ES2455745A1

ES2455745A1 - Empleo del receptor de cannabinoides CB1 como marcador de carcinoma renal de células cromófobas (CRCCh) y oncocitoma renal (OR)

Info

Publication number: ES2455745A1
Application number: ES201231588A
Authority: ES
Inventors: Gorka LARRINAGA ENBEITIA; José Ignacio LÓPEZ FERNÁNDEZ DE VILLAVERDE; Jon IRAZUSTA ASTIAZARAN; Javier GIL GOIKOURIA; Luis CASIS SÁENZ; Begoña SANZ ECHEVARRÍA
Original assignee: Euskal Herriko Unibertsitatea; Administracion General de la Comunidad Autonoma de Euskadi
Current assignee: Euskal Herriko Unibertsitatea; Administracion General de la Comunidad Autonoma de Euskadi
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2032-10-16
Also published as: ES2455745B1

Abstract

Empleo del receptor de cannabinoides CB1 como marcador de carcinoma renal de células cromófobas (CRCCh) y oncocitoma renal (OR). El receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1) puede ser utilizado como marcador de carcinoma renal de células cromófobas (CRCCh) y oncocitoma renal (OR). La invención proporciona un método in vitro para diagnosticar si un sujeto padece una neoplasia originada en células intercalares de la nefrona distal, que comprende detectar, en una muestra de dicha neoplasia de dicho sujeto, la presencia del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1), en donde la detección de la presencia de CB1 en dicha muestra es indicativa de que dicho sujeto padece una neoplasia renal originada en células intercalares de la nefrona distal, por ejemplo, CRCCh u OR. De aplicación en medicina, en diagnóstico anatomopatológico.

Description

Empleo del receptor de cannabinoides CB1 como marcador de carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCH) y oncocitoma renal (OR).

CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se relaciona, en general, con el area de las actividades sanitarias y el sector de diagnostico anatomopatologico. En particular, la invencion se relaciona con el diagnostico de neoplasias renales y, en particular, con el diagnostico de neoplasias originadas en celulas intercalares de la nefrona distal, tales como el carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCh) y el oncocitoma renal (OR), basado en el empleo del receptor de cannabinoides CB1 como marcador.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Aunque la clasificacion de la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) vigente de los tumores renales en adultos reconoce una larga serie de tipos histologicos, el 95% de los mismos se encuadran en solo cuatro entidades: carcinoma renal de celulas claras (CRCC) (70%), carcinoma renal papilar (CRP) (15%), carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCh) (5%), y oncocitoma renal (OR) (5%). El resto de los tumores renales de la clasificacion anteriormente referida son extraordinariamente infrecuentes y no suelen plantear problemas de diagnostico diferencial. Las dificultades diagnosticas suelen aparecer entre estos grupos de tumores porque no siempre son facilmente distinguibles entre si en los estudios histologicos rutinarios (aunque el diagnostico diferencial del carcinoma papilar normalmente no presenta dificultad desde el punto de vista histologico). Para su correcta identificacion se usan tecnicas inmunohistoquimicas frente a una larga bateria de anticuerpos entre ellos citoqueratinas, claudina 7, claudina 8, vicentina, a-metilacil, coenzima A, racemasa, proteina S100A1, anhidrasa carbonica IX, CD10, CD82, CD117, PAX2, PAX8, TFE3, marcador de celulas renales, p63, trombomodulina, Ecadherina, uroplaquina III, cadherina especifica renal, proteina S100P y parvalbumina (Truong LD et al., 2011 Arch Pathol Lab Med 135: 92-109).

La identificacion correcta y precisa de estos cuatro tipos histologicos tiene connotaciones clinicas relevantes debido a las diferentes implicaciones pronosticas que conllevan. Esta identificacion se realiza en la clinica mediante tecnicas histopatologicas, inmunohistoquimicas y, en ocasiones, moleculares.

La histopatologia clasica tiene limitaciones diagnosticas claras derivadas de su imposibilidad de ir mas alla de la propia morfologia y las herramientas moleculares estan poco desarrolladas en su vertiente clinica, siendo de poca ayuda ante el dilema diagnostico rutinario.

La inmunohistoquimica combina morfologia y funcion, detectando proteinas u otras sustancias inmunohistoquimicas siendo una herramienta diagnostica muy sensible y particularmente rentable debido a su alta fiabilidad y bajo coste; ademas, su utilizacion esta generalizada en practicamente todos los laboratorios de Anatomia Patologica del mundo. Asimismo, es una tecnica perfectamente estandarizada, totalmente automatizada, y, por tanto, facilmente reproducible. En la literatura especializada existe un gran numero de articulos que intentan establecer un perfil inmunohistoquimico caracteristico para cada uno de los subtipos histologicos de tumores renales mas comunes (Zhou, 2005 Clin Lab Med 25: 247-257; Hammerich, 2008 Arch Pathol Lab Med 132: 432-440, Truong 2011 Arch Pathol Lab Med 135: 92-109). Sin embargo, la realidad es que el problema del diagnostico diferencial dista mucho aun de estar resuelto en esta area concreta y con esta herramienta. Es cierto que determinados anticuerpos caracterizan a determinados tumores, pero tambien lo es que existen porcentajes significativos de excepciones a la regla. Lo anteriormente comentado hace de la inmunohistoquimica una herramienta muy util por un lado, pero imperfecta por otro.

La limitacion de la inmunohistoquimica como herramienta diagnostica es bien conocida en el campo de la anatomia patologica oncologica, no solo en relacion con los tumores renales, sino en terminos generales. Continuamente se publican nuevos estudios que propugnan la utilizacion de nuevos y prometedores anticuerpos.

El diagnostico diferencial de las neoplasias renales es importante para un correcto tratamiento, sin embargo, no existe en la actualidad un metodo facil y fiable que permita identificar una neoplasia renal concreta con seguridad.

Por tanto, existe la necesidad en el estado de la tecnica de desarrollar un metodo para identificar y diferenciar, de forma sencilla y fiable, neoplasias renales, y, en particular, identificar y diferenciar de forma sencilla y fiable entre

(i) las neoplasias renales originadas en celulas intercalares de la nefrona distal, tales como, entre las que se encuentran el carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCh) y el oncocitoma renal (OR) y (ii) las neoplasias renales que no son neoplasias originadas en celulas intercalares de la nefrona distal, tales como el carcinoma renal de celulas claras (CRCC) y el carcinoma renal papilar (CRP).

2

COMPENDIO DE LA INVENCION

En un aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal que comprende detectar en una muestra de dicha neoplasia de dicho sujeto la presencia del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1), en

-: la deteccion de la presencia de CB1 en dicha muestra es indicativa de que dicho sujeto padece una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal; o en donde

-: la no deteccion de la presencia de CB1 en dicha muestra es indicativa de que dicha neoplasia no es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que padece una neoplasia renal es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, que comprende detectar en una muestra de dicha neoplasia de dicho sujeto la presencia de CB1, en donde

-: la deteccion de la presencia de CB1 en dicha muestra es indicativa de que dicha neoplasia es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal; o en donde

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de CB1 como marcador de una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de CB1 como marcador para el diagnostico diferencial entre una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal y carcinoma renal de celulas claras (CRCC).

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de un anticuerpo que reconoce el receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1) para identificar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, o para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que la padece es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de un kit que comprende un anticuerpo que reconoce al receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1), para identificar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, o para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que la padece es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Detalle microscopico de gran aumento de los ductos colectores renales (A), CRCCh (C) y OR (E) mostrando su tipica histologia en cortes histologicos tefidos con hematoxilinaeosina (aumentos originales, x400) y su respectivo patron de tincion inmunohistoquimica con CB1 de forma selectiva en las celulas intercalares del ducto colector (B) y de forma difusa en el CRCCh (D) y en el OR (F) [aumentos originales, x400].

Figura 2. Fotografia inmunohistoquimica de una muestra que contiene carcinoma renal de celulas claras (CRCC), en donde se observa inmunotincion negativa para CB1 en CRCC (parte derecha), y tejido renal normal notese que el tejido renal normal (no tumoral) que rodea al CRCC muestra una inmunorreaccion positiva en los tubulos proximales (parte izquierda). La tincion se realizo mediante un procedimiento como el descrito en el Ejemplo 1 [n° de aumentos: x100].

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Definiciones

Un "carcinoma renal de celulas cromofobas" o "CRCCh", tal como aqui se define, es un carcinoma renal que cumple las siguientes caracteristicas: tumor solido de borde expansivo, a menudo con capsula fibrosa, de color marron oscuro, sin necrosis o hemorragias aparentes, con propension a afectar la medula renal, compuesto por celulas de aspecto "vegetal", con membranas citoplasmicas nitidas y citoplasmas reticulados eosinofilicos, y nucleos cromaticos, con binucleacion frecuente, halo perinuclear claro y escasas mitosis.

El termino "diagnosticar" o "diagnostico", tal como aqui se usa se refiere a evaluar la probabilidad segun la cual un sujeto padece una determinada patologia (en este caso, una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal). Como entenderan los expertos en la materia, tal evaluacion puede no ser correcta para el 100% de los sujetos a diagnosticar, aunque se prefiere que lo sea. El termino, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadisticamente significativa de los sujetos como que padece dicha patologia (en este caso, una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal). El experto en la materia puede determinar si

3

una parte es estadisticamente significativa usando diversas herramientas de evaluacion estadistica bien conocidas, por ejemplo, mediante la determinacion de intervalos de confianza, la determinacion del valor de p, la prueba t de Student, la prueba de Mann-Whitney, etc. Pueden encontrarse informacion y detalles sobre dichas herramientas en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,001 o inferior.

La expresion "neoplasia originada en las celulas intercalares de la nefrona distal", tal como aqui se utiliza, se refiere a cualquier alteracion de los tejidos que produzca un aumento del volumen producido por un aumento en el numero de celulas intercalares de la nefrona distal independientemente de que sean de caracter benigno o maligno. La nefrona distal consta del tubulo contorneado distal, el tubulo colector tambien denominado tubulo conector y el conducto colector. Las celulas intercalares son las encargadas de la secrecion de protones (H+) y reabsorcion de bicarbonato (HCO3-). Las celulas intercalares tienen varias vesiculas apicales, micropliegues sobre su plasmalema apical y abundancia de mitocondrias, y sus nucleos son redondos de localizacion central. Ejemplos ilustrativos de tumores de la nefrona distal incluyen el carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCh) y el oncocitoma renal (OR).

Un "oncocitoma renal", tal como aqui se define, es un tumor benigno derivado de las celulas del tubulo renal distal. El oncocitoma renal es un tumor bien circunscrito pero no encapsulado, normalmente de color marron oscuro, que puede mostrar una cicatriz fibrosa central, asi como focos de hemorragia y/o cambios quisticos. Histologicamente, el tumor esta constituido por celulas poliedricas de pequefo tamafo, con citoplasmas eosinofilicos granulares y nucleos centrales cromaticos de contorno regular. Las celulas se disponen formando nidos solidos pequefos de aspecto «organoide» en un estroma variablemente hialinizado o mixoide. Ademas de este patron de crecimiento clasico, pueden observarse areas quisticas, tubulo-quisticas, pseudo-glandulares, o solidas. En las zonas con fibrosis estromal, o en vecindad de la cicatriz central si es que la hay, las celulas pueden mostrar un cierto aclaramiento del citoplasma haciendolas en parte semejantes a las celulas del carcinoma renal de celulas claras. De manera dispersa pueden observarse, de forma suelta o en pequefos grupos, celulas de talla pequefa, con alta relacion nucleo/citoplasma y nucleo hipercromatico denominadas por algunos autores "oncoblastos". La tincion del hierro coloidal es tipicamente negativa.

El termino "receptor de cannabinoides de tipo 1" o "CB1", tal como aqui se utiliza, se refiere a un receptor de cannabinoides perteneciente a la superfamilia de receptores de cannabinoides acoplados a proteina G, caracterizados por tener 7 dominios transmembrana capaces de regular proteinas G monomericas tales como Rap1 y Rho, o tirosina quinasas citosolicas tal como Src. Aunque existen al menos 5 receptores cannabinoides distintos, los 2 mas extendidos son el CB1 y el receptor de cannabinoides de tipo 2 (CB2). La secuencia aminoacidica de CB1 (proteina), cuyo numero de acceso en la base de datos NCBI de la variante humana es NP 001153698.1 (version del 26 de junio de 2012) se muestra en la SEQ ID NO: 1:

1 mksildglad ttfrtittdl lyvgsndiqy edikgdmask lgyfpqkfpl tsfrgspfqe

61 kmtagdnpql vpadqvnite fynkslssfk eneeniqcge nfmdiecfmv lnpsqqlaia

121 vlsltlgtft vlenllvlcv ilhsrslrcr psyhfigsla vadllgsvif vysfidfhvf

181 hrkdsrnvfl fklggvtasf tasvgslflt aidryisihr playkrivtr pkavvafclm

241 wtiaiviavl pllgwncekl qsvcsdifph idetylmfwi gvtsvlllfi vyaymyilwk

301 ahshavrmiq rgtqksiiih tsedgkvqvt rpdqarmdir laktlvlilv vliicwgpll

361 aimvydvfgk mnkliktvfa fcsmlcllns tvnpiiyalr skdlrhafrs mfpscegtaq

421 pldnsmgdsd clhkhannaa svhraaesci kstvkiakvt msvstdtsae al

CB1 es un peptido de 472 aminoacidos que se localiza en el sistema nervioso central, principalmente en el cerebro, en el bazo y las amigdalas, corazon, prostata, utero, ovario y a nivel presinaptico en terminales nerviosos simpaticos. Mediante diversos mecanismos de sefalizacion participa en el control de la funcionalidad neuronal por cannabinoides, incluyendo la transmision sinaptica, la supervivencia, o la diferenciacion y migracion celular. CB1 es activado por numerosos componentes, tales como neurotransmisores endocannabinoides [e.g., anandamida y 2-araquidonoil glicerido (2-AG)], fitocannabinoides [e.g., tetrahidrocannabinol (THC)], y cannabinoides sinteticos [e.g., dronabinol]. CB1 tiene numerosas implicaciones, por ejemplo, en analgesia, disminucion de ansiedad, e incremento de la lipogenesis y del apetito, entre otras. Su activacion es responsable de los efectos psicoactivos del consumo de THC, principio activo de la planta de Cannabis y de la resina de hachis. El termino "CB1", tal y como se usa en la presente descripcion, no se refiere unicamente a la proteina CB1 humana sino tambien a los ortologos de otras especies.

4

El termino "sujeto", tal como aqui se utiliza, se refiere a un miembro de una especie de un animal mamifero, e incluye, pero no se limita, a animales domesticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.

Metodos de la invencion

Los inventores han observado que el receptor de cannabinoide de tipo 1 (CB1) puede ser utilizado como un marcador de neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal; en concreto, se ha observado que dicho receptor (CB1) permite identificar, mediante metodos inmunohitoquimicos, el carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCh) y el oncocitoma renal (OR) frente a otros tumores renales mas frecuentes y agresivos tales como, por ejemplo, el carcinoma renal de celulas claras (CRCC), por lo que dicho marcador (CB1) permite establecer un diagnostico diferencial entre las neoplasias renales originadas en celulas intercalares de la nefrona distal (CRCCh y OR) que son CB1+ y el CRCC (CB1-), que es el cancer renal mas frecuente (70%). En el Ejemplo 1 se muestra, inequivocamente, la presencia de CB1 en neoplasias renales originadas en celulas intercalares de la nefrona distal tales como CRCCh y OR pero no en otros tumores renales mas frecuentes y agresivos como el CRCC. Por consiguiente, el empleo de CB1 como marcador de CRCCh y OR contribuye a facilitar el diagnostico diferencial de esta area de la Anatomia Patologica.

Por tanto, en un aspecto, la invencion se relaciona con un metodo in vitro para diagnosticar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, en adelante "primer metodo de la invencion", que comprende detectar, en una muestra de dicha neoplasia de dicho sujeto, la presencia del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1), en donde

El primer metodo de la invencion comprende esencialmente los pasos mencionados anteriormente aunque tambien puede incluir pasos adicionales, y se lleva a cabo in vitro, es decir, no se practica en el cuerpo humano o del animal.

Para la puesta en practica del primer metodo de la invencion, se obtiene una muestra de la neoplasia renal del sujeto bajo estudio. En una realizacion particular, dicha muestra comprende tejido tumoral o celulas tumorales de la neoplasia renal de dicho sujeto cuyo origen o naturaleza se desea conocer. Dicha muestra puede obtenerse por cualquier metodo convencional, por ejemplo, mediante biopsia, cistoscopia, reseccion quirurgica, etc., utilizando metodos bien conocidos por los tecnicos en la materia. En una realizacion particular, la muestra de neoplasia renal se obtiene mediante biopsia. A modo ilustrativo, la biopsia de neoplasia renal puede llevarse a cabo mediante la extraccion de un fragmento o trozo de tejido tumoral con una aguja tras su localizacion mediante ecografia u otra tecnica de imagen radiologica y la administracion de anestesia local. Para simplificar la conservacion y el manejo de las muestras, estas se pueden fijar en formalina y embeber en parafina, o, alternativamente, se pueden congelar primero y despues embeber en un medio criosolidificable, por ejemplo, Tissue-Tek® OCTp Compound (Sakura), mediante inmersion en un medio altamente criogenico que permite la congelacion rapida.

La presencia de CB1 en la muestra a analizar puede ser detectada mediante cualquier metodo convencional que permita detectar la presencia de una proteina, en concreto CB1, en una muestra, en particular, en una muestra de tejido. Practicamente cualquier metodo convencional para la deteccion de la presencia de una proteina en una muestra de tejido puede ser utilizado dentro del marco de la invencion para detectar la presencia de CB1. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos metodos incluyen metodos basados en el empleo de anticuerpos, tecnicas de cromatografia de afinidad, ensayos de union a ligandos, etc.

En una realizacion particular, la deteccion de la presencia de CB1 se realiza mediante un inmunoensayo basado en la formacion de un complejo de tipo antigeno-anticuerpo, mediante el empleo de uno (o mas anticuerpos) que reconocen uno (o mas) epitopos de CB1, y posterior visualizacion de los complejos formados por cualquier tecnica apropiada, incluyendo tanto tecnicas radiactivas como no radiactivas tales como, por ejemplo, tecnicas colorimetricas, fluorimetricas, luminiscentes (e.g., bioluminiscentes, quimioluminiscentes, etc.), etc., utilizando para ello, en su caso, unos anticuerpos secundarios marcados con los marcadores apropiados.

Los anticuerpos a utilizar para la puesta en practica de esta realizacion particular del primer metodo de la invencion son anticuerpos frente a CB1, o frente a un fragmento antigenico de CB1, es decir, anticuerpos que reconocen un epitopo de CB1. Los anticuerpos que pueden utilizarse en este tipo de ensayos pueden ser sueros policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, scFv ("single chain Fv"), diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos humanizados, etc. capaces de reconocer y unirse a CB1, o a un fragmento antigenico de la misma. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de anticuerpos utiles para la puesta en practica de la presente invencion que reconocen la proteina CB1 humana incluyen el anticuerpo policlonal identificado como PA1-743 (ABR Affinity BioReagents, Estados Unidos), el anticuerpo

5

policlonal identificado con el n° de catalogo 216401 (Calbiochem), el anticuerpo monoclonal identificado con el n° de catalogo 101500 (Cayman Chemical), el anticuerpo policlonal identificado con el n° de catalogo sc-10066 (Santa Cruz) y el anticuerpo policlonal identificado con el n° de catalogo C1233 (Sigma). Los anticuerpos que reconocen a CB1 pueden estar, opcionalmente, conjugados a un portador; asimismo, dichos anticuerpos que reconocen a la proteina CB1 pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de marcadores que pueden ser utilizados incluyen isotopos radiactivos, enzimas, fluoroforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos o cofactores enzimaticos, inhibidores enzimaticos, particulas, colorantes, etc.

Existen una amplia variedad de ensayos bien conocidos por los tecnicos en la materia que se pueden usar para la puesta en practica de esta realizacion particular del primer metodo de la invencion, que usan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) que reconocen a CB1 y anticuerpos marcados (anticuerpos secundarios); entre estas tecnicas se incluyen Western-blot o inmunotransferencia, ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA (inmunoensayo enzimatico) competitivo, DAS-ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo), ensayos inmunohistoquimicos, ensayos inmunofluorescentes, ensayos de inmunoprecipitacion, etc.

En una realizacion preferida, la deteccion de la presencia de CB1 se lleva a cabo mediante inmunohistoquimica o "IHC" (del ingles, "immunohistochemistry"). En general, la IHC es un procedimiento histopatologico conocido que se basa en la utilizacion de un anticuerpo especifico, normalmente marcado con un marcador (por ejemplo, una enzima), que puede transformar un sustrato en un compuesto visible sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antigeno (CB1 en este caso), aplicado a una muestra de tejido organico. Con la utilizacion de alguna de las tecnicas especificas (peroxidasa, antiperoxidasa, fluoresceina, etc.), el complejo antigeno-anticuerpo formado puede localizarse e identificarse en las muestras tisulares o citologicas a estudiar, con lo que se identifican los marcadores antigenicos caracteristicos de distintas celulas y se puede determinar el tipo de celula involucrado en la muestra.

La muestra que comprende tejido de neoplasia renal a analizar con el fin de detectar la presencia de CB1 mediante IHC (o analisis inmunohistoquimico) puede ser una muestra fresca, una muestra congelada o una muestra embebida en parafina y fijada usando un agente protector del tipo de formalina o similar. En una realizacion particular, el analisis inmunohistoquimico se lleva a cabo tifendo la muestra a analizar con un anticuerpo especifico frente a CB1 y determinando la frecuencia de celulas que se han tefido y la intensidad de la tincion. Ventajosamente, la deteccion mediante IHC de la presencia de CB1 en la muestra a analizar se lleva a cabo en paralelo con muestras tisulares o citologicas que sirven como marcador positivo y como marcador negativo, y, si se desea, como referencia, se pueden usar tejidos sanos del mismo origen que el tumor que se esta analizando. Tambien es frecuente usar un control de fondo. Tipicamente, se asigna a la muestra un valor indicativo de la expresion total que se calcula en funcion de la frecuencia de celulas tefidas y de la intensidad en cada una de las celulas tefidas. Los criterios tipicos para asignar valores de expresion a las muestras han sido descritos en, por ejemplo, Handbook of Immunohistochemistry and In Situ Hybridization in Human Carcinomas,

M. Hayat Ed., 2004, Academic Press.

La deteccion de la presencia de CB1 mediante IHC presenta diversas ventajas ya que se utiliza de forma generalizada en los Laboratorios de Anatomia Patologica, lo que posibilita la aplicabilidad inmediata del primer metodo de la invencion mediante dicha tecnica, y, ademas, se encuentra muy automatizada, lo que facilita que se realice bajo las mismas condiciones.

A partir de la deteccion de la presencia de CB1 en una muestra de neoplasia renal que comprende tejido tumoral, es posible relacionar la deteccion de la presencia (o ausencia) de CB1 con el origen o naturaleza de la neoplasia renal que padece el sujeto.

Asi, en una etapa posterior, el primer metodo de la invencion implica correlacionar la deteccion de la presencia (o ausencia) del CB1 con un diagnostico sobre la naturaleza de la neoplasia renal que padece el sujeto bajo estudio. Esta correlacion puede indicar que dicha neoplasia renal es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal, por ejemplo, OR o CRCCh, cuando se detecta la presencia de CB1 en la muestra de neoplasia renal analizada; por tanto, en este caso, el sujeto bajo estudio padece una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal, por ejemplo, OR o CRCCh. Alternativamente, esa correlacion puede indicar que dicha neoplasia renal no es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal, cuando no se detecta la presencia de CB1 en la muestra de neoplasia renal analizada; en este caso, el sujeto bajo estudio padece una neoplasia renal que no es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal, por ejemplo, OR o CRCCh, sino una neoplasia renal de otro origen, por ejemplo, carcinoma renal de celulas claras (CRCC) o carcinoma renal papilar (CRP). Por tanto, la informacion proporcionada por el primer metodo de la invencion puede ser utilizada eficientemente por el especialista para seleccionar la terapia a administrar al sujeto mas apropiada en funcion del tipo de neoplasia renal que padece, optimizando de este modo la atencion terapeutica a aplicar al sujeto y evitando los inconvenientes asociados con la aplicacion de un tratamiento inapropiado.

En el sentido utilizado en esta descripcion, la expresion "deteccion de la presencia de CB1", o similar, se refiere a la capacidad de detectar CB1 en la muestra analizada utilizando alguno de los metodos a los que se ha hecho

6

referencia previamente. Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripcion, la expresion "no deteccion de la presencia de CB1", o similar, se refiere a la incapacidad de detectar CB1 en la muestra analizada utilizando alguno de los metodos a los que se ha hecho referencia previamente.

En una realizacion particular, el metodo utilizado para detectar la presencia de CB1 comprende un inmunoensayo. En una realizacion mas particular, dicho metodo comprende someter la muestra que comprende tejido de la neoplasia renal a analizar a un analisis inmunohistoquimico que comprende poner en contacto dicha muestra, previamente acondicionada, con un anticuerpo primario frente a CB1, tal como, por ejemplo, el anticuerpo policlonal PA1-743 (ABR Affinity BioReagents), a una dilucion 1:1000, peroxido de hidrogeno y diaminobencidina (DAB), y contratincion con hematoxilina. En general, antes de poner la muestra en contacto con el anticuerpo frente a CB1 la muestra es acondicionada apropiadamente; para ello, la muestra puede ser sometida, en caso necesario, a un tratamiento que comprende fijar el tejido, obtener cortes de espesor adecuado, recuperar el antigeno, bloquear moleculas que puedan interferir en la reaccion indirecta (por ejemplo, mediante tratamiento con reactivo bloqueante de peroxidasa), evitar uniones inespecificas, incubar con reactivo bloqueante de avidina e incubar con reactivo bloqueante de biotina, todo ello acompafado, en su caso, de los correspondientes lavados. De este modo, determinando la frecuencia de celulas que se han tefido y la intensidad de la tincion es posible establecer si se detecta (o no) la presencia de CB1 en la muestra analizada. Ventajosamente, la deteccion de la presencia de CB1 se lleva a cabo en paralelo con muestras tisulares o citologicas que sirven como marcador positivo y como marcador negativo, y, si se desea, como referencia, se pueden usar tejidos sanos del mismo origen que el tumor que se esta analizando, asi como un control de fondo. Tipicamente, se asigna a la muestra un valor indicativo de la expresion total que se calcula en funcion de la frecuencia de celulas tefidas y de la intensidad en cada una de las celulas tefidas.

En el Ejemplo 1 se describe de forma detallada un protocolo de un analisis inmunohistoquimico que permite la deteccion de la presencia de CB1 en muestras que comprenden tejido de neoplasia renal. La deteccion de la presencia de CB1 en tales muestras segun el protocolo descrito en el Ejemplo 1 es indicativa de que dicha neoplasia renal es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal, por ejemplo, OR o CRCCh; por el contrario, la no deteccion de la presencia de CB1 en la muestra de neoplasia renal analizada segun dicho protocolo descrito en el Ejemplo 1 es indicativa de que dicha neoplasia renal no es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal sino que es una neoplasia renal de otro origen o naturaleza, por ejemplo, CRCC o CRP.

Por tanto, el primer metodo de la invencion permite identificar si el sujeto bajo estudio padece una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal, tal como CRCCh u OR, o si, por el contrario, la neoplasia renal que padece no es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal, por ejemplo CRCC. Efectivamente, el CB1 puede ser utilizado como marcador diferencial entre carcinomas renales que morfologicamente son similares, tales como el CCRCh (CB1+) y el CRCC (CB1-), lo cual es muy importante porque el CRCC representa el 70% de los carcinomas renales.

La identificacion correcta y precisa del tipo de neoplasia renal posibilita la aplicacion al sujeto del tratamiento terapeutico apropiado segun se trate de un tumor maligno o benigno.

Relacionado con este aspecto inventivo, el experto en la materia entendera que la invencion tambien proporciona un metodo in vitro para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que padece una neoplasia renal es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, en adelante "segundo metodo de la invencion", que comprende detectar en una muestra de dicha neoplasia de dicho sujeto la presencia de CB1, en donde

Dicho segundo metodo de la invencion constituye, por tanto, un aspecto inventivo adicional de esta invencion.

Las caracteristicas de la muestra, sujeto, CB1 y forma de detectar la presencia de CB1 en la muestra del sujeto bajo estudio ya han sido mencionadas previamente en relacion con el primer metodo de la invencion y se incorporan aqui por referencia.

Usos de la invencion

Los inventores de la presente invencion han demostrado que CB1 puede ser identificado en neoplasias renales originadas en celulas intercalares de la nefrona distal, tales como CRCCh y OR pero no en otros carcinomas renales tales como, por ejemplo, CRCC, el tipo de carcinoma renal mas frecuente (70% aproximadamente) y agresivo; es decir, CB1 puede ser utilizado como marcador para el diagnostico diferencial entre CRCC, CB1 negativo (CB1-), y tumores de la nefrona distal CB1 positivos (CB1+) tales como CRCCh y OR.

7

Por tanto, en otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1) como marcador de una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal. En una realizacion particular, dicha neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal se selecciona entre CRCCh y OR. En otra realizacion particular, dicho CB1 es identificado en una muestra que comprende tejido o celulas tumorales procedentes de una neoplasia renal mediante un analisis inmunohistoquimico.

Asimismo, en otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1) como marcador para el diagnostico diferencial entre una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal y carcinoma renal de celulas claras (CRCC). En una realizacion particular, dicha neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal se selecciona entre CRCCh y OR. En otra realizacion particular, dicho diagnostico diferencial comprende la realizacion de un analisis inmunohistoquimico para detectar la presencia de CB1 en una muestra de neoplasia renal.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de un anticuerpo que reconoce la proteina receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1), para identificar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, o para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que la padece es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal. Dicho anticuerpo que reconoce la proteina CB1 puede ser utilizado en cualquier metodo convencional que permita detectar la presencia de CB1 en una muestra, tal como cualquiera de los inmunoensayos mencionados previamente en relacion con el metodo de la invencion. En una realizacion particular, dicho inmunoensayo es un analisis inmunohistoquimico.

En otro aspecto, la invencion se relaciona con el uso de un kit que comprende un anticuerpo que reconoce la proteina receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1) para identificar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, o para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que la padece es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal.

El termino "kit", tal como aqui se utiliza, se refiere a un producto que contiene los distintos reactivos necesarios para llevar a cabo los metodos de la invencion empaquetados para permitir su transporte y almacenamiento. Materiales adecuados para el empaquetado de los componentes del kit incluyen cristal, plastico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobres y similares. Adicionalmente, los kits de la invencion pueden contener instrucciones para el uso simultaneo, secuencial o separado de los distintos componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden encontrarse en forma de material impreso o en forma de un soporte electronico capaz de almacenar instrucciones de forma que puedan ser leidas por un sujeto, tales como medios de almacenamiento electronicos (discos magneticos, cintas y similares), medios opticos (CD-ROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de Internet que proporcionen dichas instrucciones. En una realizacion particular, dicho kit comprende los reactivos necesarios para realizar un inmunoensayo, preferentemente, un analisis inmunohistoquimico, para detectar la presencia de CB1; para ello, dicho kit incluira un anticuerpo que reconoce a CB1.

La invencion se ilustra a continuacion en base al siguiente ejemplo, que se proporciona a modo ilustrativo y no limitativo del alcance de la invencion.

EJEMPLO 1

Identificaci6n de CB1 en neoplasias originadas en celulas intercalares de la nefrona distal

Materiales yMetodos

Para la realizacion de este ensayo se utilizo un analisis inmunohistoquimico ya que esa tecnica es la usada de forma generalizada en los Laboratorios de Anatomia Patologica y posibilita su aplicabilidad inmediata.

Como sustrato se utilizaron fragmentos de tejido renal humano procedente de tumores renales, en concreto, piezas renales extirpadas a pacientes con los tipos mayoritarios de carcinomas renales (CRCC y CRCCh) o con OR. Dichas muestras fueron enviadas al Servicio de Anatomia Patologica del Hospital de Cruces con fines diagnosticos.

El proceso de fijacion del tejido tiene como objetivo aumentar la consistencia de un tejido mediante la desnaturalizacion de sus proteinas e impedir la difusion de las moleculas que se pretenden detectar. Las muestras objeto de estudio se fijaron con formol tamponado al 10% (v/v) durante 24-48 h. Posteriormente se realizo el tallado de la pieza, obteniendose una muestra representativa. Antes de la inclusion en parafina se llevo a cabo la deshidratacion del tejido, mediante 2 bafos de etanol al 96%, 2 bafos de etanol al 100% y 2 bafos de xileno, cada uno de ellos de 1 h de duracion. Finalmente, el tejido se incluyo en parafina liquida durante 2 h a una temperatura de 58-62°C, lo que posibilitaba el almacenamiento de las muestras a temperatura ambiente hasta su procesamiento posterior.

De los bloques anteriormente mencionados, se obtuvieron, mediante un microtomo (HM 340 E, Microm), cortes de 5 micrometros (!m) de espesor que se colocaron en un bafo de flotacion con agua destilada a 50°C con el objetivo de conseguir el estiramiento optimo de los mismos. A continuacion, los cortes se recogieron sobre unos

8

portaobjetos polilisinados convenientemente etiquetados y se fijaron en una estufa (Memmert) durante 1 h a 60°C.

Para el desparafinado y la hidratacion del tejido se realizaron 3 bafos de xileno de 5 min cada uno, y, a continuacion, 2 bafos de alcohol al 100%, 2 bafos de alcohol al 95% y 1 bafo de agua destilada, cada bafo de 1-2 min de duracion. Los portaobjetos se mantuvieron en este ultimo bafo de agua destilada hasta el paso siguiente.

Tras el desparafinado e hidratacion de la muestra, se procedio a la recuperacion antigenica. Para ello, los portaobjetos se introdujeron en una cubeta con Tris-EDTA (acido etilendiaminotetraacetico) y la cubeta se introdujo en una camara de presion (Decloaking Chamber, Biocare Medical) con un programa en 2 pasos. En primer lugar, la temperatura fue subiendo hasta alcanzar 125°C, temperatura que se mantuvo durante 10 min, y, a continuacion, se disminuyo la temperatura a 90°C, durante 10 s. Pasado este tiempo, los portaobjetos se dejaron enfriar a temperatura ambiente (20-22°C) durante 10 min.

La inmunotincion se realizo de manera automatizada en un autotefidor Autostainer Plus (Dako) utilizando un sistema de visualizacion EnVisionTM FLEX (Dako). Tras lavar los portaobjetos con PBS (tampon fosfato salino) se cubrio la muestra con un reactivo bloqueador de peroxidasa (Biocare Medical, Concorde, EEUU) durante 15 min, con el fin de bloquear moleculas del tejido que pudieran interferir en la reaccion indirecta. A continuacion, las muestras se lavaron con PBS y, posteriormente, con el reactivo bloqueador Background Sniper (Biocare Medical, Concorde, EEUU) durante 10 min, para evitar uniones inespecificas; finalmente, los portaobjetos se lavaron de nuevo con PBS, se cubrieron con el reactivo bloqueante de avidina del kit Avidin-Biotin Blocking (Biocare Medical, Concorde, EEUU), se incubaron durante 10 minutos, y, tras otro lavado con PBS, se cubrieron con reactivo bloqueante de biotina del kit Avidin-Biotin Blocking (Biocare Medical, Concorde, EEUU), y se volvieron a incubar durante 10 minutos. Tras 3 lavados con PBS, se incubaron las muestras con el anticuerpo primario anti-CB1 (ABR Affinity BioReagents, ref.: PA1-743, dilucion 1:1000), cubriendo bien las secciones de tejido, durante 20 minutos. Posteriormente, se lavaron los portaobjetos en PBS durante 5 min y se aplico el sistema de visualizacion EnVisionTM FLEX (Dako), que comprende una solucion de peroxido de hidrogeno, durante 20 min. Pasado ese tiempo se lavaron las secciones en PBS durante 5 min. Tras un lavado en PBS durante 5 min, se aplico el sustrato diaminobencidina (DAB) (Biocare Medical, Concorde, EEUU) y se dejo incubar durante 5 min. Tras 2 lavados, el primero con PBS y el segundo con agua destilada, se realizo el contraste del tejido con un preparado de hematoxilina durante 5 min.

A continuacion, se lavo el tejido con PBS y se procedio a su deshidratacion gradual a traves de alcoholes al 70, 80, 95 y 100%, durante 1 min cada uno. Finalmente, las secciones se bafaron en xileno, donde se mantuvieron hasta el siguiente paso.

Por ultimo, los portaobjetos se secaron por su parte posterior, donde no se encontraba el tejido, manteniendo la humedad del tejido con xileno residual y se les aplico unas gotas de medio de montaje Eukit (Labolan, Esparza del Galar, Navarra, Espafa) directamente en la zona de tejido. Se coloco el cubreobjetos suavemente y se empujaron hacia afuera las burbujas que se formaron. Los controles positivo y negativo de inmunotincion de CB1 se realizaron de manera interna en el parenquima renal adyacente, el cual tiene un patron de distribucion de este receptor totalmente especifico ya descrito por este grupo en articulos previamente publicados (Larrinaga G et al., Expression of cannabinoid receptors in human kidney. Histol Histopathol. 2010, 25(9):1133-8; Larrinaga G et al., Cannabinoid CBΌ receptor is downregulated in clear cell renal cell carcinoma. J Histochem Cytochem. 2010, 58(12):1129-34).

Resultados

Este proceso se realizo con un numero significativo (n=20) de muestras de todos los tipos histologicos mayores de carcinomas renales (CRCC y CRCCh) y de OR para determinar si CB1 se expresaba en ellos o no, y si lo hacia en cuales y de que manera.

Tal y como se observa en la Figura 1, la tincion de CB1 era citoplasmica intensa en las celulas proliferantes de todos (100%) los CRCCh y OR testados. El rifon normal o sano (no-tumoral) expresa CB1 en todo el sistema tubular, con especial intensidad en las celulas intercalares de la nefrona distal, lugar de origen propuesto para los tumores CRCCh y OR, mientras que en la condiciones ensayadas no se detecta la presencia de CB1 en glomerulo (esas partes del rifon normal podran servir, por tanto, como control negativo).

No se observo inmunotincion de CB1 en las celulas proliferantes de ninguno (0%) de los CRCC ensayados. La Figura 2 (Larrinaga G et al., Cannabinoid CBΌ receptor is downregulated in clear cell renal cell carcinoma. J Histochem Cytochem. 2010, 58(12):1129-34) pone de manifiesto la inmunotincion negativa para CB1 en CRCC (parte derecha); en dicha figura puede observarse que el tejido renal normal (no tumoral) que rodea al CRCC muestra una inmunorreaccion positiva en los tubulos proximales (parte izquierda).

Los resultados obtenidos permiten concluir que:

9

-: CB1 es identificado por metodos inmunohistoquimicos en neoplasias renales originadas en celulas intercalares de la nefrona distal, tales como CRCCh y OR, pero no es identificado en CRCC, el tipo de carcinoma real mas frecuente (70% aproximadamente) y agresivo;

-: CB1 puede ser utilizado como marcador de neoplasias renales originadas en celulas intercalares de la nefrona distal, tales como CRCCh y OR; y

-: CB1 puede ser utilizado como marcador para el diagnostico diferencial entre CRCC (CB1-) y los tumores de la nefrona distal CRCCh y OR (CB1+).

10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo in vitro para diagnosticar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, que comprende detectar, en una muestra de dicha neoplasia de dicho sujeto, la presencia del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1), en donde

-

la deteccion de la presencia de CB1 en dicha muestra es indicativa de que dicho sujeto padece una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal; o en donde

-

la no deteccion de la presencia de CB1 en dicha muestra es indicativa de que dicha neoplasia no es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal.
2. Un metodo in vitro para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que padece una neoplasia renal es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, que comprende detectar en una muestra de dicha neoplasia de dicho sujeto la presencia de CB1, en donde

-

la deteccion de la presencia de CB1 en dicha muestra es indicativa de que dicha neoplasia es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal; o en donde

-

la no deteccion de la presencia de CB1 en dicha muestra es indicativa de que dicha neoplasia no es una neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal.
3.

Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, en el que dicha neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal se selecciona entre carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCh) y oncocitoma renal (OR).
4.

Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra de neoplasia renal es una muestra obtenida mediante biopsia o reseccion quirurgica.
5.

Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la deteccion de la presencia de CB1 se lleva a cabo mediante un inmunoensayo.
6.

Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la deteccion de la presencia de CB1 se lleva a cabo mediante un analisis inmunohistoquimico.
7.

Uso del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1) como marcador de una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal.
8.

Uso segun la reivindicacion 7, en el que dicha neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal se selecciona entre carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCh) y oncocitoma renal (OR).
9.

Uso del receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1) como marcador para el diagnostico diferencial entre una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal y carcinoma renal de celulas claras (CRCC).
10.

Uso segun la reivindicacion 9, en el que dicha neoplasia renal originada en celulas intercalares de la nefrona distal se selecciona entre carcinoma renal de celulas cromofobas (CRCCh) y oncocitoma renal (OR).
11.

Uso segun la reivindicacion 9 o 10, en el que dicho diagnostico diferencial comprende la realizacion de un analisis inmunohistoquimico para detectar la presencia de CB1 en una muestra de neoplasia renal.
12.

Uso de un anticuerpo que reconoce el receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1) para identificar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, o para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que la padece es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal.
13.

Uso de un kit que comprende un anticuerpo que reconoce al receptor de cannabinoides de tipo 1 (CB1), para identificar si un sujeto padece una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal, o para identificar si una neoplasia renal en un sujeto que la padece es una neoplasia originada en celulas intercalares de la nefrona distal.

11

FIG. 1

12

13

Lista de secuencias

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201231588

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 16.10.2012

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : G01N33/574 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

TRUONG LUAN D et al. "Immunohistochemical Diagnosis of Renal Neoplasms" Archives of Pathology & Laboratory Medicine ENERO 2011 01.2011 VOL: 135 No: 1 Págs: 92-109 ISSN 0003-9985(print) ISSN 1543-2165(electronic); todo el documento. 1-13

A

ZHOU M. et al. "The usefulness of immunohistochemical markers in the differencial diagnosis of renal neoplasms" Clinics in Laboratory Medicine (2005) Vol. 25, N°. 2, páginas 247-257; DOI: 10.1016/j.cll.2005.01.004; todo el documento. 1-13

A

LARRINAGA GORKA et al. Cannabinoid CB1 Receptor Is Downregulated in Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Journal of Histochemistry & Cytochemistry DIC 2010 12.2010 VOL: 58 No: 12 Págs: 1129-1134 ISSN 0022-1554(print) ISSN 1551-5044(electronic) Doi: doi:10.1369/jhc.2010.957126; todo el documento. 1-13

A

BLANCO L. et al. "Acid, basic, and neutral peptidases present different profiles in chromophobe renal cell caracinoma and in oncocytoma" American Journal of Physiology: Renal Physiology (23 enero 2008) Vol. 294, páginas F850-F858; DOI: 10.1152/ajprenal.00469.2007; todo el documento. 1-13

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 26.09.2013

Examinador M. Á. García Coca Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201231588

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) G01N Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de

búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, bases de datos de texto completo TXT, NCBI, BIOSIS, MEDLINE/NLM, EMBASE/Elsevier, XPESP, XPESP2

Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201231588

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 26.09.2013

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-13 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-13 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201231588

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

TRUONG LUAN D et al. "Immunohistochemical Diagnosis of Renal Neoplasms" Archives of Pathology & Laboratory Medicine ENERO 2011 01.2011 VOL: 135 No: 1 Págs: 92-109 ISSN 0003-9985(print) ISSN 1543-2165(electronic). 31.12.2010

D02

ZHOU M. et al. "The usefulness of immunohistochemical markers in the differencial diagnosis of renal neoplasms" Clinics in Laboratory Medicine (2005) Vol. 25, N°. 2, páginas 247-257; DOI: 10.1016/j.cll.2005.01.004. 01.01.2005

D03

LARRINAGA GORKA et al. Cannabinoid CB1 Receptor Is Downregulated in Clear Cell Renal Cell Carcinoma.Journal of Histochemistry & Cytochemistry DIC 2010 12.2010 VOL: 58 No: 12 Págs: 1129-1134 ISSN 0022-1554(print) ISSN 1551-5044(electronic) Doi: doi:10.1369/jhc.2010.957126. 30.11.2010

D04

BLANCO L. et al. "Acid, basic, and neutral peptidases present different profiles in chromophobe renal cell caracinoma and in oncocytoma" American Journal of Physiology: Renal Physiology (23 enero 2008) Vol. 294, páginas F850-F858; DOI: 10.1152/ajprenal.00469.2007. 23.01.2008
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

El objeto de la invención, tal y como se recoge en las reivindicaciones 1-13, es un método in vitro para diagnosticar e identificar si un sujeto padece una neoplasia originada en células intercalares de la nefrona distal (carcinoma renal de células cromóforas y oncocitoma renal). El método se basa en la detección de la presencia del receptor de cannabiniodes de tipo 1 (CB1), de forma que la presencia de dicho receptor es indicativo de que el sujeto padece una neoplasia originada en células intercalares de la nefrona distal (reiv. 1-6). Es también objeto de la invención el uso de CB1 como marcador de una neoplasia originada en células intercalares de la nefrona distal, y como marcador diferencial entre dicho tipo de neoplasia, y el carcinoma renal de células claras (reiv. 7-11). Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo que reconoce a CB1, y el uso de un kit que comprende dicho anticuerpo, para la realización del método de la invención (reiv. 12 y 13).

Novedad (art. 6.1 de la Ley 11/1986 de Patentes) y Actividad Inventiva (art. 8.1 de la Ley 11/1986 de Patentes).

El documento D01 divulga distintos inmunomarcadores para las neoplasias renales. En este documento se indica que el carcinoma renal de células cromóforas (CRCCh) y el carcinoma renal de células claras (CRCC) presentan un perfil inmunohistoquímico distinto. Los marcadores positivos específicos para CRCCh, son cadherina específica de riñón, CD117 y CK7, mientras que los marcadores positivos específicos para CRCC son CD10, el marcador de carcinoma renal de células (RCC) y la anhidrasa carbónica IX. En este documento se indica, que incluso sería posible diferenciar entre CRCCh y el oncocitoma renal en base a sus perfiles inmunohistoquímicos.

El documento D02 también divulga distintos inmunomarcadores para las neoplasias renales. En este documento se indica que los marcadores más útiles para el diagnóstico diferencial entre CRCCh y CRCC, son CK7, CD10, vimentina, CD117, parvalbúmina y la cadherina E. Los marcadores positivos específicos para CRCCh, son la cadherina E, parvalbúmina, CD117 y CK7, mientras que los marcadores positivos específicos para CRCC son CD10, el marcador de carcinoma renal de células (RCC) y vimentina.

El documento D03 divulga que el receptor de cannabiniodes de tipo 1 (CB1), que se expresa riñones adultos sanos, no se expresa en el carcinoma renal de células claras (CRCC), indicando que el CB1 puede ser un marcador diferencial para el diagnóstico de dicha enfermedad, la cual se cree que se origina en células intercalares de la nefrona proximal.

El documento D04 divulga los perfiles de expresión de distintas peptidasas en tres tipos de carcinomas renales: CRCCh, CRCC y oncocitomas. La expresión de las distintas peptidasas se ve menos disminuida, respecto a su expresión en el tejido sano, cuanto peor es el pronóstico, de forma que para el caso de la aminopeptidasa APN (alanil aminopeptidasa de membrana o aminopeptidasa N) en los oncocitomas (tumores benignos) su expresión se ve disminuida unas 30 veces, en el CRCCh (tumor maligno) se ve disminuida unas 17 veces, y en el caso de CRCC (tumor de peor pronóstico) se ve disminuida unas 5 veces (ver tabla 2).

Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201231588

En el estado de la técnica ya se encuentran divulgados distintos marcadores tanto para CRCCh/oncocitoma como para CRCC. Por lo tanto, el problema que resolvería la invención, sería la provisión de un marcador alternativo para dichas enfermedades, en concreto, para el diagnóstico de CRCCh, y para el diagnóstico diferencial entre CRCCh/oncocitoma y CRCC. Hay que tener en cuenta que el receptor de cannabiniodes de tipo 1 (CB1) se encuentra divulgado como marcador de CRCC (ver documento D03). Sin embargo, aunque en el estado de la técnica ya se conoce que este receptor no se expresa en CRCC, no resulta obvio que dicho receptor se sobre-exprese en CRCCh, ya que se conoce que existen marcadores de neoplasias renales que, en los perfiles inmunohistoquímicos, dan positivo (por ejemplo la queratina AE1/AE3, ver documento D01) o negativo (por ejemplo la citoqueratina de alto peso molecular, ver documento D02) en ambas patologías, por lo que no resultaría evidente para un experto en la materia la utilización del mismo para diagnosticar el CRCCh a partir de los documentos mencionados anteriormente.

En conclusión, ninguno de los documentos citados, tomados solos o en combinación, revelan la invención definida en las reivindicaciones 1-13. Además, en los documentos citados no hay sugerencias que dirijan al experto en la materia hacia la invención definida por dichas reivindicaciones.

Por lo tanto, la invención reivindicada en las reivindicaciones 1-13 es nueva e implica actividad inventiva en el sentido de los artículos 6.1 y 8.1 de la Ley 11/1986 de Patentes.

Informe del Estado de la Técnica Página 5/5