ES2567411T3 - Ácido nucleico antisentido - Google Patents
Ácido nucleico antisentido Download PDFInfo
- Publication number
- ES2567411T3 ES2567411T3 ES11821996.3T ES11821996T ES2567411T3 ES 2567411 T3 ES2567411 T3 ES 2567411T3 ES 11821996 T ES11821996 T ES 11821996T ES 2567411 T3 ES2567411 T3 ES 2567411T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- nucleic acid
- synthetic nucleic
- solution
- pmo
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 title abstract description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title description 79
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title description 79
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title description 78
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 8
- 101001053946 Homo sapiens Dystrophin Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 50
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- -1 DIG Nucleic Acid Chemical class 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 9
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 9
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 8
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 4
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- JQCVPZXMGXKNOD-UHFFFAOYSA-N 1,2-dibenzylbenzene Chemical compound C=1C=CC=C(CC=2C=CC=CC=2)C=1CC1=CC=CC=C1 JQCVPZXMGXKNOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon Chemical compound CN1CCN(C)C1=O CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010023378 Endo-Porter Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150057615 Syn gene Proteins 0.000 description 2
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 2
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 239000012156 elution solvent Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000057878 human DMD Human genes 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 101150042523 myod gene Proteins 0.000 description 2
- DILRJUIACXKSQE-UHFFFAOYSA-N n',n'-dimethylethane-1,2-diamine Chemical compound CN(C)CCN DILRJUIACXKSQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJMFVVRYJKWWEK-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethyl]-4-tritylpiperazine-1-carboxylic acid Chemical compound C1CN(C(O)=O)C(CCOCCOCCO)CN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OJMFVVRYJKWWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001999 4-Methoxybenzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1OC([H])([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- KDDPSPDCPMZDMM-UZNNEEJFSA-N 4-[[(2s,6r)-6-(4-benzamido-2-oxopyrimidin-1-yl)-4-tritylmorpholin-2-yl]methoxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound N=1C(=O)N([C@H]2CN(C[C@H](O2)COC(=O)CCC(=O)O)C(C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C=CC=1NC(=O)C1=CC=CC=C1 KDDPSPDCPMZDMM-UZNNEEJFSA-N 0.000 description 1
- SAWFCLGJUBUDGF-UHFFFAOYSA-N 4-oxo-4-[2-[2-[2-(4-tritylpiperazine-1-carbonyl)oxyethoxy]ethoxy]ethoxy]butanoic acid Chemical compound C1CN(C(=O)OCCOCCOCCOC(=O)CCC(=O)O)CCN1C(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 SAWFCLGJUBUDGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N Pentrazole Chemical compound C1CCCCC2=NN=NN21 CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102220492049 Phospholipid scramblase 1_H53A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- ZXVOCOLRQJZVBW-UHFFFAOYSA-N azane;ethanol Chemical compound N.CCO ZXVOCOLRQJZVBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N divinylbenzene Substances C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- DMFVVKPXZHMPKX-XDFJSJKPSA-N n-[1-[(2r,6s)-6-(hydroxymethyl)-4-tritylmorpholin-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]benzamide Chemical compound N=1C(=O)N([C@H]2CN(C[C@H](O2)CO)C(C=2C=CC=CC=2)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)C=CC=1NC(=O)C1=CC=CC=C1 DMFVVKPXZHMPKX-XDFJSJKPSA-N 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 125000003431 oxalo group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical group CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4707—Muscular dystrophy
- C07K14/4708—Duchenne dystrophy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/314—Phosphoramidates
- C12N2310/3145—Phosphoramidates with the nitrogen in 3' or 5'-position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
- C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/33—Alteration of splicing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Un oligómero antisentido que causa salto del 53º exón en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a una cualquiera de las secuencias que consisten en el 32º al 56º o el 36º al 56º nucleótidos desde el extremo 5' del 53º exón en el gen de la distrofina humana.
Description
de una sonda basada en la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, puede detectarse hibridación con un Kit de Detección de Ácido Nucleico DIG (Roche Diagnostics) cuando la sonda está marcada con digoxigenina (DIG) usando un reactivo disponible en el mercado (por ejemplo, una Mezcla de Marcaje de PCR (Roche Diagnostics), etc.). 5 Además de los polinucleótidos descritos anteriormente, otros polinucleótidos que pueden hibridarse incluyen polinucleótidos que tienen un 90 % o más, 91 % o más, 92 % o más, 93 % o más, 94 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, 99 % o más, 99,1 o más, 99,2 o más, 99,3 o más, 99,4 o más, 99,5 o más, 99,6 o más, 99,7 o más, 99,8 o más, 99,9 o más de identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1, calculada por el 10 software de búsqueda de homología BLAST usando los parámetros por defecto.
La identidad entre secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica) de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Se han desarrollado programas llamados BLASTN y BLASTX basados en el 15 algoritmo BLAST (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Cuando se secuencia una secuencia de nucleótidos usando BLASTN, los parámetros son, por ejemplo, valor = 100 y longitud de palabra = 12. Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se emplean los parámetros por defecto para cada programa.
Ejemplos de las secuencias de nucleótidos complementarias a las secuencias que consisten en el 31º al 53º, el 31º 20 al 54º, el 31º al 55º, el 31º al 56º, el 31º al 57º, el 31º al 58º, el 32º al 53º, el 32º al 54º, el 32º al 55º, el 32º al 56º, el 32º al 57º, el 32º al 58º, el 33º al 53º, el 33º al 54º, el 33º al 55º, el 33º al 56º, el 33º al 57º, el 33º al 58º, el 34º al 53º, el 34º al 54º, el 34º al 55º, el 34º al 56º, el 34º al 57º, el 34º al 58º, el 35º al 53º, el 35º al 54º, el 35º al 55º, el 35º al 56º, el 35º al 57º, el 35º al 58º, el 36º al 53º, el 36º al 54º, el 36º al 55º, el 36º al 56º, el 36º al 57º, y el 36º al 58º nucleótidos, desde el extremo 5' del exón 53. 25 Tabla 1
- Secuencia diana en el exón 53
- Secuencia de nucleótidos complementaria SEQ ID NO:
- 31 -53
- 5'-CCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGTA-3' SEQ ID NO: 2
- 31 -54
- 5'-TCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGTA-3' SEQ ID NO: 3
- 31 -55
- 5'-CTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGTA-3' SEQ ID NO: 4
- 31 -56
- 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGTA-3' SEQ ID NO: 5
- 31 -57
- 5'-GCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGTA-3' SEQ ID NO: 6
- 31 -58
- 5'-TGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGTA-3' SEQ ID NO: 7
- 32 -53
- 5'-CCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGT-3' SEQ ID NO: 8
- 32 -54
- 5'-TCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGT-3' SEQ ID NO: 9
- 32 -55
- 5'-CTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGT-3' SEQ ID NO: 10
- 32 -56
- 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGT-3' SEQ ID NO: 11
- 32 -57
- 5'-GCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGT-3' SEQ ID NO: 12
- 32 -58
- 5'-TGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTGT-3' SEQ ID NO: 13
- 33 -53
- 5'-CCGGTTCTGAAGGTGTTCTTG-3' SEQ ID NO: 14
- 33 -54
- 5'-TCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTG-3' SEQ ID NO: 15
- 33 -55
- 5'-CTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTG-3' SEQ ID NO: 16
- 33 -56
- 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTG-3' SEQ ID NO: 17
- 33 -57
- 5'-GCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTG-3' SEQ ID NO: 18
- 33 -58
- 5'-TGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTTG-3' SEQ ID NO: 19
- 34 -53
- 5'-CCGGTTCTGAAGGTGTTCTT-3' SEQ ID NO: 20
- 34 -54
- 5'-TCCGGTTCTGAAGGTGTTCTT-3' SEQ ID NO: 21
- 34 -55
- 5'-CTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTT-3' SEQ ID NO: 22
- 34 -56
- 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTT-3' SEQ ID NO: 23
- 34 -57
- 5'-GCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTT-3' SEQ ID NO: 24
- 34 -58
- 5'-TGCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCTT-3' SEQ ID NO: 25
- 35 -53
- 5'-CCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' SEQ ID NO: 26
- 35 -54
- 5'-TCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' SEQ ID NO: 27
- 35 -55
- 5'-CTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' SEQ ID NO: 28
- 35 -56
- 5'-CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' SEQ ID NO: 29
- 35 -57
- 5'-GCCTCCGGTTCTGAAGGTGTTCT-3' SEQ ID NO: 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
La "nucleobase" para BP incluye la misma "nucleobase" que en Base, con la condición de que el grupo amino o hidroxi en la nucleobase mostrado por BP pueda protegerse.
Dicho grupo protector para amino no está particularmente limitado siempre que se use como grupo protector para ácidos nucleicos. Ejemplos específicos incluyen benzoil, 4-metoxibenzoílo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, fenilacetilo, fenoxiacetilo, 4-terc-butilfenoxiacetilo, 4-isopropilfenoxiacetilo y (dimetilamino)metileno. Ejemplos específicos del grupo protector para el grupo hidroxi incluyen 2-cianoetilo, 4-nitrofenetilo, fenilsulfoniletilo, metilsulfoniletilo y trimetilsililetilo, y fenilo, que puede estar sustituido por 1 a 5 grupos de extracción de electrones en posiciones sustituibles opcionales, difenilcarbamoílo, dimetilcarbamoílo, dietilcarbamoílo, metilfenilcarbamoílo, 1pirrolidinilcarbamoílo, morfolinocarbamoílo, 4-(terc-butilcarboxi)bencilo, 4-[(dimetilamino)carboxi]bencilo y 4(fenylcarboxi)bencilo, (cf., por ejemplo, documento WO 2009/064471).
El "vehículo sólido" no está particularmente limitado siempre que sea un vehículo útil para la reacción en fase sólida de ácidos nucleicos. Se desea que el vehículo sólido tenga las siguientes propiedades: por ejemplo, (i) sea apenas soluble en reactivos que pueden usarse para la síntesis de derivados de ácido morfolinonucleico (por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, tetrazol, N-metilimidazol, piridina, anhídrido acético, lutidina, ácido trifluoroacético); (ii) sea químicamente estable a los reactivos que se pueden usar para la síntesis de derivados de ácido morfolinonucleico; (iii) pueda modificarse químicamente; (iv) pueda cargarse con derivados deseados de ácido morfolinonucleico; (v) tenga una fuerza suficiente para resistir alta presión a través de los tratamientos; y (vi) tenga un intervalo y distribución uniformes de diámetro de partículas. Específicamente, poliestireno hinchable (por ejemplo, resina de aminometilpoliestireno reticulado con dibencilbenceno al 1 % (malla 200-400) (2,4-3,0 mmol/g) (fabricado por Tokyo Chemical Industry), Resina de Poliestireno Aminometilado·HCl [dibencilbenceno 1 %, malla 100-200] (fabricado por Peptide Institute, Inc.)), poliestireno no hinchable (por ejemplo, Primer Support (fabricado por GE Healthcare)), poliestireno unido a cadena de PEG (por ejemplo, resina de NH2-PEG (fabricado por Watanabe Chemical Co.), resina TentaGel), vidrio de poro controlado (vidrio de poro controlado; CPG) (fabricado por, por ejemplo, CPG), vidrio de poro controlado con oxalilo (cf, por ejemplo, Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)), TentaGel support-soporte derivatizado con aminopolietilenglicol (por ejemplo, Wright et al., cf., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)), y un copolímero de Poros-poliestireno/divinilbenceno.
Un "enlazador" que puede usarse es un enlazador conocido generalmente usado para conectar ácidos nucleicos o derivados de ácido morfolinonucleico. Ejemplos incluyen 3-aminopropilo, succinilo, 2,2'-dietanolsulfonilo y un alquilamino de cadena larga (LCAA).
Esta etapa puede realizase haciendo reaccionar el Compuesto (II) con un ácido.
El "ácido" que puede usarse en esta etapa incluye, por ejemplo, ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético y ácido tricloroacético. El ácido usado está apropiadamente en un intervalo de, por ejemplo, 0,1 equivalentes molares a 1000 equivalentes molares basado en 1 mol de Compuesto (II), preferiblemente en un intervalo de 1 equivalente molar a 100 equivalentes molares basado en 1 mol de Compuesto (II).
Puede usarse una amina orgánica en combinación con el ácido descrito anteriormente. La amina orgánica no está particularmente limitada e incluye, por ejemplo, trietilamina. La cantidad de la amina orgánica usada está apropiadamente en un intervalo de, por ejemplo, 0,01 equivalentes molares a 10 equivalentes molares, y preferiblemente en un intervalo de 0,1 equivalentes molares a 2 equivalentes molares, basado en 1 mol del ácido.
Cuando se usa una sal o mezcla del ácido y la amina orgánica en esta etapa, la sal o mezcla incluye, por ejemplo, una sal o mezcla de ácido trifluoroacético y trietilamina, y más específicamente, una mezcla de un equivalente de trietilamina y 2 equivalentes de ácido trifluoroacético.
El ácido que puede usarse en esta etapa también puede usarse en forma de una dilución con un disolvente apropiado en una concentración del 0,1 % al 30 %. El disolvente no está particularmente limitado en la medida en que sea inerte a la reacción, e incluye, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, un alcohol (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), agua, o una mezcla de los mismos.
La temperatura de reacción en la reacción descrita anteriormente está preferiblemente en un intervalo de, por ejemplo, 10 ºC a 50 ºC, más preferiblemente en un intervalo de 20 ºC a 40 ºC, y mucho más preferiblemente, en un intervalo de 25 ºC a 35 ºC.
El tiempo de reacción puede variar dependiendo del tipo del ácido usado y la temperatura de reacción, y está apropiadamente en un intervalo de 0,1 minutos a 24 horas en general, y preferiblemente en un intervalo de 1 minuto a 5 horas.
apropiadamente en un intervalo de, por ejemplo, 1 equivalente molar a 100000 equivalentes molares, y preferiblemente en un intervalo de 10 equivalentes molares a 1000 equivalentes molares, en base 1 mol de compuesto (VII).
5 La temperatura de reacción está apropiadamente en un intervalo de 15 ºC a 75 ºC, preferiblemente, en un intervalo de 40 ºC a 70 ºC, y más preferiblemente, en un intervalo de 50 ºC a 60 ºC. El tiempo de reacción para la desprotección puede variar dependiendo del tipo de Compuesto (VII), temperatura de reacción, etc., y está apropiadamente en un intervalo de 10 minutos a 30 horas, preferiblemente de 30 minutos a 24 horas, y más preferiblemente en un intervalo de 5 horas a 20 horas.
10
(4) Etapa D:
PMO (I) se produce haciendo reaccionar el Compuesto (IX), producido en la etapa C con un ácido:
en la que Base, n, R2, R3 y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
Esta etapa puede realizarse añadiendo un ácido al Compuesto (IX).
20 El "ácido" que puede usarse en esta etapa incluye, por ejemplo, ácido tricloroacético, ácido dicloroacético, ácido acético, ácido fosfórico, ácido clorhídrico, etc. El ácido usado se usa apropiadamente para permitir que la solución tengo un intervalo de pH de 0,1 a 4,0, y más preferiblemente, en un intervalo de pH de 1,0 a 3,0. El disolvente no está particularmente limitado en la medida en que sea inerte a la reacción, e incluye, por ejemplo, acetonitrilo, agua,
25 o una mezcla de estos disolventes de los mismos.
La temperatura de reacción está apropiadamente en un intervalo de 10 ºC a 52 ºC, preferiblemente, en un intervalo de 20 ºC a 40 ºC, y más preferiblemente, en un intervalo de 25 ºC a 35 ºC. El tiempo de reacción para la desprotección puede variar dependiendo del tipo de Compuesto (IX), la temperatura de reacción, etc., y está
30 apropiadamente en un intervalo de 0,1 minutos a 5 horas, preferiblemente de 1 minuto a 1 hora, y más preferiblemente en un intervalo de 1 minuto a 30 minutos.
PMO (I) puede obtenerse sometiendo la mezcla de reacción obtenida en esta etapa a medios convencionales de separación y purificación tales como extracción, concentración, neutralización, filtración, separación por
35 centrifugación, recristalización, cromatografía en comuna de fase inversa C8 a C18, cromatografía en columna de intercambio catiónico, cromatografía en columna de intercambio aniónico, cromatografía en columna de filtración en gel, cromatografía líquida de alto rendimiento, diálisis, ultrafiltración, etc., en solitario o en combinación de los mismos. Po tanto, el PMO (I) deseado puede aislarse y purificarse (cf., por ejemplo, documento WO 1991/09033).
40 En la purificación de PMO (I) usando cromatografía en fase inversa, por ejemplo, puede usarse una mezcla en solución de trietilamina 20 mM/tampón acetato y acetonitrilo como disolvente de elución.
En la purificación de PMO (I) usando cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, puede usarse una mezcla en solución de solución salina 1 M y solución acuosa de hidróxido sódico 10 mM como disolvente de elución.
45 Un ácido peptidonucleico es el oligómero de la presente invención que tiene un grupo representado por la siguiente fórmula general como unidad constituyente:
con metanol frío y se secó para dar 1,84 g del compuesto objetivo (rendimiento: 82,2 %).
Etapa 4: Producción de
5 Ácido 4-oxo-4-{[(2S,6R)-6-(6-oxo-2-[2-fenoxiacetamido]-1H-purin-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}butanoico cargado en resina de aminometilpoliestireno
El compuesto del título se produjo de un modo similar al Ejemplo de referencia 1, excepto que se usó N-{9-[(2R,6S)6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2-il}-2-fenoxiacetamida en esta etapa, en lugar de N-{110 [(2R,6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida en la Etapa 1 del Ejemplo de referencia 1.
[Ejemplo de referencia 3]
15 Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de aminometilpoliestireno
El compuesto del título se produjo de un modo similar al Ejemplo de referencia 1, excepto que se usó 1-[(2R,6S)-6(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona en esta etapa, en lugar de N-{1-[(2R,6S)-620 (hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida en la Etapa 1 del Ejemplo de referencia 1.
[Ejemplo de referencia 4]
Ácido 1,12-dioxo-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoxa-15-pentadecanoico cargado en resina de 25 aminometilpoliestireno
El compuesto del título se produjo de un modo similar al Ejemplo de referencia 1, excepto que se usó ácido 2-[2-(2hidroxietoxi)etoxi]etil 4-tritilpiperazin-1-carboxílico (el compuesto describo en el documento WO 2009/064471) en esta etapa, en lugar de N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida.
30 De acuerdo con las descripciones de los Ejemplos 1 a 12 y los Ejemplos de referencia 1 a 3 a continuación, se sintetizaron diversos tipos de PMO mostrados por los PMO n.º 1-11 y 13-16 en la Tabla 2. El PMO sintetizado se disolvió en agua inyectable (fabricada por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). PMO n.º. 12 se adquirió de Gene Tools, LLC.
35 TABLA 2
- PMO n.º
- Secuencia diana en el exón 53 Nota SEQ ID NO:
- 1
- 31 -55 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 4
- 2
- 32 -53 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 8
- 3
- 32 -56 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 11
- 4
- 33 -54 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 15
- 5
- 34 -58 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 25
- 6
- 36 -53 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 32
- 7
- 36 -55 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 34
- 8
- 36 -56 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 35
- 9
- 36 -57 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 36
- 10
- 33 -57 extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 18
- 11
- 39 -69 Secuencia correspondiente a H53A(+39+69) (cf. Tabla 1) en el documento no de patente 3, extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 38
- 12
- 30 -59 Secuencia correspondiente a h53A30/1 (cf. Tabla 1) en el documento no de patente 5, extremo 5': grupo (2) SEQ ID NO: 39
- 13
- 32 -56 extremo 5': grupo (1) SEQ ID NO: 11
- 14
- 36 -56 extremo 5': grupo (1) SEQ ID NO: 35
- 15
- 30 -59 Secuencia correspondiente a h53A30/1 (cf. Tabla 1) en el documento no de patente 5, extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 39
- 16
- 23 -47 Secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 429 descrita en el documento de patente 4, extremo 5': grupo (3) SEQ ID NO: 47
[Ejemplo 1]
PMO n.º 8
5 Se transfirió ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-Benzamido-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico, cargado en resina de aminometilpoliestireno (Ejemplo de referencia 1), 2 g (800 mmol) a un vaso de reacción, y se añadieron 30 ml de diclorometano al mismo. La mezcla se dejó reposar durante 30 minutos. Después de que la mezcla se lavara adicionalmente dos veces con 30 ml de diclorometano, se inició el siguiente ciclo de síntesis. Se añadió el compuesto de monómero morfolino deseado en cada ciclo para dar la secuencia de nucleótidos del
10 compuesto del título.
TABLA 3
- Etapa
- Reactivo Volumen (ml) Tiempo (min)
- 1
- solución de desbloqueo 30 2,0
- 2
- solución de desbloqueo 30 2,0
- 3
- solución de desbloqueo 30 2,0
- 4
- solución de desbloqueo 30 2,0
- 5
- solución de desbloqueo 30 2,0
- 6
- solución de desbloqueo 30 2,0
- 7
- solución neutralizante 30 1,5
- 8
- solución neutralizante 30 1,5
- 9
- solución neutralizante 30 1,5
- 10
- solución neutralizante 30 1,5
- 11
- solución neutralizante 30 1,5
- 12
- solución neutralizante 30 1,5
- 13
- diclorometano 30 0,5
- 14
- diclorometano 30 0,5
- 15
- diclorometano 30 0,5
- 16
- solución de acoplamiento B 20 0,5
- 17
- solución de acoplamiento A 6-11 90,0
- 18
- diclorometano 30 0,5
- 19
- diclorometano 30 0,5
- 20
- diclorometano 30 0,5
- 21
- solución de sellado 30 3,0
- 22
- solución de sellado 30 3,0
- 23
- diclorometano 30 0,5
- 24
- diclorometano 30 0,5
- 25
- diclorometano 30 0,5
La solución de desbloqueo usada fue una solución obtenida disolviendo una mezcla de ácido trifluoroacético (2
15 equivalentes) y trietilamina (1 equivalente) en una solución de diclorometano que contenía etanol al 1% (v/v) y 2,2,2trifluoroetanol al 10 % (v/v) para que estuviera al 3 % (p/v). La solución neutralizante usada fue una solución obtenida disolviendo N,N-diisopropiletilamina en una solución de diclorometano que contenía 2-propanol al 25 % (v/v) para que estuviera al 5 % (v/v). La solución de acoplamiento A usada fue una solución obtenida disolviendo el compuesto de monómero morfolino en 1,3-dimetil-2-imidazolidinona que contenía N,N-diisopropiletilamina al 10 %
20 (v/v) para que estuviera a 0,15 M. La solución de acoplamiento B usada fue una solución obtenida disolviendo N,Ndiisopropiletilamina en 1,3-dimetil-2-imidazolidinona para que estuviera al 10 % (v/v). La solución de sellado usada fue una solución obtenida disolviendo anhídrido acético 20 % (v/v) y 2,6-lutidina al 30 % (v/v) en diclorometano.
La resina de aminometilpoliestireno cargada con el PMO sintetizado anteriormente se recuperó del vaso de reacción
25 y se secó a temperatura ambiente durante al menos 2 horas a presión reducida. El PMO secado cargado en resina de aminometilpoliestireno se cargó en un vaso de reacción, y se añadieron 200 ml de agua con amoniaco al 28 %etanol (1/4) al mismo. La mezcla se agitó a 55 ºC durante 15 horas. La resina de aminometilpoliestireno se separó por filtración y se lavó con 50 ml de agua-etanol (1/4). El filtrado resultante se concentró a presión reducida. El residuo resultante se disolvió en 100 ml de una mezcla de disolvente de ácido acético 20 mM-tampón trietilamina
30 (tampón TEAA) y acetonitrilo (4/1) y se filtró a través de un filtro de membrana. El filtrado obtenido se purificó por HPLC en fase inversa. Las condiciones usadas son las siguientes.
TABLA 4
- Columna
- XTerra EM (Waters, φ50 x 100 mm, 1 CV = 200 ml)
- Caudal
- 60 ml/min
- Temperatura de la columna
- temperatura ambiente
- Solución A
- tampón TEAA 20 mM
- Solución B
- CH3CN
- Gradiente
- (B) conc. 20→50 %/9 CV
Cada fracción se analizó y se recuperó el producto en 100 ml de acetonitrilo-agua (1/1), al cual se añadieron 200 ml
5 de etanol. La mezcla se concentró a presión reducida. El secado adicional a presión reducida dio un sólido blanco. Al sólido resultante se añadieron 300 ml de solución acuosa de ácido fosfórico 10 mM para suspender el sólido. A la suspensión se añadieron 10 ml de solución acuosa de ácido fosfórico 2 M y la mezcla se agitó durante 15 minutos. Además, se añadieron 15 ml de solución acuosa de hidrato sódico 2 M para neutralización. Después, se añadieron 15 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 2 M para hacer la mezcla alcalina, seguido por filtración a través de un
10 filtro de membrana (0,45 µm). La mezcla se lavó minuciosamente con 10 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 10 mM para dar el producto en forma de una solución acuosa.
La solución acuosa resultante que contenía el producto se purificó por columna de resina de intercambio aniónico. Las condiciones usadas son las siguientes. 15 Tabla 5
- Columna
- Source 30Q (GE Healtcare, φ40 x 150 mm, 1 CV = 200 ml)
- Caudal
- 80 ml/min
- Temperatura de columna
- temperatura ambiente
- Solución A
- solución acuosa de hidróxido sódico 10 mM
- Solución B
- solución acuosa de hidróxido sódico 10 mM, solución acuosa de cloruro sódico 1 M
- Gradiante
- (B) conc. 5→35 %/15 CV
Cada fracción se analizó (en HPLC) y se obtuvo el producto en forma de una solución acuosa. A la solución acuosa resultante se añadieron 225 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0) para neutralización. La mezcla se filtró a través de 20 un filtro de membrana (0,45 µm). A continuación, se realizó ultrafiltración en las condiciones descritas a continuación.
Tabla 6
- Filtro
- PELLICON2MINI FILTER PLBC 3K Celulosa Regenerada, Tamiz Tipo C
- Tamaño
- 0,1 m2
25 El filtrado se concentró para dar aproximadamente 250 ml de una solución acuosa. La solución acuosa resultante se filtró a través de un filtro de membrana (0,45 µm). La solución acuosa obtenida se secó por congelación para dar 1,5 g del compuesto objetivo en forma de un sólido tipo algodón blanco.
EM-IEN-TOF Calculado: 6924,82 30 Encontrado: 6923,54
[Ejemplo 2]
PMO. N.º 1 35 El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1.
antisentido PMO n.º 11. En particular, los oligómeros PMO n.º 3 y 8 y de la presente invención mostraron eficacia de salto de exón cuatro veces mayor que la del oligómero antisentido PMO n.º 11.
[Ejemplo de ensayo 2] 5 Ensayo in vitro usando fibroblastos humanos
Se introdujo el gen myoD humano (SEQ ID NO: 44) en células TIG-119 (fibroblastos derivados de tejido normal humano, National Institute of Biomedical Innovation) o células 5017 (fibroblastos derivados de pacientes con DMD 10 humana, Coriell Institute for Medical Research) usando un vector retrovírico de coexpresión ZsGreen1.
Después de incubación durante 4 a 5 días, los fibroblastos transformados con MyoD ZsGreen positivos se recogieron por FACS y se sembraron a 5 x 104/cm2 en una placa de 12 pocillos. Como medio de cultivo, se usó un 1 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla nutriente F-12 (DMEM.F-12) (Invitrogen Corp.) que contenía
15 FCS al 10 % y Penicilina al 1 %/Estreptomicina (P/S) (Sigma-Aldrich, Inc.).
El medio se remplazó 24 horas después por medio de diferenciación (DMEN/F-12 que contenía suero equino al 2 % (Invitrogen Corp.), P/S al 1 % y suplemento de medio líquido ITS (Sigma Inc.)). El medio se intercambió cada 2 a 3 días y se continuó la incubación durante 12 a 14 días para diferenciar en miotubos.
20 Posteriormente, se remplazó el medio de diferenciación por un medio de diferenciación que contenía EndoPorter 6 µM (Gene Tools), y se añadió el oligómero morfolino al mismo en una concentración final de 10 µM. después de incubación durante 48 horas, se extrajo el ARN total de las células usando TRIzol (fabricado por (Invitrogen Corp.). Se realizó RT-PCR con 50 ng de ARN total extraído usando un kit de RT-PCR QIAGEN One Step. Se preparó una
25 solución de reacción de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Se usó un iCycler (fabricado por Bio-Rad) como termociclador. El programa de RT-PCR usado es el siguiente.
50 °C, 30 min: transcripción inversa 95 °C, 15 min: desnaturalización térmica 30 [94 °C, 1 min; 60 °C, 1 min; 72 °C, 1 min] x 35 ciclos: amplificación por PCR 72 °C, 7 min: extensión final
Los cebadores usados fueron hEX51F y hEX55R.
35 hEX51F: 5'-CGGGCTTGGACAGAACTTAC-3' (SEQ ID NO: 45) hEx55R: 5'-TCCTTACGGGTAGCATCCTG-3' (SEQ ID NO: 46)
El producto de reacción de RT-PCR anterior se separó por electroforesis en gel de agarosa al 2 % y se capturaron imágenes del gel con un GeneFlash (Syngene). Se midieron el nivel de polinucleótido "A" de la banda con salto del
40 exón 53 y el nivel de polinucleótido "B" de la banda sin salto del exón 53 usando un Image J (fabricado por National Institutes of Health). Basándose en estos valores de medición de "A" y "B", se determinó la eficacia de salto por la siguiente ecuación.
45 Resultados experimentales
Los resultados se muestran en las FIG. 2 y 3. Este experimento reveló que en células TIG-119, los oligómeros PMO n.º 3, 8 y 9 de la presente descripción (FIG. 2) causaban todos salto del exón 53 con eficacia mayor que el oligómero 50 antisentido PMO n.º 12 (FIG. 2). En particular, los oligómeros PMO n.º 3 y 8 de la presente descripción mostraron eficacia de salto de exón más de dos veces mayor que la del oligómero antisentido PMO n.º 12 (FIG. 2)
Además, este experimento reveló que los oligómeros PMO n.º 3 y 8 a 10 de la presente descripción (FIG. 3) causaban todos salto del exón 53 con una eficacia mayor que el oligómero antisentido PMO n.º 12 (FIG. 3). En 55 particular, los oligómeros PMO n.º 3 y 8 de la presente descripción mostraron eficacia de salto del exón más de siete veces mayor que la del oligómero antisentido PMO n.º 12 (FIG. 3).
[Ejemplo de ensayo 3]
60 Ensayo in vitro usando fibroblastos humanos
Se estableció la línea celular de fibroblastos cutáneos (fibroblastos de pacientes con DMD humana (exones 45-52 o exones 48-52) por biopsia del antebrazo izquierdo medio de pacientes con DMD con deleción de los exones 45-52 o pacientes con DMD con deleción de los exones 48-52. Se introdujo el gen myoD humano (SEQ ID NO: 44) en las
65 células fibroblásticas usando un vector retrovírico de coexpresión ZsGreen1.
5
15
25
35
45
55
65
Después de incubación durante 4 o 5 días, se recogieron fibroblastos transformados con MyoD ZsGreen-positivos por FACS y se sembraron a 5 x 104/cm2 en una placa de 12 pocillos. Como medio de cultivo, se usó 1 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla nutriente F-12 (DMEN/F-12) (Invitrogen Corp.) que contenía FCS al 10 % y Penicilina al 1 %/Estreptomicina (P/S) (Sigma-Aldrich, Inc.).
El medio se remplazó 24 horas después por un medio de diferenciación (DMEM/F-12 que contenía suero equino al 2 % (Invitrogen Corp.), P/S al 1 % y suplemento de medio líquido ITS (Sigma, Inc.)). El medio se intercambió cada 2 a 3 días y se continuó la incubación durante 12, 14 o 20 días para diferenciar en myotubos.
Posteriormente, se remplazó el medio de diferenciación por un medio de diferenciación que contenía EndoPorter 6 µM (Gene Tools), y se añadió un oligómero morfolino al mismo a una concentración final de 10 µM. después de incubación durante 48 horas, se extrajo el ARN total de las células usando un TRIzol (fabricado por Invitrogen Corp.). Se realizó RT-PCR con 50 ng del ARN total extraído usando un kit de RT-PCR QIAGEN OneStep. Se preparó una solución de reacción de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Se usó un iCycler (fabricado por Bio-Rad) como termociclador. El programa de RT-PCR usado es el siguiente.
50 °C, 30 min: transcripción inversa
95 °C, 15 min: desnaturalización térmica
[94 °C, 1 min; 60 °C, 1 min; 72 °C, 1 min] x 35 ciclos: amplificación por PCR
72 °C, 7 min: extensión final
Los cebadores usados fueron hEx44F y h55R.
hEx44F: 5'-TGTTGAGAAATGGCGGCGT-3' (SEQ ID NO: 48)
hEx55R: 5'-TCCTTACGGGTAGCATCCTG-3' (SEQ ID NO: 46)
El producto de reacción de RT-PCR anterior se separó por electroforesis en gel de agarosa al 2 % y se capturaron imágenes del gel con un GeneFlash (Syngene). Se midieron el nivel de polinucleótido "A "de la banda con salto del exón 53 y el nivel de polinucleótido "B" de la banda sin salto del exón 53 usando un Image J (fabricado por National Institutes of Health). Basándose en estos valores de medición de "A" y "B", se determinó la eficacia de salto por la siguiente ecuación.
Resultados experimentales
Los resultados se muestran en las FIG. 4 y 5. Este experimento reveló que los oligómeros PMO n.º 3 y 8 de la presente descripción causaban salto del exón 53 con una eficacia tan alta como más del 80 % en las células de pacientes con DMD con deleción de los exones 45-42 (FIG. 4) o deleción de los exones 48-52 (FIG. 5). Además, los oligómeros PMO n.º 3 y 8 de la presente descripción se descubrió que causaban salto del exón 53 con una eficacia mayor que la del oligómero antisentido PMO n.º 15 en las células de pacientes con DMD con deleción de los exones 45-52 (FIG. 4).
[Ejemplo de ensayo 4]
Transferencia de Western
Se añadió el oligómero PMO n.º 8 de la presente descripción a las células a una concentración de 10 µM, y se extrajeron las proteínas de las células después de 72 horas usando un tampón RIPA (fabricado por Thermo Fisher Scientific) que contenía Complete Mini (fabricado por Roche Applied Science) y se cuantificaron usando un kit de ensayo de proteína BCA (fabricado por Thermo Fisher Scientific). Las proteínas se sometieron a electroforesis en Gel de Tris-Acetato al 3-8 % NuPAGE Novex (fabricado por Invitrogen) a 150 V durante 75 minutos y se transfirieron a una membrana de PVDF (fabricada por Millipore) usando un secante semiseco. La membrana de PVDF se bloqueó con un agente de bloqueo ECL al 5 % (fabricado por GE Healthcare) y la membrana después se incubó en una solución de anticuerpo antidistrofina (fabricado por NCL-Dys1, Novocastra). Después de incubación adicional en una solución de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (Modelo n.º 170-6516, Bio-Rad), se tiñó la membrana con sistema de transferencia de Western ECL plus (fabricado por GE Healthcare).
Inmunotinción
El oligómero PMO n.º 3 u 8 de la presente descripción se añadió a las células. Las células, después de 72 horas se fijaron en paraformaldeído al 30 % durante 10 minutos, seguido por incubación en Triton-X al 10 % durante 10 minutos. Después de bloquear en PBS que contiene suero de cabra al 10 %, la membrana se incubó en una solución de anticuerpo antidistrofina (NCL-Dys1, Novocastra). La membrana se incubó adicionalmente en una solución de anticuerpo anti-IgG de ratón (fabricado por Invitrogen). La membrana se montó con reactivo Pro Long Gold Antifade (fabricado por Invitrogen) y se observó con un microscopio de fluorescencia.
Resultados experimentales
Los resultados se muestran en las FIG. 6 y 7. En este experimento se confirmó por transferencia de Western (FIG. 6) e inmunotinción (FIG. 7) que los oligómeros PMO n.º 3 y 8 de la represente descripción inducían expresión de la 5 proteína distrofina.
[Ejemplo de ensayo 5]
Ensayo in vitro usando fibroblastos humanos 10 El experimento se realizó como en el Ejemplo de ensayo 3.
Resultados experimentales
15 Los resultados se muestran en la FIG. 8. Este experimento reveló que en las células de pacientes con DMD con deleción de los exones 45-52, los oligómeros PMO n.º 3 a 8 de la presente descripción causaban salto del exón 53 con una eficacia mayor que los oligómeros n.º 13 y 14 de la presente descripción (FIG. 8).
[Ejemplo de ensayo 6] 20 Ensayo in vitro
Se realizaron experimentos usando los oligómeros antisentido de 2'-O-metoxi-fosforotioatos (2'-OMe-S-ARN) mostrados por las SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 123. Se adquirieron diversos oligómeros antisentido usados para el 25 ensayo de Japan Bio Services. Las secuencias de diversos oligómeros antisentido se dan a continuación.
TABLA 7
- Oligómero antisentido
- Secuencia de nucleótido SEQ ID NO:
- H53_39-69
- CAUUCAACUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUG 49
- H53_1-25
- UCCCACUGAUUCUGAAUUCUUUCAA 50
- H53_6-30
- CUUCAUCCCACUGAUUCUGAAUUCU 51
- H53_11-35
- UUGUACUUCAUCCCACUGAUUCUGA 52
- H53_16-40
- UGUUCUUGUACUUCAUCCCACUGAU 53
- H53_21-45
- GAAGGUGUUCUUGUACUUCAUCCCA 54
- H53_26-50
- GUUCUGAAGGUGUUCUUGUACUUCA 55
- H53_31-55
- CUCCGGUUCUGAAGGUGUUCUUGUA 56
- H53_36-60
- GUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUC 57
- H53_41-65
- CAACUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGG 58
- H53_46-70
- UCAUUCAACUGUUGCCUCCGGUUCU 59
- H53_51-75
- ACAUUUCAUUCAACUGUUGCCUCCG 60
- H53_56-80
- CUUUAACAUUUCAUUCAACUGUUGC 61
- H53_61-85
- GAAUCCUUUAACAUUUCAUUCAACU 62
- H53_66-90
- GUGUUGAAUCCUUUAACAUUUCAUU 63
- H53_71-95
- CCAUUGUGUUGAAUCCUUUAACAUU 64
- H53_76-100
- UCCAGCCAUUGUGUUGAAUCCUUUA 65
- H53_81-105
- UAGCUUCCAGCCAUUGUGUUGAAUC 66
- H53_86-110
- UUCCUUAGCUUCCAGCCAUUGUGUU 67
- H53_91-115
- GCUUCUUCCUUAGCUUCCAGCCAUU 68
- H53_96-120
- GCUCAGCUUCUUCCUUAGCUUCCAG 69
- H53_101-125
- GACCUGCUCAGCUUCUUCCUUAGCU 70
- H53_106-130
- CCUAAGACCUGCUCAGCUUCUUCCU 71
- H53_111-135
- CCUGUCCUAAGACCUGCUCAGCUUC 72
- H53_116-140
- UCUGGCCUGUCCUAAGACCUGCUCA 73
- H53_121-145
- UUGGCUCUGGCCUGUCCUAAGACCU 74
- H53_126-150
- CAAGCUUGGCUCUGGCCUGUCCUAA 75
- H53_131-155
- UGACUCAAGCUUGGCUCUGGCCUGU 76
- H53_136-160
- UUCCAUGACUCAAGCUUGGCUCUGG 77
- H53_141-165
- CCUCCUUCCAUGACUCAAGCUUGGC 78
- H53_146-170
- GGGACCCUCCUUCCAUGACUCAAGC 79
- H53_151-175
- GUAUAGGGACCCUCCUUCCAUGACU 80
- H53_156-180
- CUACUGUAUAGGGACCCUCCUUCCA 81
- H53_161-185
- UGCAUCUACUGUAUAGGGACCCUCC 82
- H53_166-190
- UGGAUUGCAUCUACUGUAUAGGGAC 83
- H53_171-195
- UCUUUUGGAUUGCAUCUACUGUAUA 84
- H53_176-200
- GAUUUUCUUUUGGAUUGCAUCUACU 85
- H53_181-205
- UCUGUGAUUUUCUUUUGGAUUGCAU 86
- H53_186-210
- UGGUUUCUGUGAUUUUCUUUUGGAU 87
- H53_84-108
- CCUUAGCUUCCAGCCAUUGUGUUGA 88
- H53_88-112
- UCUUCCUUAGCUUCCAGCCAUUGUG 89
- H53_119-143
- GGCUCUGGCCUGUCCUAAGACCUGC 90
- H53_124-148
- AGCUUGGCUCUGGCCUGUCCUAAGA 91
- H53_128-152
- CUCAAGCUUGGCUCUGGCCUGUCCU 92
- H53_144-168
- GACCCUCCUUCCAUGACUCAAGCUU 93
- H53_149-173
- AUAGGGACCCUCCUUCCAUGACUCA 94
- H53_153-177
- CUGUAUAGGGACCCUCCUUCCAUGA 95
- H53_179-203
- UGUGAUUUUCUUUUGGAUUGCAUCU 96
- H53_184-208
- GUUUCUGUGAUUUUCUUUUGGAUUG 97
- H53_188-212
- CUUGGUUUCUGUGAUUUUCUUUUGG 98
- H53_29-53
- CCGGUUCUGAAGGUGUUCUUGUACU 99
- H53_30-54
- UCCGGUUCUGAAGGUGUUCUUGUAC 100
- H53_32-56
- CCUCCGGUUCUGAAGGUGUUCUUGU 101
- H53_33-57
- GCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUCUUG 102
- H53_34-58
- UGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUCUU 103
- H53_35-59
- UUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUCU 104
- H53_37-61
- UGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUU 105
- H53_38-62
- CUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGU 106
- H53_39-63
- ACUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUG 107
- H53_40-64
- AACUGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGU 108
- H53_32-61
- UGUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUCUUGU 109
- H53_32-51
- GGUUCUGAAGGUGUUCUUGU 110
- H53_35-54
- UCCGGUUCUGAAGGUGUUCU 111
- H53_37-56
- CCUCCGGUUCUGAAGGUGUU 112
- H53_40-59
- UUGCCUCCGGUUCUGAAGGU 113
- H53_42-61
- UGUUGCCUCCGGUUCUGAAG 114
- H53_32-49
- UUCUGAAGGUGUUCUUGU 115
- H53_35-52
- CGGUUCUGAAGGUGUUCU 116
- H53_38-55
- CUCCGGUUCUGAAGGUGU 117
- H53_41-58
- UGCCUCCGGUUCUGAAGG 118
- H53_44-61
- UGUUGCCUCCGGUUCUGA 119
- H53_35-49
- UUCUGAAGGUGUUCU 120
5
15
25
35
45
55
65
030.
Después de la transfección, las células se cultivaron durante una noche en 2 ml de medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (fabricado por Sigma, Inc., a partir de ahora en este documento igual) que contenía suero fetal de ternero (FCS) al 10 % (fabricado por Invitrogen Corp.) en condiciones de 37 ºC y CO2 al 5 %. Las células se lavaron dos veces con PBS (fabricado por Nissui, a partir de ahora en este documento igual) y después se añadieron 500 µl de ISOGEN (fabricador por Nippon Gene) a las células. Después de dejar que reposaran las células a temperatura ambiente durante unos pocos minutos para alisar las células, el lisado se recogió en un tubo Eppendorf. Se extrajo el ARN total de acuerdo con el protocolo adjunto a ISOGEN. Se determinó la concentración del ARN total extraído usando un NanoDrop ND-1000 (fabricado por LMS).
Se realizó RT-PCR de una etapa con 400 ng del ARN total extraído usando un kit de RT-PCR QIAGEN OneStep (fabricado por Qiagen, Inc.). Se preparó una solución de reacción de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. El termociclador usado fue un PTC-100 (fabricado por MJ Research). El programa de RT-PCR usado es el siguiente.
50 °C, 30 min: transcripción inversa
95 °C, 15 min: desnaturalización térmica
[94 °C, 30 s; 60 °C, 30 s; 72 °C, 1 min] x 35 ciclos: amplificación por PCR
72 °C, 10 min: extensión final
Las secuencias de nucleótidos del cebador directo y cebador inverso usados para RT-PCR se dan a continuación.
Cebador directo: 5'-CATCAAGCAGAAGGCAACAA-3' (SEQ ID NO: 42)
Cebador inverso: 5'-GAAGTTTCAGGGCCAAGTCA-3' (SEQ ID NO: 43)
El producto de reacción, 1 µl, de la PCR anterior se analizó usando un Bioanalyzer (fabricado por Agilent Technologies, Inc.).
Se midieron el nivel de polinucleótido "A" de la banda con salto del exón 53 y el nivel de polinucleótido "B" de la banda sin salto del exón 53. Basándose en estos valores de medición de "A" y "B", se determinó la eficacia de salto por la siguiente ecuación:
Resultados experimentales
Los resultados se muestran en las FIG. 18 y 19. Estos experimentos revelaron que el oligómero PMO n.º 8 de a presente descripción causaba salto del exón 53 con una eficacia marcadamente elevada en comparación con los oligómeros antisentido PMO n.º 15 y 16 (FIG. 18). También se reveló que los oligómeros PMO n.º 13 y 17 de la presente descripción causaban salto del exón 53 con una eficacia marcadamente elevada en comparación con los oligómeros PMO n.º 13 y 14 de la presente descripción (FIG: 19). Estos resultados mostraron que las secuencias con grupo-OH en el extremo 5' proporcionan una eficacia de salto mayor incluso en las mismas secuencias.
Los resultados experimentales en los Ejemplos de ensayo demuestran que los oligómeros de la presente invención (PMO n.º 1 a 10) causaban todos salto del exón 53 con una eficacia marcadamente elevada en todos los entornos celulares, en comparación con los oligómeros (PMO n.º 11, 12, 15 y 16) de acuerdo con la técnica anterior. Las células 5017 usadas en el Ejemplo de ensayo 2 son las células aisladas de pacientes con DMD y los fibroblastos usados en los Ejemplos de ensayo 3 y 5 son células diana de salto del exón 53 de pacientes con DMD. Particularmente, en los Ejemplos de ensayo 3 y 5, los oligómeros de la presente invención muestran eficacia de salto del exón 53 del 90 % o mayor en las células de pacientes con DMD que son la diana para el salto del exón 53. Por consiguiente, los oligómeros de la presente invención pueden inducir salto del exón 53 con una alta eficacia, cuando se administran a pacientes con DMD.
Por lo tanto, los oligómeros de la presente invención son extremadamente útiles para el tratamiento de DMD.
Texto libre de lista de secuencias
SEQ ID NO: 2: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 3: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 4: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 5: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 6: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 7: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 8: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 9: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: : ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 11: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 12: ácido nucleico sintético
5 SEQ ID NO: 13: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 14: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 15: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 16: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 17: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 18: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 19: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: : ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 21: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 22: ácido nucleico sintético
15 SEQ ID NO: 23: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 24: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 25: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 26: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 27: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 28: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 29: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: : ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 31: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 32: ácido nucleico sintético
25 SEQ ID NO: 33: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 34: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 35: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 36: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 37: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 38: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 39: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: : ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 41: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 42: ácido nucleico sintético
35 SEQ ID NO: 43: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 44: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 45: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 46: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 47: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 48: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 49: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: : ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 51: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 52: ácido nucleico sintético
45 SEQ ID NO: 53: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 54: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 55: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 56: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 57: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 58: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 59: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: : ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 61: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 62: ácido nucleico sintético
55 SEQ ID NO: 63: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 64: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 65: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 66: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 67: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 68: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 69: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: : ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 71: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 72: ácido nucleico sintético
65 SEQ ID NO: 73: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 74: ácido nucleico sintético
Claims (1)
-
imagen1
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010196032 | 2010-09-01 | ||
| JP2010196032 | 2010-09-01 | ||
| PCT/JP2011/070318 WO2012029986A1 (ja) | 2010-09-01 | 2011-08-31 | アンチセンス核酸 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2567411T3 true ES2567411T3 (es) | 2016-04-22 |
Family
ID=45773054
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES11821996.3T Active ES2567411T3 (es) | 2010-09-01 | 2011-08-31 | Ácido nucleico antisentido |
| ES15199455T Active ES2750748T3 (es) | 2010-09-01 | 2011-08-31 | Acidos nucleicos antisentido |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15199455T Active ES2750748T3 (es) | 2010-09-01 | 2011-08-31 | Acidos nucleicos antisentido |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (16) | US9079934B2 (es) |
| EP (6) | EP3581655A1 (es) |
| JP (12) | JP5363655B2 (es) |
| KR (1) | KR101310569B1 (es) |
| CN (1) | CN103154245B (es) |
| AU (1) | AU2011296882B2 (es) |
| CA (1) | CA2809637C (es) |
| CY (2) | CY1117367T1 (es) |
| DK (2) | DK2612917T3 (es) |
| ES (2) | ES2567411T3 (es) |
| HR (2) | HRP20160336T1 (es) |
| HU (2) | HUE027321T2 (es) |
| LT (1) | LT3018211T (es) |
| PL (2) | PL2612917T3 (es) |
| PT (1) | PT3018211T (es) |
| RS (2) | RS59361B1 (es) |
| SI (2) | SI3018211T1 (es) |
| SM (2) | SMT201900559T1 (es) |
| TW (1) | TWI541024B (es) |
| WO (1) | WO2012029986A1 (es) |
Families Citing this family (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE498685T1 (de) | 2004-06-28 | 2011-03-15 | Univ Western Australia | Antisense-oligonukleotide zur induktion von exon- skipping sowie verfahren zur verwendung davon |
| USRE48960E1 (en) | 2004-06-28 | 2022-03-08 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
| AU2006213686A1 (en) | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Avi Bio Pharma, Inc. | Antisense composition and method for treating muscle atrophy |
| AU2008317566B2 (en) | 2007-10-26 | 2014-05-01 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and methods for counteracting muscle disorders |
| EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
| US8084601B2 (en) | 2008-09-11 | 2011-12-27 | Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London | Oligomers |
| CN112574988A (zh) | 2008-10-24 | 2021-03-30 | 萨雷普塔治疗公司 | 用于dmd的多外显子跳跃组合物 |
| LT2499249T (lt) | 2009-11-12 | 2018-12-27 | The University Of Western Australia | Priešprasmės molekulės ir patologijų gydymo būdai |
| TWI541024B (zh) | 2010-09-01 | 2016-07-11 | 日本新藥股份有限公司 | 反義核酸 |
| US20130085139A1 (en) | 2011-10-04 | 2013-04-04 | Royal Holloway And Bedford New College | Oligomers |
| CN112251436A (zh) | 2012-01-27 | 2021-01-22 | 比奥马林技术公司 | 治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸 |
| CA2894899A1 (en) * | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Improved exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| NZ731587A (en) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Sarepta Therapeutics Inc | Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| RS58529B1 (sr) * | 2013-03-14 | 2019-04-30 | Sarepta Therapeutics Inc | Sastavi koji preskaču egzon za tretiranje mišićne distrofije |
| CA2906812A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Improved compositions for treating muscular dystrophy |
| SMT201900169T1 (it) * | 2014-03-12 | 2019-05-10 | Nippon Shinyaku Co Ltd | Acido nucleico antisenso |
| JP6536911B2 (ja) * | 2014-05-19 | 2019-07-03 | 神戸天然物化学株式会社 | ＣＤ４４遺伝子のバリアントエクソンのスキッピングを誘導し、正常型ＣＤ４４ｍＲＮＡの発現を増加させる核酸医薬 |
| RU2695430C2 (ru) * | 2014-06-17 | 2019-07-23 | Ниппон Синяку Ко., Лтд. | Антисмысловые нуклеиновые кислоты |
| MA41795A (fr) | 2015-03-18 | 2018-01-23 | Sarepta Therapeutics Inc | Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine |
| SI3351633T1 (sl) * | 2015-09-15 | 2020-09-30 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Protismiselna nukleinska kislina |
| JP6875684B2 (ja) * | 2015-09-16 | 2021-05-26 | 日本新薬株式会社 | 筋萎縮症治療用アンチセンス核酸 |
| JP7511326B2 (ja) | 2015-10-09 | 2024-07-05 | ウェイブ ライフ サイエンシズ リミテッド | オリゴヌクレオチド組成物およびその方法 |
| EP3858993A1 (en) | 2015-10-09 | 2021-08-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating duchenne muscular dystrophy and related disorders |
| FR3044926B1 (fr) | 2015-12-09 | 2020-01-31 | Genethon | Outils de therapie genique efficaces pour le saut de l'exon 53 de la dystrophine |
| KR101686379B1 (ko) | 2016-02-05 | 2016-12-13 | 박정열 | 휴대용 구이기 |
| US11472824B2 (en) | 2016-05-24 | 2022-10-18 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers |
| TWI737736B (zh) * | 2016-05-24 | 2021-09-01 | 美商薩羅塔治療公司 | 製備磷醯二胺嗎啉代寡聚物之方法 |
| MA45362A (fr) | 2016-05-24 | 2019-04-10 | Sarepta Therapeutics Inc | Procédés de préparation d'oligomères morpholino de phosphorodiamidate |
| MA45183A (fr) | 2016-05-24 | 2019-04-10 | Sarepta Therapeutics Inc | Procédés de préparation d'oligomères morpholino de phosphorodiamidate |
| MA49775A (fr) * | 2016-05-24 | 2020-06-10 | Sarepta Therapeutics Inc | Procédés de préparation d'oligomères morpholino de phosphorodiamidate |
| TW201811807A (zh) | 2016-06-30 | 2018-04-01 | 美商薩羅塔治療公司 | 用於肌肉萎縮症之外顯子跳躍寡聚物 |
| KR102523522B1 (ko) * | 2016-06-30 | 2023-04-20 | 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 제조 방법 |
| CA3029772A1 (en) * | 2016-07-05 | 2018-01-11 | Biomarin Technologies B.V. | Pre-mrna splice switching or modulating oligonucleotides comprising bicyclic scaffold moieties, with improved characteristics for the treatment of genetic disorders |
| KR101715572B1 (ko) | 2016-10-11 | 2017-03-22 | 박종찬 | 구이대 승강구조를 갖는 양방향 구이기 |
| SMT202200366T1 (it) * | 2016-12-19 | 2022-11-18 | Sarepta Therapeutics Inc | Coniugati di oligomeri per salto di esone per distrofia muscolare |
| SI3554554T1 (sl) | 2016-12-19 | 2023-02-28 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Oligomerni konjugati, ki preskakujejo ekson za mišično distrofijo |
| IL297528A (en) | 2016-12-19 | 2022-12-01 | Sarepta Therapeutics Inc | Exon-skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy |
| US20200131231A1 (en) | 2017-02-17 | 2020-04-30 | Oxford University Innovation Limited | Cell penetrating peptides |
| US11603532B2 (en) | 2017-06-02 | 2023-03-14 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods of use thereof |
| AR112538A1 (es) * | 2017-08-31 | 2019-11-06 | Sarepta Therapeutics Inc | Métodos para el tratamiento de distrofia muscular |
| EA201991450A1 (ru) | 2017-09-22 | 2019-12-30 | Сарепта Терапьютикс, Инк. | Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии |
| WO2019067979A1 (en) | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY |
| IL277889B2 (en) | 2018-04-12 | 2025-01-01 | Wave Life Sciences Ltd | Oligonucleotide preparations and methods of using them |
| EP3784248A4 (en) * | 2018-04-26 | 2022-08-10 | Sarepta Therapeutics, Inc. | EXON-SKIPPING OLIGOMERS AND OLIGOMER CONJUGATES FOR MUSCULAR DYSTROPHY |
| EP3790596A4 (en) * | 2018-05-11 | 2022-04-06 | Wave Life Sciences Ltd. | OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE |
| US10758629B2 (en) | 2018-05-29 | 2020-09-01 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy |
| EP3815696A4 (en) | 2018-06-26 | 2022-11-30 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE CONTAINING COMPOSITION AND ITS USE IN THE TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY |
| US12018087B2 (en) | 2018-08-02 | 2024-06-25 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject |
| US11168141B2 (en) | 2018-08-02 | 2021-11-09 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
| US20220193250A1 (en) | 2018-08-02 | 2022-06-23 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
| EP3829595A4 (en) | 2018-08-02 | 2022-08-24 | Dyne Therapeutics, Inc. | MUSCLE-DIRECTED COMPLEXES AND USES THEREOF IN THE TREATMENT OF DYSTROPHINOPATHIES |
| GB201812972D0 (en) | 2018-08-09 | 2018-09-26 | Univ Oxford Innovation Ltd | Cell-penetrating peptides |
| GB201812980D0 (en) | 2018-08-09 | 2018-09-26 | Univ Oxford Innovation Ltd | Cell-penetrating peptides |
| CN113453723A (zh) | 2018-12-07 | 2021-09-28 | 牛津大学科技创新有限公司 | 接头 |
| US20220144902A1 (en) * | 2018-12-25 | 2022-05-12 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for inducing muscular cells using cells in spot urine |
| GB201821269D0 (en) * | 2018-12-28 | 2019-02-13 | Nippon Shinyaku Co Ltd | Myostatin signal inhibitor |
| JP7842395B2 (ja) * | 2019-12-19 | 2026-04-08 | 日本新薬株式会社 | エクソンスキッピングを可能にするアンチセンス核酸 |
| CN118109468A (zh) | 2019-12-26 | 2024-05-31 | 日本新药株式会社 | 诱导外显子50的跳读的反义核酸 |
| US20230140736A1 (en) * | 2020-02-28 | 2023-05-04 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Antisense nucleic acid inducing skipping of exon 51 |
| EP4119167A4 (en) | 2020-03-11 | 2025-08-06 | Biocomber Co Ltd | SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID MOLECULE FOR INDUCING FRAME SHIFT-1 AND COMPOSITION |
| WO2022059754A1 (ja) * | 2020-09-18 | 2022-03-24 | 天野エンザイム株式会社 | 加工ひよこ豆ミルクの製造方法 |
| CA3211038A1 (en) | 2021-02-12 | 2022-08-18 | Oxford University Innovation Limited | Cell-penetrating peptide conjugates and methods of their use |
| MX2023012559A (es) | 2021-04-30 | 2023-12-15 | Sarepta Therapeutics Inc | Métodos de tratamiento para la distrofia muscular. |
| US11771776B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-10-03 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies |
| US11638761B2 (en) | 2021-07-09 | 2023-05-02 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy |
| US11969475B2 (en) | 2021-07-09 | 2024-04-30 | Dyne Therapeutics, Inc. | Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy |
| IL309936A (en) | 2021-07-09 | 2024-03-01 | Dyne Therapeutics Inc | Muscle targeting complexes and formulations for the treatment of dystrophinopathy |
| US20240390508A1 (en) | 2021-08-21 | 2024-11-28 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Human transferrin receptor binding peptide-drug conjugate |
| US20240366775A1 (en) | 2021-08-24 | 2024-11-07 | Peptidream Inc. | Human transferrin receptor binding antibody-peptide conjugate |
| CA3244382A1 (en) | 2021-12-27 | 2025-02-26 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF OLIGONUCLEIC ACID COMPOUNDS |
| EP4215614A1 (en) | 2022-01-24 | 2023-07-26 | Dynacure | Combination therapy for dystrophin-related diseases |
| WO2023168427A1 (en) | 2022-03-03 | 2023-09-07 | Yale University | Compositions and methods for delivering therapeutic polynucleotides for exon skipping |
| JP2025079347A (ja) * | 2022-03-11 | 2025-05-22 | 日本新薬株式会社 | キャリアペプチドが連結された核酸 |
| JP2025509438A (ja) | 2022-03-17 | 2025-04-11 | サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド | ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーコンジュゲート |
| US20250297253A1 (en) | 2022-05-06 | 2025-09-25 | Josho Gakuen Educational Foundation | Artificial rna molecule |
| WO2025153061A1 (zh) * | 2024-01-19 | 2025-07-24 | 云合智药（苏州）生物科技有限公司 | 用于抑制激活素iib型受体基因表达的核酸及其用途 |
Family Cites Families (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3398378B2 (ja) | 1989-12-20 | 2003-04-21 | アンチビラルス・インコーポレイテツド | リン含有キラルインターサブユニットリンケージを有する非電荷モルホリノ―基体ポリマー |
| JP2924179B2 (ja) | 1993-02-19 | 1999-07-26 | 日本新薬株式会社 | グリセロール誘導体，デバイス及び医薬組成物 |
| US7321828B2 (en) | 1998-04-13 | 2008-01-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | System of components for preparing oligonucleotides |
| JP2000325085A (ja) | 1999-05-21 | 2000-11-28 | Masafumi Matsuo | デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤 |
| US6653467B1 (en) * | 2000-04-26 | 2003-11-25 | Jcr Pharmaceutical Co., Ltd. | Medicament for treatment of Duchenne muscular dystrophy |
| US6784291B2 (en) | 2000-05-04 | 2004-08-31 | Avi Biopharma, Inc. | Splice-region antisense composition and method |
| JP4836366B2 (ja) | 2000-08-25 | 2011-12-14 | 雅文 松尾 | デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療剤 |
| US6727355B2 (en) | 2000-08-25 | 2004-04-27 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy |
| EP1191097A1 (en) | 2000-09-21 | 2002-03-27 | Leids Universitair Medisch Centrum | Induction of exon skipping in eukaryotic cells |
| ITRM20020253A1 (it) | 2002-05-08 | 2003-11-10 | Univ Roma | Molecole chimeriche di snrna con sequenze antisenso per le giunzioni di splicing del gene della distrofina e applicazioni terapeutiche. |
| JP4777777B2 (ja) | 2002-11-25 | 2011-09-21 | 雅文 松尾 | ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬 |
| CA2524255C (en) | 2003-03-21 | 2014-02-11 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure |
| ATE498685T1 (de) | 2004-06-28 | 2011-03-15 | Univ Western Australia | Antisense-oligonukleotide zur induktion von exon- skipping sowie verfahren zur verwendung davon |
| JP2006038608A (ja) | 2004-07-27 | 2006-02-09 | Tokyo Electric Power Co Inc:The | 超音波検査装置及び方法 |
| US20110046200A1 (en) | 2004-08-03 | 2011-02-24 | Michael T Howard | Use of antisense oligonucleotides to effect translation modulation |
| FR2874384B1 (fr) | 2004-08-17 | 2010-07-30 | Genethon | Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables |
| EP1811024A1 (en) | 2004-10-05 | 2007-07-25 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Oligo double-stranded rna and medicinal composition |
| JP2006129594A (ja) | 2004-10-28 | 2006-05-18 | Hitachi Ltd | 船舶用電気推進装置の制御方法及びその装置 |
| NZ563206A (en) | 2005-04-22 | 2009-09-25 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mRNA by interfering with the binding or SR proteins and by interfering with secondary RNA structure |
| WO2006129594A1 (ja) | 2005-05-30 | 2006-12-07 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | 核酸含有複合体製剤の製造方法 |
| SI2548560T1 (sl) * | 2005-06-23 | 2015-12-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sestavki in postopki za moduliranje izrezovanja smn2 |
| DK2735568T3 (da) * | 2006-05-10 | 2017-11-13 | Sarepta Therapeutics Inc | Oligonukleotidanaloger med kationiske bindinger mellem underenheder |
| EP1857548A1 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-21 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and method for inducing exon-skipping |
| JP4816396B2 (ja) | 2006-10-12 | 2011-11-16 | 富士ゼロックス株式会社 | 画像形成装置 |
| US8466255B2 (en) | 2007-02-05 | 2013-06-18 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Polyethylene glycol derivative |
| AU2008317566B2 (en) | 2007-10-26 | 2014-05-01 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and methods for counteracting muscle disorders |
| MX2010004955A (es) | 2007-11-15 | 2010-06-30 | Avi Biopharma Inc | Metodo de sintesis de oligomeros de morfolina. |
| EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
| US8084601B2 (en) | 2008-09-11 | 2011-12-27 | Royal Holloway And Bedford New College Royal Holloway, University Of London | Oligomers |
| CN112574988A (zh) | 2008-10-24 | 2021-03-30 | 萨雷普塔治疗公司 | 用于dmd的多外显子跳跃组合物 |
| JP5786109B2 (ja) | 2008-10-27 | 2015-09-30 | プロセンサ テクノロジーズ ベー．フェー． | Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーｍＲＮＡ前駆体のエクソン４５の効率的なスキッピングのための方法及び手段 |
| JP2010196032A (ja) | 2009-01-29 | 2010-09-09 | Fujifilm Corp | 水不溶性色材の分散体及びこの製造方法、これを用いた記録液、インクセット、印画物、画像形成方法、及び画像形成装置 |
| CA2759899A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | Prosensa Technologies B.V. | Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd |
| PT3305302T (pt) * | 2009-06-17 | 2018-12-14 | Biogen Ma Inc | Composições e métodos de modulação de excisões de smn2 em um sujeito |
| LT2499249T (lt) * | 2009-11-12 | 2018-12-27 | The University Of Western Australia | Priešprasmės molekulės ir patologijų gydymo būdai |
| TWI541024B (zh) | 2010-09-01 | 2016-07-11 | 日本新藥股份有限公司 | 反義核酸 |
| EP2672977A1 (en) | 2011-02-08 | 2013-12-18 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority d/b/a Carolina Healthcare System | Antisense oligonucleotides |
| WO2012150960A1 (en) | 2011-05-05 | 2012-11-08 | Avi Biopharma, Inc. | Peptide oligonucleotide conjugates |
| CN112251436A (zh) | 2012-01-27 | 2021-01-22 | 比奥马林技术公司 | 治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸 |
| EP2870246B1 (en) | 2012-07-03 | 2019-09-11 | BioMarin Technologies B.V. | Oligonucleotide for the treatment of muscular dystrophy patients |
| CA2894899A1 (en) | 2012-12-20 | 2014-06-26 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Improved exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| NZ731587A (en) | 2013-03-14 | 2021-07-30 | Sarepta Therapeutics Inc | Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy |
| RS58529B1 (sr) | 2013-03-14 | 2019-04-30 | Sarepta Therapeutics Inc | Sastavi koji preskaču egzon za tretiranje mišićne distrofije |
| CA2906812A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Improved compositions for treating muscular dystrophy |
| US10112977B2 (en) | 2014-06-23 | 2018-10-30 | Toagosei Co., Ltd. | Peptide for inducing multinucleation in cells, and use therefor |
| CA2957661A1 (en) | 2014-08-09 | 2016-02-18 | Kevin FLANIGAN | Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene |
| EA201890811A1 (ru) | 2015-09-30 | 2018-09-28 | Сарепта Терапьютикс, Инк. | Способы лечения мышечной дистрофии |
| EP3858993A1 (en) | 2015-10-09 | 2021-08-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating duchenne muscular dystrophy and related disorders |
| MA49775A (fr) | 2016-05-24 | 2020-06-10 | Sarepta Therapeutics Inc | Procédés de préparation d'oligomères morpholino de phosphorodiamidate |
| MA45183A (fr) | 2016-05-24 | 2019-04-10 | Sarepta Therapeutics Inc | Procédés de préparation d'oligomères morpholino de phosphorodiamidate |
| US20190275072A1 (en) | 2016-05-24 | 2019-09-12 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising eteplirsen |
| TWI737736B (zh) | 2016-05-24 | 2021-09-01 | 美商薩羅塔治療公司 | 製備磷醯二胺嗎啉代寡聚物之方法 |
| KR102523522B1 (ko) | 2016-06-30 | 2023-04-20 | 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 제조 방법 |
| TW201811807A (zh) | 2016-06-30 | 2018-04-01 | 美商薩羅塔治療公司 | 用於肌肉萎縮症之外顯子跳躍寡聚物 |
| IL266690B2 (en) | 2016-11-16 | 2024-06-01 | Biomarin Tech Bv | Substances for targeting various selected organs or tissues |
| IL297528A (en) | 2016-12-19 | 2022-12-01 | Sarepta Therapeutics Inc | Exon-skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy |
| SMT202200366T1 (it) | 2016-12-19 | 2022-11-18 | Sarepta Therapeutics Inc | Coniugati di oligomeri per salto di esone per distrofia muscolare |
| SI3554554T1 (sl) | 2016-12-19 | 2023-02-28 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Oligomerni konjugati, ki preskakujejo ekson za mišično distrofijo |
| AR112538A1 (es) | 2017-08-31 | 2019-11-06 | Sarepta Therapeutics Inc | Métodos para el tratamiento de distrofia muscular |
| WO2019067979A1 (en) | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY |
| JP2020536058A (ja) | 2017-09-28 | 2020-12-10 | サレプタ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 筋ジストロフィーを処置するための併用療法 |
| WO2019067975A1 (en) | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY |
-
2011
- 2011-08-30 TW TW100131052A patent/TWI541024B/zh active
- 2011-08-31 JP JP2012531987A patent/JP5363655B2/ja active Active
- 2011-08-31 KR KR1020137006385A patent/KR101310569B1/ko active Active
- 2011-08-31 WO PCT/JP2011/070318 patent/WO2012029986A1/ja not_active Ceased
- 2011-08-31 SM SM20190559T patent/SMT201900559T1/it unknown
- 2011-08-31 ES ES11821996.3T patent/ES2567411T3/es active Active
- 2011-08-31 EP EP19188572.2A patent/EP3581655A1/en not_active Withdrawn
- 2011-08-31 EP EP11821996.3A patent/EP2612917B1/en active Active
- 2011-08-31 SI SI201131801T patent/SI3018211T1/sl unknown
- 2011-08-31 HU HUE11821996A patent/HUE027321T2/en unknown
- 2011-08-31 RS RSP20191250 patent/RS59361B1/sr unknown
- 2011-08-31 DK DK11821996.3T patent/DK2612917T3/en active
- 2011-08-31 ES ES15199455T patent/ES2750748T3/es active Active
- 2011-08-31 EP EP19169673.1A patent/EP3543341A1/en not_active Withdrawn
- 2011-08-31 HR HRP20160336TT patent/HRP20160336T1/hr unknown
- 2011-08-31 PT PT151994555T patent/PT3018211T/pt unknown
- 2011-08-31 AU AU2011296882A patent/AU2011296882B2/en active Active
- 2011-08-31 EP EP24168426.5A patent/EP4400168A3/en active Pending
- 2011-08-31 EP EP24168460.4A patent/EP4403632A3/en active Pending
- 2011-08-31 EP EP15199455.5A patent/EP3018211B1/en not_active Revoked
- 2011-08-31 LT LT15199455T patent/LT3018211T/lt unknown
- 2011-08-31 HU HUE15199455A patent/HUE046364T2/hu unknown
- 2011-08-31 DK DK15199455.5T patent/DK3018211T3/da active
- 2011-08-31 CN CN201180042420.0A patent/CN103154245B/zh active Active
- 2011-08-31 CA CA2809637A patent/CA2809637C/en active Active
- 2011-08-31 RS RS20160204A patent/RS54649B1/sr unknown
- 2011-08-31 PL PL11821996T patent/PL2612917T3/pl unknown
- 2011-08-31 SI SI201130767A patent/SI2612917T1/sl unknown
- 2011-08-31 PL PL15199455T patent/PL3018211T3/pl unknown
- 2011-08-31 US US13/819,520 patent/US9079934B2/en active Active
-
2013
- 2013-09-05 JP JP2013184193A patent/JP6141728B2/ja active Active
-
2015
- 2015-02-06 US US14/615,504 patent/US9708361B2/en active Active
- 2015-12-28 JP JP2015256962A patent/JP6193343B2/ja active Active
-
2016
- 2016-04-15 CY CY20161100315T patent/CY1117367T1/el unknown
- 2016-04-18 SM SM201600111T patent/SMT201600111B/it unknown
-
2017
- 2017-06-12 US US15/619,996 patent/US10329319B2/en active Active
- 2017-08-09 JP JP2017154320A patent/JP6465932B2/ja active Active
-
2019
- 2019-01-08 JP JP2019001091A patent/JP6647430B2/ja active Active
- 2019-03-20 US US16/359,213 patent/US10385092B2/en active Active
- 2019-03-26 US US16/364,451 patent/US10407461B2/en active Active
- 2019-03-29 US US16/369,427 patent/US10487106B2/en active Active
- 2019-05-10 US US16/408,529 patent/US10870676B2/en active Active
- 2019-06-24 US US16/449,537 patent/US10647741B2/en active Active
- 2019-09-30 HR HRP20191770TT patent/HRP20191770T1/hr unknown
- 2019-10-14 CY CY20191101075T patent/CY1122167T1/el unknown
- 2019-12-12 US US16/712,686 patent/US10662217B2/en active Active
- 2019-12-17 US US16/717,274 patent/US10683322B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-14 JP JP2020003338A patent/JP6867619B2/ja active Active
- 2020-12-18 US US17/126,366 patent/US20210179659A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-01-21 JP JP2021008200A patent/JP6867620B1/ja active Active
- 2021-01-21 JP JP2021008201A patent/JP6867621B1/ja active Active
- 2021-01-21 JP JP2021008202A patent/JP6867636B1/ja active Active
- 2021-02-12 US US17/175,276 patent/US11028122B1/en active Active
- 2021-03-30 JP JP2021058526A patent/JP2021104037A/ja active Pending
- 2021-05-28 US US17/333,677 patent/US20210284680A1/en not_active Abandoned
- 2021-07-14 US US17/375,877 patent/US20210340171A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-11-08 US US18/053,679 patent/US20230151050A1/en not_active Abandoned
- 2022-12-27 JP JP2022209270A patent/JP2023036865A/ja active Pending
-
2024
- 2024-07-16 US US18/774,442 patent/US20250042933A1/en active Pending
- 2024-08-27 JP JP2024145055A patent/JP2024170458A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2567411T3 (es) | Ácido nucleico antisentido | |
| RU2619184C2 (ru) | Антисмысловые нуклеиновые кислоты | |
| HK40112203A (en) | Antisense nucleic acids | |
| HK40017657A (en) | Antisense nucleic acids | |
| HK40110953A (en) | Antisense nucleic acids | |
| CN121045297A (zh) | 一种非天然嘌呤碱基核苷药物的合成方法及其应用 | |
| AU2015203659A1 (en) | Antisense nucleic acid |