ES2344531T3 - Procedimiento para purificar tacrolimo. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para separar tacrólimo de las impurezas que comprende: a) cargar una mezcla compuesta de tacrólimo e impurezas en un lecho de adsorbente pretratado con iones plata, en el que el adsorbente es gel de ciano sílice; y b) eluir la mezcla del lecho de resina adsorbente para separar el tacrólimo de las impurezas presentes en la mezcla.
Description
Procedimiento para purificar tacrólimo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación de tacrólimo.
El tacrólimo,
[3S-[3R[E(1S,3S,4S)],
4S, 5R, 8S, 9E,12R, 14R,
15S, 16R, 18S, 19S,
26aR]]-5,6,8,11,12,13,14,15,16,
17,18,19,24,25,26,26a-hexadecahidro-5,19-dihidroxi-3-[2-(4-hidroxi-3-metoxiciclohexil)-1-metiletenil]-14,16-dimetoxi-4,10,12,18-tetrametil-8-(2-propenil)-15,19-epoxi-3H-pirido[2,1-c][1,4]oxaazaciclotricosina-1,7,20,21(4H,23H)-tetrona, monohidratado (conocido anteriormente como FK506), presenta un peso molecular de 822,05, la fórmula C_{44}N_{69} NO_{12}H_{2}O, y la fórmula estructural
17,18,19,24,25,26,26a-hexadecahidro-5,19-dihidroxi-3-[2-(4-hidroxi-3-metoxiciclohexil)-1-metiletenil]-14,16-dimetoxi-4,10,12,18-tetrametil-8-(2-propenil)-15,19-epoxi-3H-pirido[2,1-c][1,4]oxaazaciclotricosina-1,7,20,21(4H,23H)-tetrona, monohidratado (conocido anteriormente como FK506), presenta un peso molecular de 822,05, la fórmula C_{44}N_{69} NO_{12}H_{2}O, y la fórmula estructural
\vskip1.000000\baselineskip
El tacrólimo es un macrólido inmunosupresor
natural producido por Streptomyces tsukubaensis. Es
comercializado bajo la denominación PROGRAF® por Fujisawa, y está
disponible para administración oral en cápsulas (cápsulas de
tacrólimo). El tacrólimo prolonga la supervivencia del hospedador y
del injerto trasplantado en modelos de trasplante animal de hígado,
riñón, corazón, médula ósea, intestino delgado y páncreas, pulmón y
tráquea, piel, córnea y extremidades inhibiendo la activación de
linfocitos T. En animales, se ha demostrado que el tacrólimo
suprime alguna inmunidad humoral y, en mayor medida, las reacciones
mediadas por células, tal como el rechace del alotrasplante, la
hipersensibilidad de tipo retardado, la artritis inducida por
colágeno, la encefalomielitis alérgica experimental y la enfermedad
de injerto contra hospedador.
El tacrólimo fue descrito por primera vez en la
patente US nº 4.894.366 y en la patente europea EP 0 184 162.
Cuando se prepara tacrólimo, se obtienen también dos análogos de
tacrólimo, que son impurezas: La ascomicina, que presenta la
formula estructural
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y el dihidrotacrólimo, que presenta
la formula
estructural
La separación del tacrólimo de estas impurezas
por procedimientos convencionales, tales como cristalización, es
difícil debido a la similitud estructural. Por consiguiente, se
necesita una purificación por cromatografía en columna. La eficacia
de la purificación puede mejorarse utilizando iones plata en la
cromatografía en columna. Los iones plata interactúan con el doble
enlace de la cadena lateral de alilo que está presente en el
tacrólimo, pero que no está presente en la ascomicina y en el
dihidrotacrólimo en los que la cadena lateral es un grupo alquilo.
En la ascomicina la cadena lateral es un grupo etilo, y, en el
dihidrotacrólimo, la cadena lateral es un grupo propilo. Como
resultado, el enlace entre el tacrólimo y la fase estacionaria o con
la fase móvil está reforzado, y, de este modo, la diferencia en el
tiempo de la retención del tacrólimo comparado con el tiempo de
retención de sus análogos aumenta.
La patente US nº 6.492.513 da a conocer la
separación del tacrólimo de sus impurezas utilizando una resina de
intercambio catiónico fuerte pretratada con iones plata que contiene
grupos de ácido sulfónico, y un eluyente de acetona o acetato de
etilo y metanol. Como el tacrólimo es sensible a la resina de
intercambio expuesta, cabría esperar la contaminación del
tacrólimo.
Las patentes US nº 6.576.135 y nº 6.881.341 dan
a conocer un procedimiento de cromatografía en columna de dos
etapas para la separación del tacrólimo de las impurezas,
particularmente del análogo tacrólimo-desmetil. Una
etapa dada a conocer implica la adsorción de una mezcla que contiene
tacrólimo en una resina de adsorción no iónica, y la emulsión con
disolvente acuoso que contiene iones plata. La otra etapa dada a
conocer implica la adsorción de la mezcla en una alúmina básica
activa y la elución con un disolvente orgánico para realizar la
separación. La utilización de agua en el eluyente da como resultado
la formación de isómeros de tacrólimo, contaminando con ello el
tacrólimo. Además, la utilización de un eluyente que contiene iones
plata libres requiere la separación de los iones de plata del
eluyente en el tacrólimo después de la elución de la columna.
La publicación de la solicitud de patente
internacional WO 05/054253 da a conocer la separación cromatográfica
de tacrólimo utilizando gel de sílice, opcionalmente, ya sea en
cromatografía en fase inversa o pretratado con plata, después del
tratamiento con gas amoniaco para eliminar las impurezas. El
eluyente dado a conocer era una mezcla de
n-butanol, acetonitrilo y un tampón para la
separación en fase inversa, y una mezcla de acetato de etilo y
hexano para la separación en gel de sílice tratada con plata.
La publicación de la solicitud de patente
internacional WO 05/098011 da a conocer una separación de tacrólimo
de las impurezas por cromatografía en gel de sílice, donde el gel de
sílice se pretrata opcionalmente con plata. Opcionalmente, el
tacrólimo se purifica más por cromatografía en fase inversa
utilizando sílice sin tratar. Para la cromatografía en fase inversa
se ilustra una columna C-8. Los eluyentes
presentados incluyen acetato de etilo en hexano para la columna
tratada con plata y una mezcla de acetonitrilo,
n-butanol y tampón para la separación en fase
inversa.
La publicación de la solicitud de patente
internacional WO 05/010015 da a conocer la separación utilizando
una resina de absorción no iónica sin plata y con un eluyente que
contiene THF o acetonitrilo, agua, y, opcionalmente, un disolvente
orgánico adicional.
Resulta necesario en la técnica un procedimiento
para purificar el tacrólimo, particularmente de ascomicina y de
dihidrotacrólimo que sería adecuado para su utilización a escala
industrial. La presente invención proporciona dicho
procedimiento.
En una forma de realización la presente
invención proporciona un procedimiento para separar tacrólimo de las
impurezas que comprende: a) cargar una mezcla compuesta por
tacrólimo e impurezas en un lecho de adsorbente pretratado con
iones plata, en la que el adsorbente es gel de ciano sílice; y b)
eluir la mezcla procedente del lecho de resina adsorbente para
separar el tacrólimo de las impurezas presentes en la mezcla.
La figura 1 presenta el análisis de HPLC de las
fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo 2.
La figura 2 presenta el análisis de HPLC de las
fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo 5.
La figura 3 presenta el análisis de HPLC de las
fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo 21.
La figura 4 presenta el análisis de HPLC de las
fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo 25.
La figura 5 presenta el análisis de HPLC de las
fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo comparativo
23.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la purificación cromatográfica de tacrólimo
utilizando un adsorbente pretratado con iones plata para la fase
estacionaria ("adsorbente modificado con plata"), en el que el
adsorbente es gel de ciano sílice. El procedimiento de la invención
es particularmente útil para la separación de tacrólimo de la
ascomicina y del dihidrotacrólimo.
El procedimiento de la invención es adecuado
para su utilización industrial. Puede llevarse a cabo con un
eluyente que no contiene agua ni/o iones plata, y proporciona una
separación más eficaz del tacrólimo del dihidrotacrólimo y la
ascomicina. Un eluyente que no contiene agua evita la contaminación
del tacrólimo facilitando la formación de sus isómeros. Además,
evitando la utilización de iones plata en el eluyente, la
contaminación del producto final con iones plata se reduce
sustancialmente. La utilización de una resina ácida fuerte, a la
que el tacrólimo es sensible, y la utilización de la cromatografía
en dos etapas, puede evitarse también en el procedimiento de la
presente
invención.
invención.
El tacrólimo, que está presente en una mezcla
con impurezas, se carga en el adsorbente modificado con plata. La
carga puede realizarse, por ejemplo, disolviendo la mezcla en un
disolvente, preferentemente una cantidad mínima de disolvente, que
permite la disolución, y cargando la solución en el adsorbente
modificado con plata como solución concentrada. Una cantidad mínima
de disolvente puede ser de aproximadamente 2 veces del volumen de
la mezcla de disolvente calculado para la masa de tacrólimo de
partida. El disolvente en el que se disuelve la mezcla puede ser el
mismo que el utilizado durante la elución. A continuación se
proporcionan ejemplos de dichos disolventes. La mezcla puede
cargarse también de otras maneras incluyendo como aceite o como
residuo sólido obtenido de la evaporación de una solución no
concentrada de la mezcla.
La mezcla compuesta de tacrólimo se eluye a
continuación con un disolvente o disolventes procedentes del
adsorbente modificado con plata. Preferentemente el disolvente es
sustancialmente anhidro. En una forma de realización, se utiliza un
eluyente no acuoso que contiene un disolvente orgánico polar
seleccionado de entre el grupo constituido por cetona
C_{3-9} lineal o ramificada, éster
C_{3-7} lineal o ramificado, alcohol
C_{1-7} lineal o ramificado, éter
C_{2-8} lineal, ramificado o cíclico, nitrilo
C_{2-5} y mezclas de los mismos, o una mezcla de
un disolvente orgánico polar y un disolvente orgánico apolar
seleccionado entre el grupo constituido por hidrocarburo
C_{5-8} lineal, ramificado o cíclico, hidrocarburo
aromático C_{6-10} y mezclas de los mismos. Los
eluyentes son preferentemente anhidros, es decir, exentos de agua, o
tienen un contenido en agua que es suficientemente bajo para evitar
la formación de isómeros de tacrólimo. Tal como se utiliza en la
presente memoria, el termino "anhidro" se refiere a los
eluyentes que están exentos de agua, excepto, posiblemente, como
impureza en pequeña cantidad que es insuficiente para producir la
formación de una cantidad detectable de isómeros de tacrólimo.
Preferentemente, el eluyente contiene menos del 2% en peso, más
preferentemente, menos del 1% en peso, aún más preferentemente,
menos del 0,05% en peso de agua.
Preferentemente, la cetona
C_{3-9} lineal o ramificada es acetona,
metiletil-cetona o
metilisobutil-cetona. Los esteres
C_{3-7} lineales o ramificados preferidos incluyen
el acetato de etilo, acetato de n-propilo, acetato
de isopropilo, acetato de n-butilo y propionato de
etilo. Los alcoholes C_{1-7} lineales o
ramificados preferidos incluyen metanol, etanol isopropanol,
n-propanol, n-butanol e isobutanol.
Los éteres C_{2-8} lineales, ramificados o
cíclicos preferidos incluyen el éter
terc-butilmetílico, éter dietílico, éter
diisopropílico y tetrahidrofurano. Un nitrilo
C_{2-5} preferido es el acetonitrilo.
Preferentemente, el hidrocarburo C_{5-8} lineal,
ramificado o cíclico es el hexano, heptano, octano, ciclohexano o
cicloheptano. Preferentemente, el hidrocarburo aromático
C_{6-10} es el tolueno. El disolvente orgánico
polar preferido es la acetona. Preferentemente, el eluyente
contiene acetona como único disolvente o en una mezcla con otro
disolvente, y, más preferentemente, el eluyente contiene acetona y
hexano o acetato de etilo.
Cuando se utiliza una mezcla de acetona y
hexano, puede utilizarse por lo menos una de las siguientes
relaciones de disolvente: aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:3,
aproximadamente 1:4 o aproximadamente 1:9, respectivamente,
dependiendo del adsorbente que se utilice. Cuando se utiliza una
mezcla de acetato de etilo y acetona, la relación de disolvente es
preferentemente aproximadamente 50 a 80% de acetona en volumen, más
preferentemente, aproximadamente 30:70 de acetato de etilo a
acetona en volumen. Opcionalmente, la elución del tacrólimo
comprende un procedimiento de elución de gradiente, partiendo de la
elución con una mezcla de disolventes, preferentemente, de acetona
y hexano, preferentemente en una relación de aproximadamente 3:2,
seguido de la elución con aproximadamente 100 por ciento de un solo
disolvente, preferentemente, acetona.
Preferentemente, el tipo de proceso de elución
se selecciona según la longitud de la columna. Preferentemente, con
una columna corta, por ejemplo una columna de aproximadamente 10 cm
de longitud, se prefiere la elución por gradiente y con una columna
más larga, por ejemplo una columna de aproximadamente 1 m, no se
utiliza elución por gradiente.
En un procedimiento preferido de la invención,
se rellena una columna con un adsorbente modificado con plata, que
se lava a continuación con eluyente. Se carga a continuación una
solución de tacrólimo en el eluyente, seguido de la elución de
tacrólimo, ascomicina y dihidrotacrólimo de la columna, y la
recuperación y análisis de las muestras obtenidas. El eluyente es
preferentemente anhidro.
Con el procedimiento de la invención puede
purificarse tacrólimo de cualquier pureza, y es el tacrólimo en
bruto. El tacrólimo purificado con el procedimiento de la invención
puede contener por lo menos una de las siguientes impurezas:
ascomicina, por lo general en una cantidad de aproximadamente 0 a 10
por ciento de área por HPLC, y/o dihidrotacrólimo, por lo general
en una cantidad de aproximadamente 6 por ciento a 0 por ciento de
área por HPLC. El tacrólimo en bruto que contiene aproximadamente
7,9 por ciento de área por HPLC de ascomicina y/o aproximadamente
3,8 por ciento de área por HPLC de dihidrotacrólimo se ha purificado
con el procedimiento de la invención.
El orden de elución depende de la naturaleza del
adsorbente y del eluyente. Por lo general, la ascomicina y el
dihidrotacrólimo se eluyen antes que el tacrólimo, ya que el
tacrólimo, tiene una mayor afinidad al adsorbente modificado con
plata.
El gel de ciano-sílice utilizado
para la preparación del gel de ciano-sílice
modificado con plata puede ser un adsorbente comercial o puede
prepararse por tratamiento del gel de sílice con
tricloro-3-cianopropilsilano,
produciendo gel de sílice unido de manera covalente en su superficie
al grupo cianoalquilo.
Preferentemente, para una purificación eficaz,
el adsorbente tiene un área superficial específica de por lo menos
aproximadamente 50 m^{2}/g, más preferentemente, de
aproximadamente 50 a 600 m^{2}/g.
Preferentemente, el adsorbente modificado con
plata se prepara mezclando el adsorbente, una fuente de cationes de
plata y un disolvente seleccionado entre el grupo constituido por un
alcohol C_{1-4}, agua y una mezcla de agua y un
disolvente miscible en agua y secando la mezcla resultante.
Preferentemente, cuando el disolvente es un alcohol
C_{1-4}, la fuente de catión plata y el alcohol
C_{1-4} se combinan inicialmente para obtener una
solución, y el adsorbente se añade a continuación para obtener una
suspensión. La suspensión resultante se seca a continuación,
preferentemente en un evaporador rotativo, seguido del secado en una
estufa al vacío durante aproximadamente 15 minutos a 5 horas.
El alcohol C_{1-4} comprende
preferentemente un solo alcohol o una mezcla de alcoholes. El
alcohol C_{1-4} preferido es el metanol.
Preferentemente, cuando el disolvente es un alcohol
C_{1-4}, la fuente de ión plata y el alcohol
C_{1-4} se calientan a aproximadamente la
temperatura de reflujo del disolvente, para obtener una
solución.
Puede utilizarse la sal de plata inorgánica o la
sal del complejo de plata inorgánico. La sal o el complejo pueden
ponerse en contacto con el adsorbente en forma de solución. Las
sales de plata preferidas incluyen el acetato de plata, sulfato de
plata y nitrato de plata. Los complejos de plata preferidos incluyen
un complejo de plata amino, un complejo de plata ciano y un
complejo de tiosulfato de plata, y acetato de plata. Más
preferentemente, la fuente de plata es el nitrato de plata.
El adsorbente puede comprender diferentes
cantidades de iones de plata. El adsorbente modificado con plata
obtenido después de secar preferentemente contiene aproximadamente
0,1 por ciento a 15 por ciento p/p de sal de plata, y, más
preferentemente, aproximadamente 3 por ciento a 13 por ciento p/p de
sal de plata.
Preferentemente, las fracciones diluidas se
recuperan recogiendo grupos de fracciones y evaporando el
disolvente, proporcionando así, una muestra. La muestra recuperada
se analiza a continuación, preferentemente, por HPLC,
proporcionando el contenido de tacrólimo, ascomicina y
dihidrotacrólimo en la muestra. Por lo general, a medida que avanza
el proceso de elución, el nivel de ascomicina y dihidrotacrólimo
disminuye mientras que el nivel de tacrólimo aumenta.
Preferentemente, se repite el proceso de modo que la muestra final
contiene sustancialmente tacrólimo puro. Preferentemente, la
muestra final contiene por lo menos aproximadamente 93 por ciento de
área por HPLC de tacrólimo, más preferentemente, por lo menos
aproximadamente 95 por ciento de área por HPLC de tacrólimo, y, aún
más preferentemente, por lo menos aproximadamente 99 por ciento de
área por HPLC. Preferentemente, la muestra final contiene también
menos de aproximadamente 0,20 por ciento de área por HPLC de
ascomicina, más preferentemente, menos de aproximadamente 0,09 por
ciento de área por HPLC, y, aún más preferentemente, menos de
aproximadamente 0,06 por ciento de área por ciento de área HPLC.
Preferentemente, la muestra final contiene también menos de
aproximadamente 0,04 por ciento de área por HPLC de
dihidrotacrólimo, y, más preferentemente, menos de aproximadamente
0,03 por ciento de área por HPLC de dihidrotacrólimo.
La columna puede regenerarse y utilizarse para
un proceso de purificación adicional.
El tacrólimo eluido puede contener iones plata
que salen de la resina; la cantidad de dichos iones plata es
sustancialmente inferior que si se utiliza un eluyente que contiene
iones plata. El tacrólimo eluido puede separarse de los iones plata
evaporando el eluyente para obtener un residuo; disolviendo el
residuo en un disolvente orgánico; mezclando con una solución que
comprende un reactivo que precipita iones plata; filtrando la sal
de plata precipitada. El reactivo puede ser una sal cloruro, tal
como cloruro de sodio o de amonio, cuya adición daría como
resultado la precipitación del cloruro de plata. Otro procedimiento
para la eliminación de los iones plata es pasar el eluido a través
de una columna rellena con gel de sílice modificada con cloruro
sódico. El gel de sílice modificada con cloruro sódico puede
prepararse fácilmente mezclando gel de sílice con la solución
acuosa del cloruro sódico.
Típicamente, el disolvente orgánico es un
disolvente en el que las sales de plata son inmiscibles.
Preferentemente, el disolvente orgánico se selecciona de entre un
grupo constituido por: acetato de etilo, tolueno, acetato de
isopropilo o normal, acetato de n-butilo, acetato de
isobutilo, acetona, metiletil-cetona,
metilisobutil-cetona, etanol, propanol,
n-butanol, isobutanol, mezclas de acetato de etilo y
acetona, mezclas de tolueno y acetona y mezcla de los mismos con
agua. Preferentemente, el disolvente es el acetato de etilo.
Preferentemente, el disolvente orgánico está
presente en una cantidad aproximadamente dos volúmenes por gramo de
residuo a aproximadamente 30 volúmenes por gramo de residuo, más
preferentemente, de aproximadamente de 10 a 30.
Típicamente, los reactivos que precipitan iones
de plata forman una sal de plata que tiene baja solubilidad en agua
y en disolventes orgánicos. Preferentemente, el reactivo incluye un
contraión seleccionado de entre un grupo constituido por acetato,
sulfato, nitrito, bromato, salicilato, yodato, cromato, carbonato,
citrato, fosfato, cloruro, estearato, sulfuro, bromuro, yoduro,
cianuro, benzoato, oxalato, sulfito y tiocianato. Más
preferentemente, el contraión es carbonato, citrato, fosfato,
cloruro, estearato, sulfuro, bromuro, yoduro, cianuro, benzoato,
oxalato, sulfito y tiocianato. Más preferentemente, el contraión es
carbonato, citrato, fosfato, cloruro, estearato, sulfuro, bromuro,
yoduro, cianuro, benzoato, oxalato, sulfito o tiocianato. Más
preferentemente, el contraión es el bromuro, yoduro, estearato,
sulfuro o cianuro. Preferentemente, el reactivo precipitante es una
sal que comprende el contraión. Más preferentemente, el reactivo
precipitante es NH_{4}Cl.
Preferentemente, el reactivo precipitante se
añade en una cantidad de 1 a aproximadamente 5 equivalentes molares
por equivalente molar de plata, y, más preferentemente, en una
cantidad de aproximadamente 1,2 a 4 equivalentes molares por
equivalente molar de plata. Preferentemente, la solución del
reactivo que precipita iones de plata es una solución acuosa.
Preferentemente, la solución acuosa se añade a la solución del
residuo en el disolvente orgánico. La adición de la solución acuosa
que comprende un reactivo para precipitar plata proporciona un
sistema que tiene por lo menos dos fases, incluyendo una fase
orgánica, que comprende un disolvente orgánico, una fase acuosa y
un precipitado de la sal de plata. Preferentemente, la sal de plata
es el cloruro de plata. La sal se filtra a continuación, y el
filtrado se somete a la separación de fases, proporcionando una fase
orgánica que comprende el tacrólimo eluido, sustancialmente exento
de iones de plata. Típicamente, la expresión "exento de", tal
como se utiliza en la presente memoria haciendo referencia al
tacrólimo se refiere al tacrólimo que contiene menos de 20 ppm de
iones plata. Preferentemente, el tacrólimo exento de iones plata
contiene menos de 10 ppm de iones plata. La concentración de iones
plata puede determinarse por cualquier procedimiento conocido por
un experto en la materia, por ejemplo, por el procedimiento descrito
en la US Pharmacopea.
El tacrólimo obtenido directamente de la columna
o después de la separación de iones plata puede purificarse más
mediante un proceso de cristalización, que comprende preferentemente
disolver la muestra final en una mezcla de
2-propanol y n-heptano, seguido de
filtración. El filtrado se combina preferentemente a continuación
con una mezcla de agua y n-heptano, seguido de
enfriamiento para obtener un precipitado. El precipitado se
recupera a continuación preferentemente por filtración y lavado con
agua y a continuación con n-heptano seguido de
secado.
Preferentemente, antes de recuperar el
precipitado, el filtrado combinado con la mezcla de disolventes se
mantiene durante aproximadamente 24 horas.
La muestra más purificada contiene
preferentemente tacrólimo con una pureza mayor que la obtenida con
el procedimiento cromatográfico. Por lo general, después de la
cristalización, las concentraciones de cualquier resto de ascomicina
y dihidrotacrólimo disminuyen más, y la concentración de tacrólimo
aumenta. Preferentemente, la muestra purificada contiene por lo
menos 97 por ciento de área por HPLC de tacrólimo, más
preferentemente, por lo menos aproximadamente 99 por ciento de área
por HPLC o por lo menos 99,5% y aún más preferentemente, por lo
menos 99,9 por ciento de área por HPLC.
Una vez así descrita la invención haciendo
referencia a formas de realización preferidas específicas y ejemplos
ilustrativos, pueden los expertos en la materia pueden apreciar
modificaciones a la invención como las descritas e ilustradas que
no se apartan del alcance de la invención tal como se da a conocer
en la memoria. Se proporcionan ejemplos no limitativos del alcance
la invención para una mayor comprensión de la misma.
Columna: Waters Symmetry C_{18} 4,6x150
mm 3,5 \mum
Fase Mobil: A: Se pesan 200 ml de
acetonitrilo en un matraz volumétrico de 2.000 ml, se rellena el
matraz con agua destilada y a continuación se añaden 100 \mul de
CH_{3}COOH al 50 por ciento (pH=4,0)
B: Se añaden 100 \mul de CH_{3}COOH al 50% a
2.000 ml de acetonitrilo.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA DE
GRADIENTE
\vskip1.000000\baselineskip
Caudal: 2,2 ml/min
Longitud de onda de detección: 200 mg
Volumen de inyección: 20 \mul
Diluyente: Acetonitrilo
Temperatura de la muestra: 20ºC
Temperatura de la columna: 60ºC
Tiempo de estabilización: 47 minutos
- Tiempo de retención típico:
- tacrólimo 24,5 min
- \quad
- Tac.I (ascomicina) RRt=0,91
- \quad
- Tac.II (dihidrotacrólimo) RRt=1,35
Los ejemplos marcados con un asterisco (*) se
proporcionan únicamente como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
1
Se disolvió nitrato de plata (10,0 g) en metanol
caliente (500 ml), seguido de adición de alúmina (óxido de aluminio
básico activo 90, 63 - 200 \mum, actividad II - III, fabricado por
Merck, 100 g) para obtener una suspensión. La suspensión se evaporó
a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo se secó al vacío
(300 mbares) a 70ºC durante 5 horas. Contenido en plata: 10 por
ciento p/p.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
2
Una columna de vidrio (22 mm de diámetro, 100 mm
de altura de lecho, relleno seco) se rellenó con alúmina modificada
con nitrato de plata (40 g) preparada según el Ejemplo 1, y la
columna se lavó con la fase móvil (aproximadamente 200 ml), que
contenía 50 por ciento (v/v) de acetona y 50 por ciento (v/v) de
n-hexano. tacrólimo en bruto (306 mg), que
contenía, según el análisis HPLC, 79,7 por ciento de tacrólimo, 7,9
por ciento de ascomicina y 3,8 por ciento de dihidrotacrólimo, se
disolvió en la fase móvil (10 ml), y la solución se cargó en la
columna. Se eluyó la columna mediante la fase móvil
(aproximadamente 20 ml/min) y se recogieron fracciones de 30 ml. Se
analizaron las fracciones por HPLC, y el cromatograma reconstruido
se presenta en la figura 1. Las primeras cuatro fracciones que
representan la ascomicina y el dihidrotacrólimo separados, se
concentraron a sequedad. El residuo (52 mg) contenía 2,1 por ciento
de tacrólimo, 31,7 por ciento de dihidrotacrólimo, y 63,0 por ciento
de ascomicina, según el análisis HPLC. Las tres fracciones
intermedias siguientes se concentraron a sequedad (15 mg), y según
el análisis HPLC, contenían 37,5 por ciento de tacrólimo. Las
fracciones posteriores, que contenían tacrólimo purificado (15
fracciones), se concentraron proporcionando 223 mg de residuo que se
analizó por HPLC, y se demostró que contenían 95,54 por ciento de
tacrólimo, 0,20 por ciento de ascomicina y 0,04 por ciento de
dihidrotacrólimo.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
3
La columna según el Ejemplo 2 se lavó con una
fase móvil consistente en 40 por ciento (v/v) de acetona y 60 por
ciento (v/v) de n-hexano. El tacrólimo en bruto (321
mg, 79,7 por ciento de tacrólimo, 7,9 por ciento de ascomicina y
3,8 por ciento de dihidrotacrólimo) se disolvió en la fase móvil (10
ml) y a continuación se cargó en la columna. La elución se realizó
con la fase móvil (350 ml) que contenía 40 por ciento de acetona y
60 por ciento n-hexano (v/v), y el eluido se
concentró a sequedad, proporcionando 59 mg de residuo, que contenía
según el análisis HPLC, 3,3 por ciento de tacrólimo, 34,5 por ciento
de dihidrotacrólimo y 67,0 por ciento de ascomicina. La columna se
eluyó a continuación con acetona (250 ml) y el eluido se concentró
para proporcionar 218 mg de residuo seco, que contenía 95,7 por
ciento de tacrólimo, 0,09 por ciento de ascomicina y 0,03 por
ciento de dihidrotacrólimo.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
4
Se disolvió tacrólimo (3,8 g) en acetona (15,6
ml). La solución se pasó a través de un lecho adsorbente de alúmina
modificada con plata (que contenía aproximadamente 10 por ciento de
plata p/p), de 85 cm de altura que se colocó en una columna de
vidrio, que tiene un diámetro 3,2 cm. La columna se eluyó a
continuación con acetona. El ritmo de elución fue de 30 ml/hora.
Una fracción contenía 0,3 por ciento de dihidrotacrólimo, 0,45 por
ciento de ascomicina y 93,0 por ciento de tacrólimo.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
5
El tacrólimo en bruto (2 g) que contenía, según
el análisis HPLC, 1,2 por ciento de ascomicina y 1,8 por ciento de
dihidrotacrólimo, se disolvió en acetona (20 ml). La solución se
pasó a través de un lecho adsorbente de alúmina modificada con
plata (200 g, que contenía aproximadamente 10 por ciento de plata
p/p). El lecho adsorbente se eluyó a continuación con acetona, se
recogieron fracciones de 50 ml y se analizaron por HPLC. El
cromatograma reconstruido se presenta en la figura 2. Las primeras
tres fracciones que contenían macrólidos se concentraron
proporcionando 0,41 g de residuo seco, que contenía, según el
análisis HPLC 6,1 por ciento de ascomicina y 9,4 por ciento de
dihidrotacrólimo. Las siguientes siete fracciones se concentraron
proporcionando 1,53 g de residuo seco que contenía, según el
análisis HPLC 0,18 por ciento de ascomicina y 0,06 por ciento de
dihidrotacrólimo.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
6
Se disolvió tacrólimo (3,8 g) en acetona (15,6
ml). La solución se pasó a través de un lecho adsorbente de alúmina
activada neutra modificada con plata (que contenía aproximadamente
10 por ciento de plata p/p), de 85 cm de altura que se colocó en
una columna de vidrio de 3,2 cm de diámetro. El lecho adsorbente se
eluyó a continuación con acetona y acetato de etilo en un
proporción acetona:acetato de etilo de 70:30. El ritmo de elución
fue de 90 ml/hora. Una fracción contenía 0,07 por ciento de
dihidrotacrólimo, 0,39 por ciento de ascomicina y 94,7 por ciento
de tacróli-
mo.
mo.
\newpage
* Ejemplo
7
\global\parskip0.930000\baselineskip
Se disolvió nitrato de plata (75,0 g) en metanol
caliente (1.400 ml), seguido de adición de alúmina (óxido de
aluminio ácido activo 90, 63 a 200 \mum, actividad I, fabricado
por Merck, 750 g) para obtener una suspensión. La suspensión se
evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio. El residuo se secó al
vacío. El residuo tenía un contenido en plata del 10 por ciento
p/p.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
8
Tacrólimo (6,0 g) que contenía, según el
análisis HPLC 1,03 por ciento de ascomicina y 1,85 por ciento de
dihidrotacrólimo, se disolvió en una mezcla disolvente (24 ml) de
acetona y acetato de etilo en una proporción acetona:acetato de
etilo de 70:30. La solución se pasó a través de un lecho adsorbente
de alúmina ácida activa modificada con plata (que contenía
aproximadamente 10 por ciento de plata p/p), que tiene una altura de
85 cm que se colocó en una columna de vidrio de 3,2 cm de diámetro.
La columna se eluyó a -5ºC con acetona y acetato de etilo en una
proporción de acetona:acetato de etilo de 70:30. El ritmo de elución
fue de 90 ml/hora. Se recogieron las fracciones y se analizaron por
HPLC. La principal fracción seleccionada se evaporó y se
cristalizó. Según el análisis HPLC el producto contenía 96,25 por
ciento de tacrólimo, 0,22 por ciento de ascomicina y 0,04 por
ciento de dihidrotacrólimo.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
9
El residuo seco obtenido por evaporación de las
fracciones de tacrólimo después de la cromatografía en una alúmina
modificada con plata (55,3 g) se disolvió en una mezcla de
2-propanol (150 ml) y n-heptano (150
ml), seguido de filtración de la solución. El filtrado se diluyó a
continuación con agua (250 ml) y n-heptano (250
ml), y la mezcla resultante se enfrió y se agitó durante 24 horas.
Se filtró el producto cristalino precipitado, se lavó con agua y
n-heptano y se secó. Se obtuvieron 47,8 g de
tacrólimo cristalino. Según el análisis HPLC el producto contenía
99,1 por ciento de tacrólimo, 0,33 por ciento de tautómero II de
tacrólimo, 0,18 por ciento de tautómero I de tacrólimo, 0,11 por
ciento de ascomicina y 0,04 por ciento de dihidrotacrólimo.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
10
Se disolvió nitrato de plata (20 g) en metanol
caliente (650 ml). Se añadió óxido de aluminio (750 g) (neutro
activado, Merck 0,063-0,200 mm, etapa I de
actividad) en la solución para obtener una suspensión. La suspensión
se concentró a presión reducida hasta sequedad. El contenido en
plata de la suspensión seca fue de 2,5 por ciento p/p.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
11
Se disolvió nitrato de plata (20 g) en metanol
caliente (650 ml). Se añadió gel de sílice en fase inversa (330 g)
(LiChroprep RP-18, Merck) en la solución para
obtener una suspensión. La suspensión se concentró a presión
reducida hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
12
Se disolvió nitrato de plata (30 g) en metanol
caliente (650 ml). Se añadió la resina de adsorción XAD 1180 (650
g) en la solución para obtener una suspensión. La suspensión se
concentró a presión reducida hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
13
Se disolvió nitrato de plata (30 g) en metanol
caliente (650 ml). Se añadió la resina de adsorción SP 207 (650 g)
en la solución para obtener una suspensión. La suspensión se
concentró a presión reducida hasta sequedad.
\global\parskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
14
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se disolvió nitrato de plata (30 g) en metanol
caliente (650 ml). Se añadió la resina de adsorción Amberchrom GC
300 M (650 g) en la solución para obtener una suspensión. La
suspensión se concentró a presión reducida hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
15
Se disolvió nitrato de plata (30 g) en metanol
caliente (650 ml) calentando a la temperatura de reflujo. Se añadió
la resina de adsorción Amberchrom GC 300 S (650 g) en la solución
para obtener una suspensión. La suspensión se concentró a presión
reducida hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
16
Se disolvió nitrato de plata (30 g) en metanol
caliente (650 ml). Se añadió la resina del intercambiador catiónico
SK 104 (650 g) en la solución para obtener una suspensión. La
suspensión se concentró a presión reducida hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
17
Se disolvió nitrato de plata (30 g) en metanol
caliente (650 ml). Se añadió la resina del intercambiador aniónico
IRA 68 (650 g) en la solución para obtener una suspensión. La
suspensión se concentró a presión reducida hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
18
Se disolvió nitrato de plata (20 g) en agua (500
ml) a temperatura ambiente. La solución concentrada de amoniaco de
40 ml se añadió a la solución de nitrato de plata en varias
porciones en presencia de gel de sílice en fase inversa de 330 g
(LiChroprep RP-18, Merck). La solución se concentró
minuciosamente a alto vacío hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
19
Se disolvió nitrato de plata (30 g) en metanol
caliente (650 ml). Se añade la resina del intercambiador aniónico
IRA 900 (650 g) en la solución para obtener una suspensión. La
suspensión se concentró a presión reducida hasta sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió nitrato de plata (10,0 g) en metanol
caliente (500 ml) y gel de ciano-sílice (gel de
sílice 100 CN, 15-35 \mum, fabricado por Fluka,
100 g) se añadió en la solución para obtener una suspensión. La
suspensión se evaporó a sequedad en un evaporador rotativo. El
residuo se secó al vacío (30 mbares) a 70ºC durante 5 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se rellenó una columna cromatográfica (25 mm de
diámetro, 250 mm de longitud) con el adsorbente preparado en el
Ejemplo 20 (54,4 g), y la columna se lavó con la fase móvil (mezcla
de acetona y n-hexano 25:75, 1.000 ml). A
continuación se disolvió en la fase móvil (25 ml) tacrólimo en bruto
(510 mg) (79,7 por ciento de tacrólimo, 7,9 por ciento de
ascomicina y 3,8 por ciento de dihidrotacrólimo), se cargó en la
columna y la columna se eluyó con la fase móvil. Se
tomaron fracciones de 100 ml cada una y se analizaron por HPLC. El cromatograma reconstruido está en la figura 3.
tomaron fracciones de 100 ml cada una y se analizaron por HPLC. El cromatograma reconstruido está en la figura 3.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió nitrato de plata (10,0 g) en metanol
caliente (500 ml) y gel de sílice (gel de sílice 60,
15-40 \mum, fabricado por Merck, 100 g) se añadió
a la solución, para obtener una suspensión. La suspensión se
evaporó a sequedad en un evaporador rotativo. El residuo se secó al
vacío (30 mbares) a 70ºC durante 8 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
23
Se rellenó una columna cromatográfica (25 mm de
diámetro, 250 mm de longitud) con el adsorbente preparado en el
Ejemplo 26 (62,6 g), y la columna se lavó con la fase móvil (mezcla
de acetona y n-hexano 20:80, 1.000 ml). A
continuación se disolvió en la fase móvil (25 ml) tacrólimo en bruto
(500 mg) (79,7 por ciento de tacrólimo, 7,9 por ciento de
ascomicina y 3,8 por ciento de dihidrotacrólimo), se cargó en la
columna y la columna se eluyó con la fase móvil. Se
tomaron fracciones de 100 ml cada una y se analizaron por HPLC. El cromatograma reconstruido está en la figura 5.
tomaron fracciones de 100 ml cada una y se analizaron por HPLC. El cromatograma reconstruido está en la figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
24
Se disolvió nitrato de plata (20,0 g) en metanol
caliente (1.000 ml) y se añadió a la solución óxido de circonio
(fabricado por Merck, 200 g), para obtener una suspensión. La
suspensión se evaporó a sequedad en un evaporador rotativo. El
residuo se secó al vacío (30 mbares) a 70ºC durante 5 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
25
Se rellenó una columna cromatográfica (25 mm de
diámetro, 250 mm de longitud) con el adsorbente preparado en el
Ejemplo 24 (345 g) (se repitió la preparación del absorbente), y la
columna se lavó con la fase móvil (aproximadamente 1.000 ml)
(mezcla de acetona y n-hexano 10:90). A
continuación, se disolvió en la fase móvil (25 ml) tacrólimo en
bruto (210 mg) (79,7 por ciento de tacrólimo, 7,9 por ciento de
ascomicina y 3,8 por ciento de dihidrotacrólimo), se cargó en la
columna y la columna se eluyó con la fase móvil. Se recogieron
fracciones de 100 ml cada una y se analizaron por HPLC. El
cromatograma reconstruido está en la figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
26
La principal fracción seleccionada recogida
según los Ejemplos 6 y 8 se evaporó a sequedad a presión reducida.
El residuo se disolvió en acetato de etilo (20 veces el volumen del
residuo). Se disolvió NH_{4}Cl (1,3 veces la masa del residuo) en
agua (5 veces el volumen del residuo) y la solución salina se añadió
a la solución de acetato de etilo. Tras 30 minutos de agitación se
filtró el cloruro de plata precipitado y se separaron las fases. Se
cristalizó el macrólido en la fase de acetato de etilo.
\vskip1.000000\baselineskip
* Ejemplo
27
El eluido de la columna se observó que contenía
aproximadamente 80 mg/l de plata. El eluido se pasó a través de una
columna rellena con un gel de sílice modificado con cloruro sódico.
La plata se retuvo completamente en la columna. El contenido en
plata fue inferior a 10 ppm. La gel de sílice modificada se preparó
añadiendo una solución acuosa de cloruro sódico a un gel de sílice
seguido de homogeneización.
Claims (39)
1. Procedimiento para separar tacrólimo de las
impurezas que comprende:
- a)
- cargar una mezcla compuesta de tacrólimo e impurezas en un lecho de adsorbente pretratado con iones plata, en el que el adsorbente es gel de ciano sílice; y
- b)
- eluir la mezcla del lecho de resina adsorbente para separar el tacrólimo de las impurezas presentes en la mezcla.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la mezcla se eluye con un eluyente anhidro, en el que el
eluyente anhidro presenta preferentemente menos de aproximadamente
2% de agua en volumen.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que las impurezas son la ascomicina y
el dihidrotacrólimo.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el eluyente anhidro se selecciona
de entre el grupo constituido por disolventes orgánicos polares y
mezclas de disolventes orgánicos polares y disolventes orgánicos
apolares.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el disolvente orgánico polar se selecciona de entre el grupo
constituido por cetonas C_{3-9} lineales o
ramificadas, ésteres C_{3-7} lineales o
ramificados, alcoholes C_{1-7} lineales o
ramificados, éteres C_{2-8} lineales, ramificados
o cíclicos, nitrilos C_{2-5} y mezclas de los
mismos.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el disolvente orgánico polar se selecciona de entre el grupo
constituido por hidrocarburo C_{5-8} lineal,
ramificado o cíclico, hidrocarburo aromático
C_{6-10} y mezclas de los mismos.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, en el que el eluyente se selecciona de entre
el grupo constituido por acetona, metiletil-cetona,
metilisobutil-cetona, acetato de etilo, acetato de
n-propilo, acetato de isopropilo, acetato de
n-butilo, propionato de etilo, metanol, etanol,
isopropanol, n-propanol, n-butanol,
isobutanol, éter terc-butilmetílico, éter dietílico,
éter diisopropílico, tetrahidrofurano acetonitrilo, tolueno, y
hexano lineal, ramificado o cíclico, heptano, octano, ciclohexano y
cicloheptano.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el eluyente anhidro comprende acetona, hexano o acetato de
etilo.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el eluyente anhidro comprende acetona y hexano, en el que la
acetona y el hexano están presentes en una relación de acetona a
hexano de aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:3, aproximadamente
1:4 o aproximadamente 1:9.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el eluyente es una mezcla de acetona y acetato de etilo, y
la acetona y el acetato de etilo están presentes en aproximadamente
50-80% de acetona por volumen comparada con el
acetato de etilo.
11. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el eluyente anhidro es la acetona.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 11, en el que el tacrólimo se eluye con una
elución por gradiente, comenzando la elución con una mezcla de
disolventes, seguida de la elución con aproximadamente 100 por cien
de un solo disolvente, preferentemente en el que la elución por
gradiente comprende comenzar la elución con una mezcla que
comprende acetona y hexano, seguida de la elución con acetona.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la acetona y el hexano están presentes en una relación de
acetona a hexano de aproximadamente 3:2 v/v.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la mezcla se eluye con una
elución por gradiente con una columna de aproximadamente 10 cm o
menos de longitud.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la mezcla se eluye sin una
elución por gradiente con una columna de por lo menos
aproximadamente 1 m de longitud.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que el procedimiento comprende
rellenar una columna con el adsorbente modificado con plata, lavar
el adsorbente modificado con plata con un eluyente, cargar una
solución de tacrólimo en el eluyente en la columna y eluir el
tacrólimo, la ascomicina y el dihidrotacrólimo de la columna.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que por lo menos uno de entre la
ascomicina y el dihidrotacrólimo se eluye de la columna antes que el
tacrólimo.
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que el tacrólimo antes de la
separación comprende hasta aproximadamente 10 por ciento de área
por HPLC de ascomicina y/o hasta aproximadamente 6 por ciento de
área por HPLC de dihidrotacrólimo.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que el adsorbente presenta una
superficie específica de por lo menos aproximadamente 50
m^{2}/g.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, que comprende además preparar el adsorbente
modificado con plata en un procedimiento que comprende mezclar el
adsorbente, una fuente de cationes de plata, y un disolvente
seleccionado de entre el grupo constituido por uno o más alcoholes
C_{1-4}, agua y una mezcla de agua y un
disolvente miscible en agua, y secar.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que el gel de ciano sílice comprende
un gel de sílice unido de manera covalente en su superficie al grupo
cianoalquilo.
22. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que el disolvente es un alcohol C_{1-4}, y la
fuente de catión plata y el alcohol C_{1-4} se
combinan para formar una solución, y el adsorbente se añade a
continuación para formar una suspensión, y preferentemente en el
que el alcohol C_{1-4} es el metanol.
23. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que el disolvente es un alcohol C_{1-4}, y la
fuente de ión plata y el alcohol C_{1-4} se
calientan a aproximadamente la temperatura de reflujo del disolvente
para obtener una solución.
24. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que el disolvente es agua o una mezcla de agua y un disolvente
miscible en agua, el adsorbente es un gel de sílice en fase inversa,
la fuente de ión plata se disuelve a temperatura ambiente, y, antes
del secado, se añade una solución de amoniaco a la solución de
disolvente y fuente de catión plata.
25. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que la fuente de cationes plata es una solución de una sal de
plata o de un complejo de plata, y preferentemente en el que la
fuente de cationes plata comprende por lo menos uno de entre
nitrato de plata y acetato de plata.
26. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que la fuente de cationes plata se selecciona de entre el grupo
constituido por nitrato de plata, acetato de plata, sulfato de
plata, un complejo plata ciano y un complejo de tiosulfato de
plata.
27. Procedimiento según la reivindicación 25, en
el que la fuente de cationes plata comprende un complejo de plata
ciano.
28. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que el adsorbente modificado con plata, después del secado,
comprende aproximadamente 0,1 a aproximadamente 15 por ciento p/p de
sal de plata.
29. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, en el que el tacrólimo separado comprende
por lo menos aproximadamente 93 por ciento de área por HPLC del
tacrólimo.
30. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, en el que el tacrólimo separado comprende
menos de aproximadamente 0,20 por ciento de área por HPLC de
ascomicina.
31. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, en el que el tacrólimo separado comprende
menos de aproximadamente 0,04 por ciento de área por HPLC de
dihidrotacrólimo.
32. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 28, que comprende además separar cualesquier
iones de plata eluidos con el tacrólimo procedentes del
tacrólimo.
33. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 32, que comprende evaporar el eluyente para
obtener un residuo, disolver el residuo en un disolvente orgánico,
mezclar la solución resultante con una solución que comprende un
reactivo que precipita iones plata, y filtrar la sal de plata
precipitada, en el que el disolvente orgánico es preferentemente
seleccionado de entre un grupo constituido por: acetato de etilo,
tolueno, acetato isopropilo o normal, acetato de
n-butilo, acetato de isobutilo, acetona,
metiletil-cetona,
metilisobutil-cetona, etanol, propanol,
n-butanol, isobutanol, mezclas de acetato de etilo y
acetona, mezclas de tolueno y acetona y mezcla de los mismos con
agua, y más preferentemente en el que el disolvente orgánico es el
acetato de etilo.
34. Procedimiento según la reivindicación 33, en
el que el reactivo comprende un contraión seleccionado de entre un
grupo constituido por acetato, sulfato, nitrito, bromato,
salicilato, yodato, cromato, carbonato, citrato, fosfato, cloruro,
estearato, sulfuro, bromuro, yoduro, cianuro, benzoato, oxalato,
sulfito, y tiocianato, y preferentemente en el que el reactivo
precipitante es NH_{4}Cl o cloruro de sodio.
35. Procedimiento según la reivindicación 33,
que comprende además la adición del reactivo precipitante en una
cantidad de 1 a aproximadamente 5 equivalentes molares por
equivalente molar de plata.
36. Procedimiento según la reivindicación 33, en
el que la solución comprende un reactivo que precipita iones plata
en una solución acuosa.
37. Procedimiento según la reivindicación 33,
que comprende pasar el eluido a través de una columna rellena con
una mezcla de gel de sílice y un agente de precipitación.
38. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 37, que comprende además recoger por lo menos
una fracción de efluente que presenta tacrólimo.
39. Procedimiento según la reivindicación 38,
que comprende además la cristalización del tacrólimo separado.
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| ES07753283T Active ES2344531T3 (es) | 2006-03-15 | 2007-03-15 | Procedimiento para purificar tacrolimo. |
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2007
- 2007-03-15 ES ES07753283T patent/ES2344531T3/es active Active
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