ES2342926T3 - Modificacion quimica de la superficie de elementos opticos. - Google Patents
Modificacion quimica de la superficie de elementos opticos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2342926T3 ES2342926T3 ES02716660T ES02716660T ES2342926T3 ES 2342926 T3 ES2342926 T3 ES 2342926T3 ES 02716660 T ES02716660 T ES 02716660T ES 02716660 T ES02716660 T ES 02716660T ES 2342926 T3 ES2342926 T3 ES 2342926T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- organic
- activated
- atr
- receptor
- ligand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/55—Specular reflectivity
- G01N21/552—Attenuated total reflection
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Polarising Elements (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Surface Treatment Of Glass (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
Abstract
Dispositivo adecuado para la investigación de interacciones ligando-receptor, en particular para la investigación de una interacción diana de un analito tal como moléculas químicas y biológicas y componentes orgánicos y su interacción con superficies, que consiste en un elemento de reflexión interna total atenuada, transparente en el infrarrojo y del que al menos una superficie se activa químicamente mediante oxidación, hidroxilación o reducción y se injerta covalentemente con una molécula orgánica que puede inmovilizar el receptor.
Description
Modificación química de la superficie de
elementos ópticos.
La invención se refiere a dispositivos adecuados
para la investigación de interacciones
ligando-receptor, en particular para la
investigación de moléculas químicas o biológicas y componentes
orgánicos y su interacción con superficies modificadas de manera
adecuada.
Más en particular, la invención se refiere a
métodos de activación química de la superficie e injerto covalente
de elementos ATR (Attenuated Total Internal Reflection,
reflexión interna total atenuada) y a su uso en dispositivos para
FTIR (Fourier Transform Infra Red, infrarrojos con
transformada de Fourier) para la detección, caracterización y
dosificación de moléculas biológicas y compuestos orgánicos.
En otro aspecto, la invención también se refiere
a elementos ATR injertados como tal.
Los biosensores (para una revisión detallada,
véase: Leech D, Chem. Soc. Rev., 1994, 23, 205-213)
son dispositivos basados en el reconocimiento específico de un
analito de interés mediante una diana tal como un componente
biológico, por ejemplo un receptor, un anticuerpo, una enzima, una
membrana, una célula o medios que contienen células, una molécula,
y la posterior transformación de esta interacción en una señal
eléctrica, óptica o de otro tipo. Los biosensores ya han suscitado
un profundo interés en muchos campos diferentes tales como control
y diagnóstico médico, análisis ambiental y monitorización de
procesos biotecnológicos.
Diferentes técnicas sensibles de superficie
pueden aplicarse para detectar interacciones
ligando-receptor, dependiendo de la naturaleza de
los soportes del sensor. Hay métodos piezoeléctricos, espectroscopía
de impedancia, microscopía y espectroscopía de resonancia de
plasmón superficial (SPR, surface plasmon resonance), en el
caso de superficies de oro u otro metal, por un lado, y
espectroscopía de fluorescencia y óptica integrada, en el caso de
superficies de vidrio (o TiO_{2}), por el otro lado.
Entre las técnicas anteriores, BIACORE
International AB (Estocolmo) ha usado satisfactoriamente la
espectroscopía SPR para desarrollar un instrumento comercial (Löfas
S, Malmqvist M, Rönnberg I, Stenberg E, Liedberg B, Lundström I,
Sensors Actuators B, 1991, 5, 79; Malmqvist M, Nature, 1993, 361,
186). La resonancia de plasmón superficial es una técnica sensible
de superficie que puede detectar interacciones moleculares en tiempo
real y en línea (para ejemplos seleccionados, véanse: Kooyman RPH,
de Bruijn HE, Eenink RG, Greve J, J. Mol. Struct., 1990, 218, 345;
Liedburg B, Nylander C, Lundström I, Sensors Actuators B, 1983, 4,
299; Karlsson R, Michaelsson A, Mattsson L, J. Immunol. Methods,
1991, 145, 229; Green RJ, Davies J, Davies MC, Roberts CJ, Tendler
SJB, Biomaterials, 1997, 18, 405; Liedberg B, Lundström I, Stenberg
E, Sensors Actuators B, 1993, 11, 63; Lahiri J, Isaacs L, Tien J,
Whitesides GM, Anal. Chem., 1999, 71, 777).
Los biosensores basados en la técnica óptica de
SPR hacen uso de las variaciones en el índice de refracción de un
medio próximo a una película delgada de metal (oro) depositada sobre
un sustrato (vidrio). Se producen modificaciones en el índice de
refracción cuando un analito tal como una molécula o una proteína,
por ejemplo se adsorbe o fija al sustrato de superficie; por
consiguiente, se ve afectado el ángulo de mínima intensidad de la
luz reflejada (el ángulo de resonancia). Intrínsicamente, esta
técnica de detección, es decir la medición de la carga másica de la
superficie, no puede proporcionar información estructural y
mecanística sobre el analito de interacción. El acceso a
información química, tal como la estructura molecular,
empaquetamiento, orientación, ... e información con resolución
temporal, tal como transiciones conformacionales que acompañan a
las interacciones ligando-receptor, son
prácticamente inaccesibles. Además, la técnica de SPR requiere la
deposición de una película de metal, que habitualmente es oro sobre
un soporte, y la inmovilización posterior de las dianas o los
receptores biológicos de interés por medio del método de monocapas
autoensambladas (SAM, self-assembled
monolayers) basado en la quimiosorción de tensioactivos que
contienen tiol (para ejemplos seleccionados, véanse Mrksich M,
Whitesides GM, ACS Symp. Ser., 1997, 680, 361; Deng L, Mrksich M,
Whitesides GM, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5136; Prime KL,
Whitesides GM, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 10714) o por medio de
la interacción con una matriz de dextrano amorfo. La presencia de
esta película de metal (aproximadamente de 200 nm de profundidad)
limita dramáticamente las posibilidades de detección superficial
mediante técnicas altamente sensibles, tales como técnicas de
fluorescencia o espectroscopía infrarroja que pueden aplicarse en
medios acuosos. Por consiguiente, deben encontrarse conceptos y
dispositivos novedosos para mejorar los soportes de biosensores y
las técnicas de detección relacionadas.
La espectroscopía infrarroja con transformada de
Fourier (FTIR) es una técnica analítica extremadamente potente,
particularmente bien adaptada para la caracterización de moléculas
orgánicas y sistemas biológicos. Puede registrarse información
conformacional y estructural cuantitativa. Se ha aplicado el método
a la investigación de mono y multicapas de muestras bioorgánicas
presentadas en los elementos ópticos, usando la configuración de
reflexión interna total atenuada (ATR) (Scheuing DR, Fourier
Transform Infra-Red Spectroscopy in Colloid and
Interface Science, ACS Symposium Series nº 447, Am. Chem. Soc.,
Washington, 1991; Mirabella Jr FM (editor), Internal Reflection
Spectroscopy, Theory and Applications, Marcel Dekker, Nueva York,
1993). De manera interesante, la configuración de ATR permite el
estudio de analitos tales como moléculas y componentes biológicos o
proteínas, por ejemplo en superficies en contacto con medios que
contienen agua. El examen de la adsorción de proteínas sobre
superficies de biomateriales es una de las aplicaciones relevantes
(Chittur KK, Biomaterials, 1998, 19, 357). Recientemente, Vogel y
colaboradores notificaron el efecto de la reducción del espesor de
la capa de metal depositada en la superficie de un elemento ATR
sobre la detección por infrarrojos de biomoléculas (Liley, M.;
Keller, T.A.; Duschl, C.; Vogel, H. Langmuir 1997, 13,
4190-4192). Posteriormente, ha aparecido una
solicitud de patente internacional que da a conocer métodos y
dispositivos para la detección y la investigación de moléculas
biológicas en (o dentro de) monocapas autoensambladas sobre
superficies de metal usando espectroscopía infrarroja en la
configuración de reflexión interna total atenuada (Vogel H, Keller
T, Liley M; documento WO 99/05509). Esta descripción se basa en el
uso de una película muy delgada de oro (de 5 a 30 nm) depositada
sobre un elemento ATR, y la posterior formación de las SAM
susceptibles de inmovilizar biomoléculas. Por tanto, se aprovecha
la transparencia relativa de la película de metal delgada en el
infrarrojo, mediante lo cual la reflexión interna del haz IR en la
interfase entre el elemento ATR y el metal produce un campo
evanescente que penetra a través de la película de metal y hacia la
fase acuosa en el otro lado. Esto permite la toma de muestras de
las SAM y biomoléculas fijadas en la interfase
metal-agua.
Otras técnicas están disponibles para
inmovilizar moléculas de interés sobre cristales ATR, tales como el
recubrimiento con capas delgadas de polímeros sintéticos, tales como
poliuretanos, poliestireno, polietileno, mediante colada por
centrifugación (Lenk TJ, Ratner BD, Chittur KK, Gendreau RM,
Langmuir, 1991, 7, 1755; Lenk TJ, Ratner BD, Chittur KK, Gendreau
RM, J. Biomed. Mater. Res., 1989, 23, 549), y el recubrimiento con
biocerámica, tal como hidroxiapatita, mediante bombardeo iónico (Ong
JL, Chittur KK, Lucas LC, J. Biomed. Mater. Res., 1994, 28, 1337).
En todos los casos, es decir, materiales de metal, polímero o
cerámica, el espesor de la capa depositada parece ser un punto
crucial porque no está permitido que cambie significativamente la
naturaleza y la intensidad del campo evanescente.
La principal desventaja del uso de un película
intermedia de metal, polímero o cerámica sobre la superficie del
elemento ATR es la formación de una barrera para la transmisión de
la luz, lo que da como resultado una limitación drástica de las
posibilidades de detectar interacciones
ligando-receptor que tienen lugar en la superficie
ATR. Por tanto, existe una necesidad adicional de un método de
modificación de la superficie de elementos ATR que minimice el
efecto de la deposición de una película intermedia de metal,
polímero o cerámica, entre el cristal y la película orgánica que
presenta los receptores biológicos.
En la presente solicitud inventiva, se omite la
molesta película intermedia y se sustituye por una modificación de
la superficie del elemento ATR que implica un procedimiento que
consiste en dos etapas. La primera etapa consiste en activar
químicamente y modificar la superficie del elemento ATR mediante
química húmeda. Preferiblemente, los elementos ATR según la
invención están compuestos por cristales de germanio o silicio. Se
conoce bien la modificación química directa de las superficies de
silicio mediante métodos de silanización (Patai S y Rappoport Z
(editores), The chemistry of Organic Silicon Compounds, John Wiley,
Chichester, 1989; Mittal KL (editor), Silanes and other Coupling
Agents, VSP, Utrecht, 1992; Auner N y Weis J (editores),
Organosilicon Chemistry II, from Molecules to Materials, VCH,
Weinheim, 1996); pero esta técnica nunca se usó para la elaboración
de elementos FTIR-ATR de biosensores.
La segunda etapa consiste en el injerto de la
superficie activada con una molécula orgánica, tal como un derivado
de silano, a través de acoplamiento covalente. Se ha descrito
anteriormente el anclaje de un derivado de silano a través de su
resto silano sobre la superficie de un elemento de reflexión interna
(Stefan I y Scherson D, Langmuir, 2000, 16,
5945-5948). El documento EP 0 596 421 da a conocer
un recubrimiento de guías de ondas de TiO_{2} dieléctricas con
elementos que pueden reconocer moléculas biológicas en la formación
de un biosensor. El recubrimiento consiste en una capa de soporte
orgánica, a la que se unen las moléculas de receptor, comprendiendo
la capa de soporte una capa monomolecular ordenada que está unida
por medio de un átomo de Si directamente a una guía de ondas de
TiO_{2} o, si se desea, por medio de una capa intermedia a una
guía de ondas de TiO_{2}. Sin embargo, ninguna de estas
construcciones da a conocer una modificación previa química de la
superficie del elemento óptico. En la presente invención, el
pretratamiento del dispositivo de superficie mediante productos
químicos mejora la humectabilidad y la reactividad de la superficie.
La activación química de la superficie ATR permite un injerto
directo y más fácil de componentes orgánicos sobre esta superficie.
Esto da como resultado una medición más exacta y eficaz de las
interacciones ligando-receptor por medio de
espectroscopía infrarroja.
La presente invención se refiere a un
dispositivo adecuado para la investigación de interacciones
ligando-receptor, en particular para la
investigación de una interacción diana de un analito tal como
moléculas químicas y biológicas y componentes orgánicos y a su
interacción con superficies, que consiste en un elemento de
reflexión interna total atenuada, transparente en el infrarrojo y
del que al menos una superficie se activa químicamente y se injerta
covalentemente con una molécula orgánica que puede inmovilizar el
receptor.
En una realización preferida, la molécula
orgánica es una derivado de silano de fórmula general
X_{3}Si-(CHF_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y,
\hskip0,2cm
X_{2}(R_{1})Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y
\newpage
o
X(R_{1})(R_{2})Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y,
en las
que
X es halógeno, preferiblemente Cl, Br o alcoxilo
C_{1}-C_{6}, preferiblemente OMe, OEt;
n es de 1 a 20;
n' es de 0 a 20;
R_{1}, R_{2} son independientemente alquilo
C_{1}-C_{6};
Y es Me, CF_{3}, CHF_{2}, CH_{2}F,
CH=CH_{2}, CN, CH=O, epóxido, halógeno, SH, NH_{2}, OH, N=C=O,
N=C=S, CO_{2}H o ésteres derivados de los mismos.
En otra realización preferida, la molécula
orgánica es un derivado de silano acoplado covalentemente con un
brazo espaciador multifuncional de fórmula general
Z_{1}-(CH_{2})_{n}-Z_{2}
en la que n es de 2 a
12;
Z_{1}-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2}-)_{n'}-O-CH_{2}-Z_{2}
en la que n' es de 0 a
5;
en las que Z_{1}, Z_{2} se eligen
independientemente de aril-N_{3} (sustituyentes
fotoactivables), CO_{2}H y formas activadas del mismo tales como
éster N-hidroxisuccinimidílico, CH_{2}NH_{2} y
derivados activados tales como N-maleimida,
CH_{2}OH y formas activadas tales como tosilatos, CH_{2}SH y
formas activadas tales como derivados de ditiano, CH_{2}N=C=O o
CH_{2}N=C=S.
La invención también proporciona un método de
construcción de dicho dispositivo que incluye las etapas de:
- -
- activar en superficie al menos una superficie de un elemento de reflexión interna total atenuada,
- -
- injertar la superficie con una molécula orgánica de la superficie activada obtenida en la etapa previa, y
- -
- acoplar un receptor por medio de fijación covalente en la molécula orgánica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen realizaciones preferidas en las
reivindicaciones dependientes.
En los dibujos, se presentan vistas esquemáticas
y gráficas de espectro de las realizaciones de la invención.
La figura 1 muestra una vista esquemática de (A)
los principios y métodos de análisis y detección relacionados de un
biosensor, (B) elemento ATR modificado en la superficie para la
detección por FTIR de biomoléculas según la invención.
La figura 2 muestra (A) un espectro
FTIR-ATR de un cristal de silicio activado e
injertado con undeciltriclorosilano; (B) un espectro
FTIR-ATR de un cristal de germanio activado e
injertado con octadeciltrimetoxisilano.
La figura 3 muestra un espectro
FTIR-ATR de un cristal de silicio activado e
injertado con APTES.
La figura 4 muestra un esquema de síntesis para
el acoplamiento de un brazo espaciador (ejemplo 2).
La figura 5 muestra un espectro
FTIR-ATR de un cristal de silicio dotado del brazo
espaciador.
La figura 6 muestra espectros FTIR de una
película de PE-biotina expuesta a una disolución
tampón que contiene estreptavidina (125 \mug/ml), se aplicaron
100 \mug de PE-biotina sobre la superficie del
cristal de germanio. Se usó una bomba peristáltica para recircular
la disolución acuosa de estreptavidina al interior de una celda de
flujo ATR vertical impermeable (4 ml/min). Se registraron los
espectros en el transcurso de la unión de estreptavidina sobre la
película de PE-biotina. Se registraron los primeros
diez espectros cada 5 minutos, después cada 50 minutos.
La figura 7 muestra espectros
FTIR-ATR, registrados como una función del tiempo,
de un cristal de germanio que presenta PE-biotina y
sometido a un flujo de disolución de estreptavidina (125 \mug/ml).
Intensidades de las bandas de absorción en 1634,7 cm^{-1} (amida
I) y 1543,4 cm^{-1} (amida II).
La figura 8 muestra una gráfica de calibración
obtenida mediante la técnica analítica multivariante PLS.
Concentraciones conocidas de estreptavidina frente a las
predichas.
La figura 9 muestra espectros
FTIR-ATR registrados en cada etapa de la
construcción del sensor de
"biotina-estreptavidina". A = cristal
injertado con APTES (referencia); B = cristal injertado con el brazo
espaciador (1740 cm^{-1}); C = cristal que ha fijado la proteína
(1634,7 y 1543,4 cm^{-1}).
La figura 10 muestra una gráfica de la
regeneración del cristal ATR. A = cristal con el brazo espaciador y
la proteína acoplada, que ha fijado PE-biotina (1640
cm^{-1}), según se indica mediante la fecha negra; B = cristal
con el brazo espaciador, recuperado tras la aplicación de una
disolución de estreptavidina.
La figura 11 muestra un esquema de síntesis para
el acoplamiento de un brazo espaciador (ejemplos 3 y 4).
La figura 12 muestra la especificidad de la
unión liando/receptor. En primer lugar, se añadió lisozima (Lys)
(130 \mug/ml), después se hizo fluir estreptavidina (SA)
30-\mug/ml en el sistema. Entonces, se lavó la
celda con Hepes 2 mM, pH 7,5 (hps). La adición extra de
estreptavidina (SA) no dio como resultado ninguna unión
adicional.
La invención proporciona un dispositivo adecuado
para la investigación de interacciones
ligando-receptor, en particular para la
investigación de moléculas biológicas y componentes orgánicos y su
interacción con superficies, que consiste en un elemento de
reflexión interna total atenuada, transparente en el infrarrojo y
del que al menos una superficie se activa químicamente y se injerta
covalentemente con una molécula orgánica que puede inmovilizar un
receptor. Una realización de dicho dispositivo se representa
esquemáticamente en la figura 1.
En otra realización, la invención proporciona un
método para activar una superficie de un elemento de reflexión
interna total atenuada, mediante química húmeda usando
oxidación/hidroxilación/reducción en un entorno alcalino o
ácido.
En general, la presente invención proporciona un
método para activar la superficie de un elemento óptico,
transparente en el infrarrojo, particularmente un dispositivo ATR de
silicio o germanio, normalmente un cristal, una fibra óptica o una
varilla compuesta por tales materiales, y para fijar covalentemente
además moléculas orgánicas funcionalizadas que pueden inmovilizar
moléculas y componentes biológicos, incluyendo receptores,
proteínas, anticuerpos, membranas biológicos y no biológicos, ...
Este elemento ATR modificado a propósito proporciona un método para
estudiar interacciones ligando-receptor que se
producen en la interfase de disolvente - elemento ATR,
particularmente, en la interfase de medios que contiene agua -
elemento ATR, usando espectroscopía infrarroja (IR) de reflexión
interna total atenuada (ATR), preferiblemente espectroscopía
infrarroja con transformada de Fourier
(FTIR).
(FTIR).
En otra realización, la invención se refiere a
un método, en el que se realiza el injerto de la superficie a
través de acoplamiento covalente con un derivado de silano. La
técnica se basa en la modificación de la superficie,
preferiblemente en la oxidación/hidroxilación/reducción, del
elemento ATR seguida por el injerto covalente de moléculas
orgánicas que presentan un resto reactivo en un extremo terminal
para el anclaje de superficie, normalmente un grupo funcional
silanilo o germanilo, y un grupo funcional en el otro extremo
terminal para el acoplamiento covalente de receptores biológicos, o
bien directamente, o bien por medio de brazos espaciadores
multifuncionales.
En otra realización, la invención proporciona un
método para estudiar interacciones ligando-receptor,
en particular moléculas biológicas o componentes orgánicos o sus
interacciones o complejaciones o reacciones con moléculas
biológicas o componentes orgánicos o moléculas solubles en agua en o
dentro de la molécula orgánica injertada, usando un elemento ATR
injertado covalentemente y activado en la superficie, que comprende
las etapas de
- -
- instalar el elemento ATR en una celda para FTIR
- -
- realizar un flujo de ligandos potenciales, preferiblemente una disolución que contiene agua, sobre la superficie ATR
- -
- analizar el espectro infrarrojo obtenido tras hacer pasar un haz de FTIR a través de la celda
- -
- regenerar la superficie ATR mediante la aplicación de una disolución de ligando libre.
\vskip1.000000\baselineskip
En general, el método inventivo permite el
estudio de ligandos específicos que interaccionan con el receptor
fijado sobre el elemento ATR. Se coloca el elemento en una celda a
baja presión que permite que pase un flujo de líquido sobre su
superficie. Se hace pasar una disolución de ligandos potenciales que
van a analizarse a través de la celda sometida a un haz de FTIR.
Debido a la baja profundidad de penetración del campo evanescente,
los ligandos en la disolución no contribuyen significativamente al
espectro IR. Por el contrario, los ligandos fijados en los
receptores, cerca de la superficie del elemento ATR, aumentan
considerablemente la concentración local en la interfase, y
contribuyen al espectro IR. El elemento ATR es preferiblemente un
cristal, más preferiblemente que tiene una geometría trapezoidal,
en forma de varilla o fibra. Estos tipos de cristales son fáciles de
usar y permiten una buena detección.
El análisis cuantitativo de los ligandos fijados
es un objeto de la invención.
El estudio con resolución temporal de la
interacción ligando-receptor es un objeto adicional
de la invención.
La regeneración del elemento ATR es otro objeto
de la invención.
La activación resulta de la
oxidación/hidroxilación de la superficie mediante cualquier técnica
disponible (física o química), preferiblemente la técnica de
química húmeda usando una disolución de un oxidante en medios
ácidos o básicos, tales como H_{2}O_{2}/H_{2}SO_{4},
H_{2}O_{2}/TFA, H_{2}O_{2}/HF,
K_{2}Cr_{2}O_{7}/H_{2}SO_{4}, Oxone/H_{2}SO_{4},
H_{2}O_{2}/NH_{4}OH, o en medios orgánicos, tales como un
perácido orgánico, Br_{2} en disolución. También puede llevarse a
cabo la activación sumergiendo los cristales en secuencias de
disoluciones de un oxidante en medios ácidos o básicos. Disoluciones
adecuadas de un oxidante en medios ácidos o básicos, son por
ejemplo H_{2}O_{2}/H_{2}SO_{4}, H_{2}O_{2}/TFA,
H_{2}O_{2}/HF, K_{2}Cr_{2}O_{7}/H_{2}SO_{4},
Oxone/H_{2}SO_{4}, H_{2}O_{2}/NH_{4}OH, o por ejemplo en
medios orgánicos, tales como un perácido orgánico, Br_{2} en una
disolución adecuada, o una combinación de estas disoluciones en
secuencias específicas, tales como HF en agua seguido por
H_{2}O_{2} en agua repetido varias veces (por ejemplo, número de
repeticiones: entre 1 y 20, preferiblemente 3) o
NH_{4}OH/H_{2}O_{2} en agua seguido por HCl/H_{2}O_{2} en
agua (por ejemplo, número de repeticiones: entre 1 y 20,
preferiblemente 1).
La temperatura está comprendida preferiblemente
entre -15ºC y +150ºC y la duración del tratamiento comprendida
entre unos cuantos segundos y varias horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtiene el injerto covalente en el elemento
activado poniendo en contacto una disolución de derivado de silano
elegido de:
X_{3}Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y,
\hskip0,3cm X_{2}(R_{1})Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y \hskip0,3cm
o \hskip0,3cm
X(R_{1})(R_{2})Si-(CHF_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y,
en las
que
X es halógeno, preferiblemente Cl, Br o alcoxilo
C_{1}-C_{6}, preferiblemente OMe, OEt;
n es de 1 a 20;
n' es de 0 a 20;
R_{1}, R_{2} son independientemente alquilo
C_{1}-C_{6};
Y es Me, CF_{3}, CHF_{2}, CH_{2}F,
CH=CH_{2}, CN, CH=O, epóxido, halógeno, SH, NH_{2}, OH, N=C=O,
N=C=S, CO_{2}H o ésteres derivados de los mismos.
Otros parámetros adecuados en esta reacción son
preferiblemente:
- -
- disolución en disolvente orgánico, tal como tolueno, diclorometano, 1,2-dicloroetano, cloroformo, acetonitrilo
- -
- concentración del 0,01% al 5%
- -
- temperatura de -15ºC a 80ºC
- -
- tiempo de reacción de unos cuantos minutos a varias horas
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtiene el acoplamiento covalente en el
elemento ATR modificado poniendo en contacto una disolución de
moléculas multifuncionales de fórmula:
Z_{1}-(CH_{2})_{n}-Z_{2}
en la que n es de 2 a
12;
Z_{1}-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2}-)_{n'}-O-CH_{2}-Z_{2}
en la que n' es de 0 a
5;
en las que Z_{1}, Z_{2} son
independientemente aril-N_{3}, CO_{2}H y formas
activadas del mismo tales como éster
N-hidroxisuccinimidílico, CH_{2}NH_{2} y
derivados activados tales como N-maleimida,
CH_{2}OH y formas activadas tales como tosilatos, CH_{2}SH y
formas activadas tales como derivados de ditiano, CH_{2}N=C=O o
CH_{2}N=C=S.
Se aplican las mismas condiciones experimentales
(disolvente, concentración, temperatura, tiempo) que
anteriormente.
En el caso de Z_{1}, Z_{2} iguales a
aril-N_{3}, se aplica activación de luz (\lambda
entre 200 y 400 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
Se hacen reaccionar las moléculas presentadas en
2. y 3. para dar las siguientes moléculas en las que X, R_{1},
R_{2} y Z_{2} se definen como anteriormente:
X_{3}Si-(CH_{2})_{n}-W-(CH_{2})_{n''}-Z_{2}
- \quad
- X_{3}Si-(CH_{2})_{n}-W-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2}-)_{n''}-O-CH_{2}-Z_{2}
en las que
n y n'' son idénticos o diferentes de
0-20;
X_{3}Si puede sustituirse por
X_{2}(R_{1})Si o
X(R_{1})(R_{2})Si;
W es -NHCO-, -CONH-CH_{2}-,
-OCH_{2}-, -NHCH_{2}-, -SCH_{2}-,
-S-S-CH_{2} o
-CH=CH-.
Se obtiene el injerto covalente en el elemento
ATR activado poniendo en contacto una disolución de los
compuestos.
De nuevo las condiciones experimentales
(disolvente, concentración, temperatura, tiempo) son las mismas que
se describieron en 2 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pone en contacto el elemento ATR que resulta
de las etapas 3. ó 4. con una disolución de receptor que contiene
agua, preferiblemente proteínas, péptidos, membranas, ...
La concentración está preferiblemente en el
intervalo de 10^{-6} mg/ml a 10^{3} mg/ml, la temperatura está
comprendida entre -15ºC y 150ºC y el tiempo de interacción es desde
unos cuantos segundos hasta varias horas (o hasta varias horas, si
es aceptable).
Las funciones activadas del elemento ATR
modificado en la superficie reaccionan como tal; es el caso, por
ejemplo, para isocianato, isotiocianato, éster de
N-hidroxisuccinimida, N-maleimida.
Las funciones no activadas, tales como ácido libre, amina, alcohol,
se activan previamente in situ usando los métodos clásicos de
síntesis de péptidos.
\newpage
Se coloca el elemento ATR obtenido en la etapa
5. en la celda para FTIR y se somete a un flujo de ligandos
potenciales, preferiblemente en una disolución que contiene
agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desplaza el ligando fijado (etapa previa) de
la superficie del elemento ATR mediante la aplicación de una
disolución de ligando libre.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Se activó un cristal de germanio mediante
tratamiento de la superficie con una mezcla de ácido/oxidante a
temperatura elevada. Normalmente, se usó una mezcla sulfocrómica (8
g/l) a 90ºC durante de 1 a 3 horas, preferiblemente 3 horas.
Entonces, se aclara abundantemente el cristal de germanio dotado de
una superficie activada con agua MilliQ y se seca en un flujo de
nitrógeno.
Etapa
2
Se expuso el cristal de germanio activado de la
etapa 1 a ozono y a radiación UV (en un horno) durante 30 min.,
entonces se trató con una disolución de alquiltriclorosilano o
alquiltrialcoxisilano en tolueno a 20ºC. Normalmente, se hizo
reaccionar octadeciltrimetoxisilano (a del 0,05 al 4%,
preferiblemente al 0,5% en tolueno) durante de 1 a 16 h,
preferiblemente durante 2 h para proporcionar una capa injertada de
4,5 nm de profundidad (según se midió mediante elipsometría),
correspondiente a un ángulo de contacto con agua de 95º. El espectro
FTIR-ATR de este cristal modificado en la
superficie mostró bandas típicas entre 2850 y 2950 cm^{-1} debido
a la cadena de CH_{2}, y una banda en 2900 cm^{-1} debido al
grupo CH_{3} terminal (figura 2B).
De manera similar, se hizo reaccionar
aminopropiltrietoxisilano (APTES) con el cristal de germanio
activado (al 0,5% en tolueno, 1-16 h, 20ºC) para
proporcionar una capa injertada de 1,2 nm de espesor (según se midió
mediante elipsometría), correspondiente a un ángulo de contacto con
agua de 42º.
Otras moléculas son undeciltriclorosilano
(C_{11}H_{23}SiCl_{3}), octadeciltriclorosilano
(C_{18}H_{37}SiCl_{3}), octadeciltrimetoxisilano
(C_{18}H_{37}Si(OCH_{3})_{3}). Estas moléculas
se ponen en una disolución de hexadecano y tetracloruro de carbono
3/7 (v/v) cuando se usan triclorosilanos y en una disolución de
tolueno cuando se usan trialcoxisilanos. Se realizó el injerto en
un periodo de tiempo que variaba desde 1 hasta 16 horas,
preferiblemente durante 2 horas para los alcoxisilanos y 1 h 30 para
los triclorosilanos. Posteriormente, se aclararon los sustratos
injertados en un baño de cloroformo durante 3 minutos y luego en un
baño de acetona durante 5 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Se activó la superficie de un cristal de silicio
mediante tratamiento con una mezcla de ácido/oxidante a alta
temperatura. Preferiblemente, se usó H_{2}SO_{4}/H_{2}O_{2}
en una razón de 7/3 (v/v) a 150ºC durante 8 min.
De manera similar, se activó en la superficie el
cristal mediante inmersión durante 5 minutos en una mezcla
compuesta por NH_{4}OH (25%), agua oxigenada H_{2}O_{2} (30%)
y H_{2}O MilliQ en una razón de 1/1/5 (v/v), se calentó hasta
80ºC y durante agitación, seguido de aclarado con H_{2}O MilliQ y
finalmente una inmersión durante 5 minutos en una mezcla compuesta
por HCl (15 M), H_{2}O_{2} (30%) y H_{2}O MilliQ en una razón
de 1/1/5 (v/v), se calentó hasta 80ºC durante agitación.
Entonces, se aclara abundantemente con H_{2}O
MilliQ el cristal de silicio dotado de una superficie activada y se
seca bajo un flujo de nitrógeno.
Etapa
2
Se expuso el cristal de silicio activado de la
etapa 1 a ozono y a radiación UV (en un horno) durante 30 min.,
entonces, se trató con una disolución de alquiltriclorosilano o
alquiltrialcoxisilano en tolueno a 20ºC. Normalmente, se hizo
reaccionar undeciltriclorosilano (al 0,08% en una mezcla compuesta
por CCl_{4} y decano en una razón de 3/7 (v/v)) durante de 1 a 16
h a baja temperatura y baja humedad relativa, preferiblemente 1,5 h
a 12ºC y HR del 30%-40%, preferiblemente el 35%, para proporcionar
una capa injertada de 12 Aº de profundidad (según se midió mediante
elipsometría), correspondiente a un ángulo de contacto con agua de
108º. El espectro FTIR-ATR de este cristal
modificado en la superficie mostró las bandas C-H
características aproximadamente a 2900 cm^{-1} (figura 2A).
De manera similar, se injertó
aminopropiltrietoxisilano injertado en el cristal de silicio
activado (al 0,5% en tolueno, 20ºC; ángulo de contacto con agua:
50º). El espectro FTIR-ATR de este cristal mostró
una banda ancha centrada en 3200 cm^{-1} (NH_{2}) y bandas
agudas entre 2850 y 2950 cm^{-1} (CH_{2}) (figura 3).
De manera similar, se usaron otras moléculas:
undeceniltriclorosilano
CH_{2}=CH-C_{9}H_{18}SiCl_{3},
octadeciltriclorosilano C_{18}H_{37}SiCl_{3},
octadeciltrimetoxisilano
C_{18}H_{37}Si(OCH_{3})_{3}. Estas moléculas
se ponen en disolución y una mezcla de hexadecano (para
octadeciltriclorosilano) o decano (para undeceniltriclorosilano) y
de tetracloruro de carbono en una razón de 3/7 (v/v) cuando se usan
los triclorosilanos, y en una disolución de tolueno cuando se usan
los trialcoxisilanos. Se realiza el injerto durante un periodo de
tiempo que varía desde 1 hasta 16 horas, preferiblemente durante 2
horas para los alcoxisilanos y aproximadamente 1 h 30 para los
triclorosilanos.
Posteriormente, se sonican estas superficies de
silano injertadas en un baño de cloroformo durante 3 minutos y
posteriormente se sumergen en un baño de acetona durante 5
minutos.
Etapa
3
Se trató el cristal de silicio injertado con
APTES, obtenido en la etapa 2, con el éster bis-activado de
un derivado de \alpha,\omega-diácido disuelto en
disolvente orgánico seco, a 20ºC. Normalmente, este método
preferido usó el éster
bis-N-hidroxisuccinimidílico del
ácido
3,6-dioxaoctano-1,8-dioico
(al 0,05-2%, preferiblemente al 1% en acetonitrilo;
de 1 a 16 horas) para proporcionar una superficie de cristal que
expone grupos succinimidilo que pueden fijar covalentemente los
receptores de interés. El espectro FTIR-ATR de este
cristal mostró una banda de carbonilo típica a 1700 cm^{-1}
(figura 5). Se realiza el aclarado con cloroformo, acetona o
preferiblemente con acetonitrilo o diclorometano. Por consiguiente,
se aclaró el cristal de germanio activado con H_{2}O MilliQ y se
secó bajo un flujo de nitrógeno. Un ejemplo de un esquema de
síntesis para el acoplamiento de un brazo espaciador según la
invención se ilustra en la figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Se activó una oblea de germanio mediante el
tratamiento de la superficie con una secuencia de ácido/oxidante a
baja temperatura. Normalmente, se usaron secuencias similares a la
siguiente: (a) HF (al 48%) diluido con agua (concentración final
entre el 1% y el 20%, preferiblemente el 10%), durante de 1 a 600
segundos, preferiblemente 10 segundos, a de 15ºC a 25ºC,
preferiblemente 20ºC y (b) H_{2}O_{2} (al 30%) diluido con agua
(concentración final entre el 1% y el 20%, preferiblemente el 10%),
durante de 1 a 600 segundos, preferiblemente 15 segundos, a de 15ºC
a 25ºC, preferiblemente 20ºC. Se repitió la secuencia (a), (b) entre
2 y 10 veces, preferiblemente 3 veces. Entonces, se aclaró
abundantemente con agua MilliQ la oblea de germanio dotada de una
superficie activada y se secó bajo un flujo de nitrógeno.
Etapa
2
Se trató la oblea de germanio activada de la
etapa 1 con una disolución de alquiltriclorosilano o
alquiltrialcoxisilano en tolueno a 20ºC. Normalmente, se hizo
reaccionar octadeciltrimetoxisilano (al 0,5% en tolueno) durante 16
h, entonces se aclaró sucesivamente la oblea en un baño de
cloroformo durante 3 min. y en un baño de acetona durante 5 min.,
para dejar una capa injertada de 4-5 nm de
profundidad (según se midió mediante elipsometría).
Etapa
3
Se trató la oblea de germanio injertada con
grupos octadecilo, obtenida en la etapa 2, con una arilazida con
activación de luz. Normalmente, este método preferido usó ácido
4-(4-azidofenil)butírico (Carnazzi E.,
Aumalas A., Barberis C., Guillon G., Seyer R., J. Med. Chem.
1994, 37, 1841) o el éster
N-hidroxisuccinimidílico correspondiente
(denominado éster activado) disuelto en un éter (dietil éter, o
preferiblemente tetrahidrofurano (THF)) (disolución a del 1% al
5%). Se depositó una alícuota de la disolución anterior sobre la
oblea de germanio con una pipeta y se evaporó en la oscuridad con
el fin de obtener una cantidad de 0,01 mg a 1 mg de azida
recubierta por centímetro cuadrado de sustrato, preferiblemente de
0,1 mg a 0,3 mg. Entonces, se irradió el sustrato a 254 nm durante
de 0,1 a 6 horas (preferiblemente 2 h), se aclaró sucesivamente con
cloroformo (5 min.) y THF (10 min.), y se secó al aire para
proporcionar una capa injertada total de 7-8 nm de
profundidad (según se midió mediante elipsometría).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Tal como se describió en el ejemplo 2.
Etapa
2
Tal como se describió en el ejemplo 2.
Etapa
3
Tal como se describió en el ejemplo 3.
El espectro FTIR-ATR del cristal
modificado en la superficie resultante mostró la banda C=O
característica del éster activado a 1740 cm^{-1}.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Se recubrió un cristal de germanio (activado o
no) con una membrana compuesta por fosfatidiletanolamina acoplada a
biotina; esta capa de PE-biotina es estable bajo un
flujo acuoso.
Etapa
2
Se hizo pasar un flujo acuoso de una disolución
de estreptavidina (125 \mug/ml) sobre el cristal
PE-biotinilado, y se registraron los espectros
FTIR-ATR cada 5 min. durante 50 min., luego cada 50
min. La contribución de la proteína era cada vez más visible a
1634,7 cm^{-1} (amida I) y 1543,4 cm^{-1} (amida II) (figura 6).
Después de 250 min., se saturó el sistema cuando se usaba una
disolución de estreptavidina de 250 \mug/ml (figura 7).
\newpage
Etapa
3
Aunque se había alcanzado el equilibrio después
de 250 min., la cuantificación de estreptavidina pudo realizarse ya
durante la fase ascendente de la curva (por ejemplo, después de 20
min.). Se han usado cinco disoluciones acuosas de estreptavidina
con concentraciones comprendidas entre 50 y
500-\mug/ml para calibrar el análisis
cuantitativo de la interacción de ligando
(biotina)-proteína. Se han registrado los espectros
FTIR-ATR correspondientes a las cinco disoluciones
como una función del tiempo de la adsorción de estreptavidina. Se ha
elegido la técnica analítica multivariante PLS (partial least
squares, mínimos cuadrados parciales) para desarrollar un modelo
a partir del conjunto de espectros de referencia (Haaland DM,
Thomas EV, Anal. Chem., 1988, 60, 1193 y 1202; Dousseau F, Pezolet
M, Biochemistry, 1990, 29, 8771). Se han considerado para esta
calibración dos dominios espectrales (1654,7-1602
cm^{-1} y 1566,4-1499,8 cm^{-1}),
representativos de las bandas características de la proteína. La
correlación obtenida entre las concentraciones conocidas de
estreptavidina y las predichas según el modelo PLS se ilustra en
la
figura 8).
figura 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Tal como se describió en el ejemplo 2.
Etapa
2
Tal como se describió en el ejemplo 2.
Etapa
3
Tal como se describió en el ejemplo 2.
Etapa
4
Se puso una disolución acuosa de estreptavidina
(250-\mug/ml) en contacto con la superficie del
cristal resultante de la etapa 3 (20 min., 20ºC). El espectro
FTIR-ATR registrado mostró las bandas típicas de
amida I (1634,7 cm^{-1}) y amida II (1543,4 cm^{-1}) de la
proteína (figura 9). No pudo eliminarse mediante lavado la proteína
fijada covalentemente.
Etapa
5
Se hizo pasar un flujo de disolución de
PE-biotina sobre la superficie del sensor obtenida
en la etapa 4. La fijación del ligando era visible a 1640 cm^{-1}
en el espectro FTIR-ATR (figura 10).
Etapa
6
Se hizo pasar un flujo de disolución de
estreptavidina sobre la superficie del sensor obtenido en la etapa
5. Según el espectro FTIR-ATR, se ha recuperado la
superficie del cristal de la etapa 3.
\newpage
Etapa
1
Tal como se describió en el ejemplo 2.
Etapa
2
Tal como se describió en el ejemplo 2.
Etapa
3
Se incubaron vesículas lipídicas
(DDP/PE-biotina 10/1 p:p) 2 mg/ml durante la noche
en presencia del cristal de silicio recubierto. Tras aclarar
durante 60 min. a 0,5 ml/min, se calentó el cristal a 45ºC durante 1
hora. Entonces, se aclaró de nuevo la superficie en las mismas
condiciones.
Etapa
4
Se demostró que la película de membrana
adsorbida se une de manera específica a estreptavidina. Se
detectaron fácilmente concentraciones de tan sólo 0,3 \mug/ml. El
espectro FTIR-ATR registrado mostró la banda de
amida I típica de estreptavidina (1634 cm^{-1}) característica de
su estructura secundaria de lámina beta (figura 12). Los datos
notificados en la figura 12 demostraron que la unión es específica.
Cuando se añadió lisozima (Lys), no se produjo una unión
significativa. Cuando se hizo fluir estreptavidina (SA) en el
sistema, la unión a su receptor presente sobre la superficie
preparada en la etapa 3 dio como resultado un gran cambio de
absorbancia. El lavado de la celda con Hepes 2 mM, pH 7,5 (hps) no
eliminó la estreptavidina unida. La adición extra de estreptavidina
(SA) no dio como resultado ninguna unión adicional.
Claims (13)
1. Dispositivo adecuado para la investigación de
interacciones ligando-receptor, en particular para
la investigación de una interacción diana de un analito tal como
moléculas químicas y biológicas y componentes orgánicos y su
interacción con superficies, que consiste en un elemento de
reflexión interna total atenuada, transparente en el infrarrojo y
del que al menos una superficie se activa químicamente mediante
oxidación, hidroxilación o reducción y se injerta covalentemente
con una molécula orgánica que puede inmovilizar el receptor.
2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que la molécula orgánica es un derivado de silano de fórmula
general
X_{3}Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y,
\hskip0,3cm X_{2}(R_{1})Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y \hskip0,3cm
o \hskip0,3cm
X(R_{1})(R_{2})Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y,
en las
que
X es halógeno, preferiblemente Cl, Br o alcoxilo
C_{1}-C_{6}, preferiblemente OMe, OEt;
n es de 1 a 20;
n' es de 0 a 20;
R_{1}, R_{2} son independientemente alquilo
C_{1}-C_{6};
Y es Me, CF_{3}, CHF_{2}, CH_{2}F,
CH=CH_{2}, CN, CH=O, epóxido, halógeno, SH, NH_{2}, OH, N=C=O;
N=C=S, CO_{2}H o ésteres derivados de los mismos.
3. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que la molécula orgánica es un derivado de silano acoplado
covalentemente con un brazo espaciador multifuncional de fórmula
general
Z_{1}-(CH_{2})_{n}-Z_{2}
en la que n es de 2 a
12;
Z_{1}-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2}-)_{n'}-O-CH_{2}-Z_{2}
en la que n' es de 0 a
5;
en las que Z_{1}, Z_{2} se eligen
independientemente de aril-N_{3} (sustituyente
fotoactivable), CO_{2}H y formas activadas del mismo tales como
éster N-hidroxisuccinimidílico, CH_{2}NH_{2} y
derivados activados tales como N-maleimida,
CH_{2}OH y formas activadas tales como tosilatos, CH_{2}SH y
formas activadas tales como derivados de ditiano, CH_{2}N=C=O o
CH_{2}N=C=S.
4. Dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el elemento de
reflexión interna total atenuada está compuesto por un material
elegido del grupo que consiste en germanio, silicio, ZnSe, ZnS,
AM-TIR (un vidrio amorfo de germanio, selenio y
arsénico).
5. Dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que el elemento de
reflexión interna total atenuada es un cristal, que tiene
preferiblemente una geometría trapezoidal, en forma de varilla o
fibra.
6. Uso de un dispositivo según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 para estudiar interacciones
ligando-receptor, en particular, moléculas
biológicas o componentes orgánicos o sus interacciones o
complejaciones o reacciones con moléculas biológicas o componentes
orgánicos o moléculas solubles en agua en o dentro de la molécula
orgánica injertada.
7. Método para la construcción de un dispositivo
según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que
comprende las etapas de:
- -
- activar en superficie al menos una superficie de un elemento de reflexión interna total atenuada mediante oxidación, hidroxilación o reducción,
- -
- injertar la superficie con un molécula orgánica de la superficie activada obtenida en la etapa anterior, y
- -
- acoplar un receptor por medio de fijación covalente en la molécula orgánica.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
el injerto de superficie se realiza a través de acoplamiento
covalente con un derivado de silano de fórmula general
X_{3}Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y,
\hskip0,3cm X_{2}(R_{1})Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y \hskip0,3cm
o \hskip0,3cm
X(R_{1})(R_{2})Si-(CH_{2})_{n}-(CF_{2})_{n'}-Y,
en las
que
X es halógeno, preferiblemente Cl, Br o alcoxilo
C_{1}-C_{6}, preferiblemente OMe, OEt;
n es de 1 a 20;
n' es de 0 a 20;
R_{1}, R_{2} son independientemente alquilo
C_{1}-C_{6};
Y es Me, CF_{3}, CHF_{2}, CH_{2}F,
CH=CH_{2}, CN, CH=O, epóxido, halógeno, SH, NH_{2}, OH, N=C=O,
N=C=S, CO_{2}H o ésteres derivados de los mismos.
9. Método según la reivindicación 8, que
comprende además el acoplamiento covalente en el derivado de silano
de un brazo espaciador multifuncional de fórmula general
Z_{1}-(CH_{2})_{n}-Z_{2}
en la que n es de 2 a
12;
Z_{1}-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2}-)_{n'}-O-CH_{2}-Z_{2}
en la que n' es de 0 a
5;
en las que Z_{1}, Z_{2} son
independientemente aril-N_{3}, CO_{2}H y formas
activadas del mismo tales como éster
N-hidroxisuccinimidílico, CH_{2}NH_{2} y
derivados activados tales como N-maleimida,
CH_{2}OH y formas activadas tales como tosilatos, CH_{2}SH y
formas activadas tales como derivados de ditiano, CH_{2}N=C=O o
CH_{2}N=C=S.
10. Método según la reivindicación 7, en el que
la molécula orgánica es un derivado de silano unido covalentemente
con un brazo espaciador, siendo la fórmula general de dicha molécula
orgánica:
X_{3}Si-(CH_{2})_{n}-W-(CH_{2})_{n''}-Z_{2}
- \quad
- X_{3}Si-(CH_{2})_{n}-W-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2}-)_{n''}-O-CH_{2}-Z_{2}
en las que
n y n'' son idénticos o diferentes de
0-20;
X_{3}Si puede sustituirse por
X_{2}(R_{1})Si o
X(R_{1})(R_{2})Si;
W es -NHCO-, -CONH-CH_{2}-,
-OCH_{2}-, -NHCH_{2}-, -SCH_{2}-,
-S-S-CH_{2} o -CH=CH-.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-10, en el que se inmoviliza un
receptor sobre la molécula orgánica.
12. Dispositivo que puede obtenerse mediante un
método según cualquiera de las reivindicaciones
7-11.
13. Método para estudiar interacciones
ligando-receptor, en particular moléculas biológicas
o componentes orgánicos o sus interacciones o complejaciones o
reacciones con moléculas biológicas o componentes orgánicos o
moléculas solubles en agua en o dentro de la molécula orgánica
injertada, usando un dispositivo según la reivindicación 12, que
comprende las etapas de
- -
- instalar dicho dispositivo en una celda para FTIR
- -
- realizar un flujo de ligandos potenciales, preferiblemente una disolución que contiene agua, sobre dicha superficie del dispositivo
- -
- analizar el espectro infrarrojo obtenido tras hacer pasar un haz de FTIR a través de dicha celda
- -
- regenerar dicha superficie del dispositivo mediante la aplicación de una disolución de ligando libre.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01870008 | 2001-01-16 | ||
| EP01870008 | 2001-01-16 | ||
| US27802801P | 2001-03-22 | 2001-03-22 | |
| US278028P | 2001-03-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2342926T3 true ES2342926T3 (es) | 2010-07-19 |
Family
ID=26077519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02716660T Expired - Lifetime ES2342926T3 (es) | 2001-01-16 | 2002-01-15 | Modificacion quimica de la superficie de elementos opticos. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040121491A1 (es) |
| EP (2) | EP1354197B1 (es) |
| AT (1) | ATE462137T1 (es) |
| AU (1) | AU2002247633A1 (es) |
| CA (1) | CA2433432C (es) |
| DE (1) | DE60235745D1 (es) |
| DK (1) | DK1354197T3 (es) |
| ES (1) | ES2342926T3 (es) |
| WO (1) | WO2002056018A1 (es) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040132092A1 (en) * | 2003-01-03 | 2004-07-08 | Stetson Christopher M. | Determining the density of functional moieties on polymer reagents |
| US7172682B2 (en) * | 2003-01-24 | 2007-02-06 | Rensselaer Polytechnic Institute | Enzyme immobilization for electroosmotic flow |
| GB2444371B (en) * | 2004-03-15 | 2008-07-23 | Evanesco Ltd | Fuctionalised interface refreshing |
| US7261768B2 (en) * | 2005-04-07 | 2007-08-28 | Luten Henry A | Hydrophobic coatings and methods |
| EP1806574A1 (en) | 2006-01-05 | 2007-07-11 | Université Catholique de Louvain | Surface modification of optical elements for the spectroscopic detection of molecules and organic components |
| GB0603036D0 (en) * | 2006-02-15 | 2006-03-29 | Farfield Sensors Ltd | Method |
| EP2271914B1 (en) * | 2008-04-23 | 2013-03-13 | Österlund, Lars | Optical sensor unit for evanescence wave spectroscopy |
| EP2116839A1 (en) | 2008-05-09 | 2009-11-11 | Université Catholique de Louvain | Device for multiple ATR analysis |
| WO2015085056A1 (en) * | 2013-12-05 | 2015-06-11 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Early detection of cell activation by atr-ftir |
| WO2015121339A1 (en) * | 2014-02-14 | 2015-08-20 | RUHR-UNIVERSITäT BOCHUM | Biosensor for conformation and secondary structure analysis |
| EP3307143A4 (en) * | 2015-06-12 | 2019-01-02 | Georgia State University Research Foundation | Atr-ftir for non-invasive detection of colitis |
| CN105854962B (zh) * | 2016-03-28 | 2018-01-19 | 北京瑞联安科技有限公司 | 一种生物识别分子固定到生物芯片的方法 |
| ES2834484T3 (es) | 2016-11-21 | 2021-06-17 | Univ Ruhr Bochum | Método para la preselección de fármacos para enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas |
| EP3631446B1 (en) | 2017-05-29 | 2024-04-17 | betaSENSE GmbH | Biosensor for conformation and secondary structure analysis |
| CN107328742A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-11-07 | 国网山东省电力公司电力科学研究院 | 傅里叶变换衰减全反射光谱分析硅烷偶联剂水解率的方法 |
| US11280732B2 (en) | 2018-08-20 | 2022-03-22 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Detection of melanoma and lymphoma by ATR-FTIR spectroscopy |
| WO2026009926A1 (ja) * | 2024-07-03 | 2026-01-08 | Ａｇｃ株式会社 | 物品、及び物品の製造方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5052771A (en) * | 1990-12-21 | 1991-10-01 | Eastman Kodak Company | Integrated electro-optical scanner |
| DE69220717T2 (de) * | 1991-04-30 | 1997-11-06 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma, Osaka | Chemisch adsorbierte Schicht und Verfahren zu deren Herstellung |
| CA2108705A1 (en) * | 1992-11-06 | 1994-05-07 | Richard Barner | Biologically recognizing layers on new ti02 waveguide for biosensors |
| JPH0831781A (ja) * | 1994-07-13 | 1996-02-02 | Sony Corp | 洗浄薬液 |
| AU3356597A (en) * | 1997-07-24 | 1999-02-16 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne | Detection and investigation of biological molecules by fourier transform nfra-red spectroscopy |
| US6511854B1 (en) * | 1997-07-31 | 2003-01-28 | The Uab Research Foundation | Regenerable biosensor using total internal reflection fluorescence with electrochemical control |
| US6285816B1 (en) * | 1999-04-13 | 2001-09-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Waveguide |
| CA2403427C (en) * | 2000-03-22 | 2013-04-30 | M. Cynthia Goh | Method and apparatus for assay for multiple analytes |
| EP1307285A2 (en) * | 2000-08-03 | 2003-05-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Microarrays of functional biomolecules, and uses therefor |
-
2002
- 2002-01-15 EP EP02716660A patent/EP1354197B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 AT AT02716660T patent/ATE462137T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-01-15 DE DE60235745T patent/DE60235745D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 CA CA2433432A patent/CA2433432C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-15 EP EP10154491A patent/EP2202521A1/en not_active Withdrawn
- 2002-01-15 DK DK02716660.2T patent/DK1354197T3/da active
- 2002-01-15 US US10/466,140 patent/US20040121491A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-15 AU AU2002247633A patent/AU2002247633A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-15 ES ES02716660T patent/ES2342926T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-15 WO PCT/EP2002/000334 patent/WO2002056018A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60235745D1 (de) | 2010-05-06 |
| CA2433432C (en) | 2012-01-10 |
| CA2433432A1 (en) | 2002-07-18 |
| EP2202521A1 (en) | 2010-06-30 |
| WO2002056018A8 (en) | 2002-08-08 |
| EP1354197A1 (en) | 2003-10-22 |
| WO2002056018A1 (en) | 2002-07-18 |
| DK1354197T3 (da) | 2010-06-07 |
| ATE462137T1 (de) | 2010-04-15 |
| AU2002247633A1 (en) | 2002-07-24 |
| EP1354197B1 (en) | 2010-03-24 |
| US20040121491A1 (en) | 2004-06-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2342926T3 (es) | Modificacion quimica de la superficie de elementos opticos. | |
| Piehler et al. | A high-density poly (ethylene glycol) polymer brush for immobilization on glass-type surfaces | |
| Gunda et al. | Optimization and characterization of biomolecule immobilization on silicon substrates using (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) and glutaraldehyde linker | |
| KR101140029B1 (ko) | 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드 | |
| Schmid et al. | Site-directed antibody immobilization on gold substrate for surface plasmon resonance sensors | |
| JP3537767B2 (ja) | 結合層と検体の結合相互作用を感知するための方法と装置 | |
| EP0945721A2 (en) | Biosensitive element for surface plasmon resonance measurements, and its method of manufacture | |
| JP5420897B2 (ja) | 位相シフト干渉法による光ファイバーアッセイ装置 | |
| JPH06265553A (ja) | 光学的バイオセンサー | |
| CN109060727A (zh) | 一种双通道光纤spr生物传感器 | |
| González-Guerrero et al. | A comparative study of in-flow and micro-patterning biofunctionalization protocols for nanophotonic silicon-based biosensors | |
| CA2326043A1 (en) | Functionalised silicon surfaces, and method for their production | |
| JPH06507709A (ja) | 分析装置 | |
| Voué et al. | Biochemical interaction analysis on ATR devices: A wet chemistry approach for surface functionalization | |
| Jiang et al. | In situ monitoring of the orientated assembly of strep-tagged membrane proteins on the gold surface by surface enhanced infrared absorption spectroscopy | |
| Schartner et al. | Chemical functionalization of germanium with dextran brushes for immobilization of proteins revealed by attenuated total reflection fourier transform infrared difference spectroscopy | |
| Gosselin et al. | Designing a high performance, stable spectroscopic biosensor for the binding of large and small molecules | |
| KR20110110072A (ko) | 항원고정화 면역형광 슬라이드의 제조방법 및 그에 의해 제조되는 면역형광 슬라이드 | |
| Bousiakou et al. | Determination of Au Film Thiolation and Silane Bonding Onto SiO2 Films Within the Frame of Biosensor Surface Functionalization–an Analysis of Best Practices and Techniques | |
| Dinh et al. | Novel optimized biofunctional surfaces for Love mode surface acoustic wave based immunosensors | |
| US20070048796A1 (en) | Biosensor | |
| US7964414B2 (en) | Biosensor with suppressed non-specific adsorption | |
| US20030113939A1 (en) | Modified surface for carrying out or detecting affinity reactions | |
| US8580571B2 (en) | Method for producing a biosensor | |
| KR101758345B1 (ko) | 국소표면 플라즈몬 공명을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법 |