ES2505245T3 - Alérgeno producido de manera recombinante - Google Patents
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Abstract
Un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.
Description
Alérgeno producido de manera recombinante
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la alergia. Más específicamente, la invención se refiere a la identificación de nuevos alérgenos de mamíferos y al diagnóstico y tratamiento de la alergia a mamíferos.
Antecedentes
La caspa de perro es una causa común de alergia de interiores con síntomas que incluyen rinitis, conjuntivitis, inflamación bronquial y asma. Los alérgenos de perro se pueden detectar no sólo en las viviendas donde los perros son mantenidos como mascotas, sino también en otros lugares, como escuelas y centros de día donde los perros no están presentes de forma regular [1].
La alergia al perro se acompaña y depende de la sensibilización a las proteínas liberadas por pelos y caspa de perro. En los casos de sospecha de alergia a perros, la investigación clínica incluye la evaluación de la sensibilización por el pinchazo de la piel o la medición de anticuerpos IgE específicos utilizando extracto de pelo y/o caspa de perro. Un inmunoanálisis de laboratorio para IgE específica, tal como Phadia ImmunoCAP™, puede detectar la mayoría de los casos de sensibilización a perro utilizando extracto natural de caspa de perro, debido a las favorables condiciones de análisis y a una gran fase sólida disponible para el anclaje del alérgeno.
Los extractos de pelo y caspa de perro contienen una complejidad de proteínas alergénicas y no alergénicas [2, 3]. Hasta ahora se han identificado y estudiado en detalle cuatro alérgenos de perro: Can f 1, Can f 2, Can f 3 y Can f 5 [4-6]. Los dos primeros son ambos miembros de la familia de proteínas de lipocalina y se han purificado y expresado como proteínas recombinantes [4, 7]. Can f 3, albúmina de suero perro, es una proteína relativamente conservada que muestra considerable reactividad cruzada con otras albúminas de mamíferos [8]. Can f 5, calicreína prostática de perro, se ha descrito recientemente como un alérgeno principal de perro y muestra reacción cruzada con el antígeno específico de próstata humano (PSA) [5].
De los alérgenos de caspa de perro conocidos hasta la fecha, Can f 1 y Can f 5 parecen ser los más importantes, uniéndose a anticuerpos IgE de aproximadamente 50% y 70% de los sujetos alérgicos al perro, respectivamente [5, 9]. Aunque aproximadamente 20-40% de los individuos adultos alérgicos al perro presenta unión del anticuerpos IgE a Can f 2 o Can f 3, pocos parecen reaccionar exclusivamente o incluso predominantemente a cualquiera de estos alérgenos [5, 9]. En un estudio recientemente referido, se encontró que una pequeña proporción de pacientes alérgicos al perro no presentaba unión del anticuerpo IgE a ninguno de Can f 1, Can f 2, Can f 3 y Can f 5, a pesar de estar sensibilizados a extracto de caspa natural de perro [5].
Además de los alérgenos mencionados anteriormente, se ha informado sobre una proteína de tipo lipocalina de 18 kDa, reactiva con IgE, distinta de Can f 1 y Can f 2, y se ha denominado Can f 4 [9]. Se informó de que 15 de 25 (60%) pacientes alérgicos al perro presentaban reactividad de IgE en suero con esta banda de 18 kDa en la inmunotransferencia, haciendo de ésta un componente potencialmente importante de alérgeno perro. Sin embargo, el alérgeno sólo se ha caracterizado como una secuencia N-terminal de 13 de aminoácidos a partir de un gel de SDS PAGE, una secuencia que no produce emparejamientos con ninguna otra secuencia de proteína conocida de perro. La secuencia de proteína completa es por tanto desconocida, y no se ha llevado a cabo la clonación de una proteína recombinante. Tampoco se ha purificado la proteína nativa, y no se ha proporcionado ninguna sugerencia en cuanto a cómo se podría completar la clonación de Can f 4.
En un resumen de Saarelainen et al. publicado en Abstract Book of 3rd International Symposium on Molecular Allegology en Salzburgo, de 18 a 20 de Abril de 2008, se establece que un mAb específico de Can f 4 reconocía una proteína de 20 kDa en un extracto de caspa de vaca.
En una edición especial de la revista científica Allergy que publica los resúmenes del XXVIII Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (EAACI) en Varsovia de 6 a 10 de Junio de 2009, existe un resumen que describe que se ha clonado un ADNc que codifica Can f 4 completo [Allergy 64 (Supl. 90): 179-538). Sin embargo no se indica sobre cómo se podría lograr esta clonación y no se proporciona ninguna secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos.
El registro de la base de datos de NCBI Protein XP_581277, introducido el 30 de Septiembre 2005, contiene una proteína de tipo proteína de unión a odorante pronosticada de 172 aminoácidos. La secuencia se proporciona en esta solicitud como SEQ ID NO: 4.
Compendio de la invención
Los autores de la presente invención han identificado la necesidad en la técnica de una caracterización y validación adicionales de la trascendencia del alérgeno Can f 4.
2 15
Como se ha establecido anteriormente, un inmunoanálisis de laboratorio para la IgE específica puede detectar la mayoría de los casos de sensibilización a perros utilizando extracto natural caspa de perro, debido a las condiciones de análisis favorables y a una gran fase sólida disponible para el anclaje del alérgeno. Sin embargo, en un inmunoanálisis miniaturizado o no de laboratorio, tal como una micromatriz de alérgeno o una prueba de consultorio médico, se ha encontrado que la combinación de condiciones de análisis menos favorables, menor capacidad de unión al anticuerpo del reactivo alérgeno y un extracto de alérgeno natural de potencia limitada, causan una sensibilidad insuficiente del diagnóstico. Una situación similar puede existir también para inmunoanálisis para IgE específica para otros epitelios de animales. De este modo, existe la necesidad en algunos casos de utilizar proteínas alergénicas puras para conseguir suficiente sensibilidad en los ensayos de diagnóstico para IgE específica. Otra necesidad para el uso de componentes de alérgenos recombinantes está dada por el concepto de diagnóstico resuelto por componentes [24]. De acuerdo con este concepto, el análisis de la respuesta de IgE a componentes de alérgenos individuales en lugar de extractos de alérgenos completos permite una mejor distinción entre las sensibilizaciones cruzadas de los alérgenos y las sensibilizaciones originales los alérgenos. De este modo, existe la necesidad de identificar y producir como proteína recombinante todos los componentes potenciales de alérgenos a partir de una fuente de alérgeno concreta.
Los presentes autores de la presente invención experimentaron problemas cuando trataron de secuenciar y clonar Can f 4 mediante el uso de métodos convencionales conocidos en la técnica. Los problemas solo se resolvieron mediante el uso de métodos no convencionales, como se describe a continuación en la sección Resultados. La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de la unión del anticuerpo IgE a extracto de caspa tanto de perro como de vaca, y la comprensión de que a fin de identificar la secuencia de ácido nucleico y para completar la clonación de Can f 4, los autores de la presente invención tuvieron que correlacionar Can f 4 con una proteína de otro organismo.
En un aspecto, la invención se refiere a un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica dicho alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante.
En otros aspectos, la invención se refiere a un vector que comprende dicho ácido nucleico, y a una célula anfitriona que comprende dicho vector.
En otro aspecto más, la invención se refiere al uso de un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante en un diagnóstico in vitro de alergia de tipo I.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir una composición de alérgeno, que comprende la etapa de añadir un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante a una composición que comprende un extracto de alérgeno y/o al menos un componente de alérgeno purificado.
En otro aspecto más, la invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro para diagnosticar una alergia de tipo I en un paciente, en donde una muestra de fluido corporal tal como una muestra de sangre o suero del paciente se pone en contacto con un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante, y se detecta si la muestra del paciente contiene o no anticuerpos IgE que se unen específicamente al alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante, en donde la presencia de tales anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Can f 4, es indicativa de una alergia de tipo I. Tal método de diagnóstico se puede llevarse a cabo de cualquier manera conocida en la técnica. El alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante puede, p. ej. ser inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como en un inmunoanálisis convencional de laboratorio, en una micromatriz o en un análisis de flujo lateral.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit de diagnóstico para llevar a cabo el método de acuerdo con el aspecto anterior, cuyo kit incluye un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante.
La invención se refiere adicionalmente a alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante para su uso en un método de tratamiento de la alergia de tipo I en un mamífero, que comprende administrar a un individuo que necesite tal tratamiento un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante. En una realización, el mamífero es un perro. En otra realización, el mamífero puede ser uno cualquiera que tenga un alérgeno de mamífero que muestre homología con un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante, siempre que el individuo muestre reactividad cruzada de IgE con dicho alérgeno de mamífero, tal como Bos d 23k. Este aspecto de la invención también se refiere al uso de un Can f 4 producido de manera recombinante en tal inmunoterapia, incluyendo p. ej., la inmunoterapia resuelta por componentes.
En otro aspecto, la invención se refiere a un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante para su uso en el tratamiento de la alergia de Tipo I.
En los aspectos anteriormente mencionados, el alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante puede ser reemplazado por un fragmento del mismos que comparte los epítopos para los anticuerpos con el alérgeno Can f 4 de tipo salvaje, como se define más abajo.
En las realizaciones de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente, el alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2, y está codificado por una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 1. En un aspecto, la invención se refiere a un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con los residuos de aminoácidos 17-174 del SEQ ID NO: 2.
Además, la invención se refiere a un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2 para su uso en el diagnóstico, así como para su uso en terapia.
La invención se refiere adicionalmente a un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4 para su uso en un diagnóstico in vitro de alergia de tipo
I.
En otro aspecto más, la invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro para diagnosticar una alergia de tipo I en un paciente, en donde una muestra de fluido corporal tal como una muestra de sangre o suero del paciente se pone en contacto con un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante o una composición de acuerdo con el aspecto anterior, y se detecta si la muestra del paciente contiene o no anticuerpos IgE que se unen específicamente al alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante, en donde la presencia de tales anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Bos d 23k, es indicativa de una alergia de tipo I. Tal método de diagnóstico se puede llevar a cabo de cualquier manera conocida en la técnica. El alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante puede ser inmovilizado, p. ej. sobre un soporte sólido, tal como en un inmunoanálisis convencional de laboratorio, en una micromatriz o en un análisis de flujo lateral.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit de diagnóstico para llevar a cabo el método de acuerdo con el aspecto anterior, cuyo kit incluye un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante.
La invención se refiere adicionalmente a un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante para su uso en un método de tratamiento de la alergia de tipo I en un mamífero, que comprende administrar a un individuo que necesite tal tratamiento una un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante. En una realización, el mamífero es bovino. En otra realización, el mamífero puede ser uno cualquiera que tenga un alérgeno de mamífero que muestre homología con un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante, siempre que el individuo muestre reactividad cruzada de IgE con dicho alérgeno de mamífero, tal como Can f 4. Este aspecto de la invención también se refiere al uso de Bos d 23k producido de manera recombinante en tal inmunoterapia, incluyendo p. ej., la inmunoterapia resuelta por componentes.
En otro aspecto, la invención se refiere a un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante para su uso en el tratamiento de la alergia de Tipo I.
En los aspectos mencionados anteriormente, el alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante puede ser reemplazado por un fragmento del mismo que comparte los epítopos para los anticuerpos con el alérgeno Bos d 23k de tipo salvaje, como se define a continuación.
En las realizaciones de cada uno de los aspectos mencionados anteriormente con respecto a Bos d 23k, el alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, y está codificado por una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el SEQ ID NO: 3.
Definiciones
Can f 4 se debe considerar como el alérgeno canino enumerado por el Subcomité de Nomenclatura de Alérgenos de la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas (www. allergen.org).
Las lipocalinas se deben considerar como el grupo grande y diverso de proteínas, presentes en una gran variedad de organismos e implicadas y multitud de funciones [25-27]. Se caracterizan por ciertas características estructurales conservadas, pero por otra parte no tienen muy conservada la secuencia de aminoácidos. Las lipocalinas son capaces de unirse a moléculas pequeñas, principalmente hidrófobas, incluyendo esteroides, ácidos grasos y feromonas. Un subgrupo de lipocalinas presentes en el aparato olfativo de los mamíferos se conoce como proteínas de unión a odorantes debido a su capacidad de unión reversible y liberación de compuestos volátiles implicados en la señalización olfativa [28]. Algunas lipocalinas de mamíferos han sido referidas como alérgenos, causando los síntomas de la alergia respiratoria en los seres humanos sensibilizados [29].
La proteína denominada Bos d 23k por los autores de la presente invención se describe en el Ejemplo como una proteína de 23 kDa purificada a partir de la caspa de vaca, que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con un producto génico bovino hipotético, descrito en el Núm. de Acc. XP_581277, deducido de una secuencia genómica de Bos taurus.
El término "Can f 4", sin especificar más, se debe interpretar como un Can f 4 completo, sin modificar, intacto.
La misma definición se aplica también mutatis mutandis a Bos d 23k.
Los fragmentos de un alérgeno Can f 4 que comparten epítopos de anticuerpos con el alérgeno Can f 4 se deben considerar como aquellos fragmentos cuya unión a los anticuerpos IgE de una muestra de suero de un paciente sensibilizado con alérgeno Can f 4 representativo puede ser inhibida significativamente por el alérgeno Can f 4. Tal análisis de inhibición se puede realizar, p. ej., según el protocolo descrito del Ejemplo 8 del documento WO 2008/079095. También se comenta que los fragmentos tienen propiedades de unión a IgE similares a las del alérgeno Can f 4.
La misma definición se aplica también mutatis mutandis a Bos d 23k.
Alérgeno homólogo se debe interpretar en el sentido de un alérgeno en el que la secuencia de ácido nucleico es susceptible de hibridar con la secuencia de ácido nucleico de otro alérgeno. El resultado de la hibridación puede depender de la longitud de las secuencias, de cómo se distribuye la homología en las secuencias, y de las condiciones experimentales, tales como la concentración de sal, la temperatura, el rigor del lavado, etc. Un alérgeno homólogo de acuerdo con la presente invención puede tener una identidad de secuencia global inferior a la que se considera a menudo para un homólogo, es decir, 65-70%. Mediante la definición de esta invención, la secuencia de ácido nucleico de un alérgeno homólogo puede mostrar una identidad secuencia global inferior con respecto al ácido nucleico de otro alérgeno, pero aún así hibridar con este otro alérgeno debido a los segmentos de las secuencias que muestran mayor identidad de secuencia.
La reactividad cruzada con un alérgeno debe ser interpretada en el sentido de que los anticuerpos IgE de un individuo contra un primer alérgeno también son reactivos contra un segundo alérgeno que puede ser o puede no ser un homólogo contra el primer alérgeno.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el análisis de inmunotransferencia de unión de anticuerpo IgE a proteínas de extracto de caspa de perro no reducidas. Se muestran 10 de 37 sueros analizados. El número de sujeto se indica por encima y la dilución de suero por debajo de cada calle. Las posiciones de las proteínas marcadoras de PM se indican a la izquierda.
La Figura 2 muestra la purificación de la proteína de caspa de perro de 16 kDa identificada mediante inmunotransferencia mediante cuatro etapas consecutivas. A, Cromatografía preparativa de exclusión por tamaños. Las fracciones agrupadas se indican mediante barras verticales. B, cromatografía de intercambio aniónico. La línea sombreada indica la conductividad (eje y de la derecha). Las fracciones agrupadas para una purificación adicional están marcadas por una llave horizontal. C, Cromatografía de fase inversa. La línea sombreada indica la concentración de acetonitrilo (eje y de la derecha). Las fracciones agrupadas para una purificación adicional están marcadas por una llave horizontal. D, Cromatografía de intercambio aniónico. La línea sombreada indica la conductividad (eje y de la derecha). El pico que contiene la proteína diana pura se indica mediante una flecha.
La Figura 3 muestra las secuencias de péptidos obtenidas a partir de fragmentos trípticos de la proteína de caspa de perro de 16 kDa purificada.
La Figura 4 muestra la secuencia de ADNc (como se representa mediante el SEQ ID NO: 1 en la lista de secuencias adjunta) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 2) de Can f 4. El sitio de escisión señal pronosticado está marcado con una flecha.
La Figura 5 muestra el análisis bioquímico e inmunológico comparativo de Can f 4 y rCan f 4 purificados. A, Filtración en gel analítica. Línea sombreada: nCan f 4 (eje y de la derecha); línea continua: rCan f 4 (eje y de la izquierda). Los volúmenes de elución de las proteínas calibradoras de 6,5, 13,7, 29, 43 y 75 kDa están marcados con símbolos de rombos. B, SDS-PAGE de muestras no reducidas (ox) y reducidas (red) de nCan f 4 y rCan f 4. Los tamaños de las proteínas marcadoras de PM relevantes se indican a la izquierda. C, Análisis de la actividad de unión del anticuerpo IgE (kUA/L) mediante ImmunoCAP. Se analizaron los sueros de 37 sujetos alérgicos al perro. Las líneas sombreadas indican niveles de 0,10 y 0,35 kUA/L.
La Figura 6 muestra la concentración de anticuerpos IgE contra extracto de caspa de perro (DDE), rCan f 1, rCan f 2, nCan f 3, rCan f5 y rCan f 4 entre 37 sujetos alérgicos al perro. Las barras horizontales indican valores medios. La línea punteada indica el nivel de 0,35 kUA/L. Los valores por debajo de 0,1 kUA/L se ajustaron a 0,1 kUA/ L.
La Figura 7 muestra la inhibición de la unión del anticuerpo IgE a Bos d 23k por rCan f 4. Se preincubaron tres sueros reactivos con Bos d-23k (AC) con 100 µg/mL de rCan f 4 (barras de color negro) o tampón (control negativo, barras de color gris), antes de la medición de la unión de IgE a Bos d 23k inmovilizado.
La Figura 8 muestra la purificación de dos proteínas de unión a anticuerpo IgE, Bos d 23k y Bos d 2, de caspa de vaca. A, Fraccionamiento mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones superiores de dos de los picos marcados A y B se combinaron y se sometieron a análisis SDS PAGE (inserto) reductor. Los tamaños de las proteínas marcadoras de PM relevantes se indican a la derecha. B, SDS-PAGE de muestras reducidas (red) y no reducidas (ox) de Bos d 23k y Bos d 2 purificadas después de la purificación adicional mediante cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio aniónico. Los tamaños de las proteínas marcadoras de PM relevantes se
indican a la izquierda de cada gel.
La Figura 9 muestra la comparación de la unión del anticuerpo IgE a Can f 4, Bos d 23k (gráfico superior) y Bos d 2 (gráfico inferior). Se indica el coeficiente de correlación (r) para cada comparación. Se analizaron los sueros de 37 sujetos alérgicos al perro. Las líneas sombreadas indican niveles de 0,10 y 0,35 kUA/L.
La Figura 10 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de Can f 4 (como se representa mediante el SEQ ID NO: 2) y Bos d 23k (como se representa mediante el SEQ ID NO: 4).
Descripción detallada de la invención
El ejemplo siguiente ilustra la presente invención con el aislamiento y el uso de la proteína de tipo lipocalina Can f 4 de perro. También hay una parte que ilustra la reactividad cruzada entre Can f 4 y un alérgeno de vaca. El ejemplo es sólo ilustrativo y no se debe considerar como limitante de la invención, que se define mediante el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo
Material y métodos
Análisis de inmunotransferencia de IgE
El análisis de inmunotransferencia se realizó sobre el extracto de caspa de perro no reducido separado mediante SDS-PAGE utilizando ExcelGel (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Suecia) al 12,5% homogéneo y se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de nitrocelulosa Hybond ECL (GE Healthcare Life Sciences). Como marcadores de peso molecular (PM), se utilizó el kit LMW (GE Healthcare Life Sciences). Las transferencias de proteínas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente utilizando tampón de bloqueo (fosfato 50 mM de pH 7,4, Tween-20 al 0,1% (v/v), NaCl al 0,9% (p/v), dextrano T10 al 0,3% (p/v)) y después se incubaron durante la noche con suero de cada paciente, se diluyeron 1,5-30 veces en tampón de bloqueo. Después de lavar en tampón de bloqueo con Tween-20 al 0,5% (v/v), la membrana se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente con un
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anticuerpo anti-IgE humana marcado con en tampón de bloqueo y, después del lavado, se detectó radiográficamente la IgE unida mediante una pantalla de almacenamiento de fósforo y un Typhoon 9410 Variable Mode Imager (GE Healthcare Life Sciences).
Purificación de proteínas de 16 kDa de caspa de perro
Se extrajo caspa de perro (Allergon, Välinge, Suecia) en MOPS 20 mM de pH 7,6, NaCl 0,5 M (MBS), se aclaró mediante centrifugación, se filtró a través de un filtro de éster de celulosa mixto de 0,45 micras (Millipore, Billerica, MA) y se aplicó a una columna Superdex 75 (GE Healthcare Life Sciences) para la cromatografía de exclusión por tamaños (SEC). Las fracciones que contenían una banda de 16 kDa observada en el análisis de inmunotransferencia se concentraron en una célula agitada Amicon (Millipore) utilizando un filtro YM-3, se desalaron en una columna superfina Sephadex G25 (GE Healthcare Life Sciences) frente a Tris-HCl 20 mM pH 8,0. La preparación desalada se aplicó a continuación a una columna Source Q (GE Healthcare Life Sciences) para la cromatografía de intercambio aniónico (AIEC) y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M. La purificación adicional se realizó mediante cromatografía de fase inversa (RPC) utilizando una columna Source 15 RPC (GE Healthcare Life Sciences) y elución con un gradiente lineal de acetonitrilo de 0-54% en agua que contenía ácido trifluoroacético (TFA) al 0,05%. Las fracciones que contenían la proteína diana se identificaron mediante SDS PAGE y se agruparon. Después de la reducción, la alquilación y la escisión con tripsina, los péptidos de la proteína purificada se aislaron mediante RPC y se analizaron por medio de secuenciación de aminoácidos. Para la evaluación de la unión del anticuerpo IgE mediante ImmunoCAP, la proteína de 16 kDa se sometió a una etapa final de refinado mediante cromatografía de intercambio catiónico (CIEC) utilizando una columna SP Sepharose FF (GE Healthcare Life Sciences) equilibrada en citrato 20 mM de pH 4,0 y elución con un gradiente lineal de NaCl 0-1 M.
Purificación de las proteínas de unión a IgE de caspa de vaca
Se extrajo caspa de vaca (Allergon) y se fraccionó mediante SEC como se ha descrito anteriormente. Las fracciones que contenían una banda de 23 kDa dominante se agruparon, se acondicionaron con NH4SO4 a una concentración final de 1 M y se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) utilizando una columna Fenil Sepharose HP (GE Healthcare Life Sciences). La banda de 23 kDa se eluyó en la fracción de flujo directo y se desaló frente a Bis-Tris propano 20 mM de pH 8,5 en una columna superfina Sephadex G25 (GE Healthcare Life Sciences) y con posterioridad se aplicó a una columna Source 15Q (GE Healthcare Life Sciences) equilibrada con el mismo tampón. La elución se realizó con un gradiente lineal de NaCl 0-0,4 M y las fracciones que contenían la banda de 23 kDa se agruparon. La concentración de proteína de la preparación final se determinó a partir de la absorbancia a 280 nm, utilizando un coeficiente de extinción calculado de 1,04 por mg/mL.
Las fracciones que contenían una banda de 19 kDa dominante se combinaron y se purificaron adicionalmente mediante HIC como se ha descrito anteriormente. La proteína de 19 kDa se eluyó en un gradiente lineal 0-1 M de NH4SO4 en Tris-HCl 20 mM de pH 8,0 y las fracciones de los picos se agruparon. Se llevaron a cabo la eliminación
de las sales y la AIEC en una columna Source 15Q como se ha descrito anteriormente. La concentración de proteína de la preparación final se determinó a partir de la absorbancia a 280 nm, utilizando un coeficiente de extinción calculado de 1,04 por mg/mL.
Análisis de proteínas
A menos que se especifique lo contrario, se realizó el análisis de SDS-PAGE de las muestras de proteína reducida (β-mercaptoetanol al 4%) y no reducida utilizando un gel NuPAGE al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) y Mark12 (Invitrogen) como marcadores de PM. Después de la separación electroforética, las proteínas se visualizaron mediante tinción con Azul Brillante de Coomassie. Se realizaron análisis de la secuencia N-terminal de bandas de proteínas extraídas utilizando un aparato Hewlett-Packard G1000A (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). La analítica SEC se realizó en una columna Superdex 75 HR 10/30 (GE Healthcare Life Sciences) equilibrada con MBS. La calibración del PM de la columna se realizó utilizando el kit de calibración de filtración en gel LMW (GE Healthcare Life Sciences).
Para el análisis de la huella dactilar de la masa peptídica (PMF) por medio de espectrometría de masas (MS) de desorción/ionización láser asistida por matriz de tiempo de vuelo (MALDI-TOF), la preparación de la muestra de proteína purificada mediante RPC en disolución, incluyendo la reducción, alquilación y digestión con tripsina, se llevó a cabo esencialmente como se describe [10] utilizando un aparato Bruker Daltonics Autoflex 2 (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). Se realizó el análisis de MS en tándem (MS/MS) para identificar los péptidos seleccionados. Para identificar las proteínas que coinciden con el PMF y los resultados de MS/MS obtenidos, se realizaron búsquedas en la base de datos MSDB utilizando un servidor Mascot (Matrixscience, Londres, Reino Unido).
La digestión con tripsina en gel de las bandas de proteínas individuales de la SDS-PAGE se realizó esencialmente de acuerdo con Shevchenko et al. [11]. La preparación de las muestras y la huella dactilar de la masa del péptido se realizaron como se ha descrito anteriormente.
Clonación, expresión y purificación de Can f 4 recombinante
El ARN total se preparó a partir de un segmento lateral de lengua del perro utilizando el kit RNAqueous (Ambion, Austin, Texas). El ARN poliadenilado se aisló a partir del ARN total utilizando el kit de purificación de ARNm (GE Healthcare Life Sciences) y la primera hebra de ADNc se preparó utilizando el kit First-Strand cDNA Synthesis (GE Healthcare Life Sciences). La 3' RACE se realizó de acuerdo con Frohman [12], utilizando los cebadores oligonucleotídicos directos anidados 5'-ATGAAGATCCTACTGTTGTGTC-3' y 5'-CAGCTACCCCTTCCTAATG-3', que portan ambos un sitio de restricción NdeI terminal para la clonación. Se aislaron y se secuenciaron en su totalidad siete clones 3' RACE independientes por medio de lo cual se pudo definir la secuencia codificante de Can f
4. La secuenciación del ADN se realizó utilizando un Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). El análisis de la secuencia de ADN y de aminoácidos y los cálculos se realizaron con los programas del GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA, USA). La predicción del péptido señal se realizó utilizando SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). Para el propósito de expresión de la proteína, la secuencia codificante de Can f 4 se amplificó utilizando los cebadores 5'-GTCAGCATATGCAGCTACCCCTTCCTAATG-3' y 5'-ACTGACTCGAGTTCATGGTTGGGACAGTTGTC-3' y se clonó entre los sitios NdeI y XhoI del vector pET-23a (+) (Novagen, Madison, WI, USA). Can f 4 recombinante se produjo en forma de una proteína etiquetada C-terminalmente con hexahistidina en E. coli BL21, utilizando un biorreactor de 3 L (Belach Bioteknik, Solna, Suecia).
Para la purificación de rCan f 4, las células recogidas se resuspendieron en Tris-HCl 20 mM de pH 8,0 y se lisaron haciendo pasar la suspensión a través de un homogenizador Emulsiflex C5 (Avestin Inc., Canadá) a 15.000-17.000 kPa. Después del aclarado mediante centrifugación y filtración, el sobrenadante se aplicó a una columna Chelating Sepharose FF (GE Healthcare Life Sciences), cargada con NiSO4. El lavado de la columna se realizó con imidazol 20 mM en Tris-HCl 20 mM de pH 8,0, NaCl 0,15 M y la proteína recombinante se eluyó en un gradiente lineal de 20500 mM de imidazol en el mismo tampón. La purificación adicional de la proteína recombinante se realizó mediante AIEC en Tris-HCl 20 mM de pH 8,0 utilizando una columna Q Sepharose FF (GE Healthcare Life Sciences). La proteína se eluyó utilizando un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M y las fracciones se agruparon de acuerdo con los resultados de SDS-PAGE. La concentración de proteína de la preparación final se determinó a partir de la absorbancia a 280 nm, utilizando un coeficiente de extinción calculado de 0,78 por mg/mL. La integridad de la proteína recombinante se confirmó mediante secuenciación N-terminal.
Sujetos alérgicos al perro y controles alérgicos al polen
En el estudio (Tabla 2) se utilizaron los sueros de 37 sujetos alérgicos al perro de España (n = 23), Suecia (n = 10) y América del Norte (n = 4). Todos los pacientes tenían un diagnóstico médico de alergia al perro, con síntomas tales como asma, rinoconjuntivitis y urticaria, una prueba cutánea positiva y una prueba ImmunoCAP positiva (Phadia, Uppsala, Suecia) para determinar la IgE específica para extracto de caspa de perro. A efectos de control, se utilizaron sueros de 44 sujetos alérgicos al polen sin síntomas diagnosticados o referidos de alergia al perro. Todas las muestras y datos clínicos se recogieron bajo la aprobación del comité de ética local en cada centro.
Mediciones específicas de anticuerpos IgE
La actividad de unión al anticuerpo IgE de alérgenos recombinante y naturales purificados se examinó utilizando ensayos ImmunoCAP™ regulares y experimentales (Phadia). Los ensayos ImmunoCAP experimentales se prepararon como se ha descrito [13]. La especificidad de análisis de los ensayos experimentales se evaluó utilizando un suero de control negativo, enriquecido con IgE de mieloma a una concentración final de 0, 1.000 o 3.000 kU/L. Se realizó un experimento de inhibición de IgE preincubando muestras de suero con Can f 4 recombinante a una concentración final de 100 µg/ml antes de la medición de la unión del anticuerpo IgE a la proteína de caspa de vaca de 23 kDa inmovilizada en fase sólida ImmunoCAP. Los resultados se calculan como los valores medios de determinaciones por duplicado.
Resultados
Análisis de inmunotransferencia de sueros de sujetos alérgicos al perro
Las muestras de suero de 10 sujetos alérgicos al perro se sometieron a análisis de inmunotransferencia de IgE utilizando extracto de caspa de perro no reducido (Fig. 1). Para los mismos sueros, los datos de ImmunoCAP sobre IgE específica de rCan f 1, rCan f 2, nCan f 3 y rCan f 5 estuvieron disponibles para la comparación. El análisis de inmunotransferencia reveló la unión de IgE a al menos 8 bandas de proteínas diferentes. De éstas, las bandas en la región de 23 kDa se correlacionaban con la unión de IgE de ImmunoCAP a rCan f 1 y rCan f 2 (sujetos 5, 24, 31 y 33), las bandas en la región de 28 kDa con la reactividad de rCan f 5 (sujetos 1, 3, 5, 15, 31, 33 y 36) y las bandas a aproximadamente 60 kDa con la reactividad de nCan f 3 (sujetos 9, 15 y 33).
La unión de IgE mediante inmunotransferencia a una banda de 16 kDa se detectó con sueros de 4 sujetos (1, 9, 14 y 36) de los cuales uno (sujeto 14) dio lugar a una señal particularmente intensa. El hecho de que este suero no mostrara unión de IgE a ninguno de rCan f 1, rCan f 2, nCan f 3 o rCan f 5 en el análisis ImmunoCAP sugirió que la banda de 16 kDa representa un nuevo alérgeno.
Purificación de la proteína de 16 kDa de caspa de perro identificada mediante inmunotransferencia
Un proceso de purificación de tres etapas que comprende SEC seguido de AIEC y RPC produjo una preparación de una proteína de 16 kDa con una pureza de 90-95% (Fig. 2). El análisis de la secuencia N-terminal de esta proteína no produjo ninguna lectura, lo que sugiere que su extremo N estaba bloqueado. Para superar este problema, la proteína se redujo, se alquiló y se digirió con tripsina para generar péptidos internos. Cuatro de dichos péptidos trípticos se pudieron separar mediante RPC y se analizaron mediante secuenciación N-terminal, produciendo las secuencias mostradas en la Fig. 3. Las búsquedas BLAST con estas secuencias de péptidos no identificaron un emparejamiento exacto con ninguna proteína de perro conocida. Sin embargo, los emparejamientos imperfectos de los péptidos 1 y 4 con las entradas de las base de datos que representan las proteínas unión de a odorante de vaca y cerdo sugirieron que la proteína de perro purificada podría estar relacionada con esta familia de proteínas. Adicionalmente, una búsqueda TBLASTN de la base de datos del genoma del perro con el péptido 4, utilizando la configuración de bajo rigor, dio como resultado emparejamientos con traducciones conceptuales de tres segmentos adyacentes en una región terminal del cromosoma X. El análisis PMF de la proteína purificada no dio como resultado ningún emparejamiento significativo con una secuencia de proteína conocida.
La actividad de unión a IgE de la proteína de 16 kDa de caspa de perro se evaluó mediante inmunoanálisis ImmunoCAP, siguiendo una etapa de refinado CIEC final para aumentar adicionalmente la pureza de la preparación. Se analizaron sueros de 37 individuos alérgicos al perro y la unión de IgE a la proteína purificada en ImmunoCAP se correlacionó bien con la detección de la banda de 16 kDa en el análisis de inmunotransferencia de extracto de caspa de perro, lo que indicó que la proteína purificada representaba la banda de 16 kDa observada en la inmunotransferencia.
Conexión entre los alérgenos epiteliales de perro y vaca
Una ayuda inesperada a la identificación y clonación del alérgeno de perro de 16 kDa provino de una línea separada de experimentos en el laboratorio de los autores de la presente invención, sobre los alérgenos epiteliales de otra especie animal. Un suero, que fue compartido entre los estudios de alérgenos en perro y vaca, mostró unión significativa del anticuerpo IgE a extracto de caspa tanto de perro como de vaca mientras que no era reactivo en ImmunoCAP con ninguno de rCan f 1, rCan f 2, nCan f 3 y rCan f 5, planteando la posibilidad de que este suero pudiera definir un nuevo alérgeno canino.
Se encontró que una proteína de 23 kDa en el extracto de caspa de vaca se unía a IgE de este suero y pudo estar altamente enriquecido mediante SEC (Fig. 8, A). Se encontró que el pico adyacente en el fraccionamiento mediante SEC contenía el alérgeno principal Bos d 2, una lipocalina de 19 kDa, como se confirmó mediante análisis de PMF (no mostrado). La purificación adicional de estas proteínas mediante HIC y AIEC (no mostrado) dio como resultado preparaciones altamente puras (Fig. 8, B), adecuadas como reactivos de inmunoanálisis.
La proteína de 23 kDa se identificó por medio de un emparejamiento significativo (p <0,05) de los datos PMF con la entrada de la base de datos XP_581277 (según se representa mediante el SEQ ID NO: 4), que representa una lipocalina bovina anotada como "similar a la proteína de unión a odorante". Adicionalmente, el análisis de la secuencia N-terminal de la proteína de 23 kDa reveló la secuencia EAQGDASQFT, emparejando los residuos 19-28
de la misma entrada de la base de datos y corroborando de este modo el emparejamiento PMF. Esta proteína se denomina en lo sucesivo Bos d 23k.
Se utilizaron los ensayos ImmunoCAP experimentales preparados tanto con Bos d 23k como con Bos d 2 para evaluar la correlación en la unión de IgE a la proteína de caspa de perro de 16 kDa. Se analizaron los sueros de 37 sujetos alérgicos al perro y los resultados se muestran en la Fig. 9. Mientras que la proteína de caspa de perro de 16 kDa y Bos d 2 no mostraron ninguna correlación en la unión de IgE (r = 0,01), se observó una correlación significativa para Bos d 23k (r = 0,89), lo que sugiere reactividad cruzada y similitud estructural entre el alérgeno de perro y Bos d 23k.
Clonación y análisis de secuencia de la proteína de caspa de perro de 16 kDa
La similitud de secuencia potencial entre la proteína de la caspa de perro de 16 kDa y Bos d 23k motivó la búsqueda en bases de datos orientada a la identificación de la proteína de perro o su secuencia genética. Una búsqueda BLASTN de una base de datos del genoma del perro con la secuencia de la proteína bovina (XP_581277) dio como resultado una coincidencia con la traducción de las posiciones de los nucleótidos 338441-338307 del Núm. de Acc. AAEX02025758, un segmento de 431454 pb de la secuencia del genoma del perro [14]. Curiosamente, la traducción teórica de esta región genómica contenía un emparejamiento de 5 residuos perfecto de los residuos de aminoácidos 9-13 de la secuencia N-terminal referida de Can f 4 [9]. Más aguas arriba (339006-338926), se encontraron una secuencia de nucleótidos que codificaba los aminoácidos que emparejaban el residuo 1-8 de la secuencia de Can f 4, así como un supuesto péptido señal.
Para el propósito de la clonación de un ADNc correspondiente al segmento identificado de AAEX02025758, que se supuso que codificaba Can f 4, se realizó un experimento 3' RACE. Se utilizaron cebadores oligonucleotídicos basados en la secuencia genómica que codificaba la primera parte del supuesto péptido señal y un tramo después del sitio de escisión pronosticado, junto con primera hebra de ADNc preparada a partir de ARN poliA de lengua de perro como molde. Se obtuvo un producto de amplificación distinto que se clonó, se analizó y posteriormente se utilizó para experimentos de expresión de proteínas.
La secuencia de ADN completa y la traducción a aminoácidos del ADNc clonado se muestra en la Fig. 4. Se identificó un marco de lectura abierto que codificaba 174 residuos de aminoácidos, de los cuales se pronosticó, mediante SignalP, que los primeros 16 residuos formaban un péptido señal. La proteína madura deducida a partir del ADNc clonado consistía en 158 residuos de aminoácidos, incluyendo dos cisteínas, y tenía una masa molecular pronosticada de 17,6 kDa y un punto isoeléctrico de 6,53. Para evaluar la presencia de diversidad de secuencias, se aislaron y secuenciaron siete clones independientes 3' RACE. Se encontraron unas pocas sustituciones de nucleótidos entre los clones (no mostradas), pero ninguna que cause variación en la secuencia de aminoácidos de la proteína. En todos los clones analizados, el codón de parada que termina el marco de lectura abierto estuvo seguido por un segmento de 213 nucleótidos no traducido que precede a un tramo de poli-A.
El sitio de escisión del péptido señal pronosticado entre los residuos 16 y 17 convertiría el residuo de glutamina de la posición 17 en el primero en la proteína madura. De acuerdo con la incapacidad de los autores de la presente invención para obtener una lectura de secuencia de la proteína intacta, un residuo de glutamina N-terminal se puede someter a ciclación con piroglutamato que se sabe que causa el bloqueo de la secuenciación N-terminal mediante degradación de Edman (15). Adicionalmente, tras un nuevo examen de los resultados de PMF para la proteína nativa, se identificó un fragmento tríptico con una masa de 1759,98 Da, que corresponde exactamente a la prevista para los residuos 17-32 del producto de traducción primario pronosticado, modificado mediante ciclación con piroglutamato. Además, se identificaron los fragmentos trípticos que emparejaban los residuos de aminoácidos 3351, 56-63, 66-73 y 95-104.
La secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc clonado contenía además las cuatro secuencias de péptidos trípticos obtenidas a partir de la proteína de 16 kDa natural purificada (Fig. 3), con una coincidencia exacta para péptidos 2-4 y dos sustituciones conservativas de aminoácidos en el péptido 1. En total, los fragmentos de proteínas identificados mediante PMF y secuenciación de péptidos representaron una cobertura de 58% de la secuencia de aminoácidos deducida de Can f 4 (Tabla 1). Tomados en conjunto, los resultados proporcionan una fuerte evidencia de que el alérgeno de 16 kDa purificado y la proteína codificada por el ADNc clonado representan ambos el alérgeno canino Can f 4.
Mediante el alineamiento de la secuencia de ADNc clonada con la secuencia genómica del Núm. de Acc. AAEX02025758, se encontró que la porción codificante del gen Can f 4 abarcaba un total de 5916 pb y comprendía 6 exones: 339006-338929 (exón 1), 338447-338307 (exón 2), 335150-335082 (exón 3), 334581-334468 (exón 4), 333609-333511 (exón 5) y 333114-333091 (exón 6). El punto de empalme exacto entre los exones 3 y 4 no se pudo deducir inequívocamente de la secuencia y esas fronteras exónicas podrían ser en cambio 335150-335079 y 334578-334468, respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos deducidas a partir del ADNc y los segmentos génicos de Can f 4 se desviaron entre sí 5 posiciones. En la posición 20 de la secuencia madura de Can f 4, un residuo de isoleucina en la traducción del ADNc correspondió a un residuo de valina en la secuencia del gen derivado, en la posición 30 un residuo de ácido
aspártico correspondió a un residuo de ácido glutámico, en la posición 38 un residuo de metionina correspondió a un residuo de leucina, en la posición 51 un residuo de serina correspondió a un residuo de leucina y en la posición 81 un residuo de tirosina correspondió a un residuo de ácido aspártico o de cisteína, dependiendo del punto de empalme exacto entre los exones 3 y 4.
Además de la secuencia del gen Can f 4 descrita anteriormente, se encontró que la entrada de la base de datos AAEX02025758 contenía otros dos segmentos relacionados con Can f 4, explicando los tres emparejamientos obtenidos en la búsqueda TBLASTN de genoma de perro con la secuencia del péptido tríptico 4. Los tres segmentos Can f 4 relacionados se dispusieron en tándem a una distancia de 5,4 y 6,7 kb entre sí, con el descrito anteriormente localizado más aguas abajo. El segmento relacionado con Can f 4 situado en el medio tenía una estructura de exón/intrón similar a la del gen de Can f 4 descrito anteriormente y su secuencia de aminoácidos deducida difería en 24 posiciones en comparación con el gen de Can f 4 y en 28 posiciones en comparación con el ADNc de Can f 4. Curiosamente, estaba completamente de acuerdo con la secuencia del péptido tríptico 1 que se desvió dos posiciones de la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc. En el segmento relacionado con Can f 4 situado más aguas arriba, no se pudo identificar una secuencia correspondiente al exón 4.
Can f 4 pertenece a la superfamilia de la lipocalina y muestra 38-39% de identidad de secuencia con proteínas de unión a odorante bovino (XP_581277) y porcino [16] (NP_998961). Un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de Can f 4 y Bos d 23k se muestra en la Fig. 10. Cabe señalar que, aparte de un patrón de dispersión de residuos similares o idénticos, la porción C-terminal de las proteínas está altamente conservada, así como los dos residuos de cisteína (posiciones 62 y 154 en Can f 4). Otros elementos conservados, característicos de las lipocalinas [17], incluyen un motivo GxW cerca del extremo N (posición 13-15), un residuo de glicina (posición 118). Otro motivo típico de lipocalinas [17], YxxxYxG, está presente en Bos d 23k (posición 74-80), pero solo se conserva parcialmente en Can f 4. Curiosamente, a pesar de pertenecer a la misma familia de proteínas, Can f 4 mostró solo una identidad de secuencia de aminoácidos de 24% y 26% con Can f 1 y Can f 2, respectivamente.
Producción de Can f 4 recombinante
Can f 4 recombinante, excluyendo el péptido señal, se expresó como un proteína etiquetada con hexahistidina Cterminal en E. coli. La proteína recombinante se purificó a partir de la fracción celular soluble mediante IMAC y AIEC. Para evaluar el estado de agregación de la proteína recombinante, una muestra de la preparación se sometió a SEC analítica, en paralelo con Can f 4 natural purificada natural. Como se muestra en la Fig. 5, A, el cromatograma estuvo dominado por un solo pico simétrico en ambos casos, correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 16,5 kDa, según se define mediante los calibradores utilizados. En la SDS-PAGE (Fig. 5, B), Can f 4 tanto natural como recombinante exhibió un cambio en la tasa de migración después de la reducción, lo que sugiere que los dos residuos de cisteína presentes en la proteína participaban en un puente disulfuro. Cabe señalar que el peso molecular aparente de Can f 4 indicado por el análisis de inmunotransferencia inicial (Fig. 1) se vio afectado por el hecho de que el extracto de caspa de perro utilizado para el análisis se aplicó al gel de separación en una forma no reducida, lo que conduce a una subestimación en lo relativo al tamaño de la proteína indicada por los análisis posteriores de las muestras reducidas de la proteína purificada. El incremento de tamaño mostrado por rCan f 4 en comparación con la proteína natural fue coherente con la adición de una etiqueta de hexahistidina C-terminal a la proteína recombinante y la retención casi completa del residuo de metionina iniciador.
Análisis de la unión del anticuerpo IgE específico a rCan f 4 en sujetos alérgicos al perro
La actividad inmunológica de Can f 4 recombinante se evaluó en comparación con la proteína natural, purificada a partir de la caspa de perro. Cada proteína se inmovilizó sobre una fase sólida ImmunoCAP™ y su unión al anticuerpo IgE se examinó utilizando muestras de suero de 37 sujetos alérgicos al perro (Fig. 5, C). Los dos conjuntos de datos mostraron una correlación muy fuerte (r = 0,99), lo que demuestra que el alérgeno recombinante se parecía mucho a su contraparte natural con respecto a los determinantes de unión al anticuerpo IgE.
La frecuencia y magnitud de la reactividad del anticuerpo IgE con Can f 4 en comparación con otros alérgenos de caspa de perro se ilustra en la Fig. 6. Un conjunto de datos más completo sobre los sujetos alérgicos al perro y su patrón de sensibilización se presenta en la Tabla 2. Entre los 37 sueros analizados, 13 (35%) presentaron unión del anticuerpo IgE a Can f 4. Uno de los 13 sueros reactivos con Can f 4 no mostró unión de IgE a ninguno de los otros alérgenos de perro sometidos a ensayo. No se pudo observar correlación en la unión a IgE entre Can f 4 y Can f 1 o Can f 2, coherente con su estructura primaria muy divergente. La especificidad de análisis del ensayo ImmunoCAP de Can f 4 experimental se demostró mediante los bajos resultados obtenidos después de someter a ensayo suero de control negativo enriquecido con hasta 3.000 kU/L de IgE de mieloma (Tabla 3).
Para examinar la aparición de anticuerpo IgE específico de Can f 4 en individuos atópicos no alérgicos al perro, se sometieron a ensayo los sueros de 44 sujetos alérgicos al polen sin síntomas diagnosticados o referidos de alergia al perro con todos los componentes alergénicos de perro disponibles y una serie de extractos de polen (Tabla 4 ). Siete de los sueros (16%) mostraron una respuesta positiva al extracto de caspa de perro, con una excepción a niveles de 2 kUA/L o menos, uno de los cuales también mostró unión de anticuerpo IgE a rCan f 4. Ningún suero negativo a la caspa de perro mostró una respuesta positiva a rCan f 4.
Reactividad cruzada entre rCan f 4 y Bos d 23k
Para estudiar el grado de reactividad cruzada entre Can f 4 y Bos d 23k indicado por su correlación en la unión al anticuerpo IgE, se realizó un experimento de inhibición de IgE con tres sueros reactivos con la proteína bovina. La proteína bovina purificada se ancló a la fase sólida ImmunoCAP y se midió la unión a IgE de sueros preincubados con rCan f 4 o tampón. Como se puede observar en la Fig. 7, rCan f 4 inhibió casi completamente (≥96%) la unión de IgE a la proteína de la caspa de vaca en los tres sueros, lo que demuestra que todos los determinantes de la unión de IgE a la proteína bovina reconocida por los sueros utilizados en el experimento eran compartidos con rCan f
4.
Discusión
Como se describe en esta solicitud, los autores de la presente invención han aislado, clonado y caracterizado una proteína de unión a IgE de la caspa de perro identificada como Can f 4. Antes de este trabajo, solo se conocía una secuencia N-terminal de 13 residuos de este alérgeno. Se encontró que Can f 4 pertenecía a la diversa superfamilia de la lipocalina y mostraba similitud con proteínas de unión a odorantes de otras especies, incluyendo vaca y cerdo. Se encontró que Can f 4 reaccionaba de forma cruzada con una proteína de unión a odorante de 23 kDa purificada a partir de caspa de vaca.
La purificación de Can f natural 4 dio como resultado un rendimiento muy pobre debido tanto a la escasez de la proteína en el extracto de caspa como a la baja resolución cromatográfica. La presencia de Can f 4 en varios picos en la RPC y el amplio pico de Can f 4 en la etapa CIEC indicaron un cierto grado de heterogeneidad de la proteína. Si bien son posibles varias explicaciones para este comportamiento, incluyendo la modificación de la proteína, la degradación parcial y la presencia de isoformas, la glicosilación ligada a N no es probable puesto que la secuencia de Can f 4 no contenía un sitio potencial para el anclaje de N-glicanos. Entre las cuatro secuencias de péptidos trípticos obtenidas, una mostró desviaciones en dos posiciones en comparación con la secuencia de aminoácidos deducida de los clones de ADNc y con el segmento genómico identificado. Por lo tanto, es posible que la variación de la isoforma pueda haber contribuido a la heterogeneidad observada durante la purificación de la proteína natural, a pesar de que no se obtuvo evidencia de la variabilidad de la secuencia en la secuenciación de ADN de siete clones de ADNc independientes. Adicionalmente, la secuenciación del fragmento tríptico y el análisis MALDI-TOF juntos confirmaron 58% de la secuencia de aminoácidos deducida de los clones de ADNc, lo que sugiere polimorfismo limitado. Incluso si no se puede excluir que al menos uno de los segmentos genómicos relacionados con Can f 4 adicionales identificados se exprese y pueda dar lugar a una forma variante de Can f 4, la única indicación de los autores de la presente invención referente a esto fue el emparejamiento de dos residuos de aminoácidos del fragmento tríptico 1 que se desvió de la secuencia codificada por el ADNc. Ninguna otra secuencia peptídica se emparejó preferentemente con el otro segmento relacionado con Can f 4 y todos los clones de ADNc derivaron claramente del gen Can f 4 para el que las posiciones de los nucleótidos se detallan en esta solicitud.
Independientemente de la posible variación de isoforma, la forma recombinante de Can f 4 producida presentó una coincidencia excelente con la proteína natural purificada, tanto bioquímicamente como inmunológicamente. Las dos proteínas eluidas en exactamente el mismo volumen en la SEC analítica y su anticuerpo de unión a IgE mostraron una correlación muy alta. Lo más importante, no se observó ningún caso de unión de IgE al alérgeno natural ni al recombinante. De hecho, se observó una unión de IgE algo mayor para los ensayos experimentales que portan la proteína recombinante pero esto se debió muy probablemente a una concentración de acoplamiento menor que la óptima de la proteína natural, forzada por el pobre rendimiento de la purificación.
La importancia de Can f 4 como alérgeno de caspa de perro se evaluó mediante ensayos ImmunoCAP de sueros de 37 sujetos alérgicos al perro. En un estudio reciente con la misma población, se informó de que 49% mostró unión de anticuerpo IgE a Can f 1, 22% a Can f 2, 16% a Can f 3 y 70% a Can f 5. En este trabajo, los autores de la presente invención encontraron que 13 de los 37 sujetos (35%) estaban sensibilizados a Can f 4. Por lo tanto, Can f 4 fue reconocido más comúnmente que rCan f 2 y nCan f 3, que aparecieron como alérgenos minoritarios en esta población de estudio. De los 13 sueros reactivos con Can f 4, uno no mostró unión de IgE a ninguno de los otros alérgenos de perros sometidos a ensayo, lo que sugiere que Can f 4 puede ser relevante como sensibilizador independiente en la alergia al perro y una importante adición al diagnóstico resuelto por componentes. Esta idea se basa en la unicidad de Can f 4 en la secuencia como en la unión a IgE en comparación con Can f 1 y Can f 2. El hecho de que solo uno de los 44 controles alérgicos al polen sin alergia al perro mostrara una débil respuesta de anticuerpos IgE a Can f 4 sugiere que el reconocimiento de IgE de este alérgeno no se produce con frecuencia como resultado de otras sensibilizaciones a aeroalérgenos.
En comparación con el extracto de caspa de perro, el extracto de caspa de vaca parecía contener cantidades mucho más altas de alérgenos y por lo tanto proporcionó resultados de purificación más satisfactorios. A juzgar por el análisis de SDS-PAGE de extracto de caspa de vaca, las proteínas dominantes en el intervalo de 10-40 kDa fueron Bos d 2 y la proteína de 23 kDa referidas aquí (Bos d 23k), estando presentes aparentemente en cantidades similares. Bos d 2 se ha establecido definitivamente como un alérgeno importante en la caspa de vaca, producido como alérgeno recombinante y caracterizado estructuralmente [18-22]. En contraste, se sabe mucho menos acerca de Bos d 23k, aunque puede ser idéntico a la banda de la proteína de unión a IgE, de 22 kDa revelada mediante análisis de inmunotransferencia de extracto de caspa de vaca [21-23].
La secuencia de aminoácidos de 154 residuos de Bos d 23k pronosticó una masa celular de 17,8 kDa, casi exactamente la misma que la de Can f 4. A pesar de este hecho, mostró una velocidad de migración significativamente menor que Can f 4 en la SDS-PAGE. Puesto que las dos proteínas están relacionadas en la secuencia y se puede suponer que tienen un plegamiento similar, una diferencia en la glicosilación sería una
5 explicación probable para disparidad electroforética observada. En efecto, la inspección de las secuencias revela que Bos d 23k contiene un sitio de N-glicosilación potencial en el residuo de asparragina 45 de la proteína madura mientras no se encuentra presente nunguno en la secuencia de Can f 4.
Entre los alérgenos de caspa de perro y vaca conocidos, la albúmina de suero (Can f 3 y Bos d 6, respectivamente) representa la única reactividad cruzada bien reconocida para alérgenos de tres especies. La reactividad cruzada 10 entre Can f 4 y Bos d 23k proporciona de este modo una nueva asociación inmunológica entre los alérgenos de caspa de perro y de vaca. Dado su nivel relativamente bajo de identidad de secuencia global, 37%, la importante reactividad cruzada entre las dos proteínas parece algo sorprendente. Sin embargo, es posible que la reactividad cruzada observada se deba a porciones de las proteínas que tienen una similitud de secuencia mayor que la puntuación total. En particular, la porción C-terminal de las dos proteínas está significativamente conservada,
15 mostrando el segmento de 20 residuos entre la posición 136/133 y 155/152 una identidad de 75%. A pesar de la reactividad cruzada demostrable entre las dos proteínas, la respuesta de IgE fue mayor para Can f 4 que para Bos d 23k para todos los sueros sometidos a ensayo, lo que implica que Can f 4 en lugar de Bos d 23k fue el sensibilizador primario en la población de estudio de los autores de la presente invención.
En conclusión, esta solicitud refiere la clonación y caracterización del alérgeno de perro Can f 4. Can f 4
20 recombinante será importante en el diagnóstico resuelto por componentes en la alergia al perro y su reactividad cruzada con una proteína de caspa bovina muy abundante eleva la posibilidad de vinculación entre la alergia a la caspa de perro y de vaca.
TABLA 1.
- Identificación del fragmento de proteína de Can f 4
- Posición del residuo de aminoácido*
- Secuencia peptídica
- MALDI-TOF
- 28-39 79-88 120-130 139-153
- 1-16 17-35 40-47 50-57 79-88
- *Posición referente a la secuencia de proteína madura
TABLA 2.
- Sujetos alérgicos al perro: demografía, síntomas de alergia y sensibilización a alérgeno de perro*
- Núm, de Sujeto
- Edad País Síntomas e5 rCan f 1 rCan f 2 nCan f 3 rCan f 5 rCan f 4
- 1
- 35 ES A, RC >100 0,09 0,12 0,08 >100 26,7
- 2
- 43 ES A, RC 5,9 0,28 0,06 0,05 5,3 0,11
- 3
- 43 ES A, RC 16,0 0,05 0,07 0,05 23,6 0,14
- 4
- 37 ES A, RC 5,2 0,13 0,05 0,06 0,11 0,23
- 5
- 25 ES A, RC 3,1 1,92 0,17 0,07 0,41 0,18
- 6
- 41 ES A, RC 4,3 0,00 0,01 0,03 2,5 0,68
- 7
- 39 ES RC 2,8 0,00 0,01 0,02 2,0 0,20
- 8
- 42 ES RC 1,6 0,00 0,02 0,04 0,62 0,10
- 9
- 19 ES RC >100 11,0 2,2 28,2 0,18 49,5
- 10
- 19 ES RC 2,0 0,08 0,11 0,11 1,0 4,9
- 11
- 34 ES RC 9,9 0,01 0,02 0,02 7,8 0,11
- 12
- 42 ES RC 3,4 1,2 0,02 0,01 0,14 0,10
- 13
- 51 ES A, RC 1,6 3,8 0,00 0,01 0,15 0,09
- 14
- 26 ES RC 2,3 0,04 0,03 0,02 0,09 1,4
- 15
- 44 ES RC 10,8 0,03 0,02 19,1 8,1 0,10
- 16
- 21 ES RC 4,6 0,02 0,01 0,04 2,2 0,11
- 17
- 39 ES A, RC 34,8 0,02 0,02 1,4 20,8 1,7
- 18
- 32 ES RC 2,4 1,1 0,02 0,01 1,3 0,10
- 19
- 23 ES RC 8,8 0,00 0,01 0,01 6,8 0,09
- 20
- 23 ES A, RC 21,5 5,8 0,07 8,8 0,99 0,16
- 21
- 37 ES A, RC 3,2 0,04 0,01 0,03 2,4 0,30
- 22
- 22
- ES A, RC 57,5 12,2 0,22 0,26 50,7 6,8
- 23
- 23
- ES RC, U 8,1 2,3 0,05 0,11 0,10 0,10
- 24
- 50 SE RC 44,5 32,1 0,15 0,08 0,14 0,16
- Sujetos alérgicos al perro: demografía, síntomas de alergia y sensibilización a alérgeno de perro*
- Núm, de Sujeto
- Edad País Síntomas e5 rCan f 1 rCan f 2 nCan f 3 rCan f 5 rCan f 4
- 25
- 44 SE A, RC 27,1 9,6 4,4 0,11 5,0 2,1
- 26
- 25 SE RC 2,7 1,2 0,60 0,67 0,11 0,12
- 27
- 29 SE A, RC 1,9 0,31 0,07 0,06 0,54 0,82
- 28
- 27 SE RC 3,9 1,4 0,09 0,08 0,77 0,17
- 29
- 32 SE U 4,4 1,8 1,2 0,08 0,18 0,39
- 30
- 25 SE RC 3,2 0,01 0,02 0,08 1,3 0,11
- 31
- 52 SE A 3,8 0,44 1,2 0,05 0,46 0,11
- 32
- 20 SE A, RC 7,4 1,8 1,4 0,04 3,8 2,6
- 33
- 29 SE A, RC 22,1 4,0 6,1 2,0 5,6 1,7
- 34
- 32 NA RC 2,9 0,84 0,06 0,08 0,12 0,12
- 35
- 30 NA RC 4,5 1,3 0,05 0,05 0,80 0,20
- 36
- 48 NA A, RC 1,9 0,00 0,01 0,01 1,1 0,61
- 37
- 27 NA RC 1,6 0,09 0,80 0,06 0,12 0,14
- ES, España; NA, Norte America; SE, Suecia; e5, extracto de caspa de perro; RC, rinoconjuntivitis; A, asma; U, urticaria *Anticuerpo IgE específico para el alérgeno en kilounidades internacionales por litro; negativo: menos de 0,35 kUA/L
TABLA 3.
- Especificidad de análisis para el ensayo ImmunoCAP de rCan f 4 experimental
- Muestra de ensayo
- Resultado del ensayo*
- Suero negativo
- 0,002
- Suero negativo + 1000 KU/L de IgE de mieloma
- 0,023
- Suero negativo + 3000 KU/L de IgE de mieloma
- 0,124
- *Anticuerpo IgE específico para el alérgeno en kilounidades internacionales por litro; negativo: menos de 0,35 kUA/L
TABLA 4.
- Sujetos alérgicos al polen sin síntomas diagnosticados o referidos de alergia al perro: demografía, sensibilización a alérgenos*
- Sujeto
- País e5 rCan f 1 rCan f 2 nCan f 3 rCan f 5 rCan f 4 t3 t9 g6 w21 w6
- 1
- DE 0,20 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 3,7 1,3 81,8 0,12 0,39
- 2
- DE 0,03 0,00 0,01 0,00 0,01 0,00 0,01 0,17 14,0 0,03 0,11
- 3
- DE 0,03 0,00 0,01 0,01 0,01 0,00 0,16 0,26 0,39 0,25 0,20
- 4
- DE 0,04 0,00 0,01 0,00 0,02 0,02 0,01 0,20 12,5 0,05 0,05
- 5
- DE 0,01 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 1,3 1,7 2,2 0,03 0,66
- 6
- DE 0,22 0,00 0,00 0,00 0,15 0,00 0,02 0,37 15,1 0,05 0,12
- 7
- ES 0,02 0,01 0,01 0,01 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 12,6 0,00
- 8
- ES 42,3 1,2 0,07 8,4 >100 0,05 0,05 4,0 9,5 0,29 0,17
- 9
- ES 0,14 0,03 0,02 0,05 0,02 0,03 2,7 6,5 25,2 10,0 3,0
- 10
- ES 0,01 0,02 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 3,7 0,00 0,01 0,00
- 11
- ES 0,08 0,01 0,02 0,05 0,02 0,02 0,01 1,3 39,3 2,1 0,14
- 12
- ES 0,05 0,01 0,01 0,01 0,01 0,00 0,18 0,16 0,60 7,9 0,11
- 13
- ES 0,06 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 4,9 8,0 31,6 1,7 3,0
- 14
- ES 0,11 0,00 0,01 0,01 0,08 0,01 0,09 8,6 16,6 0,91 0,93
- 15
- ES 0,30 0,00 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,04 0,01 30,9 0,01
- 16
- ES 0,01 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 0,01 0,00 0,88 0,00
- 17
- ES 0,07 0,00 0,00 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 15,7 0,00
- 18
- ES 0,09 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01 0,01 11,8 0,06 0,05 0,00
- 19
- ES 0,05 0,00 0,01 0,01 0,01 0,02 0,24 0,82 25,1 0,37 0,31
- 20
- ES 0,01 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00 7,2 5,2 0,02 0,00
- 21
- ES 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,07 0,15 0,00 6,6 0,00
- 22
- ES 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,04 0,13 0,38 20,4 0,38
- 23
- ES 0,03 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,07 3,1 0,04 0,13 0,00
- 24
- ES 0,05 0,00 0,00 0,00 0,01 0,02 0,00 0,98 41,1 0,03 0,11
- Sujetos alérgicos al polen sin síntomas diagnosticados o referidos de alergia al perro: demografía, sensibilización a alérgenos*
- Sujeto
- País e5 rCan f 1 rCan f 2 nCan f 3 rCan f 5 rCan f 4 t3 t9 g6 w21 w6
- 25
- ES 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,37 11,2 0,02 11,0 0,00
- 26
- ES 1,1 0,00 0,00 0,00 1,3 0,00 2,2 18,9 0,01 51,9 0,03
- 27
- ES 0,24 0,03 0,04 0,03 0,04 0,05 0,05 5,0 3,0 0,10 0,04
- 28
- ES 0,01 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,01 0,02 0,01 5,0 0,05
- 29
- ES 0,10 0,01 0,02 0,02 0,01 0,02 0,26 4,7 80,3 0,44 4,0
- 30
- ES 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 7,1 4,4 0,45 0,01
- 31
- ES 0,02 0,00 0,01 0,00 0,01 0,00 0,05 51,2 0,07 0,07 0,17
- 32
- ES 1,0 0,00 0,00 0,00 1,1 0,00 0,00 1,7 0,02 0,05 0,00
- 33
- ES 0,06 0,02 0,01 0,01 0,02 0,00 0,12 37,4 1,9 0,26 0,16
- 34
- ES 0,01 0,00 0,00 0,00 0,01 0,00 0,02 0,06 0,51 1,6 0,00
- 35
- ES 0,01 0,02 0,01 0,00 0,01 0,01 0,02 0,86 6,4 3,0 0,03
- 36
- ES 2,0 0,00 0,00 0,00 2,0 0,00 0,01 0,36 6,6 0,03 0,02
- 37
- ES 1,9 1,5 1,2 2,0 0,58 0,95 51,2 >100 >100 >100 74,7
- 38
- ES 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,02 0,12 0,21 12,3 0,00
- 39
- ES 0,64 0,02 0,03 0,03 0,61 0,03 1,6 3,8 1,8 77,8 0,88
- 40
- ES 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,30 0,00 0,02 0,00
- 41
- ES 0,09 0,00 0,00 0,00 0,07 0,00 0,01 5,0 0,00 0,02 0,00
- 42
- ES 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 5,6 0,00 0,03 0,00
- 43
- ES 1,2 0,04 0,07 0,06 0,06 0,04 0,14 6,0 9,1 14,8 0,12
- 44
- ES 0,06 0,04 0,01 0,01 0,02 0,01 0,03 0,46 14,0 0,18 0,38
- ES, España; DE, Alemania; e5, extracto de caspa de perro; t3 extracto de polen de abedul; t9 extracto de polen de olivo; g6, extracto de polen de heno; w21, extracto de polen de Parietaria judaica; w6, extracto de polen de artemisa *Anticuerpo IgE específico para el alérgeno en kilounidades internacionales por litro; negativo: menos de 0,35 kUA/L
TABLA 5.
- Contenido de la lista de secuencias
- SEQ ID NO
- Secuencia
- SEQ ID NO: 1
- ADN de Can f 4
- SEQ ID NO: 2
- proteína Can f 4
- SEQ ID NO: 3
- ADN de Bos d 23k
- SEQ ID NO: 4
- proteína Bos d 23k
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> Phadia AB Mattsson, Lars
5 Lidholm, Jonas
Lundgren, Thomas
<120> Alérgeno producido de manera recombinante
<130> P8728PC00/ICH
<150> SE 0950416-8 10 <151> 2009-06-05
<160> 4
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 525 15 <212> ADN
<213> Canis familiaris
<400> 1
<210> 2
<211> 174
<212> PRT
<213> Canis familiaris
<400> 2
<210> 3
<211> 815
<212> ADN
<213> Bos taurus
<400> 3
<210> 4
<211> 172
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 4 5
Claims (13)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.
-
- 2.
- Una molécula de ácido nucleico que codifica el alérgeno Can f 4 de acuerdo con la reivindicación 1.
-
- 3.
- La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene la secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO: 1.
-
- 4.
- Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o 3.
-
- 5.
- Una célula anfitriona que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 4.
-
- 6.
- Un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con los residuos de aminoácido 17-174 del SEQ ID NO: 2.
-
- 7.
- El uso del alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con dicho alérgeno Can f 4, en un diagnóstico in vitro de alergia de tipo I.
-
- 8.
- Un método para el diagnóstico in vitro de alergia tipo I que comprende las etapas
- -
- Poner en contacto una muestra de fluido corporal de un paciente que se sospecha que tiene alergia de tipo I con el alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4; y
- -
- Detectar la presencia, en la muestra, de anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Can f 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4,
en donde la presencia de tales anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Can f 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4, es indicativa de una alergia de tipo I. -
- 9.
- Un kit de diagnóstico para realizar el método de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende el alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4.
-
- 10.
- Un alérgeno Can f 4 producido de manera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4, para su uso en un método para el tratamiento de una alergia de tipo I a un mamífero, preferiblemente en donde el mamífero es canino.
-
- 11.
- El uso de un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Bos d 23k, en un diagnóstico in vitro de alergia de Tipo I.
-
- 12.
- Método para el diagnóstico in vitro de alergia de tipo I que comprende las etapas
- -
- Poner en contacto una muestra de fluido corporal de un paciente que se sospecha que tiene alergia de tipo I con un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Bos d 23k ; y
- -
- Detectar la presencia, en la muestra, de anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Bos d 23k, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Bos d 23k,
en donde la presencia de tales anticuerpos IgE que se unen específicamente a dicho alérgeno Bos d 23k, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para los anticuerpos IgE con el alérgeno Bos d 23k, es indicativa de una alergia de tipo I. - 13. Un alérgeno Bos d 23k producido de manera recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con el SEQ ID NO: 4, o un fragmento del mismo que comparte epítopos para anticuerpos IgE con el alérgeno Can f 4, para su uso en un método para el tratamiento de una alergia de tipo I a un mamífero, preferiblemente en donde el mamífero es bovino.
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