biológicos. Por supuesto, las consideraciones de concentración son pertinentes en otros procesos de separación, tales como en purificación de agua, o en aplicaciones donde es necesario eliminar contaminantes traza u otros productos indeseables.

El documento WO 96/07101 describe un procedimiento en el que un miembro de un primer miembro de un par de unión específico se inmoviliza sobre una superficie y se usa un campo magnético para atraer partículas a esa superficie, para promover la unión a un segundo miembro del par de unión específico. El documento WO 96/07101 no describe ni sugiere partículas que se mueven libremente móviles en relación entre sí.

El documento EP 0 295 965 describe un método para detectar un primer miembro de un par de unión específico en una muestra inmovilizando un segundo miembro de unión sobre la superficie de un oscilador de cristal piezoeléctrico, permitiendo que tenga lugar la unión entre el primer y el segundo miembro del par de unión específico y midiendo la diferencia en la frecuencia de oscilación que se produce, como un medio de determinación de la cantidad del primer miembro de unión en una muestra. El documento EP 0 295 965 no describe ni sugiere partículas móviles libremente que se pueden mover en relación entre sí.

El documento EP 1 094 114, que está disponible solamente con propósitos de novedad y en Estados Contratantes solapantes, describe un método para transferir un gen en células diana usando un retrovirus que se une a un vehículo inmovilizado y después se incuba con células diana.

El documento EP 1 094 114 no describe partículas móviles que se mueven libremente en relación entre sí.

Están disponibles diversos métodos para la unión, separación o el análisis de las sustancias diana que se han mencionado anteriormente que se basan en la formación de complejo entre la sustancia de interés y otra sustancia a la que se une específicamente la sustancia diana. La separación de los complejos resultantes de solución o de material no unido se puede conseguir gravitacionalmente, por ejemplo, por depósito o, alternativamente, por centrifugación de partículas finamente divididas o perlas acopladas a la sustancia ligando. Si se desea, tales partículas o perlas se pueden convertir en magnéticas para facilitar la etapa de separación de unido/libre. Las partículas magnéticas se conocen bien en la técnica, al igual que su uso en reacciones inmunes y otras de afinidad bioespecífica. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.554.088 y Immunoassays for Clinical Chemistry, págs. 147-162, Hunter et al. eds., Churchill Livingston, Edinborough (1983). Generalmente se puede emplear con este fin cualquier material que facilite la separación magnética o gravitacional. Sin embargo, se prefieren procesos que dependen de principios magnéticos.

Las partículas magnéticas se incluyen generalmente en dos categorías amplias. La primera categoría incluye partículas que se pueden magnetizar permanentemente o son ferromagnéticas; y la segunda comprende partículas que demuestran comportamiento magnético masivo solamente cuando se someten a un campo magnético. Las últimas se denominan partículas que responden magnéticamente. Los materiales que presentan comportamiento que responde magnéticamente se describen en ocasiones como superparamagnéticos. Sin embargo, los materiales muestran propiedades ferromagnéticas masivas, por ejemplo, óxido de hierro magnético, se pueden caracterizar como superparamagnéticos cuando se proporcionan en cristales de aproximadamente 30 nm o menos de diámetro. Los cristales mayores de materiales ferromagnéticos, por el contrario, conservan características de imán permanente después de exposición a un campo magnético y tienden a agregarse después de esto debido a interacción partícula-partícula fuerte.

Las partículas magnéticas se pueden clasificar como grandes (de 1,5 a aproximadamente 50 \mum), pequeñas (0,7-1,5 \mum) y coloidales o nanopartículas (<200 nm). Las últimas también se denominan ferrofluidos o partículas similares a ferrofluido y tienen muchas de las propiedades de ferrofluidos clásicos. Liberti et al págs. 777-790, E. Pelezzetti (ed) ``Fine Particle Science and Technology, Kluver Acad. Publishers, Netherlands.

La partículas magnéticas pequeñas son bastante útiles en análisis que implica reacciones de afinidad bio-específicas, ya que se recubren de forma conveniente con polímeros biofuncionales (por ejemplo, proteínas), proporcionan áreas superficiales muy grandes y proporcionan una cinética de reacción razonable. Se han descrito partículas magnéticas que varían entre 0,7-1,5 \mum en la bibliografía de patentes, incluyendo, a modo de ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 3.970.518; 4.018.886; 4.230.685; 4.267.234; 4.452.773; 4.554.088 y 4.659.678. Se describe que algunas de estas partículas son soportes sólidos útiles para reactivos inmunológicos.

Además de las pequeñas partículas magnéticas que se han mencionado anteriormente, existe una clase de grandes partículas magnéticas (> 1,5 \mum a aproximadamente 50 \mum), que también tienen comportamiento superparamagnético. Tales materiales incluyen los inventados por Ugelstad (Patente de Estados Unidos Nº 4.654.267) y fabricados por Dynal (Oslo, Noruega). Se sintetizan partículas poliméricas y mediante un proceso de hinchamiento de partículas se incluyen cristales de magnetita en las mismas. Se preparan otros materiales en el mismo intervalo de tamaño realizando la síntesis de la partícula en presencia de cristales de magnetita dispersos. Esto da como resultado la captura de cristales de magnetita haciendo por tanto que los materiales sean magnéticos. En ambos casos, las partículas resultantes tienen comportamiento superparamagnético, que se dispersa rápidamente después de la eliminación del campo magnético. A diferencia de coloides o nanopartículas magnéticas a las que se ha hecho referencia anteriormente, tales materiales, así como pequeñas partículas magnéticas, debido a la masa de material magnético por partícula, se separan de forma sencilla con magnética de laboratorio simple. Por tanto, se realizan separaciones en gradientes de tan sólo unos cientos de gauss/cm, hasta aproximadamente 1,5 kilogauss/cm. Las partículas magnéticas coloidales (inferiores a aproximadamente 200 nm) requieren gradientes magnéticos sustancialmente mayores para la separación debido a su energía de difusión, pequeña masa magnética/partícula y resistencia de stokes.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.795.698 de Owen et al. se refiere a partículas superparamagnéticas coloidales recubiertas con polímero, de tamaño submicrométrico. La Patente .698 describe la fabricación de tales partículas por precipitación de una especie magnética en presencia de un polímero biofuncional. La estructura de las partículas resultantes, denominadas en este documento partículas de un solo disparo, se ha observado que es un micro-aglomerado en el que se incluyen una o más cristalitas ferromagnéticas que tienen un diámetro de 5-10 nm dentro de un cuerpo polimérico que tiene un diámetro del orden de 50 nm. Estas partículas muestran una tendencia considerable a no separarse de suspensiones acuosas durante periodos de observación de hasta varios meses. Molday (Patente de Estados Unidos Nº 4.452.773) describe un material que es similar en propiedades a los descritos en la patente .698 de Owen et al. producido formando magnetita y otros óxidos de hierro a partir de Fe^{+2}/Fe^{+3} por adición de bases en presencia de concentraciones muy altas de dextrano. Los materiales producidos de este modo tienen propiedades coloidales. Este proceso se ha comercializado por Miltenyi Biotec, (Bergisch Gladbach, Alemania). Se ha demostrado que estos productos son muy útiles en ensayos de separación celular.

Otro método para producir partículas coloidales superparamagnéticas se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.597.531. A diferencia de las partículas descritas en la patente .698, estas últimas partículas se producen aplicando como recubrimiento directamente un polímero biofuncional sobre cristales superparamagnéticos pre-formados que se han dispersado mediante energía sónica en agrupaciones cristalinas casi-estables que varían de aproximadamente 25 a 120 nm. Las partículas resultantes, denominadas en este documento partículas recubiertas directamente o DC, muestran un momento magnético significativamente mayor que las nanopartículas de Owen et al. o Molday et al. que tienen el mismo tamaño global.

Las técnicas de separación magnética utilizan un aparato generador de campo magnético para separar cuerpos ferromagnéticos del medio fluido. Por el contrario, la tendencia de partículas superparamagnéticas coloidales a permanecer en suspensión, junto con su capacidad de respuesta magnética relativamente débil, requiere el uso de técnicas de separación magnética de alta gradiente (HGMS) para separar tales partículas de un medio fluido en el que se suspenden. En sistemas de HGMS, el gradiente del campo magnético, es decir, la derivada espacial, ejerce una mayor influencia sobre el comportamiento de las partículas suspendidas de la que se ejerce por la intensidad del campo en un punto dado.

La separación magnética de alto gradiente es útil para separar una amplia diversidad de materiales biológicos, que incluyen células eucariotas y procariotas, virus, ácidos nucleicos, proteínas e hidratos de carbono. En los métodos conocidos hasta ahora, el material biológico se ha podido separar mediante HGMS si poseía al menos un determinante característico capaz de ser reconocido específicamente por y unirse a un agente de unión, tal como un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, proteínas de unión específica (por ejemplo, proteína A, estreptavidina), lectina y similares.

Los sistemas de HGMS se pueden dividir en dos amplias categorías. Una de tales categorías incluye sistemas de separación magnética que emplean un circuito magnético que se sitúa externamente a una cámara o recipiente de separación. Los ejemplos de tales separadores externos (o separadores de gradiente de campo abierto) se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.186.827. En varias de las realizaciones descritas en la patente .827, el gradiente de campo magnético necesario se produce colocando imanes permanentes alrededor de la periferia de un recipiente no magnético de tal forma que los polos iguales de los imanes están en una configuración de campo opuesto. El alcance del gradiente de campo magnético dentro del medio de ensayo que se puede obtener en tal sistema se limita por la intensidad de los imanes y la distancia de separación entre los imanes. Por tanto, existe un límite finito a gradientes que se pueden obtener con sistemas de gradientes externos. En la solicitud provisional de Estados Unidos en trámite junto con la presente Nº 60/098.021 se describen medios para maximizar gradientes radiales y métodos para maximizar la eficacia de separación mediante un diseño de recipiente novedoso. Tales recipientes se pueden usar para practicar los métodos descritos en este documento.

Otro tipo de separador de HGMS utiliza una estructura de recogida ferromagnética que se dispone dentro del medio de ensayo para 1) intensificar un campo magnético aplicado y 2) producir un gradiente de campo magnético dentro del medio de ensayo. En un tipo conocido de un sistema de HGMS interno se introduce lana o gasa de acero fino dentro de una columna que se sitúa de forma adyacente a un imán. El campo magnético aplicado se concentra en proximidad de los alambres de acero de tal forma que las partículas magnéticas suspendidas se atraerán hacia y se adherirán en las superficies de los alambres. El gradiente producido en tales alambres es inversamente proporcional al diámetro de alambre mientras que el "alcance" magnético disminuye con el diámetro. Por tanto, se pueden generar gradientes muy altos.

Una desventaja de sistemas de gradiente internos es que el uso de lana de acero, material de gasa o microperlas de acero puede capturar componentes no magnéticos del medio de ensayo por acción capilar en proximidad de alambres que se cortan o dentro de intersticios entre alambres que se cortan. Se han aplicado diversos procedimientos de recubrimiento a tales columnas de gradiente interno (Patente de Estados Unidos Nº 4375407 y 5.693.539), sin embargo, la gran área superficial en tales sistemas todavía crea problemas de recuperación por adsorción. Por tanto, los sistemas de gradiente internos no son deseables, particularmente cuando la recuperación de entidades capturadas con frecuencia muy baja es el objetivo de la separación. Además, hacen que la automatización sea difícil y costosa.

Por otro lado, las separaciones de células que usan estrategias basadas en HGMS con gradientes externos proporcionan varias ventajas. En primer lugar, se pueden emplear simples tubos de laboratorio tales como tubos de ensayo, tubos de centrífuga o incluso Vacutainers (usados para recogida de sangre). Cuando los gradientes externos son del tipo en los que las células separadas están efectivamente en monocapa, como es el caso con dispositivos cuadrupolos/hexapolos como se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 5.186.827 o la disposición de dipolo opuesta descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 5.466.574, se facilita el lavado de las células y manipulaciones posteriores. Además, la recuperación de las células de tubos o recipientes similares es un proceso simple y eficaz. Esto es particularmente el caso cuando se comparan con las recuperaciones de columnas de alto gradiente. Tales recipientes de separación también proporcionan otra característica importante que es la capacidad de reducir el volumen de la muestra original. Por ejemplo, si se aísla un subconjunto de células sanguíneas humanas particular (células CD34^{+} marcadas magnéticamente) de sangre diluida al 20% con tampón para reducir la viscosidad, se puede emplear un tubo de ensayo cónico de 15 ml como el recipiente de separación en un dispositivo magnético cuadrupolo apropiado. Después de lavados apropiados y/o separaciones y resuspensiones para eliminar células no unidas, las células CD34^{+} se pueden resuspender de forma muy eficaz en un volumen de 200 \mul. Esto se puede conseguir, por ejemplo, comenzando con 12 ml de solución (sangre, ferrofluido y tampón de dilución) en un tubo de ensayo cónico de 15 ml, realizando una separación, desechando el sobrenadante y sobrenadantes de lavados posteriores y resuspendiendo las células recuperadas en 3 ml de tampón celular apropiado. Después se realiza una segunda separación que puede incluir etapas de separación/lavado adicionales (como puede ser necesario para realizar reacciones de marcado o tinción) y, finalmente, las células aisladas se resuspenden de forma sencilla en un volumen final de 200 \mul. Al reducir el volumen de este modo secuencial y emplear una mezcladora vorticial para la resuspensión, las células adheridas al tubo por encima del volumen de resuspensión se recuperan en el volumen reducido. Cuando se realiza cuidadosa y rápidamente en recipientes tratados apropiadamente, la recuperación de células es bastante eficaz (70-90%).

La eficacia con la que se pueden realizar separaciones magnéticas y la recuperación y pureza de células marcadas magnéticamente dependerá de muchos factores. Estos incluyen consideraciones tales como: el número de células que se está separando, la densidad de los determinantes característicos presentes en tales células, la carga magnética por célula, la unión no específica del material magnético (NSB), la técnica empleada, la naturaleza del recipiente, la naturaleza de la superficie del recipiente y la viscosidad del medio. Si la unión no específica de un sistema es relativamente constante, como es habitualmente el caso, entonces cuando la población diana disminuye, lo hace la pureza. Por ejemplo, un sistema con NSB del 0,2% que recupera el 80% de una población que está en el 0,25% en la mezcla original tendrá una pureza del 50%. Aunque si la población inicial estaba en el 1,0%, la pureza sería del 80%.

Es importante señalar que cuanto menor es la población de una célula dirigida, más difícil será marcar la misma magnéticamente y recuperarla. Además, el marcado y la recuperación dependen notablemente de la naturaleza de la partícula magnética empleada. Como un ejemplo, las partículas magnéticas grandes, tales como perlas Dynal, son demasiado grandes para difundir y marcar de forma eficaz células en suspensión por colisiones creadas mezclando el sistema. Si una célula está en una población de 1 célula por ml de sangre, o incluso menos, como podría ser el caso de células tumorales en cánceres muy tempranos, entonces la probabilidad de marcar células diana estará relacionada con el número de partículas magnéticas añadidas al sistema y el periodo de tiempo de la mezcla. Ya que la mezcla de células con tales partículas durante periodos de tiempo sustanciales será perjudicial, se hace necesario aumentar la concentración de partículas tanto como sea posible. Sin embargo, existe un límite a la cantidad de partículas magnéticas que se pueden añadir. En lugar de tratar con una célula infrecuente mezclada con otros componentes sanguíneos, hay una célula infrecuente mezclada con grandes cantidades de partículas magnéticas después de la separación. La última condición no mejora notablemente la capacidad de enumerar tales células o examinar las mismas. Por tanto, el compromiso es limitar la cantidad de material magnético y los tiempos de mezcla, mientras que se permite el aislamiento de entidades diana muy infrecuentes.

Otro inconveniente al uso de partículas grandes para aislar células con frecuencias raras (de 1 a 25-50 por ml de sangre) es que las grandes partículas tienden a agruparse alrededor de células de un modo similar a una jaula haciendo que sean difíciles de "ver" o de analizar. Por tanto, las partículas se tienen que liberar antes del análisis, lo que introduce claramente otras complicaciones.

En teoría, el uso de partículas magnéticas coloidales junto con separación magnética de alto gradiente parece ser el método de elección para separar un subconjunto de células de interés de una población mixta de células eucariotas, particularmente si el subconjunto de interés comprende una pequeña fracción de toda la población. Con carga magnética apropiada, se ejerce suficiente fuerza sobre una célula de tal forma que se puede aislar incluso en un medio tan viscoso como el de sangre completa diluida moderadamente. Como se señala, los materiales magnéticos coloidales menores de aproximadamente 200 nm mostrarán movimiento Browniano que mejora notablemente su capacidad de colisionar con y marcar magnéticamente células infrecuentes. Esto se demuestra, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.541.072 donde se describen resultados de experimentos de depuración de células tumorales muy eficaces que emplean partículas magnéticas coloidales de 100 nm (ferrofluidos). Igual de importante, los materiales coloidales con o por debajo del intervalo de tamaño señalado generalmente no interfieren con la visualización de células. Las células recuperadas de este modo se pueden examinar por citometría de flujo o por microscopía empleando técnicas visibles o fluorescentes. Debido a sus propiedades de difusión, tales materiales, a diferencia de grandes partículas magnéticas, "encuentran" y marcan magnéticamente de forma sencilla acontecimientos infrecuentes tales como células tumorales en sangre.

Sin embargo, existe un problema significativo asociado con el uso de partículas similares a ferrofluidos para la separación de células en sistemas de gradiente de campo externo que, por los motivos dados anteriormente, son los diseños de dispositivos de elección. El anticuerpo monoclonal directo se conjuga con partículas magnéticas de tamaño sub-micrométrico del tipo descrito por Owen o Molday, tales como las producidas por Miltenyi Biotec, no tiene un momento magnético suficiente para el uso en métodos de selección de células que emplean los mejores dispositivos de gradiente magnético externo disponibles, tales como los dispositivos magnéticos de cuadrupolo o hexapolo descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.186.827. Cuando se usan para separaciones en sangre completa moderadamente diluida, incluso son menos eficaces. Usando materiales similares que son sustancialmente más magnéticos, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.597.531 de Liberti y Pino, se han obtenido resultados más prometedores. En experimentos de adición puntual modelo, se ha observado que células SKBR3 (línea de tumor de mama), que tienen una densidad de determinante de molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) relativamente alta, se separan de forma eficaz de sangre completa con conjugados directos de ferrofluidos anti-EpCAM incluso a densidades de adición puntual muy bajas (1-5 células por ml de sangre). Por otro lado, las células PC3 (una línea de próstata) que tienen densidad de determinante de EpCAM muy baja se separan con eficacia significativamente disminuida. Muy probablemente, esto es una consecuencia de carga magnética inadecuada sobre estas células de densidad de determinante baja.

A la luz de lo anterior, los presentes inventores han apreciado una necesidad de métodos dirigidos a aumentar o mejorar la "carga" de partículas magnéticas, grandes, pequeñas o coloidales, en entidades biológicas de interés. Estos métodos se pueden usar ventajosamente para aislar sustancias diana o células que tienen densidad de determinante baja. La mejora de la eficacia del aislamiento de bioentidad diana, a su vez, facilita el análisis bioquímico e histoquímico posterior de tales entidades.

Sumario de la invención

Es el objeto de esta invención proporcionar un método eficaz para mejorar las interacciones entre miembros de un par de unión específico forzando sistemáticamente colisiones entre los miembros del par presentes en una solución biológica de un modo controlado y optimizado. Esto se consigue creando un movimiento de un miembro del par de unión específico con respecto al otro miembro de tal forma que tendrán lugar números aumentados de colisiones. A nivel microscópico, parece que la agitación vigorosa de una solución puede no dar como resultado siempre en números óptimos de colisiones entre miembros de un par de unión específico. Por ejemplo, las nanopartículas magnéticas coloidales conjugadas con anticuerpos monoclonales específicos para un determinante de superficie celular, cuando se mezclan con células diana a marcar magnéticamente, marcarán tales células de forma mucho más eficaz y con una densidad de marcado mayor cuando las dos entidades se mueven relativamente entre sí. Por tanto, si las células están en suspensión y el coloide magnético se "tira" a través de las células, un número sustancialmente mayor de nanopartículas se une específicamente a células en comparación con agitación continuada, mezcla vorticial y otros medios de mezcla. Alternativamente, si el coloide magnético es estable a centrifugación, entonces las células se pueden mover a través del coloide por centrifugación. Este proceso también aumenta significativamente la calidad de nanopartículas coloidales unidas específicamente a células diana. Por tanto, el principio se puede usar en lugar de mezcla o además de la misma.

Existen muchos modos en los que se puede inducir el movimiento de una entidad con respecto a la otra. En los ejemplos proporcionados más adelante, se usan gradientes magnéticos para trasladar partículas a través de una suspensión de células; o se usa centrifugación para mover células a través de partículas magnéticas coloidales gravitacionalmente estables. Claramente, en el último caso, ningún componente necesita ser magnético. Por ejemplo, las células se podrían centrifugar mediante cualquier coloide estable a la fuerza g del proceso, tal como centrifugando células a través de oro coloidal.

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Además de modos para provocar la traslación relativa de los miembros del par de unión específico que se han mencionado anteriormente, se puede emplear carga o la carga diferencial de un componente con respecto al otro al igual que se puede usar cualquier fuerza diferencial incluyendo magnética o gravitacional. Se podría considerar un campo eléctrico oscilante que provocaría que una entidad oscilara a través del medio con respecto a algún otro componente. Se pueden emplear fuerzas de inercia de forma similar.

Existen numerosas aplicaciones en las que se usan los métodos de la invención ventajosamente, incluyendo, pero sin limitación, inmunoensayo, separación celular, aislamiento de proteína para uso analítico o para bioprocesamiento, captura de bacterias y manipulación de ácido nucleico. Existen procesos industriales en los que dos entidades se tienen que unir o colisionar para formar un producto o un intermedio de producto. Esta invención se puede usar para reducir el tiempo de incubación o disminuir la temperatura de la reacción, ya que la temperatura se usa frecuentemente para acelerar tales reacciones. Los métodos de la invención realizan interacciones de miembro de par de unión específico eficaces deseables para las diversas aplicaciones que se han indicado anteriormente. En el caso de separaciones magnéticas, las bioentidades que tienen una densidad de determinante baja se capturan debido a la carga magnética aumentada de partículas específicas de ligando posibilitada por esta invención. Además, la invención debe proporcionar un beneficio enorme permitiendo el uso de concentraciones reducidas de uno de los miembros de par de unión específico. Si las partículas magnéticas (o cualquier otro agente) se pueden poner en contacto de algún modo repetido con una entidad diana asociada con un miembro de par de unión específico, entonces se debe necesitar una cantidad menor para conseguir el mismo nivel de marcado.

Como se usa en este documento, la expresión "bioentidades diana" o "analito" se refieren a una amplia diversidad de materiales de interés biológico o médico. Los ejemplos incluyen hormonas, proteínas, péptidos, lectinas, oligonucleótidos, fármacos, sustancias químicas, moléculas de ácido nucleico, (ARN o ADN) y analitos en forma de partículas de origen biológico, que incluyen biopartículas tales como células, virus, bacterias y similares. El término "determinante" cuando se usa con referencia a cualquiera de las bioentidades diana anteriores, se puede unir específicamente a un ligando bioespecífico o un reactivo bioespecífico y se refiere a la porción de la bioentidad diana implicada en y responsable de la unión selectiva a una sustancia de unión específica cuya presencia se requiere para que tenga lugar la unión selectiva. En términos fundamentales, los determinantes son regiones de contacto molecular en bioentidades diana que se reconocen por receptores en reacciones de par de unión específico. La expresión "par de unión específico" como se usa en este documento incluye interacciones de antígeno-anticuerpo, receptor-hormona, receptor-ligando, agonista-antagonista, lectina-hidrato de carbono, secuencias de hibridación de ácido nucleico (ARN o ADN), receptor Fc o IgG de ratón-proteína A, avidina-biotina, estreptavidina-biotina y virus-receptor. Se pueden concebir varias otras combinaciones de sustancia de unión específica de determinante para usar al practicar los métodos de esta invención, como será evidente para los especialistas en la técnica. El término "anticuerpo" como se usa en este documento incluye inmunoglobulinas, anticuerpos monoclonales o policlonales, fragmentos de inmunoglobulinas inmunorreactivos y anticuerpos de cadena única. También se consideran para el uso en la invención péptidos, oligonucleótidos o una combinación de los mismos que reconocen específicamente determinantes con especificidad similar a anticuerpos generados de forma tradicional. La expresión "marcador detectable" se usa en este documento para referirse a cualquier sustancia cuya detección o medición, directa o indirectamente, mediante medios físicos o químicos, es indicativa de la presencia de la bioentidad diana en la muestra de ensayo. Los ejemplos representativos de marcadores detectables útiles incluyen, pero sin limitación, lo siguiente: moléculas o iones detectables directa o indirectamente basándose en propiedades de absorbancia de luz, fluorescencia, reflectancia, dispersión de luz, fosforescencia o luminiscencia; moléculas o iones detectables por sus propiedades radiactivas; moléculas o iones detectables por sus propiedades de resonancia magnética nuclear o paramagnéticas. Incluidas en el grupo de moléculas que se pueden detectar indirectamente basándose en absorbancia de luz o fluorescencia, por ejemplo, hay diversas enzimas que provocan que los sustratos apropiados se conviertan, por ejemplo, de moléculas que no absorban luz a absorbentes de luz o de moléculas no fluorescentes a fluorescentes. La expresión "a la exclusión sustancial de" se refiere a la especificidad de la reacción de unión entre el ligando bioespecífico o reactivo bioespecífico y su determinante diana correspondiente. Los ligandos y reactivos bioespecíficos tienen actividad de unión específica por su determinante diana aunque también pueden mostrar un nivel bajo de unión no específica con otros componentes de muestra.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A es un histograma y la Figura 1B es un gráfico que muestra el marcado de células PC3 con anticuerpos monoclonales específicos de EpCAM.

Las Figuras 2A y 2B son un par de histogramas que muestran el marcado de células PC3 con nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos monoclonales específicos de EpCAM a concentraciones diferentes. El marcado de células se muestra antes (Figura 2A) y después (Figura 2B) de la separación magnética.

Las Figuras 3A y 3B son histogramas que muestran el marcado de células PC3 con un anticuerpo monoclonal específico de células conjugado con ferrofluido (Figura 3A) en comparación con el marcado obtenido con un ferrofluido conjugado con un anticuerpo monoclonal no específico (Figura 3B). En cada caso, se muestra la intensidad de fluorescencia de células PC3 antes y después de la separación magnética.

La Figura 4 es un histograma que muestra el marcado de células KG1a con nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos monoclonales específicos de CD34 antes y después de la recogida magnética.

Las Figuras 5A-5D son una serie de microfotografías que muestran células de tumor de próstata (PC3) después de la incubación con perlas anti-células epiteliales Dynal en el exterior (Figuras 5A y 5C) y (Figuras 5B y 5D) dentro del campo magnético. Los puntos pequeños son perlas Dynal libres. Las Figuras 5A y 5B están a un aumento de 10x; las Figuras 5C y 5D están a un aumento de 20x.

La Figuras 6A-6D son una serie de microfotografías que muestran células de tumor de mama (SKBR33) después de la incubación con perlas anti-células epiteliales Dynal en el exterior y en interior del campo magnético. Los puntos pequeños son perlas Dynal libres.

Las Figuras 7A-7C son histogramas que muestran el marcado de células PC3 con un ferrofluido específico o no específico durante la separación magnética. Figura 7A: no hay ferrofluido libre presente durante la separación magnética; Figura 7B: ferrofluido específico presente durante la separación magnética; Figura 7C: ferrofluido no específico presente durante la separación magnética.

Descripción detallada de la invención

A partir de la anterior discusión debe ser evidente que cualquier medio para mejorar las interacciones de unión entre miembros de pares de unión específicos mejora la capacidad de separación de analitos que lleven uno o el otro de tales mismos. En la solicitud de patente de cesión común titulada "Métodos de agregación controlada de nanopartículas magnéticas" de Liberti et al. se describen medios para aumentar la carga magnética en entidades diana por un principio de aglomeración. Esta descripción se basa en el descubrimiento de un factor específico, que se piensa que es una IgM, que tiene lugar a niveles variables en sangre humana de aproximadamente el 85% de la población normal. Este factor similar a IgM reacciona con ferrofluidos preparados por métodos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.597.531 de Liberti y Pino. El factor agregante de ferrofluido (FFAF) provoca que ferrofluido adicional se agrupe en ferrofluido ya unido a células. Esta carga magnética adicional mejora significativamente la eficacia de aislamientos de células infrecuentes, particularmente, aislamiento de células de densidad de determinante baja. Estas observaciones también facilitaron el desarrollo de métodos para invertir la agrupación de ferrofluidos de tal forma que las células ya no se dañan y se mejoran las recuperaciones de células. La secuencia preferida es (1) eliminar o incapacitar cualquier FFAF endógeno en sangre de los cuales potencialmente hay muchos; (2) incubar células con ferrofluido conjugado con un ligando específico de determinante; (3) simultáneamente con la etapa 2 o posteriormente provocar la aglomeración de ferrofluido añadiendo un agente aglomerante reversible; (4) someter la muestra a un gradiente magnético para provocar el aislamiento de la diana; y (5) invertir la aglomeración con al menos un agente de desaglomeración compatible con células. Este procedimiento da como resultado el aislamiento eficaz y reproducible de células de densidad de determinante baja infrecuentes de sangre completa. Al lavar sangre libre de FFAF endógeno debe ser evidente que la etapa 1 se puede eliminar y que la recuperación se mejorará.

Cuando se realizan experimentos de marcado, es habitual incubar la sustancia diana con un agente marcador. El periodo de incubación dependerá de varios factores. Estos incluyen el tamaño y la concentración del agente de marcado, la temperatura del ensayo y si el sistema se mezcla o no. En el caso de marcar células con anticuerpos monoclonales a concentraciones de 1-2 \mug/ml, es común incubar la sustancia diana con el ligando de marcado durante 15 minutos a temperatura ambiente, dependiendo de la afinidad de anticuerpo. Aumentando la concentración de anticuerpo a 5 \mug/ml, los tiempos de incubación se pueden acortar hasta aproximadamente 5 minutos. En cualquier caso, la mezcla de la muestra no un efecto demostrable sobre la cantidad de antígeno unido. En el caso de grandes partículas magnéticas, tales como perlas Dynal, los tiempos de incubación recomendados por el fabricante son de 20 a 30 minutos, requiriéndose mezcla para evitar el depósito. Se ha observado que el marcado de ferrofluido requiere una incubación de 15 minutos seguido de una separación normalizada de 15 minutos en un separador de cuadrupolo (Patente de Estados Unidos Nº 5.186.827), que proporciona típicamente los mejores resultados. Muy probablemente, esto es una consecuencia de propiedades de estabilidad coloidal de ferrofluido, de tamaño y coloidales.

En estudios sobre el aislamiento de células de soluciones viscosas (típicamente sangre) se ha observado rutinariamente que la separación óptima del medio puede requerir 10-15 minutos en uno de los dispositivos magnéticos de cuadrupolo que se han mencionado anteriormente. Sin embargo, si se resuspenden células recogidas magnéticamente en un tampón y de nuevo se separan, el tiempo óptimo para tal procesamiento requiere aproximadamente de 3 a 4 minutos. Esta observación no se puede explicar solamente por efectos de viscosidad. Se realizaron experimentos para evaluar el aislamiento de células tumorales epiteliales de densidad de determinante baja añadidas de forma puntual en sangre completa que se había tratado para eliminar factores de agregación endógenos. Se empleó ferrofluido conjugado directamente con un anticuerpo monoclonal anti-EpCAM. Inmediatamente después de una incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos, las cantidades de ferrofluido unido a células se cuantificaron y compararon con la cantidad de marcado conseguida después de una incubación combinada y una etapa de separación de 10 minutos. Los datos demuestran que en ausencia de una etapa de separación magnética, la cantidad de ferrofluido unido a las células diana se redujo 5 veces. Para evaluar si el tiempo de incubación afectó a la unión de ferrofluido, la primera muestra se incubó 10 minutos adicionales a temperatura ambiente de tal forma que los tiempos de tratamiento fueran iguales entre las dos muestras. No se observó un aumento sustancial en la unión de ferrofluido después de una incubación más prolongada. Si, inmediatamente después de la etapa de incubación y antes de la etapa de separación, se añadía una cantidad de anticuerpo monoclonal anti-EpCAM en una cantidad determinada para evitar la unión adicional de ferrofluido, se observó que la cantidad de ferrofluido unido a las células separadas era idéntica a la obtenida después de solamente incubación. Estas observaciones sugirieron que el ferrofluido adicional, que se une a células durante la etapa de separación, se une a determinantes de células específicos, y no es un tipo de fenómeno de ferrofluido-ferrofluido inducido por el magnetismo. Los estudios presentados en los siguientes ejemplos probarán que, de hecho, la anterior hipótesis es correcta.

Por tanto, se proporcionan métodos novedosos que se pueden aplicar para mejorar las interacciones entre cualquier par de unión específico independientemente del tamaño del mismo. Solamente un miembro del par de unión específico se tiene que preparar para que se mueva con respecto al otro para inducir la unión mejorada de los miembros del par de unión específico. Como un ejemplo de la aplicabilidad general del principio que subyace a esta invención, cuando una suspensión celular que se incuba con ferrofluido específico se centrifuga de tal forma que solamente las células se mueven en el líquido de centrifugación (y no el propio ferrofluido), se unirá considerablemente más ferrofluido a la células de lo que sería el caso si la suspensión se mezclara de forma minuciosa con el ferrofluido. Las perlas Dynal de mayor tamaño, debido a su tamaño y densidad, se centrifugan junto con células y, por lo tanto, no pueden proporcionar un fenómeno de carga magnética idéntico al descrito en este documento. Por tanto, cuando se incuban conjugados de perla Dynal-ligando específico con una suspensión celular y las partículas magnéticas se preparan para moverse a través de la suspensión en ciclos iterativos, poniendo un imán apropiado adyacente al recipiente, la cantidad de perlas unidas a las células se mejora muy significativamente en comparación con la mezcla simple. Estas observaciones sugieren que existen limitaciones a la mezcla verdadera o la mezcla que incluye colisiones a nivel microscópico y es posible que a nivel macromolecular.

Existen varios modos de inducir movimiento de un miembro del par de unión específico con respecto al otro, muchos de los cuales no requieren efectos magnéticos en ninguno o en ambos de los miembros del par de unión específico. En un sentido general, esta invención tiene muchas ventajas y aplicaciones prácticas. Se pueden conseguir mayores interacciones de par de unión específico en comparación con mezcla o agitación simple. Adicionalmente, en muchos casos será beneficioso conseguir la unión óptima en un periodo de tiempo más corto. Esta invención será aplicable para ese fin y no reducirá sólo de forma general la cantidad del miembro del par de unión específico requerido, sino que también aumentará en gran medida la eficacia de cualquier ensayo o proceso en el que las interacciones entre miembros de par de unión específico son un acontecimiento importante. Además de separaciones celulares y similares a células existen muchas otras potenciales aplicaciones, tales como inmunoensayo, captura de ADN o ARN y procesos industriales, que se beneficiarán de esta invención. Se prefieren métodos de separación magnética en los que se usan s partículas magnéticas para aislar sustancias de interés de un medio de ensayo no magnético mediante separación de gradiente magnético. La muestra se mezcla en primer lugar, lo que permite que las partículas magnéticas encuentren dianas antes de poner las mismas en el dispositivo de separación magnética. Durante este periodo de incubación, es habitual que la muestra se mezcle o agite mediante algún medio, tal como agitación vorticial, para provocar un mayor contacto entre las partículas magnéticas y las células diana, así como para evitar que los componentes se depositen. En los ejemplos descritos más adelante se demuestra que el marcado de las sustancias de interés bajo la influencia de un gradiente magnético que traslada nanopartículas a través de la solución con respecto a las células aumenta de forma marcada la densidad de marcado. El aumento en la densidad de marcado da como resultado una separación más eficaz de las sustancias diana.

Para marcar bioentidades tales como células, bacterias, virus, proteínas o ácidos nucleicos con partículas magnéticas, se pueden usar partículas dimensionadas de forma diferente. Sin embargo, la traslación de la partícula magnética a través de la solución o suspensión a marcar se tiene que realizar de un modo que optimice las colisiones y la unión. Si se usan gradientes magnéticos para trasladar las partículas, entonces se prefieren gradientes que provocarán que las partículas colisionen con, pero no "desgarren" determinantes (por ejemplo, receptores) de la bioentidades diana. Por tanto, las partículas Dynal requieren campos de gradiente bajo, mientras que los gradientes magnéticos superiores se pueden utilizar con nanopartículas coloidales. Se puede realizar un movimiento diferencial de sustancias diana y de recogida durante las reacciones de marcado durante la etapa de separación o mediante separaciones repetidas o separaciones parciales y resuspensiones. Alternativamente, los materiales magnéticos se pueden trasladar multidireccionalmente dentro del recipiente de incubación. Cuando se usa centrifugación para realizar la traslación relativa, uno de los miembros del par de unión específico no se debe ver afectado por la fuerza centrífuga o las fuerzas diferenciales de la centrífuga que actúan sobre los miembros del par de unión específico deben ser suficientes para provocar las colisiones.

Los siguientes ejemplos describen adicionalmente con cierto detalle el principio básico que subyace a esta invención y diversos medios para emplear la invención como se refiere a separaciones magnéticas. El uso de nanopartículas magnéticas coloidales (ferrofluidos) para separaciones celulares constituye el mejor modo considerado por los inventores en el momento de la presente descripción. Estos ejemplos particulares no deben considerarse de ningún modo como limitantes de la invención.

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Ejemplo 1 Marcado celular con un anticuerpo monoclonal específico de células en ausencia de ferrofluido

La molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) es un antígeno diana ejemplar y se ha utilizado para demostrar la carga magnética mejorada en bioentidades diana de acuerdo con los métodos de la presente invención. La EpCAM se expresa en células del origen de las células epiteliales pero no en células de origen hematopoyético. La densidad del antígeno EpCAM depende del tipo celular a aislar y/o analizar. Por ejemplo, aunque la expresión de la EpCAM en la línea de célula tumoral de próstata (células PC3) es homogénea, el nivel de expresión es relativamente bajo. La Figura 1A es un histograma que muestra la distribución de EpCAM en células PC3 usando un anticuerpo monoclonal de ratón específico para EpCAM. El nivel de unión de anticuerpo de EpCAM se cuantificó a su vez con un anticuerpo de cabra secundario anti-ratón (GAM) conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) GAM-FITC. La intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo en células. El histograma en la Figura 1 muestra la intensidad de la fluorescencia de las células PC3 que representa la distribución de EpCAM en las células. La Figura 1A también muestra que las células PC3 consisten en una población de células con respecto a EpCAM. La saturación del antígeno se obtiene a una concentración de 4 \mug/ml de anticuerpo monoclonal de EpCAM como se muestra en la Figura 1B.

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Ejemplo 2 Marcado de células con ferrofluido anti-EpCAM en ausencia de movimiento de traslación magnética relativa

El anticuerpo monoclonal de ratón específico para EpCAM se acopló a nanopartículas magnéticas (ferrofluidos). Las células PC3 se incubaron con los ferrofluidos específicos de células epiteliales (anti-EpCAM-FF) a concentraciones de 5, 10, 20, 40 y 60 \mug de hierro (Fe) por ml. Si se supone que todo el anticuerpo acoplado a los ferrofluidos es capaz de unirse específicamente a la diana, la concentración aproximada de anticuerpos es de 0,4, 0,8, 1,5, 3,1 y 4,6 \mug por ml, respectivamente. En el experimento, aproximadamente 200.000 células de PC3 en 0,75 ml de un tampón isotónico se añadieron a un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm. Se añadió anti-EpCAM-FF (volumen de 20 \mul) a la muestra a una concentración final de 5, 10, 20, 40 y 60 \mug/ml. Las muestras se mezclaron por agitación vorticial suave. Después de una incubación durante 15 minutos, las muestras se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos para retirar las células del ferrofluido no marcado. Como se ha señalado anteriormente y se mostrará más adelante, esta etapa mejora la carga de ferrofluido en las células. Con los fines de este ejemplo, el ferrofluido añadido cargado por esta etapa no afectará a los resultados globales. El sobrenadante se desechó. El sedimento celular se resuspendió en 100 \mul de un tampón isotónico. Después, las células se tiñeron con GAM-FITC para cuantificar la cantidad de anti-EpCAM-FF unido a las células. Después de incubación durante 15 minutos, 1 ml de un tampón isotónico se añadió a las células y la muestra se centrifugó para eliminar el exceso de GAM-FITC. El sedimento celular se resuspendió en 500 \mul de un tampón isotónico y se determinó la intensidad de fluorescencia de las células por citometría de flujo (FACScaliber, Becton-Dickinson, San Jose, CA). La intensidad de fluorescencia observada era directamente proporcional a la cantidad de ferrofluido en las células.

La Figura 2A muestra histogramas de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia media (MFI) o fluorescencia basal de las células no teñidas era 4,1 en unidades arbitrarias. La MFI a una concentración de 5 \mug/ml de anti-EpCAM-FF era 22,4. La MFI a una concentración de 10 \mug/ml era 33,7. La MFI a una concentración de 20 \mug/ml era 67,3. La MFI a una concentración de 40 \mug /ml era 153,0. La MFI a una concentración de 60 \mug/ml era 220,3. A partir de los datos de la Figura 2 es evidente que se podría obtener una curva de titulación para ferrofluido que es similar a la obtenida cuando se usa anticuerpo purificado para marcar células como se muestra en la Figura 1A.

Las cantidades relativamente grandes de ferrofluidos (60 \mug/ml) requeridas para saturar las células como se muestra en la Figura 2A ponen restricciones con respecto a la viabilidad económica del procedimiento en el caso en el que se necesiten procesar volúmenes mayores. Si se está trabajando con una muestra de sangre completa, por ejemplo, 20 ml que se tienen que reducir a 200 \mul para realizar el análisis, existe otra complicación. La cantidad de ferrofluido libre presente después de la reducción del volumen de la muestra puede interferir con el análisis posterior. Por lo tanto, es deseable que la concentración de partículas magnéticas se mantenga en un mínimo mientras que al mismo tiempo se proporcione un marcado óptimo y una separación eficaz.

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Ejemplo 3 Intensidad de marcado de células con un ferrofluido específico o no específico de células antes y después de la separación magnética

Este ejemplo, y varios de los siguientes, demuestran cómo se descubrió el principio de movimiento relativo, así como la magnitud del efecto y sus consecuencias. En este experimento, se usaron células de la línea celular de tumor de próstata PC3 que tiene una densidad de determinante EpCAM baja. Aproximadamente 500.000 células PC3 en 1,5 ml de un tampón isotónico se añadieron a un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm. Se añadió anti-EpCAM-FF (volumen de 20 \mul) a la muestra a una concentración final de 0, 5, 10, 20, 40 y 60 \mug/ml. Las muestras se mezclaron por agitación vorticial suave y se pusieron en separadores magnéticos de cuadrupolo durante 10 minutos para realizar la separación. Después de 10 minutos, el sobrenadante se desechó. Los tubos se retiraron de los separadores magnéticos. Las células y el ferrofluido libre recogidos en las paredes del recipiente se resuspendieron en 1 ml de tampón isotónico por agitación vorticial. La muestra se centrifugó como anteriormente para retirar las células del ferrofluido libre. El sedimento celular se resuspendió en 100 \mul de un tampón isotónico que contenía cantidades de saturación de GAM-FITC. Después de incubación durante 15 minutos, se añadió 1 ml de un tampón isotónico al tubo y se centrifugó para eliminar el exceso de GAM-FITC. El sedimento celular se resuspendió en 500 \mul de un tampón isotónico y se determinó la intensidad de fluorescencia de las células por citometría de flujo.

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Los histogramas mostrados en la Figura 2B muestran que, a diferencia de la Figura 2A, el marcado de las células PC3 con ferrofluidos era relativamente uniforme a todas las concentraciones de ferrofluidos ensayadas después de la separación de las células PC3 marcadas con ferrofluido en un campo magnético. Además, el marcado en cada caso era similar al obtenido con el mayor nivel de ferrofluido usado en el experimento de la Figura 2A, es decir, el experimento en el que no tuvo lugar ninguna separación magnética.

Para examinar el motivo del marcado aumentado de las células recogidas magnéticamente después de la incubación en el separador magnético, se realizaron los siguientes experimentos. Se añadió anti-EpCAM-FF (volumen de 20 \mul) a la muestra de células PC3 a una concentración final de 5 \mug/ml y a un volumen de 1,5 ml. Después de incubación durante 15 minutos, 500 \mul de las células marcadas con ferrofluido se transfirieron a un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm y se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos para retirar las células del ferrofluido no marcado. El 1 ml remanente de células marcadas con ferrofluido se puso en un separador magnético de cuadrupolo durante 10 minutos. Después de aspirar el sobrenadante, las células recogidas y el ferrofluido libre se resuspendieron en 1 ml de un tampón isotónico y se centrifugaron como anteriormente para separar las células de ferrofluido libre. Después de la centrifugación respectiva, los sobrenadantes se desecharon y los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 \mul de tampón de células y se marcaron con GAM-FITC. Después de incubación durante 15 minutos, 1 ml de un tampón isotónico se añadió al tubo y se centrifugó para retirar el exceso de GAM-FITC. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 500 \mul de un tampón isotónico y se determinó la intensidad de fluorescencia de las células por citometría de flujo. Adicionalmente, después del experimento de separación magnética, las células no recogidas que permanecieron en el tampón se transfirieron a un tubo de 12 x 75 mm, se centrifugaron para separar las células de cualquier ferrofluido libre y se tiñeron con GAM-FITC como se ha descrito anteriormente. La Figura 3A muestra histogramas de la intensidad de fluorescencia de las células no expuestas al anti-EpCAM-FF, las células incubadas con el anti-EpCAM-FF antes de la separación y la fracción celular no recogida y recogida después de la incubación magnética. La intensidad de fluorescencia media (MFI) era 5,0 para células no marcadas (fluorescencia de fondo), 19,4 para las células marcadas con ferrofluido antes de la separación magnética, 69,5 para las células obtenidas después de la selección magnética y 28,2 para las células que permanecieron en suspensión después de la selección magnética. Los datos muestran que la MFI de las células recogidas era 4 veces mayor en comparación con las mismas células antes de la separación magnética. La MFI de las células no recogidas era ligeramente mayor que la de las células antes de la separación magnética. La Figura 3A ilustra claramente que aunque las células PC3 son homogéneas con respecto a la densidad de EpCAM después de la separación magnética, las células recogidas magnéticamente tienen significativamente más ferrofluido sobre sus superficies en comparación con las células no recogidas. Las células no recogidas durante la separación tienen una cantidad solamente ligeramente mayor de ferrofluido sobre sus superficies celulares en comparación con las células que se marcaron con ferrofluido pero que no expusieron al separador magnético.

Para asegurar que este aumento en el marcado de ferrofluido se debe a interacciones específicas de ferrofluido-receptor, el experimento se repitió usando ferrofluidos marcados con anticuerpos no específicos que reconocen el antígeno CD34 (FF de CD34), un antígeno no presente en células PC3. La Figura 3B muestra histogramas de la intensidad de fluorescencia de células PC3 en ausencia de anti-CD34-FF, células incubadas con el anti-CD34-FF antes de la separación y la fracción celular no recogida y recogida después de la incubación magnética. La intensidad de fluorescencia media (MFI) era 5,0 para células no marcadas (fluorescencia de fondo), 4,8 para las células marcadas con ferrofluido antes de la separación magnética, 4,5 para las células que permanecieron en suspensión después de la selección magnética y 17,1 para las pocas células que se seleccionaron no específicamente. A diferencia con los experimentos que usan el anti-EpCAM-FF, las células no se marcaron con el anticuerpo secundario conjugado con GAM-FITC, indicando que no estaban presentes ferrofluidos en las células.

Las conclusiones que se pueden extraer del anterior experimento son: 1) después de la adición de ferrofluidos específicos de ligando a la muestra, la exposición posterior a un campo magnético da lugar a un aumento en el número de partículas magnéticas unidas a las células; 2) las células recogidas magnéticamente tienen un mayor número de partículas magnéticas sobre la superficie celular en comparación con las células no recogidas, aunque expresan un número similar del antígeno EpCAM como se ilustra en la Figura 1; y 3) el aumento en la masa magnética por célula se puede obtener solamente con ferrofluidos específicos de células.

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Ejemplo 4 El aumento en la densidad de marcado se puede obtener con diferentes antígenos

Para demostrar que el fenómeno descrito en este documento no se restringe a ningún determinante antigénico particular presente en una célula tumoral, se realizaron experimentos usando la línea celular KG1a CD34+ y un ferrofluido al que se conjugó el anticuerpo monoclonal CD34. El procedimiento experimental usado en este experimento fue similar al descrito para células PC3 y anti-EpCAM-FF que se ha analizado anteriormente. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 4. Los datos ponen de manifiesto que la separación magnética dio como resultado un aumento en la cantidad de partículas magnéticas que se unen a células diana. La intensidad de fluorescencia media (MFI) era 2,1 para células no marcadas (fluorescencia de fondo), 16,7 para las células marcadas con ferrofluido antes de la separación magnética, 125,1 para las células obtenidas después de la selección magnética y 20,2 para las células que permanecían en suspensión después de la selección magnética. Estos resultados son coherentes con los resultados obtenidos para células positivas a antígeno EpCAM.

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Ejemplo 5 El aumento inducido por traslación relativa de la densidad de marcado es independiente del tamaño de partículas

Los anteriores experimentos muestran que un aumento en el marcado de células con nanopartículas magnéticas específicas puede obtenerse durante el proceso de separación cuando las partículas magnéticas se mueven con respecto a células diana. Las nanopartículas magnéticas que se han usado anteriormente son ferrofluidos en el intervalo de tamaño de 150-180 nm. Para abordar si este fenómeno se aplica o no a un tamaño mayor de partículas magnéticas, se realizaron experimentos usando perlas Dynal. Dynal (Noruega) fabrica perlas magnéticas con dos tamaños diferentes (2,8 y 4,5 \mum) que se usan para el aislamiento de células. En este ejemplo, se usaron Dynabeads anti-células epiteliales que tenían 2,8 \mum de tamaño y están recubiertas con un anticuerpo monoclonal de ratón (Ber-EP4) específico para EpCAM. Ya que estas perlas se pueden observar bajo un microscopio, no se requiere tinción secundaria (por ejemplo, con GAM-FITC) para cuantificar la cantidad de perlas unidas a células. Se añadió tampón isotónico (0,75 ml) que contenía 400.000 células de tumor de próstata (PC3) a un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm. Se añadió tampón PBS (50 \mul) que contenía Dynabeads específicas anti-células epiteliales (1x10^{6} perlas) a la muestra, se mezclaron bien por agitación vorticial y la muestra se puso cerca de un separador magnético de un solo polo durante 10 minutos. Cada 2 minutos, la muestra se retiró del separador magnético, se mezcló y se devolvió. El gradiente magnético empleado para este experimento era tal que las perlas Dynal se moverían lentamente a través de la muestra. Como un control, otra muestra que contenía células PC3 se incubó con Dynabeads mezclando en ausencia de un campo magnético también durante 10 minutos. De cada una de estas muestras manipuladas durante 10 minutos, 5 \mul se añadieron puntualmente a un portaobjetos de microscopio. Las células y Dynabeads libres después se fotografiaron usando un microscopio con una cámara digital unida al mismo.

La Figura 5 muestra las células tumorales PC3 unidas a perlas magnéticas y perlas libres. Las Figuras 5A y 5C muestran muestras que se mezclan, pero que no se expusieron a un campo magnético. Obsérvese los números significativos de Dynabeads libres. En las Figuras 5B y 5D se observan muy pocas perlas libres en la muestras cuando las Dynabeads y las células se habían expuesto a un gradiente magnético. También hay claramente más perlas unidas por célula en el último caso. Estos resultados muestran que la incubación de célula diana que contiene muestras con perlas magnéticas de mayor tamaño da como resultado un aumento significativo en la unión de perlas magnéticas a las células, suponiendo que se haga que las perlas se muevan a través de la muestra celular. El experimento se repitió con Dynabeads anti-epiteliales usando la línea celular de cáncer de mama de alta densidad de EpCAM, SKBR3, y los resultados se muestran en la Figura 6. Estos resultados son coherentes con los observados para células PC3, es decir, más perlas se unieron a las células y no se observaron perlas libres en la muestra que se había sometido a un campo magnético en comparación con las muestras que únicamente se mezclaron.

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Ejemplo 6 Intensidad de marcado de células después de la incubación con un ferrofluido específico de células antes y después de la separación magnética

Para confirmar adicionalmente el principio descrito en este documento y para determinar si es necesario ferrofluido libre en solución o no para obtener el aumento observado en el marcado celular, se realizaron los siguientes experimentos. Los experimentos se realizaron con la línea celular de tumor de próstata PC3 usando anti-EpCAM-FF y anti-CD34-FF. La Figura 7A muestra un histograma de la intensidad de fluorescencia de células PC3 obtenidas después de incubación con anti-EpCAM-FF tanto antes como después de la separación magnética. A diferencia de los experimentos mostrados en la Figura 3, las células se retiraron de ferrofluido libre en solución por centrifugación antes de la separación magnética. Como es evidente a partir de la Figura 7A, la densidad de marcado no aumentó durante la separación magnética, indicando la necesidad de ferrofluido libre durante la separación magnética. En la Figura 7B, el experimento se repitió con el anti-EpCAM-FF añadido a una concentración de 2 \mug/ml antes de la separación magnética. En este caso, el marcado de las células recogidas claramente aumentó. Sin embargo, si se añadió anti-CD34-FF antes de la separación, no se observó aumento en la intensidad de marcado de las células. Esto demuestra adicionalmente que el ferrofluido libre en solución necesita ser específico para las células diana para obtener el marcado aumentado de las células, como se muestra en la Figura 3 y la siguiente Tabla I. Por tanto, el gradiente magnético actúa moviendo el ferrofluido con respecto a las células a fin de promover la unión específica.

TABLA I

1

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Se pueden extraer las siguientes conclusiones del anterior experimento: 1) la separación magnética no aumenta la intensidad de marcado si se elimina el ferrofluido en exceso/no unido antes de la separación magnética; y 2) los ferrofluidos libres en solución tienen que ser específicos de tipo celular para aumentar la intensidad de marcado de las bioentidades diana.

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Ejemplo 7 Optimización para aumentar la intensidad de marcado y la eficacia de separación

A partir de los anteriores experimentos, es evidente que el movimiento de partículas magnéticas específicas con respecto a dianas celulares aumenta significativamente la reacción de unión. En este ejemplo, el marcado de células tumorales con un anti-EpCAM-FF específico en diferentes condiciones de incubación se evaluó para proporcionar condiciones óptimas para el aumento observado. Se añadió un tampón isotónico (1 ml) que contenía 200.000 células de próstata (PC3) a diferentes tubos de poliestireno de 12 x 75 mm. Se añadió anti-EpCAM-FF específico (20 \mul) a cada muestra a una concentración final de 5 mg/ml y cada muestra se mezcló por agitación vorticial. Las muestras se incubaron en diferentes condiciones expuestas en la Tabla II. Después de una incubación de 15 minutos, las muestras se mezclaron por agitación vorticial y se centrifugaron a 500 g durante 5 minutos para eliminar las células del exceso de ferrofluido. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 \mul de un tampón isotónico después de aspirar el sobrenadante. Después, las células se tiñeron con GAM-FITC y se determinó la intensidad de fluorescencia de las células por citometría de flujo. Los resultados se proporcionan a continuación en la Tabla II.

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TABLA II

2

3

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El marcado de células diana con ferrofluido aumentó significativamente (de 5 a 7 veces) cuando las células se incubaron con ferrofluido y se expusieron a un campo magnético en el separador magnético de cuadrupolo, es decir, mientras que tiene lugar la traslación de ferrofluido. Obsérvese que cuando se realizó un experimento muy similar en un campo magnético uniforme, es decir, sin gradiente magnético, el marcado obtenido era idéntico al obtenido en este documento cuando se incubaron células y ferrofluido en ausencia de cualquier campo magnético.

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Ejemplo 8 Marcado de células diana moviendo células a través de ferrofluido por fuerza gravitacional

Los anteriores experimentos muestran que el movimiento de ferrofluido en la región de alto gradiente en el campo magnético mejora la unión de ferrofluido a células diana, es decir, las células se marcan más rápidamente y más eficazmente. Para demostrar que el movimiento de células diana con respecto al ferrofluido da como resultado asimismo unión aumentada de ferrofluido específico, se realizó un experimento de centrifugación. Para este experimento se mezclaron células diana (PC3) con anti-EpCAM-FF como anteriormente y se centrifugaron inmediatamente a 500 g durante 5 minutos. En estas condiciones, el ferrofluido no se redistribuye sensiblemente. El marcado de células con ferrofluido se comprobó después de la tinción con GAM-FITC como se ha descrito anteriormente. Estos experimentos pusieron de manifiesto que las células que se mueven a través de ferrofluido por fuerza centrífuga también dieron lugar a un marcado de células aumentado por un factor de 2 veces en comparación con células sometidas a incubación estática. Es de señalar que los medios usados para determinar la cantidad de marcado emplean eliminación de células por centrifugación de ferrofluido. Por tanto, todos los controles se elevan artificialmente. Sin embargo, los datos obtenidos demuestran claramente el principio de movimiento diferencial para aumentar la unión entre miembros de pares de unión específicos.

Las conclusiones que se pueden extraer del anterior experimento son las siguientes: 1) es el gradiente magnético, no la intensidad de campo magnético presente durante la incubación, el que realiza el aumento en la intensidad de marcado. Por tanto, se requiere la traslación de nanopartículas; 2) se puede obtener un aumento significativo en el marcado de células diana usando concentraciones sub-óptimas de partículas magnéticas mediante a) movimiento de las entidades diana a través de la suspensión de ferrofluido o b) movimiento de las partículas magnéticas a través de la suspensión celular.

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Ejemplo 9 El aumento en el número de partículas en las células aumenta la recuperación de células

Los resultados del experimento descrito más adelante en este documento ilustran adicionalmente que el aumento de la carga de partículas magnéticas en bioentidades diana usando los métodos de la presente invención mejora significativamente la eficacia de recogida de tales entidades. Se centrífugo sangre (1 ml) y el plasma se eliminó y sustituyó por un tampón isotónico para eliminar cualquier componente potencial que pudiera afectar al marcado de las células. Las células sanguíneas se añadieron a un tubo de poliestireno de 12 x 75 mm seguido de 0,5 ml de tampón de lavado de dilución (Immunicon). Se añadió de forma puntual tampón isotónico (50 \mul) que contenía un número conocido de células PC3 de baja densidad de EpCAM a la muestra sanguínea. Se añadieron 20 \mul de anti-EpCAM-FF a cada muestra a una concentración final de 5 \mug/ml.

Una muestra se incubó en ausencia de cualquier gradiente magnético durante 15 minutos sin mezcla. Después de la incubación, la muestra se puso en un dispositivo de separación magnética de cuadrupolo durante 10 minutos para realizar la separación. Las células lavadas, recogidas se tiñeron con anticuerpos marcados para determinar la recuperación de células tumorales añadidas de forma puntual por citometría de flujo del siguiente modo. Un MAb Her2-neu conjugado con Ficoeritrina (PE) que identifica las células tumorales y el MAb CD45 conjugado con proteína peridinina clorofila (PerCP) específico para leucocitos se añadieron a la muestra y se incubaron durante 15 minutos. Después de la tinción, las células se lavaron por separación magnética para retirar el exceso de anticuerpos de tinción. Las células lavadas magnéticamente y recogidas se resuspendieron en 500 \mul de tampón de lavado y dilución. Se añadieron un colorante de ácido nucleico y 10.000 perlas fluorescentes de 3 \mum en un volumen de 10 \mul a la muestra. Después, la muestra se analizó en un citómetro de flujo usando la fluorescencia emitida del colorante de ácido nucleico como un umbral. La fracción de las perlas fluorescentes adquiridas en el citómetro de flujo se usó para determinar la cantidad de muestra analizada por citometría de flujo que, a su vez, permite el cálculo de la recuperación de las células tumorales añadidas de forma puntual.

Después de mezclar células y ferrofluido, una segunda muestra se puso dentro del dispositivo de separación magnética de cuadrupolo durante 15 minutos. A cada minuto, el tubo se retiró del dispositivo de separación magnética y la muestra se mezcló por agitación vorticial durante 5 segundos y se recolocó. Finalmente, el tubo se dejó en el separador durante 10 minutos adicionales para realizar la separación. El resto de procedimiento para procesar la muestra era igual que el que se ha descrito anteriormente para la muestra 1. Una tercera muestra se trató de forma idéntica a la muestra número 2, excepto porque se retiró del separador, se agitó vorticialmente y se devolvió cada cinco minutos. Una cuarta muestra se trató de forma idéntica a la muestra número 2, excepto porque solamente se retiró del separador, se agitó vorticialmente y se devolvió al final del periodo de 15 minutos y después se dejó en el dispositivo de separación magnética durante 10 minutos para realizar la separación. Estos experimentos se realizaron por duplicado y los resultados se muestran en la Tabla III y se expresan como % de recuperación de células
PC3 añadidas.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA III

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Los datos muestran que había un aumento muy significativo en la recuperación de células PC3 cuando se incubaron sangre y partículas magnéticas en presencia de un gradiente magnético que realiza la traslación de las nanopartículas magnéticas con respecto a células. Diversas modificaciones en los esquemas de incubación en presencia de un gradiente magnético dieron como resultado de forma uniforme una mayor recuperación de células PC3 en comparación con esquemas de incubación realizados en ausencia de gradientes magnéticos. Había algunas diferencias en la recuperación de células PC3 entre diferentes incubaciones en el dispositivo magnético. Los procesos por los que el ferrofluido se pasa por células diana tres veces parecen dar los mejores resultados.

Los experimentos similares demuestran que la recuperación de células tumorales diana se reduce cuando se añadió el Mab de EpCAM libre a muestras incubadas a temperaturas ambiente antes de la etapa de separación magnética. Cuando se añade MAb de EpCAM antes de la separación, en ausencia de traslación de ferrofluido, la eficacia de separación está marcadamente disminuida, particularmente para células de densidad de determinante relativamente baja, por ejemplo, PC3. Con células de densidad de determinante alta tales como SKRB3, el efecto es menos espectacular. Véase la Tabla IV.

TABLA IV

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Ejemplo 10 Se pueden obtener aumentos en el marcado de células con células que expresan una amplia variedad de densidades de antígeno

Las células de la línea de cáncer de vejiga T24, la línea de células de cáncer de próstata PC3 y la línea celular de cáncer de mama SKBR3 expresan densidades variables del antígeno EpCAM sobre la superficie celular. La densidad de antígeno se evaluó tiñendo las células con un anticuerpo monoclonal fluoresceinado específico de EpCAM. En comparación con la intensidad de fluorescencia de las células no teñidas, la intensidad de fluorescencia media de las células T24 era 2 veces mayor, de las células PC3, 8 veces mayor y de las células SKBR3, 50 veces mayor, como se indica en la siguiente Tabla V. Para evaluar los efectos de tal variedad de densidades de antígeno sobre el principio que subyace a esta invención se realizó el siguiente experimento. Se añadieron alícuotas de células sanguíneas lavadas (1 ml) a tubos de poliestireno de 12 x 75 mm seguido de 0,5 ml de tampón de lavado y dilución. Se añadió de forma puntual tampón de células (50 \mul) que contenía un número conocido de células tumorales para cada línea celular a las respectivas muestras. Se añadió anti-EpCAM-FF (20 \mul) a una concentración final de 5 \mug/ml a cada muestra. Las muestras se mezclaron bien y los pares apropiados se incubaron a temperatura ambiente sin mezclar durante 15 minutos o se pusieron en el separador magnético durante 15 minutos. Como anteriormente, todas las muestras se agitaron vorticialmente bien y se pusieron en separadores magnéticos durante 10 minutos para realizar la separación.

Las células recuperadas se tiñeron con anticuerpos marcados apropiados para determinar la recuperación de células tumorales añadidas de forma puntual por citometría de flujo como se ha descrito anteriormente. Los resultados mostrados en la siguiente Tabla V demuestran que se consigue un aumento significativo en la recuperación de células tumorales realizando la incubación bajo la influencia de un gradiente magnético que induce la traslación de ferrofluido con respecto a analitos diana. Es de señalar que el efecto es más pronunciado en las células tumorales que tienen una menor densidad de EpCAM.

TABLA V

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Claims

1. Un método para mejorar las interacciones de unión entre un primer y segundo miembro de un par de unión específico en un medio de soporte que contiene un analito diana, en el que tanto dicho primer como dicho segundo miembro son móviles y en el que dicho primer miembro del par de unión específico está provisto de una partícula magnética coloidal y dicho segundo miembro del par de unión específico es un determinante en los analitos diana, comprendiendo dicho método provocar que dicho primer miembro de dicho par de unión específico se mueva con respecto a dicho segundo miembro de dicho par de unión específico por dicho medio de soporte; y separar dicho par de unión específico de dicho medio de soporte.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se provoca inicialmente que dicho primer miembro de dicho par de unión específico se mueva en una dirección y se provoca posteriormente que se mueva en una dirección diferente.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho par de unión específico se selecciona entre el grupo que consiste en biotina-estreptavidina, antígeno-anticuerpo, mimotopo-anticuerpo, receptor-hormona, receptor-ligando, agonista-antagonista, lectina-hidrato de carbono, proteína A-anticuerpo Fc y avidina-biotina.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se provoca que dicha partícula magnética coloidal se mueva a través de dicho medio bajo la influencia de un gradiente de campo magnético.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho analito diana se selecciona entre el grupo que consiste en hormonas, proteínas, péptidos, lectinas, oligonucleótidos, fármacos, sustancias químicas, moléculas de ácido nucleico, células, virus y bacterias.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 4, en el que dicha partícula magnética coloidal tiene un tamaño de partícula de menos de 200 nm.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 4, en el que dicho primer miembro es un anticuerpo anti-molécula de adhesión epitelial (anti-EpCAM); y dicho segundo miembro es el antígeno de superficie celular (EpCAM) en dicho analito diana, donde dicho analito diana es una célula tumoral.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el movimiento relativo se provoca por fuerzas gravitacionales, de inercia, eléctricas o magnéticas.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el movimiento relativo está provocado por centrifugación.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el movimiento relativo está provocado por separación magnética de alto gradiente.