ES2335485T3 - Peptidos y acidos nucleicos de la familia de catelicidina, derivados de pez, y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado que tiene actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos RPG-G/V- GS-X-I/P-G (SEC ID NO: 19).

Description

Péptidos y ácidos nucleicos de la familia de catelicidina, derivados de pez, y usos de los mismos.

La presente invención se refiere a moléculas que tiene actividad antimicrobiana e inmunoestimuladora, y en particular, a péptidos antimicrobianos e inmunoestimuladores de la familia de las catelicidinas.

Los vertebrados han desarrollado una amplia gama de mecanismos para contrarrestar las infecciones por microbios. Entre éstos se incluyen la generación de moléculas inorgánicas microbicidas, tales como especies de oxígeno activo, mediante células fagocíticas especialistas, así como sistemas defensivos mediados por enzimas o células más sofisticados.

Se conoce que los mamíferos producen un conjunto de péptidos antimicrobianos que ejercen principalmente sus efectos a través de la interacción la membrana celular microbiana. Una de estas familias es la familia de las catelicidinas.

Las catelicidinas se sintetizan como prepropéptidos en células mieloides, se procesan mediante la eliminación del péptido señal y se almacenan como propéptidos en los gránulos citoplasmáticos de los leucocitos neutrófílos. El propéptido contiene el dominio de Caterina bien conservado, característico de la familia, y no es por sí mismo microbicida. La razón del alto grado de conservación no está clara, pero la prosecuencia puede tener un papel en dirigir el propéptido a los gránulos o asegurar la maduración proteolítica adecuada.

La actividad antimicrobiana reside en el péptido maduro, el cual se libera por división del propéptido mediante elastasa. La división con elastasa tiene lugar predominantemente en el extremo C-terminal de los residuos de valina y ocasionalmente, después de residuos de alanina.

La familia de catelicidinas se divide en cinco grupos diferentes según la estructura del péptido maduro antimicrobiano, las secuencias del cual son altamente variables. La familia incluye péptidos con dos enlaces disulfuro (protegrinas), péptidos con un enlace disulfuro (dodecapéptido cíclico), péptidos ricos en residuos de prolina y arginina con módulos cortos dispuestos en repeticiones en tándem (bactenecinas, PR-39, profeninas); péptidos ricos en residuos de triptófano (indolicidina, PMAP-23), y péptidos con una estructura helicoidal (PMAP-36 y -37, CAP18, FALL-39) (Zanetti et al., 1995).

Entre las bactenecinas bovinas se incluyen tres repeticiones en tándem de un tetradecámero caracterizado por varios tripletes Pro-Arg-Pro espaciados por aminoácidos hidrofóbicos individuales (Frank et al., 1990). Las profeninas de cerdo contienen tres repeticiones perfectas de un decámero FPPPNFPGPR (Harwig et al., 1995).

El mecanismo de acción de estos péptidos varía desde permear rápidamente la membrana bacteriana hasta la inhibición de la síntesis macromolecular en bacterias gram negativas. Además de la actividad microbiana, algunos péptidos son capaces de neutralizar los efectos de LPS, inducir la reparación de heridas e inhibir la degradación de tejidos como parte de la protección del huésped.

Un análogo de la protegrina-1 se encuentra en las pruebas clínicas para el tratamiento de la mucositis oral polimicrobiana (Chen et al. Biopolymers (Peptide Science) 55: 88-98 (2000)).

Los presentes inventores han clonado ahora un ADNc de trucha arco iris que contiene un marco de lectura abierto que se cree que codifica el primer ejemplo de una catelicidina que no es de mamífero. Esto se consiguió de manera inesperada cuando se investigaba la presencia de genes relacionados con IL-1\beta en trucha arco iris.

Tal como se ha descrito anteriormente, las catelicidinas se sintetizan habitualmente in vivo como prepropéptidos, que tienen un péptido señal, una parte de propéptido y una parte de péptido maduro. La catelicidina particular descrita en los ejemplos cumple con esta estructura general mostrada en la figura 10; las secuencias de ADNc y la secuencia de aminoácidos predicha se muestran en la figura 8 y mediante las SEC ID Nos 1 y 2, y 20 y 21.

Aunque el clon de ADNc obtenido era incomplete, los primeros 20 aminoácidos de la secuencia de polipéptido predicha tenían las características de un péptido señal, sugiriendo que el marco de lectura abierto estaba ampliamente completo, con muy poco por clonar. La secuencia del ORF de longitud completa mostrada en la SEC ID No. 20 (de los nucleótidos 5 a 655) confirma esto, el ORF de longitud completa que codifica sólo dos aminoácidos más que el mostrado en la figura 8.

La secuenciación del ORF de longitud completa reveló la presencia de cuatro polimorfismos de nucleótidos individuales, tres de los cuales se prevé que den lugar a una variación del aminoácidos codificado. Cuando una secuencia mostrada en la presente invención incluye uno o más polimorfismos, todas las permutaciones individuales en las secuencias que surgen de estos polimorfismos se consideran que están descritas y forman parte de la presente invención.

En este documento, los nucleótidos o residuos de aminoácidos se numeran como en la figura 8, SEC ID No. 1 y SEC ID No. 2, excepto si se indica lo contrario.

Aunque aún deben confirmarse los sitios de división proteolítica, se cree que los aminoácidos 21 a 148 de la SEC ID No. 2 constituyen la región propéptido, y los aminoácidos 149 a 214 el péptido antimicrobiano "maduro".

La región propéptido propéptido (SEC ID Nos: 3 y 4, 22 y 23) contiene dos secuencias firma de catelina - residuos 28 a 44 (SEC ID Nos. 5 y 6) y 75 a 97 (SEC ID Nos. 7 y 8). Un polimorfismo en la región de propéptido proporciona una secuencia alternativa para firma de catelina de residuos 28 a 44, mostrados como las SEC ID Nos. 24 y 25. Se prevé además que la región propéptido contiene dos enlaces disulfuro internos, entre los residuos de cisteína 82 y 93 y 104 y 128 de SEC ID No. 2. La región propéptido no tiene más de un 29% de similitud a nivel de aminoácidos con cualquier secuencia publicada de catelicidina de mamífero.

La región del péptido antimicrobiano de 66 aminoácidos (SEC ID No. 9 y 10, 26 y 27) tiene similitudes con dos grupos de catelicidinas de mamífero. Se prevé que tiene un puente disulfuro interno entre los residuos 151 y 157 de la SEC ID No. 2, característico del grupo dodecapéptido, y también contiene cuatro repeticiones en tándem de una secuencia consenso nonamérica RPG-G/V-GS-X-I/P-G, similar a las repeticiones halladas en el grupo de profenina. Como resultado, los presentes inventores han clasificado este polipéptido en el grupo de profenina y lo designan como "bactenecina de trucha".

De este modo en un aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido aislado que tiene actividad antimicrobiana, tal como se describe en la reivindicación 1.

La catelicidina de la presente invención puede comprender toda o parte de la secuencia de aminoácidos de SEC ID No. 2 ó 21. Puede ser codificada por un ácido nucleico que comprende toda o parte de los nucleótidos 1 a 647 de la SEC ID No. 1, toda o parte de la SEC ID No. 20 o toda o parte de las SEC ID No. 3 ó 22 ó 9 ó 26, o mediante un mutante, variante, derivado, alelo, homólogo, ortólogo o parálogo de las mismas. La secuencia de polipéptidos codificada, o una parte de la misma, puede mostrar más de un 40% de homología con las SEC ID No.s 2, 21, 4, 23, 10 ó 27, o superior a aproximadamente un 50% de homología, superior a aproximadamente un 60% de homología, superior a aproximadamente un 70% de homología, superior a aproximadamente un 80% de homología, superior a aproximadamente un 90% de homología o superior a aproximadamente un 95% de homología con cualquiera de estas secuencias.

El término "homología" se utiliza a lo largo de esta memoria para referirse a la identidad en porcentaje ente dos secuencias. La identidad en porcentaje se puede calcular utilizando un programa, tal como BLAST o BestFit del paquete informático Genetics Computer Group (GCG) Version 10 disponible en la Universidad de Wisconsin, utilizando parámetros por defecto.

Se entenderá que las subregiones de la catelicidina puede tener una utilidad independiente. Estas subregiones pueden ser dominios individuales, subdominios o péptidos derivados de, por ejemplo, la molécula completa, la región de propéptido o el péptido maduro.

De este modo, la presente invención proporciona además un polipéptido aislado, que comprende una parte que tiene actividad antimicrobiana, de una catelicidina de mamífero, por ejemplo, de una catelicidina de pez, tal como se describe en las reivindicaciones.

Antimicrobiano en este contexto significa la capacidad de retrasar el crecimiento, o la muerte, de uno o más microbios eucariotas o procariotas, por ejemplo, un hongo, tal como una levadura o una bacteria. Los ensayos para determinar la actividad antimicrobiana se pueden basar en los descritos previamente, por ejemplo, en PCT/US00/22781, US-B-6,172,185, EP-A-665 239, Genarro et al. (1989), y Gennaro et al. (1998).

La parte que tiene actividad antimicrobiana puede comprender la secuencia de aminoácidos RPG-G/V-GS-X-I/P-G (SEC ID NO: 19), por ejemplo, de dos a cuatro repeticiones de la secuencia de aminoácidos RPG-G/V-GS-X-I/P-G (SEC ID NO: 19). Una o más de estas repeticiones pueden tener la secuencia de SEC ID NOs: 12, 14, 16 ó 18. En una realización, la parte que tiene la actividad antimicrobiana puede comprender una de cada una de las SEC ID NOs: 12, 14, 16 y 18.

La parte que tiene actividad antimicrobiana puede comprender además un par de residuos de cisteína capaces de formar un puente disulfuro interno.

En una realización, la parte que tiene actividad antimicrobiana comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID No. 10 ó 27. Alternativamente, la parte que tiene actividad antimicrobiana puede mostrar más de aproximadamente un 40% de homología con la SEC ID NO: 10 ó 27, más de aproximadamente un 60% de homología, más de aproximadamente un 70% de homología, más de aproximadamente un 80% de homología, más de aproximadamente un 90% de homología, o más de aproximadamente un 95% de homología con la misma.

El polipéptido aislado puede comprender además una parte propéptido divisible de la parte que tiene actividad antimicrobiana por una proteasa. El polipéptido aislado puede tener actividad antimicrobiana por sí mismo. Alternativamente, la parte que tiene actividad antimicrobiana puede ser capaz de expresar actividad antimicrobiana cuando se divide de la parte propéptido.

En una realización, la protease es elastasa. La división proteolítica por elastasa tiene lugar en el C-terminal de residuos pequeños no cargados, tales como valina o alanina, en catelicidinas habitualmente C-terminal de un residuo de valina. Consecuentemente, el residuo C-terminal del propéptido será habitualmente valina.

Habitualmente, la parte propéptido comprende una o más secuencias firma de Caterina; por ejemplo, la parte de propéptido puede comprender una o más de las SEC ID NOs: 6, 25 y 8; preferiblemente dos de SEC ID NOs: 6, 25 y 8.

Adicionalmente o alternativamente, la parte propéptido puede comprender por lo menos un par de residuos de cisteína capaces de formar un puente disulfuro interno. En una realización, la parte propéptido comprende por lo menos dos pares de residuos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro internos.

En una realización particular, la parte propéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEC ID No. 4 ó 23.

Alternativamente, la parte propéptido de la secuencia de polipéptido puede mostrar más de aproximadamente un 40% de homología con las SEC ID NO: 4 ó 23, más de aproximadamente un 50% de homología, más de aproximadamente un 60% de homología, más de aproximadamente un 70% de homología, más de aproximadamente un 80% de homología, más de aproximadamente un 90% de homología o más de aproximadamente un 95% de homología con las mismas.

Los polipéptidos y péptidos aislados descritos en la presente invención estarán habitualmente libres o sustancialmente libres de material con los que se asocian de forma natural, tales como polipéptidos huésped de pez u otros polipéptidos huésped fisiológicos diferentes de las catelicidinas. Adicionalmente o alternativamente, por ejemplo, si se expresa en una célula huésped procariota u otra célula huésped recombinante, pueden carecer de glicosilación nativa, por ejemplo, glicosilada alternativamente o no glicosilada). Como alternativa adicional, los polipéptidos o péptidos de la presente invención se pueden generar mediante síntesis química, técnicas que son bien conocidas en la técnica.

Los polipéptidos y péptidos de la presente invención se pueden amidar en el extremo C terminal o pueden estar en forma ácida libre. Se pueden extender en los extremos 5' o 3' de los mismos en relación con cualquiera de las secuencias detalladas en la presente invención, por ejemplo, SEC ID NOs: 2, 21, 4, 23, 6 ó 25. Por ejemplo, el marco abierto de lectura puede comprender una secuencia que codifica un péptido señal, tal como un péptido señal nativo de longitud completa (por ejemplo, una forma extendida de la secuencia codificante del potencial péptido señal truncado mostrada en los aminoácidos 1 a 20 de la SEC ID NO: 1), tal como los aminoácidos 1 a 22 de SEC ID NO: 21, un péptido señal heterólogo, o una combinación de los mismos, con el fin de asegurar la secreción adecuada cuando se expresa a partir de la célula huésped recombinante.

Particularmente, cuando se produce mediante la expresión de un huésped recombinante, los péptidos o polipéptidos de la presente invención pueden comprender un péptido señal. Éste puede ser un péptido señal nativo de longitud completa (por ejemplo, una forma extendida del potencial péptido señal truncado mostrado como los aminoácidos 1 a 20 de la SEC ID NO: 2), tal como los aminoácidos 1 a 22 de SEC ID NO: 21, o un péptido señal heterólogo, con el fin de asegurar la secreción apropiada a partir de la célula huésped recombinante.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican los péptidos y polipéptidos descritos en la presente invención.

Los ácidos nucleicos pueden ser total o parcialmente sintéticos. En particular, pueden ser recombinantes en tanto que las secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran juntas en la naturaleza (no actúan de forma contigua) se han ligado o en cualquier caso, combinado artificialmente. Alternativamente se pueden sintetizar directamente, por ejemplo utilizando un sintetizados automático.

El ácido nucleico según la presente invención pueden ser polinucleótidos u oligonucleótidos, y pueden incluir ADNc, ARN, ADN genómico (ADNg) y ácidos nucleicos modificados o análogos de ácidos nucleicos. Cuando se especifica una secuencia de ADN, por ejemplo, en referencia a una figura o una SEC ID No., a menos que el contexto requiera lo contrario, comprende el ARN equivalente, con U sustituido por T.

Los ácidos nucleicos pueden comprender, consistir o consistir esencialmente de cualquiera de las secuencias descritas en la presente invención (que puede ser un gen, un clon genómico u otra secuencia, un ADNc, o un ORF o un exón de cualquiera de los mismos, etc.). Por ejemplo, cuando se describe un ADNg, también se comprenden ácidos nucleicos que comprenden uno o más intrones o exones de cualquiera de los ADNg. Así mismo, cuando se describe ADNc, también se comprenden ácidos nucleicos que comprenden sólo la región traducida (codones de inicio a terminación).

Cuando se hace referencia a un ácido nucleico (o secuencia de nucleótidos) de la presente invención, el complemento de ese ácido nucleico (o secuencia de nucleótidos) también estará comprendido por la invención. El "complemento" en cada caso tiene la misma longitud que la referencia, pero es un 100% complementaria a la misma, por lo que cada nucleótido se empareja con su equivalente, es decir G a C y A a T o U.

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden diferir de las secuencias específicas indicadas en la presente invención por un cambio que es uno o más de una adición, inserción, deleción y sustitución de uno o más nucleótidos de las secuencias mostradas, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más nucleótidos. Los cambios en una secuencia de nucleótidos pueden dar lugar a un cambio de aminoácido a nivel de proteína, o no, determinado por la degeneración del código genético.

Por otro lado, los polipéptidos codificados pueden comprender una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más residuos de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos mostradas en la presente invención, tal como se ha indicado anteriormente. La presente invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que son variantes de la secuencia de aminoácidos, derivados, alelos, mutantes, homólogos, ortólogos o parálogos de las secuencias mostradas aquí. Los ácidos nucleicos que codifican dicho polipéptido pueden mostrar más de aproximadamente un 40% de homología con cualquiera de las secuencias codificantes mostradas en la presente invención, más de aproximadamente un 50% de homología, más de aproximadamente un 60% de homología, más de aproximadamente un 70% de homología, más de aproximadamente un 80% de homología, más de aproximadamente un 90% de homología o más de aproximadamente un 95% de homología con por ejemplo las SEC ID NOs. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 20, 22, 24 ó 26.

El marco de lectura abierto de los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido o péptido según la presente invención se puede extender en los extremos 5' o 3' de los mismos en relación a cualquiera de las secuencias codificantes detalladas en la presente invención, por ejemplo, los nucleótidos 1 a 644 de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 9. el marco de lectura abierto puede comprender una secuencia que codifica un péptido seña, tal como un péptido señal nativo de longitud completa (por ejemplo, una forma extendida de la secuencia codificante del potencial péptido señal truncado como los nucleótidos 1 a 62 de la SEC ID No. 1), un péptido señal heterólogo, o una combinación de los mismos, con el fin de asegurar la secreción apropiada cuando se expresa a partir de la célula huésped recombinante. Por ejemplo, el ORF puede ser tal como se muestra en la figura 15 o la SEC ID no. 20.

El término "ortólogo" se utiliza en la presente invención para referirse a un gen en un locus cromosómico equivalente para un gen determinado, pero en especies diferentes. El término "parálogo" se refiere a un gen presente en un locus cromosómico diferente para un gen determinado, en a misma o diferentes especies, pero homólogo a ese gen y relacionado con el mismo mediante un caso de duplicación génica.

Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden proporciona como parte de un vector, y también se proporciona en la presente invención un vector que comprende ácido nucleico tal como se ha descrito aquí, particularmente vectores a partir de los que se puede expresar el polipéptido en condiciones apropiadas, y una célula huésped que contiene dicho vector o ácido nucleico.

Se define que un "vector" incluye, entre otros, cualquier plásmido, cósmido, fago o vector binario de Agrobacterium en forma de cadena lineal o circular doble o sencilla que puede ser o no auto transmitible o movilizable, y que puede transformar un huésped procariota o eucariota mediante integración en el genoma celular o existir extracromosómicamente (por ejemplo, plásmido replicante autónomo con un origen de replicación).

Hablando en general, los expertos en la material son capaces de construer vectores y diseñar protocolos para la expresión de genes recombinantes. Se pueden elegir o construir vectores adecuados, que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo, secuencias de promotor, fragmentos de terminación, secuencias de polideanilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias apropiadas. Para más detalles, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2^{nd} edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Se incluyen específicamente vectores de transferencia por lo que se entiende un ADN portador capaz, de forma natural o por diseño, de replicarse en dos organismos huésped diferentes, que se pueden seleccionar entre actinomicetos y especies relacionadas, bacterias y eucariotas (por ejemplo, células de plantas superiores, mamíferos, levadura hongos).

Un vector que incluye ácido nucleico según la presente invención no necesita incluir una secuencia de promotor u otra secuencia reguladora, particularmente si el vector se utiliza para introducir el ácido nucleico en células para la recombinación en el genoma.

Preferiblemente, la secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención en el vector se encuentra bajo el control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la transcripción, y unido operativamente a los mismos, en una célula huésped, tal como una célula microbiana, por ejemplo bacteriana, o célula vegetal. El vector puede ser un vector de expresión bifuncional que actúa en múltiples huéspedes. En el caso de ADN genómico, éste puede contener su propio promotor u otros elementos reguladores y en el caso de ADNc, éste puede estar bajo el control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores para la expresión en la célula huésped.

Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos a partir de la cual se puede iniciar la transcripción de ADN unido operativamente "downstream" (es decir, en la dirección 3' en la cadena codificante del ADN de doble cadena).

"Unido operativamente" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, situado y orientado de manera adecuada para la transcripción a iniciarse a partir del promotor. El ADN unido operativamente a un promotor se encuentra "bajo la regulación de iniciación transcripcional" del promotor.

En una realización preferida, el promotor es un promotor inducible.

El término "inducible" aplicado a un promotor es bien comprendido por los expertos en la material. Esencialmente, la expresión bajo el control de un promotor inducible se "conecta" o aumenta en respuesta a un estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre promotores. Algunos promotores inducibles provocan niveles bajos o indetectables de expresión (o sin expresión) en ausencia de los estímulos apropiados. Otros promotores inducibles provocan la expresión constitutiva detectable en ausencia del estímulo. Cualquiera que sea el nivel de expresión en ausencia del estímulo, la expresión de cualquier promotor inducible aumenta en presencia del estímulo correcto.

De este modo, este aspecto de la presente invención proporciona una construcción génica, preferiblemente un vector replicable, que comprende un promotor (opcionalmente inducible) unido operativamente a una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención, tal como el gen de bactenecina de trucha o una variante del mismo.

La presente invención también comprende un método de fabricación de un polipéptido o péptido tal como se ha descrito, incluyendo el método la etapa de expresar dicho polipéptido o péptido del ácido nucleico que lo codifica, que en la mayoría de las realizaciones será el ácido nucleico según la presente invención. Esto puede conseguirse convenientemente mediante el crecimiento de una célula huésped que contiene dicho vector en un cultivo bajo condiciones apropiadas que provocan o permiten la expresión del polipéptido. Los polipéptidos y péptidos también se pueden expresar en sistemas in vitro, tales como lisados de reticulocitos, tal como entenderá un experto en la materia.

Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en un conjunto de células huésped diferentes son bien conocidos. Entre las células huésped adecuadas se incluyen bacterias, células eucariotas, tales como células de mamífero, células de pez y levadura, y sistemas de baculovirus. Entre las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo se incluyen, células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de rincón de hámster recién nacido, células COS y muchas otras. Una línea celular de pez candidata es la línea de fibroblastos RTG de trucha. Un huésped bacteriano habitual preferido es E. coli. Sin embargo, habitualmente, se elegirá un huésped que esté tan afectado de manera adversa por ningún efecto antimicrobiano de la proteína expresada como para perjudicar en el rendimiento de la proteína o péptido expresado. De este modo, la elección del huésped puede depender de la actividad concreta del péptido o proteína a expresar.

De este modo, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene ácido nucleico heterólogo tal como se ha descrito en la presente invención.

El ácido nucleico de la presente invención puede estar integrado en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la célula huésped. La integración se puede provocar mediante la inclusión de secuencias que provocan la recombinación con el genoma, según técnicas estándar. El ácido nucleico puede estar en un vector extracromosómico en la célula, o en cualquier caso identificable como heterólogo o extraño a la célula.

Un aspecto adicional proporciona un método que incluye introducir el ácido nucleico en una célula huésped. La introducción, a la que se puede hacer referencia en general (particularmente para la introducción in vitro), sin limitación, como "transformación", puede utilizar cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción utilizando retrovirus u otro virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección utilizando bacteriófagos. Como alternativa, se puede emplear la inyección directa del ácido nucleico.

Se pueden utilizar genes marcadores, tales como de genes de resistencia o sensibilidad a antibiótico en la identificación de clones que contienen ácido nucleico de interés, tal como es bien conocido en la técnica.

Después de la introducción se provoca o permite la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de células huésped (que puede incluir células realmente transformadas, aunque más probablemente las células serán descendientes de las células transformadas) bajo condiciones para la expresión del gen, de manera que se produce el polipéptido (o péptido) codificado. Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido señal líder apropiado, se puede secretar de la célula en el medio de cultivo. Después de la producción mediante expresión, se puede aislar y/o purificar el polipéptido o péptido de la célula huésped y/o el medio de cultivo, según sea el caso, y posteriormente utilizarse según se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición que puede incluir uno o más componentes adicionales, tales como una composición farmacéutica que incluye uno o más excipientes, vehículos o portadores farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, ver a continuación).

La clonación por los presentes inventores de la molécula de bactenecina de trucha proporciona además material válido para utilizar en la identificación y aislamiento de catelicidinas adicionales, particularmente de especies que no son mamíferos, especialmente especies de peces.

De este modo, también se describe en la presente invención un ácido nucleico aislado para su uso como sonda o cebador, comprendiendo dicho ácido nucleico una secuencia particular de por lo menos aproximadamente 16 a 24 nucleótidos de longitud, estando dicha secuencia particular presente en los nucleótidos 1 a 815 de SEC ID no. 1, o en cualquiera de SEC ID No. 20, o en cualquiera de la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 15 (SEC ID No. 28) y, particularmente, las regiones codificantes de la misma, o una secuencia equivalente por degeneración a la misma, o la combinación de cualquiera de ellas.

Una secuencia particular en este contexto es una secuencia derivada de las secuencias de bactenecina de trucha proporcionas en la presente invención, capaces de hibridarse selectivamente o específicamente a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID No. 1 ó 20, o la figura 15 (SEC ID NO: 28), y preferiblemente a las secuencias codificantes de la mismas, en una preparación heteróloga de ácido nucleico, por ejemplo, una preparación de ADN genómico, ADNc, o ARN. Dichas moléculas se pueden utilizar para identificar funcionalmente secuencias relacionadas, por ejemplo, otras secuencias de genes de catelicidina, en preparaciones de ácido nucleico de trucha arco iris, otras especies de peces, o cualquier otra especie diana.

La secuencia particular puede comprender 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 500 o más nucleótidos contiguos de las secuencias descritas en la presente invención, o una secuencia equivalente por degeneración a la misma, o el complemento de cualquiera de ellas.

De este modo, la secuencia particular puede derivar del marco de lectura abierto de SEC ID No. 1 ó 20, es decir los nucleótidos 1 a 647 de la SEC ID No. 1, o la secuencia de nucleótidos 5 a 655 de SEC ID No. 20, incluyendo el codón de parada TAG. Adicionalmente o alternativamente, la secuencia particular puede derivar total o parcialmente de la región no traducida 3' del nucleótido 648 de SEC ID No. 1, o cualquiera de las secuencias no codificantes mostradas en la SEC ID No. 20 y la figura 15.

En algunas realizaciones, la secuencia particular puede comprender toda o parte de alguna de la secuencias firma de catelina (SEC ID Nos 6, 8, 25). La secuencia particular puede comprender toda o parte de una o más de las SEC ID Nos. 11, 13, 15, 17, que codifica las repeticiones nonaméricas del péptido maduro, o de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia consenso nonámera RPG-G/V-GS-X-I/P-G, o cualquier secuencia equivalente por degeneración a cualquiera de las secuencias anteriores o el complemento de las mismas.

Las secuencias referidas anteriormente se pueden modificar mediante adición, sustitución, inserción o deleción de uno o más nucleótidos, pero preferiblemente sin eliminar la capacidad de hibridarse selectivamente con el ácido nucleico con la secuencia de SEC ID No. 1 ó 20, o la figura 15, es decir, cuando el grado de homología del oligonucleótido o polinucleótido con una de las secuencias determinadas es suficientemente elevado. La secuencia particular puede tener más de aproximadamente un 40% de homología, más de aproximadamente un 50% de homología, más de aproximadamente un 60% de homología, más de aproximadamente un 70% de homología, más de aproximadamente un 80% de homología, más de aproximadamente un 90% de homología o más de aproximadamente un 95% de homología con toda o parte de las SEC ID NO: 1 ó 20, o la secuencia de la figura 15, por ejemplo, con toda o parte de las SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 22, 24 ó 26, o una secuencia equivalente por degeneración a las mismas, o el complemento de las mismas.

Se pueden realizar experimentos preliminares mediante la hibridación bajo condiciones de baja astringencia. Para sondar, las condiciones preferidas son aquellas que son suficientemente astringentes para que sean un patrón sencillo con un pequeño número de hibridaciones identificadas como positivas que se pueden investigar posteriormente.

Por ejemplo, se pueden realizar hibridaciones, según el método de Sambrook et al. (a continuación) utilizando una solución de hibridación que comprende: 5X SSC (donde "SSC" = 0,15 M cloruro sódico; 0,15 M citrato sódico; pH 7), 5X reactivo de Denhardt, 0,5-1,0% SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado y desnaturalizado, 0,05% pirofosfato sódico y hasta un 50% de formamida. La hibridación se lleva a cabo a 37-42ºC durante por los menos seis horas. Tras la hibridación, se lavan los filtros de la siguiente manera: (1) 5 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC y 1% SDS; (2) 15 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC y 0,1% SDS; (3) 30 minutos - 1 hora a 37ºC en 1X SSC y 1% SDS; (4) 2 horas a 42-65ºC en 1X SSC y 1% SDS, cambiando la solución cada 30 minutos.

Una fórmula habitual para calcular las condiciones de astringencia requeridas para conseguir la hibridación entre moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencias especificada es (Sambrook et al., 1989):

Tm = 81,5ºC + 16,6log [Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (% formamida) - 600/# bp en cadena doble

Como ilustración de la fórmula anterior, utilizando [Na^{+}] = [0,368] y 50% formamida, con un contenido de GC de 42% y un tamaño de sonda promedio de 200 bases, la Tf es 57ºC. La Tf de una cadena doble de ADN disminuye en 1-1,5ºC con cada descenso de un 1% en la homología. De este modo, se observarían dianas con más de aproximadamente un 75% de identidad en la secuencia utilizando una temperatura de hibridación de 42ºC. Dicha secuencia se consideraría sustancialmente homóloga a la secuencia de ácido nucleico de la presente invención.

Es bien conocido en la técnica el aumento gradual de la astringencia de hibridación hasta que sólo queden unos pocos clones positivos. Otras condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, para la detección de secuencia que son aproximadamente un 80-90% idénticas, hibridación durante toda la noche a 42ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,24 M pH 7,2, SDS 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y un lavado final a 55ºC en 0,1X SSC, SDS al 0,1%. Para la detección de secuencias que tienen una identidad de más de aproximadamente un 90%, las condiciones adecuadas incluyen hibridación durante toda la noche a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M, pH 7,2, SDS al 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y un lavado final a 60ºC en 0,1X SSC, SDS al 0,1%.

La presente invención también proporciona un método para aislar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de catelicidina o una parte del mismo, empleando dicho método ciertos cebadores o sondas de ácido nucleico aislado descritos anteriormente, tal como se expresa en las reivindicaciones. Los métodos de la presente invención pueden comprender las etapas de:

(a)

proporcionar una preparación de ácido nucleico de un organismo diana;

(b)

proporcionar un cebador o sonda de ácido nucleico tal como se describe en las reivindicaciones;

(c)

poner en contacto dicha preparación de ácido nucleico con dicho cebador o sonda, y

(d)

identificar el ácido nucleico en dicha preparación que se hibrida con dicho cebador o sonda.

La preparación de ácido nucleico puede comprender, por ejemplo, ADN genómico, ARN o ADNc. El contacto, o hibridación, entre el cebador o la sonda y la preparación de ácido nucleico se pueden realizar bajo cualquier condición adecuada. Las condiciones de la hibridación se pueden controlar para minimizar la unión no específica y se prefieren preferiblemente condiciones de hibridación astringentes a moderadamente astringentes. El experto en la materia es fácilmente capaz de diseñar sondas adecuadas, marcarlas y crear condiciones adecuadas para las reacciones de hibridación, ayudado por libros de texto, tales como Sambrook et al (1989) y Ausubel et al (1992), teniendo en cuenta factores, tales como longitud de nucleótidos y composición de bases, temperatura, etcétera.

La detección e identificación del ácido nucleico que se hibrida con el cebador o la sonda se pueden realizar mediante cualquier método adecuado, muchos ejemplos de los mismos son conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, las sondas se pueden marcar radioactivamente, por fluorescencia o enzimáticamente.

El sondeo puede utilizar la técnica estándar de transferencia Southern. Por ejemplo, el ADN se puede extraer de células y se digiere con diferentes enzimas de restricción. Los fragmentos de restricción se pueden entonces separar mediante electroforesis en un gel de agarosa, antes de la desnaturalización y transferir a un filtro de nitrocelulosa. La sonda marcada se puede hibridar a los fragmentos de ADN en el filtro y se determina la unión. Se puede preparar ADN para el sondeo a partir de las preparaciones de ARN de células.

Otros métodos que no utilizan el marcaje de sonda incluyen el examen de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, amplificación utilizando PCR, división por ARNasa y sondeo con oligonucleótidos específicos de alelo.

Por ejemplo, el método de identificación puede implicar la reacción en cadena de la polimerasa, en cuyo caso, el método puede comprender las etapas de:

(a)

proporcionar una preparación de ácido nucleico de un organismo diana;

(b)

proporcionar una pareja de cebadores de ácido nucleico, siendo por lo menos uno de dichos cebadores un ácido nucleico tal como se describe en las reivindicaciones;

(c)

poner en contacto dicha preparación de ácido nucleico con dichos cebadores en condiciones para realizar una PCR, y

(d)

realizar la PCR y determinar la presencia o ausencia de ácido nucleico amplificado.

El método puede comprender además la etapa de clonar el ácido nucleico amplificado. En el contexto de la clonación, puede ser necesario que uno o más fragmentos del gen se unan para generar una secuencia codificante de longitud completa. Además, cuando no se ha obtenido una molécula de ácido nucleico codificante de longitud completa, se puede utilizar una molécula más pequeña que representa parte de la molécula completa para obtener clones de longitud completa. Se pueden preparar insertos a partir de clones de ADNc parciales y utilizarlos para cribar bibliotecas de ADNc. Los clones de longitud completa aislados se pueden subclonar en vectores de expresión y se puede ensayar la actividad mediante la transfección en células huésped adecuadas, por ejemplo, con un plásmido informador.

La presente invención comprende además métodos para producir péptidos o polipéptidos codificados por ácidos nucleicos identificados por los métodos indicados anteriormente. Dichos métodos pueden comprender las etapas de:

(a)

aislar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de catelicidina o una parte del mismo;

(b)

introducir dicho ácido nucleico en una célula huésped adecuada, y

(c)

provocar o permitir la expresión de dicho ácido nucleico en dicha célula huésped adecuada.

Se han descrito anteriormente métodos adecuados para dicha expresión.

La disposición de los péptidos y polipéptidos de bactenecina de trucha permite por primera vez producir anticuerpos capaces de unirse específicamente a estos polipéptidos, fragmentos y partes activas de los mismos.

Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un anticuerpo capaz de unirse específicamente a cualquiera de los polipéptidos de la presente invención. Dicho anticuerpo puede ser específico en el sentido de ser capaz de distinguir entre el polipéptido al que es capaz de unirse y otros polipéptidos humanos por los que no tiene o sustancialmente no tiene afinidad de unión (por ejemplo, una afinidad de unión de aproximadamente 1000 veces peor). Los anticuerpos específicos se unen a un epítopo en la molécula que no está presente o no está accesible en otras moléculas. Los anticuerpos según la presente invención pueden ser específicos para el polipéptido de tipo salvaje. Los anticuerpos según la presente invención pueden ser específicos para un polipéptido mutante, variante o derivado particular como entre esa molécula y el polipéptido de tipo salvaje, para ser útiles en métodos de pronóstico y diagnóstico, tal como se describen a continuación. Los anticuerpos también son útiles para la purificación del polipéptido o polipéptidos a los que se unen, por ejemplo después de la producción mediante expresión recombinante a partir de ácido nucleico codificante.

Los anticuerpos preferidos según la presente invención están aislados, en el sentido de estar libres de contaminantes, tales como anticuerpos, capaces de unirse a otros polipéptidos y/o estar libres de componentes del suero. Se prefieren anticuerpos monoclonales para los mismos objetivos, aunque los anticuerpos policlonales se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Los métodos de producción de anticuerpos incluyen inmunizar un mamífero o pájaro (por ejemplo, humano, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja, mono o pollo) con la proteína o un fragmento de la misma. Los anticuerpos se pueden obtener de animales inmunizados utilizando cualquiera de un conjunto de técnicas conocidas en el sector y se pueden cribar, preferiblemente utilizando la unión del anticuerpo con el antígeno de interés. Alternativamente, los animales se pueden inmunizar con ADN que codifica el antígeno de interés (Donnelly, J.J., Ulmer, J.B., Shiver, J.W. & Liu, M.A. (1997). DNA vaccines. Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648).

Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de transferencia Western o inmunoprecipitación (Armitage et al, 1992, Nature 357: 80-82). Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales.

Los anticuerpos se pueden modificar de varias maneras. De hecho, el término "anticuerpo"debería interpretarse que cubre cualquier sustancia de unión específica que tiene un dominio de unión con la especificidad requerida. De este modo, este término cubre fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, incluyendo cualquier anticuerpo que comprende un dominio de unión a inmunoglobulina, tanto natural como sintético. Por tanto, se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina, o equivalente, fusionadas a otro polipéptido. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en EP-A-0120694 y EP-A-0125023. Se ha observado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de antígenos de unión. Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios V1 y VH de un anticuerpo único; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un péptido enlazador que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos (PCT/US92/09965) y (ix) "diabodies", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión génica (WO94/13804; P Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993).

Los "diabodies" son multímeros de polipéptidos, comprendiendo cada polipéptido un primer dominio que comprende una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando los dos dominios unidos (por ejemplo mediante un péptido enlazador), pero incapaces de asociarse entre sí para formar un sitio de unión a antígeno; los sitios de unión a antígeno estás formados por la asociación del primer dominio de un polipéptido en el multímero con el segundo dominio de otro polipéptido en el multímero (WO94/13804).

Como alternativa o complemento a la inmunización de un mamífero, los anticuerpos con especificidad de unión apropiada se pueden obtener de una biblioteca producida recombinantemente de dominios variables de inmunoglobulina expresados, por ejemplo utilizando un bacteriófago lambda o bacteriófago filamentoso que muestra dominios de unión de inmunoglobulina funcionales en sus superficies; por ejemplo véase WO92/01047.

Los anticuerpos desarrollados para un polipéptido o péptido se pueden utilizar en la identificación y/o aislamiento de polipéptidos variantes y, a continuación, de sus genes codificantes. De este modo, la presente invención proporciona un método de identificación o aislamiento de un péptido de catelicidina, polipéptido o variante del mismo (tal como se ha descrito anteriormente), que comprende cribar los polipéptidos candidatos con un polipéptido que comprende el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, todo el anticuerpo o un fragmento del mismo) que es capaz de unirse a dicho péptido de catelicidina, polipéptido o variante del mismo, o preferiblemente tiene especificidad de unión por dicho polipéptido. Los miembros de unión específica, tales como anticuerpos y polipéptidos que comprenden un dominio de unión a antígeno de anticuerpos que se unen y, son preferiblemente, específicos para un péptido de catelicidina, polipéptido o mutante o derivado del mismo representan aspectos adicionales de la presente invención, al igual que lo son su uso y métodos que los utilizan.

Los polipéptidos candidatos para cribar pueden ser, por ejemplo, los productos de una biblioteca de expresión creada utilizando ácido nucleico derivado de una planta de interés o puede ser el producto de un proceso de purificación de una fuente natural. Se puede aislar el polipéptido que se encuentra que se une al anticuerpo y, a continuación, se puede someter a la secuencia de aminoácidos. Se puede utilizar cualquier técnica adecuada para secuenciar el polipéptido total o parcialmente (por ejemplo, se puede secuencia un fragmento del polipéptido). La información de la secuencia de aminoácidos se puede utilizar para la obtención de ácido nucleico que codifica el polipéptido, por ejemplo mediante el diseño de uno o más oligonucleótidos (por ejemplo, un conjunto degenerado de oligonucleótidos) para su uso como sondas o cebadores en la hibridación al ácido nucleico candidato o mediante la búsqueda con bases de datos informáticas de secuencias.

Los polipéptidos o péptidos de la presente invención se pueden utilizar en aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, los péptidos o polipéptidos con actividad antimicrobiana pueden ser útiles en el tratamiento de patologías causadas por microbios, por ejemplo infecciones fúngicas o bacterianas. Por ejemplo, se ha observado que algunas catelicidinas son activas frente a un conjunto de cepas bacterianas, incluyendo cepas resistentes a fármacos, tales como E. coli, Salmonella enteritides, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Burkholderia cepacia, Staphylococcus aureus (MRSA - es decir, resitente a meticilina), Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis (VREF - es decir, resistente a vancomicina) y Streptococcus agalactiae, y también hongos, tales como Candida albicans, Candida glabrata y Cryptococcus neoformans (Gennaro, R & Zanetti, M. (2000). Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides. Biopolymers 55: 31-49). La molécula de bactenecina de trucha puede ser activa contra cualquiera de las especies mencionadas anteriormente, y otras bacterias del mismo género. También puede ser activa contra patógenos de peces. Por ejemplo, puede ser activa contra Aeromonas, Vibrio, Yersinia, Flexibacter, Pasteurella, Flavobacterium, Renibacterium o Piscirickettsia, por ejemplo, Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Yersinia ruckeri, Flexibacter maritimus, Pasteurella piscicida, Flavobacterium psychrophilum, Renibacterium salmoninarum, o Piscirickettsia salmonis.

Sin embargo, muchas catelicidinas tienen mecanismos de acción relativamente no específicos que implican la interacción con la membrana microbiana, en lugar de con moléculas, tales como proteínas, que varían más ampliamente entre especies, y de este modo también tienen aplicaciones en el tratamiento de muchas otras patologías mediadas por microbios.

También se ha sugerido que los péptidos de catelicidina maduros son capaces de la inmunoregulación, neutralización de endotoxina bacteriana y la curación de heridas. Por ejemplo, el péptido LL37 derivado de CAP-18 humana es capaz de unirse y neutralizar endotoxina (Larrick, J.W. et al. (1994). J. Immunol. 152: 231-240), induce la liberación de histamina y la movilización de calcio intracelular en mastocitos (Niyonsaba, F. et al. (2001). Eur. J. Immunol. 31: 1066-1075), y es quimiotáctico para neutrófilos, monocitos, y células T, pero no células dendríticas (Lillard Jr, J. W. et al. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 651-656). La actividad neutralizante contra endotoxina ha conducido a que sea propuesta como potencial terapia para sepsis gram-negativa.

La PR-39 porcina es capaz, ente otras cosas, de la regulación por incremento de la expresión de proteoglicanos de tipo heparán sulfato denominados sindecanos, que están implicados en la reparación de heridas (Gallo, R.L. et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11035-11039) y tienen otras numerosas actividades, incluyendo actividades antiinflamatorias, tales como la reducción de la producción de especies reactivas de oxígeno, adhesión de neutrófilos, etc. (para revisión, véase, Zhang, G.L., Ross, C.R. & Blecha, F. (2000). Vet. Res. 31: 277-296; Gennaro, R & Zanetti, M. (2000). Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides. Biopolymers 55: 31-49).

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona péptidos, polipéptidos y ácidos nucleicos tal como se ha descrito anteriormente en un método de tratamiento médico.

En particular, los péptidos, polipéptidos y ácidos nucleicos se pueden utilizar para el tratamiento de una patología provocada por un microbio, para modular la actividad de endotoxina bacteriana (por ejemplo, en sepsis gram-negativa), para la inmunoregulación (por ejemplo, el tratamiento de inflamación), y para estimular la curación de heridas.

También se proporciona el uso de dichos péptidos, polipéptidos y ácidos nucleicos en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tratamiento de una patología provocada por un microbio, para modular la actividad de endotoxina bacteriana (por ejemplo, sepsis gram-negativa), para la inmunoregulación (por ejemplo, el tratamiento de la inflamación), y para la estimulación de la curación de heridas.

La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden péptidos, polipéptidos o ácidos nucleicos de la presente invención. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las sustancias anteriores, un excipiente, portador, tampón, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza exacta del portador u otro material puede depender de la ruta de administración, por ejemplo, rutas oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal. Para la administración a peces, la composición farmacéutica se puede formular para la adición a agua que contiene el pez.

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden ser en comprimido, cápsula, polvo o forma líquida. Un comprimido puede incluir un portador sólido, tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen generalmente un portador líquido, tal como agua, hidrocarburos, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se pueden incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o la inyección en el sitio de afección, el principio activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que está libre de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia son capaces de preparar soluciones adecuadas que utilizan, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como Inyección de Cloruro Sódico, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactato. Se pueden incluir, según se requiera, conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

Tanto si es un polipéptido, anticuerpo, péptido, molécula de ácido nucleico, molécula pequeña u otro compuesto farmacéuticamente útil según la presente invención el que se administra a una individuo, la administración es preferiblemente en una "cantidad profilácticamente eficaz" o en una "cantidad terapéuticamente eficaz" (según sea el caso, aunque la profilaxis se puede considerar terapia), siendo ésta suficiente para mostrar un beneficio al individuo. La cantidad real administrada, y la velocidad y evolución con el tiempo de la administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se trata. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosis, etc., se encuentra dentro de la responsabilidad de los profesionales médicos, otros doctores y cirujanos veterinarios, y habitualmente tiene en cuenta el trastorno a tratar, la patología del paciente, el punto de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos. Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente se pueden hallar en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980.

Los péptidos se pueden administrar, por ejemplo, mediante inyección, o, por ejemplo, mediante administración transdérmica, lo cual se puede realizar según métodos conocidos en la técnica. En general, la administración transdérmica implica el uso de un "parche" transdérmico que permite la liberación lenta del compuesto a un región de piel seleccionada. Aunque dichos parches se utilizan en general para proporcionar una liberación sistémica del compuesto, se prevé que la liberación dirigida a un punto proporcione una mayor concentración del compuesto en regiones seleccionadas de tejido. Ejemplos sistemas de administración parches transdérmicos se proporcionan en la Patente de Estados Unidos 4,655,766 (sistema impulsado osmóticamente de fluido embebido), y la Patente de Estados Unidos. No. 5,004,610 (sistema de administración transdérmica de velocidad controlada).

La administración transdérmica de péptidos se puede llevar a cabo preferiblemente utilizando métodos iontoforéticos, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos No. 5,032,109 (sistema de administración transdérmica electrolítica), y en la Patente de Estados Unidos No. 5,314,502 (dispositivo de administración iontoforética que funciona con energía eléctrica).

Para la administración transdérmica, puede ser deseable incluir sustancias aumentadoras de la permeación, tales como sustancias solubles en grasas (por ejemplo, ácidos carboxílicos alifáticos, alcoholes alifáticos), o sustancias solubles en agua (por ejemplo, alcano polioles, tales como etilenglicol, 1,3-propanodiol, glicerol, propilenglicol, y similares). Además, tal como se ha descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5,362,497, se puede añadir una "resina super absorbente en agua" a formulaciones transdérmicas para aumentar adicionalmente la liberación transdérmica. Ejemplos de dichas resinas incluyen, pero sin limitación, poliacrilatos, copolímeros de éster de acetato de vinilo-ácido acrílico saponificado, copolímeros entrecruzados de alcohol polivinilo-anhídrido maleico, polímeros de injerto de poliacrilonitrilo saponificado, polímeros de injerto de ácido acrílico en almidón, y similares. Dichas formulaciones se pueden disponer como vendajes oclusivo en la región de interés, o se pueden disponer en una o más configuraciones de parches transdérmicos descritas anteriormente.

En otros métodos de tratamiento, los moduladores se pueden administrar oralmente o mediante insuflación nasal, según los métodos conocidos en la técnica. Para la administración de péptidos, puede ser deseable incorporar dichos péptidos en microcápsulas adecuadas para la administración oral o nasal, según métodos conocidos en la técnica.

A continuación, se describirán realizaciones concretas de la presente invención haciendo referencia a las figuras acompañantes.

Figura 1 muestra los resultados de un PCR utilizando cebadores para \beta-actina, IL-1\beta1 y IL-1\beta2 para analizar la calidad de las bibliotecas de ADNc utilizadas en el presente estudio.

Figura 2 muestra películas radiográficas de membranas de recogidas en placas de fagos duplicados a partir de una placa, después de la hibridación de las membranas con una sonda IL-1\beta radiomarcada.

Figura 3 muestra los resultados de un cribado de fagos en una primera ronda de PCR, con cebadores específicos para IL-1 \beta 1 e IL-1\beta2, para identificar aquellos que contienen genes de IL-1\beta1 e IL-1\beta2.

Figura 4 muestra películas de dos placas diferentes después de una segunda ronda de cribado de recogidas en placas de fagos con la sonda IL-1\beta radiomarcada.

Figura 5 muestra un cribado de insertos de fagos en segunda ronda de PCR para identificar cualquier gen de IL-1\beta1 e IL-1\beta2.

Figura 6 muestra la amplificación por PCR de insertos de fagos utilizando los cebadores T3 y T7 específicos para secuencias flanqueantes de fagos, para confirmar la presencia de ADN fago.

Figura 7 muestra la amplificación por PCR de insertos de fagos utilizando los cebadores T3 y T7 específicos para secuencias flanqueantes de fagos, para analizar el tamaño de los insertos.

Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos prevista del clon 6-3 de ADNc.

Figura 9 muestra las alineaciones de secuencias firma de catelina de trucha con las de catelicidinas conocidas.

Figura 10 es una representación esquemática de la estructura de la catelicidina de trucha.

Figura 11 muestra una alineación del péptido maduro de catelicidina de trucha con péptidos maduros de catelicidinas conocidas.

Figura 12 muestra el análisis de RT-PCR de la expresión de \beta-actina y catelicidina de trucha en leucocitos de riñón cefálico de trucha estimulados con LPS.

Figura 13 muestra el análisis de RT-PCR de la expresión de \beta-actina y catelicidina de trucha en leucocitos de riñón cefálico de trucha estimulados con LPS estimulada con acetato de miristato forbol, acetato de miristato forbol más ionóforo de calcio, o fitohemaglutinina.

Figura 14 muestra los efectos de actinomicina D y cicloheximida en la expresión de \beta-actina y catelicidina de trucha en leucocitos de riñón cefálico de trucha estimulados con LPS.

Figura 15 muestra la secuencia genómica y la organización del gen de catelicidina de trucha, que muestra la secuencia codificante, intrones y regiones flanqueantes. Se muestran secuencias de nucleótidos no codificantes en minúscula, secuencias codificantes en mayúscula. Las secuencias de aminoácidos previstas de los exones se muestran sombreadas. Se indica un presunto recuadro TATA.

Materiales y Métodos 1.1 Bibliotecas

Se construyeron dos bibliotecas de ADNc de trucha diferentes utilizando el kit \lambdaZAP Express (Stratagene). Se extrajo ARN de los leucocitos de riñón cefálico de trucha arco iris estimulado durante 4 horas con fitohemaglutinina (PHA) (Davidson et al., 1999), y de macrófagos de riñón cefálico aislados de peces estimulados con Aeromonas salmonicida (Hardie et al., 1998). El ARN se transcribió de manera inversa a ADNc y se unió en el vector lambda ZAP-CMV XR. La construcción se empaquetó en fagos (Stratagene) y se almacenó en tampón SM y cloroformo a 4ºC.

La calidad de las bibliotecas se analizó mediante amplificación de los genes \beta-actina, IL-1\beta1 e IL-12 mediante PCR. \beta-acción es un gen constitutivo ("housekeeping") expresado de manera constitutiva en todos los tipos de células. Se utilizaron IL-1\beta1 e IL-1\beta2 como genes representativos inducidos durante respuestas inmunes. Los cebadores utilizados para la \beta-acción fueron directo (5'-ATCGTGGGGCGCCCCAGGCACC-3') e inverso (5'-CTCCTTAATGT
CACGCACGATTTC-3'), para IL-1\beta1 fueron F10 directo (5'-GGATTCACAAGAACTAAGGAC-3') e R3 inverso (5'-CTTAGTTGTGGCGCTGGATG-3'), y para IL-1\beta2 fueron F4 directo (5'-ACTACAAAACAGCCAACTACAAACC-3') e R8 inverso (5'-CTCTGCTGCTGGCTTCAGT-3').

La mezcla de reacción de PCR fue el siguiente: 1 ó 2 \mul de biblioteca de ADNc, 1 \mul de mezcla de dNTPs 10 mM, 0,25 \mul de 5 unidades/\mul Taq de Dna polimerasa, 5 \mul 10xtampón NH_{4}, 1,5 \mul de MgCl_{2} 50 mM, 2 \mul de cebador directo, 2 \mul de cebador inverso y 35,25 \mul de dH_{2}O. El protocolo de ciclado fue el siguiente: fusión inicial a 94ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 1 min, 57ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min 30 s, con una elongación final a 72ºC durante 10 min. El tamaño esperado para los productos PCR fue de \sim500 bp para \beta-actina, 843 bp para IL-1\beta1, y 323 bp para IL-1\beta2.

1.2 Preparación de células huéspedes

Una corriente de reserva de glicerol de la cepa XL-1 Blue MRF' de la bacteria huésped (Stratagene) se desarrolló durante toda la noche a 37ºC en placas de petri con agar LB (10 g NaCl, 10 g triptona, 5 g de extracto de levadura, 20 g agar pH 7 en 1L de dH_{2}O) suplementado con 12,5 \mug/ml de tetraciclina (Sigma). A continuación, se desarrolló una única colonia durante toda la noche en 6 ml de medio LB (10 g NaCl, 10 g detriptona, 5 g de extracto de levadura en 1 L dH_{2}O pH 7), suplementado con 10 mM MgSO_{4} y 0,2% (p/v) de maltosa a 30ºC 180 rpm. Las células se centrifugaron a 2000 rpm 4ºC durante 10 minutos y se suspendió el residuo en 6 ml de MgSO_{4} 10 mM.

1.3 Titulación de la biblioteca

Para comprobar la titulación de la biblioteca, se incubaron 0,6 ml de células preparadas como en 1.2 durante 15 minutos a 37ºC con 1 \mul de una serie de diluciones de la reserva de glicerol de la biblioteca (10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}). La mezcla se añadió a 6,5 ml de agar NZY Top fundido (5 g NaCl, 2 g MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 g de extracto de levadura, 10 g NZ amina, en 1L dH_{2}O pH 7,5 más 0,7% (p/v) agarosa), se vertió en placas de agar NZY de 150 mm (5 g NaCl, 2 g MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 g extracto de levadura, 10 g NZ amina, 15 g agar en 1L dH_{2}O pH 7,5) y se incubó a 37ºC hasta que tuvo lugar la lisis bacteriana (aproximadamente 5 horas. Se contaron las placas y se calculó la concentración de pfu (unidades formadoras de placas).

1.4 Recogidas en placas

Se incubaron 0,6 ml de células preparadas como en 1.2 con 1,5x10^{5} pfu durante 15 minutos a 37ºC y se emplacaron como en 1.3, Después de 5 horas, las placas se transfirieron a 4ºC durante toda la noche. Se colocó una membrana de nitrocelulosa sobre cada placa de agar NZY durante 2 minutos para permitir la transferencia de las partículas de fago a la membrana. Se realizaron duplicados y se colocaron durante 4 minutos sobre las placas de agar. Las membranas se marcaron con una aguja coloreada para la orientación. Las membranas se sumergieron durante 2 minutos en solución desnaturalizante (1,5M NaCl, 0,5M NaOH), se neutralizaron durante 5 minutos en solución neutralizante (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl pH 8,0), y finalmente se enjuagó durante 30 segundos en 0,2M Tris-HCl pH 7,5 y 2x tampón SSC. Las membranas se dejaron secar al aire en Whatman® 3MM y se reticularon bajo luz UV para fijar el ADN de fago en las membranas. Las placas se almacenaron a 4ºC.

1.5 Preparación de sonda IL-1\beta de trucha

Se amplificó un fragmento que contenía el extremo 3' de la región codificante de IL-1\beta de trucha mediante PCR utilizando cebadores F8 directo (5'-TCTGAGAACAAGTGC-3') e R3 inverso (5'-CTTAGTTGTGGCGCTGGATG-3'), y la biblioteca estimulada por PHA como molde. La mezcla de reacción de PCR fue la siguiente: 3 \mul de biblioteca de ADNc, 1 \mul de mezcla de dNTPs 10 mM, 0,25 \mul de 5 unidades/\mul de Taq ADN polimerasa, 5 \mul de 10 x tampón NH_{4}, 1,5 \mul de MgCl_{2} 50 mM, 2 \mul de cebador directo, 2 \mul de cebador inverso y 35,25 \mul de dH_{2}O. El protocolo de ciclado fue el siguiente: fusión inicial a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 57ºC durante 45 segundos, 72ºC durante 1 min, con una elongación final a 72ºC durante 10 min. El tamaño esperado para el producto PCR fue de 454 bp. El producto se separó en un gel de agarosa al 0,8%. El gel se tiñó con bromuro de etidio con el fin de visualizar las bandas para asegurar que tenían el peso molecular correcto. A continuación, el producto PCR se extrajo del gel de agarosa utilizando el kit de extracción de gel QIAGEN y su concentración se diluyó hasta 25 ng/ml en tampón TE. Se secuenció una muestra del ADN extraído para confirmar que la secuencia de nucléotidos era la de IL-1\beta.

La sonda IL-1\beta se marcó con ^{32}P antes de la hibridación utilizando el kit de marcaje de ADN (-dCTP)Ready To Go (Pharmacia Biotech). El tubo de la mezcla de reacción contenía un residuo celular translúcido compuesto de dATP, dGTP, dTTP, fragmento FPLCpuro®Klenow (4-8 unidades) y oligodesoxirribonucleótidos aleatorios, principalmente 9 de unidades. El contenido del tubo se reconstituyó mediante la adición de 20 \mul de agua destilada y se mantuvo en hielo durante 1 hora. Mientras tanto, se diluyeron 50 ng de sonda de ADN en 25 \mul de tampón TE y se desnaturalizaron mediante calentamiento durante 2-3 minutos a 95-100ºC. A continuación, se dejó el ADN en hielo durante 2 minutos y se centrifugó brevemente antes de añadirlo a la mezcla de reacción reconstituida. Se añadieron 5 \mul de (\alpha-^{32}P)-dCTP (300 Ci/mmol) a la mezcla y se incubaron a 37ºC durante 5-15 minutos. A continuación, la sonda estaba lista para usar.

1.6 Hibridación y cribado radioactivo

Las membranas obtenidas en 1.4 se colocaron en cilindros de vidrio y se prehibridaron en 20 ml de tampón de prehibridación (Amersham Pharmacia) durante 1 hora a 65ºC en rotación. Después de ese tiempo, se añadieron 50 \mul de la sonda de IL-1\beta marcada con ^{32}P (véase 1.5) en el cilindro y se incubaron en el horno a 55ºC durante 4 h en rotación. Para disminuir el exceso una hibridación inespecífica, se realizaron lavados astringentes con diferentes concentraciones de SSC (20xSSC: 3 M NaCl, 0,5 M citrato de Na pH 7) + SDS (Sigma) a 60ºC de la siguiente manera: 2x (2xSSC + 0,1%SDS durante 20 min), 2x (0,2xSSC + 0,1%SDS durante 20 min) y al final 0,1xSSC + 0,1%SDS durante 15 min. A continuación, la membrana se envolvió en una película limpia y se expuso a una película Kodak en un cassette. Las películas se revelaron después de 24 horas.

1.7 Selección y extracción de fagos positivos

Las películas reveladas de cada membrana se colocaron una en la parte superior de su duplicado siguiendo las marcas de orientación. Los puntos que estaban presentes en ambas películas eran positivos para la hibridación de IL-1\beta, siendo el resto falsos positivos. El área correspondiente a un fago positivo se seleccionó y extrajo de las placas de agar utilizando la parte superior de una punta estéril de 100 \mul. Cada cilindro de agar se colocó en tubos Eppendorf que contenían 500 \mul de tampón SM (para 1 litro: 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 50 ml 1M Tris-HCl pH 7,5, 5 ml 2% (p/v) gelatina, H_{2}O hasta 1 litro) + 20 \mul de cloroformo (Sigma). Los tubos se centrifugaron antes de la incubación durante toda la noche a 4ºC, para facilitar la liberación de las partículas de fago.

1.8 Cribado por PCR de fagos positivos

La mezcla de fagos extraída de áreas correspondientes a puntos positivos en el cribado radioactivo también se cribaron mediante PCR para descartar cualquier mezcla de fagos que contenían los ADNc de IL-1\beta1 o IL-1\beta2 ya conocidos. Para este objetivo, tuvo que incrementarse la titulación del fago.

Las células de la cepa XL-1 Blue MRF' (Stratagene) se desarrollaron durante toda la noche en medio LB a 37ºC a 200 rpm. El día siguiente, el cultivo de bacterias se centrífugo a 1500 rpm durante 10 minutos hasta obtener un residuo celular, el cual se resuspendió en el doble de la cantidad de medio utilizado la noche anterior. Se añadieron 150 \mul de suspensión celular a 125 \mul de la reserva de fagos en tampón SM (véase 1.7) y se incubó a 37ºC durante 15 min para permitir que los fagos se unieran a las células. La mezcla se añadió a un tubo que contenía 2,5 ml de medio LB suplementado con MgCl_{2} 1 mM y se incubó a 37ºC a 200 rpm hasta conseguir la lisis bacteriana total (aproximadamente 4-6 h). La mezcla se incubó con 25 ng de Dnasa I (Sigma) durante 30 min a 37ºC para digerir el ADN bacteriano liberado durante la lisis con el fin de disminuir la viscosidad.

A continuación, se añadieron 2,5 ml de Tris-HCl 10 mM pH 8 y se centrifugaron los lisados a 2500 rpm durante 30 min para obtener un residuo de la debris. Los sobrenadantes que contenía los fagos liberados se colocaron en tubos nuevos con una gota de cloroformo y se almacenaron a 4ºC.

Se utilizaron estos sobrenadantes como moldes en una reacción PCR para identificar y eliminarlos fagos que contenían genes de IL-1\beta. Los cebadores utilizados fueron F4 directo (5'-CGAATTCATGGATTTGAGTCA-3') y R3 inverso (5'-CTTAGTTGTGGCGCTGGATG-3'), que son capaces de amplificar los genes tanto de IL-1\beta1 como de IL-1\beta2. La mezcla de reacción PCR fue la siguiente: 5 \mul de mezcla de fagos, 1,5 \mul de mezcla de dNTPs 10 M, 0,125 \mul de 5 unidades/\mul Taq ADN Polimerasa, 2,5 \mul 10x tampón NH_{4}, 0,75 \mul MgCl_{2} 50 mM, 1,5 \mul cebador directo, 1,5 \mul cebador inverso y 12,125 \mul de dH_{2}O. El protocolo de ciclado fue el siguiente: fusión inicial a 95ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 1 min, 58ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min 30 s, con una elongación final a 72ºC durante 10 min. El tamaño esperado para ambos productos PCR fue de 784 bp.

1.9 Segunda ronda de cribado radioactivo

Los fagos que se hibridaron a la sonda de IL-1\beta pero que dieron resultados negativos en el cribado por PCR, es decir, no contenían los genes de IL-1\beta1 o de IL-1\beta2, se cribaron una segunda vez con la sonda de IL-1\beta marcada con ^{32}P para obtener clones individuales. Los fagos de reserva producidos en 1.7 se diluyeron 1:100 en dH_{2}O y se añadió 1 \mul de la dilución a 200 \mul de células preparadas como en 1.2. La mezcla se incubó a 37ºC durante 15 min, se añadieron a 1 ml de agar NZY top y se vertieron sobre placas de Petri con agar NZY. Las placas de Petri se colocaron a 37ºC hasta observar lisis y, a continuación, se transfirieron a 4ºC. Las recogidas de placa se realizaron como en 1.4 y las membranas se hibridaron con la sonda de IL-1\beta tal como se ha descrito anteriormente. La comparación de los duplicados permitieron la identificación de fagos positivos, que a continuación se extrajeron del agar como en 1.7.

1.10 Segunda ronda de cribador por PCR

Los fagos individuales obtenidos como resultado de la segunda ronda de cribado radioactivo se analizaron de nuevo mediante PCR para asegurar que ningún fago contenía los ADNcs para los genes de IL-1\beta 1 o de IL-1\beta2, tal como se ha descrito anteriormente. Se llevó a cabo una reacción de PCR adicional para confirmar la presencia del vector lambda ZAP-CMV XR en los casos en los que no se observó amplificación de IL-1\beta1/2. Los cebadores utilizados fueron T3 (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') y T7 (5'-CATTATGCTGAGTGATATCCCG-3'). La mezcla de reacción fue la siguiente: 5 \mul de mezcla de fagos, 1,5 \mul de mezcla de dNTPs 10 M, 0,125 \mul de 5 unidades/\mul Taq ADN Polimerasa, 2,5 \mul 10x tampón NH_{4}, 0,75 \mul MgCl_{2} 50 mM, 1,5 \mul cebador directo, 1,5 \mul cebador inverso y 12,125 \mul de dH_{2}O. El protocolo de ciclado fue el siguiente: fusión inicial a 94ºC durante 4 min, seguido de 10 ciclos de 94ºC durante 1 min, 62ºC durante 1 min, 68ºC durante 15 min, seguido de 22 ciclos de 94ºC durante 40 s, 62ºC durante 40 s, 68ºC durante 15 min + 20 s/ciclo, con una elongación final a 68ºC durante 10 min. Los tiempos de alargamiento extremadamente largos fueron necesarios porque el vector Lambda ZAP-CMV XR puede insertar secuencias de hasta 10Kb de largo.

De este modo, los clones negativos para IL-1\beta1/2, pero positivos para el vector, contenían un inserto en el vector que no era ADNc de IL-1\beta1/2.

1.11 Escisión

Para analizar y secuenciar el AND insertado en el vector Lambda ZAP-CMV XR, el fragmento debe escindirse del vector como un fagémido. Se utiliza el fago auxiliar ExAssist con la cepa XLOLR para escindir de manera eficaz el vector fagémico pCMVScript EX del vector Lambda ZAP-CMV XR. Sólo el fagémido escindido se replicará en el huésped, ya que el fago auxiliar ExAssist presenta una mutación que evita la replicación en células XLOLR.

Las células XL-1 Blue MRF se desarrollaron durante toda la noche como en 1.2. Se incubaron 200 \mul de MRF, 250 \mul de reserva de fago obtenida como en 1.9, y 1 \mul de Fago Auxiliar ExAssist a 37ºC durante 15 minutos para permitir que tenga lugar la infección. A continuación, la mezcla se añadió a 3 ml de caldo NZY y se incubó a 37ºC durante toda la noche para dar tiempo al fago ExAssist para que escinda in vivo el inserto del vector lambda en células MRF. El día siguiente, el fago lambda se lisó mediante tratamiento con calor del cultivo a 70ºC durante 20 minutos. El fagémido no se vio afectado por este tratamiento. A continuación, el cultivo se centrifugó durante 15 minutos a 1000 g y se recogieron los sobrenadantes que contenían los fagémidos.

Los cultivos de toda la noche de la cepa XLOLR se desarrollaron a 30ºC, 200 rpm en caldo NZY (1L: 5 g NaCl, 2 g MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 g de extracto de levadura, 10 g de amina NZ (hidrolisato de caseína), pH 7,5). Después de 24 h, las células se centrifugaron y se resuspendieron en el mismo volumen de MgSO_{4} 10 mM utilizado para el cultivo de toda la noche. A continuación, se incubaron 10 \mul de sobrenadante con 200 \mul de células XLOLR recién preparadas a 37ºC durante 15 minutos para permitir la infección. Esto se añadió a 300 \mul de caldo NZY y se mantuvo a 37ºC durante 45 minutos. Se emplacaron 200 \mul de la mezcla en placas de LB suplementadas con kanamicina (50 \mug/ml) y se dejaron durante toda la noche a 37ºC. La kanamicina permitiría la selección de clones que contienen el fagémido. Se analizaron posteriormente cuatro clones por placa mediante PCR utilizando los cebadores universales T3 y T7. La mezcla de PCR y el protocolo de ciclado fueron como en 1.10.

Estos clones se transfirieron a un medio con 5 ml de LB-kanamicina y se desarrollaron durante toda la noche a 37ºC. El fagémico de ADN se extrajo de las bacterias XLOLR utilizando un kit Miniprep (QIAGEN). El ADN se diluyó hasta 250 ng/ml y se secuenció utilizando un secuenciador automatizado ABI337 (Applied Biosystems, UK).

1.12 Análisis de secuencia

Las secuencias se analizaron por su similitud con secuencias conocidas utilizando el conjunto de programas FASTA (Pearson y Lipman, 1988) y BLAST (Altschul et al., 1990). La comparación directa entre las secuencias de ADN y la sonda de IL-1\beta se realizó utilizando el programa GAP (Needlleman y Wunsch, 1970), en el Paquete Informático de Análisis de Secuencias del Wisconsin Genetics Computer Group (GCG) (versión 9.1, 1997), y se generaron múltiples alineamientos de secuencias utilizando Clustal W (version 1.74, 1997; (Thompson et al., 1994). El análisis de la estructura de proteínas se realizó utilizando la herramienta de la red SMART (Schultz et al., 2000; Schultz et al., 1998).

1.13 Estudios de expresión de péptidos antimicrobianos

Se obtuvieron leucocitos de riñón cefálico de trucha arco iris mediante la destrucción de tejido de riñón cefálico mediante una malla de nylon de 100 \mum. Después del lavado, los leucocitos se suspendieron en medio L15 (Gibco) y se estimularon de la siguiente manera:

(A)

Evolución en el tiempo de LPS: las células se estimularon con 5 \mug/ml de liposacárido (LPS, Sigma) de E. coli 0127: B8 durante diferentes periodos de tiempo (0, 0,5 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h).

(B)

Inhibición de la transcripción/traducción: se añadió actinomicina D de Streptomyces (Sigma) a 100 ng/ml a las células después de 3 horas de inducción por LPS (5 \mug/ml) para inhibir la transcripción. Alternativamente, se añadió cicloheximida a 10 \mug/ml a las células después de 3 horas de estimulación con LPS (al igual que antes) para inhibir la traducción.

(C)

Diferentes inductores: se añadieron 5 \mug/ml de fitohemaglutinina (PHA, Sigma), 25 ng/ml de Acetato de miristato Forbol (PMA, Sigma) solo, o en combinación con 5x10^{-7} M de Ionóforo de Calcio (sigma) a las células durante 4 horas.

Al final del periodo de tiempo pertinente, se aisló el ARN total de aproximadamente 2x 10^{7} células con RNAzol B (Biogenesis) según las instrucciones del fabricante. A continuación, el ARN se transcribió de forma inversa al ADNc y el producto utilizado como molde en las PCRs para el gen de catelicidina de trucha y \beta-actina como control positivo. Los cebadores utilizados para la amplificación del gen de catelicidina fueron fF1 (5'-CATCCTGCTCGCTGTGGCT
GTCC-3') y R1 (5'-CCTCCAGAATCGGATGTCTGACC-3'), y para la \beta-actina fueron directo (5'-ATGGAAGAT
GAAATCGCC-3') e inverso (5'-TGCCAGATCTTCTCCATG-3'). La mezcla de reacción PCR fue la siguiente: 5 \mul de mezcla de fagos, 1,5 \mul de mezcla de dNTPs 10 M, 0,125 \mul de 5 unidades/\mul Taq ADN Polimerasa, 2,5 \mul 10x tampón NH_{4}, 0,75 \mul MgCl_{2} 50 mM, 1,5 \mul cebador directo, 1,5 \mul cebador inverso y 12,125 \mul de dH_{2}O. El protocolo de ciclado fue el siguiente: fusión inicial a 94ºC durante 4 min, seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 45 s, 60ºC durante 45 s, 72ºC durante 1 min, con una elongación final a 72ºC durante 10 min. El tamaño esperado de los productos fue 320 bp para el gen de catelicidina y 260 bp para \beta-actina.

Resultados

Para valorar la calidad de la bibliotecas de ADNc utilizadas, se amplificaron tres genes mediante PCR utilizando las bibliotecas como moldes. El primer gen, \beta-actina, es un gen constitutivo ("housekeeping") expresado constitutivamente en todos los tipos de células. Se utilizaron IL-1\beta 1 y IL-1\beta2 como representantes de genes inducidos durante una respuesta inmune. La presencia de los ADNcs de IL-1\beta en la biblioteca sugiere que es probable que los ADNcs estén presentes de otros genes inducidos bajo condiciones similares a IL-1\beta.

Tal como se muestra en la Figura 1, la \beta-actina estaba presente tanto en la biblioteca de leucocitos estimulados con PHA como en la biblioteca obtenida a partir de macrófagos estimulados con el patógeno de pez Aeromonas salmonicida. También se amplificaron ADNcs de IL-1\beta1 y IL-1\beta2 de ambas bibliotecas.

Se seleccionó la biblioteca de PHA para continuar con el estudio. Se determinó que su título era 1,45x10^{8} pfu/ml.

2.1 Primera Ronda de Cribado con Sonda IL-1\beta

Se analizaron un total de 6 placas (14 cm Ø). Se obtuvieron dos membranas duplicadas por placa para distinguir entre positivos y falsos positivos tras la hibridación. Una vez se revelaron las películas, la comparación de las películas duplicadas siguiendo las marcas de orientación revelaron aproximadamente 160 puntos positivos por placa. La Figura 2 muestra un ejemplo de películas duplicadas de una sola placa tras la hibridación con la sonda IL-1\beta. Las flechas muestran las marcas de orientación, mientras que algunos de los clones positivos se indican mediante círculos. Esto indica que se hibridaron aproximadamente el 1% de los fagos en la biblioteca de reserva a la sonda IL-1\beta en las condiciones establecidas para el experimento.

Debido al elevado total de fagos positivos (960), se utilizó sólo la placa número uno en los pasos siguientes. Se extrajeron de las placas las áreas de las placas de agar correspondientes a los puntos positivos en las películas y se guardaron en tampón SM y cloroformo.

2.2 Primera Ronda de Cribado por PCR

Para asegurarse de que las áreas seleccionadas no contenían IL-1\beta 1 o IL-1\beta2, se amplificó una muestra de la reserva de fago en tampón SM (ver 2.1) y se lisó para poder realizarse una PCR para los genes mencionados anteriormente. Dado que el número de positivos por placa fue muy alto sólo se analizaron 38 reservas de fagos.

Del total de 38 reservas de fago, 21 dieron resultados positivos en la PCR para IL-1\beta1/2 utilizando cebadores F4/R3 (Fig. 3) y por consiguiente se descartaron. Este valor indicó que aproximadamente el 55% de los fagos que se hibridaron a la sonda de IL-1\beta portaban los ADNcs de IL-1\beta1 o IL-1\beta2.

2.3 Segunda Ronda de Cribado con la Sonda IL-1\beta

Se realizó la segunda ronda para permitir el aislamiento de fagos individuales. Una dilución 10^{-2} de las reservas guardadas en tampón SM (ver 2.1) produjo un número razonable de placas por placa pero suficientemente separadas para evitar la contaminación cuando se extraían los fagos del agar. En la segunda ronda sólo se cribaron 10 reservas extraídas de las áreas correspondientes a los puntos positivos en las películas (ver 2.1) y negativos para PCR de IL-1\beta1/IL-1\beta2 (ver 2.2). Estas reservas fueron 6, 7, 9, 10, 12, 14, 19, 20, 22, y 24, todos de la placa número 1. La segunda ronda se realizó en placas de petri pequeñas ya que no se requería un alto número de positivos. En esta ocasión no se necesitaron duplicados ya que era fácil ver si los puntos correspondían a una placa o no ya que el número de placas por placa era bajo. Se observaron un total de 79 fagos positivos. En la figura 4 se muestran ejemplos de películas de dos placas tras la segunda ronda de cribado. Se indican los clones positivos mediante puntos.

2.4 Segunda Ronda de Cribado de PCR

Se extrajeron los fagos positivos obtenidos en 2.3 de la placa de agar y se guardaron en tampón SM y cloroformo y se analizaron sus lisados por la presencia de IL-1\beta1/IL-1\beta2 mediante PCR como en la primera ronda. Esta vez ninguna de las placas se amplificó en la PCR, indicando que el ADNc contenido en cada fago era similar a la IL-1\beta porque se hibridó a la sonda de IL-1\beta, pero que la secuencia insertada no fue el ADNc de IL-1\beta 1 o IL-1\beta2 ya que no se amplificó en la PCR con cebadores específicos para IL-1b1/2 (Fig. 5).

Para asegurarse de que los resultados negativos en la PCR para IL-1\beta1/2 no se debían a la ausencia de ADN de fago, como consecuencia de problemas durante la extracción, la amplificación o la lisis del fago, se realizó otra PCR (Fig. 6) utilizando cebadores universales T3 y T7, los cuales codifican para secuencias que flanquean el sitio de inserción en el vector lambda ZAP-CMV XR. Se amplificaron bandas para casi todas las muestras, indicando la presencia de vector de fago que tiene insertos de ADNc no correspondientes con los genes de IL-1\beta conocidos.

2.5 Escisión

Se escindió el inserto en los fagos y se clonó como un fagémido. En esta forma el fagémido es capaz de infectar y multiplicarse en células XLOLR. Sólo las células que contienen el fagémido crecen en placas de agar bajo selección de kanamicina. Se analizaron cuatro clones por placa mediante PCR utilizando los cebadores universales T3 y T7, presentes en la secuencia del fagémido, para evaluar el tamaño de la inserción presente en el fagémido (Fig. 7).

2.6 Análisis de la secuencia

Se extrajo el ADN de fagémido de las células XLOLR y se secuenció. Se compararon las secuencias de nucleótidos y sus traducciones, en los tres marcos de lectura diferentes, con otras secuencias presentes en la base de datos para identificarse. Las secuencias obtenidas se alinearon con la secuencia de la sonda de IL-1\beta y se comparó la región mejor alineada por la identidad de nucleótidos. El rango de valores obtenidos fluctuó entre 32% y 44%, con la excepción de una forma truncada del gen de IL-1\beta 1 que se encontró que tenía una identidad mayor (98%).

2.7 Péptido Antimicrobiano de Trucha (Bactenecina de Trucha)

De los 41 clones secuenciados, uno (designado clon 6-3) tenía una secuencia mostrada en la Figura 8. Una búsqueda con FASTA indicó que la secuencia pertenecía a la familia de las catelicidinas. Se cree que éste es el primer ejemplo de un miembro no mamífero de esta familia que se sabe que incluye miembros porcinos, ovinos, bovinos, caprinos, murinos y humanos.

La longitud total del clon secuenciado fue de 833 bp, teniendo un extremo 5' incompleto, habitual en genes clonados de bibliotecas, un UTR 3' que contiene un sitio de poliadenilación en la posición +793, y una larga cola poliA de 18 bp. El clon contiene un marco de lectura abierto que codifica para un prepropéptido de 214 aminoácidos. Los primeros 20 aminoácidos son característicos de un péptido señal, indicando que sólo falta una pequeña cantidad de marco de lectura abierto de este clon.

\vskip1.000000\baselineskip

Se cree que el propéptido empieza en el residuo Q_{21} y contiene dos secuencias firma de catelina (28-44, 75-97; SEC ID Nº: 6 y 8). La Figura 9 muestra alineaciones de las secuencias firma de catelina con aquellas de las siguientes catelicidinas conocidas:

Secuencia

Fuente

PR-39

PR-39 porcina

CATELINA

Catelina porcina

FALL-39

humana

PF2

Profenina 2 porcina

PG1

Protegrina 1 porcina

PMAP-23

Péptido 23 mieloide antibacteriano porcino

PMAP-36

Péptido 26 mieloide antibacteriano porcino

BAC1B

Bactenecina 1 bovina

SMAP-29 P

éptido 29 mieloide antibacteriano de oveja

BAC7S

Bactenecina 7 de oveja

BAC11S

Bactenecina 11 de oveja

BAC6S

Bactenecina 6 de oveja

BAC5B

Bactenecin 5 bovina

INDOL

Indolicidina bovina

CATH1

Catelina 1

CRAMP

Péptido antimicrobiano relacionado con catelina murina

CAP-18

humano

BAC-M

Bactenecina murina

P15A

conejo

\vskip1.000000\baselineskip

Se prevé además que el propéptido contiene dos enlaces disulfuro que unen residuos de cisteína en las posiciones 82-93 y 104-128. Éstos se ilustran esquemáticamente en la figura 10. Los enlaces disulfuro pueden imponer restricciones estructurales a la molécula. El propéptido de catelicidinas se divide normalmente mediante elastasa, C-terminal de un residuo de valina, para obtener el péptido maduro activo. La Val127 se alinearía con otros residuos de valina de otros péptidos conocidos de la misma familia, pero la división en esta posición requeriría la rotura del enlace disulfuro ente los residuos 104 y 128 para producir un péptido maduro libre. Por lo tanto, la Val148 es más probable que sea el punto de división por elastasa. Se observó que la región propéptido compartía hasta un 29% de similitud de aminoácidos con la de otros miembros de la familia de catelicidinas en mamíferos.

Por tanto, se prevé que el péptido maduro empiece en la Arg149 y tenga 66 aminoácidos de longitud. En la figura 11 se muestra una alineación del péptido maduro de catelicidina de trucha previsto con péptidos maduros de otras catelicidinas.

El péptido de trucha tiene características de más de uno de los 5 subgrupos de la familia de catelicidina. Presenta tanto un enlace disulfuro interno, característico de la familia de los dodecapéptidos, como cuatro repeticiones en tándem, de una secuencia nonámera rica en prolina y arginina (RPG-G/v-GS-X-I/p-G) característica del grupo de los péptidos Ricos en Prolina y Arginina (profeninas de cerdo y bactenecinas bovinas y de oveja). Como resultado, la catelicidina de trucha se ha clasificado con los péptidos Ricos en Prolina y Arginina, y se ha designado como bactenecina de trucha.

2.8 Secuenciación del ORF de longitud completa

El extremo 5' del ADNc se obtuvo mediante PCR 5' RACER con un kit de GeneRacer (TM) (Invitrogen Corp. Cat. No. L1500-01). El molde de ADNc derivaba del ARNm extraído de leucocitos de riñón cefálico obtenidos de trucha estimulada mediante inyección intraperitoneal con un oligonucleótido CpG bacteriano. Los cebadores directos utilizados fueron los suministrado con el kit, mientras que los cebadores inversos fueron ACAATTTTTGCCTCTG
GAGCATATTCT (para la primera PCR) y CACAAACAAATGTAGACAGGTCAGTGTT (para la siguiente PCR). La secuencia de longitud completa obtenida se muestra como la SEC ID No. 20, con la secuencia de aminoácidos prevista como SEC ID No. 21. Estas secuencias muestran polimorfismos de un solo nucleótido identificados en el ORF.

2.9 Secuenciación del ADN genómico

La secuencia genómica se obtuvo mediante PCR GenomeWalker PCR con un kit Universal GenomeWalker(TM) (CLONTECH Inc. Cat. No. K1807-1). El molde de ADN se extrajo del riñón cefálico de trucha arco iris. Los cebadores directos fueron los suministrados con el kit y los cebadores inversos fueron los mismos que los utilizados en la PCR (ver anteriormente). La secuencia obtenida se muestra como la figura 15.

Se muestra que el gen tiene 4 exones/3 intrones y tal como se predice a partir de secuencias conocidas de mamífero, el péptido funcional previsto se encuentra completamente en el exón 4. La secuencia flanqueante 5' (posible promotor) contiene una caja TATA prevista.

2.10 Estudios de expresión

Para estudiar cómo se regula la expresión del gen de bactenecina de trucha, se realizó una evolución con el tiempo. Se aislaron los leucocitos totales de riñón cefálico de trucha a partir de un único pez y se estimularon con 5 \mug/ml de LPS. Se realizó una RT-PCR utilizando cebadores específicos para el gen de bactenecina de trucha en ADNc preparado a partir de células estimuladas (párrafo 1.13), revelando una expresión máxima del gen después de 2 h de adición de LPS y un rápido descenso a partir de este punto (véase la figura 12). Esto indicó una regulación muy limitada y una rápida degradación del ARNm.

También se analizaron acetato de miristato forbol (PMA), PMA + ionóforo de calcio (PMA + CAI), y fitohemaglutinina (PHA) por su capacidad de inducir la expresión de bactenecinas de trucha en leucocitos (figura 13). Los resultados mostraron que después de 4 horas de inducción sólo PMA + ionóforo de calcio indujo la expresión. Esto fue interesante, ya que la expresión después de 4 horas no se detectó con LPS en experimentos previos.

Para estudiar esto en profundidad, se realizaron experimentos para estudiar los efectos sobre los leucocitos totales del riñón cefálico estimulados con LPS de la inhibición de la transcripción con actinomicina D (Act D) y la traducción con cicloheximida (CHX).

Los resultados se muestran en la figura 14. Las bandas se marcan de la siguiente manera: 4LPS - 4 h incubación con LPS; 7LPS - 7 h incubación con LPS. Para el tratamiento con ActD y/o CHX, se añadió lo siguiente a las células después de 3 horas de estimulación con LPS.

4Act - actinomicina durante 1 h; 7Act - actinomicina durante 4 h; 4CHX - cicloheximida durante 1 h; 7CHX - cicloheximida durante 4 h; 7ACHX - actinomicina y una hora más tarde cicloheximida durante 3 h. El gel superior representa la \beta-actina control, y el gel inferior la bactenecina de trucha.

En este caso, la expresión máxima después de la estimulación con LPS se detectó después de 7 horas. Por tanto, según los resultados de la evolución en el tiempo con LPS podría haber dos picos de expresión, uno muy temprano sólo 2 horas después de la adición de LPS no detectable en este experimento, y un segundo pico detectable después de 7 horas de estimulación con LPS.

\newpage

La adición de actinomicina D 3 h después de la estimulación con LPS inhibió completamente la expresión de la bactenecina de trucha. Esto indicó que el transcrito observado después de 7 h de estimulación con LPS se transcribió de nuevo, lo cual era esperado, ya que no se observó expresión a las 4 h con LPS. La cicloheximida, un inhibidor de la traducción, no indujo una superinducción del gen de bactenecina, sugiriendo que no había represores lábiles implicados en la regulación de la expresión de bactenecina. Cuando se inhibieron tanto la transcripción como la traducción, se observó un descenso rápido en la expresión indicando que la expresión de bactenecina depende principalmente del ARNm recién transcrito y que una vez sintetizado es fácilmente degradable. La baja expresión observada podría ser debida a una ligera estabilización del ARNm debido a una falta de síntesis de las enzimas implicadas en la degradación del ARNm.

Aunque se ha descrito la anterior invención en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con el fin de se claridad y entendimiento, será fácilmente evidente para los expertos en la materia a la luz de las enseñanzas de la presente invención que se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones a la misma dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Referencias

Zanetti, M., Gennaro, R., and Romeo, D. (1995). Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain. FEBS letters, 374: 1-5.

Frank, R. W., Gennaro, R., Schneider, K., Przybylski, M., and Romeo, D. (1990). Amino acid sequences of two proline-rich bactenecins. The Journal of Biological Chemistry, 265 (31): 18871-18874.

Harwig, S. S. L., Kokryakov, V. N., Swiderek, K. M., Aleshina, G. M., Zhao, C., and Lehrer, I. R. (1995). Prophenin-1, an exceptionally proline-rich antimicrobial peptide from porcine leukocytes. FEBS Letters, 362: 65-69.

Gennaro, R., Skerlavaj, B., and Romeo, D. (1989) Purification, composition and activity of two bactenecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils. Infect Immun, 57: 3142-3146.

Genarro, R, Scocchi, M., Merluzzi, L., and Zanetti, M. (1998) Biological characterization of a novel mammalian antimicrobial peptide. Biochimica et Biophysica Acta, 1425: 361-368.

Davidson, J., Smith, T., and Martin, S. A. M. (1999). Cloning and sequence analysis of rainbow trout LMP2 cDNA and differential expression of the mRNA. Fish & Shellfish Immunology, 9: 621-632.

Hardie, L. J., Laing, K., J, Daniels, G., D, Grabowski, P. S., Cunningham, C., and Secombes, C. J. (1998). Isolation of the first piscine transforming growth factor beta gene. Analysis reveals tissue specific expression and a potential regulatory sequence in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cytokine, 10: 555-563.

Pearson, W. R., and Lipman, D. I. (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sci USA, 85: 2444-2448.

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E., and Lipman, D. J. (1990). Best local alignment search tool. J Mol Biol, 215: 403-410.

Needlleman, S. B., and Wunsch, C. D. (1970). A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol, 48: 443-453.

Thompson, S. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J. (1994). Clustal W: improving the sensibility of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res, 22: 4673-4680.

Schultz, J., Copley, R. R., Doerks, T., Ponting, C. P., and Bork, P. (2000). SMART, a web-based tool for the study of genetically mobile domains. Nucleic Acids Res., 28 (1): 231-234.

Schultz, J., Milpetz, F., Bork, P., and Ponting, C. P. (1998). SMART, a simple modular architecture research tool: identification of signaling domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (11): 5857-5864.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 0022781 W [0023]

\bullet US 4655766 A [0105]

\bullet US 6172185 B [0023]

\bullet US 4655766 A [0105]

\bullet EP 665239 A [0023]

\bullet US 5032109 A [0106]

\bullet EP 0120694 A [0039]

\bullet US 5S14Í02 A [0106]

\bullet EP 0125023 A [0089]

\bullet US 5314502 A [0106]

\bullet EP 0125023 A [0089]

\bullet US 5362497 A [0107]

\bullet US 9209965 W [0089]

\bullet US 5361497 A [0107]

\bullet WO 9413804 A [0089] [0090]

\bullet GB 0201744 A [0163]

\bullet WO 9201047 A [0091 ]

\bullet GB 0201744 A [0163]

\vskip1.000000\baselineskip

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bulletChen et al. Biopolymers, 2000, vol. 55, 88-98 [0009]

\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0047]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1992 [0047]

\bulletDonnelly, J.J.; Ulmer, J.B.; Shiver, J.W.; Liu, M.A. DNA vaccines. Ann. Rev. Immunol., 1997, vol. 15, 617-648 [0087]

\bulletArmitage et al. Nature, 1992, vol. 357, 80-82 [0088]

\bulletWard, E.S. et al. Nature, 1989, vol. 341, 544-546 [0089]

\bulletBird et al. Science, 1988, vol. 242, 423-426 [0089]

\bulletHuston et al. PNAS, 1988, vol. 85, 5879-5883 [0089]

\bullet P Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 6444-6448 [0089]

\bulletGennaro, R; Zanetti, M. Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides. Biopolymers, 2000, vol. 55, 31-49 [0094] [0097]

\bulletLarrick, J.W. et al. J. Immunol., vol. 152, 231-240 [0096]

\bulletNiyonsaba, F. et al. Eur. J. Immunol., 2001, vol. 31, 1066-1075 [0096]

\bulletLillard Jr, J. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, vol. 96, 651-656 [0096]

\bulletGallo, R.L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, vol. 91, 11035-11039 [0097]

\bulletZhang, G.L.; Ross, C.R.; Blecha, F. Vet. Res., 2000, vol. 31, 277-296 [0097]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0104]

\bulletZanetti, M.; Gennaro, R.; Romeo, D. Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain. FEBS letters, 1995, vol. 374, 1-5 [0162]

\bulletFrank, R. W.; Gennaro, R.; Schneider, K.; Przybylski, M.; Romeo, D. Amino acid sequences of two proline-rich bactenecins. The Journal of Biological Chemistry, 1990, vol. 265 (31), 18871-18874 [0162]

\bulletHarwig, S. S. L.; Kokryakov, V. N.; Swiderek, K. M.; Aleshina, G. M.; Zhao, C.; Lehrer, I. R. Prophenin-1, an exceptionally proline-rich antimicrobial peptide from porcine leukocytes. FEBS Letters, 1995, vol. 362, 65-69 [0162]

\bulletGennaro, R.; Skerlavaj, B.; Romeo, D. Purification, composition and activity of two bactenecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils. Infect Immun, 1989, vol. 57, 3142-3146 [0162]

\bulletGenarro, R; Scocchi, M.; Merluzzi, L.; Zanetti, M. Biological characterization of a novel mammalian antimicrobial peptide. Biochimica et Biophysica Acta, 1998, vol. 1425, 361-368 [0162]

\bulletDavidson, J.; Smith, T.; Martin, S. A. M. Cloning and sequence analysis of rainbow trout LMP2 cDNA and differential expression of the mRNA. Fish & Shellfish Immunology, 1999, vol. 9, 621-632 [0162]

\bulletHardie, L. J.; Laing, K., J; Daniels, G., D; Grabowski, P. S.; Cunningham, C.; Secombes, C. J. Isolation of the first piscine transforming growth factor beta gene. Analysis reveals tissue specific expresión and a potential regulatory sequence in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cytokine, 1998, vol. 10, 555-563

\bulletPearson, W. R.; Lipman, D. I. Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, vol. 85, 2444-2448 [0162]

\bulletAltschul, S. F.; Gish, W.; Miller, W.; Myers, E.; Lipman, D. J. Best local alignment search tool. J Mol Biol, 1990, vol. 215, 403-410 [0162]

\bulletNeedlleman, S. B.; Wunsch, C. D. A general meted applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol, 1970, vol. 48, 443-453 [0162]

\bulletThompson, S. D.; Higgins, D. G.; Gibson, T. J. Clustal W: improving the sensibility of progressive multiple sequence alignment through séquense weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res, 1994, vol. 22, 4673-4680 [0162]

\bulletSchultz, J.; Copley, R. R.; Doerks, T.; Ponting, C. P.; Bork, P. SMART, a web-based tool for the study of genetically mobile domains. Nucleic Acids Res., 2000, vol. 28 (1), 231-234 [0162]

\bulletSchultz, J.; Milpetz, F.; Bork, P.; Ponting, C. P. SMART, a simple modular architecture research tool: identification of signaling domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95 (11), 5857-5864 [0162]

<110> The University Court of the University of Aberdeen

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Péptidos, ácidos nucleicos y usos de los mismos

\vskip0.400000\baselineskip

<130> GRF/BP6117865

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 0214660.3

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-06-25

\vskip0.400000\baselineskip

<150> GB 0201744.0

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2002-01-25

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 833

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgaagaca tcatcttagt tgctttgcct cagctgcttc ctggggaaga g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcctgggg ttggctccat aattggt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcctgggg gtggctcctt aattggt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcctgggg gtggctccgt aattggt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210>17

\vskip0.400000\baselineskip

<211>27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcctgggg gtggctctcc tcctggg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211>9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210>19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly o Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8).. (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Ile o Pro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 856

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (103)..(103)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu o Arg

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (156)..(156)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 451

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35).. (35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (103)..(103)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatgaagaca tcatctcagt tgctttgcct cagctgcttc ctggggaaga g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1813

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oncorhynchus mykiss

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu o Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (103)..(103)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Leu o Arg

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (156)..(156)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Gly o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

27

Claims (33)

1. Polipéptido aislado que tiene actividad antimicrobiana, que comprende la secuencia de aminoácidos RPG-G/V-GS-X-I/P-G (SEC ID NO: 19).

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende de dos a cuatro repeticiones de la secuencia de aminoácidos RPG-G/V-GS-X-I/PG (SEC ID NO: 19).

3. Polipéptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que una o más de dichas repeticiones tiene la secuencia de aminoácidos de las SEC ID NOs: 12, 14, 16 ó 18.

4. Polipéptido según la reivindicación 3, que comprende cada una de las SEC ID NOs: 12, 14, 16 y 18.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una pareja de residuos de cisteína capaces de formar un puente disulfuro interno.

6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que tiene actividad antifúngica o antibacteriana.

7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se indica en la SEC ID NO: 10 ó 27, o una secuencia que tiene más de un 40% de identidad, preferiblemente más de un 50% de identidad con la misma.

8. Polipéptido que comprende una parte que tiene actividad antimicrobiana tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y una parte de propéptido divisible de la parte que tiene actividad antimicrobiana mediante una proteasa.

9. Polipéptido según la reivindicación 8, en el que la parte de propéptido comprende por lo menos una secuencia firma de catelina.

10. Polipéptido según la reivindicación 9, en el que la secuencia firma de catelina comprende la SEC ID NO: 6, 8 ó 25.

11. Polipéptido según la reivindicación 10, en el que la parte de propéptido comprende dos de las SEC ID NOs: 6, 8 y 25.

12. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la parte de propéptido comprende por lo menos una pareja de residuos de cisteína capaces de formar un puente disulfuro interno.

13. Polipéptido según la reivindicación 12, en el que la parte de propéptido comprende por lo menos dos parejas de residuos de cisteína capaces de formar un puente disulfuro interno.

14. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que la proteasa es elastasa.

15. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que la parte de propéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en las SEC ID NO: 4 ó 23, o una secuencia que tiene más de un 30%, preferiblemente más de un 40% de identidad con la misma.

16. Polipéptido según la reivindicación 15, que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en las SEC ID NO: 2 ó 21, o una secuencia que tiene más de un 40% de identidad, preferiblemente más de un 50% de identidad con la misma.

17. Anticuerpo específico para el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

19. Ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos indicada en las SEC ID No. 9 ó 26, o una secuencia tiene más de un 40% de identidad con la misma.

20. Ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos indicada en las SEC ID NO: 3 ó 22, o una secuencia de ácidos nucleicos indicada en las SEC ID No. 9 ó 26 o una secuencia que tiene más de un 40% de identidad con la misma.

21. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que comprende además una secuencia que codifica un péptido señal funcional.

22. Vector de expresión que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21.

23. Célula huésped que comprende un vector de expresión según la reivindicación 22.

24. Método para aislar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de catelicidina o una parte del mismo, empleando dicho método un cebador o sonda de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos indicada en las SEC ID NO: 11, 13, 15 ó 17, o que codifica la secuencia de aminoácidos RPG-G/V-GS-X-I/P-G (SEC ID NO: 19), o el complemento de las mismas, o una secuencia equivalente por degeneración a las mismas.

25. Método para aislar un ácido nucleico que codifica un polipéptido de catelicidina o una parte del mismo, empleando dicho método un cebador o sonda de ácido nucleico que comprende las secuencias de SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 22, 24 ó 26, ó el complemento de las mismas, o una secuencia equivalente por degeneración a las mismas.

26. Método según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, que comprende las etapas de:

(a)

proporcionar una preparación de ácido nucleico de un organismo diana;

(b)

proporcionar dicho cebador o sonda de ácido nucleico; y

(c)

poner en contacto dicha preparación de ácido nucleico con dicho cebador o sonda.

27. Método según la reivindicación 26, que comprende además la etapa de:

(d)

identificar el ácido nucleico en dicha preparación que se hibrida con dicho cebador o sonda.

28. según la reivindicación 24 o la reivindicación 25, que comprende las etapas de:

(a)

proporcionar una preparación de ácido nucleico de un organismo diana;

(b)

proporcionar una pareja de cebadores de ácido nucleico, siendo por lo menos uno de dichos cebadores un cebador o sonda de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 24 o la reivindicación 25;

(c)

poner en contacto dicha preparación de ácidos nucleicos con dichos cebadores en condiciones para realizar una PCR, y

(d)

realizar la PCR y determinar la presencia o ausencia de ácido nucleico amplificado.

29. Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que el organismo diana es un pez.

30. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, para su uso en un método de tratamiento médico.

31. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, para su uso en un método de tratamiento de una patología causada por un microbio, un método de tratamiento de la inflamación, o un método de estimulación de la curación de heridas.

32. Uso del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una patología causada por un microbio, para el tratamiento de la inflamación, o para estimular la curación de heridas

33. Uso según la reivindicación 32, en el que el medicamento se formula para la adición a agua que contiene peces.