ES2564392T3 - Inhibidores de IL-6 para el tratamiento de rechazo crónico - Google Patents

Abstract

Un agente para su uso en la supresión de la reacción de rechazo crónico, que comprende como ingrediente activo un inhibidor de IL-6 que es un anticuerpo anti-IL-6 o anticuerpo anti-receptor de IL-6.

Description

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DESCRIPCION

Inhibidores de IL-6 para el tratamiento de rechazo cronico CAMPO TECNICO

La presente invencion se refiere a agentes para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprenden un inhibidor de IL-6 como ingrediente activo, y usos de los mismos. La presente invencion tambien se refiere a procedimientos para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprenden la etapa de administrar un inhibidor de IL-6 a los receptores.

TECNICA ANTERIOR

IL-6 es una citocina tambien denominada factor estimulador de linfocitos B 2 (BSF2) o interferon p2. Se descubrio la IL-6 como un factor de diferenciacion implicado en la activacion de linfocitos B (documento distinto de patente 1), y posteriormente se revelo que es una citocina multifuncional que influencia la funcion de varias celulas (documento distinto de patente 2). Se ha informado de que la IL-6 induce la maduracion de los linfocitos T (documento distinto de patente 3).

La IL-6 transmite su actividad biologica por medio de dos tipos de protemas en las celulas. La primera es el receptor de IL-6, que es una protema de union a ligando a la que se une la IL-6, con un peso molecular de aproximadamente 80 kDa (documentos distintos de patente 4 y 5). El receptor de IL-6 esta presente en una forma unida a membrana que penetra y se expresa en la membrana celular, y tambien como un receptor de IL-6 soluble que consiste principalmente en la region extracelular de la forma unida a membrana.

El otro tipo de protema es la protema de membrana gp130, que tiene un peso molecular de aproximadamente 130 kDa y esta implicada en la transduccion de senales de union distinta de ligando. La actividad biologica de IL-6 se transmite en la celula a traves de la formacion de un complejo IL-6/receptor de IL-6 por la IL-6 y el receptor de IL-6, seguido de la union del complejo con gp130 (documento distinto de patente 6).

Los inhibidores de IL-6 son sustancias que inhiben la transmision de la actividad biologica de IL-6. En la actualidad, los inhibidores de IL-6 conocidos incluyen anticuerpos frente a IL-6 (anticuerpos anti-IL-6), anticuerpos frente al receptor de IL-6 (anticuerpos anti-receptor de IL-6), anticuerpos frente a gp130 (anticuerpos anti-gp130), variantes de IL-6, peptidos parciales de IL-6, o receptor de lL-6, y similares.

Existen varios informes con relacion a los anticuerpos anti-receptor de IL-6 (documentos distintos de patente 7 y 8, y documentos de patente 1 a 3). Un informe de este tipo detalla un anticuerpo PM-1 humanizado, que se obtiene por trasplante de la region determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo de raton PM-1 (documento distinto de patente 9), que es un anticuerpo anti-receptor de IL-6, en un anticuerpo humano (documento de patente 4).

Debido a los avances en la politerapia y la aplicacion clmica de varios inmunosupresores, las estrategias terapeuticas para la reaccion de rechazo agudo que siguen al trasplante de organos estan casi establecidas, y la tasa de supervivencia al cabo de un ano despues de varios trasplantes de organos se ha mejorado significativamente. Sin embargo, la reaccion de rechazo cronico, que se vuelve problematica a partir del ano siguiente al trasplante, se produce incluso en casos clmicos en los que la reaccion de rechazo agudo se ha superado con tratamiento inmunosupresor convencional, y en los que el tratamiento se ha continuado durante un largo plazo. Por tanto, no se han establecido procedimientos preventivos ni terapeuticos eficaces frente a la reaccion de rechazo cronico. Ademas, no se ha esclarecido completamente el mecanismo causante de esta afeccion patologica, y es difmil diagnosticarlo en comparacion con la reaccion de rechazo agudo. Por tanto, se sabe que la reaccion de rechazo cronico es una complicacion que afecta al pronostico a largo plazo en los receptores (documentos distinto de patente 10 y 11).

Las caractensticas patologicas conocidas caractensticas de la reaccion de rechazo cronico incluyen fibrosis del intersticio y estenosis de luces debidas al engrosamiento de la mtima de tejidos luminales en organos trasplantados. En particular, la angioestenosis es una caractenstica patologica importante, y se denomina lesion vascular postrasplante o arterioesclerosis postrasplante. Se cree que una variedad de factores se influencian intrincadamente la progresion de la afeccion patologica, tal como prolongacion de la reaccion de rechazo tanto por inmunidad celular como humoral, trastornos de isquemia-reperfusion de organos, trastornos funcionales de los endotelios vasculares, factores de riesgo comunes para arterioesclerosis (diabetes, hiperlipidema, hipertension, y similares) en los receptores, efectos secundarios de inmunosupresores, factores geneticos, e infeccion postrasplante de citomegalovirus (documentos distintos de patente 12 y 13).

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Entre los agentes farmaceuticos existentes, los inhibidores de la calcineurina tales como ciclosporina y tacrolimus en particular son ineficaces contra la reaccion de rechazo cronico, y sus efectos secundarios tales como hipertension, hiperlipidemia y diabetes se consideran problematicos. Ademas, se requiere tratamiento inmunosupresor a largo plazo despues del trasplante en receptores pediatricos en particular. Por tanto, se ha anticipado el desarrollo de agentes farmaceuticos eficaces para la reaccion de rechazo cronico y que tienen pocos efectos secundarios (documentos distintos de patente 13 y 14).

Se han investigado perfiles de expresion genica de PG490-88 en la prevencion del rechazo cronico en aloinjertos renales en ratas por Fisniku O., et al. Transplant Proceedings (2005) 37(4): 1962-4.

El efecto de anticuerpos anti-receptor de IL-6 en la induccion de linfocitos T citotoxicos se examino en el documento EP 1 967 207.

El requisito descrito anteriormente para desarrollar un tratamiento inmunosupresor novedoso para suprimir la reaccion de rechazo cronico es el antecedente del presente estudio.

A continuacion se describen documentos de tecnicas anteriores relacionadas para la presente invencion.

[Documento de patente 1] Publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 95/09873

[Documento de patente 2 ] Solicitud de patente francesa n.° FR 2694767

[Documento de Patente 3] Patente de los Estados Unidos n.° 5216128

[Documento de patente 4] Documento WO 92/19759

[Documento distinto de patente 1] Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76

[Documento distinto de patente 2] Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78

[Documento distinto de patente 3] Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258

[Documento distinto de patente 4] Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981

[Documento distinto de patente 5] Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828

[Documento distinto de patente 6] Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581

[Documento distinto de patente 7] Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146

[Documento distinto de patente 8] Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630

[Documento distinto de patente 9] Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906

[Documento distinto de patente 10] Wong, B. W. et al., Cardiovasc. Pathol. (2005) 14, 176-80

[Documento distinto de patente 11] Homick, P. et al., Methods Mol. Biol. (2006) 333, 131-44

[Documento distinto de patente 12] Ramzy, D. et al., Can. J. Surg. (2005) 48, 319-327

[Documento distinto de patente 13] Valantine, H., J. Heart Lung Transplant (2004) 23(5 Supl), S187-93

[Documento distinto de patente 14] Webber, S. A. et al., Lancet (2006) 368, 53-69

[Documento distinto de patente 15] Izawa, A., et al., Circ. J. (2007) 71 (Supl I), 392 (Annual Scientific Meeting of the Japanese Circulation Society, Kobe, Mar 15-Mar 17, 2007; Abstract PE-269)

[Documento distinto de patente 16] Izawa, A., et al., Am. J. Transplant. (2007) 7(Supl 11), 426 (American Transplant Congress, San Francisco, CA, Mar 5-Mar 9, 2007; Resumen 1084)

DIVULGACION DE LA INVENCION

[Problemas que debe resolver la invencion]

La presente invencion se llevo a cabo bajo las circunstancias descritas anteriormente. Un objeto de la presente

invencion es proporcionar agentes para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprenden un inhibidor de IL-

6 como ingredientes activos.

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Otro objeto de la presente invencion es proporcionar procedimientos para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprenden la etapa de administrar un inhibidor de IL-6 a sujetos.

[Medios para resolver los problemas]

Para lograr los objetos descritos anteriormente, los presentes inventores sometieron a prueba anticuerpos antireceptor de IL-6 para determinar el efecto de suprimir la reaccion de rechazo cronico.

Los presentes inventores evaluaron el efecto de suprimir la reaccion de rechazo cronico de la administracion del anticuerpo anti-receptor de IL-6 de raton (MR16-1) usando un modelo de raton para rechazo cronico postrasplante cardfaco. El resultado del analisis histopatologico de los corazones trasplantados extirpados 60 dfas despues del trasplante revelo que la fibrosis de lesiones estenosicas miocardicas y vasculares, que son afecciones patologicas caractensticas de la reaccion de rechazo cronico, se suprimieron significativamente en el grupo tratado con MR16-1 en comparacion con el grupo de control. Por tanto, se demostro que la administracion de MR16-1 terna el efecto de suprimir la reaccion de rechazo cronico.

Por tanto, los presentes inventores descubrieron por primera vez que la administracion de anticuerpos anti-receptor de IL-6 suprime la reaccion de rechazo en la fase cronica despues de un trasplante de organos, y por tanto, completo la presente invencion.

Mas espedficamente, la presente invencion proporciona las siguientes invenciones:

[1] un agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprende como ingrediente activo un inhibidor de IL-6;

[2] el agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico de [1], en el que el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce una IL-6;

[3] el agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico de [1], en el que el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6;

[4] el agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico de [2] o [3], en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal;

[5] el agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico de [2] o [3], en el que el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce una IL-6 humana o un receptor de IL-6 humana;

[6] el agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico de [2] o [3], en el que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante;

[7] el agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico de una cualquiera de [2] a [6], en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico, humanizado o humano;

[8] el agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico de una cualquiera de [1] a [7], que se usa para suprimir la reaccion de rechazo cronico de trasplante cardfaco;

[9] un procedimiento para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprende la etapa de administrar un inhibidor de IL-6 a un sujeto;

[10] el procedimiento de [9], en el que el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un IL-6;

[11] el procedimiento de [9], en el que el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6;

[12] el procedimiento de [10] u [11], el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal;

[13] el procedimiento de [10] u [11], en el que el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce una IL-6 humana o un receptor de IL-6 humana;

[14] el procedimiento de [10] u [11], el que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante;

[15] el procedimiento de una cualquiera de [10] a [14], en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico, humanizado o humano;

[16] el procedimiento de una cualquiera de [9] a [15], que suprime la reaccion de rechazo cronico de trasplante cardfaco;

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[17] uso de un inhibidor de IL-6 en la produccion de un agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico;

[18] el uso de [17], en el que el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un IL-6;

[19] el uso de [17], en el que el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que reconoce un receptor de IL-6;

[20] el uso de [18] o [19], el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal;

[21] el uso de [18] o [19], en el que el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce una IL-6 humana o un receptor de

IL-6 humana;

[22] el uso de [18] o [19], el que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante;

[23] el uso de una cualquiera de [18] a [22], en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico, humanizado o humano; y

[24] un inhibidor de IL-6 para su uso en la supresion de la reaccion de rechazo cronico.

En consecuencia, la presente invencion se caracteriza por los modos de realizacion como se define en las reivindicaciones. Por tanto, se refiere a los siguientes puntos.

1. Un agente para su uso en la supresion de la reaccion de rechazo cronico, que comprende como ingrediente activo un inhibidor de IL-6 que es un anticuerpo anti-IL-6 o anticuerpo anti-receptor de IL-6.

2. Uso de un inhibidor de IL-6 que es un anticuerpo anti-IL-6 o anticuerpo anti-receptor de IL-6 para la produccion de un agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico.

3. El agente del punto 1 o el uso del punto 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. El agente o uso del punto 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce una lL-6 humana o receptor

de IL-6 humana.

5. El agente o uso del punto 3 o 4, el que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante.

6. El agente o uso de uno cualquiera de 3 a 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico, humanizado o

humano.

7. El agente o uso de uno cualquiera de los puntos 1 a 6 para su uso en la supresion cronico de trasplante cardfaco.

8. Una composicion farmaceutica que comprende el agente de uno cualquiera opcionalmente un vehroulo farmaceuticamente aceptable.

MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION

Los presentes inventores descubrieron que la administracion de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 puede suprimir la reaccion de rechazo cronico. La presente invencion se basa en estos hallazgos.

La presente invencion se refiere a agentes para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprenden un inhibidor de IL-6 como ingrediente activo.

En el presente documento, un “inhibidor de IL-6” es un anticuerpo que bloquea la transduccion de senales mediadas por IL-6 e inhibe la actividad biologica de IL-6. Preferentemente, el inhibidor de IL-6 es un anticuerpo que tiene una funcion inhibidora frente a la union de IL-6, receptor de IL-6, o gp130.

Los ejemplos de inhibidores de IL-6 incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-IL-6, anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos anti-gp130, variantes de IL-6, variantes de receptor de IL-6 soluble, y peptidos parciales de IL-6 o receptor de IL-6, y compuestos de bajo peso molecular y proternas (por ejemplo, C326 Avimer (Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-61)) que muestran las actividades similares. Preferentemente, los inhibidores de IL-6 de la presente invencion incluyen anticuerpos que reconocen receptores de IL-6.

La fuente de los anticuerpos no esta particularmente restringida en la presente invencion; sin embargo, los anticuerpos se derivan preferentemente de mairnferos, y mas preferentemente se derivan de seres humanos.

Los anticuerpos anti-IL-6 usados en la presente invencion se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando medios conocidos. En particular, son preferentes los anticuerpos monoclonales derivados de

de la reaccion de rechazo de los puntos 1 a 7 y

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mairnferos como los anticuerpos anti-IL-6 usados en la presente invencion. Los anticuerpos monoclonales derivados de mai^eras incluyen los producidos a partir de hibridomas y los producidos por procedimientos de ingeniena genetica a partir de huespedes transformados con un vector de expresion que comprende un gen de anticuerpo. Al unirse a la IL-6, el anticuerpo inhibe a la IL-6 de la union a un receptor de IL-6 y, por tanto, bloquea la transmision de la actividad biologica de IL-6 en la celula.

Dichos anticuerpos incluyen, MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956), anticuerpo SK2 (Sato, K. et al., transaction of the 21st Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology (1991) 21, 166), y asf sucesivamente.

Basicamente, los hibridomas productores de anticuerpos anti-IL-6 se pueden preparar usando tecnicas conocidas, como sigue: Espedficamente, dichos hibridomas se pueden preparar usando la IL-6 como antigeno de sensibilizacion para llevar a cabo la inmunizacion usando un procedimiento de inmunizacion convencional, fusionando las celulas inmunitarias obtenidas con celulas originales conocidas por un procedimiento de fusion celular convencional, y cribando para seleccionar las celulas productoras de anticuerpos monoclonales usando un procedimiento de cribado convencional.

Mas espedficamente, los anticuerpos anti-IL-6 se pueden producir como sigue: Por ejemplo, la IL-6 humana para su uso como antfgeno de sensibilizacion para obtener anticuerpos se puede obtener usando el gen de la IL-6 y/o secuencias de aminoacidos divulgados en Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543-550; J. Immunol. (1988) 140, 15341541; y/o Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.

Despues de transformar una celula huesped apropiada con un sistema de vectores de expresion conocido insertado con una secuencia genica de IL-6, la protema de IL-6 deseada se purifica usando procedimientos conocidos a partir del interior de la celula huesped o a partir del sobrenadante de cultivo. Esta protema de IL-6 purificada se puede usar como antfgeno de sensibilizacion. De forma alternativa, se pueden usar una protema de fusion de la protema de IL-6 y otra protema como antfgeno de sensibilizacion.

Los anticuerpos anti-receptor de IL-6 usados para la presente invencion se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando procedimientos conocidos. En particular, los anticuerpos anti-receptor de IL-6 usados en la presente invencion son preferentemente anticuerpos monoclonales derivados de mamnferos. Los anticuerpos monoclonales derivados de marnfferos incluyen los producidos a partir de hibridomas y los producidos usando procedimientos de ingeniena genetica a partir de huespedes transformados con un vector de expresion que comprende un gen de anticuerpo. Al unirse a un receptor de IL-6, los anticuerpos inhiben a la IL-6 de la union a un receptor de IL-6 y, por tanto, bloquean la transmision de la actividad biologica de IL-6 en la celula.

Dichos anticuerpos incluyen, anticuerpo MR16-1 (Tamura, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90,1192411928); anticuerpo PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906); anticuerpo AUK12-20 , anticuerpo AUK64-7 y anticuerpo AUK146-15 (publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 92/19759), y asf sucesivamente. De estos, el anticuerpo PM-1 se puede ejemplificar como un anticuerpo monoclonal preferente frente al receptor de IL-6 humana, y el anticuerpo MR16-1 como un anticuerpo monoclonal preferente frente al receptor de IL-6 de raton.

Basicamente, los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal anti-receptor de IL-6 se pueden preparar usando tecnicas conocidas, como sigue: Espedficamente, dichos hibridomas se pueden preparar usando un receptor de IL-6 como antfgeno de sensibilizacion para llevar a cabo la inmunizacion por un procedimiento de inmunizacion convencional, fusionando las celulas inmunitarias obtenidas con una celula original conocida por un procedimiento de fusion celular convencional, y cribando para seleccionar las celulas productoras de anticuerpos monoclonales usando un procedimiento de cribado convencional.

Mas espedficamente, los anticuerpos anti-receptor de IL-6 se pueden producir como sigue: por ejemplo, un receptor de IL-6 humana o receptor de IL-6 de raton para su uso como un antfgeno de sensibilizacion para obtener anticuerpos se pueden obtener usando los genes del receptor de IL-6 y/o secuencias de aminoacidos divulgados en la publicacion de solicitud de patente europea n.° EP 325474 y la publicacion de solicitud de patente japonesa Kokai n.° (JP-A) H03-155795 (solicitud de patente japonesa publicada, no examinada), respectivamente.

Existen dos tipos de protemas receptoras de IL-6: una expresada en la membrana celular y la otra separada de la membrana celular (receptores de IL-6 soluble) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). El receptor de IL-6 soluble consiste esencialmente en el receptor de IL-6 unido a la region extracelular de la membrana celular, y difiere del receptor de IL-6 unido a la membrana en que carece de la region transmembranaria o de ambas regiones transmembranaria e intracelular. Se puede emplear cualquier receptor de IL-6 como protema receptora de IL-6,

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siempre que se pueda usar como antigeno de sensibilizacion para producir un anticuerpo anti-receptor de IL-6 usado en la presente invencion.

Despues de transformer una celula huesped apropiada con un sistema de vectores de expresion conocido insertado con una secuencia genica de IL-6, la protema receptora de IL-6 deseada se purifica a partir del interior de la celula huesped o a partir del sobrenadante de cultivo usando un procedimiento conocido. Esta protema receptora de IL-6 purificada se puede usar como antigeno de sensibilizacion. De forma alternativa, se puede usar una celula que expresa el receptor de IL-6 o una protema de fusion de la protema receptora de IL-6 y otra protema como antigeno de sensibilizacion.

Los anticuerpos anti-gp130 usados en la presente invencion se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando procedimientos conocidos. En particular, los anticuerpos anti-gp130 usados en la presente invencion son preferentemente anticuerpos monoclonales derivados de mamnferos. Los anticuerpos monoclonales derivados de mamnferos incluyen los producidos a partir de hibridomas y los producidos usando procedimientos de ingeniena genetica a partir de huespedes transformados con un vector de expresion que comprende un gen de anticuerpo. Al unirse a gp130, el anticuerpo inhibe a gp130 de la union al complejo IL-6/receptor de IL-6, y, por tanto, bloquea la transmision de la actividad biologica de IL-6 en la celula.

Dichos anticuerpos incluyen, anticuerpo AM64 (documento JP-A (Kokai) H03-219894), anticuerpo 4B11 y anticuerpo 2H4 (documento US 5571513), anticuerpo B-S12 y anticuerpo B-P8 (documento JP-A (Kokai) H08-291199), y asf sucesivamente.

Basicamente, los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales anti-gp130 se pueden preparar usando tecnicas conocidas, como sigue: Espedficamente, dichos hibridomas se pueden preparar usando gp130 como antigeno de sensibilizacion para llevar a cabo la inmunizacion usando un procedimiento de inmunizacion convencional, fusionando las celulas inmunitarias obtenidas con una celula original conocida por un procedimiento de fusion celular convencional, y cribando para seleccionar las celulas productoras de anticuerpos monoclonales usando un procedimiento de cribado convencional.

Mas espedficamente, los anticuerpos monoclonales se pueden producir como sigue: Por ejemplo, se puede obtener gp130 para su uso como un antfgeno de sensibilizacion para obtener anticuerpos usando el gen de gp130 y/o secuencia de aminoacidos divulgados en la publicacion de solicitud de patente europea n.° EP 411946.

Despues de transformar una celula huesped apropiada con un sistema de vectores de expresion conocido insertado con una secuencia genica de gp130, la protema de gp130 deseada se purifica por un procedimiento conocido a partir del interior de la celula huesped o a partir del sobrenadante de cultivo. Esta protema de gp130 purificada se puede usar como antfgeno de sensibilizacion. De forma alternativa, se puede usar una celula que expresa gp130 o una protema de fusion de la protema gp130 y otra protema como antfgeno de sensibilizacion.

Los mamnferos que se van a inmunizar con un antfgeno de sensibilizacion no estan particularmente limitados, pero preferentemente se seleccionan teniendo considerando la compatibilidad con la celula original usada para la fusion celular. En general, se usan roedores tales como ratones, ratas y hamsters.

Los animales se inmunizan con antfgenos de sensibilizacion de acuerdo con procedimientos conocidos. Por ejemplo, como un procedimiento general, los animales se inmunizan por inyeccion intraperitoneal o subcutanea de un antfgeno de sensibilizacion. Espedficamente, el antfgeno de sensibilizacion preferentemente se diluye o se suspende en una cantidad apropiada de solucion salina tamponada con fosfato (PBS), solucion salina fisiologica o similar, mezclada con una cantidad apropiada de coadyuvante general (por ejemplo, coadyuvante completo de Freund), se emulsiona, y despues se administra a un mamnfero varias veces, cada de cuatro a 21 dfas. Ademas, se puede usar un vehnculo apropiado para la inmunizacion con un antfgeno de sensibilizacion.

Despues de dicha inmunizacion, se confirma un incremento en el nivel de un anticuerpo deseado en suero y a continuacion se obtienen las celulas inmunitarias del mamnfero para la fusion celular. Las celulas inmunitarias preferentes para la fusion celular incluyen, en particular, celulas del bazo.

Las celulas de mieloma de mamnferos usadas como celulas originales, es decir como celulas companeras que se van a fusionar con las celulas inmunitarias anteriores, incluyen varias cepas celulares conocidas, por ejemplo, P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. y Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al. Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al. Nature (1979) 277, 131-133), y similares.

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Basicamente, la fusion celular de las celulas inmunitarias mencionadas anteriormente y las celulas de mieloma se puede realizar usando procedimientos conocidos, por ejemplo, el procedimiento de Milstein et al. (Kohler, G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), y similares.

Mas espedficamente, la fusion celular mencionada anteriormente se logra en medio de cultivo de nutrientes general en presencia de un agente potenciadores de la fusion celular. Por ejemplo, se usan polietilenglicol (PEG), virus Sendai (HVJ) y similares, como agentes potenciadores de la fusion. Ademas, para potenciar la eficacia de fusion, se pueden anadir agentes auxiliares tales como dimetilsulfoxido dependiendo de las necesidades.

La proporcion de celulas inmunitarias con respecto a celulas de mieloma usadas es preferentemente, por ejemplo, de 1 a 10 celulas inmunitarias por cada celula de mieloma. El medio de cultivo usado para la fusion celular mencionada anteriormente es, por ejemplo, el medio de cultivo RPMI1640 o MEM, que son adecuados para la proliferacion de las celulas de mieloma mencionadas anteriormente. Tambien se puede usar un medio de cultivo general usado para cultivar este tipo de celulas. Ademas, se pueden usar en combinacion complementos de suero tales como suero fetal bovino (FCS).

Para la fusion celular, las celulas de fusion (hibridomas) de interes se forman mezclando cantidades predeterminadas de una celula inmunitaria mencionada anteriormente y celula de mieloma en un medio de cultivo mencionado anteriormente, y a continuacion anadiendo y mezclando una concentracion de un 30 % a un 60 % (p/v) de solucion de PEG (por ejemplo, una solucion de PEG con una media de peso molecular de aproximadamente 1.000 a 6.000) precalentada a aproximadamente 37 °C. A continuacion, los agentes de fusion celular y similares que no son adecuados para el crecimiento de hibridomas se pueden retirar anadiendo repetidamente un medio de cultivo apropiado y a continuacion retirando el sobrenadante por centrifugacion.

Los hibridomas anteriores se seleccionan cultivando las celulas en un medio de cultivo de seleccion general, por ejemplo, medio de cultivo HAT (un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en medio de cultivo HAT continua durante un penodo suficiente, en general de varios dfas a varias semanas, para destruir celulas distintas de los hibridomas de interes (celulas no fusionadas). A continuacion, se realiza un procedimiento de dilucion limitada estandar para cribar y clonar los hibridomas que producen un anticuerpo de interes.

Ademas de los procedimientos para inmunizar animales no humanos con antfgenos para obtener los hibridomas mencionados anteriormente, los anticuerpos humanos deseados con la actividad de union a un antfgeno deseado o celula que expresa el antfgeno deseado se pueden obtener sensibilizando un linfocito humano con una protema de antfgeno deseado o celula que expresa el antfgeno deseado in vitro, y fusionando el linfocito B sensibilizado con una celula de mieloma humana (por ejemplo, U266) (vease la publicacion de la solicitud de patente japonesa Kokoku n.° (JP-B) HOI-59878 (solicitud de patente japonesa aprobada y examinada, publicada para oposicion)). Ademas, se puede obtener un anticuerpo humano deseado administrando un antfgeno o celula que expresa el antfgeno a un animal transgenico que tiene un repertorio de genes de anticuerpos humanos, y a continuacion siguiendo el procedimiento mencionado anteriormente (veanse las publicaciones de solicitud de patente internacional n.° WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735).

Los hibridomas asf preparados que producen anticuerpos monoclonales se pueden subcultivar en un medio de cultivo convencional y almacenar en nitrogeno lfquido durante un periodo largo.

Cuando se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de los hibridomas mencionados anteriormente, se pueden emplear los siguientes procedimientos: (1) procedimientos en los que se cultivan los hibridomas de acuerdo con procedimientos convencionales y se obtienen los anticuerpos como un sobrenadante de cultivo; (2) procedimientos en los que se hacen proliferar los hibridomas administrandolos a un mairnfero compatible y se obtienen los anticuerpos como ascitis; y asf sucesivamente. El procedimiento anterior es preferente para obtener anticuerpos de alta pureza, y este ultimo es preferente para una produccion de anticuerpos a gran escala.

Por ejemplo, se pueden preparar hibridomas productores de anticuerpos anti-receptor de IL-6 por el procedimiento divulgado en el documento JP-A (Kokai) H03-139293. Dichos hibridomas se pueden preparar inyectando un hibridoma productor de anticuerpo PM-1 en la cavidad abdominal de un raton BALB/c, obteniendo ascitis, y a continuacion purificando un anticuerpo PM-1 de la ascitis; o cultivando el hibridoma en un medio apropiado (por ejemplo, medio RPMI1640 que contiene suero fetal bovino al 10%, y BM-Condimed H1 al 5% (Boehringer Mannheim); medio SFM de hibridoma (GIBCO-BRL); medio PFHM-II (GIBCO-BRL), etc.) y a continuacion obteniendo el anticuerpo PM-1 a partir del sobrenadante de cultivo.

Se pueden usar anticuerpos recombinantes como los anticuerpos monoclonales de la presente invencion, en los que los anticuerpos se producen usando tecnicas de recombinacion genetica clonando un gen de anticuerpo a partir de

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un hibridoma, insertando el gen en un vector apropiado, y a continuacion introduciendo el vector en un huesped (vease, por ejemplo, Borrebaeck, C. A. K. y Larrick, J. W., Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por Macmillan Publishers Ltd, 1990).

Mas espedficamente, los ARNm que codifican las regiones variables (V) del anticuerpo se afslan a partir de las celulas que producen los anticuerpos de interes, tales como hibridomas. se pueden aislar los ARNm preparando ARN totales de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como el procedimiento de ultracentrifugacion de guanidina (Chirgwin, J. M. et al. Biochemistry (.1979) 18, 5294-5299) y el procedimiento AGPC (Chomczynski, P. et al. Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), y preparando ARNm usando el kit de purificacion de ARNm (Pharmacia) y similares. De forma alternativa, se pueden preparar directamente ARNm usando un kit de purificacion de ARNm QuickPrep (Pharmacia).

Los ADNc de las regiones V del anticuerpo se sintetizan a partir de los ARNm obtenidos usando transcriptasa inversa. Los ADNc se pueden sintetizar usando un kit de smtesis de ADNc de primera hebra de transcriptasa inversa de AMV y asf sucesivamente. Ademas, para sintetizar y amplificar los ADNc, se puede emplear el procedimiento 5'- RACE (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al. Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) usando el kit 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) y PCR. Se purifica un fragmento de ADN de interes a partir de los productos de PCR obtenidos y a continuacion se fija con un ADN de vector. A continuacion, se prepara un vector recombinante usando el ADN anterior y se introduce en Escherichia coli (E. Coli) o similar, y a continuacion, se seleccionan sus colonias para preparar un vector recombinante deseado. Se confirma la secuencia de nucleotidos del ADN de interes, por ejemplo, por el procedimiento didesoxi.

Cuando se obtiene un ADN que codifica la region V de un anticuerpo de interes, se fija el ADN con un ADN que codifica una region constante (region C) del anticuerpo deseado y se inserta en un vector de expresion. De forma alternativa, se puede insertar un ADN que codifica una region V del anticuerpo en un vector de expresion que comprende un ADN de una region C del anticuerpo.

Para producir un anticuerpo que se va a usar en la presente invencion, como se describe a continuacion, se inserta un gen de anticuerpo en un vector de expresion de modo que se expresa bajo el control de una region reguladora de la expresion, por ejemplo, un potenciador y promotor. A continuacion, se puede expresar el anticuerpo transformando una celula huesped con este vector de expresion.

En la presente invencion, para reducir la heteroantigenicidad frente a humanos y similar, se pueden usar anticuerpos recombinantes geneticamente modificados de forma artificial, por ejemplo, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Se pueden preparar estos anticuerpos modificados usando procedimientos conocidos.

Se puede obtener un anticuerpo quimerico fijando un ADN que codifica una region V del anticuerpo, obtenido como antes, con un ADN que codifica una region C del anticuerpo humano, insertando a continuacion el ADN en un vector de expresion e introduciendolo en un huesped para la produccion (vease, la publicacion de solicitud de patente europea n.° EP 125023; publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 92/19759). Se puede usar este procedimiento conocido para obtener anticuerpos quimericos utiles para la presente invencion.

Los anticuerpos humanizados tambien se denominan anticuerpos humanos remodelados, y son anticuerpos en los que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo a partir de un mairnfero distinto del ser humano (por ejemplo, un anticuerpo de raton) se transfiere en las CDR de anticuerpos humanos. Tambien son conocidos procedimientos generales para esta recombinacion genica (vease, la publicacion de solicitud de patente europea n.° EP 125023, la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 92/19759).

Mas espedficamente, las secuencias de ADN disenadas de modo que las CDR de un anticuerpo de raton se fijan con las regiones estructurales (FR) de un anticuerpo humano, se sintetizan por PCR a partir de varios oligonucleotidos producidos para contener porciones superpuestas en sus extremos terminales. El ADN obtenido se fija con un ADN que codifica la region C del anticuerpo humano y a continuacion se inserta en un vector de expresion. El vector de expresion se introduce en un huesped para producir el anticuerpo humanizado (vease, la publicacion de solicitud de patente europea n.° EP 239400, la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 92/19759).

Las FR del anticuerpo humano que se van a fijar por medio de las CDR se seleccionan de modo que las CDR forman sitios de union a antfgeno adecuados. El/Los aminoacido(s) dentro de las FR de las regiones variables del anticuerpo puede(n) estar sustituido(s) como sea necesario de modo que las CDR del anticuerpo humano remodelado formen un sitio de union a antfgeno apropiado (Sato, K. et al. Cancer Res. (1993) 53,851 -856).

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Se usan regiones C de anticuerpo humano para los anticuerpos quimericos y humanizados, e incluyen Cy. Por ejemplo, se puede usar Cy1, Cy2, Cy3, o Cy4. Ademas, para mejorar la estabilidad de los anticuerpos o su produccion, se pueden modificar las regiones C de anticuerpos humanos.

Los anticuerpos quimericos consisten en la region variable de un anticuerpo derivado de un mairnfero no humano y la region constante de un anticuerpo derivado de un ser humano; los anticuerpos humanizados consisten en las CDR de un anticuerpo derivado de un marnffero no humano y las regiones estructurales y las regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano. Ambas tienen una antigenicidad reducida en el cuerpo humano, y por tanto, son utiles como anticuerpos para su uso en la presente invencion.

Los ejemplos espedficos preferidos de anticuerpos humanizados para su uso en la presente invencion incluyen el anticuerpo PM-1 humanizado (vease, la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 92/19759).

Adicionalmente, ademas de los procedimientos mencionados anteriormente para obtener anticuerpos humanos, tambien se conocen tecnicas para obtener anticuerpos humanos por seleccion usando una coleccion de anticuerpos humanos. Por ejemplo, las regiones variables de anticuerpos humanos se pueden expresar en superficies de fagos como, anticuerpos monocatenarios (scFv) usando el procedimiento de presentacion en fagos, y a continuacion se pueden seleccionar los fagos de union a antigeno. Al analizar los genes de los fagos seleccionados, se pueden determinar las secuencias de ADN que codifican las regiones variables del anticuerpo humano que se unen al antigeno. Una vez que se revela la secuencia de ADN de un scFv que se une al antfgeno, se puede construir un vector de expresion apropiado que comprende la secuencia para obtener un anticuerpo humano. Estos procedimientos ya son conocidos y, como referencia, se pueden usar las publicaciones de los documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, y WO 95/15388.

Los genes de anticuerpo construidos anteriormente se pueden expresar de acuerdo con procedimientos convencionales. Cuando se usa una celula de mamffero, el gen del anticuerpo se puede expresar usando un ADN en el que el gen del anticuerpo que se va a expresar este fijado funcionalmente a un promotor usado comunmente util y una senal de poli A corriente abajo del gen del anticuerpo, o un vector que comprende el ADN. Los ejemplos de un promotor/potenciador incluyen el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus humano.

Ademas, otros promotores/potenciadores que se pueden usar para expresar los anticuerpos para su uso en la presente invencion incluyen promotores/potenciadores vmcos de retrovirus, poliomavirus, adenovirus, virus sfmico 40 (SV40), y similares; y tambien incluyen promotores/potenciadores derivados de celulas de mamffero tales como el factor de alargamiento humano 1a (HEF1a).

Por ejemplo, cuando se usa el promotor/potenciador de SV40, la expresion se puede realizar facilmente siguiendo el procedimiento por Mulligan et al. (Mulligan, R. C. et al. Nature (1979) 277, 108-114). De forma alternativa, en el caso del promotor/potenciador de HEF1a, se puede usar el procedimiento por Mizushima et al (Mizushima, S. Y Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

Cuando se usa E. Coli, se puede expresar un gen del anticuerpo fijando de manera funcional un promotor convencional, una secuencia senal para la secrecion de anticuerpos y el gen del anticuerpo que se va a expresar. Los ejemplos del promotor incluyen un promotor lacZ, promotor araB y similares.

Cuando se usa un promotor lacZ, los genes se pueden expresar de acuerdo con el procedimiento de Ward et al. (Ward, E. S. et al. Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) ; y se puede usar el promotor araB de acuerdo con el procedimiento de Better et al (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043).

Cuando se produce el anticuerpo en el periplasma de E. Coli, se puede usar la secuencia senal pel B (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) como secuencia senal para la secrecion de anticuerpos. Se aislan los anticuerpos producidos en el periplasma y a continuacion se usan despues del replegado apropiado de la estructura de anticuerpo (vease, por ejemplo, el documento WO 96/30394).

Como origen de replicacion, se pueden usar los derivados de SV40, poliomavirus, adenovirus, papilomavirus bovino (PVB) y similares. Ademas, para potenciar el numero de copias genicas en un sistema de celula huesped, el vector de expresion puede comprender el gen de aminoglucosido fosfotransferasa (APH), gen de timidina cinasa (TK), gen de xantina-guanina fosforribosiltransferasa de E. Coli (Ecogpt), gen de dihidrofolato reductasa (dhfr), o similar como marcador de seleccion.

Se puede usar cualquier sistema de produccion para preparar los anticuerpos para su uso en la presente invencion. Los sistemas de produccion para la preparacion de anticuerpos incluyen sistemas de produccion in vitro e in vivo. Los sistemas de produccion in vitro incluyen los que usan celulas eucariotas o celulas procariotas.

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Los sistemas de produccion que usan celulas eucariotas incluyen los que usan celulas animales, celulas vegetales o celulas fungicas. Dichas celulas animales incluyen (1) celulas de mamnferos, por ejemplo, CHO, COS, mieloma, de rinon de cna de hamster (BHK), HeLa, Vero, y similares; (2) celulas de anfibios, por ejemplo, oocito de Xenopus; y (3) celulas de insectos, por ejemplo, sf9, sf21, Tn5, y similares. Las celulas vegetales conocidas incluyen celulas derivadas de Nicotiana tabacum, que se puede cultivar como callo. Las celulas fungicas conocidas incluyen levaduras tales como Saccharomyces (por ejemplo, S. Cerevisiae), hongos de moho tales como Aspergillus (por ejemplo, A. Niger), y similares.

Los sistemas de produccion que usan celulas procariotas incluyen los que usan celulas bacterianas. Las celulas bacterianas conocidas incluyen E. Coli y Bacillus subtilis.

Se pueden obtener anticuerpos usando una transformacion para introducir un gen del anticuerpo de interes en estas celulas, y a continuacion cultivando las celulas transformadas in vitro. Los cultivos se llevan a cabo de acuerdo con procedimientos conocidos. Por ejemplo, se pueden usar DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM como medio de cultivo, y se pueden usar en combinacion suplementos de suero tales como FCS. Ademas, se pueden transferir celulas

introducidas con genes del anticuerpo a la cavidad abdominal o similar de un animal para producir los anticuerpos in

vivo.

Por otra parte, los sistemas de produccion in vivo incluyen los que usan animales o vegetales. Los sistemas de produccion que usan animales incluyen los que usan mai^eras o insectos.

Los marnfferos que se pueden usar incluyen cabras, cerdos, ovejas, ratones, bovinos y similares (Vicki Glaser,

SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Ademas, los insectos que se pueden usar incluyen gusanos de seda. Cuando se usan vegetales, se puede usar el tabaco, por ejemplo.

Se introduce un gen de anticuerpo en estos animales o vegetales, se produce el anticuerpo en el cuerpo de los animales o vegetales, y a continuacion, se recupera este anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un gen del anticuerpo como gen de fusion insertandolo en el medio de un gen que codifica una protema tal como de casema p de cabra, que se produce unicamente en la leche. Los fragmentos de ADN que comprenden el gen de fusion, que incluye el gen del anticuerpo, se inyectan en embriones de cabra, y se introducen los embriones en cabras hembra. Se obtiene el anticuerpo deseado a partir de leche producida por los animales transgenicos nacidos de cabras que recibieron los embriones, o producida de progenitores de estos animales. A las cabras transgenicas se les pueden administrar hormonas para incrementar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado que producen (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Cuando se usan gusanos de seda, los gusanos de seda se infectan con un baculovirus insertado con un gen del anticuerpo deseado, y se obtiene el anticuerpo deseado a partir de los fluidos corporales de estos gusanos de seda (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Ademas, cuando se usa tabaco, se inserta el gen del anticuerpo deseado en un vector de expresion vegetal (por ejemplo, pMON530) y se introduce el vector en bacterias tales como Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria se usa para infectar tabaco (por ejemplo, Nicotiana tabacum) de modo que se pueden obtener los anticuerpos deseados a partir de las hojas de este tabaco (Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Cuando se producen anticuerpos usando sistemas de produccion in vitro o in vivo, como se describe anteriormente, se pueden insertar ADN que codifican una cadena pesada (cadena H) y cadena ligera (cadena L) del anticuerpo en vectores de expresion separados y a continuacion se cotransforma un huesped con los vectores. De forma alternativa, se pueden insertar los ADN en un unico vector de expresion para transformar un huesped (vease la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO 94/11523).

Los anticuerpos usados en la presente invencion pueden ser fragmentos de anticuerpo o productos modificados de los mismos, siempre que se puedan usar de forma adecuada en la presente invencion. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv y de Fv monocatenario (scFv), en los que los Fv de las cadenas H y L estan enlazados por medio de un enlazador adecuado.

Espedficamente, los fragmentos de anticuerpos se producen tratando los anticuerpos con enzimas, por ejemplo, papama o pepsina, o de forma alternativa, se construyen genes que codifican estos fragmentos, se introducen en vectores de expresion, y estos se expresan en celulas huesped apropiadas (vease, por ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. y Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121,663-666; Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

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Se puede obtener un scFv enlazando la region V de la cadena H y la region V de la cadena L de un anticuerpo. En el scFv, la region V de la cadena H y la region V de la cadena L se enlazan por medio de un enlazador, preferentemente por medio de un enlazador pepffdico (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). Las regiones V de las cadenas H y L en un scFv se pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Los enlazadores pepffdicos para enlazar las regiones V incluyen, por ejemplo, peptidos monocatenarios arbitrarios que consisten en de 12 a 19 residuos aminoaddicos.

Se puede obtener un ADN que codifica scFv usando un ADN que codifica una cadena H o una region V y un ADN que codifica una cadena L o una region V de los anticuerpos mencionados anteriormente como moldes, usando PCR para amplificar una porcion de ADN que codifica la secuencia de aminoacidos deseada en la secuencia de molde y usa cebadores que definen los extremos terminales de la porcion, y despues amplificando adicionalmente la porcion de ADN amplificada con un ADN que codifica una porcion del enlazador pepffdico y pares de cebadores que enlazan ambos extremos del enlazador a la cadena H y cadena L.

Una vez que se ha obtenido un ADN que codifica scFv, se puede obtener un vector de expresion que comprende el ADN y un huesped transformado con el vector de acuerdo con procedimientos convencionales. Ademas, se puede obtener el scFv de acuerdo con procedimientos convencionales usando el huesped.

Como antes, se pueden producir estos fragmentos de anticuerpos a partir del huesped obteniendo y expresando sus genes. En el presente documento, un “anticuerpo” engloba dichos fragmentos de anticuerpo.

Como anticuerpos modificados tambien se pueden usar anticuerpos unidos a diversas moleculas, tales como polietilenglicol (PEG). En el presente documento, un “anticuerpo” engloba dichos anticuerpos modificados. Estos anticuerpos modificados se pueden obtener modificando qmmicamente los anticuerpos obtenidos. Dichos procedimientos ya estan establecidos en la tecnica.

Los anticuerpos producidos y expresados como antes se pueden aislar a partir del interior o exterior de las celulas o a partir de los huespedes, y, a continuacion, se pueden purificar hasta que sean homogeneos. Los anticuerpos para su uso en la presente invencion se pueden aislar y/o purificar usando cromatograffa de afinidad. Las columnas que se van a usar para la cromatograffa de afinidad incluyen, por ejemplo, columnas de protema A y columnas de protema G. Los vedculos usados para las columnas de protema A incluyen, por ejemplo, HyperD, POROS, Sepharose FF y semejantes. Ademas de lo anterior, se pueden usar otros procedimientos usados para el aislamiento y/o purificacion de protemas comunes, y no estan limitados en modo alguno.

Por ejemplo, los anticuerpos usados para la presente invencion se pueden aislar y/o purificar seleccionando de forma apropiada y combinando cromatograffas ademas de cromatograffa de afinidad, filtros, ultrafiltracion, desestabilizacion salina, dialisis y semejantes. Las cromatograffas incluyen, por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa hidrofoba, filtracion en gel y semejantes. Estas cromatograffas se pueden aplicar a cromatograffa de ffquidos de alto rendimiento (HPLC). De forma alternativa, se puede usar una HPLC de fase inversa.

La concentracion de los anticuerpos obtenidos como antes se puede determinar por mediante medida de la absorbancia, ELISA o semejantes. Espedficamente, la absorbancia se determina de forma apropiada diluyendo la solucion de anticuerpo con PBS(-), midiendo la absorbancia a 280 nm, y calculando la concentracion (1,35 DO = 1 mg/ml). De forma alternativa, cuando se usa ELISA, la medida se puede realizar como sigue: Espedficamente, se anaden 100 pl de anti-IgG humana de cabra (TAG) a 1 pg/ml con tampon bicarbonato 0,1 M (pH 9,6) a una placa de 96 pocillos (Nimc) y se incuban durante la noche a 4 °C para inmovilizar el anticuerpo. Despues del bloqueo, se anaden como patron 100 pl de un anticuerpo diluido de forma apropiada de la presente invencion o una muestra diluida de forma apropiada que comprende el anticuerpo e IgG humana (CAPPEL), y se incuban durante una hora a temperatura ambiente.

Despues del lavado, se anaden 100 pl de anti-IgG humana marcada con fosfatasa alcalina diluida 5.000x (BIO SOURCE) y se incuba durante una hora a temperatura ambiente. Despues de otro lavado, se anade solucion de sustrato y se incuba, y se mide la absorbancia a 405 nm usando un Microplate Reader Model 3550 (Bio-Rad) para calcular la concentracion del anticuerpo de interes.

Las variantes de IL-6 usadas en la presente invencion son sustancias con la actividad de union a un receptor de IL-6 y que no transmiten actividad biologica de IL-6. Es decir, las variantes de IL-6 compiten con la IL-6 para unirse a los receptores de IL-6, pero no logran transmitir la actividad biologica de IL-6, y, por ende, bloquean la transduccion de senales mediadas por IL-6.

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Las variantes de IL-6 se producen introduciendo una mutacion(mutaciones) al sustituir residuos aminoaddicos en la secuencia de aminoacidos de IL-6. El origen de la IL-6 usada como la base de las variantes de IL-6 no esta limitado, pero es preferentemente IL-6 humana en consideracion con la antigenicidad y semejantes.

Mas espedficamente, las sustituciones aminoaddicas se realizan prediciendo la estructura secundaria de la secuencia de aminoacidos de IL-6 usando programas de modelado molecular conocidos (por ejemplo, WHATIF; Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56), y evaluando adicionalmente la influencia del/de los residuo(s) aminoaddico(s) sustituido(s) en toda la molecula. Despues de la determinacion del residuo aminoaddico apropiado que se va a sustituir, se llevan a cabo procedimientos de PCR comunmente realizados usando una secuencia de nucleotidos que codifica un gen de IL-6 humana como molde, y se introducen mutaciones para provocar sustituciones aminoaddicas, y, por tanto, se obtienen genes que codifican variantes de IL-6. Si es necesario, este gen se inserta en un vector de expresion apropiado, y la variante de IL-6 se puede obtener aplicando los procedimientos mencionados anteriormente para la expresion, produccion y purificacion de anticuerpos recombinantes.

Se divulgan ejemplos espedficos de las variantes de IL-6 en Brakenhoflf et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, el documento WO 96/18648 y el documento WO 96/17869.

Los peptidos parciales de IL-6 y del receptor de IL-6 que se van a usar en la presente invencion son sustancias con la actividad de union al receptor de IL-6 y a IL-6, respectivamente, y que no transmiten la actividad biologica de IL-6. En concreto, al unirse a y capturar un receptor de IL-6 o IL-6, los peptidos parciales de IL-6 o los peptidos parciales del receptor de IL-6 pueden inhibir espedficamente que la IL-6 se una al receptor de IL-6. Como resultado, no se transmite la actividad biologica de IL-6, y se bloquea a transduccion de senales mediadas por IL-6.

Los peptidos parciales de IL-6 o del receptor de IL-6 son peptidos que comprenden parte o toda la secuencia de aminoacidos de la region de la secuencia de aminoacidos de la IL-6 o del receptor de IL-6 que esta implicada en la union entre la lL-6 y el receptor de IL-6. Dichos peptidos comprenden normalmente diez a 80, preferentemente 20 a 50, mas preferentemente 20 a 40 residuos aminoaddicos.

Los peptidos parciales de IL-6 o peptidos parciales del receptor de IL-6 se pueden producir de acuerdo con procedimientos conocidos en general, por ejemplo, tecnicas de ingeniena genetica o procedimientos de smtesis peptidica, especificando la region de la secuencia de aminoacidos de la IL-6 o del receptor de IL-6 que esta implicada en la union entre la IL-6 y el receptor de lL-6, y usando una porcion o toda la secuencia de aminoacidos de la region especificada.

Cuando se prepara un peptido parcial de IL-6 o peptido parcial del receptor de IL-6 usando procedimientos de ingeniena genetica, se inserta una secuencia de ADN que codifica el peptido deseado en un vector de expresion, y, a continuacion, el peptido se puede obtener aplicando los procedimientos mencionados anteriormente para la expresion, produccion y purificacion de anticuerpos recombinantes.

Cuando se produce un peptido parcial de IL-6 o peptido parcial del receptor de IL-6 usando los procedimientos de smtesis peptidica, se pueden usar procedimientos de smtesis peptidica usados en general, por ejemplo, procedimientos de smtesis en fase solida o procedimientos de smtesis en fase lfquida.

Espedficamente, los peptidos se pueden sintetizar de acuerdo con el procedimiento descrito en “Continuation of Development of Pharmaceuticals, vol. 14, Peptide Synthesis (en japones) (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)”. Por ejemplo, como procedimiento de smtesis en fase solida se puede emplear el siguiente procedimiento: el aminoacido correspondiente al extremo C terminal del peptido que se va a sintetizar se une a un soporte que es insoluble en disolventes organicos, a continuacion, la hebra peptidica se alarga repitiendo alternativamente (1) la reaccion de condensacion de aminoacidos, cuyos grupos a-amino y grupos funcionales de cadena ramificada estan protegido con grupos protectores apropiados, una en un momento en la direccion C a N-terminal; y (2) la reaccion de retirar los grupos protectores de los grupos a-amino de los aminoacidos o peptidos unidos con resina. La smtesis peptidica en fase solida se clasifica de forma amplia en el procedimiento de Boc y el procedimiento de Fmoc, dependiendo del tipo de grupos protectores usados.

Despues de sintetizar una protema de interes, como antes, se llevan a cabo reacciones de desproteccion, a continuacion, hebra peptidica se escinde de su soporte. Para la reaccion de escision de hebra peptidica, en general, se usa fluoruro de hidrogeno o acido trifluorometano sulfonico para el procedimiento de Boc, y, en general, se usa el TFA para el procedimiento de Fmoc. Por ejemplo, en el procedimiento de Boc la resina peptidica protegida mencionada anteriormente se trata con fluoruro de hidrogeno en presencia de anisol. A continuacion, el peptido se recupera retirando los grupos protectores y escindiendo el peptido de su soporte. Mediante liofilizacion del peptido recuperado, se puede obtener un peptido en bruto. En el procedimiento de Fmoc, por otra parte, la reaccion de

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desproteccion y la reaccion para escindir la hebra peptidica del soporte se puede realizar en TFA usando un procedimiento similar a los descritos anteriormente, por ejemplo.

Los peptidos en bruto obtenidos se pueden separar y/o purificar mediante aplicacion de HPLC. La elucion se puede realizar en condiciones optimas usando un sistema disolvente agua-acetonitrilo, que, en general, se usa para la purificacion de protemas. Las fracciones correspondientes a los picos del perfil cromatografico obtenido se recogen y se liofilizan. Por tanto, las fracciones peptfdicas purificadas se identifican mediante analisis de peso molecular por medio de analisis de espectro de masas, analisis de composicion de aminoacidos, analisis de secuencia de aminoacido o semejantes.

Los ejemplos espedficos de peptidos parciales de IL-6 y peptidos parciales del receptor de IL-6 se divulgan en el documento JP-A (Kokai) H02-188600, el documento JP-A (Kokai) H07-324097, el documento JP-A (Kokai) H08- 311098, y la publicacion de patente de Estados Unidos n.° US 5210075.

Los anticuerpos usados en la presente invencion tambien pueden ser anticuerpos conjugados que se unen a diversas moleculas, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radiactivas y toxinas. Dichos anticuerpos modificados se pueden obtener modificando qmmicamente los anticuerpos obtenidos. Los procedimientos para modificar anticuerpos ya estan establecidos en la tecnica. Los “anticuerpos” de la presente invencion engloban estos anticuerpos conjugados.

Los agentes de la presente invencion para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprenden inhibidores de IL-6 como ingredientes activos, se pueden usar para tratar la reaccion de rechazo cronico. La presente invencion tambien proporciona agentes para suprimir la reaccion de rechazo cronico de trasplante cardfaco, que comprenden un inhibidor de IL-6 como ingrediente activo.

Una reaccion de rechazo que se suprime mediante agentes de supresion de la presente invencion es preferentemente la reaccion de rechazo cronico, que es un problema en la medicina de trasplantes actual. La reaccion de rechazo cronico es una complicacion caracteriza por el engrosamiento de la mtima de los vasos sangumeos y fibrosis del intersticio, que se vuelve problematica desde un ano despues del postrasplante y afecta a los pronosticos a largo plazo de los receptores. La reaccion de rechazo cronico progresa gradualmente incluso despues de que se supera clmicamente la reaccion de rechazo agudo.

Los presentes inventores han descubierto previamente el efecto terapeutico de los inhibidores de IL-6 en un modelo de raton para un rechazo agudo postrasplante cardfaco (documento W02007/058194). El mecanismo para afecciones patologicas de la reaccion de rechazo agudo mediado principalmente por linfocitos T citotoxicos se supone que es diferente del de la reaccion de rechazo cronico. Las evidencias espedficas que sugieren que la reaccion de rechazo cronico es diferente de la reaccion de rechazo agudo son como sigue:

(1) la reaccion de rechazo cronico es una afeccion patologica espedfica con crecimiento celular, tal como fibrosis del intersticio y lesion de estenosis debido al engrosamiento de la mtima en tejidos luminales de los organos trasplantados;

(2) la aparicion de la reaccion de rechazo cronico no se puede suprimir mediante tratamiento inmunosupresor que es eficaz en la supresion de la reaccion de rechazo agudo;

(3) la reaccion de rechazo cronico es una respuesta inmunitaria que progresa de forma latente incluso despues de que se supera clmicamente el rechazo agudo; y

(4) la reaccion de rechazo cronico tiene factores de riesgo caractensticos de su aparicion.

(1) Las lesiones estenosicas vasculares acompanadas por el crecimiento de celulas musculares lisas vasculares provocado por dano endotelial vascular se sabe que es una caractenstica histopatologica caractenstica de la reaccion de rechazo cronico. Dichas lesiones estenosicas vasculares tambien se denominan lesiones vasculares postrasplante o arterioesclerosis postrasplante. Esto da como resultado trastornos circulatorios debidos a la circulacion sangumea alterada en los organos trasplantados, y los organos trasplantados dejan de funcionar. Por tanto, las lesiones estenosicas vasculares se han vuelto problematicas como una complicacion grave en la etapa cronica. Las causas de los danos vasculares en los organos trasplantados incluyen trastornos de isquemia- reperfusion, estres oxidativo y la reaccion de rechazo agudo en la cirugfa de trasplante. Por tanto, de hecho se han logrado algunos resultados satisfactorios en la supresion de la reaccion de rechazo cronico debido al avance de tecnicas para sumprimir la reaccion de rechazo agudo y el mantenimiento de organos en la fase aguda. Sin embargo, no ha estado disponible ningun procedimiento preventivo definitivo. Ademas, (2) no existe ningun tratamiento inmunosupresor establecido eficaz para la reaccion de rechazo cronico. (3) La reaccion de rechazo que progresa de forma latente incluye la prolongacion de la inmunidad humoral mediada por isoanticuerpos y la prolongacion de una variedad de inmunidad celular mediada por la infiltracion de macrofagos varias citocinas. (4) Una variedad de factores de riesgo son conocidas por estar implicados en la reaccion de rechazo cronico, incluidos

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los efectos secundarios de inmunosupresores, factores geneticos, infeccion postrasplante (citomegalovirus y semejantes), y deposito de anticuerpos en tejidos asf como factores de riesgo comunes para arterioesclerosis (diabetes, hiperlipidemia, hipertension) en los receptores. Por tanto, se supone que se produce disfuncion de los organos trasplantados debido a la complicada participacion de varios factores.

En la presente invencion, “la supresion de la reaccion de rechazo cronico despues del trasplante” se refiere a la supresion de los diversos smtomas descritos anteriormente asociados con la reaccion de rechazo cronico, tales como la fibrosis del intersticio y estenosis debido al engrosamiento de la mtima en tejidos luminales de los organos trasplantados.

Los tipos de trasplantes de organos para los que se pueden usar los agentes de supresion de la presente invencion no estan particularmente limitados, y los organos preferentes para los trasplantes de organos en la presente invencion incluyen organos parenquimatosos, tales como corazones, hngados, rinones, pancreas, pulmones e intestinos delgados. La presente invencion tambien se puede aplicar al trasplante de tejidos, tales como valvulas cardfacas, vasos, piel, huesos y corneas.

En la presente invencion, la actividad de los inhibidores de IL-6 en la inhibicion de la transduccion de senales de IL-6 se puede evaluar mediante procedimientos convencionales. Espedficamente, se anade IL-6 a cultivos de lmeas celulares de mieloma humano dependientes de IL-6 (S6B45 y KPMM2), lmea celular del linfoma T de Lennert humano KT3, o la lmea celular dependiente de IL-6 MH60.BSF2; y se mide la fijacion de 3H-timidina por las celulas dependientes de IL-6 en presencia de un inhibidor de IL-6. De forma alternativa, se cultivan celulas U266 que expresan el receptor de IL-6, y el inhibidor de IL-6 marcado con 125I y un inhibidor de IL-6 se anaden al cultivo al mismo tiempo; y, a continuacion, se cuantifica la IL-6 marcada con 125I unida a las celulas que expresan el receptor de IL-6. Ademas del grupo de inhibidores de IL-6, se incluye un grupo de control negativo que no contiene un inhibidor de IL-6 en el sistema de ensayo descrito anteriormente. La actividad del inhibidor de IL-6 para inhibir la IL-6 se puede evaluar comparando los resultados de ambos grupos.

Ademas, se puede evaluar si se suprime la reaccion de rechazo postrasplante como sigue: en el trasplante de organos, tambien se puede asumir que se logra la “supresion del dano postrasplante” cuando, como resultado, se mejora la supervivencia del injerto. La supervivencia del injerto se puede evaluar en base a si cada organo funciona normalmente despues del trasplante.

Como se describe en los ejemplos a continuacion, se demostro que la reaccion de rechazo cronico de trasplante cardfaco se suprimfa administrando un anticuerpo anti-receptor de IL-6. Esto sugiere que los inhibidores de IL-6, tales como los anticuerpos anti-receptor de IL-6, son utiles como agentes para suprimir la reaccion de rechazo cronico.

Los sujetos a los que se va a administrar los agentes de supresion de la presente invencion son mairnferos. Los mamfferos son preferentemente seres humanos.

Los agentes de supresion de la presente invencion se pueden administrar como farmacos, y se pueden administrar por de forma sistemica o localmente por via oral o administracion parenteral. Por ejemplo, se pueden seleccionar inyecciones intravenosas, tales como infusiones por goteo, inyecciones intramusculares, inyecciones intraperitoneales, inyecciones subcutaneas, supositorios, enemas, comprimidos entericos orales o similares. Los procedimientos de administracion apropiados se pueden seleccionar dependiendo de la edad del paciente y smtomas. La dosis eficaz por administracion se selecciona del intervalo de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal. De forma alternativa, la dosis se puede seleccionar del intervalo de 1 a 1000 mg/paciente, preferentemente del intervalo de 5 a 50 mg/paciente. Una dosis y procedimiento de administracion preferentes son como sigue: Por ejemplo, cuando se usa un anticuerpo anti-receptor de IL-6, la dosis eficaz es una cantidad tal que esta presente anticuerpo libre en la sangre. Espedficamente, se administra una dosis de 0,5 a 40 mg/kg de peso corporal/mes (cuatro semanas), preferentemente de 1 a 20 mg/kg de peso corporal/mes por medio de una inyeccion intravenosa, tal como con una infusion por goteo, inyeccion subcutanea o semejantes, de una a varias veces al mes, por ejemplo, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas o una vez cada cuatro semanas. La pauta de administracion se puede ajustar, por ejemplo, prolongando el intervalo de administracion de dos veces por semana o una vez por semana a una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas, mientras se realiza un seguimiento de la afeccion despues del trasplante y los cambios en los valores de los analisis de sangre.

En la presente invencion, los agentes de supresion pueden contener vehmulos farmaceuticamente aceptables, tales como conservantes y estabilizantes. Los “vehmulos farmaceuticamente aceptables” se refieren a materiales que se pueden administrar simultaneamente con un agente descrito anteriormente; y pueden o no pueden producir por sf mismos el efecto descrito anteriormente de suprimir la reaccion de rechazo cronico. De forma alternativa, los

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vetnculos pueden ser materiales que no tienen el efecto de suprimir la reaccion de rechazo cronico, pero que producen un efecto de estabilizacion adicional o sinergico cuando se usan en combinacion con un inhibidor de IL-6.

Dichos materiales farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, agua esteril, solucion salina fisiologica, estabilizantes, excipientes, tampones, conservantes, tensioactivos, agentes quelantes (EDTA y semejantes) y aglutinantes.

En la presente invencion, los tensioactivos incluyen tensioactivos no ionicos, y los ejemplos tipicos de estos incluyen esteres de acido graso de sorbitan, tales como monocaprilato de sorbitan, monolaurato de sorbitan, y monopalmitato de sorbitan; esteres de acido graso de glicerol, tales como monocaprilato de glicerol, monomiristato de glicerol y monoestearato de glicerol; esteres de acidos grasos de poliglicerol, tales como el monoestearato de decaglicerilo, diestearato de decaglicerilo, y monolinoleato de decaglicerilo; esteres de acido graso de polioxietilensorbitan, tales como monolaurato de polioxietilensorbitan, monooleato de polioxietilensorbitan, monoestearato de polioxietilensorbitan, monopalmitato de polioxietilensorbitan, trioleato de polioxietilensorbitan y triestearato de polioxietilensorbitan; esteres de acido graso de polioxietilensorbitol, tales como tetraestearato de polioxietilensorbitol y tetraoleato de polioxietilensorbitol; esteres de acido graso de polioxietilenglicerol, tales como monoestearato de polioxietilenglicerol; esteres de acido graso de polietilenglicol, tales como diestearato de polietilenglicol; polioxietilen alquil eteres, tales como polioxietilen lauril eter; polioxietilen polioxipropilen alquil eteres, tales como polioxietilen polioxipropilenglicol, polioxietilen polioxipropilen propil eter y polioxietilen polioxipropilen cetil eter; polioxietilen alquil fenil eteres, tales como polioxietilen nonilfenil eter; aceites de ricino endurecido polioxietilenado, tales como aceite de ricino polioxietilenado y aceite de ricino endurecido polioxietilenado (aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado); derivados de polioxietilen-cera de abejas, tales como polioxietilensorbitol-cera de abejas; derivados de polioxietilenlanolina, tales como polioxietilenlanolina; y amidas de polioxietilen acidos grasos y semejantes con un EHL de seis a 18, tales como amida de polioxietilen acido estearico.

Los tensioactivos tambien incluyen tensioactivos anionicos, y ejemplos tfpicos de estos incluyen, por ejemplo, alquilsulfatos que tienen un grupo alquilo con diez a 18 atomos de carbono, tales como cetilsulfato de sodio, laurilsulfato de sodio y oleilsulfato de sodio; polioxietilen alquil eter sulfatos en los que el grupo alquilo tiene diez a 18 atomos de carbono y el numero molar promedio de oxido de etileno anadido es de 2 a 4, tales como polioxietilen lauril eter sulfato; sales de esteres de alquil sulfosuccinato que tienen un grupo alquilo con ocho a 18 atomos de carbono, tales como ester de lauril sulfosuccinato de sodio; tensioactivos naturales, por ejemplo, lecitina; glicerofosfolfpidos; esfingofosfolfpidos, tales como esfingomielina; y esteres de acido graso de sacarosa en los que los acidos grasos tienen de 12 a 18 atomos de carbono.

Se pueden combinar uno, dos o mas de los tensioactivos descritos anteriormente y se pueden anadir a los agentes de la presente invencion. Los tensioactivos que se usan preferentemente en las preparaciones de la presente invencion incluyen esteres de acido graso de polioxietilensorbitan, tales como los polisorbatos 20, 40, 60 y 80. Son particularmente preferentes los polisorbatos 20 y 80. Tambien son preferentes los polioxietilen polioxipropilenglicoles, tales como poloxamero (Pluronic F-68® y semejantes).

La cantidad de tensioactivo anadido vana dependiendo del tipo de tensioactivo usado. Cuando se usa polisorbato 20 u 80, la cantidad esta, en general, en el intervalo de 0,001 a 100 mg/ml, preferentemente en el intervalo de 0,003 a 50 mg/ml, mas preferentemente en el intervalo de 0,005 a 2 mg/ml.

En la presente invencion, los tampones incluyen fosfato, tampon citrato, acido acetico, acido malico, acido tartarico, acido succmico, acido lactico, fosfato de potasio, acido gluconico, acido caprico, acido desoxicolico, acido salidlico, trietanolamina, acido fumarico y otros acidos organicos; y tampon de acido carbonico, tampon Tris, tampon histidina, y tampon imidazol.

Las preparaciones de lfquidos se pueden formular disolviendo los agentes en tampones acuosos conocidos en el campo de la preparacion de lfquidos. La concentracion de tampon esta, en general, en el intervalo de 1 a 500 mM, preferentemente en el intervalo de 5 a 100 mM, mas preferentemente en el intervalo de 10 a 20 mM.

Los agentes de la presente invencion tambien pueden comprender otros polipeptidos de bajo peso molecular; protemas, tales como seroalbumina, gelatina e inmunoglobulina; aminoacidos; azucares e hidratos de carbono, tales como polisacaridos y monosacaridos, alditoles y semejantes.

En el presente documento, los aminoacidos incluyen aminoacidos basicos, por ejemplo, arginina, lisina, histidina y ornitina, y sales inorganicas de estos aminoacidos (preferentemente sales de clorhidrato, y sales de fosfato, en concreto, aminoacidos de fosfato). Cuando se usan aminoacidos libres, se ajusta el pH hasta un valor preferente anadiendo sustancias de tamponacion fisiologicamente aceptables apropiadas, por ejemplo, acidos inorganicos, y, en particular, acido clorddrico, acido fosforico, acido sulfurico, acido acetico y acido formico, y sales de los mismos.

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En este caso, el uso de fosfato es particularmente beneficioso, ya que da productos liofilizados bastante estables. El fosfato es particularmente ventajoso cuando las preparaciones no contienen sustancialmente acidos organicos, tales como acido tartarico, acido tartarico, acido cftrico, acido succmico y acido fumarico, o no contienen los aniones correspondientes (ion malato, ion tartrato, ion citrato, ion succinato, ion fumarato, y semejantes). Los aminoacidos preferentes son arginina, lisina, histidina y ornitina. Tambien se pueden usar aminoacidos acidos, por ejemplo, acido glutamico y acido aspartico, y sales de las mismos (preferentemente sales de sodio); aminoacidos neutros, por ejemplo, isoleucina, leucina, glicina, serina, treonina, valina, metionina, cistema, y alanina; y aminoacidos aromaticos, por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptofano, y su derivado, N-acetiltriptofano.

En el presente documento, los azucares e hidratos de carbono, tales como polisacaridos y monosacaridos incluyen, por ejemplo, dextrano, glucosa, fructosa, lactosa, xilosa, manosa, maltosa, sacarosa, trehalosa y rafinosa.

En el presente documento, los alditoles incluyen, por ejemplo, manitol, sorbitol e inositol.

Cuando los agentes de la presente invencion se preparan como soluciones acuosas para inyeccion, los agentes se pueden mezclar con, por ejemplo, solucion salina fisiologica, y/o solucion isotonica que contiene glucosa u otros agentes auxiliares (tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio). Las soluciones acuosas se pueden usar en combinacion con agentes solubilizantes, tales como alcoholes (etanol y semejantes), polialcoholes (propilenglicol, PEG y semejantes), o tensioactivos no ionicos (polisorbato 80 y HCO-50).

Los agentes pueden comprender ademas, en caso necesario, diluyentes, solubilizantes, ajustadores de pH, agentes calmantes, agentes reductores que contienen azufre, antioxidantes y semejantes.

En el presente documento, los agentes reductores que contienen azufre incluyen, por ejemplo, compuestos que comprenden grupos sulfhidrilo, tales como N-acetilcistema, N-acetilhomocistema, acido tioctico, tiodiglicol, tioetanolamina, tioglicerol, tiosorbitol, acido tioglicolico y sales del mismo, tiosulfato de sodio, glutation y acidos tioalcaniocos que tengan de uno a siete atomos de carbono.

Ademas, los antioxidantes en la presente invencion incluyen, por ejemplo, acido eritorbico, dibutilhidroxitolueno, butilhidroxianisol, a-tocoferol, acetato de tocoferol, acido L-ascorbico y sales del mismo, palmitato de acido L- ascorbico, estearato de acido L-ascorbico, hidrogenosulfito de sodio, sulfito de sodio, galato de triamilo, galato de propilo, y agentes quelantes, tales como etilendiaminotetraacetato (EDTA) de sodio, pirofosfato de sodio y metafosfato de sodio.

En caso necesario, los agentes se pueden encapsular en microcapsulas (microcapsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina, poli(acido metilmetacnlico) o semejantes) o preparar como sistemas de administracion de farmacos coloidales (liposomas, microesferas de albumina, microemulsion, nanopartfculas, nanocapsulas y semejantes) (vease “Remington's Pharmaceutical Science edicion n.° 16”, Oslo Ed., 1980, y similares). Ademas, tambien se conocen procedimientos para preparar agentes como agentes de liberacion prolongada, y son aplicables a la presente invencion (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1 1981, 15, 161-277; J. Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; patente de Estados Unidos n.° 3,773,919; solicitud de patente europea n.° (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22, 547-556; y el documento EP 133,988).

Los vetnculos farmaceuticamente aceptables usados se seleccionan forma apropiada de los descritos anteriormente o se combinan dependiendo del tipo de forma de dosificacion, pero no se limitan los mismos.

La presente invencion se refiere a procedimientos para suprimir la reaccion de rechazo cronico, que comprende la etapa de administrar inhibidores de IL-6 a sujetos como se especifica en las reivindicaciones.

La presente invencion tambien se refiere a procedimientos para suprimir la reaccion de rechazo cronico de trasplante cardfaco, que comprende la etapa de administrar inhibidores de IL-6 a sujetos como se especifica en las reivindicaciones.

En el presente documento, el “sujeto” se refiere a los organismos o partes del cuerpo de organismos a los que se va a administrar un inhibidor de lL-6 de la presente invencion. Los organismos incluyen animales (por ejemplo, un ser humano, especies de animales domesticos y animales salvajes) pero no estan particularmente limitados. Las “partes del cuerpo de organismos” no estan particularmente limitadas.

En el presente documento, “administracion” incluye la administracion oral y parenteral. La administracion oral incluye, por ejemplo, la administracion de agentes por via oral. Dichos agentes por via oral incluyen, por ejemplo, granulos, polvos, comprimidos, capsulas, soluciones, emulsiones y suspensiones.

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La administracion parenteral incluye, por ejemplo, la administracion de inyecciones. Dichas inyecciones incluyen, por ejemplo, inyeccion intravenosas, inyecciones subcutaneas, inyecciones intramusculares e inyeccion intraperitoneal. Mientras tanto, los efectos de los procedimientos de la presente invencion se pueden lograr introduciendo genes que comprenden oligonucleotidos que se van a administrar a organismos vivos usando tecnicas de tratamiento genico. De forma alternativa, los agentes de la presente invencion se pueden administrar localmente en areas de tratamiento objetivo. Por ejemplo, los agentes se pueden administrar por inyeccion local durante la cirugfa, uso de cateteres, o administracion genica diana de ADN que codifican peptidos de la presente invencion.

Los agentes de supresion de la presente invencion se pueden administrar a sujetos antes de un trasplante de organos, en el momento de un trasplante de organos, o despues de un trasplante de organos. Ademas, los agentes de supresion se pueden administrar una vez o repetidamente.

De forma alternativa, cuando se administran en una parte extirpada o administrada de un organismo, los agentes de supresion de la presente invencion se pueden “poner en contacto” con la parte de un organismo.

En la presente invencion, el “poner en contacto” se realiza de acuerdo con la afeccion del organismo. Los ejemplos incluyen pulverizar los agentes de supresion de la presente invencion sobre las partes de un organismo, y anadir los agentes de supresion de la presente invencion a partes de un organismo trituradas, pero no estan limitados a los mismos. Cuando la parte de un organismo son celulas cultivadas, el “contacto” mencionado anteriormente se puede lograr anadiendo los agentes de supresion de la presente invencion a un medio de cultivo de estas celulas, o introduciendo ADN que comprendan oligonucleotidos de la presente invencion en celulas que constituyen la parte de un organismo.

Cuando se ejecutan los procedimientos de la presente invencion, los agentes de la presente invencion se pueden administrar como partes de composiciones farmaceuticas en combinacion con al menos un quimioterapeutico conocido. De forma alternativa, los agentes de la presente invencion se pueden administrar de forma simultanea con al menos un inmunodepresor conocido. En un modo de realizacion, se pueden administrar virtualmente de forma simultanea los quimioterapeuticos conocidos y los agentes de supresion de la presente invencion.

Los agentes para suprimir la reaccion de rechazo cronico de la presente invencion se administran preferentemente de forma sistemica, pero se pueden administrar a sitios de un trasplante de organos despues de que se haya trasplantado el organo, o se pueden administrar a las dianas al mismo tiempo que el organo. De forma alternativa, los agentes se pueden anadir ex vivo al organo antes del trasplante.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La fig. 1 muestra graficos y fotograffas que ilustran el resultado de una comparacion y evaluacion basadas en puntuaciones de rechazo en cortes histopatologicos de los corazones trasplantados 60 dfas despues del trasplante y la proporcion de area con fibrosis.

La fig. 2 muestra un grafico y fotograffas que muestran el resultado de analisis para el porcentaje de estenosis vascular en las lesiones vasculares de los corazones trasplantados.

EJEMPLOS

A continuacion en el presente documento, se describira espedficamente la presente invencion con referencia a los ejemplos, pero no se debe interpretar como limitada a los mismos.

Se adquirieron como donantes ratones B6.C-H2bm12 por medio de Charles River Laboratories Japan Inc. de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) en Estados Unidos. Como receptores, se adquirieron ratones C57BL/6 de Japan SLC, Inc. Solamente hay leves emparejamientos incorrectos de MHC antfgeno (emparejamiento incorrecto de clase II) entre las dos cepas de raton, de modo que no se produce la reaccion de rechazo agudo en los corazones trasplantados, mientras que las caractensticas histopatologicas observadas aproximadamente dos meses despues del trasplante son consistentes con las de la reaccion de rechazo cronico en seres humanos. Por tanto, se establecen como un modelo animal para la reaccion de rechazo cronico. Los ratones se reprodujeron en el instituto para experimentos con animales de la Universidad de Shinshu (nombre formal: Division of Laboratory Animal Research, Department of Life Science, Research Center for Human and Environmental Sciences, Universidad de Shinshu) de acuerdo con los protocolos de los experimentos con animales de la institucion. El trasplante cardfaco en raton se realizo usando un modelo de raton parcialmente modificado que procedfa del modelo de raton previamente evidenciado para el trasplante cardfaco ectopico (Corry, R. J. et al., Transplantation (1973) 16, 343-350). Los ratones de seis a ocho semanas de edad se sometieron a trasplante cardfaco mediante microcirugfa usando el procedimiento descrito a continuacion.

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Ambos ratones donante y receptor se anestesiaron inyectando por via intraperitoneal pentobarbital sodico (Nenbutal (marca comercial)) a una dosis de 70 mg/kg. El corazon que se iba a trasplantar se aislo despues de ligar los vasos distintos a la aorta ascendente y arteria pulmonar que se iban a usar para anastomosis. El injerto cardfaco aislado se preservo en solucion salina fisiologica fna que contema heparina al 7,5% en hielo. El receptor se sometio a laparotoirna en la lmea media y los intestinos se voltearon para exponer la aorta abdominal y la vena cava inferior. Despues de que se detuvo la circulacion sangumea usando micropinzas para microvasos, se efectuo una incision de aproximadamente 1 mm en cada superficie para sitios anastomoticos. La aorta y la arteria pulmonar del corazon trasplantado se sometieron a anastomosis en la aorta abdominal y la vena cava inferior del receptor, respectivamente, mediante sutura continua usando hilo de sutura de nailon 10-0. Las micropinzas se soltaron gradualmente para reanudar la circulacion sangumea. Se confirmo que el corazon trasplantado reanudo los latidos. Despues de confirmar la interrupcion de la hemorragia, se suturaron la pared abdominal y la piel para cerrar el abdomen. Cada cirugfa llevo aproximadamente 45 minutos. La tasa de exito fue de un 95 % o mayor.

En el grupo de tratamiento, se administro MR16-1 a las cavidades peritoneales a una dosis unica de 0,5 mg/cabeza dos veces por semana. Se administro IgG de rata al grupo de tratamiento de control (Ig de control) de la misma manera. Sesenta dfas despues del trasplante, se extirparon los corazones trasplantados de los receptores y se evaluo la reaccion de rechazo cronico usando los tres tipos de indicadores histopatologicos siguientes.

(1) Se compara el grado de reaccion de rechazo en las muestras tenidas con hematoxilina-eosina y se evalua usando puntuaciones de rechazo determinadas con los criterios para cinco grados a partir de grado 0 a 4 en base a los indicadores de presencia de infiltracion celular, y necrosis miocardica y perdida (Billingham, M. E. et al., J. Heart Transplant (1990) 9, 587-593; Rodriguez, E. R., J. Heart Lung Transplant (2003) 22, 3-15).

Los cortes histopatologicos se prepararon a partir de los corazones trasplantados 60 dfas despues del trasplante, y se tineron con hematoxilina-eosina (fig. 1). Se descubrio infiltracion difusa de celulas inflamatorias y necrosis miocardica en el grupo de tratamiento de control (fig. 1a).

En el grupo tratado con MR16-1, la infiltracion de celulas inflamatorias fue moderada y la estructura de los tejidos miocardicos permanecio comparativamente intacta (fig. 1b). Ademas, la puntuacion de rechazo del grupo de administracion de MR16-1 fue significativamente mas baja que la del grupo de tratamiento de control (fig. 1C: grupo de tratamiento de control, 3,1 ± 0,3; grupo de administracion de MR16-1, 1,4 ± 0,3; p=0,0013).

(2) Se detecto fibrosis del intersticio miocardico caractenstica del rechazo cronico mediante tincion tricromica de Masson. Se computo la proporcion (%) del area con fibrosis en cada campo visual usando un programa informatico de analisis de imagen (NIH image, version 1.62).

El resultado mostro que el area con fibrosis se redujo significativamente en el grupo tratado con MR16-1 (fig. 1e) en comparacion con el grupo de tratamiento de control (fig. 1d) (fig. 1f: grupo de tratamiento de control, 46,5 % ± 4,1 %; grupo de administracion de MR16-1, 19,0% ± 2,1 %; p=0,0001).

(3) Para analizar las lesiones vasculares postrasplante caracterizadas por angioestenosis debida a engrosamiento de la mtima, se determino el porcentaje de estenosis vascular estimando aproximadamente la luz vascular original de la membrana elastica interna y usando el mismo programa informatico de analisis de imagen de acuerdo con el procedimiento de Suzuki, J. et al. (Nat. Med. (1997) 3, 900-903) usando la siguiente ecuacion;

Porcentaje de estenosis (%) = ((area de membrana elastica interna) - (luz)) / (area de membrana elastica interna) x 100.

El resultado obtenido analizando las lesiones vasculares en los corazones trasplantados mostro que el engrosamiento de la mtima se suprimio y, por lo tanto, la estenosis de luz vascular se suprimio significativamente en el grupo tratado con MR16-1 (fig. 2b) en comparacion con el grupo de tratamiento de control (fig. 2a) (fig. 2C: grupo de tratamiento de control, 59,6 % ± 6,0 %; grupo de administracion de MR16-1,23,7 % ± 4,2 %; p=0,0019).

Como se describe anteriormente, en el modelo de trasplante cardfaco en raton, la administracion de MR16-1 a los receptores suprimio la reaccion de rechazo cronico de los corazones trasplantados y suprimio significativamente la fibrosis y el engrosamiento de la mtima de vasos sangumeos en los corazones trasplantados que se consideran caractensticas histopatologicas caractensticas. La reaccion de rechazo cronico es una complicacion que afecta al pronostico a largo plazo en los receptores, y por tanto, el tratamiento inmunosupresor novedosos se espera que se desarrolle a traves de la aplicacion clmica de los agentes de la presente invencion.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL

La presente invencion proporciona agentes para suprimir la reaccion de rechazo cronico que comprenden un inhibidor de lL-6 como ingrediente activo, y procedimientos para suprimir la reaccion de rechazo cronico que comprenden la etapa de administrar un inhibidor de IL-6 a sujetos.

La reaccion de rechazo cronico progresa gradualmente incluso despues de que se supera la reaccion de rechazo en 5 fase aguda por varios inmunodepresores. La afeccion patologica es complicada y muy diferente en muchas maneras de la reaccion de rechazo agudo. El efecto de prevenir y tratar la reaccion de rechazo cronico no se ha logrado por ningun agente farmaceutico existente. La presente invencion proporciona utilidades terapeuticas novedosas de inhibidores de IL-6 que tienen el efecto de suprimir el rechazo cronico. Ademas, puesto que los inhibidores suprimen de forma selectiva la actividad de IL-6, una citocina inflamatoria, se espera que sirvan como inmunodepresores 10 superiores que tengan menos efectos secundarios en comparacion con los agentes farmaceuticos existentes.

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un agente para su uso en la supresion de la reaccion de rechazo cronico, que comprende como ingrediente activo un inhibidor de IL-6 que es un anticuerpo anti-IL-6 o anticuerpo anti-receptor de IL-6.

   5 2. Uso de un inhibidor de IL-6 que es un anticuerpo anti-IL-6 o anticuerpo anti-receptor de IL-6 para la produccion

   de un agente para suprimir la reaccion de rechazo cronico.
2. 3. El agente de la reivindicacion 1 o el uso de la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
3. 4. El agente o uso de la reivindicacion 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce una IL-6 humana

   10 o un receptor de IL-6 humana.
4. 5. El agente o uso de la reivindicacion 3 o 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo recombinante.
5. 6. El agente o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico, humanizado o humano.
6. 7. El agente o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la supresion de la reaccion de

   15 rechazo cronico de trasplante cardfaco.
7. 8. Una composicion farmaceutica para su uso en la supresion de la reaccion de rechazo cronico que comprende el agente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y opcionalmente un vehfculo farmaceuticamente aceptable.