ES2337917T3 - Metodo para tratar trastornos musculares. - Google Patents
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Abstract
Uso, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno muscular, de un derivado de polipéptido de factor de crecimiento I tipo insulina (IGF-1) que comprende la secuencia de: (a) el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys, (b) el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys, (c) el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys o (d) un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN específico de músculo inducido específicamente por estiramiento; y que incluye además un truncamiento N-terminal de la secuencia de aminoácidos madura.
Description
Método para tratar trastornos musculares.
La presente invención se refiere a mejoras en el
tratamiento de trastornos musculares y afecciones relacionadas
usando el factor de crecimiento I tipo insulina.
El factor de crecimiento I tipo insulina
(IGF-1) es un péptido presente en el plasma y otros
fluidos corporales. En su forma procesada madura comprende 70
aminoácidos y puede estimular el crecimiento de un amplio intervalo
de tipos celulares. Se ha clonado IGF-1 humano y su
secuencia de ADN puede encontrarse en Jansen et al, Nature,
1993 (referencia 11 a continuación). La secuencia de ADNc codifica
un precursor (también conocido como cadena D), un péptido maduro de
70 aminoácidos que comprende las regiones D, C y A respectivamente,
y una región C-terminal que se llama el péptido E.
Recientemente, se ha descubierto que el péptido E puede existir en
diferentes isoformas. Esto surge como resultado del corte y empalme
alternativo a nivel ARNm. Chew et al informan de la
existencia de tres regiones C-terminales cortadas y
empalmadas alternativamente de IGF-1 humano. Una de
las isoformas producidas es como resultado del corte y empalme entre
los exones 4, 5 y 6 del gen y esto predice una molécula
prepro-IGF-1 de 158 aminoácidos que
incluye un péptido C-terminal, el péptido Ec de 24
aminoácidos de longitud. Este péptido Ec parece corresponderse con
el péptido Eb encontrado en IGF-1 de rata.
Se ha propuesto IGF-1 para su
uso en varios trastornos relacionados con atrofia muscular y
afecciones relacionadas. Por ejemplo el documento WO92/11865
propone el uso de IGF-1 humano para la prevención o
tratamiento de trastornos cardiacos y para promover la síntesis de
proteínas del músculo cardiaco, para la prevención o tratamiento de
cardiomiopatías, insuficiencia cardiaca aguda o lesión aguda
incluyendo miocarditis o infarto de miocardio y para mejorar el
rendimiento cardiaco aumentando el volumen del impulso del corazón.
El documento WO95/13290 se refiere al uso de IGF-1
para tratar trastornos musculares tales como distrofia muscular y
fragilidad y debilitamiento progresivos del músculo esquelético
relacionados.
El documento WO93/09236 describe métodos de
terapia génica usando sistemas del vector miogénico que comprende
promotores adecuados para su uso en células musculares. Dichos
vectores pueden introducirse en un paciente humano para el
tratamiento de la atrofia muscular en seres humanos ancianos,
atrofia muscular inducida por lesiones en la médula espinal o
enfermedades neuromusculares.
Una dificultad con el uso de
IGF-1 es que este péptido es responsable de un
amplio intervalo de efectos en el cuerpo humano. Aunque
IGF-1 se produce en células musculares, también se
produce en el hígado a partir de donde circula y está implicado en
la regulación del metabolismo. La administración de
IGF-1 puede, por tanto, inducir efectos secundarios
incluyendo hipoglucemia.
De Vol et al (1990), Am. J. Physiol. 259,
E89-E95) informan de que la expresión de
IGF-1 es elevada durante el crecimiento del músculo
esquelético inducido por el trabajo. Se ha investigado la producción
de IGF-1 en músculos esqueléticos y se ha
descubierto sorprendentemente que mientras que los músculos en
reposo normalmente producen la isoforma IGF-1 de
hígado incluyendo el péptido Ea, las células musculares inducidas a
experimentar una hipertrofia rápida usando un estiramiento activo,
rápidamente regulan positivamente la producción de una isoforma de
IGF-1 diferente. Por tanto, se ha descubierto que la
isoforma Ec de IGF-1 en seres humanos, que
corresponde a la isoforma Ed de IGF-1 en ratas y
conejos, puede jugar un papel importante en la dirección de la
acción de IGF-1 a células musculares. Por tanto, el
tratamiento de trastornos musculares tales como los mencionados
anteriormente puede mejorarse por el uso de la isoforma Ec humana o
el péptido Ec de IGF-1 humano.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona:
El uso, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento de un trastorno muscular, de un derivado de
polipéptido del factor de crecimiento I tipo insulina
(IGF-1) que comprende la secuencia de:
- (a)
- el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
- (b)
- el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys,
- (c)
- el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys o
- (d)
- un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN específico de músculo inducido específicamente por estiramiento; y que incluye además un truncamiento N-terminal de la secuencia de aminoácidos madura.
\newpage
La invención también proporciona un derivado de
polipéptido del factor de crecimiento I tipo insulina
(IGF-1) cuya secuencia comprende la de:
- (a)
- el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
- (b)
- el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys,
- (c)
- el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys o
- (d)
- un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN específico de músculo inducido específicamente por estiramiento;
y que incluye además un truncamiento
N-terminal de la secuencia de aminoácidos
madura;
para el uso en un método de tratamiento o
terapia del cuerpo humano o animal.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona una composición
farmacéutica que comprende un derivado de polipéptido del factor de
crecimiento I tipo insulina (IGF-1) que comprende la
secuencia de:
- (a)
- el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
- (b)
- el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys,
- (c)
- el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Glu-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys,
- (d)
- un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN específico de músculo inducido específicamente por estiramiento;
y que incluye además un truncamiento
N-terminal de la secuencia de aminoácidos
madura;
junto con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona un derivado de
polipéptido del factor de crecimiento I tipo insulina
(IGF-1) cuya secuencia comprende la de:
- (a)
- el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
- (b)
- el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys,
- (c)
- el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys o
- (d)
- un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN específico de músculo inducido específicamente por estiramiento;
y que incluye además un truncamiento
N-terminal de la secuencia de aminoácidos
madura;
para el uso en el tratamiento de un trastorno
muscular.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención, por tanto, se refiere al
tratamiento de trastornos relacionados con atrofia muscular y
afecciones relacionadas. Esto incluye el uso de
IGF-1 humano para la prevención de trastornos
cardiacos, enfermedades en las que promover la síntesis de
proteínas del músculo cardiaco es un tratamiento beneficioso,
cardiomiopatías, insuficiencia cardiaca aguda o lesión aguda
incluyendo miocarditis o infarto de miocardio. La isoforma de IGF
también puede usarse para mejorar el rendimiento cardiaco aumentando
el volumen del impulso del corazón.
Otros trastornos musculares que pueden tratarse
incluyen distrofia muscular, por ejemplo, distrofia muscular de
Duchenne o Becker, así como distrofias autosómicas, y fragilidad y
debilitamiento progresivos del músculo esquelético relacionados. El
tratamiento de la atrofia muscular en seres humanos ancianos, la
atrofia muscular inducida por lesiones de la médula espinal o
trastornos neuromusculares también pueden tratarse por la presente
invención. La terapia con el IGF-1 apropiado también
puede promover la curación de fracturas óseas y el mantenimiento del
hueso en ancianos.
Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente
aceptables incluyen los usados en formulaciones adecuadas para
administración oral o parenteral (por ejemplo, intramuscular o
intravenosa). Las formulaciones pueden presentarse de forma
conveniente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse
por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la
farmacia. Dichos métodos incluyen la etapa de asociar el ingrediente
activo con el vehículo que constituye uno o más ingredientes
auxiliares. En general, las formulaciones se preparan asociando
uniforme e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos
o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es
necesario, dando forma al producto.
Por ejemplo, las formulaciones adecuadas para
administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles
acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones,
bacteriostáticos y solutos que vuelven la formulación isotónica con
la sangre del receptor pretendido; y suspensiones estériles acuosas
y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes
espesantes, y liposomas u otros sistemas microparticulados que
están diseñados para dirigir el polipéptido a componentes sanguíneos
o uno o más órganos.
El polipéptido de la invención puede
administrarse por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía oral
o inyección, por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular o
intravenosa, o como alternativa, pueden producirse in situ
en un paciente como resultado de tratamiento por terapia génica, por
ejemplo, como se describe en el documento WO93/09236.
El documento WO95/13290 describe intervalos de
dosis de IGF-1 humano recombinante (el polipéptido
maduro de 70 aminoácidos) en el intervalo de 0,06 a 0,12 mg/kg por
dosis y también pueden administrarse polipéptidos de
IGF-1 que comprenden el péptido Ec en este intervalo
de dosis. Las dosis pueden administrarse a intervalos diarios o
menos frecuentemente, por ejemplo, dos veces a la semana o
intervalos semanales.
La región Eb de IGF-1 de conejo
se expone en la Figura 3 del Ejemplo adjunto.
La región Ec humana se expone en la Figura 4. La
Figura 5 muestra la secuencia de ADNc humana completa que codifica
la isoforma Ea humana.
Aunque sin el deseo de limitarse por ninguna
teoría particular, se cree que la isoforma Ec humana puede ser
responsable de su actividad mediante la acción en un receptor
diferente del receptor de IGF-1 normal. La presencia
de la región Ec se cree que es responsable de unirse a este
receptor.
El siguiente Ejemplo ilustra la invención. El
factor de crecimiento 1 tipo insulina (IGF-1) es un
polipéptido de 70 restos con funciones importantes en la regulación
del crecimiento, desarrollo y diferenciación somáticos. El hígado
es una diana principal para la hormona de crecimiento de la
pituitaria (GH) que se estimula para sintetizar
IGF-1. El aumento resultante en el nivel en
circulación de IGF-1 promueve la división celular y
es un factor principal en la regulación del crecimiento del cuerpo
como conjunto. En varios tejidos hay también un sistema
aparentemente local de regulación del crecimiento, por ejemplo, del
músculo esquelético, que es capaz de experimentar una hipertrofia
rápida para adaptar la sobrecarga. Fue importante, por lo tanto,
investigar el papel de IGF-1 en la respuesta de
crecimiento regulada localmente.
Ahora está disponible información sobre la
organización del gen de IGF-1 para varias especies,
entre las cuales los genes humanos y de rata son los más
ampliamente estudiados [1-5]. La estructura del gen
de IGF-1 está bien conservada entre los mamíferos y
contiene varias características notables, incluyendo un tamaño
inesperadamente grande y la presencia de exones cortados y
empalmados alternativamente. En seres humanos, el gen de
IGF-1 comprende al menos seis exones (denominados
exón 1, 2, 3, 4, 5 y 6) que abarcan una región de unas 90 kilobases
(kb) de ADN genómico. Los exones 1 y 2 son exones líder alternativos
[4, 5] con sitios de inicio de la transcripción distintos que se
cortan y empalman de manera diferencial al exón 3 común y producen
los transcritos de ARNm de IGF-1 de clase 1 y clase
2 respectivamente [6-8]. Los exones 3 y 4 codifican
el péptido maduro IGF-1 (dominios B, C, A y D) así
como los primeros 16 aminoácidos del dominio E. Los exones 5 y 6
codifican cada uno una parte alternativa de un péptido de extensión
distinto, llamado el dominio E. Esto viene seguido por los codones
de terminación del precursor IGF-1, las regiones no
traducidas 3' y sitios señal de adición de poli(A) [2]. Los
análisis de secuencia del péptido IGF-1 purificado
de plasma humano demostraron que IGF-1 maduro
contiene los dominios A, B, C y D. Los dominios A y B son homólogos
a las cadenas A y B de la insulina [9].
El análisis de las secuencia de ADNc de
IGF-1 de hígado también demostró la presencia de un
dominio péptido E que era una prolongación del dominio péptido D
[10-12]. Un último estudio que usa anticuerpos
dirigidos contra el péptido E de IGF-1 humano
confirmó que la secuencia de ARNm que codifica el péptido E se
traduce de forma activa y sugirió que el péptido E circula como
parte de la prohormona IGF-1 [13]. En
IGF-1 de hígado de rata los ARNm codifican una
secuencia del péptido E de 35 aminoácidos (IGF-1Ea).
Sin embargo, se ha detectado una isoforma (IGF-1Eb)
con un dominio Eb de 41 aminoácidos diferente a niveles muy bajos
[14]. Estos dos ARNm codifican un péptido E alternativo debido a la
presencia (IGF-1Eb) o ausencia
(IGF-1Ea) de un inserto de 52 bases en la región
que codifica el dominio E [10, 14]. En seres humanos, también hay
ADNc de IGF-1 que codifican tres diferentes
dominios Ea, Eb y Ec. Los ADNc de tipo Ea y Eb contienen secuencias
3' completamente diferentes que especifican secuencias 3' no
traducidas diferentes así como diferentes secuencias codificantes
del dominio E [2]. Esto se debe al corte y empalme en los exones 3'
[2]. El Ec es un ADNc con los exones
4-5-6 cortados y empalmados que
predice un precursor IGF-1 de 158 restos de
aminoácidos y es el equivalente humano del Eb de rata [15]. El
papel fisiológico del péptido E alternativo generado a partir de
IGF-1Ea, IGF-1Eb e
IGF-1Ec aún no se conoce.
El músculo esquelético ha demostrado aumentar en
masa muy rápidamente en respuesta a un estiramiento pasivo. El
tibialis anterior de conejo maduro es capaz de aumentar en masa en
un 35% en 4 días de este modo [16]. A partir de un trabajo previo
[17, 18] se sabe que esto está asociado con la producción rápida de
nuevos sarcómeros que se añaden en serie en los extremos de la
fibra a miofibrillas existentes. El estiramiento muscular ha
demostrado provocar un aumento de ARNm de IGF-1
medido por RT-PCR [19]. Sin embargo, no se sabe si
el gen de IGF-1 se expresa por las fibras
musculares en sí mismas o por células satélite o qué isoformas de
IGF-1 están implicadas. La regulación del
crecimiento muscular in vivo sigue sin estar bien entendida,
aunque las observaciones originales sobre la hipertrofia muscular
compensatoria sugirieron que un componente de la regulación del
crecimiento muscular es un proceso localizado, autocontenido, y
autolimitante.
Frente a estos antecedentes, se diseñó el
estudio actual para determinar si la inducción local de crecimiento
muscular in vivo puede implicar la expresión alternativa del
gen de IGF-1 con diferente corte y empalme del ARNm
para IGF-1 y la expresión localizada del tipo de
fibra.
1. Animales y Procedimiento de Estiramiento
Muscular: Se usaron conejos blancos de Nueva Zelanda. Se sometió
el músculo digitorum longus extensor (EDL) a estiramiento agudo
inmovilizando la pata trasera izquierda en posición extendida
usando una escayola. Como informó previamente, esto provoca un
aumento del 35% en la masa muscular en unos pocos días [16].
Después de 6 días, se indujo eutanasia por inyección intravenosa de
una sobredosis de pentobarbitona sódica en la vena marginal de la
oreja. Se diseccionó inmediatamente el EDL de ambas patas traseras.
La pata trasera derecha sirvió como control. Cada músculo se cortó
transversalmente en 2 partes, una parte se fijó en paraformaldehído
de fijación al 4% recién preparado a 4ºC durante 2 horas y después
se procesó y se embebió en cera parafina. La segunda parte se envasó
en un tubo de 1,5 ml y se congeló directamente en nitrógeno líquido
y se almacenó a -70ºC en espera del aislamiento del ARN total.
2. Aislamiento del ARN: Se aisló el ARN
celular total del músculo estirado y del normal usando el método de
una etapa con extracción ácida con tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo
[20].
3. Síntesis de sondas para transferencia de
Northern e hibridación in situ : El oligonucleótido 5'
TTGGGCATGT
CAGTGTGG 3' que es complementario a la secuencia del exón 4 del gen de IGF-1 se usa como cebador para sintetizar ADNc del ARNm de IGF-1 por transcriptasa inversa (RAV-2, Amersham). Después se amplificó el ADNc por PCR usando dos cebadores oligonucleotídicos (5' GCTTGCTCACCTTTACCAGC 3' y 5' TTGGGCATGTCAGTGTGG 3'). Se subclonó un producto de PCR de 280 pares de bases que cubre el exón 3 y parte del exón 4 del gen de IGF-1 en el vector fagómido pBS+ (Stratagene) que incluye los promotores T3 y T7. Se sintetizaron sondas de ARN con sentido y antisentido marcadas por transcripción in vitro con ARN polimerasa usando digoxigenina en uridina-trifosfato marcada como sustrato (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas sondas se usaron tanto para la transferencia de Northern como para la hibridación in situ.
CAGTGTGG 3' que es complementario a la secuencia del exón 4 del gen de IGF-1 se usa como cebador para sintetizar ADNc del ARNm de IGF-1 por transcriptasa inversa (RAV-2, Amersham). Después se amplificó el ADNc por PCR usando dos cebadores oligonucleotídicos (5' GCTTGCTCACCTTTACCAGC 3' y 5' TTGGGCATGTCAGTGTGG 3'). Se subclonó un producto de PCR de 280 pares de bases que cubre el exón 3 y parte del exón 4 del gen de IGF-1 en el vector fagómido pBS+ (Stratagene) que incluye los promotores T3 y T7. Se sintetizaron sondas de ARN con sentido y antisentido marcadas por transcripción in vitro con ARN polimerasa usando digoxigenina en uridina-trifosfato marcada como sustrato (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas sondas se usaron tanto para la transferencia de Northern como para la hibridación in situ.
4. Transferencia de Northern: Las
muestras que contenían la misma cantidad (20 \mug) de ARN total se
sometieron a transferencia de Northern. Se usó la sonda antisentido
de 280 pb descrita anteriormente. Se realizaron una prehibridación
(1 hora) y una hibridación (15 horas) a 6ºC en tampón de hibridación
[formamida al 50%; 5xSSC; reactivo de bloqueo al 2%;
N-lauroilsarcosina al 0,1%; SDS al 0,02%]. Se
realizó un lavado a alta rigurosidad 2x5 minutos a temperatura
ambiente con 1xSSC y SDS al 0,1%, 2x15 minutos a 68ºC con 0,1xSSC y
SDS al 0,1%. La sonda hibridada se detectó por quimioluminiscencia
de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Boehringer
Mannheim). El filtro de transferencia se expuso a una película de
rayos X durante 6 horas.
5. Hibridación in situ : Se
cortaron los tejidos musculares en secciones de 10 \mum. Se
tomaron secciones tanto transversas como longitudinales y se
montaron en portaobjetos esterilizados en autoclave recubiertos con
3-aminopropiltrietoxi-silano al 2%
(Sigma). Se eliminó la cera de las secciones por lavado en xileno 3
veces durante 2 minutos cada vez y se rehidrató en una serie de
soluciones de metanol. Después se desnaturalizaron las secciones
incubando en HCl 0,2 N a temperatura ambiente durante 20 minutos, se
calentaron en 2xSSC a 70ºC durante 20 minutos y se digirieron con
pronasa (10 \mug/ml, Boehringer Mannheim) en Tris.HCl 50 mM
durante 15 minutos y finalmente se colocaron en tampón
trietanolamina (TEA) 0,1 M, al que se añadió anhídrido acético a
una concentración final del 0,5% y se incubaron durante 10 minutos
para bloquear los grupos polares y cargados en las secciones. La
hibridación se realizó en tampón de hibridación [formamida
desionizada al 50%; 5 x SSC; solución de Denhardt 5 x; 250
\mug/ml de ARNt de levaduras; 250 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón desnaturalizado; ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 4 mM
que contenía la sonda de ARN antisentido o con sentido marcada con
DIG que constaba de la secuencia de 280 pb derivada de los exones 3
y parte del exón 4 del gen de IGF-1. La
concentración final de la sonda fue 1000 ng/ml. La hibridación se
realizó a 68ºC durante 1 hora y después se dejó enfriar hasta 42ºC
momento en el que se mantuvo durante una noche en una cámara húmeda.
Después de la hibridación, se incubaron las secciones con ARNasa A
(100 \mug/ml, Sigma) para retirar la sonda de ARN monocatenaria
no unida. El lavado se realizó a alta rigurosidad, 25 minutos en 2 x
SSC a temperatura ambiente, 15 minutos en 1 x SSC a temperatura
ambiente, 30 minutos en 0,5 x SSC a 42ºC y 30 minutos en 0,5 x SSC a
temperatura ambiente. La sonda hibridada se detectó por el
conjugado anticuerpo
anti-digoxigenina-AP, fragmentos Fab
(1,5 U/ml, Boehringer Mannheim), de acuerdo con las instrucciones
del fabricante.
6. Síntesis y clonación molecular del ADNc de
IGF-1 muscular: Se sintetizó la primera cadena
de ADNc por transcriptasa inversa (RAV-2,
Amersham.) a partir del ARN total muscular con cebadores oligo dT y
después se amplificó por la amplificación rápida 3' de los extremos
de ADNc por reacción en cadena de la polimerasa (3' RACEPCR) con un
cebador específico del gen de IGF-1 (5'
GCTTGCTCACCTTTACCAGC 3') que es parte de la secuencia del extremo
5' del exón 3 de IGF-1. Los productos de PCR se
clonaron en el vector pCR^{TM} (Invitrogen) para la secuenciación
del ADN. Después se secuenciaron los fragmentos por el método de
terminación de cadena con didesoxi [2]. Se obtuvo un total del 98%
de la secuencia de ADN de ambas cadenas.
Transferencia de Northern. Los resultados
del análisis de transferencia de Northern realizado con ARN extraído
del digitorum longus extensor (EDL) normal y estirado se
representan en la Figura 1. La sonda antisentido de
IGF-1 de 280 pb que contiene secuencias derivadas
del exón 3, y 4 del gen de IGF-1 hibridó con las dos
muestras de ARNm de IGF-1 destacadas, de 1,2 kb y
7,5 kb de longitud. La expresión de ambos tipos de muestras de ARNm
fue superior en el músculo estirado, aunque en algunos músculos, el
músculo de control expresó más ARNm de 7,5 kb que el músculo
alargado.
Localización del ARNm de
IGF-1 en músculo normal y estirado: La expresión
del ARNm de IGF-1 en músculo normal y estirado
estudiada por hibridación in situ usando una sonda de ARN
antisentido y con sentido se muestra en la Figura 2. Los datos de
hibridación in situ demuestran que el ARNm de
IGF-1 se produce en respuesta al estiramiento a
nivel de fibra muscular como resultado de la estimulación mecánica.
Este trabajo mostró que la expresión del gen de
IGF-1 no está limitada a las células satélite, sino
que está regulada positivamente en las fibras musculares en sí
mismas. En secciones transversales, el mensaje de
IGF-1 se localizó en fibras de músculo grandes pero
tendían a expresarse fuertemente las fibras pequeñas que representan
los extremos afilados de fibras que terminan en el vientre muscular
[22]. En unos pocos músculos, se observó alguna evidencia de
degeneración y regeneración con altos niveles de ARNm de
IGF-1. Estas regiones eran superficiales e indicaban
que en estos casos la escayola estaba demasiado apretada. El
estudio de hibridación in situ, sin embargo, mostró que con
el uso del modelo de estiramiento simple, sucedía regulación
positiva de IGF-1 en fibras aparentemente no
dañadas.
Clonación molecular de ADNc de
IGF-1 muscular: Este estudio se diseñó para
investigar si diferentes isoformas de IGF-1 se
expresan en músculo cuando se somete a actividad mecánica. Se
aislaron diez clones que cubren el dominio E (exones tres a seis) y
se secuenciaron a partir del músculo estirado y del contralateral de
control. Se obtuvieron dos clases de clones de ADNc usando ARN
aislado de músculo estirado. Entre estos clones, el 30% contiene
las secuencias que codifican IGF-1Ea y el 70%
IGF-1Eb. Sin embargo, incluso después de intentos
repetidos, sólo los clones de tipo IGF-1Ea podían
aislarse de músculo de conejo no estirado. La secuencia de ADNc
clonada comienza desde el exón 3 que codifica IGF-1
maduro. Las secuencias de las dos clases de ADNc de
IGF-1 aislado del ARN total del músculo EDL estirado
se muestran en la Figura 3. La secuencia puede dividirse en tres
secciones. Una región que codifica IGF-1 maduro
(péptidos B, C, A y D), un péptido E de extensión que en
IGF-1Eb tiene un inserto de 52 bases que carece de
IGF-1Ea, y una región no traducida 3' común. En
términos del péptido de extensión (E)
carboxilo-terminal, la secuencia de aminoácidos de
conejo es idéntica a la secuencia humana hasta el resto E16. En la
primera base del codón para el resto E17, las secuencias de
aminoácidos de los dos clones de ADNc divergen debido al inserto de
52 pb en el clon IGF-1Eb. El inserto cambia la
secuencia de aminoácidos derivada así como la fase de lectura,
provocando dos posibles secuencias de péptido E
carboxilo-terminal y la presencia de dos diferentes
codones de parada UAG en variantes de los extremos.
Comparando el inserto de 52 pb de músculo de
conejo con el inserto de 52 pb en el IGF-1Eb
expresado en hígado de rata en muy pocas cantidades [14] e
IGF-1Ec que se ha detectado recientemente en hígado
humano [15], las posiciones en las que existe el inserto son
iguales. La secuencia de ADNc de conejo muestra una homología del
77% con IGF-1Eb de rata, siendo 12 de las 17
secuencias de aminoácidos esperadas idénticas y del 94% con
IGF-1Ec humano, siendo 13 de las 16 secuencias de
aminoácidos esperadas idénticas (Figura 4).
Los modelos experimentales de regeneración
muscular indicaron que IGF-1 puede funcionar como
factor trófico en la regeneración muscular [23] y se expresa en
mioblastos proliferantes y células satélite [24]. En este estudio
se ha analizado el ARNm de IGF-1 en músculo
esquelético inducido a experimentar un crecimiento longitudinal
rápido. Se eligió este modelo ya que hay muy poca lesión a las
fibras musculares. Los resultados presentados en este documento
concuerdan con el trabajo publicado [25-27] de que
el ARNm de IGF-1 se expresa en tejidos musculares.
Sin embargo, también muestran que el gen de IGF-1 se
expresa en las fibras musculares en sí mismas y no solamente en
células satélite y de tejido conectivo. La expresión de los
transcritos de IGF-1 no fue uniforme y
habitualmente son las fibras más pequeñas las que muestran altos
niveles de ARNm de IGF-1. Un estudio de secciones
transversales y longitudinales mostró que la fibra pequeña que
expresa el ARNm de IGF-1 también expresa la cadena
pesada de miosina neonatal (MyHC). También se ha demostrado que las
fibras de diámetro pequeño que contienen MyHC neonatal son los
extremos afilados de las fibras más grandes que terminan en el
vientre del músculo [22]. El crecimiento longitudinal del músculo
esquelético se ve facilitado por la adición de nuevos sarcómeros a
los extremos de las miofibras existentes [28, 29] y la fase inicial
implica la deposición de la miosina neonatal [22]. Estos datos
apoyan la hipótesis de que los extremos de las fibras adultas
normales son la región para el crecimiento longitudinal y que
IGF-1 está implicado en este proceso.
La estimación de la expresión del ARNm de
IGF-1 por transferencia de Northern sugiere que las
muestras de ARNm de IGF-1 tanto de 7,5 kb como de
1,2 kb se inducen específicamente por estimulación mecánica, pero su
aumento parece ser independiente la una de la otra. El ARNm de 1,2
kb aumentó en todos los músculos estirados que no siempre fue el
caso para el ARNm de 7,5 kb. En esta fase, no se sabe cual es el
transcrito para el Eb de IGF-1. Se necesita un
trabajo adicional para caracterizar estos ARNm y para determinar qué
secuencia de señal codificante y otros elementos incluyen.
El aislamiento de dos clases de clones de ADNc
(IGF-1Ea e IGF-1Eb) de músculos
estirados indica que ambas formas de ARNm de IGF-1
están presentes en el músculo estirado. Las secuencias 3' de ADNc de
IGF-1Ea e IGF-1Eb difieren por la
presencia de inserto de 52 pb que en la última altera la secuencia
de aminoácidos carboxilo-terminal derivada. Tres
mecanismos pueden justificar el inserto de 52 pb. Primero, el
inserto podría generarse por un sitio donante de corte y empalme
alternativo de 52 pb en el extremo 5' de un intrón presente en esta
posición en la secuencia genómica de IGF-1. Como
alternativa, puede generarse por el uso de un sitio aceptor de corte
y empalme alternativo de 52 pb del extremo 3' del intrón
pertinente. Finalmente, el inserto de 52 pb podría surgir de un exón
completamente diferente [10].
Una comparación de la secuencia de
IGF-1Eb de conejo con secuencias del
IGF-1Eb de rata [10] e IGF-1Ec
humano [15] mostró que el IGF-1Eb que está
marcadamente regulado positivamente en músculo estirado es
aparentemente el equivalente de conejo para el
IGF-1Eb de rata y el IGF-1Ec humano.
Estos resultados mostraron que IGF-1Eb de conejo
(el equivalente de IGF-1Ec humano) fue sólo
detectable en músculo estirado. El hecho de que esto sea una
isoforma inducible es coherente con los resultados de Chew et
al [15] que demostraron que después de la estimulación con
niveles fisiológicos de GH, el transcrito de IGF-1Ec
humano se aumentaba en células HepG2 de hepatoma humano (una línea
de hepatoma), con relación a IGF-1Ea humano. Se cree
que el sitio para las proteínas de unión de IGF-1
(BP) está en el dominio B [30]. También se cree que los dominios C y
D son "regiones activas" [31]. Sin embargo, el papel
fisiológico del péptido E alternativo generado a partir de el ARNm
de IGF-1Ea e IGF-1Eb sigue siendo
desconocido [14]. Se ha sugerido que podría afectar a la interacción
de IGF-1 con su receptor o sus proteínas de unión.
También se ha sugerido que los péptidos E en sí mismos también
pueden tener papeles biológicos distintos después de escindirse de
la prohormona [14]. Recientemente se ha demostrado que parte del
péptido E contiene un péptido amidado promotor del crecimiento con
sitios de unión específicos en tejidos humanos [32]. De acuerdo con
estos descubrimientos, parece que el péptido Eb se induce sólo en
el músculo estirado. Esto sugiere que el Péptido Eb puede jugar un
papel en el control del crecimiento local como queda ejemplificado
por la fibra muscular esquelética que aumenta en longitud y masa en
respuesta al estiramiento mecánico. El péptido Eb puede estar
implicado en la externalización de IGF-1 y también
en la unión de IGF-1 a receptores musculares.
Hay evidencias que sugieren que el péptido Ea
puede estar glicosilado in vivo. Bach et al [33]
descubrieron que el péptido Ea puede glicosilarse después de la
traducción in vitro en presencia del microsoma. No se
observaron supuestos sitios de glicosilación a partir de los datos
de la secuencia de Eb de IGF-1 muscular. Las
posibles funciones para las diferencias en la glicosilación de Ea y
Eb incluyen la reducción de la vida media de 1Eb de
IGF-1, la localización diferencial de las dos formas
y las afinidades diferenciales para las proteínas de unión. Por lo
tanto, el 1Eb de IGF-1 tipo músculo estirado puede
ser mucho más pequeño pero con una vida media más corta que las
isoformas producidas por músculo normal y el hígado.
Devol et al [34] informaron de que el
ARNm de IGF-1 en músculo esquelético es
independiente de GH y otras hormonas de la pituitaria y demostraron
una unión entre la estimulación local, el crecimiento del músculo
esquelético y la expresión del gen de IGF-1. El Eb
expresado sólo en músculo estirado indica que la expresión del ARNm
de IGF-1Eb podría cambiar por estimulación mecánica,
que se sabe que induce un crecimiento muscular rápido [16]. Por
tanto, el péptido Eb puede ser un factor específico que distingue la
estimulación mecánica y mecanismos asociados del crecimiento
muscular.
Es evidente a partir de este estudio que los
diferentes péptidos E pueden jugar diferentes papeles en la
actividad de IGF-1. Son necesarios estudios
adicionales para dilucidar si el péptido E de estos ARNm de
IGF-1 alternativos interaccionan de forma diferente
con el receptor de IGF-1 o con proteínas de unión a
IGF-1, o si el péptido E alternativo solo posibilita
que el factor de crecimiento funcione de un modo autocrino.
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Figura 1. Expresión del ARNm de
IGF-1 estudiado por transferencia de Northern en
músculo digitorum longus extensor (EDL) estirado (E) y de control
(C).
Figura 2. Localización y distribución del ARNm
de IGF-1 en músculo digitorum longus extensor (EDL)
estirado (A, sección transversal; B, sección longitudinal) y de
control (C). Se usó la sonda de ARN con sentido del mismo clon tanto
sobre el músculo estirado (D) como sobre un control negativo. Escala
de la barra, 30 \mum.
Figura 3. Secuencias de ADN y de aminoácidos
derivadas de ADNc de IGF-1 de conejo aisladas de
músculo estirado: Los dos tipos de secuencia de ADNc difieren por la
presencia (IGF-1Eb) o ausencia
(IGF-1Eb) de un inserto de 52 pares de bases
(subrayado) de la posición 288 a la posición 340. El inserto alteró
la secuencia derivada de aminoácidos C-terminal del
péptido E (subrayado en el caso de IGF-1Eb), cambió
las fases de lectura y usó dos codones de parada TAG diferentes
(final). El supuesto sitio de glicosilación
(Asn-Thr-Ser) (marcado por
\blacklozenge\blacklozenge\blacklozenge) está presente en el
péptido Ea pero no el péptido Eb.
Figura 4. Alineamiento de las tres secuencias de
aminoácidos derivadas de los insertos de hígado de rata (parte
inferior), hígado humano (centro) y músculo estirado de conejo
(parte superior). Se muestran los restos de aminoácidos idénticos
por los recuadros.
<110> UNIVERSITY COLLEGE LONDON
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<120> MÉTODO PARA TRATAR TRASTORNOS
MUSCULARES
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<130> N.71246C AB
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12-03-1997
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<151>
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 1
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\hfill18
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 553
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<212> ADN
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<213> Oryctolagus cuniculus
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(363)
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 121
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<212> PRT
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<213> Oryctolagus cuniculus
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<400> 4
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<211> 553
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<212> ADN
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<213> Oryctolagus cuniculus
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<220>
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<221> CDS
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<222> (341)..(397)
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<400> 5
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<211> 19
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<212> PRT
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<213> Oryctolagus cuniculus
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Oryctolagus cuniculus
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 8
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Rattus norvegicus
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<400> 9
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<211> 777
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<221> CDS
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<222> (26)..(493)
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<400> 10
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<211> 156
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Uso, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento de un trastorno muscular, de un derivado de
polipéptido de factor de crecimiento I tipo insulina
(IGF-1) que comprende la secuencia de:
- (a)
- el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
- (b)
- el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys,
- (c)
- el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys o
- (d)
- un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN específico de músculo inducido específicamente por estiramiento; y que incluye además un truncamiento N-terminal de la secuencia de aminoácidos madura.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que el trastorno muscular es distrofia muscular.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el
que el trastorno muscular es atrofia muscular o una afección
relacionada.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el
que la atrofia muscular es en seres humanos ancianos, o es atrofia
muscular inducida por lesiones de la médula espinal o un trastorno
neuromuscular.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 en la
fabricación de un medicamento para la prevención de un trastorno del
músculo cardiaco, una enfermedad para la que promover la síntesis de
proteínas del músculo cardiaco sería un tratamiento beneficioso, una
cardiomiopatía, insuficiencia cardiaca aguda o lesión cardiaca
aguda.
6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el
que la lesión cardiaca aguda es miocarditis o infarto de
miocardio.
7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 en la
fabricación de un medicamento para mejorar el rendimiento cardiaco
aumentando el volumen del impulso del corazón.
8. Un derivado de polipéptido del factor de
crecimiento 1 tipo insulina (IGF-1) cuya secuencia
comprende la de:
- (a)
- el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
- (b)
- el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys,
- (c)
- el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys,
- (d)
- un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN específico de músculo inducido específicamente por estiramiento;
y que incluye además un truncamiento
N-terminal de la secuencia de aminoácidos
madura;
para el uso en un método de tratamiento o
terapia del cuerpo humano o animal.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Una composición farmacéutica que comprende un
derivado de polipéptido del factor de crecimiento 1 tipo insulina
(IGF-1) que comprende la secuencia de:
- (a)
- el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
- (b)
- el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys,
- (c)
- el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys,
- (d)
- un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN
específico de músculo inducido específicamente
por estiramiento; y que incluye además un truncamiento
N-terminal de la secuencia de aminoácidos
madura;
junto con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 9 en una formulación adecuada para administración
oral o parenteral.
11. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 9 en una formulación adecuada para administración
intravenosa o intramuscular.
12. Un derivado de polipéptido del factor de
crecimiento 1 tipo insulina (IGF-1) cuya secuencia
comprende la de:
- (a)
- el péptido Ec humano, que tiene 24 aminoácidos de longitud y comienza con Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Asn-Thr-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Lys,
- (b)
- el péptido Eb de conejo, que es Tyr-Gln-Pro-Pro-Ser-Thr-Asn-Lys-Lys-Met-Lys-Ser-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Gly-Ser-Thr-Phe-Glu-Glu-His-Lys,
- (c)
- el péptido Eb de rata, que comienza con Ser-Gln-Pro-Leu-Ser-Thr-His-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys o
- (d)
- un péptido C-terminal de IGF-1 codificado por un transcrito de ARN específico de músculo inducido específicamente por estiramiento;
y que incluye además un truncamiento
N-terminal de la secuencia de aminoácidos
madura;
para el uso en el tratamiento de un trastorno
muscular.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Un derivado de polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 12 para el uso en el tratamiento de distrofia
muscular.
14. Un derivado de polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 12 para el uso en el tratamiento de atrofia muscular
o una afección relacionada.
15. Un derivado de polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 14 para el uso en el tratamiento de atrofia muscular
en seres humanos ancianos, o atrofia muscular inducida por lesiones
de la médula espinal o un trastorno neuromuscular.
16. Un derivado de polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 12 para el uso en la prevención de un trastorno del
músculo cardiaco, una enfermedad para la que promover la síntesis de
proteínas del músculo cardiaco sería un tratamiento beneficioso, una
cardiomiopatía, insuficiencia cardiaca aguda o lesión cardiaca
aguda.
17. Un derivado de polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 16 para el uso en el tratamiento de miocarditis o
infarto de miocardio.
18. Un derivado de polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 12 para mejorar el rendimiento cardiaco aumentando el
volumen del impulso del corazón.
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