ES2375923T3 - Promotores de arroz. - Google Patents

Abstract

1. Una construcción genética que comprende: i) un promotor aislado capaz de dirigir y/o de regular la expresión en tejido verde de una planta, que comprende: a. un ácido nucleico aislado como el presentado en la SEQ ID NO. 14 o el complemento de la SEQ ID NO. 14; o b. un ácido nucleico aislado que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con secuencias de ADN como las presentadas en la SEQ ID NO. 14; o c. un ácido nucleico aislado que hibrida específicamente bajo condiciones rigurosas con secuencias de ADN como las presentadas en la SEQ ID NO. 14; o d. un ácido nucleico aislado como el definido en cualquiera de los ítems (a) hasta (c), que está interrumpido por una secuencia interviniente; o e. un fragmento de al menos 250 pb de cualquiera de los ácido nucleicos como los definidos en (a) hasta (d), cuyo fragmento es capaz de dirigir y/o de regular la expresión y ii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo operativamente enlazada a un promotor aislado de (i), y opcionalmente iii) un terminador 3' de la transcripción.

Description

Promotores de arroz

La presente invención se relaciona con el campo de biología molecular de las plantas, más particularmente con secuencias de ácido nucleico útiles para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico operativamente enlazado en plantas. Se divulga el aislamiento de estas secuencias de ácido nucleico del arroz, así como su uso para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico operativamente enlazado. La presente invención se relaciona por lo tanto con promotores, promotores híbridos, construcciones genéticas, casetes de expresión, vectores de transformación, vectores de expresión, células huésped y plantas transgénicas que contienen a los ácidos nucleicos aislados de acuerdo con la presente invención. La presente invención también se relaciona con métodos para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico y con métodos para la producción de plantas transgénicas.

La expresión génica depende de la iniciación de la transcripción, que es mediada a través del complejo de iniciación de la transcripción. La expresión génica también depende de la regulación de la transcripción, la cual determina que tan fuerte, cuándo o donde se expresa un gen. Dicha regulación de la expresión génica puede ser mediada a través de elementos de control transcripcional, que están generalmente embebidos en la secuencia de ácido nucleico que flanquea a 5’ o secuencia arriba del gen expresado. Esta región secuencia arriba del ácido nucleico es a menudo denominada como “promotora” ya que promueve el enlazamiento, la formación y/o la activación del complejo de iniciación de la transcripción y por lo tanto es capaz de dirigir y/o de regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico secuencia abajo 3’.

La modificación por medio de ingeniería genética de plantas con el ánimo de obtener un fenotipo de planta útil, a menudo involucra expresión génica heteróloga, que es generalmente mediada por un promotor capaz de dirigir y/o de regular la expresión de un ácido nucleico heterólogo operativamente enlazado. El fenotipo de la planta huésped no depende únicamente de la contribución del ácido nucleico heterólogo, sino también de la contribución del patrón específico de expresión del promotor escogido que determina cómo, donde y cuando se expresa ese ácido nucleico heterólogo. Por lo tanto, la escogencia del promotor con un patrón de expresión adecuado es de importancia crucial para obtener el fenotipo adecuado. Una persona capacitada en el arte deberá tener diferentes promotores disponibles, para determinar al promotor óptimo para un ácido nucleico particular. Para muchas plantas huésped diferentes, esta disponibilidad está bastante limitada y por lo tanto existe la necesidad permanente de proveer nuevos promotores con diferentes perfiles de expresión. El ácido nucleico como el presentado en la SEQ ID NO. 14 fue aislado de Oryza sativa y se ha encontrado que es capaz de dirigir y regular la expresión en tejido verde de una planta de un ácido nucleico operativamente enlazado. Por lo tanto la presente invención ofrece un ácido nucleico aislado desconocido hasta ahora, el cual es útil como promotor.

Por lo tanto, la presente invención provee

i) un promotor aislado capaz de dirigir y/o de regular la expresión en tejido verde de una planta, que comprende:

(a)

un ácido nucleico aislado como el presentado en la SEQ ID NO. 14 o el complemento de la SEQ ID NO. 1; o

(b)

un ácido nucleico aislado que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con secuencias de ADN como las presentadas en la SEQ ID NO. 14; o

(c)

un ácido nucleico aislado que hibrida específicamente bajo condiciones rigurosas con secuencias de ADN como las presentadas en la SEQ ID NO. 14; o

(d)

un ácido nucleico aislado como el definido en cualquiera de los ítems (a) hasta (c), que está interrumpido por una secuencia interviniente; o

(e)

un fragmento de al menos 250 pb de cualquiera de los ácido nucleicos como los definidos en (a) hasta (d), cuyo fragmento es capaz de dirigir y/o de regular la expresión y

ii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo operativamente enlazada a un promotor aislado de (a), y opcionalmente

iii) un terminador 3’ de la transcripción.

El término “aislado” como se utiliza aquí significa que ha sido removido de su fuente original. Preferiblemente, el promotor “aislado” está libre de secuencias (tal como secuencias que codifican proteína u otras secuencias en el extremo 3’) que naturalmente flanquean al promotor en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el

promotor. Preferiblemente además, el promotor “aislado” está libre también de secuencias que naturalmente lo flanquean en el extremo 5’. Preferiblemente además, el promotor “aislado” puede incluir aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1.2 kb, 1 kb, 0.8 kb, 0.5 kb ó 0.1 kb de secuencias de ácido nucleico que naturalmente se presentan con el promotor en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el promotor.

La presente solicitud no está limitada a ácidos nucleicos como los presentados por la SEQ ID NO. 14. Una persona capacitada en el arte se dará cuenta que pueden presentarse variantes o fragmentos de un ácido nucleico, mientras se mantenga la misma funcionalidad. Estas variantes o fragmentos pueden ser hechos por el hombre (por ejemplo por medio de ingeniería genética) o incluso pueden presentarse en la naturaleza. Por lo tanto la presente solicitud se extiende a diferentes ácidos nucleicos y fragmentos de la SEQ ID NO. 14, en donde las variantes o fragmentos son útiles en los métodos de la presente invención. Tales variantes y fragmentos incluyen:

(a)

un ácido nucleico aislado como el presentado en la SEQ ID NO. 14 o el complemento de la SEQ ID NO. 14; o

(b)

un ácido nucleico aislado que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con secuencias de ADN como las presentadas en la SEQ ID NO. 14; o

(c)

un ácido nucleico aislado que hibrida específicamente bajo condiciones rigurosas con secuencias de ADN como las presentadas en la SEQ ID NO. 14; o

(d)

un ácido nucleico aislado como el definido en cualquiera de los ítems (a) hasta (c), que está interrumpido por una secuencia interviniente; o

(e)

un fragmento de al menos 250 pb de cualquiera de los ácido nucleicos como los definidos en (a) hasta (d), cuyo fragmento es capaz de dirigir y/o de regular la expresión.

Las variantes adecuadas de la SEQ ID NO. 14 abarcan homólogos que tienen en orden creciente de preferencia al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con ácidos nucleicos como los representados en la SEQ ID NO. 14.

El porcentaje de identidad puede ser calculado utilizando un programa de alineación. Preferiblemente se puede utilizar un programa de alineación global por parejas, que implementa el algoritmo de Needleman-Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 - 453, 1970). Este algoritmo maximiza el número de coincidencia y minimiza el número de brechas. Tales programas son por ejemplo GAP, Needle (paquete EMBOSS), ensanchador (paquete EMBOSS) o Align X (Vector NTI suite 5.5) y pueden utilizar los parámetros estándar (por ejemplo penalización por abertura de brecha de 6,66). Alternativamente, se puede utilizar un programa de alineación local que implementa el algoritmo de Smith-Waterman (Advances in Applied Mathematics 2, 482 - 489 (1981)). Tales programas son por ejemplo Water (paquete EMBOSS) o emparejador (paquete EMBOSS). "Identidad de secuencia" como se utiliza aquí se calcula preferiblemente sobre la longitud completa de promotores como los representados por la SEQ ID NO. 14. La longitud de este promotor está presentada en la Tabla 2.

La búsqueda e identificación de ácidos nucleicos homólogos, estaría dentro del campo de conocimientos de una persona capacitada en el arte. Tales métodos, involucran la escogencia en bases de datos de secuencias con las secuencias suministradas por la presente invención, por ejemplo la SEQ ID NO. 14, preferiblemente en una forma que puede ser leída por un ordenador. Las bases de datos de secuencias útiles, incluyen pero no se limitan al Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank), la European Molecular Biology Laboratory Nucleic acid Database (EMBL) (http:/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html) o versiones de la misma, o la base de datos MIPS (http://mips.gsf.de/). Se conocen bien en el arte diferentes algoritmos y programas de búsqueda para la alineación y comparación de secuencias. Tales programas incluyen, por ejemplo GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. Preferiblemente se utiliza el programa BLAST, que calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las secuencias. El juego de programas denominado como programas BLAST tiene 5 usos diferentes: tres diseñados para preguntas de secuencias de nucleótidos (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos diseñados para preguntas de secuencias de proteínas (BLASTP y TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76 - 80, 1994; Birren et al., GenomeAnalysis, 1: 543, 1997). El programa para llevar a cabo el análisis por BLAST se encuentra públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information.

Las secuencias del genoma de Arabidopsis thaliana y el genoma de Oryza sativa se encuentran ahora disponibles en bases de datos públicas tales como el Genbank. Otros genomas están siendo secuenciados actualmente. Por lo tanto, se espera que entre más secuencias de los genomas de otras plantas se encuentren disponibles, se pueden identificar promotores homólogos por medio de alineación de secuencias con la SEQ ID NO. 14. La persona experta podría encontrar fácilmente promotores homólogos de otras especies de plantas, por ejemplo de otras plantas de cultivo, tales como maíz. Los promotores homólogos de otras plantas de cultivo son especialmente útiles para llevar a cabo los métodos de la presente invención en plantas de cultivo.

Un ejemplo de homólogos que tienen al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 14 son variantes alélicas de la SEQ ID NO. 14. Las variantes alélicas son variantes del mismo gen que se presentan en dos individuos diferentes de la misma especie y usualmente las variantes alélicas se diferencian por medio de ligeros cambios en la secuencia. Las variantes alélicas pueden incluir a los Polimorfismos de Nucleótidos Individuales (SNP por sus siglas en inglés) así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Supresión (INDEL por sus siglas en inglés). El tamaño de los INDEL es usualmente menor a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos.

Los homólogos adecuados para uso en los métodos de acuerdo con la invención pueden ser aislados fácilmente a partir de su organismo fuente a través de la técnica de PCR o de hibridación. Su capacidad de dirigir y/o de regular la expresión puede ser fácilmente determinada, por ejemplo, siguiendo los métodos descritos en la sección de Ejemplos simplemente sustituyendo la secuencia utilizada en el Ejemplo real con el homólogo.

Otras variantes adecuadas de la SEQ ID NO. 14 abarcadas por la presente solicitud son los ácidos nucleicos que hibridan específicamente bajo condiciones rigurosas con el ácido nucleico de la SEQ ID NO. 14. El término “hibridación” significa el apareamiento con secuencias complementarias de nucleótidos sustancialmente homólogas en un proceso de hibridación. Las herramientas en biología molecular confían en tales procesos de hibridación que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; y todos los métodos basados en la misma), hibridación sustractiva, extensión aleatoria del iniciador, mapeo de la nucleasa S1, extensión del iniciador, transcripción inversa, síntesis de ADNc, despliegue diferencial de los ARN, y determinación de la secuencia de ADN, transferencias tipo Northern (transferencias de ARN), transferencias tipo Southern (transferencias de ADN). El proceso de hibridación puede presentarse también con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a una matriz tal como perlas magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en biología molecular confían en procesos que incluyen el asilamiento de ARNm poli(A+). El proceso de hibridación puede presentarse además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a un soporte sólido tal como una membrana de nylon o de nitrocelulosa o inmovilizados por ejemplo por medio de fotolitografía, por ejemplo a un soporte de vidrio silíceo (este último conocido como arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido nucleico). Las herramientas en biología molecular confían en un proceso que incluye análisis de transferencias en gel de ARN y de ADN, hibridación de colonias, hibridación en placa, hibridación in situ e hibridación de microarreglos. Con el propósito de permitir que ocurra la hibridación, se desnaturalizan generalmente térmica o químicamente las moléculas de ácido nucleico para fundir una cadena doble en dos cadenas individuales y/o para remover horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal y la composición del amortiguador de hibridación. Las condiciones convencionales de hibridación están descritas, por ejemplo, en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, el experto se dará cuenta que se pueden diseñar muchas condiciones de hibridación diferentes en función de la homología y/o la longitud conocida o esperada de la secuencia de ácido nucleico. Las condiciones de alta rigurosidad para hibridación incluyen alta temperatura y/o baja concentración de sal/sodio (sales que incluyen sodio como por ejemplo en NaCl y en citrato Na3) y/o la inclusión de formamida en el amortiguador de hibridación y/o la disminución de la concentración de compuestos tales como SDS (detergente dodecil sulfato de sodio) en el amortiguador de hibridación y/o exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilén glicol (que promueve aglutinación molecular) del amortiguador de hibridación. Específicamente, hibridación bajo condiciones rigurosas significa que las secuencias tienen que ser muy similares. La hibridación específica bajo condiciones rigurosas se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de 60ºC seguida por lavados en 0,1 hasta 1X SSC, 0,1X SDS, y 1X SSC, 0,1X SDS.

La solicitud también se relaciona con una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que hibrida específicamente con cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. La solicitud también se relaciona con una molécula de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud que amplifica específicamente un ácido nucleico de la invención por medio de la reacción en cadena de la polimerasa.

Otra variante de la SEQ ID NO. 14 abarcada por la presente solicitud son los ácidos nucleicos correspondientes a la SEQ ID NO. 14 o variantes de la misma como se describe aquí más arriba, que están interrumpidos por una secuencia interviniente. Por ejemplo, ácidos nucleicos como los presentados en la SEQ ID NO. 14 pueden ser interrumpidos por una secuencia interviniente. Con “secuencias intervinientes” se entiende cualquier ácido nucleico o nucleótido, que interrumpe otra secuencia. Los ejemplos de secuencias intervinientes incluyen intrones, etiquetas de ácido nucleico, T-ADN y secuencias móviles de ácido nucleico tales como transposones o ácidos nucleicos que pueden ser movilizados a través de recombinación. Los ejemplos de transposones particulares incluyen Ac (activador), Ds (Disociación), Spm (supresor-Mutador) o En. La introducción de intrones dentro de los promotores es ampliamente aplicada hoy en día. Los métodos de acuerdo con la presente invención pueden también ser realizados utilizados una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO. 14 provista de un intrón. En el caso en que la secuencia interviniente sea un intrón, pueden surgir variantes alternativas de empalme de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. El término “variante alternativa de empalme” como se utiliza aquí abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la cual se han cortado, reemplazado o añadido los intrones

intervinientes. Tales variantes de empalme pueden ser encontradas en la naturaleza o ser elaboradas por el hombre. Los métodos para elaborar tales promotores con un intrón o para elaborar las correspondientes variantes de empalme son bien conocidos en el arte.

Las variantes interrumpidas por una secuencia interviniente, adecuadas para uso en los métodos de acuerdo con la invención pueden ser fácilmente determinadas por ejemplo siguiendo los métodos descritos en la sección de Ejemplos simplemente sustituyendo la secuencia utilizada en el Ejemplo real con la variante.

Las variantes de ácidos nucleicos como se describe aquí más arriba pueden ser encontradas en la naturaleza (por ejemplo variantes alélicas o variantes de empalme). Adicionalmente y/o alternativamente, el hombre puede elaborar variantes de cualquiera de las SEQ ID NO. 14 como se describió aquí anteriormente a través de técnicas bien conocidas en el arte que involucran por ejemplo mutación, sustitución, inserción, supresiones o derivación. La presente solicitud también abarca tales variantes, así como su uso en los métodos de la presente invención.

Una “variante de mutación” de un ácido nucleico puede ser fácilmente elaborada utilizando técnicas de manipulación de ADN recombinante o síntesis de nucleótidos. Los ejemplos de tales técnicas incluyen mutagénesis dirigida al sitio a través de mutagénesis M13, mutagénesis del Gen T7 in vitro (USB, Cleveland, OH), mutagénesis Dirigida al Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio. Alternativamente, el ácido nucleico de la presente invención puede ser mutado en forma aleatoria.

Una “variante de sustitución” se refiere a aquellas variantes en las cuales al menos un residuo en la secuencia de ácido nucleico ha sido removido y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de ácido nucleico son típicamente de residuos individuales, pero pueden ser agrupadas dependiendo de las restricciones funcionales ubicadas sobre la secuencia de ácido nucleico; las inserciones usualmente son del orden de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 residuos de ácido nucleico, y las supresiones pueden estar en el rango aproximadamente desde 1 hasta aproximadamente 20 residuos.

Una “variante de inserción” de un ácido nucleico es una variante en la cual se introducen uno o más residuos de ácido nucleico en un sitio predeterminado en ese ácido nucleico. Las inserciones pueden incluir fusiones en el terminal 5’ y/o en el terminal 3’ así como inserciones dentro de la secuencia de múltiples nucleótidos o de nucleótidos individuales. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de ácido nucleico serán más pequeñas que las fusiones en el terminal 5’ o en el terminal 3’, del orden aproximadamente de1 a 10 residuos. Los ejemplos de fusiones en el terminal 5’ o en el terminal 3’ incluyen las secuencias de codificación de dominios de enlazamiento o dominios de activación de un activador transcripcional como el utilizado en el sistema de doble híbrido en levadura o sistema de un híbrido en levadura, o de proteínas de recubrimiento de fago, etiqueta de (histidina)6, etiqueta de glutationa S-transferasa, proteína A, proteína de enlazamiento de maltosa, deshidrofolato reductasa, epítopo de Tag•100, epítopo de c-myc, epítopo de FLAG®, lacZ, CMP (péptido de enlazamiento de calmodulina), epítopo de HA, epítopo de proteína C y epítopo del VSV.

El término “derivado” de un ácido nucleico puede incluir sustituciones, y/o supresiones y/o adiciones de residuos de ácido nucleico de origen natural y no natural comparado con el ácido nucleico natural. Los derivados pueden, por ejemplo, incluir nucleótidos metilados, o nucleótidos artificiales.

También están incluidos dentro de la presente solicitud promotores, que contienen un fragmento de cualquier ácido nucleico como el representado por la SEQ ID NO. 14 o variantes del mismo como se describió aquí anteriormente. Un “fragmento” como se utiliza aquí significa una porción de una secuencia de ácido nucleico. Los fragmentos adecuados útiles en los métodos de la presente invención son fragmentos funcionales, que retienen al menos una de las partes funcionales del promotor y por lo tanto son capaces aún de dirigir y/o de regular la expresión. Los ejemplos de fragmentos funcionales de un promotor incluyen al promotor mínimo, los elementos reguladores secuencia arriba, o cualquier combinación de los mismos.

Los fragmentos adecuados pueden estar en el rango desde aproximadamente al menos 20 pares de bases o aproximadamente 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ó 1000 pares de bases, hasta aproximadamente la secuencia de longitud completa de la invención. Estos pares de bases están típicamente inmediatamente secuencia arriba del arranque del inicio de la transcripción, pero alternativamente pueden ser de cualquier parte en la secuencia del promotor.

Los fragmentos adecuados útiles en los métodos de la presente invención pueden ser analizados por su capacidad para dirigir y/o regular la expresión por medio de técnicas estándar bien conocidas por la persona capacitada, o por medio del siguiente método descrito en la sección de Ejemplos.

Se aísla un promotor como el divulgado en la SEQ ID NO. 14 como un ácido nucleico de aproximadamente 1,2 kb de la región secuencia arriba de las secuencias particulares de codificación del arroz (CDS). Este ácido nucleico

puede incluir elementos típicos de un promotor, que están presentadas en la Figura 1. Generalmente, un promotor puede incluir desde una secuencia de codificación hasta la dirección secuencia arriba: (i) un 5’UTR de ARN premensajero, (ii) un promotor mínimo que contiene el elemento de iniciación de la transcripción (INR) y más secuencia arriba una caja TATA, y (iii) puede contener elementos reguladores que determinan el patrón específico de expresión del promotor.

El término “promotor” como se utiliza aquí es tomado en un contexto amplio y se refiere a secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar (dirigir y/o regular) la expresión de las secuencias a las cuales ellas están operativamente enlazadas. Un “promotor” abarca secuencias reguladoras transcripcionales derivadas de un gen genómico clásico. Usualmente un promotor incluye una caja TATA, que es capaz de dirigir al complejo de iniciación de la transcripción al sitio de partida apropiado de iniciación de la transcripción. Sin embargo, algunos promotores no tienen una caja TATA (promotores sin TATA), pero aún son completamente funcionales para dirigir y/o regular la expresión. Un promotor puede incluir adicionalmente una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias de activación secuencia arriba o elementos cis tales como reforzadores y silenciadores). Un “promotor” puede incluir también las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso este puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de caja -10.

“Dirección de la expresión” como se utiliza aquí significa la promoción de la transcripción de un ácido nucleico.

“Regulación de la expresión” como se utiliza aquí significa influenciar el nivel, el tiempo o el lugar de la transcripción de un ácido nucleico. Los promotores de la presente invención pueden ser utilizados por lo tanto para incrementar, disminuir o cambiar en el tiempo y/o el lugar de la transcripción de un ácido nucleico. Por ejemplo, pueden ser utilizados para limitar la transcripción a ciertos tipos de células, tejidos u órganos, o durante un cierto periodo de tiempo, o en respuesta a ciertas condiciones ambientales.

El promotor es preferiblemente un promotor expresable de una planta. El término “expresable de una planta” significa que es capaz de regular la expresión en una planta, célula de la planta, tejido de la planta y/o, órgano de la planta.

El patrón de expresión de los promotores de acuerdo con la presente invención fue estudiado en detalle y se encontró que muchos de ellos eran específicos del tejido. Por lo tanto, la presente invención provee promotores “específicos del tejido”. El término “específico del tejido” se usará para indicar que la expresión está predominantemente en un tejido particular, tipo de tejido, órgano o cualquier otra parte del organismo aunque no necesariamente exclusivamente en dicho tejido, tipo de tejido, órgano u otra parte. Por lo tanto, la invención abarca un ácido nucleico aislado como se mencionó anteriormente, capaz de dirigir y/o de regular la expresión (de un ácido nucleico operativamente enlazado) en una forma específica del tejido. La expresión puede ser dirigida y/o regulada en la semilla, embrión, escutelo, aleurona, endospermo, hojas, flores, callos, meristemo, meristemo de brote, centro de discriminación, brote, meristemo de brote y raíz. En gramíneas el meristemo de brote se localiza en la así llamada zona de discriminación desde donde se originan el brote y las hojas.

Un promotor específico del tejido es un ejemplo del así llamado “promotor regulado”. Estos promotores son regulados por señales endógenas tales como la presencia de ciertos factores de transcripción, metabolitos, hormonas de la planta, o señales exógenas, tales como envejecimiento, estreses o estado nutricional. Estas regulaciones pueden tener un efecto sobre uno o más niveles diferentes como especificidad espacial o especificidad temporal. Abarcado dentro de la presente invención está un ácido nucleico como se describió aquí anteriormente, que es un “promotor regulado”. Ejemplos de promotores regulados son los promotores específicos de la célula, promotores específicos del tejido, promotores específicos de órganos, promotores específicos del ciclo celular, promotores inducibles o promotores específicos de tejido joven.

Alternativa y/o adicionalmente, algunos promotores de la presente invención muestran un patrón de expresión constitutivo. Por lo tanto, la presente invención provee un promotor como se describió aquí anteriormente, que es un promotor constitutivo. El término “constitutivo” significa que no tiene o que tiene muy pocas regulaciones espaciales

o temporales. El término “expresión constitutiva” como se utiliza aquí se refiere a una expresión sustancialmente continua en sustancialmente todos los tejidos del organismo. La persona calificada comprenderá que un “promotor constitutivo” es un promotor que es activo durante la mayor parte, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo del organismo y a través de la mayor parte, pero no necesariamente todas, las partes de un organismo.

El “patrón de expresión” de un promotor no está influenciado únicamente por los aspectos espacial y temporal, sino también por el nivel de expresión. El nivel de expresión se determina por la así llamada “fuerza” de un promotor. Dependiendo del nivel de expresión resultante, se hace una distinción aquí entre promotores “débiles” o “fuertes”. Generalmente por “promotor débil” se entiende un promotor que dirige la expresión de un ácido nucleico operativamente enlazado en niveles aproximadamente de 1/10000 transcriptos hasta aproximadamente 1/100000

transcriptos hasta aproximadamente 1/500000 transcriptos. Generalmente, por “promotor fuerte” se entiende un promotor que dirige la expresión en niveles aproximadamente de 1/10 transcriptos hasta aproximadamente 1/100 o hasta aproximadamente 1/1000 transcriptos.

De acuerdo con una modalidad particular, la invención provee un promotor aislado como se mencionó aquí anteriormente, que es un promotor híbrido. El término “promotor híbrido” como se utiliza aquí se refiere a un promotor quimérico elaborado, por ejemplo, en forma sintética, por ejemplo por medio de ingeniería genética. Los promotores híbridos preferidos de acuerdo con la presente invención incluyen una parte, preferiblemente una parte funcional, de uno de los promotores de acuerdo con la presente invención y al menos otra parte, preferiblemente una parte funcional de un promotor. La última parte, puede ser una parte de cualquier promotor, incluido cualquiera de los promotores de acuerdo con la presente invención y otros promotores. Un ejemplo de un promotor híbrido comprende un elemento(s) regulador(es) de un promotor de acuerdo con la presente invención combinado con el promotor mínimo de otro promotor. Otro ejemplo de un promotor híbrido es un promotor que comprende elementos reguladores adicionales para mejorar adicionalmente su actividad y/o para alterar su patrón de expresión espacial y/o temporal.

La presente invención también provee el uso de un fragmento funcional de la SEQ ID NO. 14 o una variante de la misma para cambiar el patrón de expresión de un promotor. En tales métodos, al menos parte de cualquiera de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención se combinan con al menos un fragmento de otro promotor.

Además, la invención provee una construcción genética que comprende:

(a)

Un promotor aislado como el definido aquí anteriormente

(b)

Una secuencia de ácido nucleico heterólogo operativamente enlazada a un promotor aislado de (a), y opcionalmente

(c)

Un terminador de la transcripción 3’

El término “construcción genética” como se utiliza aquí significa un ácido nucleico elaborado por medio de ingeniería genética.

El término “operativamente enlazado” a un promotor como se utiliza aquí significa que la transcripción está dirigida y/o regulada por ese promotor. Una persona capacitada en el arte comprenderá que estando operativamente enlazado a un promotor preferiblemente significa que el promotor está posicionado secuencia arriba (es decir en el extremo 5’) del ácido nucleico operativamente enlazado. La distancia al ácido nucleico operativamente enlazado puede ser variable, siempre que el promotor de la presente invención sea capaz de dirigir y/o de regular la transcripción del ácido nucleico operativamente enlazado. Por ejemplo, entre el promotor y el ácido nucleico operativamente enlazado, puede haber un sitio de clonación, un adaptador, un reforzador de la transcripción o de la traducción.

El ácido nucleico operativamente enlazado puede ser cualquier ácido nucleico codificador o no codificador. El ácido nucleico operativamente enlazado puede estar en la dirección sentido o en la dirección antisentido. Típicamente en el caso de la modificación por ingeniería genética de células huésped, el ácido nucleico operativamente enlazado es introducido en la célula huésped y se pretende que cambie el fenotipo de la célula huésped. Alternativamente, el ácido nucleico operativamente enlazado es un ácido nucleico endógeno de la célula huésped.

El término “heterólogo” como se utilizan aquí se pretende que sea “heterólogo al promotor de la presente invención”. Un ácido nucleico que es heterólogo al promotor de la presente invención no es de origen natural en las secuencia de ácido nucleico que flanquean al promotor de la presente invención cuando está en su ambiente genómico bilógico. Aunque el ácido nucleico puede ser heterólogo al promotor de la presente invención, puede ser homólogo o nativo o heterólogo o extraño a la célula huésped de la planta. El ácido nucleico heterólogo operativamente enlazado puede ser cualquier ácido nucleico (por ejemplo que codifica cualquier proteína) siempre y cuando incluya o este flanqueado por al menos un nucleótido que normalmente no esté flanqueando al promotor de la presente invención.

El término “terminador de la transcripción” como se utiliza en (c) se refiere a una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN 3’ no traducidas que usualmente contiene una señal de poliadenilación, que facilita la adición de secuencias de poliadenilato al extremo 3’ de un transcripto primario. Los terminadores activos en, y/o aislados a partir de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas son conocidos y han sido descritos en la literatura. Los ejemplos de terminadores adecuados para uso en las construcciones genéticas de la presente invención incluyen al terminador del gen de nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, a la secuencia terminadora del gen de octopina sintasa (OCS) de Agrobacterium tumefaciens, a la secuencia terminadora del gen 35S del virus

del mosaico de la Coliflor (CaMV), la secuencia terminadora de la ADP-glucosa pirofosforilasa de Oryza sativa (t3’Bt2), a la secuencia terminadora del gen de la zeína de Zea mays, al terminador del gen rbcs-1A y a las secuencias terminadores del gen rbcs-3A, entre otras.

La presente invención también provee un casete de expresión, un vector de transformación o un vector de expresión de la planta que comprende una construcción genética como la descrita anteriormente.

Un “casete de expresión” como se utiliza aquí se refiere a una construcción genética mínima necesaria para la expresión de un ácido nucleico. Un casete de expresión típico incluye una combinación promotor-gen-terminador. Un casete de expresión puede incluir adicionalmente sitio de clonación, por ejemplo sitios de recombinación Gateway TM o sitios de reconocimiento de la enzima de restricción, para permitir la clonación fácil del ácido nucleico operativamente enlazado o para permitir la transferencia fácil del casete de expresión dentro de un vector. Un casete de expresión puede incluir además regiones no traducidas 5’, regiones no traducidas 3’, un marcador seleccionable, reforzadores de transcripción o reforzadores de traducción.

Con “vector de transformación” se entiende una construcción genética, que puede ser introducida en un organismo por medio de transformación y que puede ser mantenida en forma estable en dicho organismo. Algunos vectores pueden ser mantenidos por ejemplo en Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe, mientras que otros tales como fagémidos y vectores cósmidos, pueden ser mantenidos en bacterias y/o en virus. Los vectores de transformación pueden ser multiplicados en su célula huésped y pueden ser aislados nuevamente a partir de allí para ser transformados en otra célula huésped. Las secuencias de vectores generalmente incluyen un conjunto de sitios únicos reconocidos por enzimas de restricción, el sitio de clonación múltiple (MCS) en donde una o más secuencias pueden ser insertadas. Las secuencias del vector pueden incluir adicionalmente un origen de replicación que es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en una célula huésped específica. Los ejemplos de orígenes de replicación incluyen, pero no se limitan a, el f1-ori y colE1.

Los “vectores de expresión” forman un subgrupo de vectores de transformación, que, en virtud de incluir las secuencias reguladoras apropiadas, permiten la expresión de la(s) secuencia(s) no vectorial(es) insertada(s). Se ha descrito que los vectores de expresión son adecuados para expresión en bacterias (por ejemplo E. coli), hongos (por ejemplo S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris), células de insecto (por ejemplo vectores de expresión baculovirales), células animales (por ejemplo COS o células CHO) y células vegetales. Un vector de expresión adecuado de acuerdo con la presente invención es un vector de expresión de una planta, útil para la transformación de células vegetales, la integración estable en el genoma de la planta, el mantenimiento en la célula de la planta y la expresión de las secuencias no vectoriales en la célula de la planta.

Típicamente, un vector de expresión de una planta de acuerdo con la presente invención incluye un ácido nucleico de la SEQ ID NO. 14 o una variante del mismo como se describió aquí anteriormente, opcionalmente operativamente enlazado a un segundo ácido nucleico. Típicamente un vector expresable de una planta de acuerdo con la presente invención, incluye además regiones de T-ADN para integración estable dentro del genoma de la planta (por ejemplo las regiones del borde izquierdo y del borde derecho del plásmido Ti).

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir además un “marcador seleccionable”. Como se utiliza aquí, el término “marcador seleccionable” incluye cualquier gen, que confiera un fenotipo a una célula en la cual se exprese, para facilitar la identificación y/o la selección de células que son transfectadas o transformadas. Los marcadores adecuados pueden ser seleccionados a partir de los marcadores que confieren resistencia a antibióticos

o a herbicidas. Las células que contienen la construcción genética sobrevivirán por lo tanto a concentraciones de antibióticos o de herbicidas que matan células no transformadas. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptII que codifica neomicina fosfotransferasa capaz de fosforilar neomicina y kanamicina o hpt que codifica higromicina fosfotransferasa capaz de fosforilar higromicina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporciona resistencia contra el glifosato), o genes que provean un rasgo metabólico (tales como mana que permite que las plantas utilicen manosa como única fuente de carbono). Los genes marcadores visuales resultan en la formación de color (por ejemplo beta-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y derivados de la misma). Ejemplos adicionales de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de resistencia a la ampicilina (Ampr), gen de resistencia a la tetraciclina (Tcr), gen de resistencia a la kanamicina bacteriana (Kanr), gen de resistencia a la fosfinotricina, y el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), entre otros.

Además, la presente invención abarca una célula huésped que contiene un promotor aislado, o una construcción genética, o un casete de expresión, o un vector de transformación o un vector de expresión de acuerdo con la invención como se describió aquí anteriormente. En modalidades particulares de la invención, se selecciona la célula huésped entre células huésped de bacterias, algas, hongos, levaduras, plantas, insectos o animales.

En una modalidad particular, la invención provee una célula de una planta transgénica que incluye un promotor aislado de acuerdo con la invención, o un ácido nucleico aislado, o una construcción genética, o un casete de expresión, o un vector de transformación o un vector de expresión de acuerdo con la invención como se describió aquí anteriormente. Preferiblemente dicha célula vegetal es una célula de una planta dicotiledónea o una célula de una planta monocotiledónea, más preferiblemente una célula de cualquiera de las plantas mencionadas aquí. Preferiblemente, en la célula de la planta transgénica de acuerdo con la invención, el promotor o la construcción genética de la invención está integrada en forma estable dentro del genoma de la célula vegetal.

La invención también provee un método para la producción de una planta transgénica, que comprende:

(a)

La introducción en una célula vegetal de una construcción genética, o un casete de expresión, o un vector de transformación o un vector de expresión de acuerdo con la presente invención y como se describió aquí anteriormente, y

(b)

El cultivo de dicha célula vegetal bajo condiciones que promuevan el crecimiento de la planta.

La “introducción” del promotor aislado anteriormente mencionado, o la construcción genética, o el casete de expresión, o el vector de transformación o el vector de expresión, en una célula huésped (por ejemplo una célula vegetal) se logra preferiblemente por medio de transformación. El término “transformación” como se utiliza aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno dentro de una célula huésped independientemente del método utilizado para la transferencia. En particular para plantas, los tejidos capaces de propagación clonal, ya sea por organogénesis o por embriogénesis, son adecuados para ser transformados con una construcción genética de la presente invención y se puede regenerar a partir de los mismos una planta completa. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y más adecuados para, la especie particular de planta que está siendo transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes axilares y meristemos de raíz), y tejido inducido de meristemo (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotiledón). El polinucleótido puede ser introducido en forma transitoria o estable en una célula vegetal y puede ser mantenido en forma no integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede estar integrado dentro del genoma de la planta.

La transformación de una especie vegetal es ahora una técnica muy común. Convenientemente, se puede utilizar cualquiera de los diferentes métodos de transformación para introducir los ácidos nucleicos de la invención dentro de una célula progenitora adecuada. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, compuestos químicos que incrementan la admisión de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microinyección. Los métodos pueden ser seleccionados a partir del método de polietilén glicol/calcio para protoplastos (Krens, F.A. et al., 1882, Nature 296, 72 - 74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363 - 373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol 3, 1099 - 1102); microinyección dentro del material de la planta (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179 - 185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) infección con virus (no integradores) y similares. Un método de transformación preferido para la producción de células de plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención, es un método de transformación mediado por Agrobacterium.

Las plantas de arroz transgénico que contienen cualquiera de los promotores de la presente invención son preferiblemente producidos a través de transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para transformación de arroz, tal como aquellos descritos en cualquiera de las siguientes documentos: la solicitud de patente europea publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta, 199, 612 - 617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491 - 506, 1993); Hiei et al. (Plant J. 6 (2) 271 - 282, 1994); cuyas divulgaciones se incorporan aquí como referencia como si estuvieran expuestas en su totalidad. En el caso de transformación del maíz, el método preferido es como se describe ya sea en Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745 - 50) o Frame et al. (Plant Physiol. 2002 May; 129(1): 13 - 22), cuyas divulgaciones se incorporan aquí como referencia como si estuvieran expuestas en su totalidad.

Generalmente después de la transformación, las células de la planta o las agrupaciones celulares se seleccionan por la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables por la planta, transferidos conjuntamente con el gen de interés (que podrían estar bajo el control de cualquiera de los promotores de la presente invención), después de lo cual se puede cultivar el material transformado bajo condiciones que promuevan el crecimiento de la planta.

Las células de la planta transformadas resultantes pueden ser luego utilizadas para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas capacitadas en el arte. Por lo tanto, el método para la producción de una planta transgénica como se describió aquí anteriormente, puede incluir además la regeneración de una planta a partir de dicha célula vegetal de (a).

La presente invención provee además una planta que comprende una célula vegetal como se describió aquí anteriormente. Las plantas pueden ser capaces también de crecer, o incluso de alcanzar la madurez incluida por ejemplo la producción de fruto, formación de semilla, la maduración de la semilla y la composición de la semilla.

Además, la progenie puede ser producida a partir de estas semillas, cuya progenie puede ser fértil. Alternativa o adicionalmente, las plantas transformadas y regeneradas pueden producir también progenie por medio de propagación no sexual tal como clonación, injertos. Las plantas transformadas generadas pueden ser propagadas por una variedad de medios, tales como propagación clonal o técnicas clásicas de fitomejoramiento. Por ejemplo, una primera generación de plantas transformadas puede ser autofecundada para producir transformantes de segunda generación homocigotos (o T2), y las plantas T2 propagadas adicionalmente a través de técnicas clásicas de fitomejoramiento.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener al casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un vástago no transformado).

Después de la transferencia de ADN y el crecimiento de las células transformadas, se pueden evaluar las células de plantas putativamente transformadas o las plantas, utilizando por ejemplo análisis tipo Southern, por la presencia del gen de interés, el número de copia y/o la organización genómica. Alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión o los patrones de expresión del ADN recientemente introducido pueden ser medidos utilizando análisis tipo Northern y/o tipo Western, siendo ambas técnicas bien conocidas por las personas ordinariamente capacitas en el arte.

La presente invención se extiende claramente a plantas que pueden ser obtenidas por cualquiera de los métodos de acuerdo con la presente invención, cuyas plantas incluyen cualquiera de los promotores aislados o las construcciones de la presente invención. La presente invención claramente se extiende a cualquiera de las partes de la planta y a los propágulos de dicha planta. La presente invención se extiende además para abarcar la progenie de una célula primaria transformada, tejido, órgano o planta completa que ha sido producida por cualquiera de los métodos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie exhiba la misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) que aquellas producidas en los padres por medio de los métodos de acuerdo con la invención. La invención se extiende también a las partes cosechables de una planta, tales como, pero sin limitarse a, semillas, hojas, frutos, flores, cultivos de tallo, tallos, rizomas, raíces, tubérculos, bulbos y fibras de algodón.

El término “planta” o “plantas” como se utilizan aquí abarcan plantas completas, antepasados y progenie de plantas y de partes de plantas, incluidas semillas, brotes, tallos, raíces (incluidos tubérculos), y células de plantas, tejidos y órganos. El término “planta” también abarca por lo tanto cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, gametofitos, esporofitos, polen, y microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la subfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plants ornamentales, cultivos de alimentos, árboles, o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia spp., Hacer spp., Actinidia spp.,Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp.,Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Omithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squaffosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp.Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica,

Zea mays, amaranto, alcachofas, espárragos, brócoli, coles de Bruselas, repollo, canola, zanahoria, coliflor, apio, col rizada, lino, col forrajera, lenteja, colza de semilla oleaginosa, quimbombó, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, y té, árboles y algas entre otros. De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo tal como soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata, tabaco, calabaza, papaya, álamo, leguminosa, lino, lupino o sorgo. De acuerdo con otra modalidad preferida de la presente invención, la planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar, preferiblemente además un cereal tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno o avena.

Preferiblemente el ácido nucleico operativamente enlazado de (a) es heterólogo con los ácidos de acuerdo con la presente invención.

Este método puede comprender además el cultivo de la planta transformada o de las células de la planta bajo condiciones que promuevan el crecimiento, que promuevan la regeneración y/o que promuevan la maduración.

Además, la expresión del ácido nucleico operativamente enlazado puede ser dirigida y o regulada en células particulares, tejidos u órganos de una planta. Por lo tanto, la invención provee un método como el descrito anteriormente, en donde la expresión es expresión constitutiva o expresión específica del tejido. Para estas modalidades, se hace referencia a la sección de ejemplos en donde se describen los patrones de expresión específicos de los promotores de acuerdo con la invención y en donde se detallan diferentes tipos de expresión específicos del tejido.

La presente invención abarca además el uso de un ácido nucleico aislado como se definió aquí anteriormente para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico operativamente enlazado.

(i) La persona capacitada en el arte se dará cuenta que el suministro de la SEQ ID NO. 14, fácilmente pone a disposición las herramientas para aislar promotores relacionados, que pueden tener una identidad de secuencia sustancial con la SEQ ID NO. 14. Adicionalmente, el suministro de la secuencia SEQ ID NO. 36 (CDS correspondiente al promotor de la presente invención, ver la Tabla 1), fácilmente pone a disposición las herramientas para aislar promotores relacionados, de las cuales la CDS relacionada puede tener identidad de secuencia sustancial con la SEQ ID NO. 36. Por lo tanto la presente invención también abarca un método para aislar ácidos nucleicos, capaz de dirigir y/o de regular la expresión de un ácido nucleico operativamente enlazado, que comprende la selección de una base de datos de secuencia de ácido nucleico para encontrar homólogos de cualquiera de las secuencias representadas por la SEQ ID NO. 14 o la SEQ ID NO. 36. Posteriormente se utilizan estos homólogos para seleccionar una biblioteca con ADN genómico, la cual se prepara por ejemplo a partir del organismo de origen del homólogo anteriormente mencionado. El procedimiento de selección puede involucrar por ejemplo hibridación. Posteriormente, el ADN genómico que coincide con el homólogo, es analizado para identificar el sitio de iniciación de la transcripción y el sitio de iniciación de la traducción del gen correspondiente con el homólogo. Finalmente, se diseñan los iniciadores específicos para amplificación de un ácido nucleico localizado en la región secuenciar arriba (el extremo 5’) de dicho sitio de iniciación de la traducción.

La presente invención se extiende a la identificación de proteínas reguladoras que están involucradas en la regulación de la actividad de los promotores de acuerdo con la presente invención. Tal identificación puede ser lograda utilizando un sistema de un híbrido de levadura. En tal sistema de un híbrido de levadura las secuencias de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO. 14 están operativamente enlazadas al activador de transcripción GAL y transformadas con un cultivo de células de levadura. Ese cultivo de células de levadura es nuevamente transformado con una biblioteca de construcciones que codifican a los factores reguladores candidatos.

La presente invención será descrita ahora con referencia a las siguientes figuras en las cuales:

La Figura 1 muestra una representación esquemática general de un promotor. Los elementos reguladores son secuencias que pueden por ejemplo ser responsables por la regulación especial y/o temporal de la actividad del promotor. El promotor mínimo es la secuencia mínima necesaria y suficiente para dirigir la expresión. Incluye una caja TATA, que es necesaria para dirigir correctamente la ARN polimerasa II al sitio de iniciación de la transcripción. El elemento de iniciación de la transcripción (INR) incluye al sitio de arranque de iniciación de la transcripción. La región no traducida 5’ (5’UTR) es la región que es transcrita en ARN premensajero y eventualmente en ARNm, pero no es traducida en proteína. El codón de iniciación de la traducción está representado por el codón de inicio ATG.

La Figura 2 es un mapa del vector p4581 útil para expresión en plantas de un gen de �-glucuronidasa (GUS) bajo control de cualquiera de los promotores de acuerdo con la invención. Este vector binario incluye un casete de recombinación Gateway, adecuado para la clonación de recombinación de cualquiera de los promotores de la presente invención en frente del gen de �-glucuronidasa (GUS) de Escherichia coli. Este casete contiene un gen de resistencia al cloranfenicol (CamR) y al gen suicida ccdB para selección en contra de plásmidos no recombinados. Este casete de expresión de GUS incluye además la secuencia terminadora doble de T-zeína y T-rbcS-deItaGA. Este casete de expresión se localiza dentro del borde izquierdo (repetición LB, LB Ti C58) y el borde derecho

(repetición RB, RB Ti C58) del plásmido Ti de nopalina. Clonados dentro de estos bordes están también un marcador seleccionable y gene marcadores seleccionables cada uno bajo el control de un promotor constitutivo y una secuencia terminadora. Este vector también contiene un origen de replicación (pBR322) para replicación bacteriana y un marcador seleccionable bacteriano (Spe/SmeR) para selección bacteriana.

Las siguientes figuras muestran los resultados de la coloración de GUS de plantas o partes de plantas transformadas con el vector reportero p4581 que porta un promotor de acuerdo con la presente invención operativamente enlazado al gen reportero de GUS. Las plantas denominadas "plantas C" son plantas transgénicas cultivadas hasta aproximadamente 5 cm; Las plantas denominadas "plantas B" cultivadas hasta aproximadamente 10 cm; y las plantas denominadas "plantas A" cultivadas hasta la madurez. Estas plantas A fueron utilizadas para recolectar diferentes muestras de tejido de hojas viejas, hojas jóvenes y semillas.

La Figura 3 muestra el patrón de expresión de PRO0110 (RCc3, SEQ ID NO 1). La coloración de GUS es visible en raíces.

La Figura 4 muestra el patrón de expresión de PRO0005 (beta-amilasa putativa, SEQ ID NO 2). La coloración de GUS es visible en semillas, más específicamente en el embrión o en el escutelo del embrión.

La Figura 5 muestra el patrón de expresión de PRO0009 (celulosa sintetasa putativa, SEQ ID NO 3). La coloración de GUS es visible en raíces.

La Figura 6 muestra el patrón de expresión de PRO0058 (inhibidor de proteinasa Rgpi9, SEQ ID NO 4). La coloración de GUS es visible en las semillas.

La Figura 7 muestra el patrón de expresión de PRO0061 (beta expansina EXPB9, SEQ ID NO 5). La coloración de GUS es visible en flores jóvenes de plantas A (A) y en otros tejidos jóvenes de expansión de plantas B (B) y plantas C (C).

La Figura 8 muestra el patrón de expresión de PRO0063 (proteína estructural putativa, SEQ ID NO 6). La coloración de GUS es visible en tejidos jóvenes, por ejemplo en los callos (A) o en hojas viejas, hojas jóvenes y semillas de "plantas A" (B).

La Figura 9 muestra el patrón de expresión de PRO0081 (cafeoil-CoA 3-O-metiltransferasa putativa, SEQ ID NO 7). La coloración de GUS es visible en tejidos jóvenes, particularmente del brote.

La Figura 10 muestra el patrón de expresión de PRO0091 (prolamina RP5, SEQ ID NO 8). La coloración de GUS es visible en semillas (A), particularmente en el endospermo, y en meristemo (B).

La Figura 11 muestra el patrón de expresión de PRO0095 (amino peptidasa putativa, SEQ ID NO 9). La coloración de GUS es visible en semillas, más particularmente en el embrión.

La Figura 12 muestra el patrón de expresión de PRO0111 (proteína tipo uclacianina 3, SEQ ID NO 10). La coloración de GUS es visible en raíces y en meristemo.

La Figura 13 muestra el patrón de expresión de PRO0116 (subunidad 11 que no es ATPasa de la partícula reguladora del proteosoma 26S, SEQ ID NO 11). La coloración de GUS es débilmente visible en la planta completa (constitutiva débil) y es particularmente visible en meristemo.

La Figura 14 muestra el patrón de expresión de PRO0117 (proteína ribosomal 40S putativa, SEQ ID NO 12). La coloración de GUS es visible en las semillas, más particularmente en el endospermo.

La Figura 15 muestra el patrón de expresión de PRO0122 (precursor de la proteína de enlazamiento clorofila a/b (Cab27), SEQ ID NO 13). La coloración de GUS es visible en el brote.

La Figura 16 muestra el patrón de expresión de PRO0123 (protoclorofilido reductasa putativa, SEQ ID NO 14). La coloración de GUS es visible en el brote (tejidos por encima del suelo).

La Figura 17 muestra el patrón de expresión de PRO0133 (quitinasa Cht-3, SEQ ID NO 15). La coloración de GUS es visible en las raíces y el meristemo.

La Figura 18 muestra el patrón de expresión de PRO0151 (WSI18, SEQ ID NO 16). La coloración de GUS es visible en los callos y las partes superiores de la planta (A) así como en la capa de aleurona y el embrión (B).

La Figura 19 muestra el patrón de expresión de PRO0169 (acuaporina, SEQ ID NO 17). La coloración de GUS es visible en la planta completa (expresión constitutiva).

La Figura 20 muestra el patrón de expresión de PRO0170 (proteína del grupo de alta movilidad, SEQ ID NO 18). La coloración de GUS es fuertemente visible en la planta completa como se ilustra por medio de las "plantas B" (A), y diferentes tejidos tales como hojas viejas, hojas jóvenes y semillas (B) y callos (C) (expresión constitutiva).

La Figura 21 muestra el patrón de expresión de PRO0171 (proteína glicosilada en forma reversible RGP1, SEQ ID NO 19). La coloración de GUS es visible en todas las partes de la planta (expresión constitutiva).

La Figura 22 muestra el patrón de expresión de PRO0173 (MDH citosólico, SEQ ID NO 20). La coloración de GUS es visible en todas las partes de la planta y particularmente en el brote (tejidos por encima del suelo) y semillas.

La Figura 23 muestra el patrón de expresión de PRO0175 (RAB21, SEQ ID NO 21). La coloración de GUS es débilmente visible en callos (A), meristemos y hojas jóvenes, y es fuertemente visible en semillas en desarrollo y maduración (B) más particularmente en el embrión.

La Figura 24 muestra el patrón de expresión de PRO0177 (Cdc2-1, SEQ ID NO 22). La coloración de GUS es débilmente visible en meristemo y en láminas de hojas.

Ejemplos

Los promotores de acuerdo con la presente invención fueron aislados como regiones de ADN que abarcan aproximadamente 1,2 kb de la secuencia, secuencia arriba del codón de iniciación de la traducción (es decir el primer ATG, cuyo codón fue excluido) de diferentes genes de arroz. Para la determinación de su secuencia de ácido nucleico y su patrón de expresión, se siguió el siguiente procedimiento: Primero se realizaron estudios in silico sobre secuencias genómicas de arroz. Sin embargo, los procedimientos basados en programas de predicción automatizados para localizar una secuencia de ácido nucleico como la del promotor son altamente propensos a error, incluso para la localización de los elementos de control del promotor mejor caracterizados tales como la caja TATA y el elemento de iniciación de la transcripción (INR). También, la determinación in silico del patrón de expresión es extremadamente especulativa. Por lo tanto, para obtener datos no ambiguos acerca de la secuencia de ácido nucleico y el patrón de expresión de los promotores, se llevaron a cabo estudios in vivo que abarcan (i) el aislamiento de la secuencia de ácido nucleico del promotor; (ii) enlazar operativamente un gen reportero gene con el promotor e introducir la construcción genética resultante en organismos huésped; (iii) cultivar las células huésped transformadas bajo condiciones que permitan la expresión del gen reportero, y (iv) la determinación de la actividad del gen reportero en los diferentes tejidos del organismo huésped. Se describirán ahora estos métodos en forma más detallada.

Ejemplo 1. Identificación y aislamiento de los promotores

Identificación de las EST de arroz, los genes correspondientes y su localización en el genoma del arroz

Bases de datos de secuencia, que incluyen secuencias de arroz, fueron buscadas por las etiquetas de secuencia expresadas de arroz (EST). Posteriormente se realizó una transferencia tipo Northern "in silico" para permitir la identificación de familias de EST que son fuertemente expresadas o que son específicas para un órgano particular. Este análisis incluyó normalización de los números de EST aisladas de diferentes órganos de la planta. Las familias de EST con una distribución interesante entre bibliotecas fuente de ADNc fueron seleccionadas para análisis adicionales y búsquedas de homología de secuencia. Después de las búsquedas de homología de secuencia en combinación con la exploración de datos científicos, los genes que corresponden a esas familias de las EST fueron identificados a partir de las bases de datos de secuencia y se dio una función (putativa) y el nombre del gen correspondiente (ver la Tabla 1). Posteriormente, se aisló la región promotora correspondiente por medio del siguiente procedimiento. En una primera etapa se buscó en la base de datos del TIGR para encontrar un cóntigo tentativo correspondiente a una familia de EST. Se encontró homología de secuencia utilizando programas estándar de ordenador, tales como Blast N usando parámetros estándar (típicamente G El costo para abrir una brecha = 5, E El costo para extender una brecha = 2, q La penalización por una falta de correspondencia en la porción desecha del proceso = -3, r Recompensa por una coincidencia en la porción desecha del proceso = 1, e Valor de la expectativa = 10.0, W Tamaño de palabra = 11, v Número de descripciones en una línea = 100, b Número de alineaciones para mostrar = 100, Matriz = BLOSUM62). La base de datos del TIGR (The Institute for Genomic Research), proporciona Cóntigos Tentativos (TC por sus siglas en inglés) que son predicciones de secuencia con base en la construcción de cóntigos de todas las EST conocidas, de todos los ADNc conocidos y del ARNm reconstruido. Los TC utilizados para la identificación de los promotores de la presente invención están representados en la Tabla 1. En una segunda etapa estos TC fueron utilizados para localizar al gen correspondiente sobre una secuencia genómica, cuyo gen incluye la región de codificación así como la región promotora. Generalmente, estas secuencias genómicas eran clones BAC, que se representan aquí por su número de acceso del Genbank (ver la Tabla 1). A partir de estos clones BAC se podría determinar la identidad de la secuencia de la región promotora.

Tabla 1: lista de promotores de arroz de la presente invención. Las secuencias del promotor están representadas aquí por su SEQ ID NO y el número del promotor (PRO). Las secuencias de codificación (CDS) dirigidas en forma natural por un promotor de la presente invención están representadas por su nombre, por la SEQ ID NO y por el número de acceso del Cóntigo Tentativo (TC) de la base de datos del TIGR. Las secuencias genómicas (clones BAC

o genes) que incluyen una región promotora de la presente invención están representadas por su número de acceso del Genbank.

SEQ ID NO del Promotor

Número del promotor Nombre de la CDS SEQ ID NO de la CDS TC de la CDS Clon BAC (*o gen)

14

PRO0123 protoclorofilido reductasa putativa 36 TC89839 AL606456

Identificación y aislamiento de las regiones promotoras de genes del arroz

Partiendo de la información de la secuencia de los genes y su localización en el genoma del arroz, se aislaron las regiones promotoras de estos genes fueron aisladas como la región de ADN que abarca aproximadamente 1.2 kb secuencia arriba del codón de iniciación de la traducción (es decir el primer ATG), cuyo codón fue excluido. Cuando 5 estaba presente una secuencia interviniente tal como un intrón, en la región no traducida 5’ del gen, se tomó la región aislada de ADN como la región que abarca aproximadamente 1.2 kb más la longitud de esa secuencia interviniente. Las regiones promotoras fueron aisladas del ADN genómico de Oryza sativa Japonica o excepcionalmente de Oryza sativa Indica a través de PCR utilizando iniciadores específicos. Estos iniciadores específicos incluyen sitios de recombinación AttB, adecuados para clonación de recombinación de la región 10 promotora aislada. Estos iniciadores específicos son representados aquí como las SEQ ID NO 58 y 80 y están enlistados en la Tabla 2. Las condiciones para PCR eran las siguientes: 1 ciclo de 2 min a 94°C, 35 cic los de 1 min a 94°C, 1 min a 58°C y 2 min a 68°C, y 1 ciclo de 5 m in a 68°C. La longitud del fragmento esperado de PCR está también indicada en la Tabla 2. El correspondiente fragmento de PCR fue purificado de la mezcla de reacción PCR a través de electroforesis en gen y posterior purificación utilizando el Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo

15 Research, Orange, California).

Tabla 2: Resumen de los iniciadores utilizados para aislar los promotores del arroz de la presente invención y la longitud de las regiones promotoras del arroz

SEQ ID NO del promotor

Número del promotor Longitud del promotor SEQ ID NO del iniciador hacia adelante Iniciador hacia adelante SEQ ID NO del iniciador hacia atrás Iniciador hacia atrás

14

PRO0123 123 58 prm3782 80 prm2197

Ejemplo 2. Clonación de vectores reporteros promotor-GUS para transformación de la planta

20 Los fragmentos purificados de la PCR del Ejemplo 1, correspondientes a las regiones promotoras de la presente invención, fueron clonadas dentro del plásmido de entrada pDONR201 del sistema Gateway TM (Life Technologies) utilizando la “reacción de recombinación BP”. La identidad y la composición de los pares de bases del inserto clonado fueron confirmadas por medio de secuenciación y adicionalmente, se analizó el plásmido resultante a través de digestiones de restricción.

Con el propósito de clonar cada uno de los promotores de la presente invención en frente de un gen reportero, se utilizó posteriormente cada clon de entrada del Ejemplo 1 en una “reacción de recombinación del LR” (Gateway TM) con el vector de destinación p4581. Este vector de destinación fue diseñado para enlazar operativamente cada promotor de la presente invención al gen de beta-glucuronidasa (GUS) de Escherichia coli a través de la sustitución del casete de recombinación Gateway en frente del gen de GUS. Además, este vector de destinación es adecuado para la transformación de plantas e incluye dentro de los bordes derecho e izquierdo del T-ADN al casete promotor-GUS resultante y al marcador seleccionable y a los casetes cribables del marcador (ver la Figura 2). Los vectores reporteros resultantes, que incluyen un promotor de la presente invención operativamente enlazado a GUS, son posteriormente transformados en la cepa LBA4044 de Agrobacterium y posteriormente en plantas de arroz utilizando técnicas estándar de transformación.

Ejemplo 3. Patrones de expresión del casete reportero promotor-GUS en el Crecimiento de plantas y la cosecha de plantas transgénicas o partes de plantas en diferentes etapas (plantas C, plantas B y plantas A)

Para cada construcción reportera promotor-GUS, se generaron 3 plantas de arroz transgénico T0 a partir de células transformadas. El crecimiento de la planta se realizó bajo condiciones normales. Se sacrificó la primera planta transgénica para coloración con GUS cuando había alcanzado un tamaño de aproximadamente 5 cm, la cual es llamada aquí “planta C”. Se sacrificó la segunda planta transgénica para coloración con GUS cuando había alcanzado un tamaño de aproximadamente 10 cm, la cual es llamada aquí “planta B”. La tercera planta transgénica fue mantenida para producción de semillas y es llamada aquí “planta A”. Se llevó a cabo la coloración de GUS sobre plantas C y B completas. Sobre las plantas A, se llevó a cabo la coloración de GUS en pedazos de hoja, flores y secciones de semillas en diferentes etapas de desarrollo. A las plantas A se les permitió producir semillas, las cuales fueron utilizadas después de cosechadas para confirmación del patrón de expresión en plantas T1.

Coloración de GUS

Las plantas sacrificadas o partes de la planta fueron recubiertas con acetona al 90% enfriada con hielo e incubadas durante 30 min a 4ºC. Después de 3 lavadas de 5 min con amortiguador Tris [15,76 g Trizma HCI (Sigma T3253) + 2,922 g de NaCl en 1 L de agua bidestilada, ajustado a pH 7,0 con NaOH], se recubrió el material por medio de una solución de Tris/ferricianato/X-Gluc [9,8 ml de amortiguador Tris + 0,2 ml de patrón de ferricianato (0,33 g de ferricianato de potasio (Sigma P3667) en 10 ml de amortiguador Tris)+ 0,2 ml de patrón de X-Gluc (26,1 mg de X-Gluc (Europa Bioproducts ML 113A) en 500 µl de DMSO)]. Se aplicó una infiltración al vacío durante 15 a 30 minutos. Se incubaron las plantas o las partes de la planta hasta durante 16 horas a 37ºC hasta que fue visible el desarrollo de color azul. Se lavaron las muestras 3 veces durante 5 minutos con amortiguador Tris. Se extrajo la clorofila en series de etanol del 50%, 70% y 90% (cada una durante 30 minutos).

Patrones de expresión de los promotores de la presente invención

Los patrones de expresión de los promotores de arroz de la presente invención se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Patrones de expresión de los promotores de arroz de la presente invención

SEQ ID NO del promotor

Número del promotor Nombre del Promotor Patrón de expresión

(continuación)

SEQ ID NO del promotor

Número del promotor Nombre del Promotor Patrón de expresión

14

PRO0123 protoclorofilido reductasa putativa fuerte específico del brote

Los siguientes párrafos describen los patrones de expresión observados de los promotores de la presente invención

5 con más detalle. Las observaciones se basan en la inspección visual de los tejidos coloreados con GUS como se describió anteriormente. Debe entenderse que para algunos promotores, la expresión puede ser débil y que la expresión en ciertos tejidos puede ser únicamente visible con métodos de detección muy sensibles.

PRO0123 - SEQ ID NO. 14 - protoclorofilido reductasa putativa

Se investigó 1 construcción (OS1433). Se analizaron 21 callos, 18 plantas C, 19 plantas B y 18 plantas A. Se

10 observó una expresión fuerte en los brotes (33 - 68%) de plantas C y plantas B (63 - 79%). En las plantas B también hubo expresión ocasional en las raíces. En las plantas A, se observó nuevamente expresión fuerte en hojas jóvenes (73%), así como expresión ocasional en hojas viejas (39%). Se concluyó que este promotor es adecuado para expresión fuerte en brotes, preferiblemente en hojas.

Ejemplo 4. Estabilidad de los patrones de expresión de los promotores de la presente invención en generaciones 15 posteriores

Los análisis anteriormente mencionados fueron realizados sobre plantas T0 originadas a partir de los tejidos transformados. La estabilidad de la actividad del promotor en las siguientes generaciones o plantas de la progenie de la planta original T0, las así llamadas plantas T1 y T2, fue evaluada de la siguiente manera. La planta T0 transformada con las construcciones reporteras como se mencionó en los párrafos anteriores del Ejemplo 2, creció

20 hasta la madurez (plantas A), cuyas semillas (semillas T1) fueron cosechadas y sembradas para generar plantas de la progenie T1. Estas plantas fueron analizadas como se describió anteriormente en el Ejemplo 3 y se les permitió a las plantas T1 A alcanzar la madurez y producir las semillas T2.

El patrón de expresión de los promotores de la presente invención fue estudiado en plantas T0, semillas T1, plantas T1 y semillas T2 y en todos los tejidos (incluidas semillas y tejidos de semillas) como se describe en el Ejemplo 3.

25 Los patrones de expresión específicos como los reportados a partir de las semillas T0 y T1 y descritos en el Ejemplo 3 fueron confirmados en la siguiente generación T1 y semillas T2. Se concluyó que el patrón de expresión de los promotores de la presente invención son heredadas en forma estable en plantas de generaciones posteriores.

Ejemplo 5. Estabilidad de los patrones de expresión de los promotores de la presente invención en otras plantas

Los análisis anteriormente mencionados de las plantas se realizaron sobre plantas de arroz. Esta escogencia se basó en la consideración práctica de que la ingeniería genética de plantas es más rentable para plantas de cultivo. También en otras plantas de cultivo, tales como por ejemplo Zea mays, las construcciones reporteras que incluyen a los promotores de acuerdo con la presente invención son introducidas y se evalúan las plantas transformadas como se describió aquí anteriormente. Los patrones de expresión de los promotores de acuerdo con la presente invención se conservan entre las plantas. Por lo tanto, los promotores de acuerdo con la presente invención son también adecuados para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico operativamente enlazado en monocotiledóneas, tales como maíz.

Para muchos otros propósitos tales como investigación y horticultura, se están modificando genéticamente hierbas (pequeñas), lo que involucra el uso de promotores. Por lo tanto, las construcciones reporteras que incluye a los promotores de acuerdo con la presente invención son introducidas en otras especies de plantas tales como por ejemplo Arabidopsis thaliana y se evalúan las plantas transformadas como se describió aquí anteriormente. Los patrones de expresión de los promotores de acuerdo con la presente invención se conservan entre las plantas. Por lo tanto, los promotores de acuerdo con la presente invención son también adecuados para dirigir y/o regular la expresión de un ácido nucleico operativamente enlazado en otras especies de plantas tales como por ejemplo dicotiledóneas, tales como Arabidopsis.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CropDesign N.V.

<120> Promotores de arroz

<130> PF58322

<150> EP 03075331.3

<151> 2003-02-04

<160> 88

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 1264

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00110 - RCc3

<400> 1

<210> 2

<211> 1215

<212> ADN 5 <213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00005 - beta-amilasa putativa

<400> 2 10 cccgatttag tagaccacat tttggcatca aaccaaaata gaccctctcc cagaatttgt 60

<210> 3

<211> 1038

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00009 - celulosa sintasa putativa

<400> 3 <210> 4

<211> 1301

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00058 - inhibidor Rgpi9 de proteinasa

<400> 4

<210> 5

<211> 1243

<212> ADN

<213> Oryza sativa

15 <220>

<221> característica nueva

<223> PR00061 - beta-expansina EXPB9

<400> 5 <210> 6

<211> 1019

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00063 - proteína estructural

<400> 6 <210> 7

<211> 1212

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00081 - cafeoil-CoA 3-0-metiltransferasa putativa

<400> 7

10 <210> 8

<211> 1052

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220> 15 <221> característica nueva

<223> PR00091 - prolamina RP5

<400> 8 <210> 9

<211> 1216

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00095 - metionina aminopeptidasa putativa

<400> 9 <210> 10

<211> 1237

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00111 - proteína como la uclacianina 3

<400> 10

10 <210> 11

<211> 1100

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220> 15 <221> característica nueva

<223> PR00116 - subunidad 11 que no es ATPasa de la partícula reguladora del proteosoma 26S

<400> 11 <210> 12

<211> 1216

5 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PRO0117 - proteína ribosomal 40S putativa

10 <400> 12 <210> 13

<211> 1210

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PRO0122 - precursor de la proteína de enlazamiento de clorofila a/b (Cab27)

<400> 13 <210> 14

<211> 1179

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00123 - protoclorofilido reductasa putativa

<400> 14

<210> 15

<211> 1808

<212> ADN

<213> Oryza sativa

15 <220>

<221> característica nueva

<223> PRO0133 - quitinasa Cht-3

<400> 15

<210> 16

5 <211> 1828

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

10 <223> PRO0151 WSI18

<400> 16

<210> 17

<211> 1267

5 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00169 - acuaporina

10 <400> 17 <210> 18

<211> 1130

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00170 - proteína del grupo de alta movilidad

<400> 18 <210> 19

<211> 1230

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00171 - proteína RGP1 glicosilada en forma reversible

<400> 19

<210> 20

<211> 1234

<212> ADN

<213> Oryza sativa

15 <220>

<221> característica nueva

<223> PR00173 - MDH citosólico

<400> 20

5 <210> 21

<211> 1553

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220> 10 <221> característica nueva

<223> PRO0175 RAB21

<400> 21

<210> 22

<211> 1087

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> PR00177 - Cdc2-1

<210> 23

<211> 1272

<212> ADN 5 <213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC89946 (PRO0110)

<220> 10 <221> característica nueva

<222> (17) .. (17)

<223> n = cualquier nucleótido

<220>

<221> característica nueva

15 <222> (50) .. (50)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 23

<210> 24

<211> 2425

5 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC90358 (PRO0005)

10 <220>

<221> característica nueva

<222> (1558)..(1558)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 24

<210> 25

<211> 3410

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC83635 (PRO0009)

<400> 25

<210> 26

<211> 602

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC83117 (PRO0058)

<400> 26

<210> 27

<211> 1170

<212> ADN

<213> Oryza sativa

15 <220>

<221> característica nueva

<223> TC89913 (PRO0061)

<220>

<221> característica nueva

<222> (15) .. (16)

<223> n = cualquier nucleótido

<220>

<221> característica nueva

<222> (1162)..(1162)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 27

10 <210> 28

<211> 861

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220> 15 <221> característica nueva

<223> TC89985

<400> 28 <210> 29

<211> 1252

<212> ADN 5 <213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC89891 (PRO0081)

<220> 10 <221> característica nueva

<222> (5) .. (5)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 29 <210> 30

<211> 671

<212> ADN 5 <213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC89670 (PRO0091)

<220> 10 <221> característica nueva

<222> (3)..(3)

<223> n = cualquier nucleótido

<220>

<221> característica nueva

15 <222> (14)..(14)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 30

<210> 31

<211> 436

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC89883 (PRO0095)

<400> 31

<210> 32

<211> 860

<212> ADN

<213> Oryza sativa

15

<220>

<221> característica nueva

<223> TC90434 (PRO0111)

<220>

<221> característica nueva

20

<222> (1) .. (1)

<223> n = cualquier nucleótido

43

<220>

<221> característica nueva

<222> (10) .. (10)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 32

<210> 33

<211> 1167

<212> ADN 10 <213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC83072 (PRO0116)

<400> 33

<210> 34

<211> 871

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC90038 (PRO0117)

<400> 34

<210> 35

<211> 1245

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC82936 (PRO0122)

<400> 35

<210> 36

<211> 1416

10 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC89839 (PRO0123)

15 <400> 36

<210> 37

<211> 1149

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC85888 (PRO0133)

<400> 37

<210> 38

<211> 981

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC84300 (PRO0151)

<400> 38

<210> 39

<211> 1203

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC89687 (PRO0169)

<400> 39

<210> 40

<211> 964

10 <212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC89846 (PRO0170)

15 <400> 40

<210> 41

<211> 1542

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC82935 (PRO0171)

<400> 41

<210> 42

<211> 1432

<212> ADN 5 <213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC82977 (PRO0173)

<220> 10 <221> característica nueva

<222> (1429)..(1429)

<223> n = cualquier nucleótido

<400> 42

<210> 43

<211> 659

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<220>

<221> característica nueva

<223> TC83646 (PRO0175)

<400> 43

<210> 44

<211> 1310

<212> ADN

<213> Oryza sativa

15 <220>

<221> característica nueva

<223> TC90619 (PRO0177)

<400> 44

5 <210> 45

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> prm3780

<400> 45

<210> 46

<211> 55

15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2768

<400> 46

<210> 47

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2420

<400> 47

<210> 48

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2853

<400> 48

<210> 49

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2426

<400> 49

<210> 50

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2855

<400> 50

<210> 51

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3025

<400> 51

<210> 52

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3029

<400> 52

<210> 53

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3061

<400> 53

<210> 54

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3031

<400> 54

<210> 55

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10 <220>

<223> prm3051

<400> 55

<210> 56

15 <211> 58

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3592

20 <400> 56

<210> 57

<211> 55

<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm5131

<400> 57 <210> 58

<211> 56

<222> ADN

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3782

<400>

<210> 59

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2844

<400> 59

<210> 60

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2973

<400> 60

<210> 61

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3770

<400> 61

<210> 62

5 <211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3772

10 <400> 62

<210> 63

<211> 53

<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3774

<400> 63

20 <210> 64

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> pm3776

<400> 64

<210> 65

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3800

<400> 65

<210> 66

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm5135

<400> 66

<210> 67

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3781

<400> 67

<210> 68

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2769

<400> 68 <210> 69

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2421

<400> 69

<210> 70

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2854

<400> 70

<210> 71

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2427

<400> 71

<210> 72

<211> 56

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2856

<400> 72

<210> 73

<211> 49

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3026

<400> 73

<210> 74

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> prm3030

<400> 74

<210> 75

20 <211> 62

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3062

25 <400> 75

<210> 76

<211> 54

<212> ADN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3032

<400> 76

<210> 77

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3052

<400> 77

<210> 78

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3049

<400> 78

<210> 79

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2195

<400> 79

<210> 80 <211> 58

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2197

<400> 80

<210> 81

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2845

<400> 81

<210> 82

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm2974

<400> 82

<210> 83

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3771

<400> 83 <210> 84

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3773

<400> 84

<210> 85

<211> 54

<222> ADN

<213> Secuencia artificial

<223> prm3775

<400> 85

<210> 86

<211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3777

<400> 86

<210> 87

<211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm3801

<400> 87

<210> 88

5 <211> 52

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> prm5136

10 <400> 88

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una construcción genética que comprende:

   i) un promotor aislado capaz de dirigir y/o de regular la expresión en tejido verde de una planta, que comprende:

   a.

   un ácido nucleico aislado como el presentado en la SEQ ID NO. 14 o el complemento de la SEQ ID NO. 14; o

   b.

   un ácido nucleico aislado que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con secuencias de ADN como las presentadas en la SEQ ID NO. 14; o

   c.

   un ácido nucleico aislado que hibrida específicamente bajo condiciones rigurosas con secuencias de ADN como las presentadas en la SEQ ID NO. 14; o

   d.

   un ácido nucleico aislado como el definido en cualquiera de los ítems (a) hasta (c), que está interrumpido por una secuencia interviniente; o

   e.

   un fragmento de al menos 250 pb de cualquiera de los ácido nucleicos como los definidos en (a) hasta (d), cuyo fragmento es capaz de dirigir y/o de regular la expresión y

   ii) una secuencia de ácido nucleico heterólogo operativamente enlazada a un promotor aislado de (i), y opcionalmente

   iii) un terminador 3’ de la transcripción.

2. 2.

   Una construcción genética de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende un promotor, que es un promotor híbrido que contiene al menos una parte de un promotor como se define en la reivindicación 1 i) y que contiene además otra parte de un promotor.

3. 3.

   Un casete de expresión que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 1 ó 2.

4. 4.

   Un vector de transformación que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 1 ó 2.

5. 5.

   Un vector de expresión que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 1 ó 2.

6. 6.

   Una célula huésped que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 1 ó 2, o un casete de expresión como se define en la reivindicación 3, o un vector de transformación como se define en la reivindicación 4, o un vector de expresión como se define en la reivindicación 5.

7. 7.

   Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6, seleccionada de entre bacterias, algas, hongos, levadura y una célula vegetal.

8. 8.

   Una célula de una planta transgénica que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 1 ó 2, o un casete de expresión como se define en la reivindicación 3 o un vector de transformación como se define en la reivindicación 4 o un vector de expresión como se define en la reivindicación 5.

9. 9.

   Una célula de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una célula de una planta monocotiledónea.

10. 10.

    Una célula de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 8, que es una célula de una planta dicotiledónea.

11. 11.

    Una planta transgénica que comprende una célula de una planta transgénica como se define en la reivindicación 9 ó 10.

12. 12.

    Una célula de una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha planta se selecciona de entre arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, avena, centeno, sorgo, soja, girasol, canola, caña de azúcar, alfalfa, frijol, alubias, lino, lupino, colza, tabaco, tomate, patata, calabaza, papaya, álamo y algodón.

13. 13.

    Parte de una planta, preferiblemente una parte cosechable, un propágulo o progenie de una planta como se define en la reivindicación 11 ó 12 que comprende una construcción genética como se define en la reivindicación 1 ó

    2, o un casete de expresión como se define en la reivindicación 3, o un vector de transformación como se define en la reivindicación 4, o un vector de expresión como se define en la reivindicación 5.

14. 14.

    Método para la producción de una planta transgénica, que comprende:

    (a)

    La introducción en una célula vegetal de una construcción genética como se define en la reivindicación 1 ó 2, o un casete de expresión como se define en la reivindicación 3, o un vector de transformación como se define en la reivindicación 4 o un vector de expresión como se define en la reivindicación 5, y

    (b)

    El cultivo de dicha célula vegetal bajo condiciones que promuevan el crecimiento de la planta.